ES2243246T3 - Composiciones farmaceuticas para la terapia de la insuficiencia cardiaca. - Google Patents
Composiciones farmaceuticas para la terapia de la insuficiencia cardiaca.Info
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Abstract
Medicamento para el tratamiento de cardiopatías del grupo compuesto por cardiomiopatías primarias y cardiomiopatías secundarias, caracterizado porque contiene la o las secuencias de ácidos nucleicos que codifican una o múltiples proteínas S100 del grupo compuesto por S100A1, S100A2, S100A3, S100A4, S100A5, S100A6, S100A7, S100A8, S100A9, S100A10, S100A11, S100A12 y S100A13, uno o múltiples mutantes de las mismas, con una homología con respecto a ellas de al menos 60%, que aumentan la liberación de Ca2+ sistólica desde el retículo sarcoplásmico y aceleran la reabsorción de Ca2+ en el retículo sarcoplásmico, o que codifican uno o múltiples péptidos hidrófobos del grupo compuesto por péptidos según SEQ ID NO: 36 y 39, en el que la o las secuencias de ácidos nucleicos están formuladas, eventualmente, con coadyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Description
Composiciones farmacéuticas para la terapia de la
insuficiencia cardiaca.
La presente invención se refiere a medicamentos
para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca, que contienen una
cantidad terapéuticamente eficaz de una o múltiples proteínas S100,
uno o múltiples mutantes o fragmentos de las mismas, o de la o las
secuencias de ácidos nucleicos que codifican estas secuencias de
aminoácidos, eventualmente integrados en uno o múltiples vectores de
transferencia de genes.
Los medicamentos para el tratamiento de la
insuficiencia cardiaca mediante el empleo de, por ejemplo, un factor
de crecimiento de fibroblastos, son conocidos en el estado de la
técnica. Véase el documento WO 98/50079.
Las modificaciones de la homeostasia del
Ca^{2+} intracelular desempeñan, en el marco del plano molecular
de la insuficiencia cardiaca un papel fisiopatológico fundamental.
Gwathmey et al (1) fueron los primeros en demostrar
transientes prolongados de Ca^{2+} intracelular en preparaciones
de músculo cardiaco en contracción procedentes de pacientes con
insuficiencia cardiaca terminal. Ante el nivel de Ca^{2+}
diastólico elevado y los picos de Ca^{2+} sistólicos disminuidos
(2), este hallazgo se interpretó como indicativo de una disfunción
del retículo sarcoplásmico (abreviado en lo sucesivo como SR), que
se correlaciona en el plano hemodinámico con una relación inversa de
fuerza del músculo cardiaco miopático (3).
En este caso, es de especial importancia la
reabsorción reducida de Ca^{2+} en el SR durante la diástole a
través de la Ca^{2}-ATPasa (bomba de Ca^{2+} del
SR, que bombea el Ca^{2+} desde el citosol hacia el SR contra un
gradiente de concentración de 1:10000). Esto conduce, por una
parte, a una relajación alterada del músculo cardiaco durante la
diástole, así como a una reducción del vaciado de Ca^{2+},
relacionada con la misma, durante la sístole y, de esta forma, a
una disminución de la fuerza generada por el músculo cardiaco.
Entre otras, esta observación pone de manifiesto el hecho de que el
corazón insuficiente exhibe un nivel reducido de AMPc (4), puesto
que la fosforilación de fosfolambano, dependiente del AMPc, es
condición inicial para la activación de la
Ca^{2+}-ATPasa del SR.
Una de las estrategias aplicadas hasta la fecha
para mejorar la contractilidad aspiraba, por lo tanto, a un
incremento del nivel de AMPc intracelular mediante la administración
de inhibidores de fosfodiesterasa. Aun cuando esta opción
farmacológica conduce a corto plazo a una mejora del rendimiento
cardiaco, ha sido abandonada para el tratamiento crónico de la
insuficiencia cardiaca porque, en comparación con el placebo, da
lugar a un aumento de la mortalidad de los pacientes investigados de
un 53% (5,6).
Otra estrategia que se ha seguido hasta ahora
consiste en aprovechar de manera más eficaz el aporte reducido de
Ca^{2+} durante la sístole, a través de la sensibilización del
sistema contráctil por medio de un sensibilizador de
Ca^{2+} que, a idéntica concentración de Ca^{2+}, permite un
mayor desarrollo de fuerza del sistema contráctil. Estudios clínicos
realizados hasta la fecha con Pimobendan han puesto de manifiesto,
sin embargo, que, frente al placebo, no se puede demostrar una
mejoría significativa de la función cardiaca (7). Aún no se dispone
de datos clínicos para el grupo inhomogéneo del nuevo
sensibilizador de Ca^{2+}. No obstante, esta aplicación
terapéutica da lugar, a través de un incremento de la sensibilidad
al Ca^{2+} del sistema contráctil en algunos sensibilizadores de
Ca^{2+}, a una relajación alterada, de manera que la ventaja
terapéutica de una mayor generación de fuerza sistólica queda en
entredicho por la alteración de la diástole (8).
En la búsqueda de causas moleculares adicionales
de la función limitada del SR en el contexto de la insuficiencia
cardiaca, se ha podido determinar en diversos modelos animales, así
como en el hombre, una actividad disminuida de
Ca^{2+}-ATPasa en preparaciones de membrana
purificadas de forma grosera (crude membranes) de corazones
con insuficiencia, de manera que se sospechó de una composición
alterada de proteínas del SR como causa. Investigaciones sobre la
expresión génica de la proteína del SR fosfolambano,
Ca^{2+}-ATPasa y del receptor de rianodina
produjeron datos diferentes y, en parte, contradictorios. De este
modo, diversos grupos de trabajo (9,10,11) encontraron una
significativa expresión mínima de los genes que codifican
fosfolambano y Ca^{2+}-ATPasa también en el plano
proteínico, en tanto que Movsesian et al. (12) y Schwinger
et al. (13) no pudieron documentar ninguna diferencia
significativa de expresión, y Arai et al. (14) observaron una
expresión diferencial en el trascurso del desarrollo de la
hipertrofia. Aun cuando en preparaciones de membrana purificadas de
forma grosera de corazones con insuficiencia terminal se detectó
una actividad de Ca^{2+}-ATPasa
significativamente inferior (15), este hallazgo no se pudo llevar a
cabo en preparaciones de membrana altamente purificadas de retículo
sarcoplásmico (12). Hasta la fecha, los resultados contradictorios
se han atribuido al uso de métodos analíticos diferentes (12).
