ES2243237T3 - Material y metodos relacionados con la modulacion de la expresion de p66. - Google Patents
Material y metodos relacionados con la modulacion de la expresion de p66.Info
- Publication number
- ES2243237T3 ES2243237T3 ES00911131T ES00911131T ES2243237T3 ES 2243237 T3 ES2243237 T3 ES 2243237T3 ES 00911131 T ES00911131 T ES 00911131T ES 00911131 T ES00911131 T ES 00911131T ES 2243237 T3 ES2243237 T3 ES 2243237T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- shc
- nucleic acid
- cells
- polypeptide
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 55
- 239000000463 material Substances 0.000 title description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 20
- 102100022340 SHC-transforming protein 1 Human genes 0.000 claims description 306
- 101150012554 shc gene Proteins 0.000 claims description 198
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 42
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 41
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 38
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 37
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 29
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 28
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 claims description 27
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 27
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 16
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 16
- 102220471474 Protein MON2 homolog_S36A_mutation Human genes 0.000 claims description 15
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 14
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 14
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract description 37
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 abstract description 31
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 27
- 101150018665 MAPK3 gene Proteins 0.000 abstract description 12
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 11
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 abstract description 7
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002679 ablation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 100
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 41
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 19
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 17
- 230000004044 response Effects 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 15
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 15
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 15
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 14
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 14
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 12
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 11
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 11
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 11
- -1 hydroxyl radicals Chemical class 0.000 description 11
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 10
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 10
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 10
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 10
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 10
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 10
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 9
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 9
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108010055717 JNK Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 5
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 5
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 5
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 5
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- FIKAKWIAUPDISJ-UHFFFAOYSA-L paraquat dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=C[N+](C)=CC=C1C1=CC=[N+](C)C=C1 FIKAKWIAUPDISJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical class OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000011506 response to oxidative stress Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 3
- 230000010094 cellular senescence Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- DCWXELXMIBXGTH-QMMMGPOBSA-N phosphonotyrosine Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N phosphotyrosine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 3
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 3
- 102220313179 rs1553259785 Human genes 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- VQVUBYASAICPFU-UHFFFAOYSA-N (6'-acetyloxy-2',7'-dichloro-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) acetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Cl)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(Cl)C(OC(=O)C)=C1 VQVUBYASAICPFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006822 Agouti Signaling Protein Human genes 0.000 description 2
- 108010072151 Agouti Signaling Protein Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000484025 Cuniculus Species 0.000 description 2
- 101100015729 Drosophila melanogaster drk gene Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000006404 Mitochondrial Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010058682 Mitochondrial Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 2
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000007960 cellular response to stress Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 101150098203 grb2 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 210000003456 pulmonary alveoli Anatomy 0.000 description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- ZISSAWUMDACLOM-UHFFFAOYSA-N triptane Chemical compound CC(C)C(C)(C)C ZISSAWUMDACLOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 2
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 2
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 101150014742 AGE1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002407 ATP formation Effects 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 102000002569 MAP Kinase Kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010068304 MAP Kinase Kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 241001599018 Melanogaster Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000233805 Phoenix Species 0.000 description 1
- 206010063493 Premature ageing Diseases 0.000 description 1
- 208000032038 Premature aging Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000009516 Protein Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010009341 Protein Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100027584 Protein c-Fos Human genes 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 101150076031 RAS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150045048 Ras85D gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 1
- 102000014400 SH2 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050003452 SH2 domains Proteins 0.000 description 1
- 101100477614 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SIR4 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 102000035181 adaptor proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005764 adaptor proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000002787 antisense oligonuctleotide Substances 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000005735 apoptotic response Effects 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 235000019577 caloric intake Nutrition 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 230000008809 cell oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004637 cellular stress Effects 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000006650 fundamental cellular process Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 208000023589 ischemic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000002311 liver mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 1
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001466 metabolic labeling Methods 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000006548 oncogenic transformation Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000037050 permeability transition Effects 0.000 description 1
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008832 photodamage Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000037332 pore function Effects 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000010586 pulmonary interstitial glycogenosis Diseases 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 150000003354 serine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940086735 succinate Drugs 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N trisodium vanadate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-][V]([O-])([O-])=O IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Psychology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia codificadora de p66shc, estando compuesta la secuencia codificadora por la secuencia codificadora de la figura 5 que incorpora una mutación tal que, en la proteína codificada por la secuencia codificadora, está ausente el residuo S36 o está reemplazado por un residuo aminoacídico diferente.
Description
Material y métodos relacionados con la modulación
de la expresión de p66.
La presente invención se refiere a materiales y
procedimientos relacionados con los efectos de la expresión de p66.
Particularmente, pero no exclusivamente, la presente invención
proporciona materiales y procedimientos relacionados con la
observación de que el p66, y más particularmente la isoforma p66
Shc, es parte de una vía de transducción de señales que regula la
respuesta al estrés, la respuesta a señales oncogénicas y la
longevidad en mamíferos.
Los genes que son responsables del fenómeno del
envejecimiento en mamíferos son desconocidos. Las teorías actuales
postulan que el envejecimiento es la consecuencia de mutaciones que
no afectan a la salud de los individuos adultos, y que tiene
efectos perjudiciales posteriormente en la vida. Las evidencias
circunstanciales sugieren que los genes implicados en el control de
la respuesta al estrés oxidativo son "genes del
envejecimiento" candidatos. Incluso, la acumulación de daños
oxidativos está correlacionada con el envejecimiento.
El locus SHC de mamíferos codifica tres
isoformas: p52, p46 y p66. Difieren por la presencia de secuencias N
terminales de longitud variable y comparten un dominio SH2 C
terminal, un dominio de homología al colágeno central (CH1), rico
en residuos de prolina/glicina, y un dominio de unión a
fosfotirosina N terminal (PTB). La región N terminal del aminoácido
110 única del p66 también es rica en residuos de glicina y prolina
(CH2) (Figura 1A). Por lo tanto, el p66^{shc} es una variante
sometida a distinto ayuste (splicing) de
p52^{shc}/p46^{shc} (Migliaccio E. y col. "Embo J". 16,
706-716 (1997), un transductor de señales
citoplásmicas implicado en la transmisión de señales mitogénicas
desde tirosina quinasas hasta Ras (Pelicci G. y col "Cell" 70,
93-104 (1992)). Las isoformas p52/46 Shc están
implicadas en la propagación citoplásmica de señales mitogénicas
desde receptores activados hasta Ras (Bonfini L. y col. "Tibs"
21, 257-261; 1996). Se fosforilan rápidamente en la
tirosina después de la estimulación de los receptores por el ligando
y, bajo fosforilación, forman complejos estables con los receptores
activados y Grb2, una proteína adaptadora para el factor SOS de
intercambio nucleotídico de guanina de Ras (Migliaccio E. y col.
"Embo J." 16, 706-716 (1997); Pelicci G. y
col. "Cell" 70, 93-104 (1992);
Rozakis-Adcock, M. Y col. "Nature" 360,
689-692 (1992)). Estos complejos inducen la
activación de Ras, tal como se mide mediante la formación aumentada
de RasGTP, actividad de la Proteína Quinasa Activada por Mitógenos
(MAPK) y activación de FOS en células cultivadas que sobreexpresan
p52^{shc}/p46^{shc} (Migliaccio, E. y col. "Embo J." 16,
706-716 (1997); Pronk, G. y col. "Mol. Cell.
Biol." 14, 1575-1581 (1994); Lanfrancone, L. y
col. "Oncogene" 10, 907-917 (1995)). De manera
similar, el p66^{shc} se fosforila en la tirosina bajo la
activación del receptor y forma complejos estables con los
receptores activados y Grb2. Sin embargo, inhibe la activación del
promotor c-fos y no afecta a la actividad MAPK,
sugiriendo así que el p66^{shc} actúa en una vía de señalización
intracelular distinta (Migliaccio E. y col. "Embo J." 16,
706-716 (1997)).
El c-fos se activa de manera
transcripcional en respuesta a una gran variedad de agentes adversos
(estrés medioambiental), como agentes que dañan al ADN (por ejemplo
radiación ultravioleta, UV) o agentes que inducen daño oxidativo
(por ejemplo, peróxido de hidrógeno, H_{2}O_{2}) (Schereiber,
M. Y col. "Embo J." 14, 5338-5349 (1995); Sen,
C. y col. "FASEB J." 10, 709-720 (1996)).
Se postula que el factor principal del
envejecimiento es la acumulación de daños oxidativos al envejecer el
organismo (Martín, G.M. y col. "Nature Genetics" 13,
25-34 (1996); Johnson, F.B. y col. "Cell" 96,
291-302 (1999); Lithgow G.J. y col. "Science"
273, 80 (1996)). Incluso, las moscas transgénicas que sobreexpresan
las enzimas antioxidantes tienen una mayor longevidad (Orr W.C. y
col. "Science" 263, 1128-1130 (1994)); la
restricción de la ingesta calórica disminuye los niveles estables
del estrés oxidativo y los daños oxidativos y prolongan la
longevidad máxima en los mamíferos (Sohal R.S. y col.
"Science" 273, 59-63 (1996)). Sin embargo, los
genes que determinan la longevidad en mamíferos no se conocen.
Entre las teorías evolutivas actualmente aceptadas se postula que
el envejecimiento es un proceso posterior a la reproducción que ha
escapado a la fuerza de la selección natural y que ha evolucionado
a través de la selección de alelos con los primeros beneficios de
la vida combinados con los efectos pleiotrópicamente perjudiciales
posteriormente en la vida. Por lo tanto, se cree que los genes
postulados, como se seleccionan de manera activa, regulan los
procesos celulares fundamentales, comunes a diferentes
especies.
Los presentes inventores han determinado que el
p66 es un gen esencial en la regulación de las respuestas celulares
al estrés medioambiental y oncogénico y que está implicado en el
proceso del envejecimiento y en la supresión de tumores. El p66
proporciona la primera información genética sobre la teoría del
envejecimiento. El p66 ejerce mecanísticamente sus funciones después
de las serina quinasas activadas por estrés y antes de los
p53-p21.
Los presentes inventores han determinado que las
mutaciones dirigidas del gen de ratón p66^{shc} inducen
resistencia al estrés y prolongan la supervivencia. Los presentes
inventores describen en el presente documento que i) el p66^{shc}
se fosforila en la serina bajo tratamiento con luz UV o daño
oxidativo; ii) la fosforilación en la serina del p66 mediante
señales oxidativas está mediada por Erk1 y p38, tal como se muestra
in vivo y in vitro; iii) la ablación de la expresión
de p66^{shc} mediante recombinación homóloga mejora la
resistencia al daño oxidativo in vitro e in vivo; iv)
un mutante del p66^{shc} carente de fosforilación en la serina es
incapaz de restablecer una respuesta al estrés normal en células
diana p66^{shc}; v) los ratones que presentan la mutación dirigida
del p66^{shc} tienen una vida prolongada.
Los presentes inventores describen en la presente
invención que i) la activación de p16, p53 y p21 se pierde en
células p66-/- tratadas con H_{2}O_{2}, luz UV o mediante la
expresión de RASV12; ii) el oncogen RASV12 es incapaz de inducir
senescencia celular en fibroblastos de embrión de ratón p66-/-
(MEFs) y, por el contrario, transforma las células p66-/-; iii) los
MEFs p66-/- que sobreexpresan RASV12, que muestran una morfología
fusiforme transformada, son capaces de formar focos de confluencia
y colonias en medios semisólidos; iv) p16 y p53 son incapaces de
inducir la proliferación de crecimiento de las células p66-/-.
