ES2243247T3

ES2243247T3 - Matrices de autoensamblaje.

Info

Publication number: ES2243247T3
Application number: ES00917936T
Authority: ES
Inventors: Donald D. Montgomery
Original assignee: Combimatrix Corp
Current assignee: Combimatrix Corp
Priority date: 1999-03-11
Filing date: 2000-03-10
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2020-03-10
Also published as: EP1185363B1; CA2367925A1; JP2002538479A; DE60020840T2; AU3883200A; EP1185363A1; CA2367925C; WO2000053311A1; WO2000053311A9; ATE297803T1; DE60020840D1

Abstract

Método para fabricar una matriz de autoensamblaje que se forma sobre una membrana porosa que tiene una pluralidad de electrodos próximos a la membrana porosa, comprendiendo el método las etapas de: (a) preparar una o más matrices de oligonucleótidos multiplexadas espacialmente, (b) exponer la matriz de oligonucleótidos a una disolución que contiene al menos una molécula de anticuerpo que comprende un resto de oligonucleótido, que puede unirse a un oligonucleótido de la matriz mediante interacción de hibridación, y (c) eliminar mediante lavado las moléculas de anticuerpo no unidas que comprenden un resto de oligonucleótido, para formar la matriz autoensamblada.

Description

Matrices de autoensamblaje.

Campo de la invención

La presente invención está en el campo de la síntesis y el procesamiento biológicos y químicos. La presente invención se refiere a métodos para generar micromatrices de autoensamblaje.

La presente solicitud reivindica prioridad para la solicitud de patente de los EE.UU. provisional número de serie 60/123.894 presentada el 11 de marzo de 1999.

Antecedentes de la invención

Continuamente surgen avances en el campo del equipo para el procesamiento y la síntesis biológicos y químicos. Se están desarrollando muchas matrices novedosas y mejoradas de "chip biológico" que proporcionan rápidos métodos para sintetizar materiales químicos y biológicos. Ejemplos de tales tecnologías incluyen las descritas por Pirrung et al., patente de los EE.UU. número 5.143.854, las descritas por Southern en el documento WO 93/22480, las descritas por Heller en el documento 95/12808, las descritas en la patente de los EE.UU. número 5.849.486, las descritas en la patente de los EE.UU. número 5.632.957, las descritas en la patente de los EE.UU. número 5.605.662 y las descritas por Montgomery en el documento WO 98/01221. Los métodos para sintetizar materiales químicos y biológicos pueden emplear, por ejemplo, técnicas fotolitográficas o técnicas electroquímicas.

Los métodos de preparación de grandes cifras de ligandos diferentes han sido fastidiosamente lentos y prohibitivamente caros cuando se utilizaron a una escala suficiente para permitir la detección aleatoria o razonada eficaz. Por ejemplo, el método descrito por Merrifield et al. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963) se ha utilizado para sintetizar péptidos sobre soportes sólidos. En este método, se une covalentemente un aminoácido a un soporte compuesto por un polímero insoluble. Se hace reaccionar otro aminoácido con un grupo protegido en alfa con el aminoácido unido covalentemente para formar un dipéptido. Tras el lavado, se elimina el grupo protector y se añade al dipéptido un tercer aminoácido con un grupo protector en alfa. Este procedimiento se continúa hasta que se obtiene un péptido de la longitud y secuencia deseadas. Utilizando el método de Merrifield, no es factible técnicamente ni práctico desde el punto de vista económico la síntesis de más de un puñado de secuencias peptídicas.

Para sintetizar cifras mayores de secuencias poliméricas, se ha propuesto utilizar una serie de recipientes de reacción para la síntesis del polímero. Por ejemplo, puede utilizarse un sistema de reactor tubular para sintetizar un polímero lineal sobre un soporte en fase sólida mediante la adición secuencial automatizada de los reactivos. Sin embargo, este método tampoco permite la síntesis de un número suficientemente grande de secuencias poliméricas para la detección eficaz y económica.

Otro método de preparación de una pluralidad de secuencias poliméricas utiliza un recipiente poroso que encierra una cantidad conocida de partículas reactivas, de mayor tamaño que los poros del recipiente. Las partículas en los recipientes pueden hacerse reaccionar selectivamente con los materiales deseados para sintetizar las secuencias deseadas de moléculas producto. Sin embargo, como con los otros métodos conocidos en la técnica, este método no es práctico para la síntesis de una variedad suficiente de polipéptidos para una detección eficaz.

También se han descrito y probado otras técnicas. Varios de estos métodos incluyen la síntesis de péptidos sobre 96 agujas ("pin") de plástico que se adaptan al formato de las placas de microtitulación habituales. Desgraciadamente, aunque estas técnicas han sido algo útiles, sigue habiendo problemas sustanciales. Los métodos que utilizan placas de microtitulación habituales continúan estando limitados en la diversidad de secuencias que pueden sintetizarse y seleccionarse. Aunque se reconoce que el uso de placas de microtitulación produce polímeros esencialmente puros porque cada polímero se sintetiza en un pocillo aislado de la placa de microtitulación, el número de polímeros que puede producirse en cualquier momento dado está limitado por el número de pocillos de la placa de microtitulación, es decir, 96. Además, el equipo necesario para la síntesis en las placas de microtitulación es grande. Debido a esta limitación, el uso de placas de microtitulación requiere una gran cantidad de espacio para producir un número relativamente pequeño de péptidos.

Métodos de síntesis electroquímica y matrices porosas para realizar los mismos se describen en las solicitudes de patente de los EE.UU. números de serie 09/003.075 y 09/214.348 y las solicitudes de patente internacional números PCT/US97/11463 y PCT/US99/00599. Tales micromatrices y métodos de síntesis pueden emplearse para sintetizar matrices diseñadas para detectar moléculas de interés en una muestra biológica. Es un objeto de la presente invención proporcionar un método para producir matrices para tal detección y producir matrices diseñadas para detectar moléculas de interés de forma rápida y específica.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la invención muestra un método para fabricar una matriz de autoensamblaje que se forma sobre una membrana porosa que tiene una pluralidad de electrodos próximos a la membrana porosa, comprendiendo el método las etapas de:

a): preparar una o más matrices de oligonucleótidos multiplexadas espacialmente,

b): exponer la matriz de oligonucleótidos a una disolución que contiene al menos una molécula de anticuerpo que comprende un resto de oligonucleótido, que puede unirse a un oligonucleótido de la matriz mediante interacción de hibridación, y

c): eliminar mediante lavado las moléculas de anticuerpo no unidas que comprenden un resto de oligonucleótido, para formar la matriz autoensamblada.

En un segundo aspecto, la presente invención muestra matrices de autoensamblaje preparadas según la presente invención. El producto de los métodos según la presente invención es una matriz de materiales inmovilizados que están multiplexados espacialmente. Tal matriz puede utilizarse para seleccionar materiales por sus propiedades deseables de una manera con rendimiento elevado. Tal matriz también puede utilizarse para detectar la presencia de una o más moléculas en una muestra y, por tanto, proporciona una evaluación de diagnóstico.

Además, se describen métodos para detectar una molécula objetivo en una muestra que comprende la etapa de poner en contacto una muestra biológica con una matriz que comprende moléculas desplegadas de manera multiplexada espacialmente. El método muestra cómo poner en contacto una muestra biológica con una matriz. Preferiblemente, la matriz comprende al menos aproximadamente 1000 moléculas de afinidad codificadas. El método se realiza preferiblemente en condiciones adecuadas para permitir la unión de las moléculas objetivo a los correspondientes ligandos o dominios de unión. Preferiblemente, la detección se realiza utilizando marcadores, que están marcados con fluorescencia, que pueden detectarse mediante dispositivos tales como microscopios de epifluorescencia y una cámara CCD (dispositivo de acoplamiento de carga).

