ES2243208T3 - Fosfodiesterasa de nucleotido ciclico humano. - Google Patents
Fosfodiesterasa de nucleotido ciclico humano.Info
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Abstract
Una secuencia de aminoácidos que tiene actividad de PDEXV siendo capaz de catalizar la degradación de AMPc y GMPc; comprendiendo dicha secuencia de aminoácidos la secuencia presentada como SEC.ID.Nº 1 o una variante de la misma; teniendo dicha variante al menos un 95% de homología con la secuencia mostrada como SEC.ID.Nº 1 y que comprende al menos 25 aminoácidos contiguos de la siguiente secuencia N terminal:
Description
Fosfodiesterasa de nucleótido cíclico humano.
La presente invención se refiere a una enzima. La
presente invención también se refiere a una secuencia de nucleótidos
que codifica la misma.
En particular, la presente invención se refiere a
una nueva secuencia de ácidos nucleicos que codifica una nueva
enzima fosfodiesterasa.
La presente invención también se refiere al uso
de las nuevas secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos para
evaluar y o explorar agentes que pueden modular la actividad
fosfodiesterasa.
La presente invención se refiere adicionalmente a
células huésped modificadas genéticamente que comprenden o expresan
las nuevas secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos para
evaluar y/o explorar agentes que pueden modular la actividad
fosfodiesterasa.
Los nucleótidos cíclicos, tales como AMPc y GMPc,
son segundos mensajeros intracelulares importantes. Las
fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos - conocidas de otro modo
como PDE - son una familia de enzimas que cataliza la degradación
de nucleótidos cíclicos y, al hacer eso, son uno de los componentes
celulares que reúnen la concentración de nucleótidos cíclicos.
En los últimos años, se han definido al menos
siete enzimas PDE (tales como PDEI - PDEVII), así como muchos
subtipos de estas enzimas, en base a la afinidad de sustrato y las
necesidades de cofactor (Beavo JA y Reifsnyder DH, Trends
Pharmacol. Sci 11:150 [1990]; Beavo J, En: Cyclic Nucleotide
Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action., Beavo J
and Housley MD (Eds.)). Wiley:Chichester, páginas
3-15 [1990]).
Los ejemplos de PDE incluyen: PDEI que es una PDE
dependiente de Ca^{2+}/Calmodulina; PDEII que es una PDE
estimulada por GMPc; PDEIII que es una PDE inhibida por GMPc; PDEIV
que es una PDE específica de AMPc de alta afinidad; y PDEV que es
una PDE específica de GMPc.
Cada familia de PDE puede contener dos o mas
isoformas (es decir, pueden haber dos o más isoenzimas PDE). A modo
de ejemplo, PDEIV de mamífero, la homologa del gen Dunce de
Drosophila (Chen CH y col., Proc. Nat. Acad. Sci.
(USA) 83:9313 [1986]), se sabe que tiene cuatro isoformas en la
rata (Swinnen JV y col., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 86:5325
[1989]). También se sabe que las PDE humanas se encuentran como
isoformas y tienen variantes de corte y empalme. Por ejemplo, se
informó de la clonación de una isoforma humana de PDEIV a partir de
monocitos en 1990 (Livi GP y col., Mol. Cell. Bio., 10:2678
[1990]). A modo de ejemplo adicional, otros trabajadores han
clonado independientemente tres variantes de corte y empalme de
PDEIV, que ahora se denominan hPDEIV-B1,
hPDEIV-B2, y hPDEIV-B3.
También pueden encontrarse contenidos con
respecto a fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos en los
documentos US-A-5932423 y
US-A-5932465.
Pueden encontrarse contenidos de una
fosfodiesterasa de nucleótidos cíclicos adicional - llamada CN
PCDE8
- en el documento WO-A-97/35989. De acuerdo con el documento WO-A-97/35989, CN PCDE8 tiene dos isoen-
zimas - que se denominan CN PCDE8A y CN PCDE8B. El término "isoenzima" a veces se menciona en la técnica como "isoforma".
- en el documento WO-A-97/35989. De acuerdo con el documento WO-A-97/35989, CN PCDE8 tiene dos isoen-
zimas - que se denominan CN PCDE8A y CN PCDE8B. El término "isoenzima" a veces se menciona en la técnica como "isoforma".
De acuerdo con el documento
WO-A-97/35989, se han identificado
muchos inhibidores de diferentes PDE y algunos han experimentado
evaluación clínica. Por ejemplo, los inhibidores de PDEIII se han
desarrollado como agentes antitrombóticos, como agentes
antihipertensivos y como agentes cardiotónicos útiles en el
tratamiento de insuficiencia cardiaca congestiva. Rolipram, un
inhibidor de PDEIII, se ha usado en el tratamiento de depresión y
otros inhibidores de PDEIII están experimentando evaluación como
agentes anti-inflamatorios. Rolipram también ha
demostrado inhibir TNF-alfa inducido por
lipopolisacárido (LPS) que ha demostrado potenciar la replicación
de VIH-1 in vitro. Por lo tanto, rolipram
pueden inhibir la replicación de VIH-1 (Angel y
col 1995 AIDS 9:1137-44). Adicionalmente, en
base a esta capacidad de suprimir la producción de
TNF-alfa y beta e interferón gamma, rolipram ha
demostrado ser eficaz en el tratamiento de encefalomielitis, el
modelo animal experimental para esclerosis múltiple (Sommer y
col, 1995 Nat Med 1:244-248) y puede ser eficaz
en el tratamiento de disquinesia tardía (Sasaki y col, 1995
Eur J Pharmacol 282:71-76).
De acuerdo con el documento
WO-A-97/35989, también hay
inhibidores de PDE no específicos tales como teofilina, usada en el
tratamiento de asma bronquial y otras enfermedades respiratorias, y
pentoxifilina, usada en el tratamiento de claudicación intermitente
y enfermedad vascular periférica inducida por diabetes. La
teofilina se cree que funciona sobre la función del músculo liso de
las vías respiratorias así como en la capacidad
anti-inflamatoria o inmunomoduladora en el
tratamiento de enfermedades respiratorias (Banner y col 1995
Respir J 8:996-1000) donde se cree que funciona
inhibiendo la hidrólisis tanto de AMPc como de GMPc por CN PDE
(Banner y col 1995 Monaldi Arch Chest Dis
50:286-292). La pentoxifilina, también conocida por
bloquear la producción de TNF-alfa, puede inhibir
la replicación de VIH-1 (Angel y col supra).
Se proporciona una lista de inhibidores de CN PDE en Beavo 1995
supra.
Se ha sugerido que los inhibidores selectivos de
PDE, además de sus isoenzimas y sus subtipos, conducirán a una
terapia más eficaz con menos efectos secundarios. Por ejemplo,
véanse los contenidos de las revisiones de Wieshaar RE y col,
(J. Med. Chem., 28:537 [1985]), Giembycz MA (Biochem. Pharm.,
43:2041 [1992]) y Lowe JA y Cheng JB (Drugs of the Future,
17:799-807 [1992]).
Por tanto, para algunas aplicaciones es deseable
tener un inhibidor selectivo de un tipo individual de PDE. Por lo
tanto, la clonación y expresión de una PDE nueva ayudará
enormemente al descubrimiento de inhibidores selectivos.
Los aspectos de la presente invención se
presentan en las reivindicaciones y en el siguiente comentario.
En un aspecto amplio, la presente invención se
refiere a nuevas secuencias de aminoácidos. A este respecto, se ha
identificado una nueva secuencia específica de aminoácidos y se
entiende que la invención incluye la secuencia así como variantes
nuevas de la misma.
En otro aspecto amplio, la presente invención se
refiere a nuevas secuencias de ácidos nucleicos. A este respecto, se
ha identificado una nueva secuencia específica de ácidos nucleicos
y se entiende que la invención incluye la secuencia así como
variantes nuevas de la misma.
Por tanto, en resumen, algunos aspectos de la
presente invención se refieren a:
1. Nuevas secuencias de aminoácidos.
2. Nuevas secuencias de nucleótidos.
3. Ensayos que usan dichas nuevas secuencias.
4. Sistemas de expresión que comprenden o
expresan dichas nuevas secuencias.
Otros aspectos con respecto a la secuencia de
aminoácidos de la presente invención y/o la secuencia de
nucleótidos de la presente invención incluyen: una construcción que
comprende o es capaz de expresar las secuencias de la presente
invención; un vector que comprende o es capaz de expresar las
secuencias de la presente invención; un plásmido que comprende o es
capaz de expresar las secuencias de la presente invención; un
tejido que comprende o es capaz de expresar las secuencias de la
presente invención; un órgano que comprende o es capaz de expresar
las secuencias de la presente invención; un huésped transformado que
comprende o es capaz de expresar las secuencias de la presente
invención; un organismo transformado que comprende o es capaz de
expresar las secuencias de la presente invención. La presente
solicitud también incluye procedimientos para expresar la misma,
tales como expresión en un microorganismo; incluyendo
procedimientos para transferir la misma.
Para una fácil referencia, los aspectos de la
presente invención se analizan ahora en los encabezados de sección
apropiados. Sin embargo, los contenidos en cada sección no están
necesariamente limitados a cada sección particular.
En el siguiente comentario referencias a
"secuencia de nucleótidos de la presente invención" y
"secuencia de aminoácidos de la presente invención" se refiere
respectivamente a una cualquiera o más de las secuencias de
nucleótidos presentadas o analizadas en este documento y a una
cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos presentadas o
analizadas en este documento. Además, como se usa en este
documento, "secuencia de aminoácidos" se refiere a secuencias
peptídicas o proteicas y pueden referirse a porciones de las mismas.
Además, el término "secuencia de aminoácidos de la presente
invención" es sinónimo de la expresión "secuencia
polipeptídica de la presente invención". Además, el término
"secuencia de nucleótidos de la presente invención" es
sinónimo de la expresión "secuencia polinucleotídica de la
presente invención".
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención se proporciona una secuencia de aminoácidos que tiene
actividad PDEXV (es decir, que es capaz de catalizar la degradación
de AMPc y GMPc); comprendiendo dicha secuencia de aminoácidos la
secuencia presentada como SEC ID Nº:1 o una variante de la misma;
teniendo dicha variante al menos una homología del 95% con la
secuencia mostrada como SEC ID Nº:1 y que comprende al menos 25
aminoácidos contiguos de la siguiente secuencia
N-terminal:
SEC ID Nº:1 es la secuencia de aminoácidos de
PDEXV (que a veces se llama PDE11A3). PDEXV tiene 684 aminoácidos.
Sin desear unirse por la teoría, las secuencias de aminoácidos
asociadas con motivos de unión a GMPc supuestos (x 2) se han
subrayado. La presencia de dos motivos de unión a GMPc proporciona
el potencial para la regulación diferencial de variantes de corte y
empalme.
Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de
la presente invención tiene dos motivos de unión a GMPc.
Por conveniencia, ahora se presenta una Tabla que
indica los códigos usados para los aminoácidos.
| Aminoácido | Abreviatura de tres letras | Símbolo de una letra |
| Alanina | Ala | A |
| Arginina | Arg | R |
| Asparagina | Asn | N |
| Ácido aspártico | Asp | D |
| Cisteína | Cys | C |
| Glutamina | Gln | Q |
| Ácido glutámico | Glu | E |
| Glicina | Gly | G |
| Histidina | His | H |
| Isoleucina | Ile | I |
| Leucina | Leu | L |
| Lisina | Lys | K |
| Metionina | Met | M |
| Fenilalanina | Phe | F |
| Prolina | Pro | P |
| Serina | Ser | S |
| Treonina | Thr | T |
| Triptófano | Trp | W |
| Tirosina | Tyr | Y |
| Valina | Val | V |
| Cualquier resto | Xaa | X |
Por conveniencia, la PDE de la presente invención
a veces se menciona como PDEXV o PDExv.
Se cree que la PDE de la presente invención es
una versión truncada de PDE11A1. Las secuencias para PDE11A1 se
presentan en la lista de secuencias adjunta, junto con PDE11A2 que
se cree que es una variante de acuerdo con la PDE de la presente
invención.
La PDE de la presente invención es capaz de
catalizar la degradación de AMPc y GMPc.
Para SEC ID Nº:1 uno cualquiera o más de los
aminoácidos pueden ser un análogo de los mismos.
El término "análogo" como se usa en este
documento significa una secuencia que tiene una secuencia similar a
la de SEC ID Nº:1 pero donde se han hecho sustituciones o
deleciones de aminoácidos no perjudiciales (es decir, no
perjudiciales para la actividad enzimática).
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente
invención se proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica
la secuencia de aminoácidos de la presente invención.
Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos
comprende la secuencia presentada como SEC ID Nº:2 o una variante de
la misma que tiene al menos una homología del 95% con la misma.
De acuerdo con un tercer aspecto de la presente
invención se proporciona un vector que comprende la secuencia de
nucleótidos de acuerdo con la presente invención.
De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente
invención se proporciona una célula huésped en la que se ha
incorporado la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente
invención.
De acuerdo con un quinto aspecto de la presente
invención se proporciona un procedimiento de ensayo para identificar
un agente que pueda afectar a la actividad de PDEXV (es decir, que
sea capaz de catalizar la degradación de AMPc y GMPc) o la
expresión de PDEXV, comprendiendo el procedimiento de ensayo poner
en contacto un agente con un aminoácido de acuerdo con la presente
invención o una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente
invención; y medir la actividad o expresión de PDEXV; donde una
diferencia entre (a) actividad o expresión de PDEXV en ausencia del
agente y (b) actividad o expresión de PDEXV en presencia del agente
es indicativo de que el agente puede afectar a la actividad o
expresión de PDEXV.
Preferiblemente el ensayo es para explorar
agentes útiles para el tratamiento de un trastorno cardiovascular
y/o trastornos encontrados en uno cualquiera o más del cuerpo
cavernoso, riñón, hígado, músculo esquelético, testículo,
próstata.
Como se ha explicado anteriormente, la presente
invención se refiere a una nueva enzima PDE - que se ha llamado
PDEXV (que puede expresarse de otro modo como PDE11A3) - y a una
secuencia de nucleótidos que codifica la misma. La presente
invención también se refiere al uso de las nuevas secuencias de
ácidos nucleicos y aminoácidos para evaluar y/o explorar agentes
que puedan modular la actividad fosfodiesterasa. La presente
invención también se refiere a células huésped modificadas
genéticamente que comprenden o expresan las nuevas secuencias de
ácidos nucleicos o aminoácidos para evaluar y/o explorar agentes
que puedan modular la actividad fosfodiesterasa.
Se cree que PDEXV está presente en, y se puede
obtener de, una diversidad de fuentes.
A modo de ejemplo, PDEXV se encuentra en el
sistema cardiovascular, el cuerpo cavernoso, riñón, hígado, músculo
esquelético, testículo, próstata.
También se cree que PDEXV está presente en varias
fuentes distintas - tales como por ejemplo: bovina, ovina, porcina y
equina.
Preferiblemente, la PDEXV es PDEXV de mamífero
que incluye aunque sin limitación cualquiera de las fuentes
anteriores.
Más preferiblemente, la PDEXV es PDEXV
humana.
La PDEXV puede ser igual que la forma de origen
natural - para este aspecto, preferiblemente la PDEXV es la
secuencia de aminoácidos no nativa (es decir, no está presente en
su medio natural) - o es una variante de la misma. Además, o como
alternativa, la PDEXV es PDEXV asilada y/o PDEXV purificada. La
PDEXV puede obtenerse de o producirse por cualquier fuente
apropiada, sea natural o no, o puede ser sintética, semisintética o
recombinante.
La secuencia que codifica PDEXV puede ser la
misma que la forma de origen natural - para este aspecto,
preferiblemente la secuencia que codifica PDEXV es la secuencia de
nucleótidos no nativa (es decir, no está presente en su medio
natural) - o es una variante de la misma. Además, o como
alternativa, la secuencia que codifica PDEXV es una secuencia que
codifica PDEXV aislada y/o una secuencia que codifica PDEXV
purificada. La secuencia que codifica PDEXV puede obtenerse de o
producirse por cualquier fuente apropiada, sea natural o no, y
puede ser sintética, semisintética o recombinante.
PDEX y/o su secuencia codificante y/o una
secuencia capaz de hibridar con la misma es o son útiles para
ensayar la selectividad de candidatos de fármaco entre diferentes
PDE.
Se cree que PDEXV es capaz de catalizar la
conversión de GMPc a GMP y AMPc a AMP.
GMPc es el mensajero en la respuesta eréctil
masculina. Por consiguiente, inhibiendo la actividad de PDEXV
probablemente se aumenta la concentración de GMPc presente y por
tanto se puede potenciar la respuesta eréctil masculina.
Por tanto, PDEXV y o su secuencia codificante y/o
una secuencia capaz de hibridar con la misma puede ser útil para
explorar candidatos de fármaco para el tratamiento de la disfunción
eréctil masculina. Además, se cree que PDEXV y/o su secuencia
codificante y/o una secuencia capaz de hibridar con la misma puede
ser útil para explorar candidatos de fármaco para el tratamiento de
disfunción sexual femenina.
La presente solicitud describe una enzima PDEXV
recombinante y una secuencia de nucleótidos recombinante que
codifica una enzima PDEXV.
Preferiblemente, la enzima PDEXV recombinante y/o
la secuencia de nucleótidos recombinante son una enzima PDEXV de
mamífero recombinante y/o una secuencia de nucleótidos de mamífero
recombinante.
