ES2243223T3 - Aplicaciones de mezclas de proteinas plasmaticas de origen animal en gammaglobulinas y procedimiento para su preparacion. - Google Patents
Aplicaciones de mezclas de proteinas plasmaticas de origen animal en gammaglobulinas y procedimiento para su preparacion.Info
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Abstract
Aplicaciones de mezclas de proteínas plasmáticas de origen animal ricas en gammaglobulinas con un contenido en gammaglobulinas superior al 25% en peso, con respecto a las proteínas totales, para la preparación de composiciones medicamentosas, preparados alimenticios y dietéticos aptos para la prevención y tratamiento de enfermedades gastrointestinales en humanos.
Description
Aplicaciones de mezclas de proteínas plasmáticas
de origen animal ricas en gammaglobulinas y procedimiento para su
preparación.
La presente invención se refiere a unas
aplicaciones de una mezcla de proteínas plasmáticas de origen
animal con un contenido en gammaglobulina superior al 25% en peso
para la preparación de composiciones medicamentosas, preparados
alimenticios y dietéticos. Asimismo se refiere a un procedimiento
para la preparación de una mezcla de proteínas plasmáticas de
origen animal con un contenido en gammaglobulinas superior al 90%
en peso, sin utilización de columnas cromatográficas, a partir de un
primer concentrado cuya proporción de gammaglobulinas con respecto
a proteínas es superior al 30% en peso, dicho primer concentrado
siendo procedente de plasma animal que ha sido sometido a por lo
menos una centrifugación previa.
De la bibliografía conocida se desprende que la
situación sobre el proceso de fraccionamiento es la siguiente:
El documento Curling, J.M., J. Berglöf, L.O.
Lindquist & S. Eriksson "A chromatographic Procedure for
the Purification of Human Plasma Albumin". Vox Sang.
33:97-107 (1977), detalla un método de
fraccionamiento a partir de plasma humano, en el cual se utiliza
polietilenglicol (PEG) 4000 para obtener un precipitado rico en
Gammaglobulinas y un producto concentrado en fracción albúmina, que
finalmente es purificado hasta un 99% de pureza mediante la
utilización de un sistema cromatográfico.
El documento Guddat, W. & K. Hillger "A
Heat Polyethylene Glycol Procedure as an Alternative Method for
Plasmafractionation". Folia Haematol., Leipzig 109 (1982) 6,
S. 840-855, describe un proceso de fraccionamiento a
partir de plasma humano para la preparación de Albúmina de alta
pureza. En el proceso descrito alterna etapas de fraccionamiento
con PEG 4000 y la utilización de octanato sódico, calentando a
elevadas temperaturas (75ºC) para la preparación de la fracción
enriquecida en Albúmina.
El documento Hansen, J.F. & M. Ezban. "A
new high quality Albumin for therapeutic use". Joint
WHO/IABS Symposium on the Standardization of Albumin, Plasma
Substitutes and Plasmapheresis, Geneva 1980, Develop. Biol.
Standard. 48, pp. 105-112 indica un método de
fraccionamiento para la preparación de albúmina humana de
utilización con fines terapéuticos en humanos, vía inyectable, en
el cual se detallan etapas combinadas de fraccionamiento con PEG
3000 y la utilización de ácido caprílico, temperatura y etanol para
la preparación de diferentes fracciones plasmáticas y albúmina de
alta pureza.
El documento Hao, Y.L., K.C. Ingham & M.
Wickerhauser. "Fractional Precipitation of Proteins with
Polyethylene Glycol" relata un proceso de fraccionamiento a
partir de plasma humano para la preparación de las diferentes
fracciones plasmáticas. En el proceso descrito realiza una primera
separación mediante la utilización de PEG 4000 y posteriores
purificaciones mediante la utilización de columnas
cromatográficas.
El documento Lee, Y.Z., T.Aishima, S. Nakai &
J.S.Sim "Optimization for Selective Fractionation of Bovine
Blood Plasma Proteins Using Poly(ethylene glycol)".
J.Agri. Food Chem. 1987, 35, 958-962 detalla un
procedimiento de fraccionamiento plasmático a partir de plasma
bovino, en el cual trabajando a diferentes concentraciones de PEG
4000 y Cloruro sódico y a determinados valores de pH consigue
separar 3 fracciones mayoritarias: fibrinógeno, inmunoglobulinas y
albúmina.