De esta manera, los presentes inventores
demuestran en el presente documento que el propio p66 se activa
mediante fosforilación de la serina mediante quinasas activadas por
estrés y señales hasta
p16-p19-p53-p21 y
que funcionalmente, la vía de señalización de p66 regula la
supresión de tumores y la longevidad.
De esta manera, en su caso más general, la
presente invención proporciona materiales y procedimientos asociados
con la modulación de la expresión del gen p66^{shc} y su
participación en una vía de transducción de señales que se activa
mediante estrés ambiental y mutaciones oncogénicas.
La presente invención proporciona un
procedimiento para interrumpir la vía de transducción de señales del
p66^{shc} en una célula, comprendiendo el procedimiento la etapa
de poner en contacto dicha célula con una molécula de ácido
nucleico capaz de hibridar con el ácido nucleico que codifica el
p66^{shc}, evitando así la expresión del p66^{shc}.
En un primer aspecto de la presente invención
también se prevé una molécula de ácido nucleico que comprende una
secuencia codificadora de p66^{shc}, consistiendo la secuencia
codificadora de la secuencia codificadora de la figura 5 que
incorpora una mutación tal que, es la proteína codificada en la que
el residuo S36 de la secuencia codificadora está ausente o
reemplazado mediante un diferente residuo aminoacídico.
Preferiblemente, el residuo de serina se reemplaza por un residuo
aminoacídico diferente, por ejemplo el S36 se reemplaza por alanina
(p66^{shc}S36A).
La presente invención también prevé un
polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la
presente invención tal como se ha descrito anteriormente.
Generalmente, el ácido nucleico según la presente
invención se proporciona aislado, en forma aislada y/o purificada,
o libre o sustancialmente libre del material con el que está
asociado de modo natural, así como libre o sustancialmente libre
del ácido nucleico que flanquea el gen en el genoma humano, excepto
posiblemente una o más secuencias de regulación para su expresión.
El ácido nucleico puede ser total o parcialmente sintético y puede
incluir ADN, ADNc o ARN genómico. Si el ácido nucleico según la
invención incluye ARN, la referencia a la secuencia mostrada se ha
de construir como referencia al ARN equivalente, sustituyendo U a
T.
Un experto en la materia puede preparar
fácilmente las secuencias nucleotídicas que codifican todo o parte
del gen p66^{shc} y/o sus elementos de regulación usando la
información y las referencias contenidas en la presente invención y
las técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, ver Sambrook,
Fritsch y Maniatis, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, y Ausubel y col.,
"Short Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons,
1992). Estas técnicas incluyen (i) el uso de la reacción de cadena
de polimerasa (PCR) para amplificar la muestra de este ácido
nucleico, por ejemplo a partir de fuentes genómicas, (ii) la
síntesis química, o (iii) la preparación de secuencias de ADNc. Se
pueden hacer modificaciones a las secuencias de p66^{shc}, por
ejemplo usando mutagénesis dirigida para dirigir la expresión del
p66^{shc} modificado, o tener en cuenta la preferencia de codón
en las células huésped usadas para expresar el ácido nucleico.
Para obtener la expresión de las secuencias
nucleotídicas de p66^{shc}, las secuencias se pueden incorporar
en un vector que tiene secuencias de control enlazadas de manera
operativa con el ácido nucleico de p66^{shc} para controlar su
expresión. Los vectores pueden incluir otras secuencias tales como
promotores o potenciadores para dirigir la expresión del ácido
nucleico insertado, secuencias nucleotídicas de manera que el
polipéptido p66^{shc} se produce como una fusión y/o ácido
nucleico que codifica señales de secreción de manera que el
polipéptido producido en la célula huésped se segrega desde la
célula. El polipéptido p66^{shc} se puede obtener a continuación
mediante la transformación de las células huésped, en el que el
vector sea funcional, cultivando las células huésped de manera que
se produzca el polipéptido p66^{shc} y recuperando el polipéptido
p66^{shc} a partir de las células huésped o del medio que las
rodea. Se usan células procariotas o eucariotas para este propósito
en la técnica, incluyendo variedades de E. coli, levadura, y
células eucariotas tales como células COS o CHO. La elección de la
célula huésped se puede usar para controlar las propiedades del
polipéptido p66^{shc} expresado en esas células, por ejemplo
controlando si el polipéptido se deposita en las células huésped o
si afecta a propiedades tales como su glicosilación.
Las técnicas de PCR para la amplificación del
ácido nucleico se describen en la patente US 4.683.195. En general,
estas técnicas requieren que se conozca la información de la
secuencia de los extremos de la secuencia diana para permitir el
diseño de los cebadores oligonucleotídicos directos e inversos
adecuados que sean idénticos o similares a la secuencia
polinucleotídica que sea el objetivo de la amplificación. La PCR
comprende las etapas de desnaturalización del ácido nucleico de la
muestra (si tiene doble cadena), hibridación del cebador al
objetivo, y polimerización. El ácido nucleico investigado o usado
como molde en la reacción de amplificación puede ser ADN, ADNc o ARN
genómico. La PCR se puede usar para amplificar las secuencias
específicas a partir de ADN genómico, secuencias de ARN específicas
o ADNc transcrito a partir de ARNm, secuencias de bacteriófagos o
plasmídicas. Las secuencias nucleotídicas de p66^{shc} provistas
en la presente invención permiten al experto en la materia diseñar
fácilmente cebadores para la PCR. Las referencias para el uso
general de técnicas de PCR incluyen Mullis y col., "Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol.", 51:263, (1987), Ehrlich (ed), "PCR
technology", Stockton Press, NY, 1989, Ehrlich y col.,
"Science", 252:1643-1650, (1991), "PCR
protocols; A Guide to Methods and Applications", Eds. Innis y
col., Academic Press, New York, (1990).
Un oligonucleótido para uso en amplificación de
ácido nucleico puede tener unos 10 codones o menos (por ejemplo, 6,
7 u 8), es decir, tener unos 30 nucleótidos o menos de longitud
(por ejemplo 18, 21 ó 24). Generalmente los cebadores específicos
están por encima de los 14 nucleótidos de longitud, pero no más de
18 a 20. Los expertos en la materia están bien versados en el diseño
de cebadores para su uso en procesos tales como la PCR.
Una manera conveniente de producir un polipéptido
según la presente invención es expresar el ácido nucleico que lo
codifica, mediante el uso del ácido nucleico en un sistema de
expresión. El uso de un sistema de expresión ha alcanzado hoy un
avanzado grado de sofisticación.
En consecuencia, la presente invención también
abarca un procedimiento para hacer un polipéptido (tal como se
describe), incluyendo el procedimiento la expresión a partir de un
ácido nucleico que codifica el polipéptido (generalmente ácido
nucleico según la invención). Esto se puede conseguir
convenientemente creciendo una célula huésped, que contiene este
vector, en un cultivo bajo las condiciones apropiadas que provocan
o permiten la expresión del polipéptido. Los polipéptidos también se
pueden expresar en sistemas in vitro, tales como lisado de
reticulocitos.
Son bien conocidos los sistemas para clonar y
expresar un polipéptido en una variedad de diferentes células
huésped. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células
eucariotas tales como de mamíferos y de levadura, y sistemas de
baculovirus, las líneas celulares de mamíferos disponibles en la
técnica para expresión de un polipéptido heterólogo incluyen
células de ovario de hámster chino, células HeLa, células de riñón
de cría de hámster, células COS y muchas otras. Un huésped
bacteriano común preferido es E. coli.
Se pueden elegir o construir vectores adecuados,
que contengan secuencias reguladoras apropiadas, que incluyen
secuencias promotoras, fragmentos de terminación, secuencias de
poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras
secuencias según sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos,
virales, por ejemplo `fago o fagómido, como sea apropiado. Para más
detalles ver, por ejemplo, "Molecular Cloning: a Laboratory
Manual"; 2a edición, Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbor
Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la
manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo en la preparación de
construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación,
introducción de ADN en células y expresión de genes, y análisis de
proteínas, se describen en detalle en "Current Protocols in
Molecular Biology", Ausubel y col. eds., John Wiley & Sons,
1992.
De esta manera, la presente invención también
proporciona una célula huésped que contiene un vector tal como se
describe en la presente invención. El ácido nucleico de la
invención se puede integrar en el genoma (por ejemplo cromosoma) de
la célula huésped. La integración se puede promover mediante la
inclusión de secuencias que promuevan la recombinación con el
genoma, según técnicas estándar. El ácido nucleico puede estar en
un vector extra-cromosómico en el interior de la
célula.
Se puede usar un oligonucleótido antisentido
capaz de hibridar específicamente con el ácido nucleico de
p66^{shc} en la preparación de un medicamento para aumentar la
resistencia celular al estrés oxidativo.
La presente invención también proporciona
procedimientos in vitro para aumentar la resistencia de las
células al estrés oxidativo. Tal estrés oxidativo puede ser el
resultado de factores externos, por ejemplo medioambientales,
factores como luz UV, rayos X, choque térmico, choque osmótico,
estrés oxidativo (oxígeno singlete, H_{2}O_{2}, radicales
hidroxilo, citoquininas inflamatorias), o puede ser resultado de
factores internos que produzcan necrosis celular como ocurre en
algunas enfermedades.
Un procedimiento para aumentar la resistencia de
las células al estrés oxidativo comprende la interrupción de una vía
de señalización de p66^{shc}. La vía se puede interrumpir en
cualquier etapa durante el proceso de señalización, por ejemplo, el
polipéptido p66^{shc} se puede mutar de modo que falte el residuo
de serina o esté reemplazado por otros residuo aminoacídico
diferente, por ejemplo, la alanina de modo que el polipéptido
resultante no se pueda fosforilar en la serina; la capacidad de las
moléculas como p38 o MAPK de fosforilar p66^{shc} se puede
interrumpir mediante, por ejemplo, quinasa negativas dominantes o
inhibidores específicos; y, más preferiblemente, la expresión de
p66^{shc} se puede interrumpir disminuyendo de ese modo el
polipéptido p66^{shc} en la célula. Además, como p53 y p16 no son
biológicamente activos en las células p66-/-, se puede usar
cualquier molécula de p66 negativa dominante para bloquear la
función de p16 y p53.
La interrupción de la expresión del gen
p66^{shc} se puede obtener de varios modos. Se pueden diseñar
secuencias nucleotídicas antisentido basadas en la secuencia de
p66^{shc} para hibridar con la secuencia nucleotídica
complementaria, pre-ARNm, o ARNm maduro,
interfiriendo con la producción del polipéptido codificado por una
secuencia de ADN dada (por ejemplo el polipéptido nativo p66^{shc}
o un mutante suyo), de modo que su expresión se reduce o evita en
conjunto. Además de la secuencia codificadora de p66^{shc}, se
pueden usar técnicas con secuencias antisentido para afectar a las
secuencias de control del gen p66^{shc}, por ejemplo en la
secuencia flanqueante 5' de la secuencia codificadora de
p66^{shc}, a través del cual los oligonucleótidos antisentido
pueden interferir con las secuencias de control de p66^{shc}. La
construcción de las secuencias antisentido y su uso están descrita
en Peyman y Ulman, Chemical Reviews, 90: 543-584,
(r990), Crooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxical, 32:
329-376, (1992), y Zamecnik y Stephenson, P. N. A.
S., 75: 280-284, (1974).
Un procedimiento de investigación de compuestos
capaces de modular la vía de señalización de p66^{shc} puede
comprender poner en contacto un compuesto candidato con un sistema
de expresión de p66^{shc} como se describe anteriormente;
determinar la cantidad de un componente de la vía de señalización; y
comparar dicha cantidad del componente con la cantidad del
componente en ausencia de dicho compuesto candidato.
