ES2244046T3 - Facilitacion de la reparacion de lesiones neuronales con toxina cm101/gbs. - Google Patents
Facilitacion de la reparacion de lesiones neuronales con toxina cm101/gbs.Info
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Abstract
Las lesiones neuronales pueden tratarse de forma ventajosa con CM101, una toxina polisacárido aislada a partir de la bacteria Streptococcus Beta-hemolítica del grupo (B). El tratamiento con CM101 ayuda al restablecimiento de la conectividad neuronal, inhibe al menos parcialmente la formación de cicatrices e incrementa la probabilidad de supervivencia durante el período crítico que sigue a las lesiones del sistema nervioso central. Las lesiones neuronales preexistentes que tienen tejido cicatricial se mejoran excindiendo quirúrgicamente el tejido cicatricial y efectuando una administración conjunta de CM101.
Description
Facilitación de la reparación de lesiones
neuronales con toxina CM101/GBS.
Esta invención se refiere a la manufactura de un
medicamento útil en una terapia para incrementar la reparación de
una lesión neural en el sistema nervioso central o en el sistema
nervioso periférico.
Una lesión neural causada por un traumatismo
físico, isquemia o enfermedad puede dar lugar a una fuerte
discapacidad o a la muerte. Dichas discapacidades, que pueden ser
físicas y/o mentales, incluyen la pérdida de movilidad, una
alteración de la percepción sensorial, una pérdida de funciones
cognitivas, crisis epilépticas y trastornos emocionales y de la
personalidad. Dada la incidencia de muerte y la prevalencia y
posible gravedad de las discapacidades de los supervivientes, la
lesión neural es una pesada carga para los individuos y la sociedad.
En concordancia, existe la necesidad de tratamientos que faciliten
la reparación de los nervios y vías neuronales dañados. En la
actualidad, no hay un tratamiento eficaz para las lesiones del
sistema nervioso central (SNC).
Un traumatismo físico cerebral, la compresión o
la transección de la espina dorsal, una isquemia o cirugía causan
hipoxia, lo que inicia una cascada de eventos moleculares que
conducen a la lesión neural (Liu, X.Z. y col., Neuronal and glial
apoptosis after traumatic spinal cord injury, J. Nerurosci.,
17:5395-5406 (1997); Olsson, Y., y col., Release of
endogenous neurochemicals may increase vascular permeability, induce
edema and influence cell changes in trauma to the spinal cord,
Progress in Brain Res., 91: 197-203 (1992), Crowe,
M.J. y col., Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord
injury in rats and monkeys, Nature Med., 3: 73-76
(1997)). Pese a recibir atención médica, muchos pacientes mueren en
los primeros días tras una lesión grave del SNC. Para aquellos
pacientes que sobreviven a sus lesiones, el pronóstico depende de la
capacidad de las neuronas restantes a adaptarse a nuevas funciones,
ya que, con la tecnología actual, la conectividad neuronal
raramente se restablece. Debido a que la adaptación neural es lenta
y frecuentemente incompleta, el beneficio potencial de un
tratamiento que facilite la reparación neural y el restablecimiento
de la conectividad neuronal sería tremendo, como lo sería el
beneficio proporcionado por un tratamiento que redujera la
probabilidad de que un paciente muriera durante el periodo crítico
posterior a la
lesión.
lesión.
Las neuronas en el sistema nervioso periférico
pueden regenerarse y reinervar sus dianas. Sin embargo, el tejido
cicatrizado que se forma como resultado de la lesión puede obstruir
el crecimiento de los nervios periféricos en regeneración e
interferir en la recuperación de la función neural. Debido a que la
reparación de la lesión neural puede ser facilitada mediante la
inhibición de la formación de cicatriz existe la necesidad de un
tratamiento para minimizar la formación de cicatrices en el sistema
nervioso periférico.