El documento Polson, A. &
Ruiz-Bravo. "Fractionation of Plasma with
Polyetilhylene Glycol". Vox Sang. 23. 107-118
(1972) describe el proceso de fraccionamiento a partir de plasma
humano mediante la utilización de PEG 6000 para la preparación de
diferentes fracciones proteicas incluidas en el plasma. Este
documento indica que el procedimiento con PEG puede desarrollarse
trabajando únicamente con PEG o en combinación con sales o agentes
orgánicos o bien con utilización de membranas cromatográficas.
El documento Scheneider, W., H. Lefèvre, H.
Fiedler & L.J.McCarty. "An Alternative Method of Large
Scale Plasma Fractionation for the Isolation of Serum
Albumin". Blut, Band 30, Seite 121-134 (1975)
comenta la posibilidad de preparación de albúmina de alta pureza a
partir de plasma humano mediante la utilización de octanato sódico
en combinación con etanol y elevadas temperaturas (68ºC) para la
separación de albúmina del resto de proteínas del plasma.
Posteriormente mediante la utilización de PEG 4000 consiguen
precipitar la albúmina que tras resuspender en agua la obtienen en
forma líquida o bien en polvo tras un proceso de secado por
liofilización.
El documento Steinbuch, M. & R. Audran
"The Isolation of IgG from Mammalian Sera with the Aid of
Caprylic Acid". Archives of Biochemistry and Biophysics 134,
279-284. (1969) resuelve un proceso de
fraccionamiento a partir de plasma humano, ovino, caprino o de
conejo mediante la utilización de ácido caprílico (ac. Ocatóico)
para purificar la fracción rica en Inmunoglobulinas. Posteriormente
esta fracción tras ser desalinizada mediante un proceso de
diálisis, se concentra o se obtiene en forma de polvo mediante un
proceso de secado por liofilización.
El documento Viikari, J.. "Precipitation of
Plasma Lipoproteins by PEG-6000 and Its Evaluation
with Electrophoresis and Ultracentrifugation". Scand. J.
Clin. Lab. Invest., Vol. 36, 1976 comenta un método de
fraccionamiento a partir de plasma humano mediante la utilización
de PEG 6000 a diferentes dosis para la preparación en una única
etapa de precipitación de las fracciones ricas en lipoproteínas
(LDL, VLDL, HDL).
Por último el documento Wickerhauser, M. and Y.L.
Hao "Large Scale Preparation of Macroglobulins". Vox
Sang. 23: 119-125 (1972) indica la posibilidad de
fraccionamiento de una fracción rica en inmunoglobulina M (IgM) a
partir de la fracción III obtenida de plasma humano mediante el
método de fraccionamiento hidroalcohólico de Cohn. En este caso,
partiendo del precipitado III del método de Cohn, y mediante la
utilización de PEG 6000 junto a Sulfato de Zinc obtienen un
sobrenadante que posteriormente precipitan mediante la utilización
de sulfato de amonio.
La bibliografía existente desde finales de los
años 80 hasta la actualidad, además de muy escasa, no aporta
conceptos significativamente diferentes a los expresados en las
anteriores publicaciones.
Por medio de algunos de los documentos citados,
se da a conocer un procedimiento en el que, tomando como material
de partida un plasma animal (bovino, ovino, caprino o de conejo) y
sometiéndolo a una primera centrifugación previa, en condiciones
determinadas, se obtiene una fracción insolubilizada rica en
fibrinógeno y una fracción clarificada que contiene el resto de
proteínas que contiene el plasma y que son solubles en agua; esta
fracción clarificada, después de un determinado acondicionamiento,
es sometida a una segunda centrifugación previa, de la que se
separa una nueva fracción concentrada rica en gammaglobulinas y una
nueva fracción clarificada rica en albúminas.
Son conocidas algunas aplicaciones de mezclas de
proteínas plasmáticas ricas en fibrinógeno en humanos, por ejemplo
para el tratamiento de hemofílicos. Sin embargo estas aplicaciones
requieren la administración por vía intravenosa, lo que obliga a
que el origen de la mezcla sea humana, para evitar problemas de
incompatibilidad.
También son conocidas algunas aplicaciones de
mezclas de proteínas plasmáticas ricas en albúmina, por ejemplo en
intervenciones quirúrgicas. Sin embargo la administración es
asimismo por vía intravenosa y el origen de la mezcla debe ser
humano.