Misión de la presente invención fue, por lo
tanto, poner a disposición medicamentos para el tratamiento de la
insuficiencia cardiaca, en especial para el tratamiento o mejoría de
la capacidad de bombeo del corazón, limitada en el marco de la
insuficiencia cardiaca. Adicionalmente, los medicamentos deben
incrementar en general, y de forma preferente, el rendimiento
cardiaco, y ser adecuados para el tratamiento de la insuficiencia
cardiaca aguda y crónica.
De acuerdo con la invención, esta misión se
resuelve mediante el uso de proteínas S100, en donde las proteínas
se utilizan como principio activo como tales, o a través de una
aplicación de terapia génica, se lleva a cabo una sobreexpresión de
las proteínas S100 en el músculo cardiaco. Para la resolución de la
misión sirven, de manera particular, los objetos de las
reivindicaciones 1 a 35.
Las proteínas S100 pertenecen, al igual que la
calmodulina, al grupo de proteínas fijadoras de Ca^{2+} con un
patrón de fijación de Ca^{2+} EF-Hand, de
las cuales se conocen hasta el momento más de 200. La familia de las
proteínas S100 propiamente dicha comprende 17 miembros, de los
cuales 13 están codificados en un estrecho racimo de genes en el
cromosoma 1q21. Desde el punto de vista funcional, estas proteínas
intervienen en la regulación de la diferenciación celular, de la
regulación del ciclo celular, de la transducción de señales, así
como en la homeostasia de Ca^{2+} (16). Al contrario que la
calmodulina de expresión ubicua, las proteínas S100 exhiben un
patrón de expresión histoespecífico (17). Traducen, por lo tanto,
la señal de Ca^{2+} en una respuesta histoespecífica,
interactuando tras la fijación de Ca^{2+} a sus patrones
EF-Hand con proteínas diana específicas (16).
Las proteínas S100 poseen una secuencia de aminoácidos fuertemente
conservada con una alta homología dentro de la familia S100. Las
secuencias de aminoácidos y de ADNc están representadas en el
protocolo de secuencias como SEQ ID NO: 1 hasta 30 (número
característico <210>).
Por proteínas S100 en el sentido de la invención,
se deben entender las proteínas nativas completas, mutantes de las
proteínas S100, péptidos (fragmentos) de las proteínas S100, o
mutantes de péptidos (con una homología de por lo menos 60%,
preferentemente de al menos 90% y, de manera especialmente
preferida, de al menos 95%), así como proteínas o péptidos o
mutantes, o péptidos o mutantes sintéticos, preparados de forma
recombinante. Según una forma de realización especial de la
invención, la proteína S100 es S100\beta (S100B), S100A1, S100A2,
S100A4 o S100A6 (véase Schäfer et al., Genomica 23
(1995) 638-643). En lo sucesivo, bajo la expresión
"proteína S100" o "proteína" se entenderán también, de
modo alternativo, los citados mutantes o péptidos. Debido a una
homología que trasciende las especies de las proteínas S100, se
pueden utilizar según la invención proteínas y secuencias de
codificación de las mismas de cualquier especie (tales como, por
ejemplo, porcino, vacuno, etc.), prefiriéndose a menudo las
correspondientes secuencias humanas.
Objeto de la presente invención son, por lo
tanto, medicamentos (preparados farmacéuticos) para el tratamiento
de enfermedades cardiacas que cursan con una fuerza de contracción
reducida, de cualquier origen (cardiomiopatías primarias y
secundarias), que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de
una o múltiples proteínas S100A1-S100A13
(preferentemente, S100A1, S100A2, S100A4 o S100A6), uno o múltiples
mutantes o fragmentos de las mismas, formulados eventualmente con
coadyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Según formas de realización preferidas de la
invención, la proteína S100 es S100A1, que exhibe la secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y los fragmentos
preferidos exhiben las secuencias de aminoácidos que se muestran en
SEQ ID NO: 32, 34 y 36. Los péptidos predominantemente hidrófobos se
pueden prolongar, para mejorar la solubilidad del terminal C o N,
con aminoácidos hidrófilos. Preferentemente se utilizan, de acuerdo
con la invención, los fragmentos truncados o modificados según SEQ
ID NO: 37, 38 y/o 39.
Como principios activos sirven las citadas
proteínas, mutantes o péptidos aislados, si bien se pueden usar
también cualesquiera mezclas de los mismos tales como, por ejemplo,
una combinación de al menos dos de los péptidos representados en las
SEQ ID NO: 32, 34, 36, 37, 38 y 39.
En el contexto de la presente invención, se
entiende por cardiomiopatías primarias las cardiomiopatías
hereditarias familiares y las cardiomiopatías causadas por
mutaciones espontáneas; por cardiomiopatías secundarias se entienden
cardiomiopatías isquémicas causadas por una arteriosclerosis,
cardiomiopatías de dilatación causadas por enfermedades infecciosas
o tóxicas del miocardio, la cardiopatía hipertensiva causada por una
hipertensión de las arterias pulmonares y/o una hipertensión
arterial, cardiopatías estructurales causadas por trastornos del
ritmo, y enfermedades de las válvulas cardiacas, siendo las
cardiomiopatías primaria y secundaria las causas de la insuficiencia
cardiaca. La presente solicitud se refiere, por consiguiente,
adicionalmente, a medicamentos para el tratamiento de la
insuficiencia cardiaca.
Para su administración se puede utilizar una
inyección directa de proteína S100 purificada (o mutante o péptido)
por vía intravenosa, intraarterial o intracoronaria o, a largo
plazo, también la administración por vía oral de proteína
recombinante o de análogos de péptidos sintéticos.
En el marco de la presente invención se encontró,
sorprendentemente, que en el modelo de cultivo celular después del
tratamiento con proteína S100, en especial con la proteína S100A1,
así como tras la adición del gen S100 (en especial, S100A1), un
incremento de la velocidad de acortamiento y relajación de las
células miocárdicas cultivadas, que se correlaciona con los
transientes de Ca^{2+} intracelular en el sentido de una
liberación aumentada de Ca^{2+} sistólica desde el SR, y una
reabsorción acelerada de Ca^{2+} en el SR (véase el Ejemplo).
Estos resultados también se han obtenido con otras proteínas de la
familia S100.