Preferiblemente, la enzima PDEXV recombinante y/o
la secuencia de nucleótidos recombinante son una enzima PDEXV humana
recombinante y una secuencia de nucleótidos humana recombinante.
Cualquiera o tanto la secuencia de nucleótidos
que codifica PDEXV como la enzima PDEXV en sí misma pueden usarse
para explorar agentes que puedan afectar a la actividad PDEXV. En
particular, la secuencia de nucleótidos que codifica PDEXV o PDEXV
en sí misma puede usarse para explorar agentes que puedan inhibir la
actividad de PDEXV. Además, la secuencia de nucleótidos que
codifica PDEXV o la enzima PDEXV en sí misma puede usarse para
explorar agentes que afecten selectivamente a la actividad de
PDEXV, tal como inhibir selectivamente la actividad de PDEXV.
Además, la secuencia de nucleótidos que codifica
PDEXV o una secuencia que es complementaria a la misma también
pueden usarse en ensayos para detectar la presencia de secuencias
que codifican PDEXV en células humanas. Estos ensayos podrían
proporcionar información con respecto a la distribución tisular de
esta enzima y su relevancia biológica con respecto a patologías
particulares.
La presente solicitud contempla anticuerpos
frente a PDEXV (incluyendo una variante de la misma). Los
anticuerpos para PDEXV pueden usarse en ensayos para detectar la
presencia de PDEXV en células humanas. Estos ensayos podrían
proporcionar información con respecto a la distribución tisular de
esta enzima y su relevancia biológica con respecto a patologías
particulares.
En particular, una cualquiera o más de las
isoenzimas PDEXV, las secuencias de nucleótidos que codifican las
mismas, las secuencias de nucleótidos que son complementarias a las
mismas, y los anticuerpos dirigidos frente a las mismas pueden
usarse en ensayos para explorar agentes que afecten selectivamente a
una de las isoenzimas. Estos ensayos podrían proporcionar
información con respecto a la distribución tisular de cada una de
las isoenzimas y para proporcionar información con respecto a la
relevancia biológica de cada una de las isoenzimas con respecto a
patologías
particulares. Estos ensayos también podrían permitir a los trabajadores ensayar e identificar agentes que son útiles para aceptar a la expresión de o actividad de PDEXV - tal como en un tejido particular o en una patología particular.
particulares. Estos ensayos también podrían permitir a los trabajadores ensayar e identificar agentes que son útiles para aceptar a la expresión de o actividad de PDEXV - tal como en un tejido particular o en una patología particular.
El término "polipéptido" - que es
intercambiable con el término "proteína" - incluye moléculas
polipeptídicas de cadena única así como complejos polipeptídicos
múltiples donde los polipéptidos constituyentes individuales están
unidos por medios covalentes o no covalentes.
Preferiblemente, el polipéptido de la presente
invención es un polipéptido de cadena única.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
estar en forma sustancialmente aislada. Se entenderá que el
polipéptido puede mezclarse con vehículos o diluyentes, que no
afectarán al propósito pretendido del polipéptido y aun se
conservará como sustancialmente aislado. Un polipéptido de la
presente invención también puede estar en forma sustancialmente
purificada, en cuyo caso generalmente comprenderá el polipéptido en
una preparación en la que más del 90%, por ejemplo, 95%, 98% o 99%
del polipéptido en la preparación es un polipéptido de la presente
invención. Los polipéptidos de la presente invención pueden estar
modificados por ejemplo por la adición de restos de histidina para
ayudar a su purificación o por la adición de una secuencia señal
para promover su secreción a partir de una célula como se analiza a
continuación.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
producirse por medios sintéticos (por ejemplo, como se describe por
Geysen y col., 1996) o de manera recombinante, como se
describe a continuación.
En una realización preferida, la secuencia de
aminoácidos per se de la presente invención no incluye la
PDEXV nativa de acuerdo con la presente invención cuando está en su
medio natural y cuando se ha expresado por su secuencia codificante
de nucleótidos nativa que también está en su medio natural y cuando
la secuencia de nucleótidos está bajo el control de su promotor
nativo que también está en su medio natural. Para una fácil
referencia, se ha llamado a esta realización preferida la
"secuencia de aminoácidos no nativa".
Los términos "variante", "homólogo" o
"fragmento" en relación con la secuencia de aminoácidos para la
enzima de la presente invención incluyen cualquier sustitución de,
variación de, modificación de, reemplazamiento de, deleción de o
adición de un (o más) aminoácido a partir de o a la secuencia
promocionando la enzima resultante que tiene actividad de PDEXV,
preferiblemente siendo al menos tan biológicamente activa como la
enzima mostrada en la lista de secuencias adjunta. En particular,
el término "homólogo" incluye homología con respecto a la
estructura y/o función. Con respecto a homología de secuencia, hay
al menos un 95%, más preferiblemente al menos un 98%, de homología
con la secuencia mostrada como SEC ID Nº:1.
La variante de la presente invención comprende al
menos 25 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 45
aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 65 aminoácidos
contiguos, preferiblemente al menos 85 aminoácidos contiguos,
preferiblemente al menos 105 aminoácidos contiguos, preferiblemente
al menos 125 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 145
aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 165 aminoácidos
contiguos, preferiblemente al menos 185 aminoácidos contiguos de la
siguiente secuencia N-terminal:
Típicamente, para la variante de la presente
invención, los tipos de sustituciones de aminoácidos que podrían
hacerse deben mantener la hidrofobicidad/hidrofilicidad de la
secuencia de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden
hacerse, por ejemplo de 1, 2 ó 3 a 10, 20 ó 30 sustituciones a
condición de que la secuencia modificada mantenga la capacidad de
funcionar como una enzima PDE de acuerdo con al presente invención.
Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir el uso de análogos
de origen no natural, por ejemplo para aumentar la semivida en
plasma sanguíneo.
La secuencia de aminoácidos de la presente
invención puede producirse por expresión de una secuencia de
nucleótidos que codifica la misma en un sistema de expresión
apropiado.
Además, o como alternativa, la proteína en sí
misma podría producirse usando procedimientos químicos para
sintetizar una secuencia de aminoácidos de PDE, por completo o en
parte. Por ejemplo, los péptidos pueden sintetizarse por técnicas
en fase sólida, escindirse de la resina, y purificarse por
cromatografía líquida de alta resolución preparativa (por ejemplo,
Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH
Freeman and Co, Nueva York NY). La composición de los péptidos
sintéticos puede confirmase por análisis de aminoácidos o
secuenciación (por ejemplo, el procedimiento de degradación de
Edman).
La síntesis peptídica directa puede realizarse
usando diversas técnicas en fase sólida (Roberge JY y col
(1995) Science 269:202-204) y puede conseguirse
síntesis automática, por ejemplo, usando el Sintetizador Peptídico
ABI
43 1 A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Adicionalmente, la secuencia de aminoácidos de PDE, o cualquier parte de la misma, puede alterarse durante la síntesis directa y/o combinarse usando procedimientos químicos con una secuencia de otras subunidades, o cualquier parte de las mismas, para producir un polipéptido variante.
43 1 A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Adicionalmente, la secuencia de aminoácidos de PDE, o cualquier parte de la misma, puede alterarse durante la síntesis directa y/o combinarse usando procedimientos químicos con una secuencia de otras subunidades, o cualquier parte de las mismas, para producir un polipéptido variante.
En otra realización descrita en la solicitud,
puede ligarse una secuencia de PDE natural, modificada o
recombinante a una secuencia heteróloga para codificar una proteína
de fusión. Por ejemplo, para explorar bibliotecas de péptidos para
inhibidores de la actividad PDE, puede ser útil codificar una
proteína PDE quimérica que exprese un epítope heterólogo que se
reconozca por un anticuerpo disponible en el mercado. Una proteína
de fusión también puede modificarse para que contenga un sitio de
escisión localizado entre una secuencia de PDE y la secuencia de
proteína heteróloga, de modo que la PDE pueda escindirse y
purificarse del resto heterólogo.
La PDE también puede expresarse como una proteína
recombinante con uno o más dominios polipeptídicos adicionales
añadidos para facilitar la purificación de proteína. Dichos
dominios que facilitan la purificación incluyen, aunque sin
limitación, péptidos quelantes de metales tales como módulos
histidina-triptófano que permiten la purificación
en metales inmovilizados (Porath J (1992) Protein Expr Purif 3
-26328 1), dominios de proteína A que permiten la purificación en
inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema
de purificación por extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp,
Seattle, WA). La inclusión de una secuencia engarce que se puede
escindir tal como el Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San
Diego, CA) entre el dominio de purificación y PDE es útil para
facilitar la purificación.
Una secuencia de aminoácidos específica de PDEXV
se muestra como SEC ID Nº:1. Sin embargo, la presente invención
incluye secuencias de aminoácidos que codifican otros miembros de la
familia PDEXV, que podrían incluir secuencias de aminoácidos que
tienen al menos un 95% de identidad con las secuencias de
aminoácidos específicas.
Los polipéptidos de la presente invención también
pueden modificarse para que contengan una o más (por ejemplo, al
menos 2, 3, 5, ó 10) sustituciones, deleciones o inserciones,
incluyendo sustituciones conservadas. Estos aspectos se analizan en
una sección posterior.
El término "secuencia de nucleótidos" como
se usa en este documento se refiere a una secuencia
oligonucleotídica o secuencia polinucleotídica, y variantes de las
misma (tales como porciones de la misma). La secuencia de
nucleótidos pude ser ADN o ARN, que puede ser de origen genómico o
sintético o recombinante que puede ser de doble hélice o hélice
única que represente la cadena con sentido a antisentido.
Preferiblemente, el término "secuencia de
nucleótidos" significa ADN.
Más preferiblemente, el término "secuencia de
nucleótidos" significa ADN preparado por el uso de técnicas de
ADN recombinante (es decir, ADN recombinante).
En una realización preferida, la secuencia de
nucleótidos per se de la presente invención no incluye la
secuencia codificante de nucleótidos nativa de acuerdo con la
presente invención en su medio natural cuando está bajo el control
de su promotor nativo que también está en su medio natural. Para
una fácil referencia, se ha llamado a esta realización preferida la
"secuencia de nucleótidos no nativa".
Las secuencias de nucleótidos de la presente
invención pueden incluir en ellas nucleótidos sintéticos o
modificados. Se conocen varios tipos diferentes de modificación a
oligonucleótidos en la técnica. Estas incluyen estructuras
metilfosfonato y fosforotioato, adición de cadenas de acridina o
polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los
propósitos de la presente invención, se entiende que las secuencias
de nucleótidos descritas en este documento pueden modificarse por
cualquier procedimiento disponible en la técnica. Dichas
modificaciones pueden realizarse para potenciar la actividad in
vivo o el margen de vida de las secuencias de nucleótidos de la
presente
invención.
invención.
El término "variante" también incluye
secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de
hibridar con las secuencias de nucleótidos presentadas en este
documento.
Preferiblemente, el término "variante"
incluye secuencias que son complementarias a secuencias que son
capaces de hibridar en condiciones rigurosas (por ejemplo, 65ºC y
0,1 x SSC {1 x SSC = NaCl 0,015 M, Na_{3}citrato 0,015 pH 7,0})
con las secuencias de nucleótidos presentadas en este
documento.
Los ácidos nucleicos ejemplares pueden
caracterizarse alternativamente como las secuencias de nucleótidos
que codifican una proteína PDEXV e hibridan con la secuencia de ADN
mostrada en la lista de secuencias adjunta. Se prefieren dichas
secuencias que codifican PDEXV que hibridan en condiciones de alta
rigurosidad con la secuencia mostrada en la lista de secuencias
adjunta o el complementario de la misma.
Los términos "variante", "homólogo" o
"fragmento" en relación con la secuencia de nucleótidos que
codifica la enzima preferida de la presente invención incluyen
cualquier sustitución de, variación de, modificación de,
reemplazamiento de, deleción de o adición de un (o más) aminoácido
de o a la secuencia proporcionando la secuencia de nucleótidos
resultante que codifica o es capaz de codificar una enzima que tiene
actividad de PDEXV, siendo preferiblemente al menos tan
biológicamente activa como la enzima codificada por las secuencias
mostradas en la lista de secuencias adjunta. En particular, el
término "homólogo" incluye homología con respecto a la
estructura y/o función a condición de que la secuencia de
nucleótidos resultante codifique o sea capaz de codificar una
enzima que tenga actividad de PDEXV. Con respecto a homología de
secuencia, hay al menos un 95%, más preferiblemente al menos un
98%, de homología con la secuencia mostrada como SEC ID Nº:2.
La variante de la presente invención comprende
una secuencia de nucleótidos que codifica al menos 25 aminoácidos
contiguos, preferiblemente al menos 45 aminoácidos contiguos,
preferiblemente al menos 65 aminoácidos contiguos, preferiblemente
al menos 85 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 105
aminoácidos contiguos, preferible-
mente al menos 125 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 145 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 165 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 185 aminoácidos contiguos, de la siguiente secuencia N-terminal:
mente al menos 125 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 145 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 165 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 185 aminoácidos contiguos, de la siguiente secuencia N-terminal:
\vskip1.000000\baselineskip
Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos que
codifica un ejemplo de dicha secuencia N-terminal se
presenta a continuación:
Como se ha indicado, la presente invención se
refiere a una secuencia de ADN (preferiblemente una secuencia de
ADNc) que codifica PDEXV. En particular, la presente invención se
refiere a secuencias de ADNc que codifican PDEXV.
La presente invención también se refiere a
segmentos de ADN que comprenden la secuencia de ADN de las
secuencias mostradas en la lista de secuencias adjunta o variaciones
alélicas de dichas secuencias.
La presente invención también se refiere a
polipéptidos producidos por la expresión en una célula huésped en
la que se han incorporado las secuencias de ADN anteriores o
variaciones alélicas de las mismas.
La presente invención también se refiere a ADN
que comprende la secuencia de ADN mostrada en la lista de secuencias
adjunta o una variación alélica de la misma.
La presente invención también se refiere a ADN no
nativo que comprende la secuencia de ADN mostrada en la lista de
secuencias adjunta o una variación alélica de la misma.
Un aspecto altamente preferido de la presente
invención se refiere a ADN recombinante que comprende la secuencia
de ADN mostrada en la lista de secuencias adjunta o una variación
alélica de la misma.
Los polinucleótidos de la presente invención
incluyen secuencias de ácidos nucleicos que codifican los
polipéptidos de la presente invención. Se apreciará que un
intervalo de polinucleótidos diferentes codifica una secuencia de
aminoácidos dada como consecuencia de la degeneración del código
genético.
Mediante el conocimiento de las secuencias de
aminoácidos expuestas en este documento es posible elaborar
secuencias de ácidos nucleicos parciales y de longitud completa
tales como clones de ADNc y/o genómicos que codifican los
polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, los
polinucleótidos de la presente invención pueden obtenerse usando
PCR degenerada que usará cebadores diseñados para secuencias diana
que codifican las secuencias de aminoácidos presentadas en este
documento. Los cebadores contendrán típicamente posiciones
degeneradas múltiples. Sin embargo, para minimizar la degeneración,
las secuencias se elegirán de modo que codifiquen regiones de las
secuencias de aminoácidos presentadas en este documento que
contienen aminoácidos tales como metionina que están codificados
por solo un triplete. Además, las secuencias se elegirán para que
tengan en cuenta el uso del codón en el organismo cuyo el ácido
nucleico se usa como ADN molde para el procedimiento de PCR. La PCR
se usará en condiciones de rigurosidad inferiores a las usadas para
secuencias de clonación con cebadores de secuencia única (no
degenerados) frente a secuencias conocidas.
Las secuencias de ácidos nucleicos obtenidas por
PCR que codifican fragmentos polipeptídicos de la presente invención
después pueden usarse para obtener secuencias más grandes usando
técnicas de exploración de biblioteca de hibridación. Por ejemplo,
un clon de PCR puede marcarse con átomos radiactivos y usarse para
explorar una biblioteca de ADNc o genómica de otra especie,
preferiblemente otra especie de mamífero. Las condiciones de
hibridación serán típicamente condiciones de rigurosidad media a
alta (por ejemplo, cloruro sódico 0,03 M y citrato sódico 0,03 M de
aproximadamente 50ºC a aproximadamente 60ºC).
Las sondas de ácidos nucleicos degeneradas que
codifican toda o parte de la secuencia de aminoácidos también pueden
usarse para sondear bibliotecas de ADNc y/o genómicas de otra
especie, preferiblemente otra especie de mamífero. Sin embargo, se
prefiere realizar técnicas de PCR en un principio para obtener una
secuencia única para su uso en procedimientos de exploración
adicionales.
Como se describe en este documento, las
secuencias de polinucleótidos PDEXV que codifican PDEXV, fragmentos
del polipéptido, proteínas de fusión o equivalentes funcionales de
los mismos, pueden usarse para generar moléculas de ADN
recombinante que dirigen la expresión de PDEXV en células huésped
apropiadas. Debido a la degeneración inherente del código genético,
pueden usarse otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente
la misma secuencia o una secuencia de aminoácidos funcionalmente
equivalente, para clonar y expresar PDEXV. Como se entenderá por
los especialistas en la técnica, puede ser ventajoso producir
secuencias de nucleótidos que codifican PDE que tienen codones de
origen no natural. Pueden seleccionarse los codones preferidos por
un huésped procariota o eucariota particular (Murray E y col
(1989) Nuc Acid Res 17:477-508), por ejemplo, para
aumentar la el índice de expresión de PDEXV o para producir
transcritos de ARN recombinante que tienen propiedades deseables,
tales como semivida más larga, que los trascritos producidos a
partir de la secuencia de origen natural.