La invención tiene por objeto unas aplicaciones
de una mezcla de proteínas plasmáticas de origen animal con un
contenido en gammaglobulina superior al 25% en peso, con respecto a
las proteínas totales, para la preparación de composiciones
medicamentosas, preparados alimenticios y dietéticos: [a] aptos para
la prevención y tratamiento de enfermedades gastrointestinales en
humanos y animales, [b] aptos para la mejora del estado
inmunológico en humanos y animales, y [c] aptos para el tratamiento
de situaciones clínicas que cursan con desnutrición en humanos y
animales, en particular para colitis ulcerosa; enfermedad de Crohn;
caquexia cancerosa por enteritis crónica por tratamiento quimio y/o
radioterápico; patología médica infecciosa que comporta malabsorción
severa; SIDA; fibrosis quística, fístulas enterocutáneas de bajo
débito, e insuficiencia renal infantil que compromete el crecimiento
del paciente.
La invención tiene también por objeto unas
aplicaciones de mezclas de proteínas plasmáticas de origen animal
ricas en gammaglobulinas con un contenido en gammaglobulinas
superior al 25% en peso, con respecto a las proteínas totales, para
la preparación de composiciones medicamentosas, preparados
alimenticios y dietéticos aptos para el tratamiento de procesos de
malabsorción seleccionados de entre el grupo constituido por
síndrome de intestino corto; diarrea intratable de origen
autoinmune; linfoma; esteatorrea posgastrectomía; carcinoma de
páncreas; resección amplia pancreática; insuficiencia vascular
mesentérica; amiloidosis; esclerodermia; enteritis eosinofílica. En
estos casos, preferentemente las proteínas plasmáticas proceden de
plasma porcino, bovino, caprino, equino y ovino. Es particularmente
preferente el empleo de plasma porcino, sobre todo para el
tratamiento de humanos.
Una forma ventajosa de aplicación se obtiene
cuando las composiciones medicamentosas, preparados alimenticios y
dietéticos son utilizables disueltas en agua, leche, zumos, yogur y
otros alimentos. Preferentemente estos otros alimentos son leche
maternizada, papillas y otros alimentos infantiles.
Preferentemente se adicionan fibras en cualquiera
de sus variedades, productos prebióticos, probióticos, vitaminas y
minerales a las preparaciones medicamentosas, preparados
alimenticios y dietéticos.
Es particularmente interesante que las
inmunoglobulinas sean inespecíficas, ya que significan una
importante reducción de coste, tienen una actividad terapéutica
suficiente para infecciones leves y son una ayuda en las infecciones
más graves, y no enmascaran ninguno de los síntomas de la infección
a tratar, por lo que se pueden utilizar de forma inmediata a la
aparición de dichos síntomas.
Finalmente otra aplicación preferente se obtiene
al combinar su utilización con la toma de antibióticos.
La invención también tiene por objeto obtener un
concentrado de la fracción de gammaglobulinas superior al 90% en
peso, dado que en tal caso se requieren menores cantidades en sus
posteriores aplicaciones, mediante un procedimiento que reduzca
significativamente el coste de producción respecto a las técnicas
cromatográficas habituales. Esta finalidad se consigue con un
procedimiento del tipo indicado al principio que está caracterizado
porque: [i] dicho primer concentrado se diluye en agua en una
relación primer concentrado:agua comprendida en el intervalo
1:7-1:11, obteniendo una primera mezcla; [ii] se
efectúa un primer ajuste del pH de dicha primera mezcla a un valor
comprendido en el intervalo 3-6, resultando una
segunda mezcla; [iii] a dicha segunda mezcla, se efectúa una
adición de polietilenglicol en una proporción en peso comprendida
entre el 2 y el 6% en peso con respecto a dicha segunda mezcla,
obteniendo una tercera mezcla; [iv] se somete dicha tercera mezcla
a una primera centrifugación, a una aceleración comprendida en el
intervalo 3000-11000 g, resultando una primera
fracción insolubilizada rica en betaglobulinas y una primera
fracción clarificada rica en gammaglobulinas, siendo objeto de
separación ambas primeras fracciones; [v] dicha fracción rica en
gammaglobulinas es objeto de un segundo ajuste del pH a un valor
comprendido entre 6 y 9 obteniéndose una cuarta mezcla, la cual
recibe una adición de polietilenglicol hasta alcanzar una
proporción en peso comprendida entre 6-12% en peso
con respecto a dicha cuarta mezcla, obteniéndose una quinta mezcla;
[vi] se somete dicha quinta mezcla a una segunda centrifugación, a
una aceleración comprendida en el intervalo
3000-11000 g, de la que resulta una segunda fracción
insolubilizada compuesta mayoritariamente por gammaglobulina y una
segunda fracción clarificada, siendo objeto de separación ambas
segundas fracciones.
Es preferente que el plasma animal utilizado para
este procedimiento sea porcino, bovino, ovino, equino o caprino,
siendo particularmente preferente la utilización de plasma
porcino.