Breve descripción de las figuras

La figura 1 representa un resto a modo de ejemplo que puede autoensamblarse de una manera multiplexada espacialmente cuando se expone a una matriz de afinidad codificada, siendo el ejemplo una sonda de captura de anticuerpo unida a un oligonucleótido.

La figura 2 describe cómo pueden utilizarse matrices preferidas según la presente invención para sintetizar un modelo de moléculas. En primer lugar, la matriz se recubre con una membrana porosa biocompatible que permite que las moléculas fluyan libremente entre un disolvente a granel y un electrodo. La matriz también puede sumergirse en una disolución que contiene un precursor para un reactivo generado electroquímicamente (ECG) de interés. Entonces, puede conectarse un ordenador a la matriz para activar el modelo de electrodo deseado y el precursor puede convertirse electroquímicamente en una especie activa. El reactivo generado electroquímicamente (ECG), a su vez, reacciona con moléculas inmovilizadas en la membrana que recubre el electrodo.

La figura 3 ilustra una característica fundamental de las matrices preferidas según la presente invención, que tienen la capacidad para encerrar los reactivos ECG en una región inmediatamente adyacente a un microelectrodo seleccionado. Aquí, se ha inmovilizado covalentemente un colorante de fluoresceína en localizaciones de microelectrodo dirigidas de manera individual. El colorante puede restringirse estrictamente a un patrón de tablero de ajedrez y no muestra sustancialmente interferencia química entre los microelectrodos activos e inactivos. Este nivel de localización de reactivos ECG puede conseguirse aprovechándose de la química física de la disolución en la que se sumerge la matriz de microelectrodos. Tales disoluciones normalmente contienen tampones y agentes eliminadores que reaccionan con los reactivos ECG. Sin embargo, la tasa a la que se producen los reactivos ECG puede saturar la capacidad de la disolución para reaccionar con ellos en la pequeña zona local próxima al microelectrodo. Como resultado, la química que está mediada por los reactivos ECG se produce cerca de los microelectrodos seleccionados, pero no existe interferencia química.

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la presente invención muestra un método para fabricar una matriz de autoensamblaje que se forma sobre una membrana porosa que tiene una pluralidad de electrodos próximos a la membrana porosa, comprendiendo el método las etapas de:

Estas matrices pueden prepararse, por ejemplo, sintetizando las moléculas in situ utilizando una matriz de electrodo. Otros métodos para preparar matrices multiplexadas espacialmente de moléculas codificadas serán evidentes para un experto en la técnica.

Pueden marcarse químicamente diversos materiales utilizando diversas moléculas que tienen una afinidad específica por diversos sitios espaciales en la matriz de afinidad codificada. Los materiales pueden inmovilizarse de una manera autoorganizadora, sobre diversas localizaciones espaciales, basándose en la afinidad de tales marcadores químicos por la molécula de afinidad codificada en cualquier localización espacial dada. Las moléculas que tienen afinidad codificada son los oligonucleótidos.

La presente solicitud da a conocer matrices de autoensamblaje preparadas según la presente invención. El producto de los métodos según la presente invención es una matriz de materiales inmovilizados que están multiplexados espacialmente. Tal matriz puede utilizarse para seleccionar materiales por sus propiedades deseables de una manera con rendimiento elevado. Tal matriz puede utilizarse para detectar la presencia de una o más moléculas en una muestra y, por tanto, proporciona una evaluación de diagnóstico.

La matriz se forma sobre una membrana porosa próxima a al menos un electrodo. Preferiblemente, la corriente o potencial de electrodo se controla y opera mediante la interfaz con un ordenador, ya esté próximo o alejado del electrodo. La matriz se forma sobre un soporte poroso que tiene una pluralidad de electrodos próximos a la membrana porosa. En realizaciones especialmente preferidas, están presentes en la matriz al menos aproximadamente 100 electrodos y oligonucleótidos. En realizaciones incluso más preferidas, están presentes en la matriz al menos aproximadamente 50 o al menos aproximadamente 1000 electrodos y oligonucleótidos. Se contempla que uno o más de uno de los oligonucleótidos puede estar próximo a cada electrodo.

También se describen métodos para detectar una molécula objetivo en una muestra, que comprenden la etapa de poner en contacto la muestra biológica con una matriz que comprende moléculas desplegadas de manera multiplexada espacialmente. El método muestra la puesta en contacto de una muestra biológica con una matriz. Preferiblemente, la matriz comprende al menos aproximadamente 1000 moléculas de afinidad codificadas. El método se realiza preferiblemente en condiciones adecuadas para permitir la unión de las moléculas objetivo a los correspondientes ligandos o dominios de unión. Preferiblemente, la detección se realiza utilizando marcadores, que están marcados con fluorescencia, que pueden detectarse mediante dispositivos tales como microscopios de epifluorescencia y una cámara CCD.

Definiciones

Tal como se utilizan en el presente documento, se entiende que los siguientes términos expresan los siguientes significados generales:

Una "matriz multiplexada espacialmente" es una matriz que comprende diferentes materiales inmovilizados en diferentes localizaciones espaciales. Como ejemplo, una matriz puede utilizar un sistema de coordenadas rectilíneas en el que cada elemento de una cuadrícula se marca mediante dos variables (x,y). Cada localización espacial separada en este tipo de cuadrícula tiene una única marca de dos variables. Los diferentes materiales pueden inmovilizarse en diferentes localizaciones espaciales tales como una cuadrícula. Cada material inmovilizado puede asociarse con una localización espacial particular en la cuadrícula. Mediante esta definición, estos materiales inmovilizados están "multiplexados espacialmente" en tal sistema de cuadrícula.

El término "afinidad codificada" se refiere a la afinidad química que depende de la secuencia de las unidades monoméricas en una cadena polimérica lineal, semilineal o de ciclo cerrado. A modo de ejemplo, pueden producirse oligonucleótidos que tienen una afinidad de hibridación relativamente grande para una secuencia nucleotídica complementaria.

Matrices

La presente invención muestra el uso de una matriz de electrodo para inmovilizar electroquímicamente una matriz multiplexada espacialmente de anclajes de afinidad sobre una membrana porosa. Según las realizaciones preferidas de los métodos de la presente invención, el anclaje de afinidad y la molécula se unen a la matriz electroquímicamente, de modo que la molécula de anclaje sólo queda unida a la matriz sobre un electrodo activo.

Los métodos de la presente invención se pueden aplicar particularmente para producir matrices de afinidad multiplexadas espacialmente sobre la superficie de las matrices descritas en las patentes de los EE.UU. de números de serie 9/003.075 y 09/214.348. Tales matrices se diseñan para permitir que se sinteticen compuestos químicos tales como péptidos en localizaciones bien definidas y direccionables de manera individual. Tales matrices puede fabricarse a bajo coste mediante fabricantes contratados utilizando instalaciones de fabricación de semiconductores ya existentes. La figura 2 describe cómo puede utilizarse tal matriz para sintetizar un modelo de moléculas. En primer lugar, la matriz puede recubrirse con una membrana porosa biocompatible que permita que las moléculas fluyan libremente entre un disolvente a granel y un electrodo. La matriz puede sumergirse luego en una disolución que contenga un precursor para un reactivo generado electroquímicamente (ECG) de interés. Luego, puede conectarse un ordenador con la matriz para activar el modelo de electrodo deseado y el precursor puede convertirse electroquímicamente en una especie activa. El reactivo generado electroquímicamente (ECG), a su vez, reacciona con moléculas inmovilizadas en la membrana que recubre el electrodo.

