ES2243208T3

ES2243208T3 - Fosfodiesterasa de nucleotido ciclico humano.

Info

Publication number: ES2243208T3
Application number: ES00307981T
Authority: ES
Inventors: Mark David Fidock; Nicola Melanie Robas
Original assignee: Pfizer Corp Belgium; Pfizer Corp SRL
Current assignee: Pfizer Corp Belgium; Pfizer Corp SRL
Priority date: 1999-09-17
Filing date: 2000-09-14
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2020-09-14
Also published as: EP1085089A2; DE60021497D1; US20040126863A1; US7063971B2; ATE300613T1; JP2001136987A; EP1085089B1; GB9922124D0; EP1085089A3; DE60021497T2

Abstract

Una secuencia de aminoácidos que tiene actividad de PDEXV siendo capaz de catalizar la degradación de AMPc y GMPc; comprendiendo dicha secuencia de aminoácidos la secuencia presentada como SEC.ID.Nº 1 o una variante de la misma; teniendo dicha variante al menos un 95% de homología con la secuencia mostrada como SEC.ID.Nº 1 y que comprende al menos 25 aminoácidos contiguos de la siguiente secuencia N terminal:

Description

Fosfodiesterasa de nucleótido cíclico humano.

Antecedentes de la presente invención

La presente invención se refiere a una enzima. La presente invención también se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica la misma.

En particular, la presente invención se refiere a una nueva secuencia de ácidos nucleicos que codifica una nueva enzima fosfodiesterasa.

La presente invención también se refiere al uso de las nuevas secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos para evaluar y o explorar agentes que pueden modular la actividad fosfodiesterasa.

La presente invención se refiere adicionalmente a células huésped modificadas genéticamente que comprenden o expresan las nuevas secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos para evaluar y/o explorar agentes que pueden modular la actividad fosfodiesterasa.

Técnica antecedente

Los nucleótidos cíclicos, tales como AMPc y GMPc, son segundos mensajeros intracelulares importantes. Las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos - conocidas de otro modo como PDE - son una familia de enzimas que cataliza la degradación de nucleótidos cíclicos y, al hacer eso, son uno de los componentes celulares que reúnen la concentración de nucleótidos cíclicos.

En los últimos años, se han definido al menos siete enzimas PDE (tales como PDEI - PDEVII), así como muchos subtipos de estas enzimas, en base a la afinidad de sustrato y las necesidades de cofactor (Beavo JA y Reifsnyder DH, Trends Pharmacol. Sci 11:150 [1990]; Beavo J, En: Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action., Beavo J and Housley MD (Eds.)). Wiley:Chichester, páginas 3-15 [1990]).

Los ejemplos de PDE incluyen: PDEI que es una PDE dependiente de Ca^{2+}/Calmodulina; PDEII que es una PDE estimulada por GMPc; PDEIII que es una PDE inhibida por GMPc; PDEIV que es una PDE específica de AMPc de alta afinidad; y PDEV que es una PDE específica de GMPc.

Cada familia de PDE puede contener dos o mas isoformas (es decir, pueden haber dos o más isoenzimas PDE). A modo de ejemplo, PDEIV de mamífero, la homologa del gen Dunce de Drosophila (Chen CH y col., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 83:9313 [1986]), se sabe que tiene cuatro isoformas en la rata (Swinnen JV y col., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 86:5325 [1989]). También se sabe que las PDE humanas se encuentran como isoformas y tienen variantes de corte y empalme. Por ejemplo, se informó de la clonación de una isoforma humana de PDEIV a partir de monocitos en 1990 (Livi GP y col., Mol. Cell. Bio., 10:2678 [1990]). A modo de ejemplo adicional, otros trabajadores han clonado independientemente tres variantes de corte y empalme de PDEIV, que ahora se denominan hPDEIV-B1, hPDEIV-B2, y hPDEIV-B3.

También pueden encontrarse contenidos con respecto a fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos en los documentos US-A-5932423 y US-A-5932465.

Pueden encontrarse contenidos de una fosfodiesterasa de nucleótidos cíclicos adicional - llamada CN PCDE8
- en el documento WO-A-97/35989. De acuerdo con el documento WO-A-97/35989, CN PCDE8 tiene dos isoen-
zimas - que se denominan CN PCDE8A y CN PCDE8B. El término "isoenzima" a veces se menciona en la técnica como "isoforma".

De acuerdo con el documento WO-A-97/35989, se han identificado muchos inhibidores de diferentes PDE y algunos han experimentado evaluación clínica. Por ejemplo, los inhibidores de PDEIII se han desarrollado como agentes antitrombóticos, como agentes antihipertensivos y como agentes cardiotónicos útiles en el tratamiento de insuficiencia cardiaca congestiva. Rolipram, un inhibidor de PDEIII, se ha usado en el tratamiento de depresión y otros inhibidores de PDEIII están experimentando evaluación como agentes anti-inflamatorios. Rolipram también ha demostrado inhibir TNF-alfa inducido por lipopolisacárido (LPS) que ha demostrado potenciar la replicación de VIH-1 in vitro. Por lo tanto, rolipram pueden inhibir la replicación de VIH-1 (Angel y col 1995 AIDS 9:1137-44). Adicionalmente, en base a esta capacidad de suprimir la producción de TNF-alfa y beta e interferón gamma, rolipram ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de encefalomielitis, el modelo animal experimental para esclerosis múltiple (Sommer y col, 1995 Nat Med 1:244-248) y puede ser eficaz en el tratamiento de disquinesia tardía (Sasaki y col, 1995 Eur J Pharmacol 282:71-76).

De acuerdo con el documento WO-A-97/35989, también hay inhibidores de PDE no específicos tales como teofilina, usada en el tratamiento de asma bronquial y otras enfermedades respiratorias, y pentoxifilina, usada en el tratamiento de claudicación intermitente y enfermedad vascular periférica inducida por diabetes. La teofilina se cree que funciona sobre la función del músculo liso de las vías respiratorias así como en la capacidad anti-inflamatoria o inmunomoduladora en el tratamiento de enfermedades respiratorias (Banner y col 1995 Respir J 8:996-1000) donde se cree que funciona inhibiendo la hidrólisis tanto de AMPc como de GMPc por CN PDE (Banner y col 1995 Monaldi Arch Chest Dis 50:286-292). La pentoxifilina, también conocida por bloquear la producción de TNF-alfa, puede inhibir la replicación de VIH-1 (Angel y col supra). Se proporciona una lista de inhibidores de CN PDE en Beavo 1995 supra.

Se ha sugerido que los inhibidores selectivos de PDE, además de sus isoenzimas y sus subtipos, conducirán a una terapia más eficaz con menos efectos secundarios. Por ejemplo, véanse los contenidos de las revisiones de Wieshaar RE y col, (J. Med. Chem., 28:537 [1985]), Giembycz MA (Biochem. Pharm., 43:2041 [1992]) y Lowe JA y Cheng JB (Drugs of the Future, 17:799-807 [1992]).

Por tanto, para algunas aplicaciones es deseable tener un inhibidor selectivo de un tipo individual de PDE. Por lo tanto, la clonación y expresión de una PDE nueva ayudará enormemente al descubrimiento de inhibidores selectivos.

Sumario de aspectos de la presente invención

Los aspectos de la presente invención se presentan en las reivindicaciones y en el siguiente comentario.

En un aspecto amplio, la presente invención se refiere a nuevas secuencias de aminoácidos. A este respecto, se ha identificado una nueva secuencia específica de aminoácidos y se entiende que la invención incluye la secuencia así como variantes nuevas de la misma.

En otro aspecto amplio, la presente invención se refiere a nuevas secuencias de ácidos nucleicos. A este respecto, se ha identificado una nueva secuencia específica de ácidos nucleicos y se entiende que la invención incluye la secuencia así como variantes nuevas de la misma.

Por tanto, en resumen, algunos aspectos de la presente invención se refieren a:

1. Nuevas secuencias de aminoácidos.

2. Nuevas secuencias de nucleótidos.

3. Ensayos que usan dichas nuevas secuencias.

4. Sistemas de expresión que comprenden o expresan dichas nuevas secuencias.

Otros aspectos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la presente invención y/o la secuencia de nucleótidos de la presente invención incluyen: una construcción que comprende o es capaz de expresar las secuencias de la presente invención; un vector que comprende o es capaz de expresar las secuencias de la presente invención; un plásmido que comprende o es capaz de expresar las secuencias de la presente invención; un tejido que comprende o es capaz de expresar las secuencias de la presente invención; un órgano que comprende o es capaz de expresar las secuencias de la presente invención; un huésped transformado que comprende o es capaz de expresar las secuencias de la presente invención; un organismo transformado que comprende o es capaz de expresar las secuencias de la presente invención. La presente solicitud también incluye procedimientos para expresar la misma, tales como expresión en un microorganismo; incluyendo procedimientos para transferir la misma.

Para una fácil referencia, los aspectos de la presente invención se analizan ahora en los encabezados de sección apropiados. Sin embargo, los contenidos en cada sección no están necesariamente limitados a cada sección particular.

En el siguiente comentario referencias a "secuencia de nucleótidos de la presente invención" y "secuencia de aminoácidos de la presente invención" se refiere respectivamente a una cualquiera o más de las secuencias de nucleótidos presentadas o analizadas en este documento y a una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos presentadas o analizadas en este documento. Además, como se usa en este documento, "secuencia de aminoácidos" se refiere a secuencias peptídicas o proteicas y pueden referirse a porciones de las mismas. Además, el término "secuencia de aminoácidos de la presente invención" es sinónimo de la expresión "secuencia polipeptídica de la presente invención". Además, el término "secuencia de nucleótidos de la presente invención" es sinónimo de la expresión "secuencia polinucleotídica de la presente invención".

Aspectos detallados de la presente invención

De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona una secuencia de aminoácidos que tiene actividad PDEXV (es decir, que es capaz de catalizar la degradación de AMPc y GMPc); comprendiendo dicha secuencia de aminoácidos la secuencia presentada como SEC ID Nº:1 o una variante de la misma; teniendo dicha variante al menos una homología del 95% con la secuencia mostrada como SEC ID Nº:1 y que comprende al menos 25 aminoácidos contiguos de la siguiente secuencia N-terminal:

1

SEC ID Nº:1 es la secuencia de aminoácidos de PDEXV (que a veces se llama PDE11A3). PDEXV tiene 684 aminoácidos. Sin desear unirse por la teoría, las secuencias de aminoácidos asociadas con motivos de unión a GMPc supuestos (x 2) se han subrayado. La presencia de dos motivos de unión a GMPc proporciona el potencial para la regulación diferencial de variantes de corte y empalme.

Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de la presente invención tiene dos motivos de unión a GMPc.

Por conveniencia, ahora se presenta una Tabla que indica los códigos usados para los aminoácidos.

Aminoácido	Abreviatura de tres letras	Símbolo de una letra
Alanina	Ala	A
Arginina	Arg	R
Asparagina	Asn	N
Ácido aspártico	Asp	D
Cisteína	Cys	C
Glutamina	Gln	Q
Ácido glutámico	Glu	E
Glicina	Gly	G
Histidina	His	H
Isoleucina	Ile	I
Leucina	Leu	L
Lisina	Lys	K
Metionina	Met	M
Fenilalanina	Phe	F
Prolina	Pro	P
Serina	Ser	S
Treonina	Thr	T
Triptófano	Trp	W
Tirosina	Tyr	Y
Valina	Val	V
Cualquier resto	Xaa	X

Por conveniencia, la PDE de la presente invención a veces se menciona como PDEXV o PDExv.

Se cree que la PDE de la presente invención es una versión truncada de PDE11A1. Las secuencias para PDE11A1 se presentan en la lista de secuencias adjunta, junto con PDE11A2 que se cree que es una variante de acuerdo con la PDE de la presente invención.

La PDE de la presente invención es capaz de catalizar la degradación de AMPc y GMPc.

Para SEC ID Nº:1 uno cualquiera o más de los aminoácidos pueden ser un análogo de los mismos.

El término "análogo" como se usa en este documento significa una secuencia que tiene una secuencia similar a la de SEC ID Nº:1 pero donde se han hecho sustituciones o deleciones de aminoácidos no perjudiciales (es decir, no perjudiciales para la actividad enzimática).

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención se proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la presente invención.

Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia presentada como SEC ID Nº:2 o una variante de la misma que tiene al menos una homología del 95% con la misma.

De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención se proporciona un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención se proporciona una célula huésped en la que se ha incorporado la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención.

De acuerdo con un quinto aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento de ensayo para identificar un agente que pueda afectar a la actividad de PDEXV (es decir, que sea capaz de catalizar la degradación de AMPc y GMPc) o la expresión de PDEXV, comprendiendo el procedimiento de ensayo poner en contacto un agente con un aminoácido de acuerdo con la presente invención o una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención; y medir la actividad o expresión de PDEXV; donde una diferencia entre (a) actividad o expresión de PDEXV en ausencia del agente y (b) actividad o expresión de PDEXV en presencia del agente es indicativo de que el agente puede afectar a la actividad o expresión de PDEXV.

Preferiblemente el ensayo es para explorar agentes útiles para el tratamiento de un trastorno cardiovascular y/o trastornos encontrados en uno cualquiera o más del cuerpo cavernoso, riñón, hígado, músculo esquelético, testículo, próstata.

PDEXV (PDE11A3)

Como se ha explicado anteriormente, la presente invención se refiere a una nueva enzima PDE - que se ha llamado PDEXV (que puede expresarse de otro modo como PDE11A3) - y a una secuencia de nucleótidos que codifica la misma. La presente invención también se refiere al uso de las nuevas secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos para evaluar y/o explorar agentes que puedan modular la actividad fosfodiesterasa. La presente invención también se refiere a células huésped modificadas genéticamente que comprenden o expresan las nuevas secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos para evaluar y/o explorar agentes que puedan modular la actividad fosfodiesterasa.

Se cree que PDEXV está presente en, y se puede obtener de, una diversidad de fuentes.

A modo de ejemplo, PDEXV se encuentra en el sistema cardiovascular, el cuerpo cavernoso, riñón, hígado, músculo esquelético, testículo, próstata.

También se cree que PDEXV está presente en varias fuentes distintas - tales como por ejemplo: bovina, ovina, porcina y equina.

Preferiblemente, la PDEXV es PDEXV de mamífero que incluye aunque sin limitación cualquiera de las fuentes anteriores.

Más preferiblemente, la PDEXV es PDEXV humana.

La PDEXV puede ser igual que la forma de origen natural - para este aspecto, preferiblemente la PDEXV es la secuencia de aminoácidos no nativa (es decir, no está presente en su medio natural) - o es una variante de la misma. Además, o como alternativa, la PDEXV es PDEXV asilada y/o PDEXV purificada. La PDEXV puede obtenerse de o producirse por cualquier fuente apropiada, sea natural o no, o puede ser sintética, semisintética o recombinante.

La secuencia que codifica PDEXV puede ser la misma que la forma de origen natural - para este aspecto, preferiblemente la secuencia que codifica PDEXV es la secuencia de nucleótidos no nativa (es decir, no está presente en su medio natural) - o es una variante de la misma. Además, o como alternativa, la secuencia que codifica PDEXV es una secuencia que codifica PDEXV aislada y/o una secuencia que codifica PDEXV purificada. La secuencia que codifica PDEXV puede obtenerse de o producirse por cualquier fuente apropiada, sea natural o no, y puede ser sintética, semisintética o recombinante.

PDEX y/o su secuencia codificante y/o una secuencia capaz de hibridar con la misma es o son útiles para ensayar la selectividad de candidatos de fármaco entre diferentes PDE.

Se cree que PDEXV es capaz de catalizar la conversión de GMPc a GMP y AMPc a AMP.

GMPc es el mensajero en la respuesta eréctil masculina. Por consiguiente, inhibiendo la actividad de PDEXV probablemente se aumenta la concentración de GMPc presente y por tanto se puede potenciar la respuesta eréctil masculina.