Las secuencias polinucleotídicas de la presente
invención obtenidas usando las técnicas descritas anteriormente
pueden usarse para obtener secuencias homólogas adicionales y
variantes usando las técnicas descritas anteriormente. También
pueden estar modificadas para su uso en la expresión de los
polipéptidos de la presente invención en una diversidad de sistemas
de células huésped, por ejemplo para optimizar las preferencias de
codones para una célula huésped particular en la que se están
expresando las secuencias polinucleotídicas. Pueden desearse otros
cambios de secuencia para introducir sitios de reconocimiento de
enzimas de restricción, o para alterar la propiedad o función de
los polipéptidos codificados por los polinucleótidos.
Las secuencias polinucleotídicas de PDEXV
alteradas que pueden usarse de acuerdo con la invención incluyen
deleciones, inserciones o sustituciones de diferentes restos de
nucleótidos diferentes que dan como resultado un polinucleótido que
codifica la misma o una PDE funcionalmente equivalente. La proteína
también puede tener deleciones, inserciones o sustituciones de
restos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y dan como
resultado una PDE funcionalmente equivalente. Las sustituciones
deliberadas de aminoácidos pueden hacerse en base a la similitud de
polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o
la naturaleza anfipática de los restos mientras se mantenga la
actividad biológica de PDE. Por ejemplo, los aminoácidos cargados
negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los
aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y
los aminoácidos con grupos de cabezas polares no cargadas que
tienen valores de hidrofilicidad similar incluyen leucina,
isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina,
treonina, fenilalanina, y tirosina.
Se incluyen en el alcance de la presente
invención alelos de PDE. Como se usa en este documento, un
"alelo" o "secuencia alélica" es una forma alternativa de
PDE. Los alelos son el resultado de una mutación, es decir, un
cambio en la secuencia de ácidos nucleicos, y generalmente
producen ARNm alterados o polipéptidos cuya estructura o función
puede estar o no estar alterada. Cualquier gen dado puede tener
ninguna, una o muchas formas alélicas. Los cambios mutacionales
habituales que dan lugar a alelos se atribuyen generalmente a
deleciones, adiciones o sustituciones de aminoácidos. Cada uno de
estos tipos de cambios puede suceder solo, o en combinación con los
otros, una o mas veces en una secuencia dada.
Las secuencias de nucleótidos de la presente
invención pueden modificarse para alterar una secuencia que codifica
PDE por una diversidad de razones, incluyendo aunque sin
limitación, alteraciones que modifican la clonación, procesamiento
y/o expresión del producto génico. Por ejemplo, las mutaciones
pueden introducirse usando técnicas que son bien conocidas en la
técnica, por ejemplo, mutagénesis dirigida de sitio para insertar
nuevos sitios de restricción, para alterar los patrones de
glicosilación o para cambiar la preferencia de codón.
Los polinucleótidos de la presente invención
pueden usarse para producir un cebador, por ejemplo, un cebador de
PCR, un cebador para una reacción de amplificación alternativa, una
sonda por ejemplo marcada con un marcador de revelado por un medio
convencional usando marcadores radiactivos o no radiactivos, o los
polinucleótidos pueden clonarse en vectores. Dichos cebadores,
sondas u otros fragmentos serán de al menos 25, preferiblemente al
menos 30 o 40 nucleótidos de longitud, y también se incluyen por el
término de polinucleótidos de la presente invención como se usa en
este documento.
Los polinucleótidos o cebadores de la presente
invención pueden llevar un marcador de revelado. Los marcadores
apropiados incluyen radioisótopos tales como ^{32}P o ^{35}S,
marcadores enzimáticos, u otros marcadores proteicos tales como
biotina. Dichos marcadores pueden añadirse a los polinucleótidos o
cebadores de la presente invención y pueden detectarse usando
técnicas conocidas per se.
Los polinucleótidos tales como un polinucleótido
y cebadores de ADN de acuerdo con la presente invención pueden
producirse de manera recombinante, de manera sintética, o por
cualquier medio disponible para los especialistas en la técnica.
También pueden clonarse por técnicas convencionales.
En general, los cebadores se producirán por
medios sintéticos, implicando una fabricación por etapas de la
secuencia de ácidos nucleicos deseada de un nucleótido cada vez.
Las técnicas para conseguir esto usando técnicas automáticas están
fácilmente disponibles en la técnica.
Los polinucleótidos más largos generalmente se
producirán usando medios recombinantes, por ejemplo usando técnicas
de clonación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Esto
implicará fabricar un par de cebadores (por ejemplo, de
aproximadamente 15-30 nucleótidos) para una región
de la secuencia de nucleótidos que se desea clonar, poner los
cebadores en contacto con el ARNm o ADNc obtenido de una célula
fúngica, vegetal o procariota, realizar una reacción en cadena de la
polimerasa en condiciones que provoquen la amplificación de la
región deseada, aislar el fragmento amplificado (por ejemplo,
purificando la mezcla de reacción en un gel de agarosa) y recuperar
el ADN amplificado. Los cebadores pueden diseñarse para que
contengan sitios de reconocimiento de enzimas de restricción
apropiados de modo que el ADN amplificado pueda clonarse en un
vector de clonación apropiado.
Las moléculas de ADN pueden modificarse para
aumentar la estabilidad intracelular y la semivida. Las
modificaciones posibles incluyen, aunque sin limitación, la adición
de secuencias flanqueantes de los extremos 5' y/o 3' de la molécula
y el uso de fosforotioato o 2' O-metilo en lugar de
engarces fosfodiesterasa en la estructura de la molécula.
La presente solicitud también describe secuencias
de nucleótidos que son capaces de hibridar con toda o parte de la
secuencia mostrada en la lista de secuencias adjunta o una
variación alélica de la misma. Estas secuencias de nucleótidos
pueden usarse en técnicas antisentido para modificar la expresión
de PDEXV. Como alternativa, estas secuencias (o porciones de las
mismas) pueden usarse como sonda, o para amplificar toda o parte de
dicha secuencia cuando se usa como cebador de la reacción en cadena
de la polimerasa.
Además de las secuencias de ADN recombinante, las
secuencias genómicas también son de utilidad en el contexto del
descubrimiento de fármacos. Puede ser valioso inhibir la
trascripción de ARNm de una isoforma particular en lugar de inhibir
su proteína traducida. Esto puede ser cierto con PDEXV, si hay
variantes de corte y empalme y donde las diferentes variantes de
corte y empalme pueden trascribirse a partir de promotores
diferentes. Hay un precedente de promotores múltiples que dirigen la
transcripción de una 3' fosfodiesterasa de nucleótido
2',3'-cíclico de cerebro de ratón (Kurihara T y
col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 170:1074 [1990]).
Otra utilidad de la invención es que las
secuencias de ADN, una vez conocidas, dan la información necesaria
para diseñar ensayos para detectar específicamente isoenzimas o
variantes de corte y empalme. Los pares de cebadores de PCR
específicos de isoenzimas son un ejemplo de un ensayo que depende
completamente del conocimiento de la secuencia de ADN específica de
la isoenzima o variante de corte y empalme. Dicho ensayo permite la
detección de ARNm para la isoenzima para acceder a la distribución
tisular y relevancia biológica de cada isoenzima para una patología
particular. Esto también permite la identificación de líneas
celulares que pueden expresar de manera natural solo una isoenzima
- un descubrimiento que podría evitar la necesidad de expresar
genes recombinantes. Si las isoenzimas de PDEXV específicas
demuestran asociarse con una patología particular, la invención
podría ser valiosa en el diseño de ensayos de diagnóstico para
detectar la presencia de ARNm de isoenzima.
Un nivel anormal de las secuencias de nucleótidos
que codifican una PDEXV en una muestra biológica puede reflejar una
aberración cromosómica, tal como una deleción o mutación de ácidos
nucleicos. Por consiguiente, las secuencias de nucleótidos que
codifican una PDEXV proporcionan la base para sondas que pueden
usarse en forma de diagnóstico para detectar aberraciones
cromosómicas tales como deleciones, mutaciones o translocaciones
cromosómicas en el gen que codifica PDE. La expresión del gen de
PDEXV puede estar alterada en dichas patologías o puede ser una
aberración cromosómica presente en la región del gen que codifica
una PDEXV.
En una realización alternativa de la invención,
la secuencia codificante de PDE podría sintetizarse, por completo o
en parte, usando procedimientos químicos bien conocidos en la
técnica (véase Caruthers MH y col (1980) Nuc Acids Res Symp
Ser 215-23, Horn T y col (1980) Nuc Acids Res
Symp Ser 225-232).
Como se usa en este documento "origen
natural" se refiere a una PDEXV con una secuencia de aminoácidos
encontrada en la naturaleza.
Como se usa en este documento, los términos
"aislado" y "purificado" se refiere a moléculas,
secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos, que se han retirado
de su medio natural y aislado o separado de al menos un componente
distinto con el que están asociados de manera natural.
Como se usa en este documento "biológicamente
activo" se refiere a una PDEXV de acuerdo con la presente
invención - tal como una PDEXV recombinante - que tiene una función
estructural similar (pero no necesariamente al mismo grado), y/o
función reguladora similar (pero no necesariamente al mismo grado)
y/o función bioquímica similar (pero no necesariamente al mismo
grado) y/o actividad inmunológica (pero no necesariamente al mismo
grado) de la PDEXV de origen natural. Específicamente, una PDEXV de
la presente invención tiene la capacidad de hidrolizar un
nucleótido cíclico, que es una de las actividades características de
la enzima PDE de la presente invención. Mas específicamente, una
PDEXV de la presente invención es capaz de catalizar la degradación
de AMPc y GMPc.
Como se usa en este documento, "actividad
inmunológica" se define como la capacidad de la PDEXV natural,
recombinante o sintética o cualquier oligopéptido de la misma, para
inducir una respuesta inmune específica en animales apropiados o
células y para unirse con anticuerpos específicos.
El término "derivado" como se usa en este
documento en relación con la secuencia de aminoácidos incluye la
modificación química de una PDEXV. Una ilustración de dichas
modificaciones podría ser el reemplazamiento de hidrógeno por un
grupo alquilo, acilo, o amino.
Como se usa en este documento una "deleción"
se define como un cambio en una secuencia de nucleótidos o
aminoácidos en la que uno o más nucleótidos o restos de
aminoácidos, respectivamente, están ausentes.
Como se usa en este documento una
"inserción" o "adición" es un cambio en una secuencia de
nucleótidos o aminoácidos que es el resultado de la adición de uno
o más nucleótidos o restos de aminoácidos, respectivamente, en
comparación con la PDE de origen natural.
Como se usa en este documento "sustitución"
es el resultado del reemplazamiento de uno o más nucleótidos o
aminoácidos por nucleótidos o aminoácidos diferentes,
respectivamente.
El término "homólogo" con respecto a la
secuencia de nucleótidos de la presente invención y la secuencia de
aminoácidos de la presente invención puede ser sinónimo de
variaciones alélicas de las secuencias.
En particular, el término "homología" como
se usa en este documento puede equipararse con el término
"identidad". Aquí, la homología de secuencia con respecto a la
secuencia de nucleótidos de la presente invención y la secuencia de
aminoácidos de la presente invención puede determinarse por una
comparación "visual" simple (es decir, una comparación
estricta) de una cualquiera o más de las secuencias con otra
secuencia para ver si la otra secuencia tiene al menos un 95% de
identidad con la secuencia o secuencias. La homología de secuencia
relativa (es decir, identidad de secuencia) también puede
determinarse por programas informáticos disponibles en el mercado
que pueden calcular el porcentaje de homología entre dos o más
secuencias. Un ejemplo típico de dicho programa informático es
CLUSTAL.
El % de homología puede calcularse sobre
secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra
secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara
directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia,
un resto cada vez. Esto se llama un alineamiento "sin huecos".
Típicamente, dichos alineamientos sin huecos se realizan solo sobre
una cantidad relativamente corta de restos (por ejemplo menos de 50
aminoácidos contiguos).
Aunque esto es un procedimiento muy simple y
lógico, falla en tener en consideración que, por ejemplo, en un par
de secuencias idénticas de otro modo, una inserción o deleción
provocará que los restos de aminoácidos siguientes queden fuera del
alineamiento, dando potencialmente como resultado, por tanto, una
reducción grande en el % de homología cuando se realiza un
alineamiento global. Por consiguiente, la mayoría de los
procedimientos de comparación de secuencia se diseñan para que
produzcan alineamientos óptimos que tengan en cuenta posibles
inserciones y deleciones sin penalizar excesivamente la puntuación
de homología global. Esto se consigue insertando "huecos" en
el alineamiento de secuencia para intentar maximizar la homología
local.
Sin embargo, estos procedimientos más complejos
asignan "penalizaciones por hueco" a cada hueco que sucede en
el alineamiento de modo que, para la misma cantidad de aminoácidos
idénticos, un alineamiento de secuencia con la menor cantidad de
huecos posible - reflejando una relación más alta entre las dos
secuencias comparadas - conseguirá una puntuación más alta que uno
con muchos huecos. Los "costes de huecos afines" se usan
típicamente de modo que carguen un coste relativamente alto para la
existencia de un hueco y una penalización más pequeña para cada
resto posterior en el hueco. Este es el sistema de puntuación de
hueco usado más habitualmente. Las penalizaciones por hueco altas
producirán, por supuesto, alineamientos optimizados con menos
huecos. La mayoría de los programas de alineamiento permiten
modificar las penalizaciones por hueco. Sin embargo, se prefiere
usar los valores por defecto cuando se usa dicho software para
comparaciones de secuencia. Por ejemplo, cuando se usa el paquete
GCG Wisconsin Bestfit (véase a continuación) la penalización por
hueco por defecto para secuencias de aminoácidos es -12 para un
hueco y -4 para cada extensión.
El cálculo de % de homología máximo por lo tanto
requiere en primer lugar la producción de un alineamiento óptimo,
teniendo en cuenta las penalizaciones por hueco. Un programa
informático apropiado para realizar dicho alineamiento es el
paquete GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, U.S.A.;
Devereux y col., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Los
ejemplos de otros software que pueden realizar comparaciones de
secuencia incluyen, aunque sin limitación, el paquete BLAST (véase,
Ausubel y col., 1999 ibid - Capítulo 18), FASTA
(Atschul y col., 1990, J. Mol. Biol.,
403-410) y el juego de herramientas de comparación
GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para una
búsqueda off-line y on-line (véase,
Ausubel y col., 1999 ibid, páginas
7-58 a 7-60). Sin embargo, para
algunas aplicaciones se prefiere el uso del programa GCG
Bestfit.
Aunque el % de homología final puede medirse en
términos de identidad, en algunos casos, el procedimiento de
alineamiento en sí mismo típicamente no se basa en una comparación
de pares todo-o-nada. En su lugar,
generalmente se usa una matriz de puntuación de similitud en escala
que asigna puntuaciones a cada comparación por pares en base a la
similitud química o distancia evolutiva. Un ejemplo de dicha matriz
habitualmente usada es la matriz BLOSUM62 -
la matriz por defecto para el juego de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin generalmente usan los valores por defecto públicos o suministran una tala de comparación de símbolos habituales (véase el manual del usuario para detalles adicionales). Se prefiere usar los valores por defecto públicos para el paquete GCG, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.
la matriz por defecto para el juego de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin generalmente usan los valores por defecto públicos o suministran una tala de comparación de símbolos habituales (véase el manual del usuario para detalles adicionales). Se prefiere usar los valores por defecto públicos para el paquete GCG, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.
Una vez que el software ha producido un
alineamiento óptimo, es posible calcular el % de homología,
preferiblemente el % de identidad de secuencia. El software
típicamente hace esto como parte de la comparación de secuencia y
genera un resultado numérico.
Como se ha indicado, para algunas aplicaciones,
la homología de secuencia (o identidad) puede determinarse usando
cualquier algoritmo de homología apropiado, usando por ejemplo
parámetros por defecto. Para un análisis de cuestiones básicas en
la búsqueda de similitud de bases de datos de secuencia, véase
Altschul y col (1994) Nature Genetics 6:119-129.
Para algunas aplicaciones, se emplea el algoritmo BLAST, con
parámetros ajustados a valores por defecto. El algoritmo BLAST se
describe con detalle en
http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html. De manera ventajosa,
"homología sustancial" cuando se evalúa por BLAST equivale a
secuencias que coinciden con un valor ESPERADO de al menos
aproximadamente 7, preferiblemente al menos aproximadamente 9 y más
preferiblemente 10 o más. El umbral por defecto para el valor
ESPERADO en la búsqueda BLAST habitualmente es 10.
Deben usarse Penalizaciones por Hueco cuando se
determina la identidad de secuencia, después se usan preferiblemente
los siguientes parámetros:
| Para blast | |
| Abrir hueco | 0 |
| Extensión de hueco | 0 |
| Para clustal | ADN | Proteína | |
| Tamaño de palabra | 2 | 1 | K triple |
| Penalización por hueco | 10 | 10 | |
| Extensión de hueco | 0,1 | 0,1 |
Otros procedimientos de programas informáticos
para determinar la identidad y similitud entre las dos secuencias
incluyen, aunque sin limitación, el paquete de programas GCG
(Devereux y col 1984 Nucleic Acids Research 12: 387) y FASTA
(Altschul y col 1990 J Molec Biol 403-410).