Por lo tanto, la invención se refiere,
adicionalmente, a medicamentos para el tratamiento de
cardiomiopatías primaria y secundaria, así como de la insuficiencia
cardiaca, que contienen la o las mismas secuencias de ácidos
nucleicos que codifican una o múltiples proteínas S100, o uno o
múltiples mutantes o fragmentos de las mismas, estando el o los
ácidos nucleicos eventualmente formulados con coadyuvantes y/o
vehículos farmacéuticamente aceptables. Estas secuencias de ácidos
nucleicos pueden estar contenidas también en uno o múltiples
vectores de transferencia de genes. Las secuencias de ácidos
nucleicos que codifican las proteínas S100 utilizadas según la
invención se representan en SEQ ID NO: 1 hasta 35, siendo
especialmente preferida la SEQ ID NO: 1 (ADNc S100A1). Según una
forma de realización preferida de la invención, se utiliza una
combinación de al menos dos de las secuencias de ácidos nucleicos
que codifican las SEQ ID NO: 32, 34, 36, 37, 38 y 39 (en especial,
las secuencias que codifican las SEQ ID NO: 31, 33, 35, así como
las SEQ ID NO: 37, 38 y 39). En la aplicación de terapia génica se
toman en consideración una o múltiples vectores de transferencia de
genes que comprenden estas combinaciones, es decir, las citadas
secuencias de ácidos nucleicos pueden estar clonadas en múltiples
vectores (por ejemplo, de manera respectivamente aislada), o la
combinación de las secuencias de codificación puede estar contenida
en un solo vector.
Los ácidos nucleicos o vectores de transferencia
de genes se formulan, eventualmente, para la administración
intravenosa, intraarterial, intracoronaria u oral. El uso de ADN en
fracciones liposómicas constituye una posibilidad adicional de
administración, aunque exhibe una eficacia de transfección más
reducida.
Objeto de la presente invención es, por lo tanto,
también el uso de una construcción que hace posible una
sobreexpresión de S100, preferentemente de S100A1, en el músculo
cardiaco. Se prefiere, en este caso, una construcción viral que
contiene el ADN de una proteína S100, en particular de la proteína
S100\beta, S100A1, S100A2, S100A4 y S100A6, y que se administra,
preferentemente, a través de un catéter coronario en la arteria
coronaria, alcanzando tras esta administración la máxima eficacia de
transfección.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere, adicionalmente, a un procedimiento para la preparación de
un vector de transferencia de genes que codifique una o múltiples
proteínas S100, o uno o múltiples mutantes o fragmentos de las
mismas, en el cual se clonan en uno o múltiples vectores apropiados
para la terapia génica la o las secuencias de ácidos nucleicos que
codifican la o las proteínas, el o los mutantes o el o los
fragmentos.
La secuencia de ácidos nucleicos de codificación
se selecciona, preferentemente, del grupo de secuencias de ácidos
nucleicos representadas en las SEQ ID NO: 1 hasta 30. Según una
forma de realización especialmente preferida de la invención, se
utiliza para la preparación de los vectores de transferencia de
genes o para la administración directa el ADN S100 (secuencia que
codifica S100A1 según SEQ ID NO: 1), o las secuencias de ácidos
nucleicos que codifican fragmentos según SEQ ID NO: 32, 34, 36, 37,
38 y/o 39 (en especial, SEQ ID NO: 31, 33, 35, así como las
secuencias que codifican SEQ ID NO: 37, 38 y 39).
Para la transfección del tejido cardiaco con ADN
S100 resultan adecuados, en principio, múltiples sistemas de
vectores virales. Nuevos sistemas de vectores (G. Bilbao et
al., FASEB J. 11 (1977), 624-634; A.
Amalficano et al., J. Virol. 72 (1998),
926-933) pueden proporcionar una mejora de la
eficacia de la terapia génica gracias a sus efectos secundarios
inmunológicos aún más reducidos en comparación con los vectores
adenovirales conocidos. La eficacia de la terapia génica se puede
optimizar, adicionalmente, mediante el empleo de promotores
cardio-específicos más potentes tales como, por
ejemplo, un promotor de cadena pesada de miosina \alpha.
El efecto de las proteínas S100 se puede
reforzar, además, mediante el uso de los correspondientes
oligonucleótidos de sentido, si bien se puede tomar también en
consideración la aplicación de oligonucleótidos antisentido para
sustancias inhibitorias de S100. Los oligonucleótidos de sentido (u
oligonucleótidos antisentido de proteínas/péptidos de acción
antagonista), o las proteínas S100 se pueden transferir directamente
a la pared vascular de las arterias coronarias. Por medio del uso
de un sistema de balón con una superficie de gel como sustancia
portadora para oligonucleótidos o proteínas se consigue la
transferencia de estas moléculas a la capa endotelial del vaso
mediante el inflado del balón. No obstante, este método de
administración está limitado por la influencia que ejerce sobre la
contractilidad cardiaca, a través de la mejora de la función
vascular, en el sentido de una mejoría de la función endotelial o de
la musculatura lisa, dado que con este método sólo se puede lograr
un incremento local de la concentración de proteínas S100.
La transfección con ADN S100A1 conduce a una
concentración aumentada de proteínas S100A1 en el tejido cardiaco,
de manera que se puede tratar de manera causal por terapia génica
una expresión reducida, que se produce en el marco de una
insuficiencia cardiaca, de S100A1, estando garantizada nuevamente la
función de esta proteína. Cabe destacar la acción inotrópica y
lusitrópica positiva de S100A1 en el tejido cardiaco. Bajo la
terapia génica S100A1 de cardiomiocitos cultivados, de tejido
cardiaco reconstituido (18), así como en un modelo in vivo del
corazón de conejo, se demuestra tras la sobreexpresión de S100A1 un
incremento significativo de la velocidad de contracción en al menos
un 20% (inotropía positiva), así como una relajación acelerada
(lusitropía positiva). Este efecto se basa en la mejora de la
función del retículo sarcoplásmico que se caracteriza por una
liberación acelerada y aumentada de Ca^{2+} desde el SR, así como
por una reabsorción de Ca^{2+} en el SR. Esto se confirma en un
ensayo no publicado hasta la fecha, con análisis de bioluminiscencia
de los transientes de Ca^{2+} intracelular (véanse los
Ejemplos).
La ventaja de esta invención radica especialmente
en la posibilidad de tratar de manera causal la disfunción del SR,
patognomónica de la insuficiencia cardiaca.
En el contexto de la presente invención no sólo
se ponen a disposición medicamentos para el tratamiento de la
insuficiencia cardiaca (crónica), sino también medicamentos para el
tratamiento de cardiopatías que se comprenden como causas de una
insuficiencia cardiaca tales como las cardiomiopatías primarias (por
ejemplo, cardiomiopatías hereditarias familiares, cardiomiopatías
causadas por mutaciones espontáneas), y cardiomiopatías secundarias
(por ejemplo, cardiomiopatía isquémica basada en una
arteriosclerosis, cardiomiopatía de dilatación originada por una
enfermedad infecciosa o tóxica del miocardio, cardiopatía
hipertensiva causada por una hipertensión de las arterias
pulmonares y/o arterial, cardiopatías estructurales causadas por
trastornos del ritmo, enfermedades de las válvulas cardiacas,
etc.).