Por tanto, PDEXV y o su secuencia codificante y/o una secuencia capaz de hibridar con la misma puede ser útil para explorar candidatos de fármaco para el tratamiento de la disfunción eréctil masculina. Además, se cree que PDEXV y/o su secuencia codificante y/o una secuencia capaz de hibridar con la misma puede ser útil para explorar candidatos de fármaco para el tratamiento de disfunción sexual femenina.

La presente solicitud describe una enzima PDEXV recombinante y una secuencia de nucleótidos recombinante que codifica una enzima PDEXV.

Preferiblemente, la enzima PDEXV recombinante y/o la secuencia de nucleótidos recombinante son una enzima PDEXV de mamífero recombinante y/o una secuencia de nucleótidos de mamífero recombinante.

Preferiblemente, la enzima PDEXV recombinante y/o la secuencia de nucleótidos recombinante son una enzima PDEXV humana recombinante y una secuencia de nucleótidos humana recombinante.

Cualquiera o tanto la secuencia de nucleótidos que codifica PDEXV como la enzima PDEXV en sí misma pueden usarse para explorar agentes que puedan afectar a la actividad PDEXV. En particular, la secuencia de nucleótidos que codifica PDEXV o PDEXV en sí misma puede usarse para explorar agentes que puedan inhibir la actividad de PDEXV. Además, la secuencia de nucleótidos que codifica PDEXV o la enzima PDEXV en sí misma puede usarse para explorar agentes que afecten selectivamente a la actividad de PDEXV, tal como inhibir selectivamente la actividad de PDEXV.

Además, la secuencia de nucleótidos que codifica PDEXV o una secuencia que es complementaria a la misma también pueden usarse en ensayos para detectar la presencia de secuencias que codifican PDEXV en células humanas. Estos ensayos podrían proporcionar información con respecto a la distribución tisular de esta enzima y su relevancia biológica con respecto a patologías particulares.

La presente solicitud contempla anticuerpos frente a PDEXV (incluyendo una variante de la misma). Los anticuerpos para PDEXV pueden usarse en ensayos para detectar la presencia de PDEXV en células humanas. Estos ensayos podrían proporcionar información con respecto a la distribución tisular de esta enzima y su relevancia biológica con respecto a patologías particulares.

En particular, una cualquiera o más de las isoenzimas PDEXV, las secuencias de nucleótidos que codifican las mismas, las secuencias de nucleótidos que son complementarias a las mismas, y los anticuerpos dirigidos frente a las mismas pueden usarse en ensayos para explorar agentes que afecten selectivamente a una de las isoenzimas. Estos ensayos podrían proporcionar información con respecto a la distribución tisular de cada una de las isoenzimas y para proporcionar información con respecto a la relevancia biológica de cada una de las isoenzimas con respecto a patologías
particulares. Estos ensayos también podrían permitir a los trabajadores ensayar e identificar agentes que son útiles para aceptar a la expresión de o actividad de PDEXV - tal como en un tejido particular o en una patología particular.

Polipéptido de la presente invención

El término "polipéptido" - que es intercambiable con el término "proteína" - incluye moléculas polipeptídicas de cadena única así como complejos polipeptídicos múltiples donde los polipéptidos constituyentes individuales están unidos por medios covalentes o no covalentes.

Preferiblemente, el polipéptido de la presente invención es un polipéptido de cadena única.

Los polipéptidos de la presente invención pueden estar en forma sustancialmente aislada. Se entenderá que el polipéptido puede mezclarse con vehículos o diluyentes, que no afectarán al propósito pretendido del polipéptido y aun se conservará como sustancialmente aislado. Un polipéptido de la presente invención también puede estar en forma sustancialmente purificada, en cuyo caso generalmente comprenderá el polipéptido en una preparación en la que más del 90%, por ejemplo, 95%, 98% o 99% del polipéptido en la preparación es un polipéptido de la presente invención. Los polipéptidos de la presente invención pueden estar modificados por ejemplo por la adición de restos de histidina para ayudar a su purificación o por la adición de una secuencia señal para promover su secreción a partir de una célula como se analiza a continuación.

Los polipéptidos de la presente invención pueden producirse por medios sintéticos (por ejemplo, como se describe por Geysen y col., 1996) o de manera recombinante, como se describe a continuación.

En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos per se de la presente invención no incluye la PDEXV nativa de acuerdo con la presente invención cuando está en su medio natural y cuando se ha expresado por su secuencia codificante de nucleótidos nativa que también está en su medio natural y cuando la secuencia de nucleótidos está bajo el control de su promotor nativo que también está en su medio natural. Para una fácil referencia, se ha llamado a esta realización preferida la "secuencia de aminoácidos no nativa".

Los términos "variante", "homólogo" o "fragmento" en relación con la secuencia de aminoácidos para la enzima de la presente invención incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazamiento de, deleción de o adición de un (o más) aminoácido a partir de o a la secuencia promocionando la enzima resultante que tiene actividad de PDEXV, preferiblemente siendo al menos tan biológicamente activa como la enzima mostrada en la lista de secuencias adjunta. En particular, el término "homólogo" incluye homología con respecto a la estructura y/o función. Con respecto a homología de secuencia, hay al menos un 95%, más preferiblemente al menos un 98%, de homología con la secuencia mostrada como SEC ID Nº:1.

La variante de la presente invención comprende al menos 25 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 45 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 65 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 85 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 105 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 125 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 145 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 165 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 185 aminoácidos contiguos de la siguiente secuencia N-terminal:

2

Típicamente, para la variante de la presente invención, los tipos de sustituciones de aminoácidos que podrían hacerse deben mantener la hidrofobicidad/hidrofilicidad de la secuencia de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden hacerse, por ejemplo de 1, 2 ó 3 a 10, 20 ó 30 sustituciones a condición de que la secuencia modificada mantenga la capacidad de funcionar como una enzima PDE de acuerdo con al presente invención. Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir el uso de análogos de origen no natural, por ejemplo para aumentar la semivida en plasma sanguíneo.

La secuencia de aminoácidos de la presente invención puede producirse por expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica la misma en un sistema de expresión apropiado.

Además, o como alternativa, la proteína en sí misma podría producirse usando procedimientos químicos para sintetizar una secuencia de aminoácidos de PDE, por completo o en parte. Por ejemplo, los péptidos pueden sintetizarse por técnicas en fase sólida, escindirse de la resina, y purificarse por cromatografía líquida de alta resolución preparativa (por ejemplo, Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, Nueva York NY). La composición de los péptidos sintéticos puede confirmase por análisis de aminoácidos o secuenciación (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman).

La síntesis peptídica directa puede realizarse usando diversas técnicas en fase sólida (Roberge JY y col (1995) Science 269:202-204) y puede conseguirse síntesis automática, por ejemplo, usando el Sintetizador Peptídico ABI
43 1 A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Adicionalmente, la secuencia de aminoácidos de PDE, o cualquier parte de la misma, puede alterarse durante la síntesis directa y/o combinarse usando procedimientos químicos con una secuencia de otras subunidades, o cualquier parte de las mismas, para producir un polipéptido variante.

En otra realización descrita en la solicitud, puede ligarse una secuencia de PDE natural, modificada o recombinante a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para explorar bibliotecas de péptidos para inhibidores de la actividad PDE, puede ser útil codificar una proteína PDE quimérica que exprese un epítope heterólogo que se reconozca por un anticuerpo disponible en el mercado. Una proteína de fusión también puede modificarse para que contenga un sitio de escisión localizado entre una secuencia de PDE y la secuencia de proteína heteróloga, de modo que la PDE pueda escindirse y purificarse del resto heterólogo.

La PDE también puede expresarse como una proteína recombinante con uno o más dominios polipeptídicos adicionales añadidos para facilitar la purificación de proteína. Dichos dominios que facilitan la purificación incluyen, aunque sin limitación, péptidos quelantes de metales tales como módulos histidina-triptófano que permiten la purificación en metales inmovilizados (Porath J (1992) Protein Expr Purif 3 -26328 1), dominios de proteína A que permiten la purificación en inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación por extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp, Seattle, WA). La inclusión de una secuencia engarce que se puede escindir tal como el Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y PDE es útil para facilitar la purificación.

Una secuencia de aminoácidos específica de PDEXV se muestra como SEC ID Nº:1. Sin embargo, la presente invención incluye secuencias de aminoácidos que codifican otros miembros de la familia PDEXV, que podrían incluir secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 95% de identidad con las secuencias de aminoácidos específicas.

Los polipéptidos de la presente invención también pueden modificarse para que contengan una o más (por ejemplo, al menos 2, 3, 5, ó 10) sustituciones, deleciones o inserciones, incluyendo sustituciones conservadas. Estos aspectos se analizan en una sección posterior.

Secuencia de nucleótidos de la presente invención

El término "secuencia de nucleótidos" como se usa en este documento se refiere a una secuencia oligonucleotídica o secuencia polinucleotídica, y variantes de las misma (tales como porciones de la misma). La secuencia de nucleótidos pude ser ADN o ARN, que puede ser de origen genómico o sintético o recombinante que puede ser de doble hélice o hélice única que represente la cadena con sentido a antisentido.

Preferiblemente, el término "secuencia de nucleótidos" significa ADN.

Más preferiblemente, el término "secuencia de nucleótidos" significa ADN preparado por el uso de técnicas de ADN recombinante (es decir, ADN recombinante).

En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos per se de la presente invención no incluye la secuencia codificante de nucleótidos nativa de acuerdo con la presente invención en su medio natural cuando está bajo el control de su promotor nativo que también está en su medio natural. Para una fácil referencia, se ha llamado a esta realización preferida la "secuencia de nucleótidos no nativa".

Las secuencias de nucleótidos de la presente invención pueden incluir en ellas nucleótidos sintéticos o modificados. Se conocen varios tipos diferentes de modificación a oligonucleótidos en la técnica. Estas incluyen estructuras metilfosfonato y fosforotioato, adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los propósitos de la presente invención, se entiende que las secuencias de nucleótidos descritas en este documento pueden modificarse por cualquier procedimiento disponible en la técnica. Dichas modificaciones pueden realizarse para potenciar la actividad in vivo o el margen de vida de las secuencias de nucleótidos de la presente
invención.

El término "variante" también incluye secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridar con las secuencias de nucleótidos presentadas en este documento.

Preferiblemente, el término "variante" incluye secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de hibridar en condiciones rigurosas (por ejemplo, 65ºC y 0,1 x SSC {1 x SSC = NaCl 0,015 M, Na_{3}citrato 0,015 pH 7,0}) con las secuencias de nucleótidos presentadas en este documento.

Los ácidos nucleicos ejemplares pueden caracterizarse alternativamente como las secuencias de nucleótidos que codifican una proteína PDEXV e hibridan con la secuencia de ADN mostrada en la lista de secuencias adjunta. Se prefieren dichas secuencias que codifican PDEXV que hibridan en condiciones de alta rigurosidad con la secuencia mostrada en la lista de secuencias adjunta o el complementario de la misma.

Los términos "variante", "homólogo" o "fragmento" en relación con la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima preferida de la presente invención incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazamiento de, deleción de o adición de un (o más) aminoácido de o a la secuencia proporcionando la secuencia de nucleótidos resultante que codifica o es capaz de codificar una enzima que tiene actividad de PDEXV, siendo preferiblemente al menos tan biológicamente activa como la enzima codificada por las secuencias mostradas en la lista de secuencias adjunta. En particular, el término "homólogo" incluye homología con respecto a la estructura y/o función a condición de que la secuencia de nucleótidos resultante codifique o sea capaz de codificar una enzima que tenga actividad de PDEXV. Con respecto a homología de secuencia, hay al menos un 95%, más preferiblemente al menos un 98%, de homología con la secuencia mostrada como SEC ID Nº:2.

La variante de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos 25 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 45 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 65 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 85 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 105 aminoácidos contiguos, preferible-
mente al menos 125 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 145 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 165 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 185 aminoácidos contiguos, de la siguiente secuencia N-terminal:

\vskip1.000000\baselineskip

3

Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos que codifica un ejemplo de dicha secuencia N-terminal se presenta a continuación:

4

Como se ha indicado, la presente invención se refiere a una secuencia de ADN (preferiblemente una secuencia de ADNc) que codifica PDEXV. En particular, la presente invención se refiere a secuencias de ADNc que codifican PDEXV.

La presente invención también se refiere a segmentos de ADN que comprenden la secuencia de ADN de las secuencias mostradas en la lista de secuencias adjunta o variaciones alélicas de dichas secuencias.

La presente invención también se refiere a polipéptidos producidos por la expresión en una célula huésped en la que se han incorporado las secuencias de ADN anteriores o variaciones alélicas de las mismas.

La presente invención también se refiere a ADN que comprende la secuencia de ADN mostrada en la lista de secuencias adjunta o una variación alélica de la misma.

La presente invención también se refiere a ADN no nativo que comprende la secuencia de ADN mostrada en la lista de secuencias adjunta o una variación alélica de la misma.

Un aspecto altamente preferido de la presente invención se refiere a ADN recombinante que comprende la secuencia de ADN mostrada en la lista de secuencias adjunta o una variación alélica de la misma.

Los polinucleótidos de la presente invención incluyen secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la presente invención. Se apreciará que un intervalo de polinucleótidos diferentes codifica una secuencia de aminoácidos dada como consecuencia de la degeneración del código genético.

Mediante el conocimiento de las secuencias de aminoácidos expuestas en este documento es posible elaborar secuencias de ácidos nucleicos parciales y de longitud completa tales como clones de ADNc y/o genómicos que codifican los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención pueden obtenerse usando PCR degenerada que usará cebadores diseñados para secuencias diana que codifican las secuencias de aminoácidos presentadas en este documento. Los cebadores contendrán típicamente posiciones degeneradas múltiples. Sin embargo, para minimizar la degeneración, las secuencias se elegirán de modo que codifiquen regiones de las secuencias de aminoácidos presentadas en este documento que contienen aminoácidos tales como metionina que están codificados por solo un triplete. Además, las secuencias se elegirán para que tengan en cuenta el uso del codón en el organismo cuyo el ácido nucleico se usa como ADN molde para el procedimiento de PCR. La PCR se usará en condiciones de rigurosidad inferiores a las usadas para secuencias de clonación con cebadores de secuencia única (no degenerados) frente a secuencias conocidas.

Las secuencias de ácidos nucleicos obtenidas por PCR que codifican fragmentos polipeptídicos de la presente invención después pueden usarse para obtener secuencias más grandes usando técnicas de exploración de biblioteca de hibridación. Por ejemplo, un clon de PCR puede marcarse con átomos radiactivos y usarse para explorar una biblioteca de ADNc o genómica de otra especie, preferiblemente otra especie de mamífero. Las condiciones de hibridación serán típicamente condiciones de rigurosidad media a alta (por ejemplo, cloruro sódico 0,03 M y citrato sódico 0,03 M de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 60ºC).

Las sondas de ácidos nucleicos degeneradas que codifican toda o parte de la secuencia de aminoácidos también pueden usarse para sondear bibliotecas de ADNc y/o genómicas de otra especie, preferiblemente otra especie de mamífero. Sin embargo, se prefiere realizar técnicas de PCR en un principio para obtener una secuencia única para su uso en procedimientos de exploración adicionales.

Como se describe en este documento, las secuencias de polinucleótidos PDEXV que codifican PDEXV, fragmentos del polipéptido, proteínas de fusión o equivalentes funcionales de los mismos, pueden usarse para generar moléculas de ADN recombinante que dirigen la expresión de PDEXV en células huésped apropiadas. Debido a la degeneración inherente del código genético, pueden usarse otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia o una secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente, para clonar y expresar PDEXV. Como se entenderá por los especialistas en la técnica, puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que codifican PDE que tienen codones de origen no natural. Pueden seleccionarse los codones preferidos por un huésped procariota o eucariota particular (Murray E y col (1989) Nuc Acid Res 17:477-508), por ejemplo, para aumentar la el índice de expresión de PDEXV o para producir transcritos de ARN recombinante que tienen propiedades deseables, tales como semivida más larga, que los trascritos producidos a partir de la secuencia de origen natural.