Una característica fundamental de estas matrices preferidas es la capacidad para encerrar los reactivos ECG en una región inmediatamente adyacente a un microelectrodo seleccionado. Esto se ilustra en la figura 3. Aquí, se ha inmovilizado covalentemente un colorante de fluoresceína en localizaciones de microelectrodo dirigidas individualmente. El colorante puede restringirse estrictamente a un patrón de tablero de ajedrez y no muestra sustancialmente interferencia química entre los microelectrodos activos e inactivos. Este nivel de localización de reactivos ECG puede conseguirse aprovechándose de la química física de la disolución en la que se sumerge la matriz de microelectrodos. Tales disoluciones normalmente contienen tampones y agentes eliminadores que reaccionan con los reactivos ECG. Sin embargo, la tasa a la que se producen los reactivos ECG puede saturar la capacidad de la disolución para reaccionar con ellos en la pequeña zona local próxima al microelectrodo. Como resultado, la química que está mediada por los reactivos ECG se produce cerca de los microelectrodos seleccionados, pero no existe interferencia química.

En algunas realizaciones, la superficie de estas matrices preferidas puede dotarse de una capa de moléculas espaciadoras ("linker"). Las moléculas espaciadoras permiten la unión indirecta de monómeros o moléculas formadas previamente al sustrato o a una capa que recubre el sustrato. Las moléculas espaciadoras se unen preferiblemente a una capa de recubrimiento a través de enlaces silicio-carbono utilizando, por ejemplo, vidrio de porosidad controlada (CPG) como el material de la capa. Las moléculas espaciadoras también facilitan el reconocimiento objetivo de los polímeros sintetizados. Además, las moléculas espaciadoras se eligen preferiblemente basándose en sus propiedades hidrófilas/hidrófobas para mejorar la presentación de los polímeros sintetizados a ciertos receptores. Por ejemplo, en el caso de un receptor hidrófilo, se preferirán moléculas espaciadoras hidrófilas de modo que permitan que el receptor se aproxime más cerca del polímero sintetizado.

Las moléculas espaciadoras son preferiblemente de longitud suficiente para permitir que los polímeros sobre un sustrato completado interaccionen libremente con entidades de unión expuestas al sustrato. Las moléculas espaciadoras, cuando se utilizan, son preferiblemente de 10 a 1000 átomos de largo, y en realizaciones especialmente preferidas, son de aproximadamente 650 átomos de largo para proporcionar una exposición suficiente de los grupos funcionales a la entidad de unión. Las moléculas espaciadoras, que pueden utilizarse ventajosamente según la invención incluyen, por ejemplo, arilacetileno, oligómeros de etilenglicol que contienen desde 2 hasta 10 unidades monoméricas, diaminas, diácidos, aminoácidos y combinaciones de los mismos. Pueden utilizarse otras moléculas espaciadoras según las diferentes realizaciones de la presente invención y se reconocerán por los expertos en la técnica a la luz de esta descripción.

Según otra realización preferida, las moléculas espaciadoras se dotan de un grupo escindible en una posición intermedia, grupo que puede escindirse con un reactivo generado electroquímicamente. Este grupo se escinde preferiblemente con un reactivo diferente del (de los) reactivo(s) utilizado(s) para eliminar los grupos protectores. Esto permite la retirada de diversos polímeros o secuencias de ácidos nucleicos sintetizados tras la finalización de la síntesis incluyendo: anhídrido acético, n-acetilimidazol, formiato de isopropenilo, fluorescamina, anhídrido 3-nitroftálico y anhídrido 3-sulfopropiónico. De estos, se prefieren anhídrido acético y n-acetilimidazol.

Según otra realización preferida, las moléculas espaciadoras se dotan de un grupo escindible en una posición intermedia, grupo que puede escindirse con un reactivo generado electroquímicamente. Este grupo se escinde preferiblemente con un reactivo diferente del (de los) reactivo(s) utilizado(s) para eliminar los grupos protectores. Esto permite la retirada de diversos polímeros sintetizados tras la finalización de la síntesis por medio de los reactivos generados electroquímicamente. En particular, pueden utilizarse derivados de las moléculas de 4,4'-dimetoxitritilo lábiles en medio ácido con un éster activo exocíclico, según la presente invención. Estas moléculas espaciadoras pueden obtenerse de Perseptive Biosystems, Framingham, Massachusetts. Más preferiblemente, se utiliza 4-[bis(4-metoxifenil)-clorometil]-benzoato de N-succinimidilo como molécula espaciadoras escindible durante la síntesis de ADN. La síntesis y uso de esta molécula se describe en A Versatile Acid-Labile Linker for Modification of Synthetic Biomolecules, por Brian D. Gildea, James M. Coull y Hubert Koester, Tetrahedron Let-ters, Volumen 31, Nº 49, págs. 7095-7098 (1990). Alternativamente, pueden utilizarse otras maneras de escisión en toda la matriz al mismo tiempo, tal como reactivos químicos, luz o calor.

El uso de grupos ligadores escindibles proporciona la disociación o separación de las moléculas sintetizadas, por ejemplo polímeros, de la matriz de electrodo en cualquier momento deseado. Esta disociación permite la transferencia del, por ejemplo, polímero sintetizado, a otra matriz de electrodo o a un segundo sustrato. Obviamente, los expertos en la técnica pueden contemplar varios usos para transferir moléculas sintetizadas sobre el electrodo original a un segundo sustrato.

Las matrices preferidas utilizadas según la presente invención no necesitan ser de ninguna forma específica es decir, los electrodos no necesitan ser de forma de matriz cuadrada. Las geometrías de la matriz de electrodo contempladas incluyen: cuadrados; rectángulos; matrices de malla hexagonal y rectilíneas con cualquier clase de contorno poligonal; geometrías de malla de círculos concéntricos en las que los electrodos forman círculos concéntricos alrededor de un centro común, y que pueden estar delimitadas por un polígono arbitrario; y geometrías de matriz de malla fractal que tienen electrodos con diámetros iguales o diferentes. También pueden utilizarse electrodos entrelazados según la presente invención. Sin embargo, preferiblemente, la matriz de electrodos contiene al menos 100 electrodos en una matriz de al menos 10 x 10. Más preferiblemente, la matriz de electrodos contiene al menos 400 electrodos en, por ejemplo, una matriz de al menos 20 x 20. Incluso más preferiblemente, la matriz contiene al menos 1024 ó 2048 electrodos en, por ejemplo, una matriz de al menos 64 x 32, y todavía más preferiblemente, la matriz contiene al menos 204.800 electrodos en, por ejemplo, una matriz de al menos 640 x 320. Matrices de otros tamaños que pueden utilizarse según la presente invención resultarán rápidamente evidentes para los expertos en la técnica con la revisión de esta descripción.

Las matrices de electrodo que contienen electrodos que oscilan en diámetro desde aproximadamente menos de 1 micra hasta aproximadamente 100 micras (0,1 milímetros) se utilizan ventajosamente según la presente invención. Además, las matrices de electrodo que tienen una distancia de aproximadamente 10-1000 micras de centro a centro de los electrodos, independientemente del diámetro de electrodo, se utilizan ventajosamente según la presente invención. Más preferiblemente, existe una distancia de 50-100 micras entre los centros de dos electrodos vecinos.

Los electrodos pueden estar alineados con la superficie del sustrato. Sin embargo, según una realización preferida de la presente invención, los electrodos tienen forma semiesférica, en lugar de discos planos. Más específicamente, el perfil de los electrodos de forma semiesférica se representa mediante una función arcotangente que parece una semiesfera. Los expertos en la técnica estarán familiarizados con los electrodos de esta forma. Los electrodos con forma semiesférica ayudan a garantizar que el potencial eléctrico es constante a través del perfil radial del electrodo. Es decir, los electrodos con forma semiesférica ayudan a garantizar que el potencial eléctrico no es mayor cerca del borde del electrodo que en el centro del electrodo, garantizando así que se produce la generación de reactivos electroquímicos a la misma tasa en todas las partes del electrodo.