Preferiblemente, el sistema de expresión
comprende un vector de ácidos nucleicos con la secuencia
codificadora de p66^{shc} o un fragmento de la misma insertado en
su interior. Se pueden elegir o construir los vectores adecuados,
que contengan las secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo
secuencias promotoras, fragmentos de terminación, secuencias de
poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras
secuencias según sean apropiadas. Para más detalles ver, por
ejemplo, "Molecular Cloning: a Laboratory Manual"; 2a edición,
Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Los
procedimientos para introducir el ácido nucleico en las células
depende de la célula huésped usada, pero son muy conocidos.
De este modo el sistema de expresión también
puede comprender una célula huésped que contenga una secuencia
codificadora de p66^{shc} o un vector como se describe
anteriormente. Más preferiblemente, el sistema de expresión
comprende una célula derivada de una línea celular, como
fibroblastos de embrión de ratón, que se sabe que expresan
p66^{shc}.
La vía de señalización de p66^{shc} se puede
modular, por ejemplo interrumpir, en cualquier etapa durante la vía
de señalización, como evitar la producción de un p66^{shc} activo.
Los ejemplos de tal modulación pueden incluir evitar directamente la
expresión de de p66^{shc} bloqueando los factores implicados en la
transcripción de los genes. Por ejemplo, se pueden usar cebadores
antisentido para que se unan al gen p66^{shc} impidiéndose de este
modo que los factores de transcripción se unan a los agentes
reguladores requeridos para promover la transcripción.
Alternativamente, nos podemos centrar en la secuencia codificadora
de p66^{shc} de modo que introduzcamos mutaciones que impidan la
expresión de p66^{shc} sin interrumpir la expresión de proteínas
asociadas como p52^{shc} y p46^{shc}. Preferiblemente, la
mutación altera el exón que codifica la región CH_{2} de p66. Se
pueden usar además sondas antisentido para que se unan al ADN o al
ARNm que codifica a p66^{shc} evitándose así su traducción.
Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos específicos para
p66^{shc} (por ejemplo, anticuerpos anti-CH_{2})
que se unan específicamente a la proteína ya expresada de modo que
se impida la posterior unión de p66^{shc} a otras proteínas, por
ejemplo a receptores.
Además, se puede obtener la inhibición de la
función de p66^{shc} inhibiendo la fosforilación de la región
CH_{2} de p66 inducida por las quinasas de respuesta frente al
estrés Erk1 o p38. Con este fin, se puede examinar una colección de
compuestos para identificar aquellos que son capaces de inhibir la
fosforilación in vitro de la región
GST-CH_{2} por una Erk1 recombinante. Los ejemplos
de tales compuestos incluyen MAPK (proteína quinasa activada por
mitógenos), cualquier serina/treonina quinasa y p38.
También se pueden usar los anticuerpos para
afectar o modular la actividad de la función de p66^{shc}. Así,
hay un uso adicional e importante del polipéptido p66^{shc} al
aumentar los anticuerpos que tienen la propiedad de unirse
específicamente al polipéptido p66^{shc}, o fragmentos y partes
activas del mismo.
La producción de anticuerpos monoclonales está
bien establecida en la técnica. Los anticuerpos monoclonales se
pueden someter a técnicas de tecnología del ADN recombinante para
producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que mantengan la
especificidad del anticuerpo original. Tales técnicas pueden
implicar la introducción del ADN que codifica la región variable de
la inmunoglobulina, o las regiones determinantes de
complementariedad (CDR), de un anticuerpo hasta las regiones
constantes, o regiones constantes más regiones estructurales (FW),
de una inmunoglobulina diferente. Ver, por ejemplo, EPA184187,
GBA2188638 o EPA239400. Un hibridoma que produce un anticuerpo
monoclonal se puede someter a una mutación genética u otros cambios,
que puedan o no alterar la especificidad de unión de los anticuerpos
producidos.
Un anticuerpo capaz de unirse específicamente al
polipéptido p66^{shc} puede ser específico en el sentido de que
sea capaz de distinguir entre el polipéptido al que es capaz de
unirse y a otros polipéptidos humanos para los que no tiene o tiene
poca capacidad de unirse (por ejemplo una capacidad de unión 1000
veces peor). Los anticuerpos específicos se unen a un epítopo de la
molécula que o no está presente o no es accesible en otras
moléculas. Los anticuerpos según la presente invención son
particularmente específicos para el polipéptido p66^{shc}
silvestre de modo que alteran su función.
Los anticuerpos preferidos se aíslan, en el
sentido de que se eliminan contaminantes como otros anticuerpos
capaces de unirse a otros polipéptidos y otros componentes séricos.
Para algunos propósitos se prefieren los anticuerpos monoclonales,
aunque los anticuerpos policlonales entran dentro del alcance de la
presente invención.
Los anticuerpos se pueden obtener usando técnicas
que son habituales en la técnica. Los procedimientos para producir
anticuerpos incluyen la inmunización de un mamífero (por ejemplo,
ratón, rata conejo, caballo, cabra, oveja o mono) con la proteína o
un fragmento de la misma. Los anticuerpos se pueden obtener a partir
de los animales inmunizados usando una de las varias técnicas
conocidas en la técnica, y se examinan, preferiblemente usando la
unión del anticuerpo al antígeno de interés. Por ejemplo, se pueden
usar técnicas de inmunotransferencia tipo Western o
inmunoprecipitación (Armitage y col., Nature, 357:
80-82,1992). El aislamiento de los anticuerpos y
las células que los producen a partir de un animal puede estar
acompañado de una etapa de sacrificio del animal.
Como una alternativa o complemento a la
inmunización de un mamífero con un péptido, se puede obtener un
anticuerpo específico para un proteína a partir de una colección de
dominios variables de inmunoglobulinas expresados recombinantemente,
por ejemplo usando un bacteriófago lambda o un bacteriófago
filamentoso que presente dominios de unión funcionales en su
superficie; por ejemplo, ver WO92/01047. La colección puede ser
inicial, es decir, se construye a partir de secuencias obtenidas de
organismos que no han sido inmunizados con ninguna de las proteínas
(o fragmentos), o puede ser una construida usando secuencias
obtenidas a partir de un organismo que ya ha sido expuesto al
antígeno de interés.
Los anticuerpos según la presente invención se
pueden modificar de varias maneras. De hecho el término
"anticuerpo" se debería emplear de modo que cubra cualquier
sustancia con capacidad de unión que tenga un dominio de unión con
la especificidad requerida. Así, la invención cubre fragmentos de
anticuerpo, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de
anticuerpos, incluyendo moléculas sintéticas y moléculas cuya forma
mimetiza a la de un anticuerpo haciendo que pueda unirse a un
antígeno o epítopo.
Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo, capaces
de unirse al antígeno u otra molécula relacionada con capacidad de
unión son el fragmento Fab, compuesto por los dominios VL, VH CI y
CH1; el fragmento Fd está compuesto por los dominios VH y CH1; el
fragmento Fv, compuesto por los dominios VL y VH de un brazo simple
de un anticuerpo; el fragmento dAb que está compuesto por un dominio
VH; regiones aisladas CDR y fragmentos F(ab')2, un fragmento
bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente
disulfuro a la región bisagra. También se incluyen fragmentos Fv de
cadena simple.
Es más que sabido que la investigación
farmacéutica que conduce a la identificación de un nuevo fármaco
puede implicar el análisis de una enorme cantidad de sustancias
candidatas, tanto antes como incluso después de que se haya
encontrado un compuesto ejemplo. Éste es un factor que hace que la
investigación farmacéutica sea muy cara y que lleve mucho tiempo.
Los medios de ayuda en el proceso de análisis pueden tener una
considerable importancia y utilidad comercial. La presente invención
proporciona tales medios para el análisis de sustancias
potencialmente útiles en el aumento de la resistencia al estrés
oxidativo y extendiéndose así a la longevidad celular.
Un procedimiento de análisis de una sustancia que
modula (interrumpe) la actividad del polipéptido p66^{shc} puede
incluir el poner en contacto una o más sustancias de prueba con el
polipéptido en un medio de reacción adecuado, probando la actividad
del polipéptido tratado y comparando esa actividad con la actividad
del polipéptido en un medio de reacción comparable si tratar con la
sustancia o sustancias de prueba. Convenientemente, se puede usar un
ensayo de actividad enzimática para determinar cualquier alteración
de la actividad de p66^{shc}.
La tecnología de colecciones combinatorias
proporciona un eficaz modo para probar un número potencialmente alto
de diferentes sustancias para su capacidad de interrumpir o eliminar
la actividad de p66^{shc}. Tales colecciones y su uso son muy
conocidas en la técnica. Se prefiere el uso de colecciones de
péptidos.
Además, los ensayos para determinar inhibidores
de p66^{shc} pueden incluir el uso de células silvestres (tanto
líneas celulares establecidas como cultivos celulares primarios
capaces de expresar p66^{shc}, por ejemplo MEFs, p66-/- MEHS o
MEFs sobreexpresando p66^{shc} (mediante el uso de un vector de
expresión de p66^{shc})).
Las respuestas comparativas que se han de
determinar pueden incluir respuestas a factores de estrés, por
ejemplo luz UV o H_{2}O_{2}; senescencia en fibroblastos
primarios inducida por la inhibición de RASV12 (o cualquier otro
oncogen); inhibición de la función de p53, p19, p16 o p21 (como se
mide mediante ensayos transcripcionales, o ensayos de estabilidad, o
ensayos de exportación núcleo-citoplasma); o
inhibición de la fosforilación de p66 inducida por RASV12 o por
señales de estrés oxidativo.
Tras la identificación de una sustancias o
compuesto que interrumpa p66^{shc} o un paso en la vía de
señalización de p66^{shc}, se puede investigar adicionalmente la
sustancia o compuesto. Además, se puede fabricar y ser empleado en
la preparación, es decir fabricación de la formulación, una
composición como un medicamento, una composición farmacéutica o un
fármaco. Éstas se pueden administrar a los individuos. Se ha
implicado al estrés oxidativo en la generación de muchas
enfermedades humanas. Así, se pueden usar medicamentos,
composiciones farmacéuticas o fármacos que comprenden un inhibidor
de la función de p66, o sustancias o compuestos que interrumpan a
p66 en cualquier etapa de la vía de p66^{shc} en el tratamiento de
enfermedades como arteriosclerosis, enfermedad isquémica del
corazón, Parkinson, Alzheimer, complicaciones vasculares de la
diabetes, enfisema y otras enfermedades pulmonares, infarto de
miocardio, accidente cerebrovascular, envejecimiento prematuro,
senescencia celular, enfermedades de la piel y cánceres.
La presente invención también proporciona un
procedimiento in vitro para aumentar la resistencia celular
al estrés oxidativo que comprende la eliminación o interrupción del
que codifica a p66^{shc} en el genoma celular. Tal procedimiento
incluye procesos en los que un vector de ácido nucleico que
comprende una secuencia nucleotídica capaz de incorporarse en el
genoma de la célula e interrumpir la expresión de p66^{shc}.
En la técnica anterior se han usado vectores como
vectores virales para introducir genes en una amplia variedad de
células diana diferentes. Típicamente los vectores se exponen a las
células diana de modo que pueda tener lugar la transfección en una
proporción suficiente de células para proporcionar un efecto
terapéutico o profiláctico útil a partir de la expresión del
polipéptido deseado. El ácido nucleico transfectado se puede
incorporar permanentemente en el genoma en cada célula tumoral
transfectada, proporcionando un efecto a largo plazo, o de modo
alternativo el tratamiento se puede repetir periódicamente.