Las secuencias polinucleotídicas de la presente invención obtenidas usando las técnicas descritas anteriormente pueden usarse para obtener secuencias homólogas adicionales y variantes usando las técnicas descritas anteriormente. También pueden estar modificadas para su uso en la expresión de los polipéptidos de la presente invención en una diversidad de sistemas de células huésped, por ejemplo para optimizar las preferencias de codones para una célula huésped particular en la que se están expresando las secuencias polinucleotídicas. Pueden desearse otros cambios de secuencia para introducir sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, o para alterar la propiedad o función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos.

Las secuencias polinucleotídicas de PDEXV alteradas que pueden usarse de acuerdo con la invención incluyen deleciones, inserciones o sustituciones de diferentes restos de nucleótidos diferentes que dan como resultado un polinucleótido que codifica la misma o una PDE funcionalmente equivalente. La proteína también puede tener deleciones, inserciones o sustituciones de restos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y dan como resultado una PDE funcionalmente equivalente. Las sustituciones deliberadas de aminoácidos pueden hacerse en base a la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los restos mientras se mantenga la actividad biológica de PDE. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabezas polares no cargadas que tienen valores de hidrofilicidad similar incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina, y tirosina.

Se incluyen en el alcance de la presente invención alelos de PDE. Como se usa en este documento, un "alelo" o "secuencia alélica" es una forma alternativa de PDE. Los alelos son el resultado de una mutación, es decir, un cambio en la secuencia de ácidos nucleicos, y generalmente producen ARNm alterados o polipéptidos cuya estructura o función puede estar o no estar alterada. Cualquier gen dado puede tener ninguna, una o muchas formas alélicas. Los cambios mutacionales habituales que dan lugar a alelos se atribuyen generalmente a deleciones, adiciones o sustituciones de aminoácidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede suceder solo, o en combinación con los otros, una o mas veces en una secuencia dada.

Las secuencias de nucleótidos de la presente invención pueden modificarse para alterar una secuencia que codifica PDE por una diversidad de razones, incluyendo aunque sin limitación, alteraciones que modifican la clonación, procesamiento y/o expresión del producto génico. Por ejemplo, las mutaciones pueden introducirse usando técnicas que son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, mutagénesis dirigida de sitio para insertar nuevos sitios de restricción, para alterar los patrones de glicosilación o para cambiar la preferencia de codón.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse para producir un cebador, por ejemplo, un cebador de PCR, un cebador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda por ejemplo marcada con un marcador de revelado por un medio convencional usando marcadores radiactivos o no radiactivos, o los polinucleótidos pueden clonarse en vectores. Dichos cebadores, sondas u otros fragmentos serán de al menos 25, preferiblemente al menos 30 o 40 nucleótidos de longitud, y también se incluyen por el término de polinucleótidos de la presente invención como se usa en este documento.

Los polinucleótidos o cebadores de la presente invención pueden llevar un marcador de revelado. Los marcadores apropiados incluyen radioisótopos tales como ^{32}P o ^{35}S, marcadores enzimáticos, u otros marcadores proteicos tales como biotina. Dichos marcadores pueden añadirse a los polinucleótidos o cebadores de la presente invención y pueden detectarse usando técnicas conocidas per se.

Los polinucleótidos tales como un polinucleótido y cebadores de ADN de acuerdo con la presente invención pueden producirse de manera recombinante, de manera sintética, o por cualquier medio disponible para los especialistas en la técnica. También pueden clonarse por técnicas convencionales.

En general, los cebadores se producirán por medios sintéticos, implicando una fabricación por etapas de la secuencia de ácidos nucleicos deseada de un nucleótido cada vez. Las técnicas para conseguir esto usando técnicas automáticas están fácilmente disponibles en la técnica.

Los polinucleótidos más largos generalmente se producirán usando medios recombinantes, por ejemplo usando técnicas de clonación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Esto implicará fabricar un par de cebadores (por ejemplo, de aproximadamente 15-30 nucleótidos) para una región de la secuencia de nucleótidos que se desea clonar, poner los cebadores en contacto con el ARNm o ADNc obtenido de una célula fúngica, vegetal o procariota, realizar una reacción en cadena de la polimerasa en condiciones que provoquen la amplificación de la región deseada, aislar el fragmento amplificado (por ejemplo, purificando la mezcla de reacción en un gel de agarosa) y recuperar el ADN amplificado. Los cebadores pueden diseñarse para que contengan sitios de reconocimiento de enzimas de restricción apropiados de modo que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonación apropiado.

Las moléculas de ADN pueden modificarse para aumentar la estabilidad intracelular y la semivida. Las modificaciones posibles incluyen, aunque sin limitación, la adición de secuencias flanqueantes de los extremos 5' y/o 3' de la molécula y el uso de fosforotioato o 2' O-metilo en lugar de engarces fosfodiesterasa en la estructura de la molécula.

La presente solicitud también describe secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridar con toda o parte de la secuencia mostrada en la lista de secuencias adjunta o una variación alélica de la misma. Estas secuencias de nucleótidos pueden usarse en técnicas antisentido para modificar la expresión de PDEXV. Como alternativa, estas secuencias (o porciones de las mismas) pueden usarse como sonda, o para amplificar toda o parte de dicha secuencia cuando se usa como cebador de la reacción en cadena de la polimerasa.

Además de las secuencias de ADN recombinante, las secuencias genómicas también son de utilidad en el contexto del descubrimiento de fármacos. Puede ser valioso inhibir la trascripción de ARNm de una isoforma particular en lugar de inhibir su proteína traducida. Esto puede ser cierto con PDEXV, si hay variantes de corte y empalme y donde las diferentes variantes de corte y empalme pueden trascribirse a partir de promotores diferentes. Hay un precedente de promotores múltiples que dirigen la transcripción de una 3' fosfodiesterasa de nucleótido 2',3'-cíclico de cerebro de ratón (Kurihara T y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 170:1074 [1990]).

Otra utilidad de la invención es que las secuencias de ADN, una vez conocidas, dan la información necesaria para diseñar ensayos para detectar específicamente isoenzimas o variantes de corte y empalme. Los pares de cebadores de PCR específicos de isoenzimas son un ejemplo de un ensayo que depende completamente del conocimiento de la secuencia de ADN específica de la isoenzima o variante de corte y empalme. Dicho ensayo permite la detección de ARNm para la isoenzima para acceder a la distribución tisular y relevancia biológica de cada isoenzima para una patología particular. Esto también permite la identificación de líneas celulares que pueden expresar de manera natural solo una isoenzima - un descubrimiento que podría evitar la necesidad de expresar genes recombinantes. Si las isoenzimas de PDEXV específicas demuestran asociarse con una patología particular, la invención podría ser valiosa en el diseño de ensayos de diagnóstico para detectar la presencia de ARNm de isoenzima.

Un nivel anormal de las secuencias de nucleótidos que codifican una PDEXV en una muestra biológica puede reflejar una aberración cromosómica, tal como una deleción o mutación de ácidos nucleicos. Por consiguiente, las secuencias de nucleótidos que codifican una PDEXV proporcionan la base para sondas que pueden usarse en forma de diagnóstico para detectar aberraciones cromosómicas tales como deleciones, mutaciones o translocaciones cromosómicas en el gen que codifica PDE. La expresión del gen de PDEXV puede estar alterada en dichas patologías o puede ser una aberración cromosómica presente en la región del gen que codifica una PDEXV.

En una realización alternativa de la invención, la secuencia codificante de PDE podría sintetizarse, por completo o en parte, usando procedimientos químicos bien conocidos en la técnica (véase Caruthers MH y col (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn T y col (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).

Origen Natural

Como se usa en este documento "origen natural" se refiere a una PDEXV con una secuencia de aminoácidos encontrada en la naturaleza.

Aislado/Purificado

Como se usa en este documento, los términos "aislado" y "purificado" se refiere a moléculas, secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos, que se han retirado de su medio natural y aislado o separado de al menos un componente distinto con el que están asociados de manera natural.

Biológicamente Activo

Como se usa en este documento "biológicamente activo" se refiere a una PDEXV de acuerdo con la presente invención - tal como una PDEXV recombinante - que tiene una función estructural similar (pero no necesariamente al mismo grado), y/o función reguladora similar (pero no necesariamente al mismo grado) y/o función bioquímica similar (pero no necesariamente al mismo grado) y/o actividad inmunológica (pero no necesariamente al mismo grado) de la PDEXV de origen natural. Específicamente, una PDEXV de la presente invención tiene la capacidad de hidrolizar un nucleótido cíclico, que es una de las actividades características de la enzima PDE de la presente invención. Mas específicamente, una PDEXV de la presente invención es capaz de catalizar la degradación de AMPc y GMPc.

Actividad Inmunológica

Como se usa en este documento, "actividad inmunológica" se define como la capacidad de la PDEXV natural, recombinante o sintética o cualquier oligopéptido de la misma, para inducir una respuesta inmune específica en animales apropiados o células y para unirse con anticuerpos específicos.

Derivado

El término "derivado" como se usa en este documento en relación con la secuencia de aminoácidos incluye la modificación química de una PDEXV. Una ilustración de dichas modificaciones podría ser el reemplazamiento de hidrógeno por un grupo alquilo, acilo, o amino.

Deleción

Como se usa en este documento una "deleción" se define como un cambio en una secuencia de nucleótidos o aminoácidos en la que uno o más nucleótidos o restos de aminoácidos, respectivamente, están ausentes.

Inserción/Adición

Como se usa en este documento una "inserción" o "adición" es un cambio en una secuencia de nucleótidos o aminoácidos que es el resultado de la adición de uno o más nucleótidos o restos de aminoácidos, respectivamente, en comparación con la PDE de origen natural.

Sustitución

Como se usa en este documento "sustitución" es el resultado del reemplazamiento de uno o más nucleótidos o aminoácidos por nucleótidos o aminoácidos diferentes, respectivamente.

Homólogo

El término "homólogo" con respecto a la secuencia de nucleótidos de la presente invención y la secuencia de aminoácidos de la presente invención puede ser sinónimo de variaciones alélicas de las secuencias.

En particular, el término "homología" como se usa en este documento puede equipararse con el término "identidad". Aquí, la homología de secuencia con respecto a la secuencia de nucleótidos de la presente invención y la secuencia de aminoácidos de la presente invención puede determinarse por una comparación "visual" simple (es decir, una comparación estricta) de una cualquiera o más de las secuencias con otra secuencia para ver si la otra secuencia tiene al menos un 95% de identidad con la secuencia o secuencias. La homología de secuencia relativa (es decir, identidad de secuencia) también puede determinarse por programas informáticos disponibles en el mercado que pueden calcular el porcentaje de homología entre dos o más secuencias. Un ejemplo típico de dicho programa informático es CLUSTAL.

El % de homología puede calcularse sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un resto cada vez. Esto se llama un alineamiento "sin huecos". Típicamente, dichos alineamientos sin huecos se realizan solo sobre una cantidad relativamente corta de restos (por ejemplo menos de 50 aminoácidos contiguos).

Aunque esto es un procedimiento muy simple y lógico, falla en tener en consideración que, por ejemplo, en un par de secuencias idénticas de otro modo, una inserción o deleción provocará que los restos de aminoácidos siguientes queden fuera del alineamiento, dando potencialmente como resultado, por tanto, una reducción grande en el % de homología cuando se realiza un alineamiento global. Por consiguiente, la mayoría de los procedimientos de comparación de secuencia se diseñan para que produzcan alineamientos óptimos que tengan en cuenta posibles inserciones y deleciones sin penalizar excesivamente la puntuación de homología global. Esto se consigue insertando "huecos" en el alineamiento de secuencia para intentar maximizar la homología local.

Sin embargo, estos procedimientos más complejos asignan "penalizaciones por hueco" a cada hueco que sucede en el alineamiento de modo que, para la misma cantidad de aminoácidos idénticos, un alineamiento de secuencia con la menor cantidad de huecos posible - reflejando una relación más alta entre las dos secuencias comparadas - conseguirá una puntuación más alta que uno con muchos huecos. Los "costes de huecos afines" se usan típicamente de modo que carguen un coste relativamente alto para la existencia de un hueco y una penalización más pequeña para cada resto posterior en el hueco. Este es el sistema de puntuación de hueco usado más habitualmente. Las penalizaciones por hueco altas producirán, por supuesto, alineamientos optimizados con menos huecos. La mayoría de los programas de alineamiento permiten modificar las penalizaciones por hueco. Sin embargo, se prefiere usar los valores por defecto cuando se usa dicho software para comparaciones de secuencia. Por ejemplo, cuando se usa el paquete GCG Wisconsin Bestfit (véase a continuación) la penalización por hueco por defecto para secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4 para cada extensión.

El cálculo de % de homología máximo por lo tanto requiere en primer lugar la producción de un alineamiento óptimo, teniendo en cuenta las penalizaciones por hueco. Un programa informático apropiado para realizar dicho alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux y col., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Los ejemplos de otros software que pueden realizar comparaciones de secuencia incluyen, aunque sin limitación, el paquete BLAST (véase, Ausubel y col., 1999 ibid - Capítulo 18), FASTA (Atschul y col., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) y el juego de herramientas de comparación GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para una búsqueda off-line y on-line (véase, Ausubel y col., 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones se prefiere el uso del programa GCG Bestfit.

Aunque el % de homología final puede medirse en términos de identidad, en algunos casos, el procedimiento de alineamiento en sí mismo típicamente no se basa en una comparación de pares todo-o-nada. En su lugar, generalmente se usa una matriz de puntuación de similitud en escala que asigna puntuaciones a cada comparación por pares en base a la similitud química o distancia evolutiva. Un ejemplo de dicha matriz habitualmente usada es la matriz BLOSUM62 -
la matriz por defecto para el juego de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin generalmente usan los valores por defecto públicos o suministran una tala de comparación de símbolos habituales (véase el manual del usuario para detalles adicionales). Se prefiere usar los valores por defecto públicos para el paquete GCG, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.

Una vez que el software ha producido un alineamiento óptimo, es posible calcular el % de homología, preferiblemente el % de identidad de secuencia. El software típicamente hace esto como parte de la comparación de secuencia y genera un resultado numérico.

Como se ha indicado, para algunas aplicaciones, la homología de secuencia (o identidad) puede determinarse usando cualquier algoritmo de homología apropiado, usando por ejemplo parámetros por defecto. Para un análisis de cuestiones básicas en la búsqueda de similitud de bases de datos de secuencia, véase Altschul y col (1994) Nature Genetics 6:119-129. Para algunas aplicaciones, se emplea el algoritmo BLAST, con parámetros ajustados a valores por defecto. El algoritmo BLAST se describe con detalle en http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html. De manera ventajosa, "homología sustancial" cuando se evalúa por BLAST equivale a secuencias que coinciden con un valor ESPERADO de al menos aproximadamente 7, preferiblemente al menos aproximadamente 9 y más preferiblemente 10 o más. El umbral por defecto para el valor ESPERADO en la búsqueda BLAST habitualmente es 10.

Deben usarse Penalizaciones por Hueco cuando se determina la identidad de secuencia, después se usan preferiblemente los siguientes parámetros:

Para blast
Abrir hueco	0
Extensión de hueco	0

Para clustal	ADN	Proteína
Tamaño de palabra	2	1	K triple
Penalización por hueco	10	10
Extensión de hueco	0,1	0,1

Otros procedimientos de programas informáticos para determinar la identidad y similitud entre las dos secuencias incluyen, aunque sin limitación, el paquete de programas GCG (Devereux y col 1984 Nucleic Acids Research 12: 387) y FASTA (Altschul y col 1990 J Molec Biol 403-410).