La regeneración de los nervios en el SNC de los
mamíferos es más limitada. Hasta ahora se pensaba que la
regeneración neural era prácticamente imposible en el SNC del
mamífero adulto (Snell, L. And Schwab, M. E., Sprouting and
regeneration of lesioned cortical spinal tract fibers in the adult
rat spinal cord, Eur. J. Neurosci., 5: 1156-1161
(1993); Chen, H. y col., Spinal cord repair in adult paraplegic
rats: partial restoration of hind limb function, Science,
273:510-513 (1996); Young, W., Spinal cord
regeneration, Science, 273:451 (1996); Olson L., Regeneration in the
adult central nervous system: Experimental repair strategies, Nature
Med., 3(12):1329-1335 (1997); Li, Y., y col.,
Repair of adult rat cortical spinal tract by transplant of olfactory
and ensheathing cells, Science,277:2000-2002
(1997)). Puesto que las neuronas adultas del SNC de mamíferos han
mostrado ser capaces de crecer y desarrollar conexiones sinápticas
cuando se sitúan en una localización diferente, se ha hipotetizado
que el SNC contiene inhibidores de la regeneración neuronal. El
crecimiento neuronal en el SNC puede también retardarse por la
gliosis, un proceso en el que se forman cicatrices gliales en el
sistema nervioso en curación como resultado de la proliferación de
astrocitos y microglías y de la infiltración de macrófagos. La
epilepsia postraumática que puede surgir varios años después del
trauma cerebral, también se asocia con cicatrices gliales
cerebromeníngeas (McNamara, J.O., Cellular and molecular basis of
epilepsia, J. Neurosci., 14:3413-3416 (1994)).
Puesto que la minimización de la gliosis puede facilitar tanto la
regeneración neuronal como disminuir la probabilidad de una
epilepsia posttraumática, existe la necesidad de tratamientos que
inhiban la gliosis.
La incapacidad de las personas con lesión del
SNC, particularmente lesiones de médula espinal, para recuperar la
función neural, se debe al menos parcialmente a la interferencia
estérica causada por la gliosis y la consiguiente formación de
cicatriz. Existe la necesidad de un tratamiento que facilite la
reparación de las lesiones de SNC mediante la minimización de la
gliosis y la cicatrización. La necesidad es particularmente
importante para un tratamiento que, junto a facilitar la reparación
de lesiones neurales recientes, pueda facilitar la restauración de
la función neural en personas con una lesión neural
preexistente.
\newpage
La presente invención permite un procedimiento
para el tratamiento de la lesión neural mediante la administración
de la toxina GBS, un polisacárido no tóxico derivado de la bacteria
Streptococcus \beta-hemolítico del grupo
B.
Un aspecto de la presente invención es el uso de
la toxina del Streptococcus
\beta-hemolítico del grupo B (GBS) en la
fabricación de un medicamento para ayudar al restablecimiento de la
conectividad neuronal en un paciente con lesión neural. La presente
invención demuestra que la administración de la toxina GBS facilita
un aumento de la transferencia de impulsos eléctricos a través de la
zona de daño neural. El aumento de la conectividad neuronal causado
por la toxina GBS es funcionalmente significativa: los animales
tratados con toxina GBS recuperan la capacidad de caminar en los
primeros días tras la lesión neuronal, mientras que los animales no
tratados con lesiones idénticas permanecen paralizados.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de la toxina del Streptococcus
\beta-hemolítico del grupo B (GBS) en la
fabricación de un medicamento para inhibir, al menos parcialmente,
la formación de cicatriz en pacientes con lesión neuronal. La
minimización de la fomación de cicatrices permite una recuperación
de la conectividad neuronal más completa. Además, mediante la
reducción de la gliosis, la administración de la toxina GBS a
pacientes con trauma cerebral reduce la probabilidad de epilepsia
postraumática y de otras complicaciones.
Un tercer aspecto de la invención es el uso de la
toxina del Streptococcus \beta-hemolítico
del grupo B (GBS) en la fabricación de un medicamento que aumente la
probabilidad de supervivencia del paciente tras una lesión del
SNC.
Un cuarto aspecto de la invención es el uso de la
toxina del Streptococcus \beta-hemolítico
del grupo B (GBS) en la fabricación de un medicamento que minimice
la formación de nuevas cicatrices tras la extirpación quirúrgica de
un tejido cicatrizado existente asociado a una lesión neural
preexistente. El tratamiento debe incluir el transplante de células
progenitoras neurales en la proximidad de la región a extirpar. El
medicamento debe incluir un compuesto que promueva la regeneración
neural, p.ej., IGF1, bFGF, TGF\betaS, BDNF, NT-3 o
CNTF.
Se describe también un artículo de fabricación
que incluye la toxina GBS, y particularmente CM101, junto con
instrucciones para el tratamiento, y un procedimiento para fabricar
el artículo. La toxina GBS puede usarse para mejorar la calidad del
proceso de reparación en el SNC y el sistema nervioso
periférico.