Unos concentrados del producto al que se refiere
la invención, pueden obtenerse mediante la utilización de secadores
tipo spray drying, liofilización o cualquier otra técnica de
secado. La presente invención no excluye la preparación de estos
concentrados en forma líquida o congelada. También pueden obtenerse
mediante técnicas de microencapsulación del componente activo,
protegiéndolo y estabilizándolo frente a altas temperaturas,
oxidantes, pH, luz, humedad, etc.
Pueden presentarse en forma de comprimidos,
cápsulas, ampollas bebibles, granulado, polvo, crema, tanto como
componente único como asociado a otros excipientes o compuestos
activos.
La invención consiste en la aplicación de
concentrados de inmunoglobulinas, en particular de origen porcino
con fines preventivos y de cotratamiento de enfermedades
gastrointestinales de origen diversos. Estos concentrados son
preferentemente de inmunoglobulinas inespecíficas. Está previsto que
sean administrados por vía oral o tópica, y utilizados tanto de
forma aislada como asociados a otras substancias.
El uso de inmunoglobulinas porcinas disminuye el
riesgo de reacciones alérgicas provocadas por otras fuentes de
inmunoglobulinas, que presentan un riesgo alergénico. Este riesgo
alergénico aparece, por ejemplo, debido al hecho de que tanto la
leche vacuna como el huevo sean alimentos utilizados en nutrición
infantil en los primeros estadios de substitución de la leche
materna. Ello hace que algunos individuos hayan desarrollado
alergias específicas a proteínas de estos orígenes.
La mayoría de procesos en los que se utilizan
inmunoglobulinas específicas son costosos dado que se deben
hiperinmunizar animales con antígenos específicos. Estos
tratamientos requieren un diagnóstico previo preciso, que resultan
costosos tanto a nivel económico como de tiempo de preparación del
resultado analítico.
La aplicación de inmunoglobulinas inespecíficas
(que contienen anticuerpos frente a un número muy elevado de
microorganismos) es ventajosa en infecciones intestinales leves en
las que la presencia de anticuerpos disponibles en el concentrado de
inmunoglobulinas ya sea suficiente para detener los síntomas
causados por la infección. De esta manera también se pueden paliar
síntomas en infecciones más graves en las que haya de recurrir a
tratamientos con antibióticos específicos después de un diagnóstico,
dado que no se enmascara ninguno de los síntomas de la infección, y
se puede, por tanto, aplicar de forma inmediata después de la
aparición de dichos síntomas.
Es particularmente ventajoso la administración de
inmunoglobulinas inespecíficas de origen porcino por vía oral o
enteral, ya que ello no provoca problemas de rechazo inmunológico
al no traspasar las mencionadas inmunoglobulinas la pared
intestinal, y al realizar su acción protectora o terapéutica a nivel
local en la luz intestinal.
A menudo sucede que en grupos de población de
riesgo a enfermedades gastrointestinales como es el caso de niños
recién nacidos con bajo peso al nacimiento, niños recién nacidos
sin nutrición materna, ancianos con inmunodeficiencias, adultos con
su sistema inmunitario deficiente, especialmente en el caso del
SIDA, personas con tratamiento de quimioterapia en procesos
cancerígenos, o personas que hayan sufrido un trasplante de médula
ósea, las infecciones gastrointestinales son crónicas y a menudo
acompañadas con infecciones oportunistas que aprovechan el
desequilibrio en la flora intestinal para manifestar su
patogeneidad. En tales casos suele ocurrir que las terapias
utilizadas no son del todo efectivas, dado que en los mejores casos
consiguen reducir la incidencia provocada por el primer patógeno
pero son inactivas frente a los gérmenes oportunistas, por lo que la
utilización de concentrados de gammaglobulinas inespecíficas de
amplio espectro bacteriano es muy aconsejable en estas situaciones,
dado que además de ayudar a restablecer el ecosistema bacteriano
del intestino, impide la acción de patógenos oportunistas y ayuda
con ello a la recuperación del epitelio intestinal. Por la misma
razón resulta interesante la aplicación conjunta de un preparado
enriquecido en inmunoglobulinas junto con la terapia específica.
La aplicación de preparados enriquecidos en
inmunoglobulinas porcinas presenta la ventaja adicional de que no
provoca la aparición de sintomatología secundaria asociada a la
utilización de otros compuestos que se utilizan en procesos de
desordenes gastrointestinales, como son el estreñimiento, la
pérdida de la flora gastrointestinal o reducción del apetito, dado
que al tratarse de proteínas naturales, tras su efecto asociado a la
bioactividad de tales moléculas, serán degradas o excretadas del
mismo modo que ocurre con el resto de proteína animal que
diariamente se ingieren en la dieta.