Variantes y Derivados Polipeptídicos

Los términos "variante" o "derivado" en relación con las secuencias de aminoácidos de la presente invención incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazamiento de, deleción de o adición de un (o más) aminoácido a partir de o a la secuencia a condición de que la secuencia de aminoácidos resultante tenga actividad PDE, preferiblemente que tenga al menos la misma actividad que el polipéptido presentado en la lista de secuencias.

Las secuencias de la presente invención pueden modificarse para su uso en la presente invención. Típicamente, las modificaciones se hacen de modo que mantengan la actividad PDE de la secuencia. Las sustituciones de aminoácidos pueden hacerse, por ejemplo de 1, 2 ó 3 a 10, 20 ó 30 sustituciones a condición de que la secuencia modificada mantenga la actividad PDE. Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir el uso de análogos de origen no natural, por ejemplo para aumentar la semivida en plasma sanguíneo de un polipéptido administrado terapéuticamente.

Las sustituciones conservativas pueden hacerse, por ejemplo, de acuerdo con la siguiente Tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque de la segunda columna y preferiblemente en la misma línea de la tercera columna pueden sustituirse entre sí:

5

Como se ha indicado anteriormente, las proteínas de la invención típicamente se fabrican por medios recombinantes, por ejemplo como se describe en este documento, y/o usando medios sintéticos usando técnicas bien conocidas por los especialistas en la técnica tales como síntesis en fase sólida. Las variantes y derivados de dichas secuencias incluyen proteínas de fusión, donde las proteínas de fusión comprenden al menos la secuencia de aminoácidos de la presente invención unida (directa o indirectamente) a otra secuencia de aminoácidos. Estas secuencias de aminoácidos distintas - que a veces se mencionan como compañeros de proteína de fusión - otorgarán típicamente una funcionalidad favorable - tal como para ayudar a la extracción y purificación de la secuencia de aminoácidos de la presente invención. Los ejemplos de compañeros de proteína de fusión incluyen glutatión-S-transferasa (GST), 6xHis, GAL4 (dominios de unión a ADN y/o activación de la transcripción) y \beta-galactosidasa. También puede ser conveniente incluir un sitio de escisión proteolítica entre el compañero de proteína de fusión y la secuencia proteica de la presente invención de modo que permita la retirada del último. Preferiblemente, el compañero de proteína de fusión no impedirá la función de la proteína de la presente invención.

Variantes y Derivados Polinucleotídicos

Los términos "variante" o "derivado" en relación con la secuencia de nucleótidos de la presente invención incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazamiento de, deleción de o adición de un (o más) ácido nucleico a partir de o a la secuencia a condición de que la secuencia de nucleótidos resultante codifique un polipéptido que tenga actividad PDE, preferiblemente que tenga al menos la misma actividad que las secuencias presentadas en la lista de secuencias.

Como se ha indicado anteriormente, con respecto a la homología de secuencia, preferiblemente hay al menos un 95%, más preferiblemente al menos un 98%, de homología con las secuencias mostradas en la lista de secuencias en este documento. Las comparaciones de homología de nucleótidos pueden realizarse como se ha descrito anteriormente. Para algunas aplicaciones, un programa de comparación de secuencias preferido es el programa GCG Wisconsin Bestfit descrito anteriormente. La matriz de puntuación por defecto tiene un valor de coincidencia de 10 para cada nucleótido y -9 para cada falta de coincidencia. La penalización por creación de hueco por defecto es -50 y la penalización por extensión de hueco por defecto es -3 para cada nucleótido.

Como se usa en este documento, los términos "variante", "homólogo", "fragmento" y "derivado" abarcan variaciones alélicas de las secuencias.

Hibridación

El término "hibridación" como se usa en este documento incluirá "el procedimiento por el que una cadena de ácidos nucleicos se une con una cadena complementaria a través del apareamiento de bases" (Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, Nueva York NY) así como el procedimiento de amplificación como se realiza en tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa como se describe en Dieffenbach CW y GS Dveksler (1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY).

Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tm) del complejo de unión a ácido nucleico, como se explica en Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA), y confieren una "rigurosidad" definida como se explica a continuación.

La rigurosidad de hibridación se refiere a condiciones en las que los híbridos de ácidos polinucleicos son estables. Dichas condiciones son evidentes para los especialistas en el campo. Como se sabe por los especialistas en la técnica, la estabilidad de los híbridos se refleja en la temperatura de fusión (Tm) del híbrido que disminuye aproximadamente 1 a 1,5ºC con cada disminución del 1% en la homología de secuencia. En general, la estabilidad de un híbrido es una función de la concentración de ión sodio y la temperatura. Típicamente, la reacción de hibridación se realiza en condiciones de rigurosidad más alta, seguido por lavados de rigurosidad variada.

Como se usa en este documento, rigurosidad alta se refiere a condiciones que permiten la hibridación de solo las secuencias de ácidos nucleicos que forman híbridos estables en Na+ 1 M a 65-68ºC.

La rigurosidad máxima típicamente sucede a aproximadamente Tm-5ºC (5ºC por debajo de la Tm de la sonda).

La alta rigurosidad sucede a aproximadamente 5ºC a 10ºC por debajo de la Tm de la sonda. Se pueden proporcionar condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, por hibridación en una solución acuosa que contiene 6 x SSC, 5 x solución de Denhardt, SDS al 1% (dodecilsulfato sódico), Na+ pirofosfato 0,1 M y 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado como competidor no específico. Después de la hibridación, puede hacerse un lavado de alta rigurosidad en varias etapas, con un lavado final (aproximadamente 30 minutos) a la temperatura de hibridación en 0,2-0,1 x SSC, SDS al 0,1%.

La rigurosidad moderada, o intermedia, típicamente sucede a aproximadamente 10ºC a 20ºC por debajo de la Tm de la sonda.

La rigurosidad baja típicamente sucede a aproximadamente 20ºC a 25ºC por debajo de la Tm de la sonda.

Como se entenderá por los especialistas en la técnica, una hibridación de rigurosidad máxima puede usarse para identificar o detectar las secuencias polinucleotídicas idénticas mientras que puede usarse una hibridación de rigurosidad intermedia (o baja) para identificar o detectar secuencias polinucleotídicas similares o relacionadas.

Rigurosidad moderada se refiere a condiciones equivalentes a hibridación en solución descrita anteriormente pero a aproximadamente 60-62ºC. En ese caso el lavado final se realiza a la temperatura de hibridación en 1 x SSC, SDS al 0,1%.

Rigurosidad baja se refiere a condiciones equivalentes a hibridación en solución descrita anteriormente a aproximadamente 50-52ºC. En ese caso, el lavado final se realiza a la temperatura de hibridación en 2 x SSC, SDS al 0,1%.

Se entiende que estas condiciones pueden adaptarse y duplicarse usando una diversidad de tampones, por ejemplo, tampones basados en formamida, y temperaturas. La solución de Denhardt y SSC son bien conocidos por los especialistas en la técnica como otros tampones de hibridación apropiados (véase, por ejemplo Sambrook, y col., eds (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York o Ausubel, y col., eds. (1990) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.). Las condiciones óptimas de hibridación tienen que determinarse empíricamente, ya que la longitud y el contenido en GC de la sonda también juegan un papel.

Los polinucleótidos de la invención capaces de hibridar selectivamente con las secuencias de nucleótidos presentadas en este documento, o con sus complementarios, serán de al menos un 95%, preferiblemente al menos un 98% homólogos con las secuencias de nucleótidos correspondientes presentadas en este documento sobre una región de al menos 25, preferiblemente al menos 30, por ejemplo al menos 40, 60 ó 100 o más nucleótidos contiguos.

El término "que puede hibridar selectivamente" significa que el polinucleótido usado como sonda se usa en condiciones donde se encuentra que un polinucleótido diana de la invención hibrida con la sonda a un nivel significativamente por encima del de fondo. La hibridación de fondo puede suceder a causa de otros polinucleótidos presentes, por ejemplo, en la biblioteca de ADNc o ADN genómico a explorar. En este caso, el fondo implica un nivel de señal generado por interacción entre la sonda y un miembro de ADN no específico de la biblioteca que es de menos de 10 veces, preferiblemente de menos de 100 veces la intensidad de la interacción específica observada con el ADN diana. La intensidad de interacción puede medirse, por ejemplo, por radiomarcaje de la sonda, por ejemplo, con ^{32}P.

La presente solicitud también describe secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con una cualquiera o más de las secuencias de nucleótidos de la presente invención en condiciones rigurosas (por ejemplo, 65ºC 7 0,1 x SSC
{1 x SSC = NaCl 0,15 M, Na_{3}Citrato 0,015 M pH 7,0}).

Cuando el polinucleótido de la presente invención es de doble hélice, ambas hélices del dúplex, individualmente o en combinación, se incluyen por la presente invención. Cuando el polinucleótido es de hélice única, se entiende que la secuencia complementaria de ese polinucleótido también se incluye en el alcance de la presente invención.

Los polinucleótidos que no son 100% homólogos a las secuencias de la presente invención pero que pertenecen al alcance de la invención pueden obtenerse de varias formas. Otras variantes de las secuencias descritas en este documento pueden obtenerse por ejemplo sondeando bibliotecas de ADN fabricadas a partir de un intervalo de individuos, por ejemplo individuos de diferentes poblaciones. Además, pueden obtenerse otros homólogos virales/bacterianos, o celulares, particularmente homólogos celulares encontrados en células de mamífero (por ejemplo, células de rata, ratón, bovinas y de primate), y dichos homólogos y fragmentos de los mismos en general serán capaces de hibridar selectivamente con las secuencias mostradas en la lista de secuencias en este documento. Dichas secuencias pueden obtenerse sondeando bibliotecas de ADNc fabricadas a partir de o bibliotecas de ADN genómico a partir de otra especie animal, y sondeando dichas bibliotecas con sondas que comprenden toda o parte de la secuencia en la lista de secuencias adjunta en condiciones de rigurosidad media a alta. Se aplican consideraciones similares para obtener homólogos de especies y variantes alélicas de las secuencias polipeptídicas o de nucleótidos de la invención.

Las variantes y homólogos de cepa/especie también pueden obtenerse usando PCR degenerada, que usará cebadores diseñados para secuencias diana en las variantes y homólogos que codifican secuencias de aminoácidos conservadas en las secuencias de la presente invención. Las secuencias conservadas pueden predecirse, por ejemplo, por alineamiento de las secuencias de aminoácidos a partir de varias variantes/homólogos. Los alineamientos de secuencia pueden realizarse usando software informático conocido en la técnica. Por ejemplo, se usa ampliamente el programa GCG Wisconsin PileUp.

Los cebadores usados en PCR degenerada contendrán una o más posiciones degeneradas y se usarán en condiciones de rigurosidad inferior que las usadas para las secuencias de clonación con cebadores de secuencia única frente a secuencias conocidas.

Como alternativa, dichos polinucleótidos pueden obtenerse por mutagénesis dirigida de sitio de secuencias caracterizadas. Esto puede ser útil cuando, por ejemplo, se requieran cambios de codón silenciosos en secuencias para optimizar preferencias de codón para una célula huésped particular en la que las secuencias polinucleotídicas se están expresando. Pueden desearse otros cambios de secuencia para introducir sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, o para alterar la propiedad o función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos.

Los polinucleótidos de la invención pueden usarse para producir un cebador, por ejemplo, un cebador de PCR, un cebador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda, por ejemplo, marcada con un marcador de revelado por medios convencionales usando marcadores radiactivos o no radiactivos, o los polinucleótidos pueden clonarse en vectores. Dichos cebadores, sondas y otros fragmentos serán de al menos 25, preferiblemente al menos 30 ó 40 nucleótidos de longitud, y también se incluyen por el término de polinucleótidos de la invención como se usa en este documento.

Los polinucleótidos tales como polinucleótidos de ADN y sondas de acuerdo con la invención pueden producirse de manera recombinante, sintética o por cualquier medio disponible por los especialistas en la técnica. También pueden clonarse por técnicas convencionales.

Los polinucleótidos más largos generalmente se producirán usando medios recombinantes, por ejemplo, usando técnicas de clonación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Esto implicará fabricar un par de cebadores (por ejemplo, de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos) que flanquean una región de la secuencia de dirección de lípidos que se desea clonar, poner los cebadores en contacto con el ARNm o ADNc obtenido de una célula animal o humana, realizar una reacción en cadena de la polimerasa en condiciones que provoquen la amplificación de la región deseada, aislar el fragmento amplificado (por ejemplo, purificando la mezcla de reacción en un gel de agarosa) y recuperar el ADN amplificado. Los cebadores pueden diseñarse para que contengan sitios de reconocimiento de enzimas de restricción apropiados de modo que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonación apropiado.

Secuencias Reguladoras

Preferiblemente, el polinucleótido de la presente invención está unido de manera operativa a una secuencia reguladora, que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificante, tal como por la célula huésped elegida. A modo de ejemplo, la presente invención incluye un vector que comprende el polinucleótido de la presente invención unido de manera operativa a dicha secuencia reguladora, es decir, el vector es un vector de expresión.

El término "unido de manera operativa" se refiere a una yuxtaposición donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de su modo pretendido. Una secuencia reguladora "unida de manera operativa" a una secuencia codificante está ligada de modo que la expresión de la secuencia codificante se consigue en una condición compatible con las secuencias de control.

El término "secuencias reguladoras" incluye promotores y potenciadores y otras señales de regulación de la expresión.

El término "promotor" se usa en el sentido normal de la técnica, por ejemplo, un sitio de unión a ARN polimerasa.

La expresión potenciada del polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente invención también puede conseguirse por la selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo, regiones promotoras, líder de secreción y terminadoras, que sirven para aumentar la expresión y, si se desea los niveles de secreción de la proteína de interés a partir de un huésped de expresión elegido y/o para proporcionar el control inducible de la expresión del polipéptido de la presente invención.

Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos de la presente invención puede estar unida de manera operativa al menos a un promotor.

A parte del promotor nativo del gen que codifica el polipéptido de la presente invención, pueden usarse otros promotores para dirigir la expresión del polipéptido de la presente invención. El promotor puede seleccionarse por su eficacia en dirigir la expresión del polipéptido de la presente invención en el huésped de expresión deseado.

En otra realización, puede seleccionarse un promotor constitutivo para dirigir la expresión del polipéptido deseado de la presente invención. Dicha construcción de expresión puede proporcionar ventajas adicionales ya que evita la necesidad de cultivar los huéspedes de expresión en un medio que contenga un sustrato de inducción.

Los ejemplos de promotores constitutivos fuertes y/o inducibles que se prefieren para su uso en huéspedes de expresión fúngicos son los que se obtienen de los genes fúngicos para los promotores de xilanasa (xlnA), fitasa, ATP-sintetasa, subunidad 9 (oliC), triosafosfato isomerasa (tpi), alcohol deshidrogenasa (AdhA), \alpha-amilasa (amy), amiloglucosidasa (AG - del gen glaA), acetamidasa (amdS) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gpd).

Los ejemplos de promotores de levaduras fuertes son los que se pueden obtener de los genes para la alcohol deshidrogenasa, lactasa, 3-fosfogliceratoquinasa y triosafosfato isomerasa.

Los ejemplos de promotores bacterianos fuertes son los promotores de \alpha-amilasa y SP02 así como promotores de genes de proteasa extracelular.

También pueden usarse promotores híbridos para mejorar la regulación inducible de la construcción de expresión.

El promotor puede incluir adicionalmente características para asegurar o para aumentar la expresión en un huésped apropiado. Por ejemplo, las características pueden ser regiones conservadas tales como una caja Pribnow o una caja TATA. El promotor también puede contener otras secuencias que afecten (tal como para mantener, potenciar, disminuir) los niveles de expresión de la secuencia de nucleótidos de la presente invención. Por ejemplo, otras secuencias apropiadas incluyen el intrón Sh1 o un intrón ADH. Otras secuencias incluyen elementos inducibles - tales como elementos inducibles por temperatura, compuesto químico, luz o estrés. Además, pueden estar presentes elementos apropiados para potenciar la trascripción o traducción. Un ejemplo del último elemento es la secuencia señal 5' TMV (véase, Sleat Gene 217 [1987] 217-225; y Dawson Plant Mol. Biol. 23 [1993] 97).