\newpage
Una ventaja adicional de esta invención radica en
el hecho que se han descrito funciones adicionales de S100, en
particular de S100A1, que pueden ampliar de manera esencial las
posibilidades de aplicación en terapia génica para el tratamiento de
la insuficiencia cardiaca.
Las investigaciones de Donato, así como de
Garbuglia et al. (19,20) han demostrado una polimerización de
los microtúbulos, así como de los filamentos intermedios, a través
de S100A1 en ensayos de reconstitución bioquímicos. Los análisis
inmuno-histoquímicos de Schaper et al. (12)
han puesto de manifiesto un incremento significativo de la red de
microtúbulos, así como de filamentos intermedios desordenados, en
corazones explantados de pacientes con insuficiencia cardiaca de
gravedad NYHA IV (New York Heart Association IV), que da lugar a una
sobrecarga viscosa del miocardio insuficiente y, por consiguiente,
a una velocidad de contracción disminuida (22). La sobreexpresión
terapéutica de S100A1 puede impedir, por lo tanto, una reticulación
excesiva del esqueleto celular y mejorar las condiciones de
contracción mediante la reducción de la carga viscosa.
Por último, datos de Baudier et al. (23)
confirman una inhibición de la proteín-quinasa C
mediante S100A1. Dado que la activación de la
proteín-quinasa C ocupa una posición clave en la
cascada de la transducción de señales del proceso de hipertrofia que
conduce a la insuficiencia (24), la inhibición de la
proteín-quinasa C por medio de un aumento del nivel
tisular de S100A1 en el miocardio insuficiente podría tener un
importante significado terapéutico para la normalización de la
transducción de señales del corazón afecto de insuficiencia.
Los siguientes Ejemplos, Figuras y el protocolo
de secuencias deben explicar más detalladamente la invención, sin
limitarla en su alcance.
Se preparó S100A1 recombinante humano en E.
coli modificada por tecnología génica. Para ello, se clonó el
ADNc de S100A1 en un vector de expresión pGEMEX, se transformaron
E. coli competentes con este vector, y se les seleccionó a
través de una resistencia a la ampicilina contenida en el vector.
Las bacterias modificadas por tecnología génica se almacenaron hasta
su uso en glicerina al 50% a -80ºC, empleándolas a continuación
según el siguiente esquema: Se inocularon 3 ml de medio LB con 100
\mug/ml de ampicilina del recipiente de depósito con un asa de
inoculación, y se incubaron durante la noche a 37ºC. Al día
siguiente, se agregó el cultivo nocturno a 250 ml de Medio LB con
100 \mug/ml de ampicilina y 30 \mug/ml de cloranfenicol. Se
midió la densidad óptica cada 30 minutos y, a partir de >0,5 se
agregaron 120 \mul de IPTG 1M. Después de otras 3 a 4 horas, se
centrifugó el medio y los granulados se descongelaron 3 a 4 veces y
se volvieron a congelar para lisar las bacterias.
Los granulados bacterianos se homogeneizaron en
el tampón de extracción (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5,
KCl 50 mM, PMSF 1 mM, EDTA 5 mM), con ayuda de ultrasonidos. Los
sobrenadantes se llevaron a una concentración final de 2 M con
solución saturada de sulfato de amonio, y se centrifugaron. El
sobrenadante de la precipitación con sulfato de amonio se aplicó en
una columna de HiTrap Octil-Sefarosa (Cía.
Pharmacia, Friburgo), previamente equilibrada con tampón A
(Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, CaCl_{2} 2 mM). La S100A1
unida a la columna se eluyó con un gradiente de etapas de tampón B
(Tris-HCl 25 mM, pH 9,5, EGTA 5 mM). Para obtener
una pureza mayor de 95%, el eluato de S100 se sometió, a
continuación, a una cromatografía de intercambio aniónico. La
muestra se transfirió a una columna HiTrapQ (Cía. Pharmacia)
previamente equilibrada en tampón A (Tris-HCl 25 mM,
pH 7,5), y se eluyó a través de un gradiente lineal sobre tampón B
al 40% (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 1 M). La S100A1
purificada se concentró en un evaporador de vacío y se dializó
contra HEPES 10 mM (pH 7,5) y, por último, se almacenó en partes
alícuotas a -80ºC. La Fig. 1a muestra el perfil de elución de la
columna HiTrapQ, así como un gel de SDS poliacrilamida, y la Fig. 1b
la correspondientes transferencias de Western que se llevaron a cabo
para los controles de calidad de la purificación de S100A1. Se
reconoce que el procedimiento de purificación utilizado conduce a un
elevado grado de purificación de la proteína S100A1.
Se extrajeron los corazones neonatales de ratas
de 3 días de edad, se separaron los ventrículos de las aurículas y
se trituraron de manera grosera en tampón ADS (6,8 g de NaCl, 4,76 g
de HEPES, 0,12 g de NaH_{2}PO_{4}, 1 g de glucosa, 0,4 g de KCl,
0,1 g de MgSO_{4}, hasta 1000 con H_{2}O), y se almacenaron
sobre hielo. A continuación, en un biorreactor (cápsula Wheaton®)
se separaron las células por digestión con colagenasa (108 U/mg/ml
de colagenasa, Worthington, EE.UU.) de la estructura tisular, y las
células libres se separaron por centrifugación sobre un gradiente
de densidad (Percoll, Pharmacia®). La fracción de cardiomiocitos se
resuspendió en medio de cultivo celular (DMEM + Suero de Ternero
Recién Nacido al 10%), sembrándolos en placas en una densidad de
aprox. 100.000 cardiomiocitos por pocillo, en placas de cultivo
celular de 24 pocillos. Después de 24 horas de cultivo a 37ºC y
CO_{2} al 5%, se agregó al medio de cultivo S100A1 recombinante
en concentraciones de 1 \muM hasta 10 \muM en intervalos de dos
días. Después de 7 días, se llevó a cabo la medición de los
transientes de calcio después de la carga, durante 1 hora, de las
células con FuraPE3AM®. Los transientes de Ca^{2+} intracelular
se detectaron y cuantificaron, entonces, mediante microscopia de
fluorescencia inversa (Olympus OSP 3®), tanto en condiciones de
reposo como bajo estimulación de campo eléctrica (PHYWE® - Unidad de
medición bioeléctrica; frecuencias de 30-300 bpm).