En la técnica se conoce una variedad de vectores,
tanto vectores virales como vectores plasmídicos, ver la patente de
EE.UU. 5.252.479 y WO93/07282. En particular, se han usado varios
virus como vectores para transfectar el gen, incluyendo,
papovavirus, como SV40, virus vaccinia, herpes virus,
incluyendo HSV y EBV y retrovirus. En la técnica anterior se han
usado muchos protocolos de terapia génica usando retrovirus murinos
inactivados.
Como alternativa al uso de vectores virales otros
procedimientos conocidos para introducir ácido nucleico en células
incluyen la electroporación, coprecipitación con fosfato de calcio,
técnicas mecánicas como la microinyección, transferencia mediada por
liposomas y entrada directa del ADN y transferencia de ADN mediada
por receptores.
Como se menciona anteriormente, los presentes
inventores también han determinado que la expresión de p66 es
indispensable para la capacidad de producir apoptosis de p53 (tras,
por ejemplo, un estrés oxidativo) o para la senescencia (tras por
ejemplo, la expresión de Ras). Así, cabe esperar que los agonistas
de p66 puedan ser teóricos supresores de tumores. De hecho,
cualquier molécula que pueda evitar la desfosforilación de p66 o de
las quinasas que inducen la fosforilación de p66 son mecanismos
potenciales para el tratamiento tumoral.
Así, en un aspecto adicional de la presente
invención, se proporciona el uso de un vector que comprende el ácido
nucleico que codifica el polipéptido p66^{shc} en la preparación
de un medicamento para aumentar la resistencia frente a la formación
de tumores en un tejido aumentando la expresión de p66^{shc}. Los
resultados descritos en la presente invención indican que los
niveles incrementados de p66^{shc} reducen la susceptibilidad a la
carcinogénesis.
El vector es capaz de incorporar dicho ácido
nucleico al genoma de las células del tejido.
Por ejemplo, se podría usar un ácido nucleico que
codifica un polipéptido p66^{shc} biológicamente activo auténtico
en un procedimiento de terapia génica, para tratar a un paciente que
no es capaz de sintetizar el polipéptido activo o que no es capaz de
sintetizarlo al nivel normal, proporcionando por lo tanto el efecto
proporcionado por el p66^{shc} y suprimiendo la susceptibilidad a
la formación de tumores.
A continuación se ilustran los aspectos y formas
de realización de la invención, a modo de ejemplo, con referencia a
las figuras que los acompañan. Los aspectos adicionales de la
invención serán evidentes para aquellos expertos en la materia.
En las figuras
La figura 1 muestra la fosforilación de la serina
de p66^{shc} mediante el tratamiento con luz UV o H_{2}O_{2}.
Figura 1A: Organización modular de p66^{shc}; Y:Y239, Y340 e
Y317, los principales sitios de fosforilación de tirosina Shc. Se
indica el codón de inicio alternativo (ATG) de p66^{shc}. Figura
1B: Inmunotransferencia tipo Western antifosfotirosina de
anti-p66 (\alpha-CH2)
inmunoprecipitados a partir de lisados de MEFs (SF) sin suero o de
fibroblastos embrionarios de ratón tratados con EGF, luz UV o
H_{2}O_{2} durante 5 minutos o 4 horas, como se indica. La misma
membrana se volvió a tratar con anticuerpos
anti-p66^{shc} (\alpha-CH2). Los
polipéptidos p66^{shc} están señalados con una flecha. También se
indican los polipéptidos que tienen reacciones cruzadas con la
inmunoglobulina (Ig). Figura 1C: Análisis de inmunoprecipitación
tipo Western de la expresión de p66^{shc} de MEFs (SF) sin suero o
de MEFs tratadas con EGF, luz UV o H_{2}O_{2} durante 5 minutos
o 4 horas como se indica. La misma membrana se volvió a tratar con
anticuerpos anti-actina. Figura 1D: Análisis de los
fosfoaminoácidos de p66^{shc}. Las MEFs (SF) sin suero se
etiquetaron con ortofosfato [P^{32}] 1 mCi/ml durante 4 horas y se
lisaron células sin estimular o estimuladas con EGF, luz UV o
H_{2}O_{2} durante 5 minutos o 4 horas y se resolvieron los
inmunoprecipitados con un gel de poliacrilamida
SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa y se
ultraradiografiaron (no mostrado). El análisis de fosfoaminoácidos
se realizó sobre el péptido p66^{shc}. Se indican las posiciones
de fosfoserinas (S), fosfotreoninas (T) y fosfotirosinas (Y).
La figura 2 muestra la respuesta potenciada
frente al estrés oxidativo de p66^{shc} in vitro e in
vivo. Figura 2A: Análisis de inmunotransferencia tipo Western de
la expresión de Shc en MEFs^{hc}+/+ y p66^{shc}-/- (panel
izquierdo) y en MEFs p66^{shc}-/- transducidas con el vector solo,
ADNc de p66^{shc} o p66^{shc}S36A (panel derecho). Figura 2B:
Viabilidad de MEFs tras el tratamiento con H_{2}O_{2}. Se
infectaron números iguales (1,2 x 15^{5}) de las células MEFs
indicadas crecidas en placas de 100 mm por triplicado con el
retrovirus PINCO o con retrovirus PINCO que expresaban p66^{shc} o
p66^{shc}S36A, como se indica, mantenidas durante 48 horas
adicionales para permitir la expresión del gen de los ADNc exógenos
y se expusieron a H_{2}O_{2} 400 mM durante 24 horas. La
viabilidad celular se determinó mediante exclusión con azul de
triptán. Los resultados se expresan como porcentaje de células
viables con respecto a los controles sin tratar con H_{2}O_{2} y
representan el promedio de los tres experimentos independientes. La
expresión de p66^{shc} o p66^{shc}S36A no influyó
significativamente en la viabilidad o en la tasa de crecimiento de
las MEFs, según la medición a las 48 horas tras la infección viral
(no mostrado).
La figura 3 muestra el mapa de los sitios de
fosforilación en las serinas de p66^{shc}. Figura 3A:
Inmunotransferencias con anti-CH2 de lisados de MEFs
transfectadas con vectores que expresan la región CH2 aislada y
después sin suero (SF) o tratadas con EGF o luz UV durante 5 minutos
o 4 horas, como se indica. La estrella indica el polipéptido CH2
desplazado. Figura 3B: Se introdujeron las mutaciones S36A o S54A en
la región CH2 aislada o en el p66^{shc} de longitud completa. El
ADNc resultante se etiquetó con HA, se clonó en un vector de
expresión pcDNA3 y se transfectó en las células MEFs. Los cultivos
se trataron como se indica y se analizaron mediante
inmunotransferencia tipo Western usando anticuerpos
anti-HA. Figura 3C: Análisis de fosfoaminoácidos de
p66^{shc} y p66^{shc}S36A o p66^{shc}S54A. Las células MEFs se
transfectaron con los vectores de expresión con
p66^{shc}-HA o p66^{shc}S36A-HA,
se mantuvieron en un cultivo etiquetado con ortofosfato [p^{32}] 1
mCi/ml durante 48 horas durante 4 horas y se trataron con EGF o
H_{2}O_{2} durante 5 minutos, como se indica, se lisan y se
inmunoprecipitan con anticuerpos anti-HA. El
análisis de fosfoaminoácidos se realizó en los polipéptidos
p66^{shc}-HA o p66^{shc}S36A-HA
como se describe en la leyenda de la figura 1.
La figura 4 muestra al supervivencia acumulativa
(Kaplan y Meier) de ratones p66^{shc}+/+ (línea de estrellas),
p66^{shc}+/- (línea de puntos) y p66^{shc}-/- (línea negra). La
supervivencia de los ratones p66^{shc}-/- fue del 71,4%.
La figura 5 muestra (a) la secuencia nucleotídica
del ADNc de p66 (el sitio de inicio ATG está subrayado) y (b),
separado, la secuencia aminoacídica de p66.
La figura 6 muestra una región genómica de 13 kb
que contiene todos los exones que codifican a Shc que se
caracterizaron un mapa con enzimas de restricción y la secuencia de
nucleótidos de todos los limites exón-intrón y las
regiones reguladoras 5'.
La figura 7 muestra la construcción del vector
dirigido pBSp66ShcKO.
La figura 8 muestra el vector pBSp66ShcKO con una
unidad transcripcional TK clonada en su extremo 3'.
La figura 9 muestra múltiples cambios metabólicos
en las células p66^{Shc}-/-. En particular muestra el mecanismo de
acción de p66 y sus efectos metabólicos, en particular la producción
incrementada de H_{2}O_{2} y el consiguiente aumento de
concentración de especies de oxígeno reactivas (ROS); y la
producción incrementada de ATP (a costa de las ROS). También se
confirma la localización en la membrana mitocondrial de p66 y regula
un puerto de transición y está implicada en la transferencia de
electrones.
La figura 10 muestra la regulación de la
actividad mitocondrial por p66^{shc}.
La figura 11 muestra el papel de p66 en la
apoptosis dependiente de p53.
Se aislaron fibroblastos embrionarios de ratón
(MEFs) a partir de embriones de 12 a 14 días derivados de ratones
p66^{shc}-/- y ratones p66^{shc}+/+ y se mantuvieron en medio
esencial mínimo de Earle suplementado con 10% de suero fetal bovino.
Las mutaciones S36A y S54A se generaron mediante técnicas de PCR
habituales. Los p66^{shc}, p66^{shc}S36A,
CH2-HA, CH2S35A-HA,
CH2S54A-HA, p66^{shc}-HA,
p66^{shc}-S35A-HA y
p66^{shc}S54A-HA se clonaron en los vectores de
expresión eucariotas pCDNA3 o PINCO (Claudio P. P. y col. Cancer
Res. 54,5556-5560 (1994); Grignai, F. y col. Cancer
Res. 1,14-19 (1998)). Los anticuerpos que se usaron
fueron: el anticuerpo policlonal anti-Shc que
reconoce el dominio SH2 de las tres isoformas Shc (Pelicci G. y
col. Cell 70,93-104 (1992)); el anticuerpo
policlonal anti-p66 que reconoce la isoforma
p66^{shc} (Migliaccio E. y col. Embo J. 16,706-716
(1997)); el anticuerpo policlonal anti-\betaactina
(Sigma Immuno Chemicals); el anticuerpo monoclonal
anti-HA; el anticuerpo monoclonal antifosfotirosina,
(Santa Cruz Biotechnology).
Para todos los lisados, las células se lisaron en
un tampón de muestra con SDS (Tris-HCL 50 mM, pH
6,8, 2% SDS v/v, 10% de glicerol y 5% v/v -mercaptoetanol) y se
hirvieron durante 5 minutos. Se analizaron 50 \mug de proteína
total en un gel de poliacrilamida SDS-PAGE. Para la
inmunoprecipitación, las células se lisaron en tampón PY en hielo
(Tris-HCL 20 mM, pH 7,8, NaCl 50 mM,
Na_{4}P_{2}0_{7} 30 mM, ortovanadato sódico 5 mM, 1% v/v de
Triton x-100 con inhibidores de proteasas recién
añadidos: fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 10 \mug.ml^{-1}
de leupeptina y 5 mg. ml^{-1} de aprotinina), los anticuerpos
apropiados se adsorbieron a Proteína A Sefarosa (Pharmacia) y se
incubaron después con los lisados durante 2 horas a 4ºC. Se
recuperaron los inmunoprecipitados, se resolvieron en un gel de
poliacrilamida SDS-PAGE del 10% y se transfirieron a
filtros de nitrocelulosa, como se describe en (Migliaccio E. y col.