Secreción

A menudo, es deseable para el polipéptido de la presente invención que a secretarse a partir del huésped de expresión en el medio de cultivo a partir del cual el polipéptido de la presente invención puede recuperarse más fácilmente. De acuerdo con la presente invención, la secuencia líder de secreción puede seleccionarse en base al huésped de expresión deseado. También pueden usarse secuencias señal híbridas con el contexto de la presente invención.

Los ejemplos típicos de secuencias líder de secreción heterólogas son las que se originan del gen de amiloglucosidasa (AG) fúngica (glaA - las versiones de 18 y 24 aminoácidos, por ejemplo, de Aspergillus), el gen del factor a (levaduras, por ejemplo, Saccharomyces y Kluyveromyces) o el gen de \alpha-amilasa (Bacillus).

Construcciones

El término "construcción" - que es sinónimo de términos tales como "conjugado", "casete" e "híbrido" - incluye la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención unida directa o indirectamente a un promotor. Un ejemplo de una unión indirecta es el suministro de un grupo espaciador apropiado tal como una secuencia intrónica, tal como el intrón Sh1 o el intrón ADH, entre el promotor y la secuencia de nucleótidos de la presente invención. Lo mismo es cierto para el término "fusionado" en relación con la presente invención, que incluye unión directa o indirecta. En cada caso, los términos no incluyen la combinación natural de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína asociada de manera habitual con el promotor génico de tipo silvestre y cuando ambos están en su medio natural.

La construcción también puede contener o expresar un marcador, que permite la selección de la construcción genética en, por ejemplo, una bacteria, preferiblemente del género Bacillus, tal como Bacillus subtilis, o plantas en las que se ha transferido. Existen diversos marcadores que pueden usarse, tales como por ejemplo los que codifican la manosa-6-fosfato isomerasa (especialmente para plantas) o los marcadores que proporcionan resistencia a antibióticos - por ejemplo, resistencia a G418, higromicina, bleomicina, kanamicina y gentamicina.

Preferiblemente la construcción de la presente invención comprende al menos la secuencia de nucleótidos de la presente invención unida de manera operativa a unpromotor.

Vectores

El término "vector" incluye vectores de expresión y vectores de transformación y vectores lanzadera.

El término "vector de expresión" significa una construcción capaz de la expresión in vivo o in vitro.

El término "vector de transformación" significa una construcción capaz de transferirse de una entidad a otra entidad - que puede ser de la misma especie o puede ser de diferente especie. Si la construcción es capaz de transferirse de una especie a otra - tal como de un plásmido de E. coli a una bacteria, tal como del genero Bacillus, entonces el vector de transformación a veces se llama "vector lanzadera". También puede ser una construcción capaz de transferirse de un plásmido de E. coli a una Agrobacterium a una planta.

Los vectores de la presente invención pueden transformarse en una célula huésped apropiada como se describe a continuación para proporcionar la expresión de un polipéptido de la presente invención. Por tanto, en un aspecto adicional la presente solicitud describe un procedimiento para preparar polipéptidos de acuerdo con la presente invención que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión como se ha descrito anteriormente en condiciones para proporcionar la expresión por el vector de una secuencia codificante que codifica los polipéptidos, y recuperar los polipéptidos expresados.

Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores plasmídicos, virales o fágicos con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor.

Los vectores de la presente invención pueden contener uno o más genes marcadores de selección. Los sistemas de selección más apropiados para microorganismos industriales son los formados por el grupo de marcadores de selección que no requieren una mutación en el organismo huésped. Los ejemplos de marcadores de selección fúngicos son los genes para acetamidasa (amdS), ATP sintetasa, subunidad 9 (oliC), orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa (pvrA), resistencia a pleomicina y benomil (benA). Los ejemplos de marcadores de selección no fúngicos son el gen de resistencia a G418 bacteriano (esto también puede usarse en levaduras, pero no en hongos filamentosos), el gen de resistencia a ampicilina (E. coli), el gen de resistencia a neomicina (Bacillus) y el gen uidA de E. coli, que codifica \beta-glucuronidasa (GUS).

Los vectores pueden usarse in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o usarse para transfectar o transformar una célula huésped.

Por tanto, los polinucleótidos de la presente invención pueden incorporarse en un vector recombinante (típicamente un vector replicable), por ejemplo un vector de clonación o expresión. El vector puede usarse para replicar el ácido nucleico en una célula huésped compatible. Por tanto en una realización adicional, la presente solicitud describe un procedimiento para fabricar polinucleótidos de la presente invención introduciendo un polinucleótido de la presente invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula huésped compatible, y haciendo crecer la célula huésped en condiciones que provocan la replicación del vector. El vector puede recuperarse de la célula huésped. Las células huésped apropiadas se describen a continuación junto con los vectores de expresión.

La presente invención también se refiere también al uso de células huésped modificadas genéticamente que expresan una PDEXV o variante, homólogo, fragmento o derivado de la misma en procedimientos de exploración para la identificación de inhibidores y antagonistas de la PDEXV que podría modular la actividad fosfodiesterasa modulando de este modo los niveles de nucleótido cíclico. Dichas células huésped modificadas genéticamente pueden usarse para explorar bibliotecas de péptidos o moléculas orgánicas capaces de modular la actividad de PDEXV. Los antagonistas e inhibidores de PDEXV, tales como anticuerpos, péptidos o moléculas orgánicas pequeñas proporcionarán la base para las composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades asociadas con, por ejemplo, PEDXV. Dichos inhibidores o antagonistas pueden administrarse solos o en combinación con otros agentes terapéuticos para el tratamiento de dichas enfermedades.

La presente invención también se refiere a vectores de expresión y células huésped que comprenden secuencias polinucleotídicas que codifican PDEXV o una variante de la misma para la producción in vivo o in vitro de la proteína PDEXV o para explorar agentes que puedan afectar a la expresión o actividad de PEDXV.

Tejido

El término "tejido" como se usa en este documento incluye tejido per se y órgano.

Células Huésped

El término "célula huésped" - en relación con la presente invención incluye cualquier célula que podría comprender una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína recombinante de acuerdo con la presente invención y/o productos obtenidos de la misma, donde un promotor puede permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención cuando está presente en la célula huésped.

Por tanto, una realización adicional de la presente invención proporciona células huésped trasformadas o transfectadas con un polinucleótido de la presente invención. Preferiblemente dicho polinucleótido se alberga en un vector para la replicación y expresión de dichos polinucleótidos. Las células se elegirán para que sean compatibles con dicho vector y pueden, por ejemplo, ser células procariotas (por ejemplo bacterianas), fúngicas, de levaduras o vegetales.

La bacteria gram-negativa E. coli se usa ampliamente como huésped para la expresión de genes heterólogos. Sin embargo, tienden a acumularse grandes cantidades de proteína heteróloga en el interior de la célula. La purificación posterior de la proteína deseada a partir del total de las proteínas intracelulares de E. coli puede a veces ser difícil.

En contraste a E. coli, bacterias del género Bacillus son muy apropiadas como huéspedes heterólogos a causa de su capacidad para secretar proteínas en el medio de cultivo. Otras bacterias apropiadas como huéspedes son las de los géneros Streptomyces y Pseudomonas.

Dependiendo de la naturaleza del polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente invención, y/o lo deseable del procesamiento adicional de la proteína expresada, pueden preferirse huéspedes eucariotas tales como levaduras y otros hongos. En general, las células de levaduras se prefieren sobre células fúngicas a causa de su facilidad de manipulación. Sin embargo, algunas proteínas se secretan mal a partir de la célula de levadura, o en algunos casos no se procesan apropiadamente (por ejemplo, hiperglicosilación en levaduras). En estos casos, debe seleccionarse un organismo huésped fúngico diferente.

Los ejemplos de huéspedes de expresión apropiados dentro del alcance de la presente invención son hongos tales como especies Aspergillus (tales como las descritas en los documentos EP-A-0184438 y EP-A-0284603) y especies Trichoderma; bacterias tales como especies Bacillus (tales como las descritas en los documentos EP-A-0134048 y EP-A-0253455), especies Streptomyces y especies Pseudomonas; y levaduras tales como especies Kluyveromyces (tales como las descritas en los documentos EP-A-0096430 y EP-A-0301670) y especies Saccharomyces. A modo de ejemplo, pueden seleccionarse huéspedes de expresión típicos de Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus orvzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis y Saccharomyces cerevisiae.

El uso de células huésped apropiadas - tales como células de levadura, fúngicas y vegetales - pueden proporcionar modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, miristoilación, glicosilación, truncado, lipidación y fosforilación de tirosina, serina o treonina) según sea necesario para conferir la actividad biológica óptima a los productos de expresión recombinante de la presente invención.

Organismo

El término "organismo" en relación con la presente invención incluye cualquier organismo no humano que podría comprender la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína recombinante de acuerdo con la presente invención y/o productos obtenidos de la misma, donde un promotor puede permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención cuando está presente en el organismo. Los ejemplos de organismos pueden incluir un hongo, levadura o una planta.

El término "organismo transgénico" en relación con la presente invención incluye cualquier organismo no humano que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de acuerdo con la presente invención y/o productos obtenidos de la misma, donde el promotor puede permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención en el organismo. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos se incorpora en el genoma del organismo.

El término "organismo transgénico" no incluye la secuencia codificante de nucleótidos nativa de acuerdo con la presente invención en su medio natural cuando está bajo en control de su promotor nativo, que también está en su medio natural. Además, la presente invención no incluye la proteína nativa de acuerdo con la presente invención cuando está en su medio natural y cuando se ha expresado por su secuencia codificante de nucleótidos nativa que también está en su medio natural y cuando la secuencia de nucleótidos está bajo el control de su promotor nativo que también está en su medio natural.

Por lo tanto, el organismo transgénico de la presente invención incluye un organismo que comprende una cualquiera de, o combinaciones de, la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la presente invención, construcciones de acuerdo con la presente invención (incluyendo combinaciones de las mismas), vectores de acuerdo con la presente invención, plásmidos de acuerdo con la presente invención, células de acuerdo con la presente invención, tejidos de acuerdo con la presente invención o los productos de los mismos. La célula u organismo transformado podría preparar cantidades aceptables del compuesto deseado, que podría retirarse fácilmente de la célula o el organismo.

Transformación de Células Huésped/Organismos Huésped

Como se ha indicado anteriormente, el organismo huésped puede ser un organismo procariota o eucariota. Los ejemplos de huéspedes procariotas apropiados incluyen E. coli y Bacillus subtilis. Los contenidos sobre la transformación de huéspedes procariotas está bien documentado en la técnica, por ejemplo, véase Sambrook y col (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) y Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.

Si se usa un huésped procariota entonces la secuencia de nucleótidos puede necesitar modificarse apropiadamente antes de la transformación - tal como por retirada de los intrones.

En otra realización el organismo transgénico no humano puede ser una levadura. A este respecto, la levadura también puede usarse ampliamente como vehículo para la expresión de genes heterólogos. La especie Saccharomyces cerevisiae tiene una larga historia de uso industrial, incluyendo su uso para la expresión de genes heterólogos. La expresión de genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae se ha analizado por Goodey y col (1987, Yeast Biotechnology, D R Berry y col, eds, páginas 401-429, Allen and Unwin, Londres) y por King y col (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G T Yarronton, eds, páginas 107-133, Blackie, Glasgow).

Por varias razones Saccharomyces cerevisiae está bien preparado para la expresión de genes heterólogos. Primero, es no patogénico para humanos y es incapaz de producir ciertas endotoxinas. Segundo, tiene una larga historia de uso seguro después de siglos de explotación comercial para diversos propósitos. Esto ha conducido a una aceptabilidad pública amplia. Tercero, el uso comercial extensivo y la investigación ferviente del organismo ha dado como resultado una riqueza de conocimiento acerca de la genética y fisiología así como las características de fermentación a gran escala de Saccharomyces cerevisiae.

Se proporciona un análisis de los principios de la expresión de genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae y la secreción de productos génicos por E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeast, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2ª edición, Academic Press Ltd.).

Están disponibles varios tipos de vectores de levaduras, incluyendo vectores de integración, que requieren la recombinación con el genoma huésped para su mantenimiento, y vectores plasmídicos de replicación autónoma.

Para preparar el Saccharomyces tansgénico, se preparan construcciones de expresión insertando la secuencia de nucleótidos de la presente invención en una construcción diseñada para la expresión en levaduras. Se han desarrollado varios tipos de construcciones usadas para la expresión heteróloga. Las construcciones contienen un promotor activo en levaduras fusionado con la secuencia de nucleótidos de la presente invención, habitualmente se usa un promotor de origen de levaduras, tal como el promotor GAL1. Habitualmente se usa una secuencia señal de origen de levaduras, tal como la secuencia que codifica el péptido señal SUC2. Un terminador activo en levaduras termina el sistema de expresión.

Para la transformación de levaduras se han desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo, un Saccharomyces transgénico de acuerdo con la presente invención puede prepararse siguiendo los contenidos de Hinnen y col (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104); e Ito, H y col (1983, J Bacteriology 153, 163-168).

Las células de levadura transformadas se seleccionan usando diversos marcadores de selección. Entre los marcadores usados para la transformación hay varios marcadores auxotróficos tales como LEU2, HIS4 y TRP1, y marcadores de resistencia a antibiótico dominantes tales como los marcadores del antibiótico de aminoglicósido, por ejemplo, G418.

Otro organismo huésped es una planta. El principio básico en la construcción de plantas modificadas genéticamente es insertar la información genética en el genoma vegetal para obtener un mantenimiento estable del material genético insertado.

Existen varias técnicas para insertar la información genética, siendo los dos principios generales la introducción directa de la información genética y la introducción de la información genética por el uso de un sistema vectorial. Puede encontrarse un análisis de las técnicas generales en artículos por Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech marzo/abril 1994 17-27). Pueden encontrarse contenidos adicionales sobre la trasformación vegetal en el documento EP-A-0449375.

Por tanto, la presente solicitud también describe un procedimiento para trasformar una célula huésped con una secuencia de nucleótidos mostrada en la lista de secuencias adjunta o una variante de la misma.

Las células huésped transformadas con la secuencia que codifica el nucleótido PDE pueden cultivarse en condiciones apropiadas para la expresión y recuperación de la proteína codificada a partir del cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante puede secretarse o puede estar contenida de manera intracelular dependiendo de la secuencia y/o el vector usado. Como se entenderá por los especialistas en la técnica, los vectores de expresión que contienen secuencias que codifican PDE pueden diseñarse con secuencias señal, que dirigen la secreción de las secuencias que codifican PDE a través de una membrana celular procariota o eucariota particular. Otras construcciones recombinantes pueden unir la secuencia que codifica PDE con la secuencia de nucleótidos que codifica un dominio polipeptídico, que facilitará la purificación de proteínas solubles (Kroll DJ y col (1993) DNA Cell Biol 12:441-53, véase también el análisis anterior de vectores que contienen proteínas de fusión).

Producción del Polipéptido

De acuerdo con la presente solicitud, la producción del polipéptido de la presente invención puede verse afectada por el cultivo de, por ejemplo, huéspedes de expresión microbianos, que se han transformado con uno o más polinucleótidos de la presente invención, en un medio de fermentación de nutrientes convencional. La selección del medio apropiado puede basarse en la elección de huéspedes de expresión y/o basarse en las necesidades reguladoras de la construcción de expresión. Dichos medios son bien conocidos por los especialistas en la técnica. El medio puede, si se desea, contener componentes adicionales que favorecen a los huéspedes de expresión transformados sobre otros microorganismos potencialmente contaminantes.

Por tanto, la presente solicitud también describe un procedimiento para producir un polipéptido que tiene actividad de PDEXV, comprendiendo el procedimiento las etapas de a) transformar una célula huésped con una secuencia de nucleótidos mostrada en la lista de secuencias adjunta o una variante de la misma; y b) cultivar la célula huésped trasformada en condiciones apropiadas para la expresión de dicho polipéptido.