Los electrodos que pueden utilizarse según la invención pueden estar compuestos por, pero sin limitarse a, metales nobles tales como iridio y/o platino, y otros metales tales como paladio, oro, plata, cobre, mercurio, níquel, zinc, titanio, tungsteno, aluminio, así como aleaciones de varios metales, y otros materiales conductores, tales como carbono, incluyendo carbono vítreo, carbono vítreo reticulado, grafito de plano basal, grafito de plano de borde y grafito. También se contemplan óxidos dopados tales como óxido de indio y estaño y semiconductores tales como óxido de silicio y arseniuro de galio. Adicionalmente, los electrodos pueden estar compuestos por polímeros conductores, polímeros dopados con metal, materiales cerámicos conductores y arcillas conductoras. Entre los metales nobles, se prefieren especialmente platino y paladio debido a las ventajosas propiedades asociadas con su capacidad para absorber hidrógeno, es decir, su capacidad para "precargarse" con hidrógeno antes de utilizarse en los métodos de la invención.

Según otras realizaciones preferidas de estas matrices, uno o más de los electrodos están próximos a una estructura de "absorbente" ("getter"). Preferiblemente, la estructura de "absorbente" comprende un segundo electrodo. El segundo electrodo puede ser de cualquier forma o tamaño. Sin embargo, puede funcionar para eliminar los reactivos generados electroquímicamente solo o en combinación con una disolución eliminadora y/o una disolución tampón o puede funcionar para reducir o eliminar la difusión de iones cerca de fuentes eléctricas tales como circuitos de semiconductores. Tales segundos electrodos pueden fabricarse del mismo material que los electrodos seleccionados, tratados anteriormente.

El (los) electrodo(s) utilizado(s) según las matrices pueden conectarse a una fuente eléctrica de cualquier manera conocida. Las formas preferidas de conexión de los electrodos a la fuente eléctrica incluyen circuitos de conmutación de CMOS (semiconductor de óxido metálico complementario), conmutadores direccionables por radiofrecuencia y frecuencia de microondas, conmutadores por luz y la conexión directa de un electrodo a un área de conexión en el perímetro de una pastilla de semiconductor. La colocación de una estructura de "absorbente" según la descripción expuesta anteriormente prolonga eficazmente la vida de una pastilla de semiconductor, haciendo así tal conexión particularmente ventajosa.

Los circuitos de conmutación de CMOS suponen la conexión de cada uno de los electrodos a un conmutador de transistor CMOS. Se accede al conmutador enviando una señal de dirección electrónica bajo un bus común para circuitos de SRAM (memoria estática de acceso aleatorio) asociados con cada electrodo. Cuando el conmutador está "encendido", el electrodo está conectado a una fuente eléctrica. Este es un modo preferido de funcionamiento.

Los conmutadores direccionables por radiofrecuencia y frecuencia de microondas suponen que los electrodos están conmutados mediante una señal de RF o de microondas. Esto permite que los conmutadores estén accionados con y/o sin utilizar lógica de conmutación. Los conmutadores pueden regularse para recibir una frecuencia particular o frecuencia de modulación y conmutar sin lógica de conmutación. Alternativamente, los conmutadores pueden utilizar ambos métodos.

Los conmutadores direccionables por luz se conmutan mediante luz. En este método, los electrodos también pueden conmutarse con y sin lógica de conmutación. La señal luminosa puede localizarse espacialmente para conseguir la conmutación sin lógica de conmutación. Esto se obtiene, por ejemplo, barriendo un rayo láser sobre la matriz de electrodo; conmutándose el electrodo cada vez que el láser lo ilumina. Alternativamente, la matriz completa pueden iluminarse por inundación y la señal luminosa puede modularse temporalmente para generar una señal codificada. Sin embargo, se requiere lógica de conmutación para la iluminación por inundación.

También puede realizarse un tipo de conmutación direccionable por luz de una manera indirecta. En este método, los electrodos se forman de materiales semiconductores. Los electrodos de semiconductor se polarizan entonces por debajo de su tensión umbral. A polarizaciones suficientemente bajas, no se produce ninguna electroquímica debido a que los electrones no tienen suficiente energía para superar la banda prohibida. Los electrodos que están "encendidos" ya se han activado mediante otro método. Cuando los electrodos se iluminen, los electrones adquirirán suficiente energía de la luz para superar la banda prohibida y harán que se produzca electroquímica.

Por tanto, puede colocarse una matriz de electrodos para llevar a cabo la electroquímica siempre que se iluminen. Con este método, la matriz completa puede iluminarse por inundación o cada electrodo puede iluminarse por separado. Esta técnica es útil para la pulsación muy rápida de la electroquímica sin la necesidad de electrónica para conmutación rápida. La conexión directa de un electrodo a un área de conexión en el perímetro de la pastilla de semiconductor es otra posibilidad, aunque este método de conexión podría limitar la densidad de la matriz.

La generación electroquímica del tipo deseado de especies químicas requiere que el potencial eléctrico de cada electrodo tenga un determinado valor mínimo. Es decir, es necesario un determinado potencial mínimo, que puede conseguirse especificando la tensión o la corriente. Por tanto, hay dos maneras de conseguir el potencial mínimo necesario en cada electrodo, o bien puede especificarse la tensión en el valor necesario, o bien puede determinarse la corriente de tal manera que sea suficiente para albergar la tensión necesaria. El valor de potencial mínimo necesario estará determinado por el tipo de reactivo químico elegido para generarse. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la tensión y/o corriente necesaria que va a utilizarse basándose en la especie química deseada. El valor máximo de potencial que puede utilizarse también está determinado por la especie química deseada. Si se supera el valor máximo de potencial asociado con la especie química deseada, pueden producirse consiguientemente especies químicas no deseadas.

Métodos de síntesis

La presente invención, en realizaciones preferidas, muestra la inmovilización electroquímicamente de moléculas de afinidad codificadas a una matriz. Moléculas de afinidad codificadas a modo de ejemplo dentro del alcance de la presente invención son los oligonucleótidos.

Cuando el anclaje de afinidad es un oligonucleótido, la molécula de anclaje de afinidad puede inmovilizarse sobre la matriz utilizando los métodos expuestos en los documentos de los Estados Unidos de números de serie 09/003.075 y 09/214.348. La figura 2 demuestra cómo puede utilizarse una matriz según la presente invención para sintetizar un modelo de moléculas. En primer lugar, la matriz se recubre con una membrana porosa biocompatible que permite que las moléculas fluyan libremente entre el disolvente a granel y el electrodo. La matriz se sumerge entonces en una disolución que contiene un precursor inactivo para el reactivo generado electroquímicamente (ECG) de interés. Entonces, un ordenador activa el modelo de electrodo deseado, y el precursor se convierte electroquímicamente en la especie activa. El reactivo ECG, a su vez, reacciona con las moléculas inmovilizadas en la membrana que recubre el electrodo. Tamponando la disolución apropiadamente, se elimina la difusión del reactivo ECG más allá de la zona del electrodo activo.

El método de la presente invención utiliza preferiblemente un método para la colocación electroquímica de un material en una localización específica sobre un sustrato, tal como se describe en las solicitudes de patente de los Estados Unidos de números de serie 09/003.075 y 09/214.348 y en las solicitudes de patente internacional números PCT/US97/11463 y PCT/US99/00599, que comprende las etapas de: proporcionar un sustrato que tiene en su superficie al menos un electrodo que está próximo a al menos una molécula que es reactiva con un reactivo generado electroquímicamente, aplicar un potencial al electrodo suficiente para generar reactivos electroquímicos que pueden reaccionar con la al menos una molécula próxima al electrodo, y producir una reacción química de ese modo. Tal método permite la producción de una matriz de moléculas de afinidad codificadas tales como oligonucleótidos.