Los términos "variante" o "derivado" en
relación con las secuencias de aminoácidos de la presente invención
incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de,
reemplazamiento de, deleción de o adición de un (o más) aminoácido a
partir de o a la secuencia a condición de que la secuencia de
aminoácidos resultante tenga actividad PDE, preferiblemente que
tenga al menos la misma actividad que el polipéptido presentado en
la lista de secuencias.
Las secuencias de la presente invención pueden
modificarse para su uso en la presente invención. Típicamente, las
modificaciones se hacen de modo que mantengan la actividad PDE de
la secuencia. Las sustituciones de aminoácidos pueden hacerse, por
ejemplo de 1, 2 ó 3 a 10, 20 ó 30 sustituciones a condición de que
la secuencia modificada mantenga la actividad PDE. Las
sustituciones de aminoácidos pueden incluir el uso de análogos de
origen no natural, por ejemplo para aumentar la semivida en plasma
sanguíneo de un polipéptido administrado terapéuticamente.
Las sustituciones conservativas pueden hacerse,
por ejemplo, de acuerdo con la siguiente Tabla. Los aminoácidos en
el mismo bloque de la segunda columna y preferiblemente en la misma
línea de la tercera columna pueden sustituirse entre sí:
Como se ha indicado anteriormente, las proteínas
de la invención típicamente se fabrican por medios recombinantes,
por ejemplo como se describe en este documento, y/o usando medios
sintéticos usando técnicas bien conocidas por los especialistas en
la técnica tales como síntesis en fase sólida. Las variantes y
derivados de dichas secuencias incluyen proteínas de fusión, donde
las proteínas de fusión comprenden al menos la secuencia de
aminoácidos de la presente invención unida (directa o
indirectamente) a otra secuencia de aminoácidos. Estas secuencias
de aminoácidos distintas - que a veces se mencionan como compañeros
de proteína de fusión - otorgarán típicamente una funcionalidad
favorable - tal como para ayudar a la extracción y purificación de
la secuencia de aminoácidos de la presente invención. Los ejemplos
de compañeros de proteína de fusión incluyen
glutatión-S-transferasa (GST),
6xHis, GAL4 (dominios de unión a ADN y/o activación de la
transcripción) y \beta-galactosidasa. También
puede ser conveniente incluir un sitio de escisión proteolítica
entre el compañero de proteína de fusión y la secuencia proteica de
la presente invención de modo que permita la retirada del último.
Preferiblemente, el compañero de proteína de fusión no impedirá la
función de la proteína de la presente invención.
Los términos "variante" o "derivado" en
relación con la secuencia de nucleótidos de la presente invención
incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de,
reemplazamiento de, deleción de o adición de un (o más) ácido
nucleico a partir de o a la secuencia a condición de que la
secuencia de nucleótidos resultante codifique un polipéptido que
tenga actividad PDE, preferiblemente que tenga al menos la misma
actividad que las secuencias presentadas en la lista de
secuencias.
Como se ha indicado anteriormente, con respecto a
la homología de secuencia, preferiblemente hay al menos un 95%, más
preferiblemente al menos un 98%, de homología con las secuencias
mostradas en la lista de secuencias en este documento. Las
comparaciones de homología de nucleótidos pueden realizarse como se
ha descrito anteriormente. Para algunas aplicaciones, un programa de
comparación de secuencias preferido es el programa GCG Wisconsin
Bestfit descrito anteriormente. La matriz de puntuación por defecto
tiene un valor de coincidencia de 10 para cada nucleótido y -9 para
cada falta de coincidencia. La penalización por creación de hueco
por defecto es -50 y la penalización por extensión de hueco por
defecto es -3 para cada nucleótido.
Como se usa en este documento, los términos
"variante", "homólogo", "fragmento" y "derivado"
abarcan variaciones alélicas de las secuencias.
El término "variante" también incluye
secuencias que son complementarias a secuencias que son capaces de
hibridar con las secuencias de nucleótidos presentadas en este
documento.
El término "hibridación" como se usa en este
documento incluirá "el procedimiento por el que una cadena de
ácidos nucleicos se une con una cadena complementaria a través del
apareamiento de bases" (Coombs J (1994) Dictionary of
Biotechnology, Stockton Press, Nueva York NY) así como el
procedimiento de amplificación como se realiza en tecnologías de
reacción en cadena de la polimerasa como se describe en Dieffenbach
CW y GS Dveksler (1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Press, Plainview NY).
Las condiciones de hibridación se basan en la
temperatura de fusión (Tm) del complejo de unión a ácido nucleico,
como se explica en Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular
Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press,
San Diego CA), y confieren una "rigurosidad" definida como se
explica a continuación.
La rigurosidad de hibridación se refiere a
condiciones en las que los híbridos de ácidos polinucleicos son
estables. Dichas condiciones son evidentes para los especialistas
en el campo. Como se sabe por los especialistas en la técnica, la
estabilidad de los híbridos se refleja en la temperatura de fusión
(Tm) del híbrido que disminuye aproximadamente 1 a 1,5ºC con cada
disminución del 1% en la homología de secuencia. En general, la
estabilidad de un híbrido es una función de la concentración de ión
sodio y la temperatura. Típicamente, la reacción de hibridación se
realiza en condiciones de rigurosidad más alta, seguido por lavados
de rigurosidad variada.
Como se usa en este documento, rigurosidad alta
se refiere a condiciones que permiten la hibridación de solo las
secuencias de ácidos nucleicos que forman híbridos estables en Na+
1 M a 65-68ºC.
La rigurosidad máxima típicamente sucede a
aproximadamente Tm-5ºC (5ºC por debajo de la Tm de
la sonda).
La alta rigurosidad sucede a aproximadamente 5ºC
a 10ºC por debajo de la Tm de la sonda. Se pueden proporcionar
condiciones de alta rigurosidad, por ejemplo, por hibridación en
una solución acuosa que contiene 6 x SSC, 5 x solución de Denhardt,
SDS al 1% (dodecilsulfato sódico), Na+ pirofosfato 0,1 M y 0,1 mg/ml
de ADN de esperma de salmón desnaturalizado como competidor no
específico. Después de la hibridación, puede hacerse un lavado de
alta rigurosidad en varias etapas, con un lavado final
(aproximadamente 30 minutos) a la temperatura de hibridación en
0,2-0,1 x SSC, SDS al 0,1%.
La rigurosidad moderada, o intermedia,
típicamente sucede a aproximadamente 10ºC a 20ºC por debajo de la Tm
de la sonda.
La rigurosidad baja típicamente sucede a
aproximadamente 20ºC a 25ºC por debajo de la Tm de la sonda.
Como se entenderá por los especialistas en la
técnica, una hibridación de rigurosidad máxima puede usarse para
identificar o detectar las secuencias polinucleotídicas idénticas
mientras que puede usarse una hibridación de rigurosidad intermedia
(o baja) para identificar o detectar secuencias polinucleotídicas
similares o relacionadas.
Rigurosidad moderada se refiere a condiciones
equivalentes a hibridación en solución descrita anteriormente pero a
aproximadamente 60-62ºC. En ese caso el lavado
final se realiza a la temperatura de hibridación en 1 x SSC, SDS al
0,1%.
Rigurosidad baja se refiere a condiciones
equivalentes a hibridación en solución descrita anteriormente a
aproximadamente 50-52ºC. En ese caso, el lavado
final se realiza a la temperatura de hibridación en 2 x SSC, SDS al
0,1%.
Se entiende que estas condiciones pueden
adaptarse y duplicarse usando una diversidad de tampones, por
ejemplo, tampones basados en formamida, y temperaturas. La solución
de Denhardt y SSC son bien conocidos por los especialistas en la
técnica como otros tampones de hibridación apropiados (véase, por
ejemplo Sambrook, y col., eds (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York
o Ausubel, y col., eds. (1990) Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons, Inc.). Las condiciones óptimas de
hibridación tienen que determinarse empíricamente, ya que la
longitud y el contenido en GC de la sonda también juegan un
papel.
Los polinucleótidos de la invención capaces de
hibridar selectivamente con las secuencias de nucleótidos
presentadas en este documento, o con sus complementarios, serán de
al menos un 95%, preferiblemente al menos un 98% homólogos con las
secuencias de nucleótidos correspondientes presentadas en este
documento sobre una región de al menos 25, preferiblemente al menos
30, por ejemplo al menos 40, 60 ó 100 o más nucleótidos
contiguos.
El término "que puede hibridar
selectivamente" significa que el polinucleótido usado como sonda
se usa en condiciones donde se encuentra que un polinucleótido
diana de la invención hibrida con la sonda a un nivel
significativamente por encima del de fondo. La hibridación de fondo
puede suceder a causa de otros polinucleótidos presentes, por
ejemplo, en la biblioteca de ADNc o ADN genómico a explorar. En
este caso, el fondo implica un nivel de señal generado por
interacción entre la sonda y un miembro de ADN no específico de la
biblioteca que es de menos de 10 veces, preferiblemente de menos de
100 veces la intensidad de la interacción específica observada con
el ADN diana. La intensidad de interacción puede medirse, por
ejemplo, por radiomarcaje de la sonda, por ejemplo, con
^{32}P.
La presente solicitud también describe secuencias
de nucleótidos que pueden hibridar con una cualquiera o más de las
secuencias de nucleótidos de la presente invención en condiciones
rigurosas (por ejemplo, 65ºC 7 0,1 x SSC
{1 x SSC = NaCl 0,15 M, Na_{3}Citrato 0,015 M pH 7,0}).
{1 x SSC = NaCl 0,15 M, Na_{3}Citrato 0,015 M pH 7,0}).
Cuando el polinucleótido de la presente invención
es de doble hélice, ambas hélices del dúplex, individualmente o en
combinación, se incluyen por la presente invención. Cuando el
polinucleótido es de hélice única, se entiende que la secuencia
complementaria de ese polinucleótido también se incluye en el
alcance de la presente invención.
Los polinucleótidos que no son 100% homólogos a
las secuencias de la presente invención pero que pertenecen al
alcance de la invención pueden obtenerse de varias formas. Otras
variantes de las secuencias descritas en este documento pueden
obtenerse por ejemplo sondeando bibliotecas de ADN fabricadas a
partir de un intervalo de individuos, por ejemplo individuos de
diferentes poblaciones. Además, pueden obtenerse otros homólogos
virales/bacterianos, o celulares, particularmente homólogos
celulares encontrados en células de mamífero (por ejemplo, células
de rata, ratón, bovinas y de primate), y dichos homólogos y
fragmentos de los mismos en general serán capaces de hibridar
selectivamente con las secuencias mostradas en la lista de
secuencias en este documento. Dichas secuencias pueden obtenerse
sondeando bibliotecas de ADNc fabricadas a partir de o bibliotecas
de ADN genómico a partir de otra especie animal, y sondeando dichas
bibliotecas con sondas que comprenden toda o parte de la secuencia
en la lista de secuencias adjunta en condiciones de rigurosidad
media a alta. Se aplican consideraciones similares para obtener
homólogos de especies y variantes alélicas de las secuencias
polipeptídicas o de nucleótidos de la invención.
Las variantes y homólogos de cepa/especie también
pueden obtenerse usando PCR degenerada, que usará cebadores
diseñados para secuencias diana en las variantes y homólogos que
codifican secuencias de aminoácidos conservadas en las secuencias
de la presente invención. Las secuencias conservadas pueden
predecirse, por ejemplo, por alineamiento de las secuencias de
aminoácidos a partir de varias variantes/homólogos. Los
alineamientos de secuencia pueden realizarse usando software
informático conocido en la técnica. Por ejemplo, se usa ampliamente
el programa GCG Wisconsin PileUp.
Los cebadores usados en PCR degenerada contendrán
una o más posiciones degeneradas y se usarán en condiciones de
rigurosidad inferior que las usadas para las secuencias de
clonación con cebadores de secuencia única frente a secuencias
conocidas.
Como alternativa, dichos polinucleótidos pueden
obtenerse por mutagénesis dirigida de sitio de secuencias
caracterizadas. Esto puede ser útil cuando, por ejemplo, se
requieran cambios de codón silenciosos en secuencias para optimizar
preferencias de codón para una célula huésped particular en la que
las secuencias polinucleotídicas se están expresando. Pueden
desearse otros cambios de secuencia para introducir sitios de
reconocimiento de enzimas de restricción, o para alterar la
propiedad o función de los polipéptidos codificados por los
polinucleótidos.
Los polinucleótidos de la invención pueden usarse
para producir un cebador, por ejemplo, un cebador de PCR, un
cebador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda,
por ejemplo, marcada con un marcador de revelado por medios
convencionales usando marcadores radiactivos o no radiactivos, o los
polinucleótidos pueden clonarse en vectores. Dichos cebadores,
sondas y otros fragmentos serán de al menos 25, preferiblemente al
menos 30 ó 40 nucleótidos de longitud, y también se incluyen por el
término de polinucleótidos de la invención como se usa en este
documento.
Los polinucleótidos tales como polinucleótidos de
ADN y sondas de acuerdo con la invención pueden producirse de
manera recombinante, sintética o por cualquier medio disponible por
los especialistas en la técnica. También pueden clonarse por
técnicas convencionales.
En general, los cebadores se producirán por
medios sintéticos, implicando una fabricación por etapas de la
secuencia de ácidos nucleicos deseada de un nucleótido cada vez.
Las técnicas para conseguir esto usando técnicas automáticas están
fácilmente disponibles en la técnica.
Los polinucleótidos más largos generalmente se
producirán usando medios recombinantes, por ejemplo, usando técnicas
de clonación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Esto
implicará fabricar un par de cebadores (por ejemplo, de
aproximadamente 15 a 30 nucleótidos) que flanquean una región de la
secuencia de dirección de lípidos que se desea clonar, poner los
cebadores en contacto con el ARNm o ADNc obtenido de una célula
animal o humana, realizar una reacción en cadena de la polimerasa
en condiciones que provoquen la amplificación de la región deseada,
aislar el fragmento amplificado (por ejemplo, purificando la mezcla
de reacción en un gel de agarosa) y recuperar el ADN amplificado.
Los cebadores pueden diseñarse para que contengan sitios de
reconocimiento de enzimas de restricción apropiados de modo que el
ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonación
apropiado.
Preferiblemente, el polinucleótido de la presente
invención está unido de manera operativa a una secuencia
reguladora, que es capaz de proporcionar la expresión de la
secuencia codificante, tal como por la célula huésped elegida. A
modo de ejemplo, la presente invención incluye un vector que
comprende el polinucleótido de la presente invención unido de
manera operativa a dicha secuencia reguladora, es decir, el vector
es un vector de expresión.
El término "unido de manera operativa" se
refiere a una yuxtaposición donde los componentes descritos están
en una relación que les permite funcionar de su modo pretendido.
Una secuencia reguladora "unida de manera operativa" a una
secuencia codificante está ligada de modo que la expresión de la
secuencia codificante se consigue en una condición compatible con
las secuencias de control.
El término "secuencias reguladoras" incluye
promotores y potenciadores y otras señales de regulación de la
expresión.
El término "promotor" se usa en el sentido
normal de la técnica, por ejemplo, un sitio de unión a ARN
polimerasa.
La expresión potenciada del polinucleótido que
codifica el polipéptido de la presente invención también puede
conseguirse por la selección de regiones reguladoras heterólogas,
por ejemplo, regiones promotoras, líder de secreción y
terminadoras, que sirven para aumentar la expresión y, si se desea
los niveles de secreción de la proteína de interés a partir de un
huésped de expresión elegido y/o para proporcionar el control
inducible de la expresión del polipéptido de la presente
invención.
Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos de
la presente invención puede estar unida de manera operativa al
menos a un promotor.
A parte del promotor nativo del gen que codifica
el polipéptido de la presente invención, pueden usarse otros
promotores para dirigir la expresión del polipéptido de la presente
invención. El promotor puede seleccionarse por su eficacia en
dirigir la expresión del polipéptido de la presente invención en el
huésped de expresión deseado.
En otra realización, puede seleccionarse un
promotor constitutivo para dirigir la expresión del polipéptido
deseado de la presente invención. Dicha construcción de expresión
puede proporcionar ventajas adicionales ya que evita la necesidad
de cultivar los huéspedes de expresión en un medio que contenga un
sustrato de inducción.
Los ejemplos de promotores constitutivos fuertes
y/o inducibles que se prefieren para su uso en huéspedes de
expresión fúngicos son los que se obtienen de los genes fúngicos
para los promotores de xilanasa (xlnA), fitasa,
ATP-sintetasa, subunidad 9 (oliC),
triosafosfato isomerasa (tpi), alcohol deshidrogenasa
(AdhA), \alpha-amilasa (amy),
amiloglucosidasa (AG - del gen glaA), acetamidasa
(amdS) y
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (gpd).
Los ejemplos de promotores de levaduras fuertes
son los que se pueden obtener de los genes para la alcohol
deshidrogenasa, lactasa, 3-fosfogliceratoquinasa y
triosafosfato isomerasa.
Los ejemplos de promotores bacterianos fuertes
son los promotores de \alpha-amilasa y
SP02 así como promotores de genes de proteasa
extracelular.
También pueden usarse promotores híbridos para
mejorar la regulación inducible de la construcción de
expresión.