Embo J. 16,706-716 (1997)). Se bloqueó la
inmunotransferencia, se usaron como sonda anticuerpos específicos y
los inmunocomplejos se revelaron con un antisuero secundario
específico (Biorad) conjugado con peroxidasa de rábano picante y
después quimioluminiscencia potenciada. Para el análisis de
fosfoaminoácidos, se cultivaron las células hasta confluencia en
placas de 10 cm, se privaron nutricionalmente en un medio sin suero
y se etiquetaron durante 4 horas en 5 ml de medio DMEM sin fosfato
con un 5% de FBS dializado y ortofosfato P^{32} 1 mCi.ml^{-1} Se
estimuló a las células con 30 ng.ml^{-1} de EGF o H_{2}O_{2}
400 \muM, o se irradiaron con luz UV 50 J/m^{2}, se aclararon
dos veces con PBS frío y se lisaron en tampón PY. Se aislaron las
proteínas p66 mediante inmunoprecipitación con anticuerpos
anti-SHC o anticuerpos anti-HA y se
resolvieron en un gel de poliacrilamida SDS-PAGE.
Los polipéptidos p66^{shc} fueron transferidos a membranas de PVDF
y se hidrolizaron en HCl 6 M durante 60 minutos a 110ºC. Los
productos de la hidrólisis se separaron en presencia de marcadores
de fosfoserina, fosfotreonina o fosfotirosina en un gel de
poliacrilamida SDS-PAGE a pH 1,9 y pH 3,5 en placas
de TLC de dos dimensiones.
Se transfectaron los MEFs con el reactivo
LipofectaMINE PLUS Reagent de GibcoBRL (eficacia de transfección
media del 50%). Para las infecciones retrovirales, se transfectó el
vector PINCO vacío y los vectores PINCO recombinantes que expresan
los ADNc de p66^{shc} o p66^{shc}S36A en la línea celular de
empaquetamiento anfotrópico phoenix y tras 48 horas, se
usaron los sobrenadantes para infectar las células MEFs (1,2 x
10^{5} células/100 placas de 100 mm). La eficacia de la infección
(células GFP positivas) se determinó mediante FACS 48 horas después
de la infección. La viabilidad se valoró mediante la prueba de
exclusión por tinción con azul de triptán.
Las funciones de supervivencia se estimaron
mediante el método de producto límite de Kaplan y Meier. Las
distribuciones de supervivencia se compararon usando la prueba de
log-rango (Marubini E. y col. New York, John
Wiley & Sons (1995)). Todos los cálculos estadísticos se
realizaron usando el programa SAS/STAT Rel. 6.12 software (SAS
Institute 1995).
El vector dirigido se construyó usando
procedimientos de clonación habituales. El plásmido se linearizó
cortando con Kpn1 antes de electroporar las células ES. Las células
CJ7 ES se mantuvieron en una monocapa de fibroblastos embrionarios
primarios resistentes a neomicina e inactivados por mitomicina C. Se
electroporó una suspensión de 15 millones de células ES
tripsinizadas en PBS con 25 \mug de ADN del vector dirigido
linearizado usando el aparato de Bio-Rad, gene
pulser II, con 240 V y 500 \muF. Las células se sembraron en
placas inmediatamente después de la transfección y se dejó que se
recuperaran durante 24 horas antes de la selección en el medio con
350 \mug/ml de geneticina y 2 \muM de ganciclovir. Se cambió el
medio a las células diariamente y después de 9 días se picaron las
colonias resultantes y se cultivaron individualmente hasta la
extracción y congelación.
Para identificar el alelo Shc, se preparó ADN
genómico a partir de las células ES y de colas de ratón tratándolas
con proteinasa K y con extracción con
fenol-cloroformo, se digirió con EcoR1 y se
analizó mediante un análisis de tipo Southern. Se usó un fragmento
EcoR1.Xba1 de 1,1 kb como sonda externa para discriminar entre las
bandas del fragmento silvestre de 8 kb y del alelo recombinante de
3,5 kb.
Se usaron dos clones diferentes de las células
diana ES para generar ratones quimera. Se transfirieron unos
blastocistos C57BL/6J a los que se inyectaron 10-15
células ES a hembras de ratones pseudoembarazadas. Los ratones
quimera, que se pueden identificar por su color de pelaje agutí, se
emparejaron con ratones C57BL/6J. Se examinó la descendencia con
color de pelaje agutí para comprobar la presencia del alelo
recombinado mediante análisis de tipo Southern. Se entrecruzaron los
heterocigotos obtenidos de los cruces de las quimeras con las
hembras de ratones 129Sv para establecer la colonia de ratones
p66-/- en el fondo genético de los 129. Los ratones se incubaron a
una temperatura (22ºC) y humedad (60%) constantes con ciclos de
luz/oscuridad de 12 horas, con acceso libre al pienso habitual de
los ratones y al agua corriente.
Los presentes inventores han mutado el locus Shc
de ratón usando la tecnología de las células madre embrionarias
convencional. Se aisló el locus genómico Shc a partir de una
colección de una colección genómica de ratón 129. Se caracterizó una
región genómica de 13 kb que contenía todos los exones que codifican
a Shc con un mapa mediante enzimas de restricción y secuenciación
nucleotídica de todas los límites exón-intrón y
regiones reguladoras 5' (fig. 6). Se aplicó una estrategia de
selección positiva (G418/Ganciclovir) para introducir una mutación
en la región del primer codón codificador que contiene el ATG de
p66. Para construir el vector dirigido (pBSp66ShcKO, fig. 7) usamos
el fragmento EcoR1 de 8 kb que contiene los exones
1-8 (fig. 7). El fragmento Bal1 que contiene el
sitio de inicio específico de p66 (fig. 7) se sustituyó con la
unidad transcripcional Neo bajo el control del promotor pY. Los
vectores resultantes contienen las secuencias flanqueantes de 2,2 y
4,6 kb de los extremos 5' y 3', respectivamente (fig. 7). En su
extremo 3' se clonó una unidad transcripcional TK (fig. 3).
Se transfectaron por electroporación las células
CJ7 ES, facilitadas por el Dr. Vera Soares (Memorial Sloan Kettering
Cancer Center, NY, EE.UU.), y se seleccionaron las colonias
resistentes y se examinaron mediante un análisis de tipo Southern
para comprobar la existencia de la deleción de la primera secuencia
codificadora de p66. La estrategia de selección se basó en el sitio
EcoR1 introducido en el alelo diana mediante la inserción de la
unidad transcripcional Neo (fig. 7). 24 clones ES de los 150
analizados mostraron un alelo Shc diana. El análisis citogenético de
9 clones reveló un número modal normal de cromosomas.
Se inyectaron dos clones ES en blastocistos
C57BL/6J, según con los procedimientos establecidos. El cruce de los
heterocigotos (p66^{shc}+/-) produjo la frecuencia esperada de
animales homocigotos. El análisis del genotipo de los animales se
realizó mediante un análisis tipo Southern del ADN extraído de las
colas y se confirmó mediante un ensayo de inmunotransferencia tipo
Western de la expresión de p66^{shc} en varios tejidos.
Puesto que Fos se activa transcripcionalmente por
una variedad de tipos de estrés medioambiental (peróxido de
hidrógeno: H_{2}O_{2}); radiación ultravioleta: UV), los
presentes inventores han analizado las modificaciones de p66 de
ratón y de fibroblastos humanos bajo el estímulo de H_{2}O_{2} y
la luz UV. Los resultados revelaron que p66 está notablemente
fosforilado en la serina en condiciones de H_{2}O_{2}/radiación
UV. Además, los presentes inventores han trazado el mapa y el
principal sitio de fosforilación de serina es la Ser 36. Un mutante
p66 Ser-Ala36 no se fosforila in vivo en
condiciones de H_{2}O_{2}/radiación UV.
Usando enzimas purificados para ensayos in
vitro y otras quinasas negativas dominantes o inhibidores
específicos in vivo, los presentes inventores han demostrado
que p38 y Erk1 fosforilan a p66 bajo la inducción de
H_{2}O_{2}/radiación UV.
Erk1 (también conocido como MAPK), JNK y p38 son
quinasas inducidas por estrés. Para identificar las quinasas
responsables de la fosforilación de p66 inducida por estrés
oxidativo in vivo, los presentes inventores analizaron el
grado de fosforilación de p66 tras señales de estrés en MEFs que
expresaban una quinasa negativa dominante JNK o en células tratadas
con varios inhibidores específicos de MAPK y p38 [PD98059, que
impide la activación de Erk1 por Raf; SB203580 que inhibe
específicamente a las Map quinasas de p38]. Los resultados
demostraron que SB203580 y PD98059, pero no la quinasa negativa
dominante JNK, impidieron la fosforilación de p66 inducida por
señales estrés oxidativo (H_{2}O_{2}), lo que indica que Erk1 y
p38 fosforilan in vivo a p66, pero no así JNK.
Los presentes inventores reconstruyeron entonces
in vitro la fosforilación de p66 usando Erk1 o JNK
recombinantes y la región CH2 de p66 expresada en bacterias (CH2 se
expresó en bacterias como proteína de fusión a GST). Erk1, pero no
JNK, fue incapaz de fosforilar in vitro a la región CH2 de
p66. La fosforilación fue específica, como se muestra en el hecho de
que, del mismo modo, Erk1 fue incapaz de fosforilar la región CH2 de
p66 cuando se introdujo la mutación S36A.
El tratamiento con H_{2}O_{2} induce la
muerte celular en fibroblastos. Los presentes inventores han
demostrado que: i) sobreexpresión de p66 en el fenotipo silvestre.
MEFs aumenta la muerte celular inducida por H_{2}O_{2}; ii)
MEFs
p66-/- son más resistentes a la muerte celular inducida por H_{2}O_{2} que los controles silvestres in vivo. El paraquat es un pesticida que mata a los ratones induciendo lesiones oxidativas. Los presentes inventores han demostrado además que los ratones p66 -/- son más resistentes al tratamiento con paraquat que el resto de la camada.
p66-/- son más resistentes a la muerte celular inducida por H_{2}O_{2} que los controles silvestres in vivo. El paraquat es un pesticida que mata a los ratones induciendo lesiones oxidativas. Los presentes inventores han demostrado además que los ratones p66 -/- son más resistentes al tratamiento con paraquat que el resto de la camada.
Puesto que el estrés medioambiental activa las
vías de señalización de p16-p53-p21,
los presentes inventores han investigado adicionalmente si p66
interfiere con la activación de
p16-p53-p21 inducida por
H_{2}O_{2}. Los resultados revelaron que la activación de p16,
p53 y p21 se ha perdido en las células p66 -/- después del
tratamiento con H_{2}O_{2}.
In vitro, el efecto estimulador de p66
sobre la vía de p53-p21 sugiere que podría
desempeñar un papel importante en la respuesta celular al estímulo
oncogénico. Por lo tanto, los presentes inventores han evaluado los
efectos de p66 sobre la respuesta de fibroblastos primarios en el
mutante RASV12 oncogénico. RASV12 induce senescencia en MEFs
silvestres, como consecuencia de la activación de
p53-921. La expresión de RASV12 en MEFs p66-/-
indujo una transformación celular. Además los presentes inventores
han demostrado que p53 y p16 son incapaces de inducir senescencia en
fibroblastos de ratón p66-/-.