Al tratarse de un concentrado de inmunoglobulinas
de alto espectro, y obtenidas de un volumen muy elevado de sangre
de animales provenientes de diversas procedencias, es de esperar
que contengan anticuerpos frente a un número muy variado de
bacterias y virus. En medicina humana, el tratamiento de
infecciones gastrointestinales víricas, no está aún resuelto, dado
que los antibióticos carecen de efecto sobre estos virus, por lo que
la utilización de inmunoglobulinas podría suponer un avance en la
reducción de la agudeza de tales infecciones.
Es conocido que tanto bacterias como virus,
poseen la capacidad de adquirir resistencias frente a antibióticos
o preparados químicos. Los mamíferos combaten tales resistencias
creando nuevos anticuerpos específicos frente a la nueva mutación de
las bacterias, de tal modo que de forma natural las mutaciones en
bacterias y virus se corresponden con aparición de anticuerpos
predominantes en sangre frente a tales mutaciones. En estos casos,
suele ocurrir que con el paso del tiempo los antibióticos o
inmunoglobulinas obtenidas de animales hiperinmunizados dejan de
tener un total efecto, teniéndose que obtener nuevas generaciones de
antibióticos o de inmunoglobulinas específicas. En nuestro caso,
ello no ocurre, dado que el preparado enriquecido en
inmunoglobulinas, al obtenerse de animales sacrificados, contiene
anticuerpos frente a las nuevas cepas de bacterias que hayan mutado
para adquirir resistencia a los antibióticos, teniendo de este modo
en todo momento actividad inmunológica frente a las subclases de
patógenos causantes de las enfermedades gastrointestinales.
Estas aplicaciones son asimismo adecuadas para
animales de compañía. La calidad microbiológica de los alimentos es
inferior a la humana y sobre todo a que la comida suele quedar en
los comederos durante bastantes horas a temperatura ambiente,
pudiéndose desarrollar crecimiento bacteriano en tales condiciones,
lo que puede ocasionar infecciones intestinales. Es poco frecuente
la utilización de inmunoglobulinas específicas provenientes de
animales hiperinmunizados para el tratamiento de estas infecciones
gastrointestinales por el alto coste que supone tal terapia así como
la falta de un diagnóstico preciso de tal infección. Por ello, la
utilización de concentrados de inmunoglobulinas de amplio espectro
bacteriano y vírico, particularmente las de origen porcino, es una
alternativa económica y viable para su utilización en reducción de
la gravedad de infecciones gastrointestinales y recuperación del
equilibrio intestinal de animales, así como una utilización
preventiva en animales con infecciones crónicas y por ello de mala
absorción intestinal.
Es práctica habitual incluir plasma en polvo en
las dietas de iniciación y destete de animales de granja, en
particular cerdos. Ello aporta beneficios en cuanto a crecimiento y
reducción de diarreas y mortalidad en esta etapa de vida. Tales
beneficios han sido asociados en la bibliografía científica a la
fracción de inmunoglobulinas presente en el plasma en polvo, por lo
que la utilización de una fracción rica en inmunoglobulinas en los
piensos administrados en estas edades tendrá un efecto superior al
ejercido por el plasma entero. Los cerdos pertenecen a un grupo de
mamíferos que nacen inmunodeficientes que necesitan ingerir el
calostro materno, rico en inmunoglobulinas, para incorporar
inmunidad pasiva a su organismo. Ello debe ocurrir durante las
primeras 24-36 horas de vida, que es cuando se
presenta una permeabilidad intestinal a macromoléculas, por lo que
parte de las inmunoglobulinas ingeridas en el calostro pasarán a la
sangre del lechón, dándole inmunidad pasiva durante las primeras
semanas, hasta que el animal sea capaz de generar su propio sistema
inmunitario.
Sin embargo, los aportes de inmunoglobulinas
lacto-remplazantes de calostro materno conocidos en
el mercado están basados en inmunoglobulinas bovinas. El hecho de
emplear inmunoglobulinas de origen porcino representa una ventaja
respecto al uso de las inmunoglobulinas bovinas ya que el tiempo de
acción en sangre de inmunoglobulinas bovinas es sensiblemente menor
a cuando se administran inmunoglobulinas porcinas, por lo que se
mejora la inmunidad pasiva de los lechones durante las primeras 24
horas de vida.