El promotor puede incluir adicionalmente
características para asegurar o para aumentar la expresión en un
huésped apropiado. Por ejemplo, las características pueden ser
regiones conservadas tales como una caja Pribnow o una caja TATA. El
promotor también puede contener otras secuencias que afecten (tal
como para mantener, potenciar, disminuir) los niveles de expresión
de la secuencia de nucleótidos de la presente invención. Por
ejemplo, otras secuencias apropiadas incluyen el intrón Sh1 o un
intrón ADH. Otras secuencias incluyen elementos inducibles - tales
como elementos inducibles por temperatura, compuesto químico, luz o
estrés. Además, pueden estar presentes elementos apropiados para
potenciar la trascripción o traducción. Un ejemplo del último
elemento es la secuencia señal 5' TMV (véase, Sleat Gene 217 [1987]
217-225; y Dawson Plant Mol. Biol. 23 [1993]
97).
A menudo, es deseable para el polipéptido de la
presente invención que a secretarse a partir del huésped de
expresión en el medio de cultivo a partir del cual el polipéptido
de la presente invención puede recuperarse más fácilmente. De
acuerdo con la presente invención, la secuencia líder de secreción
puede seleccionarse en base al huésped de expresión deseado.
También pueden usarse secuencias señal híbridas con el contexto de
la presente invención.
Los ejemplos típicos de secuencias líder de
secreción heterólogas son las que se originan del gen de
amiloglucosidasa (AG) fúngica (glaA - las versiones de 18 y
24 aminoácidos, por ejemplo, de Aspergillus), el gen del
factor a (levaduras, por ejemplo, Saccharomyces y
Kluyveromyces) o el gen de \alpha-amilasa
(Bacillus).
El término "construcción" - que es sinónimo
de términos tales como "conjugado", "casete" e
"híbrido" - incluye la secuencia de nucleótidos de acuerdo con
la presente invención unida directa o indirectamente a un promotor.
Un ejemplo de una unión indirecta es el suministro de un grupo
espaciador apropiado tal como una secuencia intrónica, tal como el
intrón Sh1 o el intrón ADH, entre el promotor y la secuencia de
nucleótidos de la presente invención. Lo mismo es cierto para el
término "fusionado" en relación con la presente invención, que
incluye unión directa o indirecta. En cada caso, los términos no
incluyen la combinación natural de la secuencia de nucleótidos que
codifica la proteína asociada de manera habitual con el promotor
génico de tipo silvestre y cuando ambos están en su medio
natural.
La construcción también puede contener o expresar
un marcador, que permite la selección de la construcción genética
en, por ejemplo, una bacteria, preferiblemente del género
Bacillus, tal como Bacillus subtilis, o plantas en
las que se ha transferido. Existen diversos marcadores que pueden
usarse, tales como por ejemplo los que codifican la
manosa-6-fosfato isomerasa
(especialmente para plantas) o los marcadores que proporcionan
resistencia a antibióticos - por ejemplo, resistencia a G418,
higromicina, bleomicina, kanamicina y gentamicina.
Preferiblemente la construcción de la presente
invención comprende al menos la secuencia de nucleótidos de la
presente invención unida de manera operativa a unpromotor.
El término "vector" incluye vectores de
expresión y vectores de transformación y vectores lanzadera.
El término "vector de expresión" significa
una construcción capaz de la expresión in vivo o in
vitro.
El término "vector de transformación"
significa una construcción capaz de transferirse de una entidad a
otra entidad - que puede ser de la misma especie o puede ser de
diferente especie. Si la construcción es capaz de transferirse de
una especie a otra - tal como de un plásmido de E. coli a una
bacteria, tal como del genero Bacillus, entonces el vector
de transformación a veces se llama "vector lanzadera". También
puede ser una construcción capaz de transferirse de un plásmido de
E. coli a una Agrobacterium a una planta.
Los vectores de la presente invención pueden
transformarse en una célula huésped apropiada como se describe a
continuación para proporcionar la expresión de un polipéptido de la
presente invención. Por tanto, en un aspecto adicional la presente
solicitud describe un procedimiento para preparar polipéptidos de
acuerdo con la presente invención que comprende cultivar una célula
huésped transformada o transfectada con un vector de expresión como
se ha descrito anteriormente en condiciones para proporcionar la
expresión por el vector de una secuencia codificante que codifica
los polipéptidos, y recuperar los polipéptidos expresados.
Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores
plasmídicos, virales o fágicos con un origen de replicación,
opcionalmente un promotor para la expresión de dicho polinucleótido
y opcionalmente un regulador del promotor.
Los vectores de la presente invención pueden
contener uno o más genes marcadores de selección. Los sistemas de
selección más apropiados para microorganismos industriales son los
formados por el grupo de marcadores de selección que no requieren
una mutación en el organismo huésped. Los ejemplos de marcadores de
selección fúngicos son los genes para acetamidasa (amdS), ATP
sintetasa, subunidad 9 (oliC),
orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa
(pvrA), resistencia a pleomicina y benomil (benA). Los
ejemplos de marcadores de selección no fúngicos son el gen de
resistencia a G418 bacteriano (esto también puede usarse en
levaduras, pero no en hongos filamentosos), el gen de resistencia a
ampicilina (E. coli), el gen de resistencia a neomicina
(Bacillus) y el gen uidA de E. coli, que
codifica \beta-glucuronidasa (GUS).
Los vectores pueden usarse in vitro, por
ejemplo para la producción de ARN o usarse para transfectar o
transformar una célula huésped.
Por tanto, los polinucleótidos de la presente
invención pueden incorporarse en un vector recombinante
(típicamente un vector replicable), por ejemplo un vector de
clonación o expresión. El vector puede usarse para replicar el ácido
nucleico en una célula huésped compatible. Por tanto en una
realización adicional, la presente solicitud describe un
procedimiento para fabricar polinucleótidos de la presente invención
introduciendo un polinucleótido de la presente invención en un
vector replicable, introduciendo el vector en una célula huésped
compatible, y haciendo crecer la célula huésped en condiciones que
provocan la replicación del vector. El vector puede recuperarse de
la célula huésped. Las células huésped apropiadas se describen a
continuación junto con los vectores de expresión.
La presente invención también se refiere también
al uso de células huésped modificadas genéticamente que expresan una
PDEXV o variante, homólogo, fragmento o derivado de la misma en
procedimientos de exploración para la identificación de inhibidores
y antagonistas de la PDEXV que podría modular la actividad
fosfodiesterasa modulando de este modo los niveles de nucleótido
cíclico. Dichas células huésped modificadas genéticamente pueden
usarse para explorar bibliotecas de péptidos o moléculas orgánicas
capaces de modular la actividad de PDEXV. Los antagonistas e
inhibidores de PDEXV, tales como anticuerpos, péptidos o moléculas
orgánicas pequeñas proporcionarán la base para las composiciones
farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades asociadas con, por
ejemplo, PEDXV. Dichos inhibidores o antagonistas pueden
administrarse solos o en combinación con otros agentes terapéuticos
para el tratamiento de dichas enfermedades.
La presente invención también se refiere a
vectores de expresión y células huésped que comprenden secuencias
polinucleotídicas que codifican PDEXV o una variante de la misma
para la producción in vivo o in vitro de la proteína
PDEXV o para explorar agentes que puedan afectar a la expresión o
actividad de PEDXV.
El término "tejido" como se usa en este
documento incluye tejido per se y órgano.
El término "célula huésped" - en relación
con la presente invención incluye cualquier célula que podría
comprender una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína
recombinante de acuerdo con la presente invención y/o productos
obtenidos de la misma, donde un promotor puede permitir la expresión
de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención
cuando está presente en la célula huésped.
Por tanto, una realización adicional de la
presente invención proporciona células huésped trasformadas o
transfectadas con un polinucleótido de la presente invención.
Preferiblemente dicho polinucleótido se alberga en un vector para la
replicación y expresión de dichos polinucleótidos. Las células se
elegirán para que sean compatibles con dicho vector y pueden, por
ejemplo, ser células procariotas (por ejemplo bacterianas),
fúngicas, de levaduras o vegetales.
La bacteria gram-negativa E.
coli se usa ampliamente como huésped para la expresión de genes
heterólogos. Sin embargo, tienden a acumularse grandes cantidades
de proteína heteróloga en el interior de la célula. La purificación
posterior de la proteína deseada a partir del total de las
proteínas intracelulares de E. coli puede a veces ser
difícil.
En contraste a E. coli, bacterias del
género Bacillus son muy apropiadas como huéspedes
heterólogos a causa de su capacidad para secretar proteínas en el
medio de cultivo. Otras bacterias apropiadas como huéspedes son las
de los géneros Streptomyces y Pseudomonas.
Dependiendo de la naturaleza del polinucleótido
que codifica el polipéptido de la presente invención, y/o lo
deseable del procesamiento adicional de la proteína expresada,
pueden preferirse huéspedes eucariotas tales como levaduras y otros
hongos. En general, las células de levaduras se prefieren sobre
células fúngicas a causa de su facilidad de manipulación. Sin
embargo, algunas proteínas se secretan mal a partir de la célula de
levadura, o en algunos casos no se procesan apropiadamente (por
ejemplo, hiperglicosilación en levaduras). En estos casos, debe
seleccionarse un organismo huésped fúngico diferente.
Los ejemplos de huéspedes de expresión apropiados
dentro del alcance de la presente invención son hongos tales como
especies Aspergillus (tales como las descritas en los
documentos EP-A-0184438 y
EP-A-0284603) y especies
Trichoderma; bacterias tales como especies Bacillus
(tales como las descritas en los documentos
EP-A-0134048 y
EP-A-0253455), especies
Streptomyces y especies Pseudomonas; y levaduras tales
como especies Kluyveromyces (tales como las descritas en los
documentos EP-A-0096430 y
EP-A-0301670) y especies
Saccharomyces. A modo de ejemplo, pueden seleccionarse
huéspedes de expresión típicos de Aspergillus niger, Aspergillus
niger var. tubigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus
aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus orvzae, Trichoderma
reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus
amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis y Saccharomyces
cerevisiae.
El uso de células huésped apropiadas - tales como
células de levadura, fúngicas y vegetales - pueden proporcionar
modificaciones post-traduccionales (por ejemplo,
miristoilación, glicosilación, truncado, lipidación y fosforilación
de tirosina, serina o treonina) según sea necesario para conferir
la actividad biológica óptima a los productos de expresión
recombinante de la presente invención.
El término "organismo" en relación con la
presente invención incluye cualquier organismo no humano que podría
comprender la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína
recombinante de acuerdo con la presente invención y/o productos
obtenidos de la misma, donde un promotor puede permitir la expresión
de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención
cuando está presente en el organismo. Los ejemplos de organismos
pueden incluir un hongo, levadura o una planta.
El término "organismo transgénico" en
relación con la presente invención incluye cualquier organismo no
humano que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la
proteína de acuerdo con la presente invención y/o productos
obtenidos de la misma, donde el promotor puede permitir la
expresión de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente
invención en el organismo. Preferiblemente, la secuencia de
nucleótidos se incorpora en el genoma del organismo.
El término "organismo transgénico" no
incluye la secuencia codificante de nucleótidos nativa de acuerdo
con la presente invención en su medio natural cuando está bajo en
control de su promotor nativo, que también está en su medio natural.
Además, la presente invención no incluye la proteína nativa de
acuerdo con la presente invención cuando está en su medio natural y
cuando se ha expresado por su secuencia codificante de nucleótidos
nativa que también está en su medio natural y cuando la secuencia de
nucleótidos está bajo el control de su promotor nativo que también
está en su medio natural.
Por lo tanto, el organismo transgénico de la
presente invención incluye un organismo que comprende una cualquiera
de, o combinaciones de, la secuencia de nucleótidos que codifica la
secuencia de aminoácidos de acuerdo con la presente invención,
construcciones de acuerdo con la presente invención (incluyendo
combinaciones de las mismas), vectores de acuerdo con la presente
invención, plásmidos de acuerdo con la presente invención, células
de acuerdo con la presente invención, tejidos de acuerdo con la
presente invención o los productos de los mismos. La célula u
organismo transformado podría preparar cantidades aceptables del
compuesto deseado, que podría retirarse fácilmente de la célula o
el organismo.
Como se ha indicado anteriormente, el organismo
huésped puede ser un organismo procariota o eucariota. Los ejemplos
de huéspedes procariotas apropiados incluyen E. coli y
Bacillus subtilis. Los contenidos sobre la transformación de
huéspedes procariotas está bien documentado en la técnica, por
ejemplo, véase Sambrook y col (Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) y
Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology
(1995), John Wiley & Sons, Inc.
Si se usa un huésped procariota entonces la
secuencia de nucleótidos puede necesitar modificarse apropiadamente
antes de la transformación - tal como por retirada de los
intrones.
En otra realización el organismo transgénico no
humano puede ser una levadura. A este respecto, la levadura también
puede usarse ampliamente como vehículo para la expresión de genes
heterólogos. La especie Saccharomyces cerevisiae tiene una
larga historia de uso industrial, incluyendo su uso para la
expresión de genes heterólogos. La expresión de genes heterólogos
en Saccharomyces cerevisiae se ha analizado por Goodey y col
(1987, Yeast Biotechnology, D R Berry y col, eds, páginas
401-429, Allen and Unwin, Londres) y por King y col
(1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton and G T
Yarronton, eds, páginas 107-133, Blackie,
Glasgow).
Por varias razones Saccharomyces
cerevisiae está bien preparado para la expresión de genes
heterólogos. Primero, es no patogénico para humanos y es incapaz de
producir ciertas endotoxinas. Segundo, tiene una larga historia de
uso seguro después de siglos de explotación comercial para diversos
propósitos. Esto ha conducido a una aceptabilidad pública amplia.
Tercero, el uso comercial extensivo y la investigación ferviente
del organismo ha dado como resultado una riqueza de conocimiento
acerca de la genética y fisiología así como las características de
fermentación a gran escala de Saccharomyces cerevisiae.
Se proporciona un análisis de los principios de
la expresión de genes heterólogos en Saccharomyces
cerevisiae y la secreción de productos génicos por E
Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression
of heterologous genes", Yeast, Vol 5, Anthony H Rose and J
Stuart Harrison, eds, 2ª edición, Academic Press Ltd.).
Están disponibles varios tipos de vectores de
levaduras, incluyendo vectores de integración, que requieren la
recombinación con el genoma huésped para su mantenimiento, y
vectores plasmídicos de replicación autónoma.
Para preparar el Saccharomyces tansgénico,
se preparan construcciones de expresión insertando la secuencia de
nucleótidos de la presente invención en una construcción diseñada
para la expresión en levaduras. Se han desarrollado varios tipos de
construcciones usadas para la expresión heteróloga. Las
construcciones contienen un promotor activo en levaduras fusionado
con la secuencia de nucleótidos de la presente invención,
habitualmente se usa un promotor de origen de levaduras, tal como el
promotor GAL1. Habitualmente se usa una secuencia señal de origen
de levaduras, tal como la secuencia que codifica el péptido señal
SUC2. Un terminador activo en levaduras termina el sistema de
expresión.
Para la transformación de levaduras se han
desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo, un
Saccharomyces transgénico de acuerdo con la presente
invención puede prepararse siguiendo los contenidos de Hinnen y col
(1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA
75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104); e Ito, H y
col (1983, J Bacteriology 153, 163-168).
Las células de levadura transformadas se
seleccionan usando diversos marcadores de selección. Entre los
marcadores usados para la transformación hay varios marcadores
auxotróficos tales como LEU2, HIS4 y TRP1, y marcadores de
resistencia a antibiótico dominantes tales como los marcadores del
antibiótico de aminoglicósido, por ejemplo, G418.
Otro organismo huésped es una planta. El
principio básico en la construcción de plantas modificadas
genéticamente es insertar la información genética en el genoma
vegetal para obtener un mantenimiento estable del material genético
insertado.
Existen varias técnicas para insertar la
información genética, siendo los dos principios generales la
introducción directa de la información genética y la introducción
de la información genética por el uso de un sistema vectorial.
Puede encontrarse un análisis de las técnicas generales en artículos
por Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991]
42:205-225) y Christou
(Agro-Food-Industry
Hi-Tech marzo/abril 1994 17-27).
Pueden encontrarse contenidos adicionales sobre la trasformación
vegetal en el documento
EP-A-0449375.
Por tanto, la presente solicitud también describe
un procedimiento para trasformar una célula huésped con una
secuencia de nucleótidos mostrada en la lista de secuencias adjunta
o una variante de la misma.
Las células huésped transformadas con la
secuencia que codifica el nucleótido PDE pueden cultivarse en
condiciones apropiadas para la expresión y recuperación de la
proteína codificada a partir del cultivo celular. La proteína
producida por una célula recombinante puede secretarse o puede
estar contenida de manera intracelular dependiendo de la secuencia
y/o el vector usado. Como se entenderá por los especialistas en la
técnica, los vectores de expresión que contienen secuencias que
codifican PDE pueden diseñarse con secuencias señal, que dirigen la
secreción de las secuencias que codifican PDE a través de una
membrana celular procariota o eucariota particular. Otras
construcciones recombinantes pueden unir la secuencia que codifica
PDE con la secuencia de nucleótidos que codifica un dominio
polipeptídico, que facilitará la purificación de proteínas solubles
(Kroll DJ y col (1993) DNA Cell Biol
12:441-53, véase también el análisis anterior de
vectores que contienen proteínas de fusión).