La Figura 1 muestra el resultado de experimentos
electrofisiológicos sobre SNC aislados con lesiones de médula
espinal por aplastamiento. La Figura 1A esquematiza el sistema de
dos microelectrodos usado en los experimentos: el microelectrodo de
la izquierda de la zona de aplastamiento lanza un solo pulso
eléctrico (flecha) y el microelectrodo de la derecha graba los
cambios en el potencial de membrana inducidos por el pulso. Los
experimentos se realizaron un día (B y C) y 5 días (D y E) después
de la lesión sobre SNCs lesionados sin tratamiento (B y D) y SNCs
lesionados que fueron tratados con 0.3 \mug/ml de CM101 (C y E).
Las calibraciones a la derecha se aplican en todo el
estudio.
estudio.
La Figura 2 representa la recuperación de la
función de la extremidad trasera en ratones monoplégicos (A), o
paraplégicos (B), respecto a grupos control (cuadrados huecos),
CM101 30 g/Kg (triángulo relleno) y CM101 60 g/Kg (círculo relleno).
Se muestran los valores medios del test de caminar en campo abierto
de cada ratón en el eje de Y, y en el eje de X se indica el día en
que se tomaron las medidas, en donde el día 0 es el día de la
cirugía. Los valores se generaron a partir del miembro paralizado en
los animales monoplégicos (A). En los animales paraplégicos (B), los
valores individuales para cada animal se calcularon haciendo la
media de los valores de cada extremidad trasera.
La Figura 3 muestra los efectos de pulsos de 3
segundos de GABA 10 M (líneas horizontales por debajo de lectura)
sobre el potencial de membrana de neuronas de médula espinal de
ratón en cultivo (A, D, G), neuronas lesionadas tratadas con 0,3
g/ml de CM101 (B, E, H), y neuronas lesionadas sin tratar (C, F, I).
Los pulsos de GABA se aplicaron 6 horas (A, B, C), dos días (D, E,
F), y cinco días (G, H, I) tras la lesión. Las calibraciones de la
derecha se aplicaron en todo el estudio.
El CM101, una toxina GBS, es una molécula
polisacárida aislada del Streptococcus
\beta-hemolítico del grupo B. Específicamente, el
Streptococcus \beta-hemolítico del grupo B
patogénico produce una exotoxina polisacárida. Esta exotoxina es el
agente putativo para la aparición temprana de la enfermedad en
neonatos humanos. Se cree que existen receptores para el CM101
principalmente en los pulmones de recién nacidos, haciéndolos
susceptibles al comienzo temprano de la enfermedad pero que los
receptores se pierden aproximadamente de cuatro a siete días después
del nacimiento. Por tanto, la presente invención se refiere en
general al tratamiento de pacientes que al menos tienen 7 días de
edad.
El CM101 aislado y purificado muestra tener
efectos tóxicos en el modelo experimental de oveja que imita la
neumonía infantil por GBS. (Hellerqvist, C. G. y col., Studies on
group B -hemolytic Streptococcus I. Isolation and partial
characterization of an extra-cellular toxin.,
Pediatr. Res., 12:892-898 (1981)). En el modelo de
oveja para el estudio de la aparición temprana de la enfermedad, la
toxina GBS causa hipertensión pulmonar, aumento de la permeabilidad
vascular pulmonar, granulocitopenia, y secuestro pulmonar de
granulocitos.
El CM101 tiene un peso molecular de
aproximadamente 300000 Daltons y comprende residuos de
N-acetil galactosamina, N-acetil
glucosamina, glucosa, galactosa y manosa. Se cree también que los
residuos de ácido carboxílico constituyen parte integrante de la
molécula. En la respuesta patofisiológica al CM101 parecen jugar un
papel importante los epitopos activos repetitivos mediante la unión
covalente de los receptores al endotelio diana. (Hellerqvist, C.G. y
col., Early Results of a Phase I Trial of CM101 in Cancer Patients.
Proceedings of the American Association of Cancer Research Annual
Meeting (1995)).
La patente americana US 5010062 proporciona un
procedimiento de purificación de una toxina GBS. Preferentemente,
sin embargo, el CM101 se purifica según el procedimiento mostrado en
la Solicitud de Patente Internacional PCT/US97/17535.
Una fuente de material de partida de GBS para ser
usado en el procedimiento de la presente invención puede obtenerse
cultivando cepas de la bacteria Streptococcus
\beta-hemolítico del grupo B que recientemente
hayan infectado o sean capaces de infectar niños recién nacidos. Los
aislados de dichas cepas pueden obtenerse de la sangre o del fluido
cerebroespinal de niños infectados.