La presente solicitud también describe un procedimiento para producir un polipéptido que tiene actividad de PDEXV, comprendiendo el procedimiento las etapas de a) cultivar una célula huésped que se a trasformado con una secuencia de nucleótidos mostrada en la lista de secuencias adjunta o una variante de la misma en condiciones apropiadas para la expresión de dicho polipéptido; y b) recuperar dicho polipéptido del cultivo de la célula
huésped.

La presente solicitud también describe un procedimiento para producir un polipéptido que tiene actividad de PDEXV, comprendiendo el procedimiento las etapas de a) trasformar una célula huésped con una secuencia de nucleótidos mostrada en la lista de secuencias adjunta o una variante de la misma; b) cultivar la célula huésped transformada en condiciones apropiadas para la expresión de dicho polipéptido; y c) recuperar dicho polipéptido del cultivo de la célula huésped.

Ribozimas

Las ribozimas son moléculas de ARN enzimático capaces de catalizar la escisión específica de ARN. El mecanismo de la acción de la ribozima implica la hibridación específica de secuencia de la molécula de ribozima con el ARN diana complementario, seguido por una escisión endonucleolítica. Las moléculas de ribozima con motivo de cabeza de martillo modificadas pueden catalizar especifica y eficazmente le escisión endonucleolítica de secuencias de ARN de PDE.

Los sitios de escisión de ribozima específicos en cualquier ARN potencial diana se identifican en un principio por el examen de la molécula diana para sitios de escisión por ribozima, que incluyen las siguientes secuencias, GUA, GUU y GUC. Una vez identificados, las secuencias de ARN cortas entre 15 y 20 ribonucleótidos que corresponden a la región del gen diana que contiene el sitio de escisión pueden evaluarse para características estructurales secundarias que pueden hacer a la secuencia oligonucleotídica inoperable. Lo apropiado de las dianas candidatas también puede evaluarse ensayando la accesibilidad a hibridación con oligonucleótidos complementarios usando ensayos de protección de ribonucleasa.

Tanto las moléculas de ARN y ADN antisentido como las ribozimas de la presente invención pueden prepararse por cualquier procedimiento conocido en la técnica para la síntesis de moléculas de ARN. Estas incluyen técnicas para sintetizar químicamente oligonucleótidos tales como síntesis química con fosforamidita en fase sólida. Como alternativa, las moléculas de ARN pueden generarse por transcripción in vitro o in vivo de secuencias de ADN que codifican la molécula de ARN antisentido. Dichas secuencias de ADN pueden incorporarse en una amplia diversidad de vectores con promotores de la ARN polimerasa apropiados tales como T7 o SP6. Como alternativa, pueden introducirse construcciones de ADNc antisentido que sintetizan ARN antisentido de manera constitutiva o inducible en líneas celulares, células o tejidos.

Detección

La presencia de la secuencia que codifica el polinucleótido de PED puede detectarse por hibridación ADN-ADN o ADN-ARN o amplificación usando sondas, porciones o fragmentos de la secuencia presentada en la lista de secuencias adjunta. Los ensayos basados en la amplificación de ácidos nucleicos implican el uso de oligonucleótidos u oligómeros basados en la secuencia codificante de PDE para detectar transformantes que contienen ADN o ARN de PDE. Como se usa en este documento "oligonucleótidos" u "oligómeros" puede referirse a una secuencia de ácidos nucleicos de al menos aproximadamente 10 nucleótidos y como mucho aproximadamente 60 nucleótidos, preferiblemente aproximadamente 15 a 30 nucleótidos, y más preferiblemente aproximadamente 20-25 nucleótidos que puede usarse como sonda o amplímero. Preferiblemente, los oligonucleótidos se obtienen de la región 3' de la secuencia de nucleótidos mostrada en la lista de secuencias adjunta.

Se conocen en la técnica una diversidad de protocolos para detectar y medir la expresión de polipéptido PDE, tal como usando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para la proteína. Los ejemplos incluyen ensayo inmunoabsorbente de enzimas unidas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y separación de células activadas por fluorescencia (FACS). Se prefiere un inmunoensayo de base monoclonal de dos sitios utilizando anticuerpos monoclonales reactivos frente a dos epítopes no interferentes en los polipéptidos PDE, pero puede emplearse un ensayo de unión competitiva. Se describen estos y otros ensayos, entre otros sitios, en Hampton R y col (1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul MN) y Maddox DE y col (1983, J Exp Med 158:121 1).

Se conocen por los especialistas en la técnica una amplia diversidad de marcadores y técnicas de conjugación y pueden usarse en diversos ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Los medios para producir hibridación marcada o sondas de PCR para la detección de secuencias polinucleotídicas de PDE incluyen oligomarcaje, traslado de mella, marcaje final o amplificación por PCR usando un nucleótido marcado. Como alternativa, la secuencia codificante de PDE, o cualquier porción de la misma, puede clonarse en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Dichos vectores son conocidos en la técnica, están disponibles en el mercado, y pueden usarse para sintetizar sondas de ARN in vitro por la adición de una ARN polimerasa apropiada tal como T7, T3 o SP6 y nucleótidos marcados.

Varias compañías tales como Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI), y US Biochemical Corp (Cleveland, OH) suministran kits comerciales y protocolos para estos procedimientos. Las moléculas informadoras apropiadas o marcadores incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, o cromogénicos así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares. Las patentes que contienen el uso de dichos marcadores incluyen los documentos US-A-3817837; US-A-3850752; US-A-3939350; US-A-3996345; US-A-4277437; US-A-4275149 y US-A-4366241. Además, pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes como se muestra en el documento US-A-4816567.

Los procedimientos adicionales para cuantificar la expresión de una molécula particular incluyen radiomarcaje (Melby PC y col 1993 J Immunol Methods 159:235-44) o nucleótidos biotinilados (Duplaa C y col 1993 Anal Biochem 229-36), co-amplificación de un ácido nucleico de control, y curvas patrón en las que los resultados experimentales se interpolan. La cuantificación de muestras múltiples puede acelerarse realizando el ensayo en un formato ELISA donde el oligómero de interés está presente en diversas diluciones y una respuesta espectrofotométrica o calorimétrica da una cuantificación rápida.

Aunque la presencia/ausencia de la expresión del gen marcador sugiere que el gen de interés también está presente, su presencia y expresión debe confirmarse. Por ejemplo, si la secuencia que codifica PDE se inserta en la secuencia del gen marcador, las células recombinantes que contienen regiones que codifican PDE pueden identificarse por la ausencia de la función del gen marcador. Como alternativa, puede colocarse un gen marcador en tándem con una secuencia que codifica PDE bajo el control de un promotor único. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o selección habitualmente también indica la expresión de PDE.

Como alternativa, las células huésped, que contienen la secuencia codificante para PDE y expresan las regiones que codifican PDE, pueden identificarse por una diversidad de procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica. Estos procedimientos incluyen, aunque sin limitación, hibridación ADN-ADN o ADN-ARN y técnicas de bioensayo o inmunoensayo de proteína, que incluyen tecnologías basadas en membrana, basadas en solución, o basadas en chip para la detección y/o cuantificación del ácido nucleico o proteína.

Anticuerpos

La secuencia de aminoácidos de la presente invención también puede usarse para generar anticuerpos - tal como por el uso de técnicas convencionales - frente a la secuencia de aminoácidos.

Pueden usarse procedimientos bien conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos frente a polipéptidos PDEXV. Dichos anticuerpos incluyen, aunque sin limitación, policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena única, fragmentos Fab y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab. Se prefieren especialmente anticuerpos neutralizantes, es decir, los que inhiben la actividad biológica de polipéptidos PDE, para diagnóstico y terapia.

Para la producción de anticuerpos, pueden inmunizarse diversos huéspedes incluyendo cabras, conejos, ratas, ratones, etc., por inyección con el inhibidor o cualquier porción, variante, homólogo, fragmento o derivado del mismo u oligopéptido que mantenga las propiedades inmunogénicas. Dependiendo de la especie huésped, pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Dichos adyuvantes incluyen, aunque sin limitación, adyuvante de Freund, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana, y dinitrofenol. BCG (Bacilli Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum son adyuvantes humanos potencialmente útiles, que pueden emplearse.

Los anticuerpos monoclonales frente a la secuencia de aminoácidos también pueden preparase usando cualquier técnica, que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, aunque sin limitación, la técnica de hibridoma descrita en un principio por Koehler y Milstein (1975 Nature 256:495-497), la técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor y col (1983) Immunol Today 4:72; Cote y col(1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030) y la técnica de hibridoma de EBV (Cole y col (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, páginas 77-96). Además, pueden usarse las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el corte y empalme de genes de anticuerpos de ratón con genes de anticuerpos humanos para obtener una molécula con especificidad antigénica y actividad biológica apropiadas (Morrison y col (1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855; Neuberger y col (1984) Nature 312:604-608; Takeda y col (1985) Nature 314:452-454). Como alternativa, pueden adaptarse las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena única (documento US-A-4946779) para producir anticuerpos de cadena única específicas inhibidoras.

Los anticuerpos también pueden producirse induciendo la producción in vivo en la población de linfocitos o explorando bibliotecas de inmunoglobulina recombinante o paneles de reactivos de unión altamente específicos como se describe en Orlandi y col (1989, Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837), y Winter G y Milstein C (1991; Nature 349:293-299).

También pueden generarse fragmentos de anticuerpo, que contienen sitios de unión específicos para PDEXV. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen, aunque sin limitación, los fragmentos F(ab')_{2} que pueden producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')_{2}. Como alternativa, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab para permitir la rápida y fácil identificación de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada (Huse WD y col (1989) Science 256:1275-1281).

Una técnica alternativa implica la exploración de bibliotecas que presentan fagos donde, por ejemplo, el fago expresa fragmentos scFv en la superficie de su cubierta con una amplia diversidad de regiones determinantes de complementariedad (CDR). Esta técnica es bien conocida en la técnica.

Los anticuerpos específicos para PDEXV son útiles para el diagnóstico de afecciones y enfermedades asociadas con la expresión del polipéptido PDEXV. Se conocen bien en la técnica una diversidad de protocolos para ensayos de unión competitiva o inmunorradiométricos usando anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidades establecidas. Dichos inmunoensayos implican típicamente la formación de complejos entre polipéptidos PDEXV y su anticuerpo específico (o molécula de unión a PDEXV similar) y la medida de la formación de complejo. Se prefiere un inmunoensayo de base monoclonal de dos sitios que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos frente a dos epítopes no interferentes en una proteína PDEXV específica, pero también puede emplearse un ensayo de unión competitiva. Estos ensayos se describen en Maddox DE y col(1983, J Exp Med 158:121 1).

Los anticuerpos anti-PDEXV son útiles para el diagnóstico de inflamación, afecciones asociadas con la proliferación de células hematopoyéticas e infección por VIH u otros trastornos o enfermedades caracterizadas por la expresión anormal de una PDEXV. Los ensayos de diagnóstico para una PDEXV incluyen procedimientos que utilizan el anticuerpo y un marcador para detectar un polipéptido PDEXV en fluidos corporales humanos, células, tejidos o secciones o extractos de dichos tejidos. Dichos polipéptidos y anticuerpos pueden usarse con o sin modificación. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos se marcarán uniéndolos, de manera covalente o no covalente, a una molécula informadora. Se conoce una amplia diversidad de moléculas informadoras por los especialistas en la técnica.

Los anticuerpos pueden usarse en un procedimiento para detectar polipéptidos de la invención presentes en muestras biológicas por un procedimiento que comprende: (a) proporcionar un anticuerpo de la invención; (b) incubar la muestra biológica con dicho anticuerpo en condiciones que permiten la formación de un complejo anticuerpo-antígeno; y (c) determinar si se forma el complejo anticuerpo-antígeno que comprende dicho anticuerpo.

Dependiendo de las circunstancias, las muestras apropiadas pueden incluir extractos de tejidos tales como tejidos de cerebro, mama, ovario, pulmón, colon, páncreas, testículos, hígado, músculo y óseo o de crecimientos neoplásicos obtenidos de dichos tejidos.

Los anticuerpos pueden unirse a un soporte sólido y/o compactarse en kits en un recipiente apropiado junto con reactivos apropiados, controles, instrucciones y similares.

Ensayos/Procedimientos de Identificación

La presente solicitud también describe un procedimiento de ensayo para detectar la presencia de PDEXV en células (tal como células humanas) que comprende: (a) realizar una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa sobre ARN (tal como ARN total) de dichas células usando un par de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa que son específicos para PDEXV, como se determina a partir de la secuencia de ADN mostrada en la lista de secuencias adjunta o una variación alélica de la misma; y (b) ensayar la aparición de un fragmento de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de tamaño apropiado - tal como por electroforesis en gel de agarosa.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para identificar agentes (tal como compuestos, otras sustancias o composiciones que comprenden los mismos) que afectan (tal como inhibir o modificar de otro modo) la actividad de PEDXV y/o la expresión de la misma, comprendiendo el procedimiento poner en contacto PDEXV o la secuencia de nucleótidos que codifica la misma con el agente y después medir la actividad de PDEXV y/o la expresión de la misma.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para identificar agentes (tal como compuestos, otras sustancias o composiciones que comprenden los mismos) que afectan selectivamente (tal como inhibir o modificar de otro modo) la actividad de PEDXV y/o la expresión de la misma, comprendiendo el procedimiento poner en contacto PEDXV o la secuencia de nucleótidos que codifica la misma con el agente y después medir la actividad de PEDXV y/o la expresión de la misma.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para identificar agentes (tal como compuestos, otras sustancias o composiciones que comprenden los mismos) que afectan (tal como inhibir o modificar de otra manera) la actividad de PEDXV y/o la expresión de la misma, comprendiendo el procedimiento medir la actividad de PEDXV y/o la expresión de la misma en presencia del agente o después de la adición del agente en: (a) una línea celular en la que se ha incorporado ADN recombinante que comprende la secuencia de ADN mostrada en la lista de secuencias adjunta o una variación alélica de la misma, o (b) una población de células o línea celular que expresa selectivamente de manera natural PDEXV. Preferiblemente, la actividad de PEDXV se determina por el procedimiento de ensayo descrito anteriormente.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para identificar agentes (tal como compuestos, otras sustancias o composiciones que comprenden los mismos) que afectan selectivamente (tal como inhibir o modificar de otra manera) la actividad de PEDXV y/o la expresión de la misma, comprendiendo el procedimiento medir la actividad de PEDXV y/o la expresión de la misma en presencia del agente o después de la adición del agente en: (a) una línea celular en la que se ha incorporado ADN recombinante que comprende la secuencia de ADN mostrada en la lista de secuencias adjunta o una variación alélica de la misma, o (b) una población de células o línea celular que expresa selectivamente de manera natural PEDXV. Preferiblemente, la actividad de PEDXV se determina por el procedimiento de ensayo descrito anteriormente.

La presente invención también proporciona un procedimiento para explorar un agente para la modulación (preferiblemente para modulación específica) de la actividad de PEDXV (o una variante de la misma) o la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la misma (incluyendo una variante de la misma), comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) proporcionar un agente candidato; (b) combinar PEDXV (o la variante de la misma) o la secuencia de nucleótidos que codifica la misma (o la variante de la misma) con el agente candidato durante un tiempo suficiente para permitir la modulación en condiciones apropiadas; y (c) detectar la modulación del agente candidato sobre PEDXV (o la variante de la misma) o la secuencia de nucleótidos que modifica la misma (o la variante de la misma) para determinar si el agente candidato modula la actividad de PEDXV (o la variante de la misma) o la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la misma (o la variante de la misma).