En una realización preferida, la presente invención utiliza un método para la síntesis electroquímica de una matriz de oligonucleótidos formados por separado sobre un sustrato, que comprende las etapas de: colocar una disolución tampón o eliminadora en contacto con una matriz de electrodos que está próxima a una superficie de sustrato, estando próxima dicha superficie a una o más moléculas que llevan al menos un grupo funcional químico protegido unido a las mismas, desproteger selectivamente al menos un grupo funcional químico protegido en al menos una de las moléculas; unir un primer monómero, normalmente un nucleótido que tiene al menos un grupo funcional químico protegido a uno o más grupos químicos funcionales desprotegidos de la molécula; desproteger selectivamente un grupo funcional químico en la molécula unida u otra de las moléculas que llevan al menos un grupo funcional químico protegido; unir un segundo monómero, normalmente un nucleótido que tiene al menos un grupo funcional químico protegido a un grupos químico funcional desprotegido de la molécula unida o de la otra molécula desprotegida; y repetir la desprotección selectiva de un grupo funcional químico en un monómero protegido unido o una molécula protegida unida y la posterior unión de un monómero adicional, normalmente un nucleótido, al grupo funcional químico desprotegido hasta que se formen al menos dos polímeros separados, normalmente oligonucleótidos de la longitud deseada, sobre la superficie del sustrato.

En realizaciones preferidas adicionales, la presente invención utiliza un método para la síntesis electroquímica de una matriz de moléculas de afinidad codificadas que comprende polímeros formados por separado sobre un sustrato, que comprende las etapas de: colocar una disolución tampón o eliminadora en contacto con una matriz de electrodos que está próxima a una superficie de sustrato, estando próxima dicha superficie a una o más moléculas que llevan al menos un grupo funcional químico protegido unido a las mismas, desproteger selectivamente al menos un grupo funcional químico protegido en al menos una de las moléculas; unir un primer monómero que tiene al menos un grupo funcional químico protegido a uno o más grupos químicos funcionales desprotegidos de la molécula; desproteger selectivamente un grupo funcional químico en la molécula unida u otra de las moléculas que llevan al menos un grupo funcional químico protegido; unir un segundo monómero que tiene al menos un grupo funcional químico protegido a un grupo químico funcional desprotegido de la molécula unida o de la otra molécula desprotegida; y repetir la desprotección selectiva de un grupo funcional químico en un monómero protegido unido o una molécula protegida unida y la posterior unión de un monómero adicional al grupo funcional químico desprotegido hasta que se formen al menos dos polímeros separados, normalmente oligonucleótidos de la longitud deseada, sobre la superficie del sustrato. Según la presente invención, el monómero o molécula es normalmente un nucleótido y el polímero es un oligonucleótido.

Utilizando estas técnicas electroquímicas, es posible colocar monómeros, tanto aquellos que pueden utilizarse para la síntesis de polímeros como los que pueden estar decorados, y moléculas formadas previamente en localizaciones conocidas, pequeñas y con precisión sobre un sustrato. Por tanto, es posible sintetizar oligonucleótidos de una secuencia de ácido nucleico conocida en localizaciones seleccionadas sobre un sustrato. Además, es posible sintetizar oligonucleótidos de una secuencia de ácido nucleico conocida en localizaciones preseleccionadas sobre un sustrato, en las que se conocen la localización exacta y las coordenadas conocidas de los polímeros.

Las realizaciones preferidas de los métodos de síntesis descritos en el presente documento, utilizan una disolución tampón o eliminadora en contacto con cada electrodo, que se tampona frente a los reactivos generados electroquímicamente, en particular, frente a los protones y/o iones hidroxilo, y que evita de manera activa la interferencia química producida por la difusión de los iones generados electroquímicamente desde un electrodo hasta otro electrodo en una matriz. Por ejemplo, cuando se polariza un electrodo expuesto a un medio acuoso o parcialmente acuoso hasta un potencial suficientemente positivo (o negativo), se producen protones (o iones hidroxilo) como productos de la hidrólisis del agua. Los protones, por ejemplo, son útiles para eliminar los grupos protectores electroquímicos de varias moléculas útiles en la síntesis combinatoria, por ejemplo, péptidos.

Con el fin de producir péptidos separados y puros, es deseable mantener estos protones (o iones hidroxilo) encerrados en la zona inmediatamente próxima al (los) electrodo(s) seleccionado(s) con el fin de minimizar y, si es posible eliminar, la interferencia química entre electrodos cercanos en una matriz. La extensión espacial del recorrido de los reactivos generados electroquímicamente puede controlarse de manera activa mediante el uso de una disolución tampón o eliminadora que reacciona con los reactivos que se alejan de los electrodos seleccionados, evitando así que estos reactivos reaccionen en un electrodo cercano.

Otra técnica para encerrar estos reactivos generados electroquímicamente en la zona inmediatamente próxima al (los) electrodo(s) seleccionado(s) es colocar una estructura de "absorbente" en las proximidades del (de los) electrodo(s) seleccionado(s) y sustancialmente expuesta al entorno externo. Tal estructura de "absorbente" puede utilizarse junto con o en lugar de una disolución eliminadora. Una estructura de "absorbente" puede diseñarse con cualquier material adecuado y formarse con cualquier forma o tamaño adecuados, tal como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. Los criterios más importantes para tal estructura de "absorbente" es que funcione para eliminar reactivos generados electroquímicamente que pueden difundir fuera del (de los) electrodo(s) seleccionado(s). La estructura de "absorbente" puede funcionar de manera pasiva haciéndola reaccionar químicamente con los reactivos generados electroquímicamente. Alternativamente, la estructura de "absorbente" puede funcionar de manera activa para eliminar los reactivos generados electroquímicamente. Esto puede realizarse aplicando un potencial suficiente a la estructura de "absorbente" para producir la eliminación electroquímica. Otra función de la estructura de "absorbente" puede ser evitar la difusión de iones hacia o al interior de circuitos tales como transistores que pueden estar unidos operativamente al (a los) electrodo(s) seleccionado(s). Según esta función, la estructura de "absorbente" puede colocarse sustancialmente en la superficie de contacto entre un dieléctrico aislante y una capa de metalización unida operativamente al (a los) electrodo(s) seleccionado(s).

Como la molécula de afinidad codificada es un oligonucleótido, el sustrato en la invención está próximo a al menos un electrodo, es decir, una región eléctricamente conductora que está rodeada sustancialmente por una región eléctricamente aislante. El (los) electrodo(s), estando "próximos" al sustrato, puede(n) localizarse en el sustrato, es decir, incluidos en o sobre el sustrato, puede estar cerca de, debajo o por encima del sustrato, pero necesitan estar en una proximidad suficientemente cercana al sustrato, de modo que los reactivos generados electroquímicamente en el (los) electrodo(s) puedan conseguir la desprotección deseada de los grupos químicos funcionales en el (los) monómero(s) y/o molécula(s).

Además de estar próximo a al menos un electrodo, el sustrato tiene sobre una superficie del mismo, al menos una molécula, y preferiblemente varias moléculas, que llevan al menos un grupo funcional químico protegido mediante un grupo protector que puede eliminarse electroquímicamente. Estas moléculas que llevan grupos químicos funcionales protegidos también necesitan estar próximas al (a los) electrodo(s). A este respecto, las moléculas sobre la superficie del sustrato necesitan estar en una proximidad suficientemente cercana al (a los) electrodo(s), de modo que los reactivos electroquímicos generados en el electrodo puedan eliminar el grupo protector de al menos un grupo funcional protegido en la(s) molécula(s) próxima(s).