En algunas aplicaciones es conveniente disponer
de unas mezclas de proteínas plasmáticas que contengan unas
concentraciones en gammaglobulinas superiores al 90%.
Sin embargo, en otras aplicaciones es suficiente
con disponer de mezclas de proteínas plasmáticas que contengan unas
concentraciones en gammaglobulinas, respecto del total de
proteínas, mayor del 25%. En estos casos se pueden obtener dichas
mezclas de una forma más económica y, adicionalmente, en dichas
mezclas se conservan otras proteínas, péptidos, vitaminas y
factores de crecimiento de elevado valor y que quedan eliminados en
las mezclas de proteínas plasmáticas cuyo contenido en
gammaglobulinas es mayor del 90%.
Para la mejor comprensión de la invención, a
continuación se dan a conocer ejemplos de las diversas fases del
procedimiento objeto de la invención, con inclusión de fases
previas a la preparación del material de partida.
Sobre un reactor de trabajo se carga 1000 kg de
plasma porcino, a 4ºC, sin hemolizar y con pH 7,7. Se somete a
agitación a 50 r.p.m. y se añaden 53,18 kg de ácido clorhídrico con
lo que se consigue el descenso del pH a un valor de 4,5. Se añaden
55 kg de polietilenglicol (PEG) 4000, con lo que la mezcla contiene
un 6% en peso de PEG; se ajusta de nuevo el pH a 4,5. Se deja la
mezcla de reacción en agitación durante 5 horas y a continuación se
centrifuga la mezcla en una centrífuga a 9000 g, con bol para la
recuperación de la fracción concentrada en su interior. Tras la
centrifugación se obtienen 33,7 kg de una fracción rica en
fibrinógeno y 1052 kg de una fracción clarificada que contiene el
resto de proteínas solubles.
Esta fracción clarificada, una vez libre de
polietilenglicol, presenta una concentración de gammaglobulinas,
respecto del total de proteínas, aproximadamente del 30%.
Los 1052 kg de la fracción clarificada obtenida
según el ejemplo anterior se mantienen bajo agitación constante y a
4ºC y se ajusta el pH a 7,0 mediante la adición de 33,32 kg de
hidróxido sódico; a continuación se le añaden 88,2 kg de PEG para
mantener la proporción en peso del 12%, ajustándose de nuevo del pH
a 7,0. La mezcla se deja bajo agitación constante a la temperatura
indicada durante 5 horas. A continuación se somete la mezcla a una
operación de centrifugado en la misma centrífuga citada en el
ejemplo anterior y se obtienen 1093 kg de una nueva fracción
clarificada y 54,8 kg de un concentrado rico en
gammaglobulinas.
Este concentrado rico en gammaglobulinas tiene
una concentración de gammaglobulinas, respecto del total de
proteínas, aproximadamente del 50%.
Los 54,8 kg del concentrado rico en
gammaglobulinas obtenido según el ejemplo anterior reciben la
adición de 493 kg de agua (proporción concentrado:
agua\rightarrow1:9). Se ajusta el pH a 6,0 mediante la adición de
7,7 kg de ácido clorhídrico y se añaden otros 32,8 kg de PEG a fin
de que la proporción de PEG sea de un 6% en peso, ajustándose de
nuevo el pH con ácido clorhídrico. La mezcla se mantiene bajo
agitación constante y a 4ºC durante 5 horas, después de la cual se
centrifuga en una centrífuga del tipo indicado en los ejemplos
anteriores. Al finalizar el proceso de centrifugación se obtienen 17
kg de una fracción insolubilizada rica en betaglobulinas y 552 kg
de una fracción clarificada rica en gammaglobulinas.
Los 552 kg de la fracción clarificada rica en
gammaglobulina obtenidos según el ejemplo anterior son objeto de
una adición de 4,6 kg de hidróxido sódico, con lo que se ajusta su
pH a 9,0; además recibe la adición de 38 kg de PEG, con lo que la
proporción de PEG (teniendo en cuenta el PEG contenido en la
fracción) se mantiene en el 12% en peso, ajustándose de nuevo el pH
a 9,0. La mezcla se mantiene en agitación constante y a 4ºC durante
5 horas, transcurridas las cuales se procede a una centrifugación
con un aparato del tipo indicado anteriormente y así se obtienen
550 kg de una fracción clarificada y 30 kg de una fracción de alto
contenido de gammaglobulina.