Sin limitarse a una teoría en particular, se cree
que la toxina GBS, y específicamente el CM101, juega un papel
importante en el tratamiento de la lesión neural porque facilita la
regeneración de la conectividad neuronal a través de la inhibición
de la proliferación de las células gliales. Es sabido que el trauma
del SNC causa hipoxia (Liu y col., 1997), y ésta produce la
liberación del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF).
El VEGF estimula las células endoteliales a diferenciarse y empezar
a formar nueva vasculatura. La vasculatura formada de nuevo facilita
la proliferación de células gliales que dan lugar a las cicatrices
que físicamente interfieren con la nueva formación de contactos
neurales. El tratamiento con CM101 dificulta la proliferación de
células gliales, disminuyendo de ese modo la gliosis (la formación
de cicatrices en el SNC en curación). El impedimento sobre la
proliferación de células gliales causado por el CM101 es indirecto y
ocurre a través de la unión del CM101 a células endoteliales
angiogénicas desdiferenciadas, marcándolas para su destrucción a
través del complemento y mediante la disminución de la transcripción
de VEGF (Wamil, B.D. y col., CM101 inhibits VEGF induced tumor
neovascularization as determined by MRI and RT-PCR,
AACR Proceedings, 38:327 (1997)). Puesto que las cicatrices gliales
interfieren estéricamente con la reconexión neuronal de los axones
dañados, el tratamiento con CM101 fomenta el reestablecimiento de
la conectividad neuronal y permite la recuperación de la función de
órganos vitales así como la función motora y sensorial.
La presente invención es útil para tratar
lesiones del sistema nervioso central y periférico. Facilita el
restablecimiento de la conectividad neuronal postlesión mediante la
inhibición de la formación de la cicatriz y mediante el aumento de
la regeneración neuronal. Junto al tratamiento de pacientes con
trauma, cirugía e isquemia en los minutos u horas que preceden o que
siguen a la producción de la lesión, el CM101 encuentra uso en
pacientes con lesiones neurales preexistentes, lesiones con más de
dos semanas. Estos pacientes reciben CM101 para inhibir la formación
de nuevas cicatrices tras la extirpación microquirúrgica de tejido
cicatrizado ya existente. Estos pacientes pueden recibir infusiones
de factores de crecimiento del tejido nervioso tales como
IGF-1, bFGF o TGF S (Houle J. y col., Axonal
regeneration by chronically injured supraspinal neurons can be
enhanced by exposure to insulin-like growth factor,
basic fibroblast growth factor or transforming growth factor beta,
Restorative Neurol. Neurosci., 10(4):205-215
(1996)), o BDNF, NT-3 (Grill, R. y col., Cellular
delivery of neurorophin-3 promotes corticospinal
axonal growth and partial functional recovery after spinal cord
injury, J. Neurosci., 17:5560-5572 (1997)), CNTF
(Ye, J-H. And Houle, J., Treatment of the
chronically injured spinal cord with neurotrophic factors can
promote axonal regenration from supraspinal neurons, Exp. Neurol.,
143(1):70-81 (1997); Grill y col., 1997) o
transplantes de celulas progenitoras neurales (Lundberg, C. Y col .,
Conditionally immortalized neural progenitor cell lines integrate
and differentiate after grafting to the adult rat striatum: A
combined autoradiographic and electron microscopic study, Brain
Res., 737(1-2):295-300
(1996)) para aumentar la regeneración neuronal en el lugar de la
extirpación. En pacientes con trauma cerebral, el tratamiento con
CM101 disminuye la probabilidad de epilepsia posttraumática asociada
con la cicatrización cerebromeníngea.
Puesto que el CM101 produce la reparación
neuronal y facilita el restablecimiento de la conectividad neuronal,
éste proporciona un procedimiento para el tratamiento de personas
con enfermedades caracterizadas por degeneración neuronal o
deficiencias de la conectividad neuronal. Estas enfermedades
incluyen la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Picks, la
enfermedad de Parkinson, la degeneración estriatonigral, el síndrome
Shy-Drager, el síndrome
Hallevorden-Spatz, la parálisis supranuclear
progresiva, la atrofia olivopontocerebelar, la ataxia de Friedreich,
la ataxia telangiectasia, la esclerosis amiotrófica lateral, la
esclerosis lateral primaria, la atrofia muscular progresiva, la
parálisis bulbar progresiva, la parálisis pseudobulbar, la
enfermedad de Werdning-Hoffman, el síndrome de
Kugelberg-Welander, la esclerosis múltiple y las
encefalomielitis perivenosas. El beneficio del aumento de la
reparación neuronal por el CM101 en pacientes que sufren este tipo
de enfermedades es apreacible.