Las moléculas que llevan un grupo funcional químico protegido que están unidas a la superficie del sustrato pueden seleccionarse generalmente de monómeros, moléculas espaciadoras y moléculas formadas previamente. Preferiblemente, las moléculas unidas a la superficie del sustrato incluyen monómeros, nucleótidos, aminoácidos, péptidos y moléculas espaciadoras. Todas estas moléculas generalmente se unen al sustrato mediante enlaces covalentes o interacciones iónicas. Alternativamente, todas estas moléculas pueden unirse, también mediante enlaces covalentes o interacciones iónicas, a una capa que recubre el sustrato, por ejemplo, una capa de membrana permeable, capa que puede adherirse a la superficie del sustrato de varias maneras diferentes, incluyendo enlaces covalentes, interacciones iónicas, interacciones de dispersión e interacciones hidrófilas o hidrófobas. Todavía en otra manera de unión, un monómero o moléculas formada previamente puede unirse a una molécula espaciadora que se une o al sustrato o a una capa que recubre el sustrato.

Los monómeros, moléculas espaciadoras y moléculas formadas previamente utilizadas en el presente documento, preferiblemente nucleótidos, se dotan preferiblemente con un grupo funcional químico que está protegido mediante un grupo protector que puede eliminarse mediante reactivos generados electroquímicamente. Si no está presente un grupo funcional químico que pueda desprotegerse mediante un reactivo generado electroquímicamente, en la molécula sobre la superficie del sustrato, no puede producirse en esta molécula de la unión de posteriores monómeros o moléculas formadas previamente. Preferiblemente, el grupo protector está en el extremo distal o terminal de la molécula espaciadora, monómero o molécula formada previamente, opuesto al sustrato. Es decir, la molécula espaciadora termina preferiblemente en un grupo funcional químico, que lleva un grupo protector que puede eliminarse electroquímicamente. Los grupos funcionales químicos que se encuentran en los monómeros, moléculas espaciadoras y moléculas formadas previamente incluyen cualquier funcionalidad químicamente reactiva. Normalmente, los grupos funcionales químicos están asociados con los correspondientes grupos protectores y se elegirán o utilizarán basándose en el producto que se esté sintetizando. Las moléculas de la invención se unen a grupos funcionales químicos desprotegidos mediante enlaces covalentes o interacciones iónicas.

Los monómeros, particularmente los oligonucleótidos utilizados según los métodos de la presente invención para sintetizar los diversos polímeros de afinidad codificados, particularmente oligonucleótidos, contemplados para su uso como anclajes de afinidad incluyen todos los miembros de un conjunto de pequeñas moléculas que pueden unirse entre sí para formar un polímero. Los monómeros incluyen cualquier miembro de un conjunto base para la síntesis de un polímero. Pueden utilizarse diferentes conjuntos base en etapas sucesivas en la síntesis de un polímero. El número de monómeros que puede utilizarse según los métodos de síntesis puede variar ampliamente, por ejemplo pueden utilizarse desde 2 hasta varios miles de monómeros, pero en realizaciones más preferidas, el número de monómeros oscilará desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 200, y más preferiblemente, el número de monómeros oscilará desde 4-20.

Además, esencialmente cualquier molécula formada previamente puede servir como molécula de afinidad codificada y puede unirse al sustrato, una capa que recubre el sustrato, un monómero o una molécula espaciadora y sirve como un anclaje de afinidad. Las moléculas formadas previamente incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos. Las moléculas formadas previamente se forman, en general, en un sitio distinto a sobre el sustrato. En una realización preferida, una molécula formada previamente se une a un grupo funcional desprotegido en una molécula, monómero u otra molécula formada previamente. A este respecto, una molécula formada previamente que ya está unida al sustrato puede llevar adicionalmente al menos un grupo funcional químico protegido al que puede unirse un monómero u otra molécula formada previamente, seguido por desprotección del grupo funcional químico.

Los grupos protectores son materiales que se unen a un monómero, una molécula espaciadora o una molécula formada previamente para proteger una funcionalidad reactiva en el monómero, molécula espaciadora o molécula formada previamente, que puede eliminarse con la exposición selectiva a un activador, tal como un reactivo generado electroquímicamente. Los grupos protectores que pueden utilizarse según la presente invención incluyen preferiblemente todos los grupos protectores lábiles en medio ácido y básico. Por ejemplo, los grupos hidroxilo en fosforamiditas pueden protegerse mediante dimetoxitritilo (DMT) que es lábil en medio ácido. Los grupos de amina exocíclica en nucleósidos, en particular en fosforamiditas, se protegen preferiblemente mediante dimetilformamidina en las bases de adenosina y guanosina, e isobutirilo en las bases de citidina, los cuales son ambos grupos protectores lábiles en medio básico. Esta estrategia de protección se conoce como desprotección rápida de oligonucleótidos (FOD). Las fosforamiditas protegidas de esta manera se conocen como fosforamiditas FOD.

Grupos protectores adicionales que pueden utilizarse según la presente invención incluyen grupos lábiles en medio ácido para proteger grupos hidroxilo: dimetiltritilo; y grupos lábiles en medio básico para proteger grupos fosfotriéster: cianoetilo.

Las moléculas de afinidad codificadas de la invención, es decir, los monómeros, moléculas espaciadoras y moléculas formadas previamente, pueden unirse directamente al sustrato o pueden unirse a una capa o membrana de material de separación que recubre el sustrato. Es decir, los anclajes de afinidad de la presente invención pueden unirse a una capa o membrana de material de separación que recubre el sustrato. Los materiales que pueden formar una capa o membrana que recubre el sustrato, de tal manera que las moléculas puedan unirse allí para su modificación por reactivos generados electroquímicamente, incluyen: vidrio de porosidad controlada (CPG); polímeros genéricos, tales como, teflones, nylons, policarbonatos, poliestirenos, polacrilatos, policianoacrilatos, poli(alcoholes vinílicos), poliamidas, poliimidas, polisiloxano, polisiliconas, polinitrilos, polielectrolitos, hidrogeles, polímeros epoxídicos, melaminas, uretanos y copolímeros y mezclas de éstos y otros polímeros; polímeros derivados biológicamente, tales como, polisacáridos, poli(ácidos hialúricos), celulosas y quitonas; materiales cerámicos, tales como, alúmina, óxidos metálicos, arcillas y zeolitas; tensioactivos; tioles; monocapas autoensambladas; carbono poroso y materiales de fullereno. La membrana puede recubrirse sobre el sustrato mediante recubrimiento por rotación, recubrimiento por inmersión o aplicación manual, o cualquier otra forma de recubrimiento aceptable en la técnica.

Los reactivos que pueden generarse electroquímicamente en los electrodos se clasifican en dos clases amplias: oxidantes y reductores. También hay reactivos heterogéneos que son útiles según la invención. Los oxidantes que pueden generarse electroquímicamente incluyen yodo, yodato, ácido peryódico, peróxido de hidrógeno, hipoclorito, metavanadato, bromato, dicromato, cerio (IV) y permanganato. Los reductores que pueden generarse electroquímicamente incluyen cromo (II), ferrocianuro, tioles, tiosulfato, titanio (III), arsénico (III) e hierro (III). Los reactivos heterogéneos incluyen bromo, cloro, protones e iones hidroxilo. Entre los reactivos anteriores, se prefieren los protones, iones hidroxilo, yodo, bromo, cloro y los tioles.