Los 30 kg de la fracción de alto contenido de
gammaglobulina obtenidos de acuerdo con el ejemplo anterior son
objeto de disolución en agua por medio de una adición de 60 kg de
agua (proporción 1:2 en peso); se ajustó el pH a 6,0. Una vez la
mezcla estuvo perfectamente disuelta, se procedió a su secado
mediante un atomizador (spray dried), secando el agua
contenida en el producto líquido al someterlo a un transporte con
aire a elevadas temperaturas (150ºC el aire a la entrada y 100ºC el
aire a la salida) durante un breve espacio de tiempo, con lo que se
evapora el agua sin afectar la solubilidad de la proteína a secar;
finalmente, el producto en polvo fue ensacado. Las características
del producto en polvo obtenido son:
| Humedad | <10% |
| Proteína | 90 \pm 2% |
| Cenizas | <2% |
| Insolubles | <2% |
(Continuación)
| Proteinograma tipo % (respecto a proteína) | |
| Albúmina | 1,0% |
| Alfaglobulina | 5,3% |
| Betaglobulina | 4,0% |
| Gammaglobulina | 90,63% |
La utilidad de las composiciones a las que se
está haciendo referencia, pueden deberse en parte a que el producto
obtenido según el procedimiento objeto de la invención puede
contener IgM, transferrina, factores de crecimiento celular o alfa 2
macroglobulina.
Claims (25)
1. Aplicaciones de mezclas de proteínas
plasmáticas de origen animal ricas en gammaglobulinas con un
contenido en gammaglobulinas superior al 25% en peso, con respecto a
las proteínas totales, para la preparación de composiciones
medicamentosas, preparados alimenticios y dietéticos aptos para la
prevención y tratamiento de enfermedades gastrointestinales en
humanos.
2. Aplicaciones de mezclas de proteínas
plasmáticas de origen animal ricas en gammaglobulinas con un
contenido en gammaglobulinas superior al 25% en peso, con respecto a
las proteínas totales, para la preparación de composiciones
medicamentosas, preparados alimenticios y dietéticos aptos para la
mejora del estado inmunológico en humanos.
3. Aplicaciones de mezclas de proteínas
plasmáticas de origen animal ricas en gammaglobulinas con un
contenido en gammaglobulinas superior al 25% en peso, con respecto a
las proteínas totales, para la preparación de composiciones
medicamentosas, preparados alimenticios y dietéticos aptos para el
tratamiento de procesos de malabsorción en humanos seleccionados de
entre el grupo constituido por: síndrome de intestino corto;
diarrea intratable de origen autoinmune; linfoma; esteatorrea
posgastrectomía; carcinoma de páncreas; resección amplia
pancreática; insuficiencia vascular mesentérica; amiloidosis;
esclerodermia; enteritis eosinofílica.
4. Aplicaciones de mezclas de proteínas
plasmáticas de origen animal ricas en gammaglobulinas con un
contenido en gammaglobulinas superior al 25% en peso, con respecto a
las proteínas totales, para la preparación de composiciones
medicamentosas, preparados alimenticios y dietéticos aptos para el
tratamiento de situaciones clínicas que cursan con desnutrición en
humanos.
5. Aplicación según la reivindicación 4,
caracterizada porque dichas situaciones clínicas son:
colitis ulcerosa; enfermedad de Crohn; caquexia cancerosa por
enteritis crónica por tratamiento quimio y/o radioterápico;
patología médica infecciosa que comporta malabsorción severa; SIDA;
fibrosis quística, fístulas enterocutáneas de bajo débito, e
insuficiencia renal infantil que compromete el crecimiento del
paciente.
6. Aplicación según por lo menos la
reivindicación 3, caracterizada porque dichas proteínas
plasmáticas proceden de plasma porcino, bovino, caprino, equino u
ovino.
7. Aplicación según por lo menos una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque dichas
composiciones medicamentosas, preparados alimenticios y dietéticos
son utilizables disueltas en agua, leche, zumos, yogur u otros
alimentos.
8. Aplicación según la reivindicación 7,
caracterizada porque dichos otros alimentos son leche
maternizada, papillas u otros alimentos infantiles.
9. Aplicación según por lo menos una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque dichas
preparaciones medicamentosas, preparados alimenticios y dietéticos
son aptas para recibir la adición de fibras en cualquiera de sus
variedades, productos prebióticos, probióticos, vitaminas o
minerales.
10. Aplicación según por lo menos una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque dichas
preparaciones medicamentosas, preparados alimenticios y dietéticos
son de utilización preferente con la toma de antibióticos.
11. Aplicación según por lo menos una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque dichas mezclas
de proteínas plasmáticas son de origen porcino y porque se aplican
para el tratamiento de humanos.