La Fig. 2 muestra las derivaciones originales de las células de
control analizadas (2a), así como de las células tratadas con
S100A1 (2b). La evaluación estadística demuestra que bajo la
estimulación con S100A1 el incremento de la concentración de
Ca^{2+} por unidad de tiempo en la sístole (+dc/dt) aumentó de
manera significativa en un factor de 3 (p<0,0002) en comparación
con la población de células de control. El descenso de la
concentración de Ca^{2+} por unidad de tiempo en la diástole
(-dc/dt) se acelera, bajo la estimulación con S100A1, en un factor
de 2,2 (p<0,0003), en comparación con la población de células de
control. Las modificaciones de la concentración de Ca^{2+} por
unidad de tiempo se midieron como el cociente del tiempo necesario
para alcanzar el máximo de señal y la amplitud de señal (+dc/dt), o
como el cociente del tiempo necesario para alcanzar la mitad de la
amplitud y de la amplitud de señal (-dc/dt). Por medio de este
ensayo, se puede demostrar que S100A1, como factor paracrino,
mejora la eficacia de la función del SR.
Para la preparación de la construcción viral que
sobreexpresa S100A1, se aplica la siguiente estrategia: el ADN de
S100A1 se clona detrás de un promotor de CMV en el vector de
transformación adenoviral pAD TRACK (Tong-Chuan He
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95;
2509-2514) en el sitio de
multi-clonación. El plasmidio resultante se
linealiza con PME1 y se recombina con pEASY
(Tong-Chuan He et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 95; 2509-2514) en E. coli BJ 5183.
El producto de recombinación (pAD/S100A1) corresponde a un plasmidio
que contiene el ADN viral del adenovirus Tipo 5 E1 y E3
delecionados, el ADN de S100A1, así como una resistencia a la
kanamicina. Muestras del plasmidio pAD/S100A1 se depositaron el 26
de marzo de 1999 en la DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH (Colección Alemana de Microorganismos y
Cultivos Celulares, S.L.), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig,
bajo el número de acceso DSM 12755, de acuerdo con el Tratado de
Budapest. Entonces, se transforma y multiplica pAD/S100A1 en E.
coli DH5_{\alpha}, bajo selección de kanamicina (50
\mug/ml). pAD/S100A1 se linealiza con PAC1, bajo la pérdida de la
resistencia a kanamicina, y se incluye en la producción de virus con
ayuda de Lipofectamina (Gibco, BRL) en células HEK293. Después de
10 días, se cosecha el virus con un título bajo y se infecta
nuevamente HEK293. Tras múltiples ciclos de cosecha y reinfección de
células HEK293, se obtiene finalmente un virus con título alto, que
se procesa del modo siguiente antes de aplicarlo en el organismo:
Las células HEK293 se cosechan y centrifugan (3400 rpm x 10 min)
antes de que se produzca la lisis celular. El granulado de células
HEK293 resultante se lava dos veces en PBS (0,01 M, Sigma,
p-3813) y, por último, se recoge en Tris 0,01 M pH
8,1. Seguidamente, las células KEK293 que contienen el virus se
lisan mediante múltiples congelaciones (nitrógeno líquido) y
descongelaciones (a 37ºC), y se libera el virus. El ADN de las
células HEK se separa por digestión con ADNasa (a 37ºC durante 30
min), y las proteínas de las células HEK se separan del lisado por
extracción con freón. El virus se purifica por ultracentrifugación
(12 h x 12700 g) sobre un gradiente de cloruro de cesio. La
fracción viral resultante se marca con puntos y se dializa 3 veces
x 2 h (1% en volumen de sacarosa en PBS 0,01 M, pH 7,4), y se
almacena en partes alícuotas a -80ºC. Para el tratamiento con
terapia génica se utilizan entre 10^{9} y 10^{12} partículas
virales por gramo de tejido cardiaco.
Por toracotomía lateral del 4º espacio
intercostal, se abrió el tórax derecho de conejos blancos de Nueva
Zelanda. Tras la detección de la aorta, se procedió a la abertura
del pericardio y a la ligadura de la aorta. Mediante inyección en la
cavidad izquierda, se llevó a cabo una perfusión intracoronaria con
2 x 10^{11} partículas virales del virus S100A1 recombinante (n =
6), de un virus son ADNc de S100A1 (n = 11), o de NaCl (n = 11). 7
días después de la operación, se procedió a la cateterización de los
conejos a través de la arteria carótida. De esta forma, se midieron
la velocidad de contracción (dP/dt) y la presión de eyección
sistólica (SEP) de los corazones de conejo, tanto bajo condiciones
básicas como bajo estimulación con isoproterenol (0,1, 0,5 y 1,0
\mug/kg/min). A partir de miocardios de conejo ultracongelados en
nitrógeno líquido se practicaron crio-cortes y se
demostró la infección viral del miocardio mediante la determinación
por microscopia de fluorescencia de la expresión de GFP (véase la
Figura 3).
La inyección de una construcción viral son ADNc
de S100A1 tiene como consecuencia una disminución de, en promedio,
9% de la presión de eyección sistólica (SEP en mmHg) del corazón de
conejo bajo todas las condiciones aplicadas, en comparación con los
animales tratados con NaCl. Bajo condiciones basales, el
comportamiento de la SEP en los animales tratados con S100A1 no
difiere de manera estadísticamente significativa de ambos grupos de
control. La SEP en el grupo de conejos con sobreexpresión de S100A1
aumenta, en comparación con el grupo tratado con la construcción
viral que no contiene el ADNc de S100A1, bajo todas las
estimulaciones con isoproterenol en 17% (0,1 \mug/kg/min;
p<0,02), 10% (0,5 \mug/kg/min; p=0,06), y 11% (1,0
\mug/kg/min; p<0,05). Bajo la estimulación con isoproterenol,
los animales tratados con S100A1 exhiben una SEP aumentada en 4% (no
significativo) en comparación con el grupo de NaCl (véase la Figura
4a).
La velocidad de contracción (dP/dt en mmHg) del
corazón disminuye con la administración de una construcción viral
sin ADNc de S100A1, en comparación con la inyección de NaCl, bajo
todas las condiciones medidas, en una media de 10%, lo que atribuyen
los presentes autores a una miocarditis. Los animales con
sobreexpresión de S100A1 exhibieron, bajo condiciones basales, una
dP/dt no estadísticamente desviada en comparación con el grupo de
control del virus. Por el contrario, la fuerza de contracción del
corazón en el grupo S100A1 aumentó bajo estimulación con
isoproterenol en 17% (0,1 \mug/kg/min; p<0,05), 14% (0,5
\mug/kg/min; p<0,03) y 14% (1,0 \mug/kg/min; p<0,05), en
comparación con los controles del virus. Los animales tratados con
el virus S100A1 recombinante mostraron, a pesar de la miocarditis,
una dP/dt aumentada en una media de 5% (no significativo) con
respecto al grupo de NaCl (véase la Figura 4b).