Los resultados presentados en la presente
invención demuestran que p66 está implicada en la respuesta celular
al estrés (medioambiental y oncogénico). Los presentes inventores
consideraron por lo tanto si p66 también estaba implicado en la
mediación del envejecimiento. Para hacer esto, evaluaron la
supervivencia de ratones p66-/-. De los muchos ratones que nacieron
en agosto de 1996, 14 +/+, 8 +/- y 15 -/- no fueron sacrificados y
se mantuvieron para proceder al análisis de supervivencia. La
evaluación tras 28 meses (diciembre de 1998) reveló:
| +/+ | 0/14 supervivientes, 0% |
| +/- | 3/8 supervivientes, 37% |
| -/- | 11/15 supervivientes, 73% |
Para analizar los mecanismos moleculares
subyacentes al aumento de resistencia de los MEFs p66 -/- a la
apoptosis inducida por estrés oxidativo, los presentes inventores
analizaron la función de p53 en MEFs p66 -/- (frente a los MEFs
silvestres) tras el tratamiento con H_{2}O_{2}.
p53 es un gen supresor de tumores que funciona
como un factor transcripcional. p53 es también un componente crítico
de los mecanismos celulares que responden a una variedad de
distintos tipos de estrés medioambiental, incluyendo lesiones del
ADN, hipoxia o estrés oxidativo, y que conduce a la detención del
ciclo celular o la apoptosis. La activación de p53 inducida por
estrés implica una estabilidad proteica mayor y modificaciones
postraduccionales incluyendo la fosforilación y la acetilación.
El tratamiento con H_{2}O_{2} indujo una
regulación al alza de p53 en MEFs silvestres como p66 -/-, lo que
implica que los mecanismos que subyacen a la estabilidad
incrementada de p53 debida al estrés oxidativo no está afectada por
la expresión de p66. Sin embargo, la sobreexpresión de p53 (usando
retrovirus o adenovirus) en MEFS p66 -/- fue incapaz de inducir
apoptosis, lo que indica que la vía final o posterior de p53 se ve
alterada en ausencia de p66.
Para comprender los mecanismos que subyacen en la
pérdida de actividad de p53 en las células p66 -/-, los inventores
midieron el potencial de p53 de actuar como factor transcripcional
en células p66-/-. Con este fin, realizaron experimentos de
activación trans usando p53 y un promotor de p53 en MEFs p66-/- y
silvestres. Los datos mostraron que en los p66-/- se mantiene la
actividad transcripcional de p53. Este descubrimiento sugiere que la
incapacidad de p53 de ejecutar el proceso apoptótico en los MEFs
p66-/- podría estar debida a alteraciones de la actividad (alguna)
de los genes diana de p53.
Se sabe poco de los genes diana de p53 que están
implicados en la ejecución de muchas actividades biológicas de p53
(apoptosis, senescencia, detención del ciclo celular). En el caso de
la apoptosis, recientemente se ha demostrado que p53 activa un
conjunto de genes (llamados PIGs, genes inducibles por p53) que
están implicados en el control del metabolismo de las ROS. De hecho,
la activación de p53 tiene como resultado la activación
transcripcional de estos genes, aumento de las concentraciones de
ROS, activación de caspasas y apoptosis.
Para probar si esta vía intracelular está
alterada en los MEFs p66-/-, lo inventores midieron las
concentraciones intracelulares de ROS en MEFs p66-/- y silvestres la
sobreexpresión de p53 (usando tinciones fluorescentes, como DCFDA).
Los resultados mostraron que el pico de ROS intracelulares inducido
por p53 tras la expresión de p53 se pierde en los MEFs p66-/-.
En conjunto, estos resultados indican que p66
regula el metabolismo de las ROS y es un efector crucial de la
apoptosis mediada por p53.
p53 regula una respuesta de punto de control a
las señales oncogénicas: la expresión de mutantes oncogénicos de Ras
en células primarias activa p53, dando como resultado una
senescencia prematura, mientras que la ausencia de una versión
funcional de p53 es suficiente para la transformación oncogénica de
fibroblastos murinos. p53, de hecho, muta con una alta frecuencia en
muchos tipos de tumores, lo que implica que su acción es central en
el desarrollo tumoral. Los mecanismos a través de los cuales la
célula percibe la hiperproliferación y que conduce a la activación
de p53 y a la senescencia cellar sin embargo, sigue sin comprenderse
muy bien. Recientemente se ha demostrado que la senescencia inducida
por Ras implicaba la generación de ROS, lo que implica que las ROS
también están implicado en la ejecución del programa de senescencia
mediante p53.
Por lo tanto, los inventores han analizado si Ras
es capaz de inducir senescencia celular en MEFs p66-/-. Los
resultados mostraron que los MEFs p66-/- eran resistentes a la
senescencia inducida por Ras, lo que sugiere que los mecanismos
intracelulares que regulan la respuesta a las señales oncogénicas
está alterada en las células p66-/-.
Para investigar si los MEFs p66-/- son más
susceptibles a la formación tumoral, los presentes inventores
analizaron la capacidad de los MEFs p66-/- de expresar Ras para
formar colonias en metilcelulosa (una propiedad de las células
transformadas), en comparación con los MEFS p53-/-. Si bien la
expresión de Ras indujo la transformación de los MEFs p53-/-, fue
incapaz de hacerlo en los MEFs p66-/-. De modo similar, los ratones
p66-/- no mostraron un aumento en la frecuencia de tumoración
espontánea inducida por luz UV (o TPA).
Los inventores concluyen que la expresión de p66
es indispensable para la capacidad de p53 de inducir apoptosis (tras
un estrés oxidativo) o senescencia (tras la expresión de Ras). Sin
embargo, la pérdida de p66 no mimetiza la pérdida de p53 en lo que
respecta al fenotipo de propensión al desarrollo de tumores, lo que
sugiere que hay otras vías activadas mediadas por las señales
oncogénicas que siguen a p53.
p66 es un objetivo posterior de p53 en la
ejecución de la apoptosis y senescencia celular mediada por p53. Se
pueden usar manipulaciones de p66, por lo tanto, para restaurar la
función en células in p53. Una aplicación potencial de este
descubrimiento es la posibilidad de activar las vías apoptóticas y
de senescencia en tumores con una versión de p53 no funcional (las
vías p19-p53 no son funcionales en la gran mayoría
de tumores). Se puede uno imaginar a los agonistas de p66 como
teóricos supresores de tumores. Cualquier molécula que impida la
desfosforilación de p66 o de las quinasas que inducen la
fosforilación de p66 son dispositivos potenciales para el
tratamiento tumoral.
Los resultados antes mencionados sugieren que p66
está implicado en la regulación del metabolismo de las ROS. Por lo
tanto los inventores han medido las concentraciones intracelulares
de ROS en cultivos de MEFS silvestres y p66-/- (usando tinciones
fluorescentes, como DCFDA). Los resultados mostraron que la
concentración intracelular de ROS está consecuentemente disminuida
en MEFS p66-/- (un tercio aproximadamente).
Se ha implicado al estrés oxidativo en la
generación de muchas enfermedades humanas. Las ROS inducen lesiones
en una variedad de macromoléculas, como las proteínas (formación de
puentes disulfuro); lípidos (peroxidación); ADN (mutaciones). Se
cree que estas alteraciones median los rasgos fenotípicos del
envejecimiento y que están implicados en la patogénesis de
diferentes enfermedades (aterosclerosis, enfermedad cardiaca
isquémica; Parkinson, Alzheimer, complicaciones vasculares de la
diabetes). Los inhibidores de la función de p66 se podrían emplear
en el tratamiento de estas enfermedades.
Los presentes inventores han investigado los
mecanismos que subyacen a la regulación de la producción de ROS por
p66. Las ROS se producen principalmente en la mitocondria, como
consecuencia del mínimo, aunque fisiológico, desacople de la
transferencia de electrones durante la fosforilación oxidativa. Por
lo tanto, los inventores han evaluado primero si p66 es una proteína
mitocondrial. La microscopía electrónica, la inmunofluorescencia y
los estudios de fraccionamiento celular (usando anticuerpos
policlonales y monoclonales específicos anti-p66)
revelaron que p66 es una proteína mitocondrial, localizada en la
membrana interna de la mitocondria.
Para valorar si la diferente supervivencia en
respuesta al tratamiento con H_{2}O_{2} también se refleja en
una respuesta mitocondrial diferente, los inventores probaron la
funcionalidad de la mitocondria en MEFS silvestres y p66-/- des el
tratamiento con H_{2}O_{2}.
El potencial eléctrico mitocondrial
(m\Delta\Psi) es una medida directa del gradiente electroquímico
desarrollado por la actividad de los complejos de la cadena de
transferencia de electrones y el resultante bombeo de protones. Se
medio por lo tanto (m\Delta\Psi) como indicador de la actividad
mitocondrial tras el tratamiento con H_{2}O_{2}, usando éster
metílico de tetrametilrodamina (TMRM). El TMRM es una sonda
fluorescente catiónica lipófila que se acumula en la mitocondria
según la ecuación de Nerst. Cuanto mayor sea el m\Delta\Psi
mayor es la señal que resulta de la fluorescencia del TRMRM,
permitiendo de este modo determinar las variaciones de
m\Delta\Psi en los sistemas de cultivo celular.
Los inventores descubrieron que la reducción del
m\Delta\Psi después de 10 minutos de la adición de
H_{2}O_{2} 200 \muM es aproximadamente del 50% en los MEFs
silvestres y de sólo el 20% en los MEFs p66-/-. Este resultado
indica que en los p66-/- las mitocondrias están menos dañadas por
el H_{2}O_{2} que las de las células silvestres.
Para determinar si el rendimiento respiratorio
mitocondrial se altera en ausencia de la proteína p66, se analizaron
mitocondrias purificadas de hígados de ratones silvestres y p66-/-
para comprobar su actividad respiratoria. La cuantificación in
vitro del consumo de oxígeno de las suspensiones mitocondriales
se realiza usando un electrodo sensible al oxígeno. Los inventores
midieron tanto la respiración basal como la estimulada tras la
administración de ADP, succinato, aspartato, malato, dinitrofenol y
calcularon el coeficiente estado 3/estado 4 de las mitocondrias
silvestres y p66-/-. Los inventores descubrieron coherentemente
mayores valores de este coeficiente en el caso de las p66-/- en
comparación con las mitocondrias silvestres. Estos descubrimientos
sugieren que las mitocondrias extraídas de hígados p66-/- están en
un mejor "estado acoplado".
Las mitocondrias de mamífero poseen un canal en
la membrana interna, el poro de transición de permeabilidad (MTP).
La apertura del MTP es la responsable de la transición de
permeabilidad (PT), un aumento repentino de la permeabilidad frente
a solutos con pesos moleculares de aproximadamente 1500 Da (obtenido
experimentalmente tras la acumulación de Ca^{2+} en presencia de
una variedad de los llamados "agentes inductores"). La PT es el
primer suceso de la apoptosis y junto con la despolarización
mitocondrial, representa el "ejecutor central") de la cascada
apoptótica. La PT tiene como resultado una modificación del volumen
mitocondrial y un consecuente hinchamiento del orgánulo.
Es posible analizar la probabilidad relativa de
apertura de los MTP y la PT resultante midiendo la variación de la
absorbancia del hinchado usando un espectrofotómetro a 540 nm de
longitud de onda. Los inventores analizaron la respuesta al
"hinchamiento" de mitocondrias aisladas de hígado a partir de
ratones silvestres y p66-/- tras diferentes estímulos de la PT. En
las mitocondrias p66-/- se detectó una alteración o retraso del
hinchamiento tras el tratamiento con H_{2}O_{2} 100 \muM. Este
descubrimiento indica que el MTP en la mitocondria p66-/- es menos
sensible a la oxidación y su consecuente apertura inducida por
H_{2}O_{2} sugiere que la regulación de la apertura de los MTP
es uno de los sucesos controlados por p66 en la mitocondria. Por lo
tanto, p66, funcionaría favoreciendo la apertura del poro,
determinándose así un mitocondria desacoplada más frágil Esto
tendría como resultado un rendimiento respiratorio menos eficaz, una
producción más activa de ROS y una mejor respuesta apoptótica al
estrés oxidativo.