Según realizaciones preferidas de los método de síntesis de moléculas de afinidad codificadas de la presente invención, una disolución tampón y/o eliminadora está en contacto con cada electrodo. Las disoluciones tampón y/o eliminadoras que pueden utilizarse según la invención se tamponan preferiblemente frente a, o eliminan, iones tales como protones y/o iones hidroxilo, aunque se contemplan claramente otros reactivos generados electroquímicamente que pueden tamponarse y/o eliminarse. La disolución tampón funciona para evitar la interferencia química debida a la difusión de los reactivos generados electroquímicamente desde un electrodo en una matriz hasta otro electrodo en la matriz, mientras que una disolución eliminadora funciona para buscar y neutralizar/desactivar los reactivos generados electroquímicamente uniéndose o reaccionando con ellos. Por tanto, la extensión espacial del recorrido de los reactivos generados electroquímicamente puede controlarse de manera activa mediante el uso de una disolución tampón y/o eliminadora. Según la invención, las disoluciones tampón y/o eliminadoras pueden utilizarse independientemente o juntas. Preferiblemente, se utiliza una disolución tampón porque la capacidad de una disolución tampón se mantiene más fácilmente, en comparación con una disolución eliminadora.

Las disoluciones tampón que pueden utilizarse según la presente invención incluyen todas las sales de electrolitos utilizadas en preparaciones acuosas o parcialmente acuosas. Las disoluciones tampón utilizadas preferiblemente según la presente invención incluyen: tampones acetato, que normalmente tamponan alrededor de pH 5; tampones borato, que normalmente tamponan alrededor de pH 8; tampones carbonato, que normalmente tamponan alrededor de pH 9; tampones citrato, que normalmente tamponan alrededor de pH 6; tampones glicina, que normalmente tamponan alrededor de pH 3; tampones HEPES, que normalmente tamponan alrededor de pH 7; tampones MOPS, que normalmente tamponan alrededor de pH 7; tampones fosfato, que normalmente tamponan alrededor de pH 7; tampones TRIS, que normalmente tamponan alrededor de pH 8; y KI 0,1 M en disolución, que tampona la concentración de yodo mediante la reacción de equilibrio I_{2} + I^{-} = I_{3}^{-}, siendo el coeficiente de equilibrio para esta reacción de aproximadamente 10^{-2}.

Alternativamente, o en combinación con una disolución tampón, puede utilizarse una disolución eliminadora que contiene especies tales como aminas terciarias que funcionan como eliminadores de protones o ácidos sulfónicos que funcionan como eliminadores de iones hidroxilo en medios no acuosos. La velocidad a la que se elimina un reactivo/especie depende tanto de la velocidad intrínseca de la reacción que se produce y de la concentración del eliminador. Por ejemplo, los disolventes constituyen buenos eliminadores porque están presentes frecuentemente en altas concentraciones. La mayor parte de las moléculas eliminan de manera no selectiva, sin embargo, algunas moléculas tales como la superóxido dismutasa y la peroxidasa de rábano, eliminan de manera selectiva.

De particular interés para la presente invención son las moléculas eliminadoras que pueden eliminar las diferentes especies reactivas generadas comúnmente, por ejemplo, mediante la hidrólisis del agua en los electrodos, incluyendo radicales hidroxilo, superóxidos, radicales de oxígeno y peróxido de hidrógeno. Los radicales hidroxilo se encuentran entre las moléculas más reactivas conocidas, su velocidad de reacción está controlada por la difusión, es decir, reaccionan con el primer reactivo/especie que se encuentran. Cuando se generan radicales hidroxilo mediante la hidrólisis del agua, la primera molécula que se encuentran normalmente es una molécula de agua. Por este motivo, el agua es un eliminador rápido y efectivo de los radicales hidroxilo. Los superóxidos también son una especie relativamente reactiva, pero pueden ser estables en algunos disolventes no acuosos o parcialmente acuosos. En medios acuosos, los superóxidos reaccionan rápidamente con la mayor parte de moléculas, incluyendo el agua. En muchos disolventes, pueden eliminarse selectivamente con superóxido dismutasa.

Los radicales de oxígeno son una familia de especies de oxígeno que existen como radicales libres. Pueden eliminarse mediante una amplia variedad de moléculas tales como el agua o el ácido ascórbico. El peróxido de hidrógeno es una especie reactiva relativamente débil que es útil, en particular, en la síntesis combinatoria. El peróxido de hidrógeno se elimina con agua y muchos tipos de agentes oxidantes y reductores. La velocidad a la que se elimina el peróxido de hidrógeno depende del potencial redox de las moléculas eliminadoras que se están utilizando. El peróxido de hidrógeno también puede eliminarse selectivamente mediante la peroxidasa de rábano. Otra especie generada electroquímicamente que puede eliminarse es el yodo. El yodo es un reactivo oxidante débil que también es útil para la síntesis combinatoria. El yodo puede eliminarse mediante reacción con iones hidroxilo, para formar iones yoduro e hipoyodito. La velocidad a la que se elimina el yodo depende del pH; las disoluciones de pH superior eliminan yodo más rápidamente. Todas las moléculas eliminadoras tratadas anteriormente pueden utilizarse según la presente invención. Resultarán evidentes para los expertos en la técnica otras moléculas eliminadoras con la revisión de esta descripción.

Según los métodos de síntesis de moléculas de afinidad codificadas de la presente invención, las disoluciones tampón se utilizan preferiblemente en una concentración de al menos 0,01 mM. Más preferiblemente, la disolución tampón está presente en una concentración que oscila desde 1 hasta 100 mM, y todavía más preferiblemente, la disolución tampón está presente en una concentración que oscila desde 10 hasta 100 mM. De la manera más preferida, la concentración de la disolución tampón es de aproximadamente 30 mM. Una concentración de la disolución tampón de aproximadamente 0,1 molar, permitirá que los protones o iones hidroxilo se muevan aproximadamente 100 ángstrom antes de tamponar el pH hasta los valores experimentales. Concentraciones inferiores de la disolución tampón, tales como 0,00001 molar, permitirán un recorrido de los iones de aproximadamente varias micras, que todavía puede ser una distancia aceptable dependiendo de la distancia entre los electrodos en la matriz.

Según los métodos de síntesis de moléculas de afinidad codificadas de la presente invención, la concentración de moléculas eliminadoras en una disolución dependerá de las moléculas eliminadoras específicas utilizadas, ya que diferentes moléculas eliminadoras reaccionan a diferentes velocidades. Cuanto más reactivo es el eliminador, menor es la concentración de la disolución eliminadora que se necesita, y viceversa. Los expertos en la técnica podrán determinar la concentración apropiada de la disolución eliminadora dependiendo del eliminador específico seleccionado.

El al menos un electrodo próximo al sustrato de la invención es preferiblemente una matriz de electrodos. Puede utilizarse una matriz de electrodos de cualquier dimensión, incluyendo matrices que contienen hasta varios millones de electrodos. Preferiblemente, múltiples electrodos en una matriz son simultáneamente direccionables y controlables mediante una fuente eléctrica. Más preferiblemente, cada electrodo es direccionable individualmente y controlable mediante su propia fuente eléctrica, proporcionando así la aplicación selectiva de diferentes potenciales para seleccionar electrodos en la matriz. A este respecto, los electrodos pueden describirse como "conmutables".

Moléculas de afinidad codificadas y moléculas objetivo

Las moléculas de afinidad codificadas a modo de ejemplo dentro del alcance de la presente invención incluyen oligonucleótidos. Una vez que los anclajes de afinidad de la presente invención se localizan en la matriz, preferiblemente mediante inmovilización electroquímica, la matriz puede ponerse en contacto con las moléculas de interés que van a localizarse en la misma.

Cuando la molécula de afinidad codificada es un oligonucleótido, la molécula que va a inmovilizarse se une mediante interacción de hibridación.

Las moléculas que van a inmovilizarse pueden ponerse en contacto con los anclajes de afinidad en condiciones de unión o hibridación adecuadas tal como conocen los expertos en la técnica. Una vez que las moléculas que van a inmovilizarse se han unido a las moléculas de afinidad codificadas, las moléculas no unidas en exceso pueden eliminarse mediante cualquier etapa de lavado conocida por los expertos en la técnica.