De acuerdo con la presente solicitud, la
producción del polipéptido de la presente invención puede verse
afectada por el cultivo de, por ejemplo, huéspedes de expresión
microbianos, que se han transformado con uno o más polinucleótidos
de la presente invención, en un medio de fermentación de nutrientes
convencional. La selección del medio apropiado puede basarse en la
elección de huéspedes de expresión y/o basarse en las necesidades
reguladoras de la construcción de expresión. Dichos medios son bien
conocidos por los especialistas en la técnica. El medio puede, si se
desea, contener componentes adicionales que favorecen a los
huéspedes de expresión transformados sobre otros microorganismos
potencialmente contaminantes.
Por tanto, la presente solicitud también describe
un procedimiento para producir un polipéptido que tiene actividad
de PDEXV, comprendiendo el procedimiento las etapas de a)
transformar una célula huésped con una secuencia de nucleótidos
mostrada en la lista de secuencias adjunta o una variante de la
misma; y b) cultivar la célula huésped trasformada en condiciones
apropiadas para la expresión de dicho polipéptido.
La presente solicitud también describe un
procedimiento para producir un polipéptido que tiene actividad de
PDEXV, comprendiendo el procedimiento las etapas de a) cultivar una
célula huésped que se a trasformado con una secuencia de
nucleótidos mostrada en la lista de secuencias adjunta o una
variante de la misma en condiciones apropiadas para la expresión de
dicho polipéptido; y b) recuperar dicho polipéptido del cultivo de
la célula
huésped.
huésped.
La presente solicitud también describe un
procedimiento para producir un polipéptido que tiene actividad de
PDEXV, comprendiendo el procedimiento las etapas de a) trasformar
una célula huésped con una secuencia de nucleótidos mostrada en la
lista de secuencias adjunta o una variante de la misma; b) cultivar
la célula huésped transformada en condiciones apropiadas para la
expresión de dicho polipéptido; y c) recuperar dicho polipéptido
del cultivo de la célula huésped.
Las ribozimas son moléculas de ARN enzimático
capaces de catalizar la escisión específica de ARN. El mecanismo de
la acción de la ribozima implica la hibridación específica de
secuencia de la molécula de ribozima con el ARN diana
complementario, seguido por una escisión endonucleolítica. Las
moléculas de ribozima con motivo de cabeza de martillo modificadas
pueden catalizar especifica y eficazmente le escisión
endonucleolítica de secuencias de ARN de PDE.
Los sitios de escisión de ribozima específicos en
cualquier ARN potencial diana se identifican en un principio por el
examen de la molécula diana para sitios de escisión por ribozima,
que incluyen las siguientes secuencias, GUA, GUU y GUC. Una vez
identificados, las secuencias de ARN cortas entre 15 y 20
ribonucleótidos que corresponden a la región del gen diana que
contiene el sitio de escisión pueden evaluarse para características
estructurales secundarias que pueden hacer a la secuencia
oligonucleotídica inoperable. Lo apropiado de las dianas candidatas
también puede evaluarse ensayando la accesibilidad a hibridación
con oligonucleótidos complementarios usando ensayos de protección
de ribonucleasa.
Tanto las moléculas de ARN y ADN antisentido como
las ribozimas de la presente invención pueden prepararse por
cualquier procedimiento conocido en la técnica para la síntesis de
moléculas de ARN. Estas incluyen técnicas para sintetizar
químicamente oligonucleótidos tales como síntesis química con
fosforamidita en fase sólida. Como alternativa, las moléculas de
ARN pueden generarse por transcripción in vitro o in
vivo de secuencias de ADN que codifican la molécula de ARN
antisentido. Dichas secuencias de ADN pueden incorporarse en una
amplia diversidad de vectores con promotores de la ARN polimerasa
apropiados tales como T7 o SP6. Como alternativa, pueden
introducirse construcciones de ADNc antisentido que sintetizan ARN
antisentido de manera constitutiva o inducible en líneas celulares,
células o tejidos.
La presencia de la secuencia que codifica el
polinucleótido de PED puede detectarse por hibridación
ADN-ADN o ADN-ARN o amplificación
usando sondas, porciones o fragmentos de la secuencia presentada en
la lista de secuencias adjunta. Los ensayos basados en la
amplificación de ácidos nucleicos implican el uso de
oligonucleótidos u oligómeros basados en la secuencia codificante de
PDE para detectar transformantes que contienen ADN o ARN de PDE.
Como se usa en este documento "oligonucleótidos" u
"oligómeros" puede referirse a una secuencia de ácidos
nucleicos de al menos aproximadamente 10 nucleótidos y como mucho
aproximadamente 60 nucleótidos, preferiblemente aproximadamente 15 a
30 nucleótidos, y más preferiblemente aproximadamente
20-25 nucleótidos que puede usarse como sonda o
amplímero. Preferiblemente, los oligonucleótidos se obtienen de la
región 3' de la secuencia de nucleótidos mostrada en la lista de
secuencias adjunta.
Se conocen en la técnica una diversidad de
protocolos para detectar y medir la expresión de polipéptido PDE,
tal como usando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos
para la proteína. Los ejemplos incluyen ensayo inmunoabsorbente de
enzimas unidas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y separación de
células activadas por fluorescencia (FACS). Se prefiere un
inmunoensayo de base monoclonal de dos sitios utilizando
anticuerpos monoclonales reactivos frente a dos epítopes no
interferentes en los polipéptidos PDE, pero puede emplearse un
ensayo de unión competitiva. Se describen estos y otros ensayos,
entre otros sitios, en Hampton R y col (1990, Serological
Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul MN) y Maddox DE
y col (1983, J Exp Med 158:121 1).
Se conocen por los especialistas en la técnica
una amplia diversidad de marcadores y técnicas de conjugación y
pueden usarse en diversos ensayos de ácidos nucleicos y
aminoácidos. Los medios para producir hibridación marcada o sondas
de PCR para la detección de secuencias polinucleotídicas de PDE
incluyen oligomarcaje, traslado de mella, marcaje final o
amplificación por PCR usando un nucleótido marcado. Como
alternativa, la secuencia codificante de PDE, o cualquier porción de
la misma, puede clonarse en un vector para la producción de una
sonda de ARNm. Dichos vectores son conocidos en la técnica, están
disponibles en el mercado, y pueden usarse para sintetizar sondas
de ARN in vitro por la adición de una ARN polimerasa
apropiada tal como T7, T3 o SP6 y nucleótidos marcados.
Varias compañías tales como Pharmacia Biotech
(Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI), y US Biochemical Corp
(Cleveland, OH) suministran kits comerciales y protocolos para
estos procedimientos. Las moléculas informadoras apropiadas o
marcadores incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes,
quimioluminiscentes, o cromogénicos así como sustratos, cofactores,
inhibidores, partículas magnéticas y similares. Las patentes que
contienen el uso de dichos marcadores incluyen los documentos
US-A-3817837;
US-A-3850752;
US-A-3939350;
US-A-3996345;
US-A-4277437;
US-A-4275149 y
US-A-4366241. Además, pueden
producirse inmunoglobulinas recombinantes como se muestra en el
documento US-A-4816567.
Los procedimientos adicionales para cuantificar
la expresión de una molécula particular incluyen radiomarcaje
(Melby PC y col 1993 J Immunol Methods
159:235-44) o nucleótidos biotinilados (Duplaa C
y col 1993 Anal Biochem 229-36),
co-amplificación de un ácido nucleico de control, y
curvas patrón en las que los resultados experimentales se
interpolan. La cuantificación de muestras múltiples puede
acelerarse realizando el ensayo en un formato ELISA donde el
oligómero de interés está presente en diversas diluciones y una
respuesta espectrofotométrica o calorimétrica da una cuantificación
rápida.
Aunque la presencia/ausencia de la expresión del
gen marcador sugiere que el gen de interés también está presente,
su presencia y expresión debe confirmarse. Por ejemplo, si la
secuencia que codifica PDE se inserta en la secuencia del gen
marcador, las células recombinantes que contienen regiones que
codifican PDE pueden identificarse por la ausencia de la función del
gen marcador. Como alternativa, puede colocarse un gen marcador en
tándem con una secuencia que codifica PDE bajo el control de un
promotor único. La expresión del gen marcador en respuesta a la
inducción o selección habitualmente también indica la expresión de
PDE.
Como alternativa, las células huésped, que
contienen la secuencia codificante para PDE y expresan las regiones
que codifican PDE, pueden identificarse por una diversidad de
procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica. Estos
procedimientos incluyen, aunque sin limitación, hibridación
ADN-ADN o ADN-ARN y técnicas de
bioensayo o inmunoensayo de proteína, que incluyen tecnologías
basadas en membrana, basadas en solución, o basadas en chip para la
detección y/o cuantificación del ácido nucleico o proteína.
La secuencia de aminoácidos de la presente
invención también puede usarse para generar anticuerpos - tal como
por el uso de técnicas convencionales - frente a la secuencia de
aminoácidos.
Pueden usarse procedimientos bien conocidos en la
técnica para la producción de anticuerpos frente a polipéptidos
PDEXV. Dichos anticuerpos incluyen, aunque sin limitación,
policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena única, fragmentos
Fab y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab.
Se prefieren especialmente anticuerpos neutralizantes, es decir,
los que inhiben la actividad biológica de polipéptidos PDE, para
diagnóstico y terapia.
Para la producción de anticuerpos, pueden
inmunizarse diversos huéspedes incluyendo cabras, conejos, ratas,
ratones, etc., por inyección con el inhibidor o cualquier porción,
variante, homólogo, fragmento o derivado del mismo u oligopéptido
que mantenga las propiedades inmunogénicas. Dependiendo de la
especie huésped, pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la
respuesta inmunológica. Dichos adyuvantes incluyen, aunque sin
limitación, adyuvante de Freund, geles minerales tales como
hidróxido de aluminio, y sustancias tensioactivas tales como
lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos,
emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana, y
dinitrofenol. BCG (Bacilli Calmette-Guerin) y
Corynebacterium parvum son adyuvantes humanos potencialmente
útiles, que pueden emplearse.
Los anticuerpos monoclonales frente a la
secuencia de aminoácidos también pueden preparase usando cualquier
técnica, que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo
por líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, aunque
sin limitación, la técnica de hibridoma descrita en un principio
por Koehler y Milstein (1975 Nature 256:495-497),
la técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor y col
(1983) Immunol Today 4:72; Cote y col(1983) Proc Natl Acad
Sci 80:2026-2030) y la técnica de hibridoma de EBV
(Cole y col (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,
Alan R Liss Inc, páginas 77-96). Además, pueden
usarse las técnicas desarrolladas para la producción de
"anticuerpos quiméricos", el corte y empalme de genes de
anticuerpos de ratón con genes de anticuerpos humanos para obtener
una molécula con especificidad antigénica y actividad biológica
apropiadas (Morrison y col (1984) Proc Natl Acad Sci
81:6851-6855; Neuberger y col (1984) Nature
312:604-608; Takeda y col (1985) Nature
314:452-454). Como alternativa, pueden adaptarse las
técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena
única (documento US-A-4946779) para
producir anticuerpos de cadena única específicas inhibidoras.
Los anticuerpos también pueden producirse
induciendo la producción in vivo en la población de
linfocitos o explorando bibliotecas de inmunoglobulina recombinante
o paneles de reactivos de unión altamente específicos como se
describe en Orlandi y col (1989, Proc Natl Acad Sci
86:3833-3837), y Winter G y Milstein C (1991; Nature
349:293-299).
También pueden generarse fragmentos de
anticuerpo, que contienen sitios de unión específicos para PDEXV.
Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen, aunque sin limitación, los
fragmentos F(ab')_{2} que pueden producirse por digestión
con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que
pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos
F(ab')_{2}. Como alternativa, pueden construirse
bibliotecas de expresión de Fab para permitir la rápida y fácil
identificación de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad
deseada (Huse WD y col (1989) Science
256:1275-1281).
Una técnica alternativa implica la exploración de
bibliotecas que presentan fagos donde, por ejemplo, el fago expresa
fragmentos scFv en la superficie de su cubierta con una amplia
diversidad de regiones determinantes de complementariedad (CDR).
Esta técnica es bien conocida en la técnica.
Los anticuerpos específicos para PDEXV son útiles
para el diagnóstico de afecciones y enfermedades asociadas con la
expresión del polipéptido PDEXV. Se conocen bien en la técnica una
diversidad de protocolos para ensayos de unión competitiva o
inmunorradiométricos usando anticuerpos policlonales o monoclonales
con especificidades establecidas. Dichos inmunoensayos implican
típicamente la formación de complejos entre polipéptidos PDEXV y su
anticuerpo específico (o molécula de unión a PDEXV similar) y la
medida de la formación de complejo. Se prefiere un inmunoensayo de
base monoclonal de dos sitios que utiliza anticuerpos monoclonales
reactivos frente a dos epítopes no interferentes en una proteína
PDEXV específica, pero también puede emplearse un ensayo de unión
competitiva. Estos ensayos se describen en Maddox DE y
col(1983, J Exp Med 158:121 1).
Los anticuerpos anti-PDEXV son
útiles para el diagnóstico de inflamación, afecciones asociadas con
la proliferación de células hematopoyéticas e infección por VIH u
otros trastornos o enfermedades caracterizadas por la expresión
anormal de una PDEXV. Los ensayos de diagnóstico para una PDEXV
incluyen procedimientos que utilizan el anticuerpo y un marcador
para detectar un polipéptido PDEXV en fluidos corporales humanos,
células, tejidos o secciones o extractos de dichos tejidos. Dichos
polipéptidos y anticuerpos pueden usarse con o sin modificación.
Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos se marcarán
uniéndolos, de manera covalente o no covalente, a una molécula
informadora. Se conoce una amplia diversidad de moléculas
informadoras por los especialistas en la técnica.
Los anticuerpos pueden usarse en un procedimiento
para detectar polipéptidos de la invención presentes en muestras
biológicas por un procedimiento que comprende: (a) proporcionar un
anticuerpo de la invención; (b) incubar la muestra biológica con
dicho anticuerpo en condiciones que permiten la formación de un
complejo anticuerpo-antígeno; y (c) determinar si se
forma el complejo anticuerpo-antígeno que comprende
dicho anticuerpo.
Dependiendo de las circunstancias, las muestras
apropiadas pueden incluir extractos de tejidos tales como tejidos
de cerebro, mama, ovario, pulmón, colon, páncreas, testículos,
hígado, músculo y óseo o de crecimientos neoplásicos obtenidos de
dichos tejidos.
Los anticuerpos pueden unirse a un soporte sólido
y/o compactarse en kits en un recipiente apropiado junto con
reactivos apropiados, controles, instrucciones y similares.
La presente solicitud también describe un
procedimiento de ensayo para detectar la presencia de PDEXV en
células (tal como células humanas) que comprende: (a) realizar una
reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa sobre
ARN (tal como ARN total) de dichas células usando un par de
cebadores de reacción en cadena de la polimerasa que son
específicos para PDEXV, como se determina a partir de la secuencia
de ADN mostrada en la lista de secuencias adjunta o una variación
alélica de la misma; y (b) ensayar la aparición de un fragmento de
PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de tamaño apropiado - tal
como por electroforesis en gel de agarosa.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento para identificar agentes (tal como compuestos, otras
sustancias o composiciones que comprenden los mismos) que afectan
(tal como inhibir o modificar de otro modo) la actividad de PEDXV
y/o la expresión de la misma, comprendiendo el procedimiento poner
en contacto PDEXV o la secuencia de nucleótidos que codifica la
misma con el agente y después medir la actividad de PDEXV y/o la
expresión de la misma.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento para identificar agentes (tal como compuestos, otras
sustancias o composiciones que comprenden los mismos) que afectan
selectivamente (tal como inhibir o modificar de otro modo) la
actividad de PEDXV y/o la expresión de la misma, comprendiendo el
procedimiento poner en contacto PEDXV o la secuencia de nucleótidos
que codifica la misma con el agente y después medir la actividad de
PEDXV y/o la expresión de la misma.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento para identificar agentes (tal como compuestos, otras
sustancias o composiciones que comprenden los mismos) que afectan
(tal como inhibir o modificar de otra manera) la actividad de PEDXV
y/o la expresión de la misma, comprendiendo el procedimiento medir
la actividad de PEDXV y/o la expresión de la misma en presencia del
agente o después de la adición del agente en: (a) una línea celular
en la que se ha incorporado ADN recombinante que comprende la
secuencia de ADN mostrada en la lista de secuencias adjunta o una
variación alélica de la misma, o (b) una población de células o
línea celular que expresa selectivamente de manera natural PDEXV.