Ya que p66 controla la función del poro de
permeabilidad en las mitocondrias e, indirectamente, la eficacia de
la transferencia de electrones y la producción de ROS, se espera que
las alteraciones de la función de p66 permitan la manipulación del
metabolismo y la apoptosis.
Todos los niveles de organización de un
organismo, desde las moléculas hasta los sistemas orgánicos
completos, sufren senescencia y un gran número de evidencias indican
que los radicales libres son la causa principal de este fenómeno. El
envejecimiento inducido por el estrés oxidativo resultante es un
proceso que está estrictamente asociado con la disminución de las
capacidades funcionales de todas las partes del cuerpo e incluso si
no define claramente las causas de muerte que tienen lugar al final
del periodo de vida de un organismo, generalmente se carga a este
síndrome senil degenerativo.
Algunos estudios sugieren que el fallo renal o
hepático son las causas más comunes de muerte en edades muy
avanzadas en humanos y en otros mamíferos pero además disfunciones
en otros órganos debido a que el envejecimiento contribuye al final
significativamente a la muerte.
En particular, en el pulmón, la relación
volumen/peso del parénquima pulmonar seco hinchado aumenta
significativamente con la edad dando como resultado el llamado
"enfisema pulmonar asociado al envejecimiento" o "enfisema
senil". La muerte celular programada inducida por el estrés
oxidativo acumulado durante el envejecimiento puede contribuir al
adelgazamiento de los septos alveolares que se observa con la edad.
El análisis de pulmones de ratones ancianos (más de un año) p66-/- y
silvestres reveló que el peso y el tamaño de los pulmones de los
p66-/- era mayor que el de los ratones silvestres. Los análisis
histológicos de estos pulmones muestran que hay una patrón general
de mayor densidad celular y en particular unas paredes alveolares
más delgadas en el pulmón de los ratones p66-/-.
Los presentes inventores, por lo tanto han
concluido que el adelgazamiento retardado de las paredes alveolares
y la consecuente aparición temprana de signos de enfisema senil en
ratones silvestres podría sugerir una posible explicación
mecanística que se puede extender a todos los órganos, para la
prolongada vida observada en ausencia de p66.
Independientemente de la contribución del
enfisema senil retardado a la mayor longevidad de los ratones
p66-/-, estos descubrimientos indican que el pulmón es un órgano
diana de las funciones de p66. La inhibición de la función de p66 en
el pulmón, puede por lo tanto conducir al aumento de funcionalidad
del pulmón y proporcionar nuevos tratamientos para el enfisema.
Para investigar su papel en la repuesta celular
al estrés, los presentes inventores analizaron el grado de
fosforilación en las tirosinas de p66^{shc} en fibroblastos
embrionarios de ratón (MEFs) tratados con luz UV o H_{2}O_{2} en
comparación con los efectos del tratamiento con factores de
crecimiento, como el factor de crecimiento epidérmico (EGF). Los
inmunoprecipitados anti-p66 de lisados de
fibroblastos sin tratar y estimulados con EGF, luz UV o
H_{2}O_{2} se revelaron con anticuerpos antifosfotirosina. La
estimulación con EGF indujo un notable aumento del contenido de
fosfotirosina de p66^{shc}, que fue máximo tras 5 minutos. Ni el
tratamiento con luz UV, ni con H_{2}O_{2} indujo una
fosforilación en las tirosinas de p66^{shc} significativa (fig.
1B). Sin embargo, la inmunotransferencia tipo Western de los mismos
lisados con anticuerpos anti-Shc reveló un notable
retardo en el gel de los polipéptidos p66^{shc} tras un
tratamiento de 5 minutos y 4 horas con luz UV y H_{2}O_{2},
coherente con otras modificaciones postraduccionales de p66^{shc}
inducidas por estos agentes (fig. 1C). Por lo tanto, se analizó la
fosforilación de p66^{shc} por análisis de fosfoaminoácidos (fig.
2C). Los polipéptidos p66^{shc} de células sin suero estaban
fosforilados principalmente en las serinas. La luz UV (fig. 2C) y el
H_{2}O_{2} (no mostrado) indujeron un notable aumento del nivel
de fosfoserinas y no tuvo efecto sobre las fosfotirosinas. Por el
contrario, el EGF indujo un notable aumento del nivel de
fosfotirosinas y un modesto aumento de las fosfoserinas (fig. 2C).
Parece, por lo tanto, que p66^{shc} está implicado en las vías de
transducción intracelular tanto de estrés medioambiental como de
factores de crecimiento, aunque con distintas funciones, ya que la
luz UV o el H_{2}O_{2} indujeron una fosforilación en las
serinas rápida y permanente, mientras que el EGF indujo una
fosforilación en las tirosinas rápida y permanente.
Para investigar el papel funcional de p66^{shc}
en la respuesta al estrés oxidativo, los presentes inventores
analizaron después los efectos de la sobrexpresión de p66^{shc} o
de la ablación de p66^{shc} sobre la respuesta celular de MEFS
frente al H_{2}O_{2}. Los MEFs procedían de ratones que llevaban
una mutación dirigida del locus Shc que interrumpe el exón que
codifica la región CH2 de p66^{shc}, sin afectar a las secuencias
codificadoras p52^{shc/}p46^{shc} (M. Giogio y col.: pendiente
de publicación). Se usaron MEFs p66^{shc}+/+ procedentes de
ratones silvestres con un fondo genético idéntico como comparación.
Como se esperaba, la expresión de p66^{shc} fue normal en MEFs
p66^{shc}+/+ mientras que fue indetectable en MEFs p66^{shc}-/-;
la expresión de p52^{shc/}p46^{shc} fue idéntica en los MEFs
p66^{shc}-/- y los p66^{shc}+/+. Los MEFs p66^{shc}+/+ fueron
susceptibles al tratamiento con H_{2}O_{2}, muriendo más del 70%
de células tras 24 horas de la exposición a H_{2}O_{2} 400
\muM. La sobreexpresión de p66^{shc} volvió a los p66^{shc}+/+
más susceptibles al tratamiento con H_{2}O_{2} (aproximadamente
un 85-90% de muerte celular tras 24 horas). Por el
contrario, las células MEFs p66^{shc}-/- fueron más resistentes a
la muerte con la misma dosis de H_{2}O_{2} y más el 70% de estas
células sobrevivieron tras 24 horas de tratamiento con
H_{2}O_{2} (fig. 2B). La expresión del ADNc de p66^{shc} en
las células p66^{shc}-/- restauró la respuesta normal frente al
H_{2}O_{2} (fig. 2B).
Los presentes inventores examinaron entonces la
capacidad de las células de resistir al estrés oxidativo in
vivo. Con este fin, se trató a los ratones con paraquat, que
una vez en el interior por las células, genera un anión superóxido.
A una dosis de 70 mg/kg, 5 de 5 ratones p66^{shc}+/+ murieron en
un plazo de 48 horas tras la administración de paraquat. Por el
contrario de los 5 ratones p66^{shc}-/- tratados, dos murieron en
el plazo de 48 horas, dos después de aproximadamente 72 horas y 1
sobrevivió durante varias semanas (fig. 2C). Juntos, estos
resultados indican una función de p66^{shc} en la respuesta al
estrés oxidativo celular.
Para investigar si p66^{shc} participa en la
respuesta al estrés celular como un transductor citoplásmico de las
señales de estrés, los presentes inventores analizaron el potencial
de un mutante de p66^{shc} sin fosforilación en serinas para
rescatar la respuesta dañada de los MEFs p66^{shc}-/- al estrés.
La región CH2 de p66^{shc} probablemente contiene el principal
sitio de fosforilación en serinas de p66^{shc}, como se sugirió en
el cambio de movilidad electroforética en gel inducido por
H_{2}O_{2} y EGF, cuando se expresó CH2 como un dominio aislado
en células en cultivo (fig. 3A). La región CH2 contiene tres
residuos de serina con una secuencia consenso para la fosforilación
por una serina/treonina quinasa (S28, S36 y S54) (Davis, J. J. Biol.
Chem. 268, 14553-14556 (1993)). La sustitución por
alanina de S36 abolió el cambio de movilidad en gel tanto de la
región aislada CH2 como del p66^{shc} de longitud completa,
inducidos por H_{2}O_{2} (fig. 3B). Los análisis de
fosfoaminoácidos de los polipéptidos p66^{shc} y p66^{shc}S36A
reveló un notable aumentó del nivel de fosfoserina inducido por
H_{2}O_{2} en el p66^{shc} pero no en el mutante
p66^{shc}S36A (fig. 3C), confirmándose así que S36 es el principal
sitio de fosforilación de p66^{shc}.
Los presentes inventores expresaron entonces el
mutante p66^{shc}S36A en MEFs p66^{shc}-/- y evaluaron su efecto
en la respuesta al estrés oxidativo. Como se muestra en la figuran
2B, p66^{shc}S36A fue incapaz de restaurar una respuesta normal al
H_{2}O_{2}. En cambio, confirió una resistencia adicional a la
muerte celular inducida por H_{2}O_{2}, probablemente a través
de un efecto negativo dominante sobre la vía de señalización de la
respuesta al estrés. Juntos, estos resultados indican que
p66^{shc} actúa como un transductor de señales en la respuesta
celular frente al estrés oxidativo.
La resistencia potenciada al estrés
medioambiental está correlacionada con la longevidad prolongada en
los invertebrados. En S. cerevisiae las deleciones del locus
RAS1 (Sun, J. y col. J. Biol. Chem. 269,18638-18645
(1994); Kale, S. P. y col. Dev. Genet. 18,154-160
(1996)) o las mutaciones en el locus SIR4 (Kennedy, B. K. y col.
Cell 80,485-496 (1995)) aumentaron la longevidad y
la resistencia a la privación nutricional, al etanol y al choque
térmico o a la luz UV, respectivamente. En C. elegans, los
mutantes de los genes de la vía de señalización de Dauer, como
age-1 y daf-2, sobreviven más tiempo
y son más resistentes a los radicales de oxígeno, al calor y a la
luz UV (Murakami, S. y col. Genetics, 143,1207-1218
(1985); Larsen, P. L. y col. Genetics 139,1576-1583
(1995)). En D. melanogaster, la selección de los individuos
mejor adaptados tardía está asociada con una mayor resistencia al
estrés medioambiental (Service, P. M. y col. Physiol, Zool.
58,380-389 (1985); Service P. M. Physiol Zool.
60,321-326 (1987); Arking R. y col. Dev. Genet. 12
362-370 (1991)), y los mutantes hipomórficos del
locus mth viven un 35% más y son más resistentes al paraquat añadido
a la alimentación y a la privación nutricional (Lin, Y. J. y col.
Science 282, (1998). Los presentes inventores, por lo tanto,
analizaron retrospectivamente los efectos de la mutación p66^{shc}
en la longevidad. No se sacrificaron a 37 ratones nacidos en agosto
de 1997 de parentales heterocigotos p66^{shc}+/- y se mantuvieron
bajo idénticas condiciones de estabilidad. Estuvieron compuestos por
14 p66^{shc}+/+, 8 p66^{shc}+/- y 15 p66^{shc}-/-. Tras 28
días de observación, todos los animales de tipo silvestre habían
muerto (mediana de supervivencia de 25,37\pm0,63) mientras que 3
de los 8 heterocigotos (37%) y 11 de los 15 homocigotos (73%) aún
vivían. Los 3 p66^{shc}+/- restantes murieron dos meses después
(mediana de supervivencia de 27,40\pm2,819). Los 3 ratones
p66^{shc}-/- también murieron a los dos meses; los 9 restantes aún
seguían vivos (longevidad de más de 31 meses). La comparación de las
curvas de supervivencia obtenidas por el método de Kaplan y Meier
(Marubinii, E. y col. Valsecchi, M. G. New York, John Wiley e hijos
(1995)) (fig. 4) mostró una diferencia altamente significativa entre
los tres grupos (log-rango p= 0,0002). La
supervivencia acumulada no difirió significativamente entre el
silvestre y el heterocigoto (p= ns [0,057]). La supervivencia
acumulada en el grupo p66^{shc}+/+ fue de 71,4% (p<0,01 frente
a p66^{shc}+/- y p66^{shc}+/+). Por lo tanto, parece que la
mutación en homocigosis de p66^{shc} está correlacionada con la
supervivencia prolongada en ratones.