La fijación de Ca^{2+} a S100A1 conduce a una
estructura terciaria modificada de esta proteína fijada a Ca^{2+},
produciéndose una estrecha coordinación espacial de las tres
fracciones hidrófobas de la proteína (primeros aminoácidos
2-16 (N-terminales), véase la SEQ ID
NO: 32; segundos aminoácidos 42-54 (región bisagra),
véase la SEQ ID NO: 34; terceros aminoácidos 75-85
(C-terminales), véase la SEQ ID NO: 36), que se
fijan conjuntamente al RyR (receptor de rianodina, que es un
sinónimo de la Ca^{2+}-ATPasa del SR), tal como
permiten suponer los datos de Treves et al. (25). El objetivo
de este planteamiento experimental fue, por lo tanto, investigar el
significado funcional de estas secuencias - en forma de péptidos
sintéticos - en comparación con la proteína total, para la
regulación de la liberación de Ca^{2+} desde el SR. La liberación
de Ca^{2+} se midió de manera indirecta en fibras de músculo
esquelético semipermeabilizados con saponina de rata, a través de
un gradiente de fuerzas isométrico. Como control se utilizó la
medición de la fuerza isométrica antes y después de la
administración del péptido/proteína S100A1.
En tanto que los péptidos aislados no mostraron
ningún efecto, la combinación de péptido
"C-terminal" y de la "región bisagra"
aumentó el desarrollo de la fuerza isométrica ya en 15% \pm 4%.
Tanto la combinación de los tres péptidos (Fig. 5b), como también
la proteína recombinante (Fig. 5a) en concentración equimolar
(5-10 \muM), aumentaron el desarrollo de fuerza
máximo en la musculatura esquelética lenta (músculo sóleo)
igualmente en 49% \pm 6% ó 52% \pm 7%, en comparación con los
controles con sensibilidad al Ca^{2+} inalterada del sistema
contráctil.
Estos resultados demuestran que es posible
simular los efectos de S100A1 por medio de las fracciones hidrófobas
de proteínas, y que sólo a través de la combinación de los tres
péptidos es posible desencadenar el efecto total de la proteína
nativa. De esta forma, confirman la importancia de la regulación de
la coordinación del RyR, dependiente del Ca^{2+}, por medio de la
secuencias hidrófobas de S100A1.
Fig. 1: (a) perfil de elución de HiTrapQ,
absorción a 220 nm. (b) Tinción argéntica tras la electroforesis
sobre gel de poliacrilamida-SDS de las diferentes
etapas de purificación: 1.: extracto de E. coli, 2.: de
proteínas no unidas a octil-sefarosa, 3.: eluato de
EGTA de octil-sefarosa, 4.-5.: de proteínas no
unidas a HiTrapQ, 6.-8.: fracciones del pico de S100A1 de
HiTrapQ.
Fig. 2: Derivaciones originales de las células
de control analizadas (Fig. 2a), así como de células tratadas con
S100A1 (Fig. 2b).
Fig. 3: Demostración de la infección viral del
miocardio por determinación por microscopia de fluorescencia de la
expresión de GFP en crio-cortes de miocardio de
conejo ultracongelado.
Fig. 4: Presión de eyección sistólica, bajo
estimulación con isoproterenol, en animales tratados con S100A1, en
comparación con el grupo de control (Fig. 4a). Velocidad de
contracción, bajo estimulación con isoproterenol, en animales
tratados con S100A1, en comparación con el grupo de control (Fig.
4b).
Fig. 5: Incremento del desarrollo de fuerza
máximo en la musculatura esquelética lenta (músculo sóleo) a través
de la combinación de los tres péptidos S100A1
(N-terminales, región bisagra,
C-terminales; Fig. 5b), así como a través de la
proteína S100A1 recombinante (Fig. 5a) en concentración equimolar
(5-10 \muM).
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<211> 285
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(285)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc de S100A1
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<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 94
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S100A1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(294)
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<223> ADNc de S100A2
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<400> 3
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\newpage
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<210> 4
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<211> 97
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<223> S100A2
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<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 306
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(306)
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<223> cDNA de S100A3
\newpage
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 101
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<223> S100A3
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 306
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(306)
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<223> ADNc de S100A4
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<400> 7
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<211> 101
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<212> PRT
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<223> S100A4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(333)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc de S100A5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S100A5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(273)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc de S100A6
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S100A6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 306
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(306)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc de S100A7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S100A7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 282
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(282)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc de S100A8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S100A8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 345
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(345)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc de S100A9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S100A9
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(294)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc de S100A10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>19
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S100A10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 318
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(318)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc S100A11
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S100A11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 279
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(279)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc S100A12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S100A12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 297
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(297)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc S100A13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S100A13
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(288)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc de S100B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S100B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 288
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(288)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc de S100P
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S100P
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(45)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc S100A1
[N-terminal]
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S100A1
[N-terminal]
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Glu Leu Glu Thr Ala Met Glu Thr Leu
Ile Asn Val Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(39)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc S100A1 [región bisagra]
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211>13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Ser Gly Phe Leu Asp Ala Gln Lys Asp Val
Asp Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S100A1 [bisagra región]
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Ser Gly Phe Leu Asp Ala Gln Lys Asp Val
Asp Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc de S100A1
[C-terminal]
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S100A1
[C-terminal]
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Val Val Leu Val Ala Ala Leu Thr Val
Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211>17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S100A1 [N-terminal,
modificada]
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Glu Leu Glu Thr Ala Met Glu Thr Leu
Ile Asn Val Phe His}
\sac{Ala}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S100A1 [región bisagra,
modificada]
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Ser Gly Phe Leu Asp Ala Gln Lys Asp Ala
Asp Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213>Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S100A1 [C-terminal,
modificada]
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Lys Asp Asp Pro Pro Tyr Val Val Leu Val
Ala Ala Leu Thr Val}
\sac{Ala}
Claims (35)
1. Medicamento para el tratamiento de
cardiopatías del grupo compuesto por cardiomiopatías primarias y
cardiomiopatías secundarias, caracterizado porque contiene
la o las secuencias de ácidos nucleicos que codifican una o
múltiples proteínas S100 del grupo compuesto por S100A1, S100A2,
S100A3, S100A4, S100A5, S100A6, S100A7, S100A8, S100A9, S100A10,
S100A11, S100A12 y S100A13, uno o múltiples mutantes de las mismas,
con una homología con respecto a ellas de al menos 60%, que aumentan
la liberación de Ca^{2+} sistólica desde el retículo sarcoplásmico
y aceleran la reabsorción de Ca^{2+} en el retículo
sarcoplásmico, o que codifican uno o múltiples péptidos hidrófobos
del grupo compuesto por péptidos según SEQ ID NO: 36 y 39, en el que
la o las secuencias de ácidos nucleicos están formuladas,
eventualmente, con coadyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente
aceptables.