Preferiblemente, la actividad de PEDXV se determina por el
procedimiento de ensayo descrito anteriormente.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento para identificar agentes (tal como compuestos, otras
sustancias o composiciones que comprenden los mismos) que afectan
selectivamente (tal como inhibir o modificar de otra manera) la
actividad de PEDXV y/o la expresión de la misma, comprendiendo el
procedimiento medir la actividad de PEDXV y/o la expresión de la
misma en presencia del agente o después de la adición del agente
en: (a) una línea celular en la que se ha incorporado ADN
recombinante que comprende la secuencia de ADN mostrada en la lista
de secuencias adjunta o una variación alélica de la misma, o (b)
una población de células o línea celular que expresa selectivamente
de manera natural PEDXV. Preferiblemente, la actividad de PEDXV se
determina por el procedimiento de ensayo descrito anteriormente.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para explorar un agente para la modulación
(preferiblemente para modulación específica) de la actividad de
PEDXV (o una variante de la misma) o la expresión de la secuencia de
nucleótidos que codifica la misma (incluyendo una variante de la
misma), comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a)
proporcionar un agente candidato; (b) combinar PEDXV (o la variante
de la misma) o la secuencia de nucleótidos que codifica la misma (o
la variante de la misma) con el agente candidato durante un tiempo
suficiente para permitir la modulación en condiciones apropiadas; y
(c) detectar la modulación del agente candidato sobre PEDXV (o la
variante de la misma) o la secuencia de nucleótidos que modifica la
misma (o la variante de la misma) para determinar si el agente
candidato modula la actividad de PEDXV (o la variante de la misma)
o la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica la misma
(o la variante de la misma).
La presente invención también proporciona un
procedimiento para explorar un agente para la afinidad de unión
específica con PEDXV (o la variante de la misma) o la secuencia de
nucleótidos que codifica la misma (incluyendo una variante de la
misma), comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a)
proporcionar un agente candidato; (b) combinar PEDXV (o la variante
de la misma) o la secuencia de nucleótidos que codifica la misma (o
la variante de la misma) con el agente candidato durante un tiempo
suficiente para permitir la unión en condiciones apropiadas; y (c)
detectar la unión del agente candidato a PEDXV (o la variante de la
misma) o la secuencia de nucleótidos que codifica la misma (o la
variante de la misma) para determinar si el agente candidato se une
a PEDXV (o la variante de la misma) o la secuencia de nucleótidos
que codifica la misma (o la variante de la misma).
La presente invención también proporciona un
procedimiento para identificar un agente que es capaz de modular
PEDXV, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) poner en
contacto el agente con PDEXV (o la variante de la misma) o la
secuencia de nucleótidos que codifica la misma (o la variante de la
misma), (b) incubar la mezcla de la etapa (a) con un nucleótido
cíclico en condiciones apropiadas para la hidrólisis del nucleótido
cíclico, (c) medir la cantidad de hidrólisis de nucleótido cíclico,
y (d) comparar la cantidad de hidrólisis de nucleótido cíclico de
la etapa (c) con la cantidad de hidrólisis de nucleótido cíclico
obtenido con PDEXV (o la variante de la misma) o la secuencia de
nucleótidos que codifica la misma (o la variante de la misma)
incubado con el compuesto, determinando de este modo si el agente
afecta (tal como estimular o inhibir) la hidrólisis de nucleótido
cíclico.
Por tanto, en ciertas realizaciones de la
presente invención, PDEXV o una variante de la misma y/o una línea
celular que expresa la PDEXV o una variante de la misma puede
usarse para explorar anticuerpos, péptidos, u otro agente, tal como
moléculas orgánicas o inorgánicas, que funcionen como moduladores de
la actividad fosfodiesterasa o para la expresión de la misma,
identificando de este modo un agente terapéutico capaz de modular
los niveles de nucleótido cíclico. Por ejemplo, los anticuerpos
anti-PDEXV capaces de neutralizar la actividad de
PDEXV pueden usarse para inhibir la hidrólisis por PEDXV de
nucleótidos cíclicos, aumentado de este modo sus niveles. Como
alternativa, la exploración de bibliotecas de péptidos o
bibliotecas orgánicas hechas por química de combinación con PDEXV
expresada de manera recombinante o una variante de la misma o líneas
celulares que expresan PDEXV o una variante de la misma puede ser
útil para la identificación de agentes terapéuticos que funcionen
modulando la hidrólisis por PDEXV de nucleótidos cíclicos. Pueden
explorarse compuestos sintéticos, productos naturales, y otras
fuentes de materiales potencialmente biológicamente activos en
varios modos considerados de rutina por los especialistas en la
técnica. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos que codifican
la región N-terminal de PDEXV pueden expresarse en
una línea celular que puede usarse para explorar moduladores
alostéricos, agonistas o antagonistas, de la actividad PDEXV. Como
alternativa, las secuencias de nucleótidos que codifican el dominio
catalítico conservado de PDEXV pueden expresarse en líneas celulares
y usarse para explorar inhibidores de la hidrólisis de nucleótidos
cíclicos.
La capacidad de un agente de ensayo para afectar
a la actividad de PDEXV o hidrólisis de nucleótido cíclico puede
determinarse midiendo los niveles de PDEXV o niveles de nucleótido
cíclico (como se describe en Smith y col 1993 Appl. Biochem.
Biotechnol. 41:189-218). También están disponibles
en el mercado kits de inmunoensayos para la medición de AMPc y GMPc
(por ejemplo, Amersham International, Arlington Heights, IL y
DuPont, Boston, MA). La actividad de PEDXV también puede
controlarse midiendo otras respuestas tales como fosforilación o
defosforilación de otras proteínas usando técnicas convencionales
desarrolladas para este propósito.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un procedimiento para identificar un compuesto que es
capaz de modular la actividad fosfodiesterasa de nucleótidos
cíclicos de una PDEXV, o una variante de la misma, que comprende las
etapas de a) poner en contacto el compuesto con una PDEXV, o una
variante de la misma, b) incubar la mezcla de la etapa a) con un
nucleótido cíclico en condiciones apropiadas para la hidrólisis del
nucleótido cíclico; c) medir la cantidad de hidrólisis de
nucleótido cíclico; y d) comprar la cantidad de hidrólisis de
nucleótido cíclico de la etapa c) con la cantidad de hidrólisis de
hidrólisis de nucleótido cíclico obtenida con la PDEXV, o una
variante de la misma, incubada sin el compuesto, determinando de
este modo si el compuesto estimula o inhibe la hidrólisis de
nucleótido cíclico. En una realización del procedimiento, el
fragmento puede ser de la región N-terminal de la
PDEXV y proporciona un procedimiento para identificar moduladores
alostéricos de la PDEXV. En otra realización de la presente
invención, el fragmento puede ser de la región carboxi terminal de
la PDEXV y proporciona un procedimiento para identificar
inhibidores de hidrólisis de nucleótido cíclico.
Un polipéptido PDEXV, sus fragmentos u
oligopéptidos inmunogénicos del mismo pueden usarse para explorar
compuestos terapéuticos en cualquiera de una diversidad de técnicas
de exploración de fármaco. El polipéptido empleado en dicho ensayo
puede estar libre en solución, fijado a un soporte sólido, soportado
sobre una superficie celular, o localizado intracelularmente. Puede
medirse la eliminación de la actividad o la formación de complejos
de unión entre un polipéptido PDEXV y el agente que se está
ensayando.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un procedimiento para explorar uno o una pluralidad de
compuestos para la modulación (preferiblemente modulación
específica, tal como afinidad de unión específica) de PDEXV o la
expresión de la misma, o una variante de la misma, que comprende
proporcionar uno o una pluralidad de compuestos; combinar una PDEXV
o una secuencia de nucleótidos que codifica la misma o una variante
de la misma con el compuesto o cada uno de una pluralidad de
compuestos durante un tiempo suficiente para permitir la modulación
en condiciones apropiadas; y detectar la unión de una PDEXV, o una
variante de la misma, a cada uno de la pluralidad de compuestos,
identificando de este modo el compuesto o compuestos que modulan
una PDEXV o una secuencia de nucleótidos que codifica la misma. En
dicho ensayo, la pluralidad de compuestos puede producirse por
técnicas de química de combinación conocidas por los especialistas
en la técnica.
Otra técnica para exploración de fármaco
proporciona una búsqueda de alto rendimiento de compuestos que
tienen afinidad de unión apropiada para los polipéptidos PDEXV y se
basa en el procedimiento descrito con detalle en Geysen, Solicitud
de Patente Europea Nº 84/03564, publicada el 13 de septiembre de
1984. En resumen, se sintetizan grandes cantidades de compuestos de
ensayo peptídicos pequeños diferentes sobre un sustrato sólido, tal
como pines plásticos o alguna otra superficie. Los compuestos de
ensayo peptídicos se hacen reaccionar con fragmentos de PDEXV y se
lavan. Después se detecta una PDEXV unida - tal como por
procedimientos apropiadamente adaptados bien conocidos en la
técnica. También puede recubrirse directamente una PDEXV purificada
sobre placas para su uso en las técnicas de exploración de fármaco
mencionadas anteriormente. Como alternativa, pueden usarse
anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e
inmovilizarlo en un soporte sólido.
Esta solicitud también contempla el uso de
ensayos de exploración de fármaco competitivos en los que los
anticuerpos neutralizantes capaces de unirse a PDEXV compiten
específicamente con un compuesto de ensayo por la unión a PDEXV. De
este modo, los anticuerpos pueden usarse para detectar la presencia
de cualquier péptido, que forma uno o más determinantes antigénicos
con una PDEXV.
El procedimiento de ensayo de la presente
invención puede ser una exploración de alto rendimiento (HTS). A
este respecto, pueden adaptarse los contenidos del documento WO
84/03564 para la PDE de la presente invención.
Pueden adaptarse los contenidos del documento
US-A-5738985 para el procedimiento
de ensayo de la presente invención.
El agente identificado por los ensayos de la
presente invención puede ser, por ejemplo, un compuesto orgánico o
un compuesto inorgánico. El agente puede ser, por ejemplo, una
secuencia de nucleótidos que es antisentido para toda o parte de
las secuencias mostrada en la lista de secuencias adjunta.
La presente solicitud también contempla el uso de
un agente que afecta a la actividad de PDEXV (tal como inhibir,
modula, o agonizar) en uno cualquiera o más del sistema
cardiovascular, el cuerpo cavernoso, riñón, hígado, músculo
esquelético, testículo, próstata.
La presente solicitud también contempla una
composición de diagnóstico para la detección de secuencias
polinucleotídicas de PDEXV. La composición de diagnóstico puede
comprenden una cualquiera de las secuencias mostradas en la lista de
secuencias adjunta o una variante de las mismas.
Para proporcionar una base para el diagnóstico de
la enfermedad, deben establecerse valores normales o patrón a
partir de la expresión de polipéptido PDEXV. Esto se consigue
combinando fluidos corporales o extractos celulares tomados de
sujetos normales, animales o humanos, con anticuerpo frente al
polipéptido PDEXV en condiciones apropiadas para la formación de
complejo, que es bien conocido en la técnica. La cantidad de
formación de complejo patrón puede cuantificarse comparándolo con
una serie de dilución de controles positivos donde una cantidad
conocida de anticuerpo se combina con concentraciones conocidas de
un polipéptido PDEXV purificado. Después, los valores patrón
obtenidos de muestras normales pueden compararse con valores
obtenidos de muestras de sujetos potencialmente afectados por un
trastorno o enfermedad relacionado con la expresión de un
polipéptido PDEXV. La desviación entre los valores patrón y del
sujeto establecen la presencia de la patología.
Un polinucleótido de PDEXV, o cualquier parte del
mismo, puede proporcionar la base para un compuesto de diagnóstico
y/o terapéutico. Para propósitos de diagnóstico, pueden usarse
secuencias polinucleotídicas de PDEXV para detectar y cuantificar
la expresión génica en afecciones, trastornos o enfermedades en las
que puede estar implicada la actividad de PDEXV.
La secuencia polinucleotídica que codifica PDEXV
puede usarse para el diagnóstico de enfermedades que son el
resultado de la expresión de PDEXV. Por ejemplo, pueden usarse
secuencias polinucleotídicas que codifican PDEXV en ensayos de
hibridación o PCR de tejidos de biopsias o autopsias o fluidos
biológicos, tales como suero, fluido sinovial o biopsia tumoral,
para detectar anormalidades en la expresión de PDEXV. La forma de
dichos procedimientos cualitativos o cuantitativos puede incluir
análisis de Southern o northern, dot blot u otras tecnologías
basadas en membrana; tecnologías de PCR; tecnologías de varilla, pin
o chip; y ELISA u otras tecnologías formales de muestras múltiples.
Todas estas técnicas son bien conocidas en la técnica y son de
hecho la base de muchos kits de diagnóstico disponibles en el
mercado.
Dichos ensayos pueden adaptarse para evaluar la
eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico particular y
pueden usarse en estudios animales, en ensayos clínicos, o en el
control del tratamiento de un paciente individual. Para
proporcionar una base para el diagnóstico de enfermedad, debe
establecerse un perfil normal o patrón para la expresión de PDE.
Esto se consigue combinando fluidos corporales o extractos
celulares tomados de sujetos normales, animales o humanos, con PDEXV
o una porción de la misma, en condiciones apropiadas para la
hibridación o amplificación. La hibridación patrón puede
cuantificarse comparando los valores obtenidos de sujetos normales
con una serie de dilución de controles positivos realizada en el
mismo experimento donde se usa una cantidad conocida de PDEXV. Los
valores patrón obtenidos de muestras normales pueden compararse con
valores obtenidos de muestras de sujetos potencialmente afectados
por un trastorno o enfermedad relacionada con la expresión de la
secuencia que codifica PDE. La desviación entre los valores patrón
y del sujeto establece la presencia de la patología. Si se
establece la enfermedad, se administra un agente terapéutico
existente, y puede generarse un perfil o valores de tratamiento.
Finalmente, el ensayo puede repetirse en una base regular para
evaluar si los valores progresan o vuelven al patrón normal o
convencional. Pueden usarse perfiles de tratamiento sucesivos para
demostrar la eficacia del tratamiento durante un periodo de varios
días o varios meses.
Por tanto, la presente solicitud contempla el uso
de un polipéptido PDEXV, o variante, homólogo, fragmento derivado
del mismo, para producir anticuerpos anti-PDEXV que
pueden, por ejemplo, usarse de modo diagnóstico para detectar y
cuantificar niveles de PDEXV en patologías.
La presente solicitud también contempla ensayos
de diagnóstico y kits para la detección de PDEXV en células y
tejidos que comprenden una PDEXV purificada, que puede usarse como
control positivo, y anticuerpos anti-PDEXV. Dichos
anticuerpos pueden usarse en tecnologías basadas en solución,
basadas en membrana, o basadas en tejido para detectar cualquier
patología o afección relacionada con la expresión de proteína PDEXV
o expresión de deleciones o una variante, homólogo, fragmento
derivado de la misma.
Otro aspecto de la presente solicitud es la
descripción de sondas de hibridación o PCR de ácidos nucleicos que
son capaces de detectar secuencias polinucleotídicas, incluyendo
secuencias genómicas, que codifican la región codificante de PDE o
moléculas altamente relacionadas, tales como alelos. La
especificidad de la sonda, es decir, si se ha obtenido de una
región o dominio altamente conservado, conservado o no conservado,
y la rigurosidad de la hibridación o amplificación (alta, intermedia
o baja) determinará si la sonda identifica solo la secuencia que
codifica PDEXV de origen natural, o secuencias relacionadas. Las
sondas para la detección de secuencias de ácidos nucleicos
relacionadas se seleccionan de regiones de nucleótidos conservadas o
altamente conservadas de los miembros de la familia PDE de
nucleótidos cíclicos, tales como la región 3', y dichas sondas
pueden usarse en una combinación de sondas degeneradas. Para la
detección de secuencias de ácidos nucleicos idénticas, o donde se
desea la máxima especificidad, se seleccionan sondas de ácidos
nucleicos de las regiones de nucleótidos no conservadas o regiones
únicas de polinucleótidos PDE. Como se usa en este documento, el
término "región de nucleótidos no conservada" se refiere a una
región de nucleótidos que es única para la secuencia que codifica
PDE descrita en este documento y no se encuentra en miembros de la
familia relacionados, tal como PDE de nucleótidos cíclicos
conocidas.
La PCR como se describe en los documentos
US-A-4683195,
US-A-4800195 y
US-A-4965188 proporciona usos
adicionales para oligonucleótidos en base a la secuencia PDEXV.
Dichos oligómeros generalmente se sintetizan químicamente, pero
pueden generarse enzimáticamente o producirse a partir de una fuente
recombinante. Los oligómeros generalmente comprenden dos secuencias
de nucleótidos, una con orientación con sentido (5'\rightarrow3')
y una con antisentido (3'\leftarrow5') empleadas en condiciones
optimizadas para la identificación de un gen específico o afección.
Los mismos dos oligómeros, conjuntos combinados de oligómeros, o
incluso una combinación degenerada de oligómeros pueden emplearse
en condiciones menos rigurosas para la detección y/o cuantificación
de secuencias de ADN o ARN altamente relacionadas.
La secuencia de ácidos nucleicos para PDEXV
también puede usarse para generar sondas de hibridación como se ha
descrito previamente, para mapear la secuencia genómica endógena.
La secuencia puede mapearse en un cromosoma particular o para una
región específica del cromosoma usando técnicas bien conocidas.
Estas incluyen hibridación in situ con tramos cromosómicos
(Verma y col (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic
Techniques, Pergamon Press, Ciudad de Nueva York), preparaciones
cromosómicas clasificadas por flujo, o construcciones cromosómicas
artificiales tales como YAC, cromosomas artificiales bacterianos
(BAC), construcciones PI bacterianas o bibliotecas de ADNc de
cromosomas únicos.