La presente invención también proporciona un procedimiento para explorar un agente para la afinidad de unión específica con PEDXV (o la variante de la misma) o la secuencia de nucleótidos que codifica la misma (incluyendo una variante de la misma), comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) proporcionar un agente candidato; (b) combinar PEDXV (o la variante de la misma) o la secuencia de nucleótidos que codifica la misma (o la variante de la misma) con el agente candidato durante un tiempo suficiente para permitir la unión en condiciones apropiadas; y (c) detectar la unión del agente candidato a PEDXV (o la variante de la misma) o la secuencia de nucleótidos que codifica la misma (o la variante de la misma) para determinar si el agente candidato se une a PEDXV (o la variante de la misma) o la secuencia de nucleótidos que codifica la misma (o la variante de la misma).

La presente invención también proporciona un procedimiento para identificar un agente que es capaz de modular PEDXV, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en contacto el agente con PDEXV (o la variante de la misma) o la secuencia de nucleótidos que codifica la misma (o la variante de la misma), (b) incubar la mezcla de la etapa (a) con un nucleótido cíclico en condiciones apropiadas para la hidrólisis del nucleótido cíclico, (c) medir la cantidad de hidrólisis de nucleótido cíclico, y (d) comparar la cantidad de hidrólisis de nucleótido cíclico de la etapa (c) con la cantidad de hidrólisis de nucleótido cíclico obtenido con PDEXV (o la variante de la misma) o la secuencia de nucleótidos que codifica la misma (o la variante de la misma) incubado con el compuesto, determinando de este modo si el agente afecta (tal como estimular o inhibir) la hidrólisis de nucleótido cíclico.

Por tanto, en ciertas realizaciones de la presente invención, PDEXV o una variante de la misma y/o una línea celular que expresa la PDEXV o una variante de la misma puede usarse para explorar anticuerpos, péptidos, u otro agente, tal como moléculas orgánicas o inorgánicas, que funcionen como moduladores de la actividad fosfodiesterasa o para la expresión de la misma, identificando de este modo un agente terapéutico capaz de modular los niveles de nucleótido cíclico. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PDEXV capaces de neutralizar la actividad de PDEXV pueden usarse para inhibir la hidrólisis por PEDXV de nucleótidos cíclicos, aumentado de este modo sus niveles. Como alternativa, la exploración de bibliotecas de péptidos o bibliotecas orgánicas hechas por química de combinación con PDEXV expresada de manera recombinante o una variante de la misma o líneas celulares que expresan PDEXV o una variante de la misma puede ser útil para la identificación de agentes terapéuticos que funcionen modulando la hidrólisis por PDEXV de nucleótidos cíclicos. Pueden explorarse compuestos sintéticos, productos naturales, y otras fuentes de materiales potencialmente biológicamente activos en varios modos considerados de rutina por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos que codifican la región N-terminal de PDEXV pueden expresarse en una línea celular que puede usarse para explorar moduladores alostéricos, agonistas o antagonistas, de la actividad PDEXV. Como alternativa, las secuencias de nucleótidos que codifican el dominio catalítico conservado de PDEXV pueden expresarse en líneas celulares y usarse para explorar inhibidores de la hidrólisis de nucleótidos cíclicos.

La capacidad de un agente de ensayo para afectar a la actividad de PDEXV o hidrólisis de nucleótido cíclico puede determinarse midiendo los niveles de PDEXV o niveles de nucleótido cíclico (como se describe en Smith y col 1993 Appl. Biochem. Biotechnol. 41:189-218). También están disponibles en el mercado kits de inmunoensayos para la medición de AMPc y GMPc (por ejemplo, Amersham International, Arlington Heights, IL y DuPont, Boston, MA). La actividad de PEDXV también puede controlarse midiendo otras respuestas tales como fosforilación o defosforilación de otras proteínas usando técnicas convencionales desarrolladas para este propósito.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento para identificar un compuesto que es capaz de modular la actividad fosfodiesterasa de nucleótidos cíclicos de una PDEXV, o una variante de la misma, que comprende las etapas de a) poner en contacto el compuesto con una PDEXV, o una variante de la misma, b) incubar la mezcla de la etapa a) con un nucleótido cíclico en condiciones apropiadas para la hidrólisis del nucleótido cíclico; c) medir la cantidad de hidrólisis de nucleótido cíclico; y d) comprar la cantidad de hidrólisis de nucleótido cíclico de la etapa c) con la cantidad de hidrólisis de hidrólisis de nucleótido cíclico obtenida con la PDEXV, o una variante de la misma, incubada sin el compuesto, determinando de este modo si el compuesto estimula o inhibe la hidrólisis de nucleótido cíclico. En una realización del procedimiento, el fragmento puede ser de la región N-terminal de la PDEXV y proporciona un procedimiento para identificar moduladores alostéricos de la PDEXV. En otra realización de la presente invención, el fragmento puede ser de la región carboxi terminal de la PDEXV y proporciona un procedimiento para identificar inhibidores de hidrólisis de nucleótido cíclico.

Un polipéptido PDEXV, sus fragmentos u oligopéptidos inmunogénicos del mismo pueden usarse para explorar compuestos terapéuticos en cualquiera de una diversidad de técnicas de exploración de fármaco. El polipéptido empleado en dicho ensayo puede estar libre en solución, fijado a un soporte sólido, soportado sobre una superficie celular, o localizado intracelularmente. Puede medirse la eliminación de la actividad o la formación de complejos de unión entre un polipéptido PDEXV y el agente que se está ensayando.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento para explorar uno o una pluralidad de compuestos para la modulación (preferiblemente modulación específica, tal como afinidad de unión específica) de PDEXV o la expresión de la misma, o una variante de la misma, que comprende proporcionar uno o una pluralidad de compuestos; combinar una PDEXV o una secuencia de nucleótidos que codifica la misma o una variante de la misma con el compuesto o cada uno de una pluralidad de compuestos durante un tiempo suficiente para permitir la modulación en condiciones apropiadas; y detectar la unión de una PDEXV, o una variante de la misma, a cada uno de la pluralidad de compuestos, identificando de este modo el compuesto o compuestos que modulan una PDEXV o una secuencia de nucleótidos que codifica la misma. En dicho ensayo, la pluralidad de compuestos puede producirse por técnicas de química de combinación conocidas por los especialistas en la técnica.

Otra técnica para exploración de fármaco proporciona una búsqueda de alto rendimiento de compuestos que tienen afinidad de unión apropiada para los polipéptidos PDEXV y se basa en el procedimiento descrito con detalle en Geysen, Solicitud de Patente Europea Nº 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984. En resumen, se sintetizan grandes cantidades de compuestos de ensayo peptídicos pequeños diferentes sobre un sustrato sólido, tal como pines plásticos o alguna otra superficie. Los compuestos de ensayo peptídicos se hacen reaccionar con fragmentos de PDEXV y se lavan. Después se detecta una PDEXV unida - tal como por procedimientos apropiadamente adaptados bien conocidos en la técnica. También puede recubrirse directamente una PDEXV purificada sobre placas para su uso en las técnicas de exploración de fármaco mencionadas anteriormente. Como alternativa, pueden usarse anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo en un soporte sólido.

Esta solicitud también contempla el uso de ensayos de exploración de fármaco competitivos en los que los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse a PDEXV compiten específicamente con un compuesto de ensayo por la unión a PDEXV. De este modo, los anticuerpos pueden usarse para detectar la presencia de cualquier péptido, que forma uno o más determinantes antigénicos con una PDEXV.

El procedimiento de ensayo de la presente invención puede ser una exploración de alto rendimiento (HTS). A este respecto, pueden adaptarse los contenidos del documento WO 84/03564 para la PDE de la presente invención.

Pueden adaptarse los contenidos del documento US-A-5738985 para el procedimiento de ensayo de la presente invención.

Agentes

El agente identificado por los ensayos de la presente invención puede ser, por ejemplo, un compuesto orgánico o un compuesto inorgánico. El agente puede ser, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que es antisentido para toda o parte de las secuencias mostrada en la lista de secuencias adjunta.

La presente solicitud también contempla el uso de un agente que afecta a la actividad de PDEXV (tal como inhibir, modula, o agonizar) en uno cualquiera o más del sistema cardiovascular, el cuerpo cavernoso, riñón, hígado, músculo esquelético, testículo, próstata.

Diagnóstico

La presente solicitud también contempla una composición de diagnóstico para la detección de secuencias polinucleotídicas de PDEXV. La composición de diagnóstico puede comprenden una cualquiera de las secuencias mostradas en la lista de secuencias adjunta o una variante de las mismas.

Para proporcionar una base para el diagnóstico de la enfermedad, deben establecerse valores normales o patrón a partir de la expresión de polipéptido PDEXV. Esto se consigue combinando fluidos corporales o extractos celulares tomados de sujetos normales, animales o humanos, con anticuerpo frente al polipéptido PDEXV en condiciones apropiadas para la formación de complejo, que es bien conocido en la técnica. La cantidad de formación de complejo patrón puede cuantificarse comparándolo con una serie de dilución de controles positivos donde una cantidad conocida de anticuerpo se combina con concentraciones conocidas de un polipéptido PDEXV purificado. Después, los valores patrón obtenidos de muestras normales pueden compararse con valores obtenidos de muestras de sujetos potencialmente afectados por un trastorno o enfermedad relacionado con la expresión de un polipéptido PDEXV. La desviación entre los valores patrón y del sujeto establecen la presencia de la patología.

Un polinucleótido de PDEXV, o cualquier parte del mismo, puede proporcionar la base para un compuesto de diagnóstico y/o terapéutico. Para propósitos de diagnóstico, pueden usarse secuencias polinucleotídicas de PDEXV para detectar y cuantificar la expresión génica en afecciones, trastornos o enfermedades en las que puede estar implicada la actividad de PDEXV.

La secuencia polinucleotídica que codifica PDEXV puede usarse para el diagnóstico de enfermedades que son el resultado de la expresión de PDEXV. Por ejemplo, pueden usarse secuencias polinucleotídicas que codifican PDEXV en ensayos de hibridación o PCR de tejidos de biopsias o autopsias o fluidos biológicos, tales como suero, fluido sinovial o biopsia tumoral, para detectar anormalidades en la expresión de PDEXV. La forma de dichos procedimientos cualitativos o cuantitativos puede incluir análisis de Southern o northern, dot blot u otras tecnologías basadas en membrana; tecnologías de PCR; tecnologías de varilla, pin o chip; y ELISA u otras tecnologías formales de muestras múltiples. Todas estas técnicas son bien conocidas en la técnica y son de hecho la base de muchos kits de diagnóstico disponibles en el mercado.

Dichos ensayos pueden adaptarse para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico particular y pueden usarse en estudios animales, en ensayos clínicos, o en el control del tratamiento de un paciente individual. Para proporcionar una base para el diagnóstico de enfermedad, debe establecerse un perfil normal o patrón para la expresión de PDE. Esto se consigue combinando fluidos corporales o extractos celulares tomados de sujetos normales, animales o humanos, con PDEXV o una porción de la misma, en condiciones apropiadas para la hibridación o amplificación. La hibridación patrón puede cuantificarse comparando los valores obtenidos de sujetos normales con una serie de dilución de controles positivos realizada en el mismo experimento donde se usa una cantidad conocida de PDEXV. Los valores patrón obtenidos de muestras normales pueden compararse con valores obtenidos de muestras de sujetos potencialmente afectados por un trastorno o enfermedad relacionada con la expresión de la secuencia que codifica PDE. La desviación entre los valores patrón y del sujeto establece la presencia de la patología. Si se establece la enfermedad, se administra un agente terapéutico existente, y puede generarse un perfil o valores de tratamiento. Finalmente, el ensayo puede repetirse en una base regular para evaluar si los valores progresan o vuelven al patrón normal o convencional. Pueden usarse perfiles de tratamiento sucesivos para demostrar la eficacia del tratamiento durante un periodo de varios días o varios meses.

Por tanto, la presente solicitud contempla el uso de un polipéptido PDEXV, o variante, homólogo, fragmento derivado del mismo, para producir anticuerpos anti-PDEXV que pueden, por ejemplo, usarse de modo diagnóstico para detectar y cuantificar niveles de PDEXV en patologías.

La presente solicitud también contempla ensayos de diagnóstico y kits para la detección de PDEXV en células y tejidos que comprenden una PDEXV purificada, que puede usarse como control positivo, y anticuerpos anti-PDEXV. Dichos anticuerpos pueden usarse en tecnologías basadas en solución, basadas en membrana, o basadas en tejido para detectar cualquier patología o afección relacionada con la expresión de proteína PDEXV o expresión de deleciones o una variante, homólogo, fragmento derivado de la misma.

Sondas

Otro aspecto de la presente solicitud es la descripción de sondas de hibridación o PCR de ácidos nucleicos que son capaces de detectar secuencias polinucleotídicas, incluyendo secuencias genómicas, que codifican la región codificante de PDE o moléculas altamente relacionadas, tales como alelos. La especificidad de la sonda, es decir, si se ha obtenido de una región o dominio altamente conservado, conservado o no conservado, y la rigurosidad de la hibridación o amplificación (alta, intermedia o baja) determinará si la sonda identifica solo la secuencia que codifica PDEXV de origen natural, o secuencias relacionadas. Las sondas para la detección de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas se seleccionan de regiones de nucleótidos conservadas o altamente conservadas de los miembros de la familia PDE de nucleótidos cíclicos, tales como la región 3', y dichas sondas pueden usarse en una combinación de sondas degeneradas. Para la detección de secuencias de ácidos nucleicos idénticas, o donde se desea la máxima especificidad, se seleccionan sondas de ácidos nucleicos de las regiones de nucleótidos no conservadas o regiones únicas de polinucleótidos PDE. Como se usa en este documento, el término "región de nucleótidos no conservada" se refiere a una región de nucleótidos que es única para la secuencia que codifica PDE descrita en este documento y no se encuentra en miembros de la familia relacionados, tal como PDE de nucleótidos cíclicos conocidas.

La PCR como se describe en los documentos US-A-4683195, US-A-4800195 y US-A-4965188 proporciona usos adicionales para oligonucleótidos en base a la secuencia PDEXV. Dichos oligómeros generalmente se sintetizan químicamente, pero pueden generarse enzimáticamente o producirse a partir de una fuente recombinante. Los oligómeros generalmente comprenden dos secuencias de nucleótidos, una con orientación con sentido (5'\rightarrow3') y una con antisentido (3'\leftarrow5') empleadas en condiciones optimizadas para la identificación de un gen específico o afección. Los mismos dos oligómeros, conjuntos combinados de oligómeros, o incluso una combinación degenerada de oligómeros pueden emplearse en condiciones menos rigurosas para la detección y/o cuantificación de secuencias de ADN o ARN altamente relacionadas.

La secuencia de ácidos nucleicos para PDEXV también puede usarse para generar sondas de hibridación como se ha descrito previamente, para mapear la secuencia genómica endógena. La secuencia puede mapearse en un cromosoma particular o para una región específica del cromosoma usando técnicas bien conocidas. Estas incluyen hibridación in situ con tramos cromosómicos (Verma y col (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Ciudad de Nueva York), preparaciones cromosómicas clasificadas por flujo, o construcciones cromosómicas artificiales tales como YAC, cromosomas artificiales bacterianos (BAC), construcciones PI bacterianas o bibliotecas de ADNc de cromosomas únicos.

La hibridación in situ de preparaciones cromosómicas y técnicas de mapeo físico tales como análisis de unión usando marcadores cromosómicos establecidos es inapreciable en mapas genéticos amplios. Pueden encontrarse ejemplos de mapas genéticos en Science (1995; 270:410f y 1994; 265:1981f). A menudo la colocación de un gen en el cromosoma de otra especie de mamífero puede revelar marcadores asociados incluso si no se conoce el número o brazo de un cromosoma humano particular. Pueden asignarse nuevas secuencias a brazos cromosómicos, o partes de los mismos, por mapeo físico. Esto proporciona información valiosa para los investigadores que buscan genes de enfermedades usando clonación posicional u otras técnicas de descubrimiento de genes. Una vez se ha localizado toscamente una enfermedad o síndrome, tal como ataxia telangiectasia (AT), por unión genética a una región genómica particular, por ejemplo, AT a 11q22-23 (Gatti y col (1988) Nature 336:577-580), cualquier secuencia con mapeo en esa área puede representar genes asociados o reguladores para investigación adicional. La secuencia de nucleótidos de la presente invención también puede usarse para detectar diferencias en la localización cromosómica debido a translocación, inversión, etc. entre individuos normales, portadores o afectados.