Los resultados que se presentan en esta memoria
descriptiva con consecuentes con un modelo en el que la longevidad
viene determinada por el resultado de la capacidad incrementada de
resistir o reparar el daño provocado por el medioambiente.
p66^{shc} es parte de una vía de transducción de señales, que se
activa por el estrés medioambiental (H_{2}O_{2} o luz UV) y cuya
mutación aumenta la resistencia al estrés y la longevidad. La
investigación bioquímica y genética de la vía de señalización de
p66^{shc} debería conducir a una mejor comprensión de los
mecanismos que intervienen en la longevidad en mamíferos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Cancer Research Venures Limited
\hskip1cmPelicci, Pier G
\hskip1cmGiorigio, Marco
\hskip1cmLanfraconte, Luisa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Materiales y métodos relacionados con
la modulación de la expresión de p66
\vskip0.400000\baselineskip
<130> JEC/BP5846738
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/GB00/01079
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-03-22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 9906515.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
199-03-22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3664
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 583
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (19)
1. Molécula de ácido nucleico que comprende una
secuencia codificadora de p66^{shc}, estando compuesta la
secuencia codificadora por la secuencia codificadora de la figura 5
que incorpora una mutación tal que, en la proteína codificada por la
secuencia codificadora, está ausente el residuo S36 o está
reemplazado por un residuo aminoacídico diferente.
2. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 1 en la que S36 se reemplaza por alanina
(p66^{shc}S36A).
3. Polipéptido codificado por una molécula de
ácido nucleico según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
4. Vector de replicación que comprende el ácido
nucleico según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 enlazado
operativamente a las secuencias control para dirigir su
expresión.
5. Células huésped transformada con un vector
según la reivindicación 4.
6. Procedimiento para producir un polipéptido
p66^{shc} modificado que comprende una célula huésped según la
reivindicación 5 de modo que produzca el polipéptido
p66^{shc}.
7. Procedimiento para producir una molécula de
ácido nucleico modificada que comprende una secuencia codificadora
de p66^{shc}, comprendiendo el procedimiento la modificación de la
secuencia codificadora de la figura 5 de modo que, en la proteína
codificada por la secuencia codificadora, el residuo S36 de la
proteína codificada por la secuencia codificadora de la figura 5
esté ausente o reemplazado por un residuo aminoacídico
diferente.
8. Procedimiento para producir un polipéptido
p66^{shc} modificado, que comprende la modificación de una
secuencia aminoacídica como se describe en la reivindicación 7 y la
expresión del ácido nucleico modificado en la célula huésped.
9. Procedimiento in vitro para interrumpir
la vía de transducción de señales de p66^{shc} en una célula que
comprende el poner en contacto dicha célula con una molécula de
ácido nucleico capaz de hibridar con el ácido nucleico que codifica
a p66^{shc} evitando por lo tanto la expresión de dicho
p66^{shc}.
10. Procedimiento in vitro para
incrementar la resistencia de las células frente al estrés oxidativo
que comprende a etapa de interrumpir la vía de señalización de
p66^{shc}.
11. Procedimiento in vitro según la
reivindicación 10 en la que dicha etapa de interrupción de
p66^{shc} afecta a la susceptibilidad de p66^{shc} de ser
fosforilado.
12. Procedimiento in vitro según la
reivindicación 10 o la reivindicación 11 en la que dicha etapa de
interrupción de la vía de p66^{shc} provoca que se exprese un
polipéptido p66^{shc} mutante de modo que el residuo S36 de la
proteína codificada por la secuencia de la figura 5 esté ausente o
reemplazado por un residuo aminoacídico diferente.
13. Procedimiento in vitro según la
reivindicación 12 en el que el residuo que corresponde a S36 está
reemplazado por alanina.
14. Procedimiento in vitro para
incrementar la resistencia de las células frente al estrés oxidativo
que comprende la etapa de interrumpir la vía de señalización de
p66^{shc} poniendo en contacto la célula con un anticuerpo capaz
de unirse específicamente al polipéptido p66^{shc} de modo que se
evita la posterior unión de p66^{shc} a otras proteínas.
15. Procedimiento in vitro para
incrementar la resistencia de las células frente al estrés oxidativo
que comprende la etapa de interrumpir la vía de señalización de
p66^{shc} poniendo en contacto la célula con un oligonucleótido
antisentido capaz de hibridar con el ácido nucleico que codifica al
polipéptido p66^{shc}.
16. Uso de un oligonucleótido antisentido capaz
de hibridar específicamente con el ácido nucleico de p66^{shc} en
la preparación de un medicamento para incrementar la resistencia de
las células al estrés oxidativo.
17. Uso según la reivindicación 16 en el que la
secuencia de ácido nucleico de p66^{shc} se muestra en la figura
5.
18. Uso de un anticuerpo capaz de unirse
específicamente al polipéptido p66^{shc} o a un fragmento suyo en
la preparación de un medicamento para incrementar la resistencia de
las células al estrés oxidativo.
19. Uso de un vector que comprende el ácido
nucleico que codifica el polipéptido p66^{shc} en la preparación
de un medicamento para incrementar la resistencia a la formación de
tumores en un tejido, siendo dicho vector capaz de incorporar dicho
ácido nucleico al genoma de las células del tejido.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9906515 | 1999-03-22 | ||
| GBGB9906515.3A GB9906515D0 (en) | 1999-03-22 | 1999-03-22 | Materials and methods relating to the effects oF P66 expression |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2243237T3 true ES2243237T3 (es) | 2005-12-01 |
Family
ID=10850083
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00911131T Expired - Lifetime ES2243237T3 (es) | 1999-03-22 | 2000-03-22 | Material y metodos relacionados con la modulacion de la expresion de p66. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1163335B1 (es) |
| JP (1) | JP2002539789A (es) |
| AT (1) | ATE296352T1 (es) |
| AU (1) | AU778301B2 (es) |
| CA (1) | CA2367464A1 (es) |
| DE (1) | DE60020348T2 (es) |
| DK (1) | DK1163335T3 (es) |
| ES (1) | ES2243237T3 (es) |
| GB (1) | GB9906515D0 (es) |
| WO (1) | WO2000056886A1 (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1654377A4 (en) * | 2002-03-01 | 2010-03-24 | Roger Williams Hospital | PROCESSES AND COMPOSITIONS RELATED TO THE SHC PROTEIN FOR THE PROGNOSIS OF BREAST, PROSTATE AND EGG CANCER |
| GB0722759D0 (en) * | 2007-11-20 | 2008-01-02 | Congenia S R L | Antisense oligonucleotides for the modulation of gene expression and methods relating to the use thereof |
| US20140179774A1 (en) * | 2012-12-26 | 2014-06-26 | Industrial Technology Research Institute | Methods for inhibition of shc-1/p66 to combat aging-related diseases |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5744313A (en) * | 1994-12-09 | 1998-04-28 | The Regents Of The University Of California | Assay employing novel protein domain which binds tyrosine phosphorylated proteins |
-
1999
- 1999-03-22 GB GBGB9906515.3A patent/GB9906515D0/en not_active Ceased
-
2000
- 2000-03-22 WO PCT/GB2000/001079 patent/WO2000056886A1/en not_active Ceased
- 2000-03-22 AU AU33124/00A patent/AU778301B2/en not_active Ceased
- 2000-03-22 DK DK00911131T patent/DK1163335T3/da active
- 2000-03-22 CA CA002367464A patent/CA2367464A1/en not_active Abandoned
- 2000-03-22 EP EP00911131A patent/EP1163335B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-22 JP JP2000606745A patent/JP2002539789A/ja active Pending
- 2000-03-22 ES ES00911131T patent/ES2243237T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-22 AT AT00911131T patent/ATE296352T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-03-22 DE DE60020348T patent/DE60020348T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2002539789A (ja) | 2002-11-26 |
| EP1163335A1 (en) | 2001-12-19 |
| GB9906515D0 (en) | 1999-05-19 |
| DE60020348T2 (de) | 2006-02-02 |
| CA2367464A1 (en) | 2000-09-28 |
| DK1163335T3 (da) | 2005-09-19 |
| ATE296352T1 (de) | 2005-06-15 |
| AU778301B2 (en) | 2004-11-25 |
| DE60020348D1 (de) | 2005-06-30 |
| EP1163335B1 (en) | 2005-05-25 |
| AU3312400A (en) | 2000-10-09 |
| WO2000056886A1 (en) | 2000-09-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Montcouquiol et al. | Asymmetric localization of Vangl2 and Fz3 indicate novel mechanisms for planar cell polarity in mammals | |
| ES2311734T3 (es) | Proteinas tau truncadas. | |
| CN100381570C (zh) | 滑膜细胞蛋白质 | |
| US8513181B2 (en) | Substances and compositions for enhancing DNA repair and methods of use | |
| Teng et al. | Strain-dependent perinatal lethality of Ovol1-deficient mice and identification of Ovol2 as a downstream target of Ovol1 in skin epidermis | |
| Dominguez et al. | Protein kinase CK2 is required for dorsal axis formation in Xenopus embryos | |
| CA2375106A1 (en) | Compositions and methods for the therapeutic use of an atonal-associated sequence for deafness, osteoarthritis, and abnormal cell proliferation | |
| Danno et al. | PKN2 is essential for mouse embryonic development and proliferation of mouse fibroblasts | |
| Pacal et al. | Insights from animal models on the origins and progression of retinoblastoma | |
| ES2243237T3 (es) | Material y metodos relacionados con la modulacion de la expresion de p66. | |
| US20130097718A1 (en) | Chd5 is a novel tumor suppressor gene | |
| US20030041341A1 (en) | Non-human transgenic animal whose germ cells and somatic cells contain a knockout mutation in DNA encoding 4E-BP1 | |
| US7723564B2 (en) | Compositions and methods for modulation of KSR1 and KSR2 interactions | |
| AU5781099A (en) | Lats knock-out animal models and their uses | |
| JP2009513153A (ja) | 末端酸化酵素及びその使用 | |
| JP2009513153A5 (es) | ||
| ES2355490T3 (es) | Composiciones y métodos para la utilización terapéutica de una secuencia asociada con el gen atonal. | |
| Wynder | ZIPRO1: Fine Tuning Proliferation in Discrete Cell Populations | |
| US20050042671A1 (en) | Modulation of angiogenesis | |
| Firestein | Molecular and genetic characterization of the roles of the Sbf1 pseudo-phosphatase in growth control and development | |
| Biswas | Shark tyrosine kinase-interacting proteins in Drosophila embryonic development | |
| Ferreira | Dissecting the Role of Clasp1 in the Mammalian Development | |
| Kasper | Simian virus 40 large T antigen inactivates CUL7, a p53-interacting cullin | |
| Brunet | The role of T-cell protein tyrosine phosphatase (TC-PTP) in the nucleus | |
| Dai | Role of the Mouse Pygopus 2 Gene and Wnt Signaling in Normal and Malignant Development of Mammary Glands and Hair Follicles |