2. Medicamento para el tratamiento de
cardiopatías del grupo compuesto por cardiomiopatías primarias y
cardiomiopatías secundarias, caracterizado porque contiene
un vector de transferencia de genes que contiene la o las secuencias
de ácidos nucleicos que codifican una o múltiples proteínas S100
del grupo compuesto por S100A1, S100A2, S100A3, S100A4, S100A5,
S100A6, S100A7, S100A8, S100A9, S100A10, S100A11, S100A12 y S100A13,
uno o múltiples mutantes de las mismas, con una homología con
respecto a ellas de al menos 60%, que aumentan la liberación de
Ca^{2+} sistólica desde el retículo sarcoplásmico y aceleran la
reabsorción de Ca^{2+} en el retículo sarcoplásmico, o que
codifican uno o múltiples péptidos hidrófobos del grupo compuesto
por péptidos según SEQ ID NO: 36 y 39, en el que el vector está
formulado, eventualmente, con coadyuvantes y/o vehículos
farmacéuticamente aceptables.
3. Medicamento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque las cardiomiopatías primarias comprenden
cardiomiopatías hereditarias familiares y cardiomiopatías causadas
por mutaciones espontáneas.
4. Medicamento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque las cardiomiopatías secundarias
comprenden cardiomiopatías isquémicas causadas por una
arteriosclerosis, cardiomiopatías de dilatación causadas por una
enfermedad infecciosa o tóxica del miocardio, cardiopatías
hipertensivas causadas por una hipertensión de la arteria pulmonar
y/o arterial, cardiopatías estructurales causadas por trastornos del
ritmo, y enfermedades de las válvulas cardiacas.
5. Medicamento para el tratamiento de la
insuficiencia cardiaca, caracterizado porque contiene la o
las secuencias de ácidos nucleicos que codifican una o múltiples
proteínas S100 del grupo compuesto por S100A1, S100A2, S100A3,
S100A4, S100A5, S100A6, S100A7, S100A8, S100A9, S100A10, S100A11,
S100A12 y S100A13, uno o múltiples mutantes de las mismas, con una
homología con respecto a ellas de al menos 60%, que aumentan la
liberación de Ca^{2+} sistólica desde el retículo sarcoplásmico y
aceleran la reabsorción de Ca^{2+} en el retículo sarcoplásmico, o
que codifican uno o múltiples péptidos hidrófobos del grupo
compuesto por péptidos según SEQ ID NO: 36 y 39, en el que la o las
secuencias de ácidos nucleicos están formuladas, eventualmente, con
coadyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
6. Medicamento para el tratamiento de la
insuficiencia cardiaca, caracterizado porque contiene un
vector de transferencia de genes que contiene las secuencias de
ácidos nucleicos que codifican una o múltiples proteínas S100 del
grupo compuesto por S100A1, S100A2, S100A3, S100A4, S100A5, S100A6,
S100A7, S100A8, S100A9, S100A10, S100A11, S100A12 y S100A13, uno o
múltiples mutantes de las mismas, con una homología con respecto a
ellas de al menos 60%, que aumentan la liberación de Ca^{2+}
sistólica desde el retículo sarcoplásmico y aceleran la reabsorción
de Ca^{2+} en el retículo sarcoplásmico, o que codifican uno o
múltiples péptidos hidrófobos del grupo compuesto por péptidos
según SEQ ID NO: 36 y 39, en el que el vector está formulado,
eventualmente, con coadyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente
aceptables.
7. Medicamento según las reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado porque S100A1 tiene la secuencia de
aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 2.
8. Medicamento según las reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado porque el péptido tiene la secuencia de
aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 36.
9. Medicamento según las reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado porque contiene una combinación de al menos
dos de los péptidos representados en las SEQ ID NO: 32, 34, 36, 37,
38 y 39.
10. Medicamento según las reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado porque contiene una secuencia de ácidos
nucleicos según SEQ ID NO: 1 que codifica S100A1, o un vector de
transferencia de genes que contiene esta secuencia.
11. Medicamento según las reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado porque las secuencias de ácidos nucleicos que
codifican péptidos se seleccionan de los grupos compuesto por SEQ
ID NO: 35 y de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican
péptidos según la SEQ ID NO: 39, o están contenidas en forma de uno
o múltiples vectores de transferencia de genes que contienen estas
secuencias.
12. Medicamento según las reivindicaciones 1 a 6,
caracterizado porque contiene una combinación de al menos
dos de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las SEQ ID
NO: 32, 34, 36, 37, 38 y 39, preferentemente al menos dos de las
secuencias de ácidos nucleicos representadas en las SEQ ID NO: 31,
33, 35, y de las secuencias que codifican las SEQ ID NO: 37, 38 y
39, o uno o múltiples vectores de transferencia de genes que
contienen esta combinación.
13. Medicamento según las reivindicaciones 1 a
12, caracterizado porque está formulado para su
administración oral, intravenosa, intraarterial o
intracoronaria.
14. Uso de una o múltiples proteínas S100, uno o
múltiples mutantes de las mismas, que incrementan la liberación de
Ca^{2+} sistólica desde el retículo sarcoplásmico y aceleran la
reabsorción de Ca^{2+} en el retículo sarcoplásmico, o de uno o
múltiples péptidos hidrófobos del grupo compuesto por péptidos
según las SEQ ID NO: 36 y 39, para la preparación de un medicamento
para el tratamiento de cardiopatías del grupo compuesto por
cardiomiopatías primarias y cardiomiopatías secundarias.
15. Uso de una o múltiples secuencias de ácidos
nucleicos que codifican una o múltiples proteínas S100, uno o
múltiples mutantes de las mismas, que incrementan la liberación de
Ca^{2+} sistólica desde el retículo sarcoplásmico y aceleran la
reabsorción de Ca^{2+} en el retículo sarcoplásmico, o uno o
múltiples péptidos hidrófobos del grupo compuesto por péptidos
según las SEQ ID NO: 36 y 39, para la elaboración de un preparado
farmacéutico para el tratamiento de cardiopatías del grupo compuesto
por cardiomiopatías primarias y cardiomiopatías secundarias, en el
que el o los ácidos nucleicos están formulados, eventualmente, con
coadyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
16. Uso de un vector de transferencia de genes
que contiene la o las secuencias de ácidos nucleicos que codifican
una o múltiples proteínas S100, uno o múltiples mutantes de las
mismas, que incrementan la liberación de Ca^{2+} sistólica desde
el retículo sarcoplásmico y aceleran la reabsorción de Ca^{2+} en
el retículo sarcoplásmico, o uno o múltiples péptidos hidrófobos
del grupo compuesto por péptidos según las SEQ ID NO: 36 y 39, para
la elaboración de un preparado farmacéutico para el tratamiento de
cardiopatías del grupo compuesto por cardiomiopatías primarias y
cardiomiopatías secundarias, en el que el vector está formulado,
eventualmente, con coadyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente
aceptables.