Agentes Farmacéuticos

La presente solicitud también contempla una composición farmacéutica para tratar a un individuo en necesidad de la misma debido a la actividad de PDEXV, comprendiendo la composición una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que afecta (tal como inhibir) a dicha actividad y un vehículo, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Por tanto, la presente solicitud también contempla composiciones farmacéuticas que comprenden los agentes descritos anteriormente (es decir, un agente capaz de modular el patrón de expresión de la secuencia de nucleótidos de la presente invención o la actividad del producto de expresión de la misma y/o un agente identificado por un ensayo de acuerdo con la presente invención). A este respecto, y en particular para terapia humana, aunque los agentes pueden administrarse solos, generalmente se administrarán en mezcla con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéutico seleccionado con respecto a la vía pretendida de administración y la práctica farmacéutica convencional.

Se incluyen en el alcance de agente secuencias oligonucleotídicas, moléculas de ARN y ADN antisentido y ribozimas, que funcionan desestabilizando el ARNm de PDEXV o inhibiendo la traducción de una PDEXV. Dichas secuencias de nucleótidos pueden usarse en condiciones donde podría ser preferible aumentar los niveles de nucleótido cíclico, tal como en inflamación.

Una molécula antisentido de PDEXV puede proporcionar la base para el tratamiento de diversas afecciones anormales relacionadas con, por ejemplo, actividad de PDEXV aumentada.

Una molécula antisentido de ácidos nucleicos de PDEXV puede usarse para bloquear la actividad de la PDEXV en afecciones donde podría ser preferible elevar los niveles de nucleótido cíclico.

Los vectores de expresión obtenidos de retrovirus, adenovirus, virus del herpes o vaccinia, o de diversos plásmidos bacterianos, pueden usarse para suministrar las moléculas con sentido o antisentido de PDEXV recombinante a la población de células diana. Pueden usarse procedimientos que son bien conocidos por los especialistas en la técnica para construir vectores recombinantes que contienen PDEXV. Como alternativa, puede suministrarse PDEXV recombinante a las células diana en liposomas.

La secuencia de ADNc de longitud completa y/o sus elementos reguladores posibilitan a los investigadores usar PDEXV como herramienta en investigaciones con sentido (Youssoufian H y HF Lodish 1993 Mol Cell Biol 13:98-104) o antisentido (Eguchi y col (1991) Annu Rev Biochem 60:631-652) de función génica. Pueden usarse oligonucleótidos, diseñados a partir del ADNc o secuencias de control obtenidas del ADN genómico in vitro o in vivo para inhibir la expresión. Dicha tecnología ahora es bien conocida en la técnica, y pueden diseñarse oligonucleótidos con sentido o antisentido de fragmentos más grandes a partir de diversas localizaciones a lo largo de las regiones codificantes o control. Los oligonucleótidos apropiados, que pueden ser de 20 nucleótidos de longitud, pueden usarse para aislar secuencias de PDEXV o moléculas altamente relacionadas a partir de bibliotecas humanas.

Adicionalmente, la expresión de PDEXV puede modularse transfectando una célula o tejido con vectores de expresión, que expresan altos niveles de un fragmento de PDEXV en afecciones en las que podría ser preferible bloquear la actividad fosfodiesterasa aumentado de este modo los niveles de nucleótidos cíclicos. Dichas construcciones pueden saturar a las células de secuencias con sentido o antisentido no traducibles. Incluso en ausencia de integración en el ADN, dichos vectores pueden continuar transcribiendomoléculas de ARN hasta que todas las copias del vector se inutilicen por nucleasas endógenas. Dicha expresión transitoria puede durar un mes o más con un vector no replicante e incluso más si los elementos de replicación apropiados forman parte del sistema vectorial.

Las modificaciones de la expresión génica pueden obtenerse diseñando secuencias antisentido a las regiones de control del gen de PDE, tal como los promotores, potenciadores, e intrones.

Se prefieren oligonucleótidos obtenidos del sitio de inicio de la trascripción, por ejemplo, entre las regiones -10 y +10 de la secuencia líder. También pueden diseñarse moléculas de ARN y ADN antisentido para bloquear la traducción de ARNm evitando que el transcrito se una a los ribosomas. De manera similar, puede conseguirse la inhibición usando metodología de apareamiento de bases de Hogeboom, también conocido como apareamiento de bases en "tripe hélice". El apareamiento en triple hélice compromete la capacidad de la doble hélice de abrirse suficientemente para la unión de las polimerasas, los factores de trascripción, o moléculas reguladoras.

Por tanto, la presente solicitud también contempla composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades eficaces de inhibidores o antagonistas de la proteína PDEXV (incluyendo secuencias de ácidos nucleicos antisentido) en mezcla con un diluyente, vehículo, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable (incluyendo combinaciones de los mismos).

La presente solicitud contempla composiciones farmacéuticas que pueden comprenden toda o porciones de las secuencias polinucleotídicas de PDEXV, moléculas antisentido de PDEXV, polipéptidos PDEXV, moduladores proteicos, peptídicos u orgánicos de la bioactividad de PDEXV, tal como inhibidores, antagonistas (incluyendo anticuerpos) o agonistas, solos o en combinación con al menos otro agente, tal como un compuesto estabilizante, y pueden administrarse en cualquier vehículo farmacéutico biocompatible estéril, incluyendo, aunque sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, y agua.

Referencias de Metodología General

Aunque en general las técnicas mencionadas en este documento son bien conocidas en la técnica, puede hacerse referencia en particular a Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) y Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4ª Ed, John Wiley & Sons, Inc. La PCR se describe en los documentos US-A-4683195, US-A-4800195 y US-A-4965188.

Depósitos

La siguiente muestra se depositó de acuerdo con el Tratado de Budapest en el depósito reconocido The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) en 23 St. Marchar Drive, Aberdeen, Escocia, Reino Unido, AB2 1RY el 9 septiembre de 1999:

NCIMB número NCIMB 41025 es Escherichia coli (pHSPDExv).

El depositante fue Pfizer Central Research, Pfizer Limited, Ramsgate Road, Sandwich, Kent, CT13 9NJ, Reino Unido.

La presente solicitud también incluye secuencias que se pueden obtener y/o expresar a partir de ese depósito y realizaciones que comprenden la misma. La presente solicitud también incluye secuencias parciales que se pueden obtener y/o expresar a partir de ese depósito y realizaciones que comprenden la misma, donde esas secuencias parciales codifican sitios enzimáticos activos. La presente solicitud también incluye proteínas que comprenden secuencias que se pueden obtener y/o expresar a partir de ese depósito y realizaciones que comprenden la misma. La presente solicitud también incluye proteínas que comprenden secuencias parciales que se pueden obtener y/o expresar a partir de ese depósito y realizaciones que comprenden la misma, donde esas secuencias parciales codifican sitios enzimáticos activos.

La presente invención ahora se describirá, solo a modo de ejemplo.

Aislamiento de ADNc de PDExv Materiales y procedimientos

5'RACE: Los tampones y enzimas de reacción se obtuvieron en formato de kit de tecnologías Life. El protocolo se realizó de acuerdo con el manual de instrucciones ([tecnologías Life] sistema 5'RACE para la amplificación rápida de extremos de ADNc, versión 2 Nº Cat. 18374-058), usando la modificación de una cola de dA en la primera cadena de ADNc.

Cebador ancla: 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'

Cebador adaptador: 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'

Expresión: PDExv se expresó usando el sistema de baculovirus como se detalla a continuación.

Resultados

Secuencia original identificada en la base de datos IMAGE EST por búsqueda de palabra clave (IMAGE clon Nº 1639772 - aislado de biblioteca de testículo humano).

Para obtener la secuencia 5' completa de la variante de corte y empalme, se realizó una amplificación 5' rápida de los extremos de ADNc (RACE) en ARN poli A^{+} de testículo (Clontech)

GSP1: 5'-CAGAACAGCGTTCACATTTCAGC-3'

GSP2: 5'-AGGTCAGTCTGTTCTTCAAAGAGG-3'

GSP3: 5'-CAGTAAATGGAGCTCCTTCAGG-3'

Se generó ADNc a partir del ARN poli A^{+} de testículo usando GSP1 como cebador de síntesis.

Se realizó una primera ronda de PCR sobre este ADNc usando GSP2 como cebador 3' y el cebador ancla suministrado con el kit. Se realizó una PCR combinada sobre los productos de la primera ronda usando GSP3 como cebador 3' y el cebador adaptador 5' suministrado con el kit. Los productos RACE combinados e usaron para generar una minibiblioteca de 1500 clones en el vector de clonación TOPO-TA (PCR2.1-TOPO, Invitrogen). Esta minibiblioteca se exploró por hibridación con una sonda oligonucleotídica GSP4.

GSP4: 5'-TTGTGCATGCCTATCCGAAGCAGTTATGGT-3'

Se identificaron 8 clones en la secuenciación que se demostró que prolongaban la secuencia PDE11 conocida. Usando esta secuencia prolongada, se diseñó un cebador 5' (GSP5) para permitir la clonación de la nueva secuencia en el vector de expresión pFASTBAC-FLAG. Estos cebadores contienen un sitio RsrII modificado.

GSP5: 5'-GCACGGTCCGAGATGCTGAAGCAGG-3'

GSP6: 5'-AGATATCTGGTCTGCCTCTGC-3'

La PCR usando GSP5 (cebador 5') y GSP6 (cebador 3') generó un fragmento de 780 pb que contenía un sitio RsrII modificado 5' y un sitio StuI natural.

La construcción de expresión PDE11A1 (PDE10-Incyte) original en pFASTBAC, y el fragmento de 780 pb anterior, se digirieron con las endonucleasas de restricción RsrII y StuI. El fragmento de 780 pb se ligo al extremo 3' de PDE11A1 para generar la variante de corte y empalme prolongada PDExv (PDE11A3). La construcción PDExv completa después se clonó en pFASTBAC-FLAG.

Expresión

La enzima recombinante hidroliza tanto GMPc como AMPc.

Expresión en baculovirus

Los siguientes estudios demuestran que la enzima PDE de la presente invención - llamada PDE aquí de manera corta - puede generarse usando un sistema de expresión de baculovirus.

Los siguientes estudios también demuestran que la PDE muestra actividad hidrolítica de nucleótido cíclico cuando se expresa en el sistema de baculovirus.

La enzima PDE se generó usando el sistema de expresión de baculovirus basado en la infección por el virus de la polihedrosis nuclear (AcNPV) Autographa californica de células de insecto Spodoptera frugiperda (células Sf9).

En estos estudios, se clonó el ADNc que codifica PDE en el plásmido donante pFASTBAC-FLAG, que contiene un mini-elemento de transposición Tn7. El plásmido recombinante se transformó en células competentes DH10BAC, que contienen el bacmid parental bMON14272 (ADN infeccioso de AcNPV) y un plásmido auxiliar. El mini-elemento Tn7 en el donante pFASTBAC puede transponer el sitio de unión attTn7 en el bacmid introduciendo de este modo el gen PDE en el genoma viral. Las colonias que contienen los bacmid recombinantes se identifican por interrupción del gen lacZ. La construcción PDE/bacmid después se puede aislar e infectar en células de insecto (células Sf9) dando como resultado la producción de partículas de baculovirus recombinantes infecciosas y la expresión de la proteína de fusión PDE-FLAG recombinante.

Se midió la actividad fosfodiesterasa de los extractos celulares en bruto.

Las células se recogieron y se prepararon extractos 24, 48 y 72 horas después de la transfección.

Estos resultados confirman que el ADNc de PDE codifica una fosfodiesterasa, que es capaz de hidrolizar a AMPc y GMPc.

El material lisado en bruto se purificó por FPLC usando una columna que contenía perlas de agarosa (gel de afinidad M2) con las que se había conjugado anticuerpo anti-FLAG monoclonal IgG_{1} purificado por unión con hidrazida (Eastman Kodak). Esto permite la retención específica en la columna del material recombinante (ya que está fusionado al epítope FLAG) mientras que las proteínas de insecto endógenas se retiran por lavado en el eluido. El material recombinante después se retira por lavado en condiciones de bajo pH. Este material purificado fue más apropiado para los estudios enzimático e inhibidor detallados. La pureza del material se evalúa por tinción con coomassie después de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) o a través de transferencia de western en una membrana de nitrocelulosa de un SDS-PAGE no teñido (que contiene PDE recombinante) y análisis con el anticuerpo con epítope anti-FLAG monoclonal IgG1. La proteína de fusión PDE-FLAG se detecta debido a la interacción entre al anticuerpo anti-FLAG y el epítope FLAG, que está fusionado a la proteína PDE.

La actividad fosfodiesterasa de la proteína de fusión PDE-FLAG purificada se ensayó usando un kit SPA (ensayo de centelleo por proximidad) disponible en el mercado (Amersham - Amersham place, Little Chalfont, Bucks, HP7 9NA UK) para la actividad hidrolítica de AMPc y/o GMPc. Esto puede usarse para permitir la determinación del valor Km para PDE frente a AMPc y/o GMPc para determinar la actividad enzimática a un intervalo de concentraciones de sustrato que permiten el cálculo de un valor Vmax aproximado para la enzima.

Los resultados de estos experimentos muestran que el ADNc de PDE codifica una fosfodiesterasa que es capaz de hidrolizar a AMPc y GMPc.

Resumen

En resumen, la presente invención proporciona:

1. Secuencias nuevas de aminoácidos.

2. Secuencias nuevas de nucleótidos.

3. Ensayos que usan dichas nuevas secuencias.

4. Sistemas de expresión que comprenden o expresan dichas nuevas secuencias.

7

\newpage

Alineamiento de la secuencia de nucleótidos de PDE11A3 (PDExv) con la variante PDE11A2 y también PDE11A1

\vskip1.000000\baselineskip

Aquí, la secuencia de aminoácidos de PDE11A2 es SEC.ID.Nº3 y la secuencia de nucleótidos es SEC.ID.Nº4.

\vskip1.000000\baselineskip

Aquí, la secuencia de aminoácidos de PDE11A1 es SEC.ID.Nº5 y la secuencia de nucleótidos es SEC.ID.Nº6.

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

10

\newpage

Alineamiento de la secuencia peptídica de PDE11A3 (PDExv) con las variantes de corte y empalme PDE11A2 y PDE11A1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

11

Claims

1. Una secuencia de aminoácidos que tiene actividad de PDEXV siendo capaz de catalizar la degradación de AMPc y GMPc; comprendiendo dicha secuencia de aminoácidos la secuencia presentada como SEC.ID.Nº 1 o una variante de la misma; teniendo dicha variante al menos un 95% de homología con la secuencia mostrada como SEC.ID.Nº 1 y que comprende al menos 25 aminoácidos contiguos de la siguiente secuencia N terminal:

6

2. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos como se ha definido en la reivindicación 1.

3. Una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende la secuencia presentada como SEC.ID.Nº 2 o una variante de la misma que tiene al menos un 95% de homología con la misma.

4. Un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 2 o reivindicación 3.

5. Una célula huésped aislada que tiene incorporada la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 2 o reivindicación 3.

6. Un procedimiento de ensayo para identificar un agente que pueda afectar a la actividad de PDEXV (es decir, que es capaz de catalizar la degradación de AMPc o GMPC) o la expresión de PDEXV, comprendiendo el procedimiento de ensayo

poner en contacto un agente con un aminoácido de acuerdo con la reivindicación 1 o una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 2 o reivindicación 3; y

medir la actividad o expresión de PDEXV;

donde una diferencia entre (a) la actividad o expresión de PDEXV en ausencia del agente y (b) la actividad o expresión de PDEXV en presencia del agente es indicativo de que el agente puede afectar a la actividad o expresión de PDEXV.