12. Aplicación según por lo menos una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque dicho
contenido en gammaglobulinas es superior al 90% en peso.
13. Procedimiento para la preparación de mezclas
de proteínas plasmáticas de origen animal ricas en gammaglobulinas,
con un contenido en gammaglobulinas superior al 90% en peso, sin
utilización de columnas cromatográficas, a partir de un primer
concentrado cuya proporción de gammaglobulinas con respecto a
proteínas es superior al 30% en peso, dicho primer concentrado
siendo procedente de plasma animal que ha sido sometido a por lo
menos una centrifugación previa, caracterizado porque: [i]
dicho primer concentrado se diluye en agua en una relación primer
concentrado:agua comprendida en el intervalo
1:7-1:11, obteniendo una primera mezcla; [ii] se
efectúa un primer ajuste del pH de dicha primera mezcla a un valor
comprendido en el intervalo 3-6, resultando una
segunda mezcla; [iii] a dicha segunda mezcla, se efectúa una adición
de polietilenglicol en una proporción en peso comprendida entre el
2 y el 6% en peso con respecto a dicha segunda mezcla, obteniendo
una tercera mezcla; [iv] se somete dicha tercera mezcla a una
primera centrifugación, a una aceleración comprendida en el
intervalo 3000- 11000 g, resultando una primera fracción
insolubilizada rica en betaglobulinas y una primera fracción
clarificada rica en gammaglobulinas, siendo objeto de separación
ambas primeras fracciones; [v] dicha fracción rica en
gammaglobulinas es objeto de un segundo ajuste del pH a un valor
comprendido entre 6 y 9 obteniéndose una cuarta mezcla, la cual
recibe una adición de polietilenglicol hasta alcanzar una proporción
en peso comprendida entre 6-12% en peso con
respecto a dicha cuarta mezcla, obteniéndose una quinta mezcla;
[vi] se somete dicha quinta mezcla a una segunda centrifugación, a
una aceleración comprendida en el intervalo
3000-11000 g, de la que resulta una segunda fracción
insolubilizada
compuesta mayoritariamente por gammaglobulina y una segunda fracción clarificada, siendo objeto de separación ambas segundas fracciones.
compuesta mayoritariamente por gammaglobulina y una segunda fracción clarificada, siendo objeto de separación ambas segundas fracciones.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque dicho plasma animal es plasma porcino,
bovino, ovino, equino o caprino.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque dicho plasma animal es plasma
porcino.
16. Procedimiento según por lo menos una de las
reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque dicha segunda
fracción insolubilizada es objeto de disolución en agua en una
relación segunda fracción insolubilizada:agua comprendida en el
intervalo 1:2- 1:9; es objeto de un tercer ajuste del pH a un valor
comprendido entre 5 y 9; y es objeto de secado.
17. Procedimiento según la reivindicación 16,
caracterizado porque dicho secado se efectúa con un
atomizador, sometiendo dicha segunda fracción insolubilizada a una
circulación de aire a alta temperatura.
18. Procedimiento según la reivindicación 17,
caracterizado porque dicha alta temperatura varía entre un
intervalo de 150-250ºC a la entrada y un intervalo
de 70-100ºC a la salida.
19. Procedimiento según por lo menos una de las
reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque dichos
concentrados en gammaglobulina se obtienen en forma líquida,
congelada, concentrada o secada por un procedimiento diferente del
que utiliza un atomizador.
20. Procedimiento según por lo menos una de las
reivindicaciones 13 a 19, caracterizado porque dicho primer
ajuste se realiza con ácido clorhídrico o ácido fosfórico.
21. Procedimiento según por lo menos una de las
reivindicaciones 13 a 20, caracterizado porque dicha
separación tiene lugar mediante un filtro prensa con un tamiz de
poro filtrante.
22. Procedimiento según por lo menos una de las
reivindicaciones 13 a 17, caracterizado porque dicha
separación tiene lugar mediante una centrifugadora con una
aceleración superior a 3000 g.
23. Procedimiento según la reivindicación 22,
caracterizado porque dicha centrifugadora es continua.
24. Procedimiento según la reivindicación 22,
caracterizado porque dicha centrifugadora es de bol
interior.
25. Procedimiento según por lo menos una de las
reivindicaciones 13 a 22, caracterizado porque dicho segundo
ajuste se realiza mediante hidróxido sódico.
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| ES9900757 | 1999-04-13 | ||
| ES9900757A ES2158776B1 (es) | 1999-04-13 | 1999-04-13 | Procedimiento para la obtencion de gammaglobulinas de origen animal y aplicaciones correspondientes. |
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