Marcadores

Puede añadirse directamente un marcador a la molécula que va a inmovilizarse. Los medios de unión de marcadores a aminoácidos, péptidos y proteínas se conocen bien por los expertos en la técnica. Marcadores detectables para su uso en la presente invención incluyen cualquier composición detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos, de láser o químicos. Marcadores útiles en la presente invención incluyen biotina para tinción con conjugado de estreptavidina marcada, perlas magnéticas (por ejemplo, Dynabeads^{MR}), colorantes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rojo Texas, rodamina, proteína fluorescente verde, etc.), radiomarcadores (por ejemplo, 3H, `251, 35S, 14C, 32P, etc.), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, etc.), y marcadores colorimétricos tales como oro coloidal o vidrio o plástico coloreado (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.), perlas. Se proporcionan usos de tales marcadores, por ejemplo, en las patentes de los EE.UU. números 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241.

Los medios de detección de tales marcadores se conocen bien por los expertos en la técnica. Los radiomarcadores pueden detectarse utilizando película fotográfica o contadores de centelleo, los marcadores fluorescentes pueden detectarse utilizando un fotodetector para detectar la luz emitida. Los marcadores enzimáticos pueden detectarse proporcionando a la enzima un sustrato y detectando el producto de reacción producido por la acción de la enzima sobre el sustrato. Los marcadores colorimétricos pueden detectarse simplemente visualizando el marcador coloreado.

El marcador puede añadirse a la molécula que va a inmovilizarse antes, o después de la unión a las moléculas de afinidad codificadas. Los marcadores directos son marcadores detectables que se unen directamente a o se incorporan en la molécula que va a inmovilizarse antes de la unión a la molécula de afinidad codificada. Los marcadores indirectos pueden unirse al dúplex tras haberse unido la molécula que va a inmovilizarse a la molécula de afinidad codificada. En algunas realizaciones, se une un marcador indirecto a un resto de unión que se ha unido a una molécula que va a inmovilizarse. Por tanto y por ejemplo, la molécula que va a inmovilizarse puede tratarse con biotina antes de la hibridación. Tras la hibridación, un fluoróforo conjugado con avidina se unirá a los dúplex híbridos que llevan biotina proporcionando un marcador que se detecta fácilmente.

En algunas realizaciones, las moléculas que van a inmovilizarse no se marcan en sí mismas. En su lugar, se marcan las moléculas de afinidad codificadas o se unen directa o indirectamente a un resto que responde a una señal. Se conocen métodos para detectar moléculas marcadas que van a inmovilizarse una vez unidas a las moléculas de afinidad codificadas de una matriz de alta densidad por los expertos en la técnica. Puede utilizarse un marcador colorimétrico o una sonda marcada radiactiva.

En algunas realizaciones, las moléculas que van a inmovilizarse se marcan con un marcador fluorescente y la localización del marcador en la matriz puede conseguirse mediante microscopía de fluorescencia. La matriz puede excitarse con una fuente luminosa a la longitud de onda de excitación del marcador fluorescente particular y se detecta la fluorescencia resultante a la longitud de onda de emisión. En una realización particularmente preferida, la fuente luminosa de excitación es un láser apropiado para la excitación del marcador fluorescente. Puede automatizarse un microscopio confocal con una fase controlada por ordenador para barrer automáticamente la matriz. De manera similar, el microscopio puede equiparse con un fototransductor unido a un sistema de adquisición de datos automatizado para registrar automáticamente la señal de fluorescencia producida por la unión a cada molécula de afinidad codificada en la matriz. Tales sistemas automatizados se describen detenidamente en la patente de los EE.UU. número: 5.143.854.

Un experto en la técnica apreciará que los métodos para evaluar los resultados de unión varían con la naturaleza de la molécula de afinidad codificada específica así como los controles proporcionados. En una realización, se determina la simple cuantificación de la intensidad para cada molécula de afinidad codificada. Esto se consigue midiendo la intensidad de la señal de la molécula de afinidad codificada en cada localización que representa un sitio de unión codificado diferente en la matriz. Comparar las intensidades absolutas de una matriz unida a una molécula que va a inmovilizarse de una muestra de prueba con las intensidades producidas por una muestra control, proporciona una medida de la cantidad relativa de la molécula presente.

Las señales pueden variar de intensidad con la afinidad, la cantidad de marcador en la molécula que va a inmovilizarse y la cantidad de la molécula que va a inmovilizarse en la muestra. Normalmente, las moléculas presentes a niveles muy bajos pueden producir una señal muy débil. A ciertos niveles bajos de concentración, la señal puede volverse indistinguible del fondo. Al evaluar los datos, puede seleccionarse un valor de intensidad umbral por debajo del cual no se cuenta una señal ya que es esencialmente indistinguible del fondo. Cuando es deseable detectar moléculas a niveles inferiores, puede elegirse un nivel inferior. Por el contrario, cuando sólo van a evaluarse concentraciones moleculares elevadas, puede seleccionarse un umbral superior. En una realización, el umbral es aproximadamente un 10% superior a la señal de fondo promedio. Además, la provisión de los controles apropiados permite un análisis más detallado que controla las variaciones en las condiciones. Por tanto y por ejemplo, en una realización preferida, la matriz de afinidad codificada multiplexada espacialmente se dota con controles de normalización. Cuando las condiciones de unión sean malas, los controles de normalización mostrarán una señal más pequeña, y cuando las condiciones de unión sean buenas, los controles de normalización mostrarán una señal mayor. La normalización de la señal derivada de otras sondas en la matriz con respecto a los controles de normalización proporciona así un control de las variaciones de las condiciones de unión. Normalmente, la normalización se obtiene dividiendo la señal medida procedente de otras sondas en la matriz entre la señal promedio producida por los controles de normalización. La normalización también incluye una corrección para las variaciones debidas a la amplificación y la preparación de la muestra. Tal normalización puede obtenerse dividiendo la señal medida entre la señal promedio procedente de las sondas de control de amplificación/preparación de la muestra. Los valores resultantes pueden multiplicarse por un valor constante para ampliar a escala los resultados.

La concentración de una molécula particular puede determinarse entonces midiendo la intensidad de la señal de cada una de las moléculas de afinidad codificadas que se unen específicamente a la molécula objetivo y normalizando con respecto a los controles de normalización.

Los métodos de la presente invención se realizan preferiblemente utilizando un ordenador. El ordenador ejecuta un programa de software que incluye un código informático que incorpora la invención para analizar las intensidades de unión medidas a partir de un sustrato y monitorizar y/o cuantificar la concentración de una o más moléculas objetivo que van a inmovilizarse.

Claims

1. Método para fabricar una matriz de autoensamblaje que se forma sobre una membrana porosa que tiene una pluralidad de electrodos próximos a la membrana porosa, comprendiendo el método las etapas de:

(a) preparar una o más matrices de oligonucleótidos multiplexadas espacialmente,

(b) exponer la matriz de oligonucleótidos a una disolución que contiene al menos una molécula de anticuerpo que comprende un resto de oligonucleótido, que puede unirse a un oligonucleótido de la matriz mediante interacción de hibridación, y

(c) eliminar mediante lavado las moléculas de anticuerpo no unidas que comprenden un resto de oligonucleótido, para formar la matriz autoensamblada.

2. Matriz de autoensamblaje, formada sobre una membrana porosa que tiene una pluralidad de electrodos próximos a la membrana porosa, que comprende una o más matrices de oligonucleótidos multiplexadas espacialmente, unidas a la membrana porosa, y al menos una molécula de anticuerpo que comprende un resto de oligonucleótido, unida por interacción de hibridación a un oligonucleótido de la matriz.