La hibridación in situ de preparaciones
cromosómicas y técnicas de mapeo físico tales como análisis de
unión usando marcadores cromosómicos establecidos es inapreciable
en mapas genéticos amplios. Pueden encontrarse ejemplos de mapas
genéticos en Science (1995; 270:410f y 1994; 265:1981f). A menudo la
colocación de un gen en el cromosoma de otra especie de mamífero
puede revelar marcadores asociados incluso si no se conoce el
número o brazo de un cromosoma humano particular. Pueden asignarse
nuevas secuencias a brazos cromosómicos, o partes de los mismos, por
mapeo físico. Esto proporciona información valiosa para los
investigadores que buscan genes de enfermedades usando clonación
posicional u otras técnicas de descubrimiento de genes. Una vez se
ha localizado toscamente una enfermedad o síndrome, tal como ataxia
telangiectasia (AT), por unión genética a una región genómica
particular, por ejemplo, AT a 11q22-23 (Gatti y
col (1988) Nature 336:577-580), cualquier
secuencia con mapeo en esa área puede representar genes asociados o
reguladores para investigación adicional. La secuencia de
nucleótidos de la presente invención también puede usarse para
detectar diferencias en la localización cromosómica debido a
translocación, inversión, etc. entre individuos normales,
portadores o afectados.
La presente solicitud también contempla una
composición farmacéutica para tratar a un individuo en necesidad de
la misma debido a la actividad de PDEXV, comprendiendo la
composición una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que
afecta (tal como inhibir) a dicha actividad y un vehículo,
diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
Por tanto, la presente solicitud también
contempla composiciones farmacéuticas que comprenden los agentes
descritos anteriormente (es decir, un agente capaz de modular el
patrón de expresión de la secuencia de nucleótidos de la presente
invención o la actividad del producto de expresión de la misma y/o
un agente identificado por un ensayo de acuerdo con la presente
invención). A este respecto, y en particular para terapia humana,
aunque los agentes pueden administrarse solos, generalmente se
administrarán en mezcla con un vehículo, excipiente o diluyente
farmacéutico seleccionado con respecto a la vía pretendida de
administración y la práctica farmacéutica convencional.
Se incluyen en el alcance de agente secuencias
oligonucleotídicas, moléculas de ARN y ADN antisentido y ribozimas,
que funcionan desestabilizando el ARNm de PDEXV o inhibiendo la
traducción de una PDEXV. Dichas secuencias de nucleótidos pueden
usarse en condiciones donde podría ser preferible aumentar los
niveles de nucleótido cíclico, tal como en inflamación.
Una molécula antisentido de PDEXV puede
proporcionar la base para el tratamiento de diversas afecciones
anormales relacionadas con, por ejemplo, actividad de PDEXV
aumentada.
Una molécula antisentido de ácidos nucleicos de
PDEXV puede usarse para bloquear la actividad de la PDEXV en
afecciones donde podría ser preferible elevar los niveles de
nucleótido cíclico.
Los vectores de expresión obtenidos de
retrovirus, adenovirus, virus del herpes o vaccinia, o de diversos
plásmidos bacterianos, pueden usarse para suministrar las moléculas
con sentido o antisentido de PDEXV recombinante a la población de
células diana. Pueden usarse procedimientos que son bien conocidos
por los especialistas en la técnica para construir vectores
recombinantes que contienen PDEXV. Como alternativa, puede
suministrarse PDEXV recombinante a las células diana en
liposomas.
La secuencia de ADNc de longitud completa y/o sus
elementos reguladores posibilitan a los investigadores usar PDEXV
como herramienta en investigaciones con sentido (Youssoufian H y HF
Lodish 1993 Mol Cell Biol 13:98-104) o antisentido
(Eguchi y col (1991) Annu Rev Biochem
60:631-652) de función génica. Pueden usarse
oligonucleótidos, diseñados a partir del ADNc o secuencias de
control obtenidas del ADN genómico in vitro o in vivo
para inhibir la expresión. Dicha tecnología ahora es bien conocida
en la técnica, y pueden diseñarse oligonucleótidos con sentido o
antisentido de fragmentos más grandes a partir de diversas
localizaciones a lo largo de las regiones codificantes o control.
Los oligonucleótidos apropiados, que pueden ser de 20 nucleótidos
de longitud, pueden usarse para aislar secuencias de PDEXV o
moléculas altamente relacionadas a partir de bibliotecas
humanas.
Adicionalmente, la expresión de PDEXV puede
modularse transfectando una célula o tejido con vectores de
expresión, que expresan altos niveles de un fragmento de PDEXV en
afecciones en las que podría ser preferible bloquear la actividad
fosfodiesterasa aumentado de este modo los niveles de nucleótidos
cíclicos. Dichas construcciones pueden saturar a las células de
secuencias con sentido o antisentido no traducibles. Incluso en
ausencia de integración en el ADN, dichos vectores pueden continuar
transcribiendomoléculas de ARN hasta que todas las copias del vector
se inutilicen por nucleasas endógenas. Dicha expresión transitoria
puede durar un mes o más con un vector no replicante e incluso más
si los elementos de replicación apropiados forman parte del sistema
vectorial.
Las modificaciones de la expresión génica pueden
obtenerse diseñando secuencias antisentido a las regiones de
control del gen de PDE, tal como los promotores, potenciadores, e
intrones.
Se prefieren oligonucleótidos obtenidos del sitio
de inicio de la trascripción, por ejemplo, entre las regiones -10 y
+10 de la secuencia líder. También pueden diseñarse moléculas de
ARN y ADN antisentido para bloquear la traducción de ARNm evitando
que el transcrito se una a los ribosomas. De manera similar, puede
conseguirse la inhibición usando metodología de apareamiento de
bases de Hogeboom, también conocido como apareamiento de bases en
"tripe hélice". El apareamiento en triple hélice compromete la
capacidad de la doble hélice de abrirse suficientemente para la
unión de las polimerasas, los factores de trascripción, o moléculas
reguladoras.
Por tanto, la presente solicitud también
contempla composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades
eficaces de inhibidores o antagonistas de la proteína PDEXV
(incluyendo secuencias de ácidos nucleicos antisentido) en mezcla
con un diluyente, vehículo, excipiente o adyuvante farmacéuticamente
aceptable (incluyendo combinaciones de los mismos).
La presente solicitud contempla composiciones
farmacéuticas que pueden comprenden toda o porciones de las
secuencias polinucleotídicas de PDEXV, moléculas antisentido de
PDEXV, polipéptidos PDEXV, moduladores proteicos, peptídicos u
orgánicos de la bioactividad de PDEXV, tal como inhibidores,
antagonistas (incluyendo anticuerpos) o agonistas, solos o en
combinación con al menos otro agente, tal como un compuesto
estabilizante, y pueden administrarse en cualquier vehículo
farmacéutico biocompatible estéril, incluyendo, aunque sin
limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, y
agua.
Aunque en general las técnicas mencionadas en
este documento son bien conocidas en la técnica, puede hacerse
referencia en particular a Sambrook y col., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (1989) y Ausubel y col., Short
Protocols in Molecular Biology (1999) 4ª Ed, John Wiley & Sons,
Inc. La PCR se describe en los documentos
US-A-4683195,
US-A-4800195 y
US-A-4965188.
La siguiente muestra se depositó de acuerdo con
el Tratado de Budapest en el depósito reconocido The National
Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) en
23 St. Marchar Drive, Aberdeen, Escocia, Reino Unido, AB2 1RY el 9
septiembre de 1999:
NCIMB número NCIMB 41025 es Escherichia
coli (pHSPDExv).
El depositante fue Pfizer Central Research,
Pfizer Limited, Ramsgate Road, Sandwich, Kent, CT13 9NJ, Reino
Unido.
La presente solicitud también incluye secuencias
que se pueden obtener y/o expresar a partir de ese depósito y
realizaciones que comprenden la misma. La presente solicitud
también incluye secuencias parciales que se pueden obtener y/o
expresar a partir de ese depósito y realizaciones que comprenden la
misma, donde esas secuencias parciales codifican sitios enzimáticos
activos. La presente solicitud también incluye proteínas que
comprenden secuencias que se pueden obtener y/o expresar a partir
de ese depósito y realizaciones que comprenden la misma. La presente
solicitud también incluye proteínas que comprenden secuencias
parciales que se pueden obtener y/o expresar a partir de ese
depósito y realizaciones que comprenden la misma, donde esas
secuencias parciales codifican sitios enzimáticos activos.
La presente invención ahora se describirá, solo a
modo de ejemplo.
5'RACE: Los tampones y enzimas de reacción
se obtuvieron en formato de kit de tecnologías Life. El protocolo
se realizó de acuerdo con el manual de instrucciones ([tecnologías
Life] sistema 5'RACE para la amplificación rápida de extremos de
ADNc, versión 2 Nº Cat. 18374-058), usando la
modificación de una cola de dA en la primera cadena de ADNc.
Cebador ancla:
5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'
Cebador adaptador:
5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'
Expresión: PDExv se expresó usando el
sistema de baculovirus como se detalla a continuación.
Secuencia original identificada en la base de
datos IMAGE EST por búsqueda de palabra clave (IMAGE clon Nº
1639772 - aislado de biblioteca de testículo humano).
Para obtener la secuencia 5' completa de la
variante de corte y empalme, se realizó una amplificación 5' rápida
de los extremos de ADNc (RACE) en ARN poli A^{+} de testículo
(Clontech)
GSP1:
5'-CAGAACAGCGTTCACATTTCAGC-3'
GSP2:
5'-AGGTCAGTCTGTTCTTCAAAGAGG-3'
GSP3:
5'-CAGTAAATGGAGCTCCTTCAGG-3'
Se generó ADNc a partir del ARN poli A^{+} de
testículo usando GSP1 como cebador de síntesis.
Se realizó una primera ronda de PCR sobre este
ADNc usando GSP2 como cebador 3' y el cebador ancla suministrado
con el kit. Se realizó una PCR combinada sobre los productos de la
primera ronda usando GSP3 como cebador 3' y el cebador adaptador 5'
suministrado con el kit. Los productos RACE combinados e usaron
para generar una minibiblioteca de 1500 clones en el vector de
clonación TOPO-TA (PCR2.1-TOPO,
Invitrogen). Esta minibiblioteca se exploró por hibridación con una
sonda oligonucleotídica GSP4.
GSP4:
5'-TTGTGCATGCCTATCCGAAGCAGTTATGGT-3'
Se identificaron 8 clones en la secuenciación que
se demostró que prolongaban la secuencia PDE11 conocida. Usando
esta secuencia prolongada, se diseñó un cebador 5' (GSP5) para
permitir la clonación de la nueva secuencia en el vector de
expresión pFASTBAC-FLAG. Estos cebadores contienen
un sitio RsrII modificado.
GSP5:
5'-GCACGGTCCGAGATGCTGAAGCAGG-3'
GSP6:
5'-AGATATCTGGTCTGCCTCTGC-3'
La PCR usando GSP5 (cebador 5') y GSP6 (cebador
3') generó un fragmento de 780 pb que contenía un sitio RsrII
modificado 5' y un sitio StuI natural.
La construcción de expresión PDE11A1
(PDE10-Incyte) original en pFASTBAC, y el fragmento
de 780 pb anterior, se digirieron con las endonucleasas de
restricción RsrII y StuI. El fragmento de 780 pb se ligo al extremo
3' de PDE11A1 para generar la variante de corte y empalme
prolongada PDExv (PDE11A3). La construcción PDExv completa después
se clonó en pFASTBAC-FLAG.
La enzima recombinante hidroliza tanto GMPc como
AMPc.
Los siguientes estudios demuestran que la enzima
PDE de la presente invención - llamada PDE aquí de manera corta -
puede generarse usando un sistema de expresión de baculovirus.
Los siguientes estudios también demuestran que la
PDE muestra actividad hidrolítica de nucleótido cíclico cuando se
expresa en el sistema de baculovirus.
La enzima PDE se generó usando el sistema de
expresión de baculovirus basado en la infección por el virus de la
polihedrosis nuclear (AcNPV) Autographa californica de
células de insecto Spodoptera frugiperda (células
Sf9).
En estos estudios, se clonó el ADNc que codifica
PDE en el plásmido donante pFASTBAC-FLAG, que
contiene un mini-elemento de transposición Tn7. El
plásmido recombinante se transformó en células competentes DH10BAC,
que contienen el bacmid parental bMON14272 (ADN infeccioso de
AcNPV) y un plásmido auxiliar. El mini-elemento Tn7
en el donante pFASTBAC puede transponer el sitio de unión attTn7 en
el bacmid introduciendo de este modo el gen PDE en el genoma viral.
Las colonias que contienen los bacmid recombinantes se identifican
por interrupción del gen lacZ. La construcción PDE/bacmid
después se puede aislar e infectar en células de insecto (células
Sf9) dando como resultado la producción de partículas de
baculovirus recombinantes infecciosas y la expresión de la proteína
de fusión PDE-FLAG recombinante.
Se midió la actividad fosfodiesterasa de los
extractos celulares en bruto.
Las células se recogieron y se prepararon
extractos 24, 48 y 72 horas después de la transfección.
Estos resultados confirman que el ADNc de PDE
codifica una fosfodiesterasa, que es capaz de hidrolizar a AMPc y
GMPc.
El material lisado en bruto se purificó por FPLC
usando una columna que contenía perlas de agarosa (gel de afinidad
M2) con las que se había conjugado anticuerpo
anti-FLAG monoclonal IgG_{1} purificado por unión
con hidrazida (Eastman Kodak). Esto permite la retención específica
en la columna del material recombinante (ya que está fusionado al
epítope FLAG) mientras que las proteínas de insecto endógenas se
retiran por lavado en el eluido. El material recombinante después
se retira por lavado en condiciones de bajo pH. Este material
purificado fue más apropiado para los estudios enzimático e
inhibidor detallados. La pureza del material se evalúa por tinción
con coomassie después de electroforesis en gel de poliacrilamida
con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) o a través de
transferencia de western en una membrana de nitrocelulosa de un
SDS-PAGE no teñido (que contiene PDE recombinante) y
análisis con el anticuerpo con epítope anti-FLAG
monoclonal IgG1. La proteína de fusión PDE-FLAG se
detecta debido a la interacción entre al anticuerpo
anti-FLAG y el epítope FLAG, que está fusionado a
la proteína PDE.
La actividad fosfodiesterasa de la proteína de
fusión PDE-FLAG purificada se ensayó usando un kit
SPA (ensayo de centelleo por proximidad) disponible en el mercado
(Amersham - Amersham place, Little Chalfont, Bucks, HP7 9NA UK) para
la actividad hidrolítica de AMPc y/o GMPc. Esto puede usarse para
permitir la determinación del valor Km para PDE frente a AMPc y/o
GMPc para determinar la actividad enzimática a un intervalo de
concentraciones de sustrato que permiten el cálculo de un valor
Vmax aproximado para la enzima.
Los resultados de estos experimentos muestran que
el ADNc de PDE codifica una fosfodiesterasa que es capaz de
hidrolizar a AMPc y GMPc.
En resumen, la presente invención
proporciona:
1. Secuencias nuevas de aminoácidos.
2. Secuencias nuevas de nucleótidos.
3. Ensayos que usan dichas nuevas secuencias.
4. Sistemas de expresión que comprenden o
expresan dichas nuevas secuencias.
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
Aquí, la secuencia de aminoácidos
de PDE11A2 es SEC.ID.Nº3 y la secuencia de nucleótidos es
SEC.ID.Nº4.
\vskip1.000000\baselineskip
Aquí, la secuencia de aminoácidos
de PDE11A1 es SEC.ID.Nº5 y la secuencia de nucleótidos es
SEC.ID.Nº6.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
Aquí, la secuencia de aminoácidos
de PDE11A2 es SEC.ID.Nº3 y la secuencia de nucleótidos es
SEC.ID.Nº4.
\vskip1.000000\baselineskip
Aquí, la secuencia de aminoácidos
de PDE11A1 es SEC.ID.Nº5 y la secuencia de nucleótidos es
SEC.ID.Nº6.
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (6)
1. Una secuencia de aminoácidos que tiene
actividad de PDEXV siendo capaz de catalizar la degradación de AMPc
y GMPc; comprendiendo dicha secuencia de aminoácidos la secuencia
presentada como SEC.ID.Nº 1 o una variante de la misma; teniendo
dicha variante al menos un 95% de homología con la secuencia
mostrada como SEC.ID.Nº 1 y que comprende al menos 25 aminoácidos
contiguos de la siguiente secuencia N terminal:
2. Una secuencia de nucleótidos que codifica la
secuencia de aminoácidos como se ha definido en la reivindicación
1.
3. Una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la
reivindicación 2, que comprende la secuencia presentada como
SEC.ID.Nº 2 o una variante de la misma que tiene al menos un 95% de
homología con la misma.
4. Un vector que comprende la secuencia de
nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 2 o reivindicación
3.
5. Una célula huésped aislada que tiene
incorporada la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la
reivindicación 2 o reivindicación 3.
6. Un procedimiento de ensayo para identificar un
agente que pueda afectar a la actividad de PDEXV (es decir, que es
capaz de catalizar la degradación de AMPc o GMPC) o la expresión de
PDEXV, comprendiendo el procedimiento de ensayo
poner en contacto un agente con un aminoácido de
acuerdo con la reivindicación 1 o una secuencia de nucleótidos de
acuerdo con la reivindicación 2 o reivindicación 3; y
medir la actividad o expresión de PDEXV;
donde una diferencia entre (a) la actividad o
expresión de PDEXV en ausencia del agente y (b) la actividad o
expresión de PDEXV en presencia del agente es indicativo de que el
agente puede afectar a la actividad o expresión de PDEXV.
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