17. Uso según las reivindicaciones 14 a 16,
caracterizado porque las cardiomiopatías primarias
comprenden cardiomiopatías hereditarias familiares y cardiomiopatías
causadas por mutaciones espontáneas.
18. Uso según las reivindicaciones 14 a 16,
caracterizado porque las cardiomiopatías secundarias
comprenden cardiomiopatías isquémicas causadas por una
arteriosclerosis, cardiomiopatías de dilatación causadas por una
enfermedad infecciosa o tóxica del miocardio, cardiopatías
hipertensivas causadas por una hipertensión de la arteria pulmonar
y/o arterial, cardiopatías estructurales causadas por trastornos del
ritmo, y enfermedades de las válvulas cardiacas.
19. Uso de una o múltiples proteínas S100, de uno
o múltiples mutantes de las mismas, que incrementan la liberación
de Ca^{2+} sistólica desde el retículo sarcoplásmico y aceleran
la reabsorción de Ca^{2+} en el retículo sarcoplásmico, o uno o
múltiples péptidos hidrófobos del grupo compuesto por péptidos según
las SEQ ID NO: 36 y 39, para la elaboración de un preparado
farmacéutico para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca.
20. Uso de una o múltiples secuencias de ácidos
nucleicos, que codifican una o múltiples proteínas S100, uno o
múltiples mutantes de las mismas, que incrementan la liberación de
Ca^{2+} sistólica desde el retículo sarcoplásmico y aceleran la
reabsorción de Ca^{2+} en el retículo sarcoplásmico, o uno o
múltiples péptidos hidrófobos del grupo compuesto por péptidos
según las SEQ ID NO: 36 y 39, para la elaboración de un preparado
farmacéutico para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca, en el
que el o los ácidos nucleicos están formulados, eventualmente, con
coadyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
21. Uso de un vector de transferencia de genes
que contiene la o las secuencias de ácidos nucleicos que codifican
una o múltiples proteínas S100, uno o múltiples mutantes de las
mismas, que incrementan la liberación de Ca^{2+} sistólica desde
el retículo sarcoplásmico y aceleran la reabsorción de Ca^{2+} en
el retículo sarcoplásmico, o uno o múltiples péptidos hidrófobos
del grupo compuesto por péptidos según las SEQ ID NO: 36 y 39, para
la elaboración de un preparado farmacéutico para el tratamiento de
la insuficiencia cardiaca, en el que el vector está formulado,
eventualmente, con coadyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente
aceptables.
22. Uso según las reivindicaciones 19 a 21,
caracterizado porque la proteína S100 se selecciona del
grupo compuesto por S100\beta, S100A1, S100A2, S100A4 y
S100A6.
23. Uso según la reivindicación 22,
caracterizado porque S100A1 tiene la secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 2.
24. Uso según la reivindicación 21,
caracterizado porque el péptido tiene la secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 36.
25. Uso según las reivindicaciones 14 a 22,
caracterizado porque se utiliza una combinación de al menos
dos de los péptidos representados en las SEQ ID NO: 32, 34, 36, 37,
38 y 39.
26. Uso según las reivindicaciones 15 a 22,
caracterizado porque se utiliza una secuencia de ácidos
nucleicos que codifica S100A1 según la SEQ ID NO: 1, o un vector de
transferencia de genes que contiene esta secuencia.
27. Uso según las reivindicaciones 16 a 22,
caracterizado porque las secuencias de ácidos nucleicos que
codifican los péptidos se seleccionan de la SEQ ID NO: 35, o de
vectores de transferencia de genes que contienen esta secuencia.
28. Uso según las reivindicaciones 15 a 22,
caracterizado porque se utiliza una combinación de al menos
dos de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las SEQ ID
NO: 32, 34, 36, 37, 38 y 39, preferentemente al menos dos de las
secuencias de ácidos nucleicos representadas en las SEQ ID NO: 31,
33, 35, y de las secuencias que codifican las SEQ ID NO: 37, 38 y
39, o uno o múltiples vectores de transferencia de genes que
comprenden esta combinación.
29. Uso según las reivindicaciones 14 a 28,
caracterizado porque el medicamento está formulado para su
administración oral, intravenosa, intraarterial o
intracoronaria.
30. Péptido, caracterizado porque está
compuesto por la secuencia representada en la SEQ ID NO: 34, 36, 38
ó 39.
31. Ácido nucleico, caracterizado porque
codifica los péptidos según la reivindicación 30.
32. Vector de transferencia de genes según DSM
12755.
33. Procedimiento para la preparación de un
vector de transferencia de genes que codifica una o múltiples
proteínas S100 del grupo compuesto por S100A1, S100A2, S100A3,
S100A4, S100A5, S100A6, S100A7, S100A8, S100A9, S100A10, S100A11,
S100A12 y S100A13, uno o múltiples mutantes de las mismas, con una
homología con respecto a ellas de al menos 60%, que aumentan la
liberación de Ca^{2+} sistólica desde el retículo sarcoplásmico y
aceleran la reabsorción de Ca^{2+} en el retículo sarcoplásmico,
o que codifican uno o múltiples péptidos hidrófobos del grupo
compuesto por péptidos según SEQ ID NO: 36 y 39,
caracterizado porque se clonan en uno o múltiples vectores
apropiados para la terapia génica la o las secuencias de ácidos
nucleicos que codifican la o las proteínas, el o los mutantes o los
péptidos.
34. Procedimiento según la reivindicación 33,
caracterizado porque la o las secuencias de ácidos nucleicos
de codificación se seleccionan del grupo de las secuencias de
ácidos nucleicos representadas en las SEQ ID NO: 1 hasta 26.
35. Procedimiento para la preparación de un
vector de transferencia de genes según la reivindicación 32,
caracterizado porque se clona el ADNc representado en la SEQ
ID NO: 1 en el sitio de multi-clonación del vector
de transformación pAD TRACK, se linealiza con PME1 y se recombina
con pEASY en E. coli BJ 5183.
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