Uno de los procedimientos para determinar el
efecto del CM101 sobre la reparación neuronal es un ensayo in
vitro de la alteración del potencial de membrana neuronal
causada por GABA. Este ensayo se basa en la observación de que
aunque las neuronas sanas hiperpolarizan cuando se exponen al GABA,
las neuronas que tienen una lesión no reparada despolarizan cuando
se aplica el GABA. Puesto que la amplitud de la despolarización
refleja la severidad de la lesión neuronal, la respuesta al GABA a
lo largo del tiempo proporciona una medida de la cinética de la
reparación y la expansión neuronal. Este ensayo demuestra que el
CM101 aumenta la regeneración neuronal. El ensayo GABA tiene
utilidad para analizar la capacidad de otros compuestos de afectar
positiva o negativamente la recuperación de la lesión neuronal.
La toxina GBS tal y como se utiliza aquí se
define como cualquier fracción o componente aislado de una bacteria
GBS natural o lisada, o derivada de los sobrenadantes del medio de
bacterias GBS lisadas y/o autoclavadas, que además tiene una
actividad biológica como se evidencia por la inducción de dificultad
respiratoria en el modelo experimental en ovejas (Hellerqvist, C.G.
y col., Studies on group B -hemolytic Streptococcus I.
Isolation and partial characterization of an extracellular toxin.,
Pediatr. Res., 2:892-898 (1981)) o la activación del
complemento y la unión a la vasculatura como se demuestra mediante
un ensayo de peroxidasa-antiperoxidasa (PAP) de un
especimen de tejido tumoral (Hellerqvist, C.G. y col.,
Anti-tumor effects of GBS toxin: a polysaccharide
exotoxin from group B -hemolytic Streptococcus, J. Canc Res.
Clin. Oncol., 120:63-70 (1993); and Hellervist, C.
G. y col., Early Results of a Phase I Trial of CM101 in Cancer
patients. Proceedings of the American Association of Cancer Research
Annual Meeting (1995)). La toxina GBS se refiere también a cualquier
polisacárido sintético con la misma estructura o función como
cualquier molécula derivada del GBS con la actividad mencionada.
Una toxina GBS esencialmente pura quiere decir
aquella preparación en la que la toxina GBS se encuentra en más de
un 40% pura (p.ej., presente en una concentración de al menos un 40%
en peso) preferentemente al menos aproximadamente un 60% pura, más
preferentemente al menos aproximadamente un 90% pura, y más
preferentemente al menos aproximadamente un 95% pura. Dosis de menos
pureza en toxina GBS deben ser alteradas en concordancia. La pureza
de la toxina GBS se discute en mayor detalle en la Aplicación
Internacional PCT/US97/17535.
El CM101 o cualquier otra toxina GBS se combina
preferentemente con un vehículo farmacéuticamente aceptable y se
administra sistémicamente a un paciente. El vehículo preferentemente
es aquel que pueda mezclarse fácilmente con el CM101 para formar una
composición que sea administrable por vía intravenosa (i.v.). Por
tanto, el vehículo preferentemente es salino, el cual puede tener
otros excipientes farmaceuticamente aceptables incluidos para
asegurar su idoneidad para la administración intravenosa. La
composición resultante deberá ser estéril y deberá tener propiedades
osmóticas aceptables. En general, una formulación i.v. adecuada se
prepara de acuerdo con técnicas estandáres conocidas en el área. Por
ejemplo, el capítulo 85 titulado "Intravenous Admixtures" por
Salvatore J. Turco en la edición número 18 de Remigton's
Pharmaceutical Sciences, Mach Publishing Co. (1990), proporciona
técnicas estándares para la preparación de una composición IV
farmacéuticamente aceptable útil para esta invención. También pueden
utilizarse otras formas de administración para administrar el CM101.
Éstas deben estar indicadas para la administración intraarterial o
intratecal. Como alterantiva a la administración sistémica, el CM101
puede administrarse localmente. La administración de CM101 al
paciente puede ocurrir antes, durante y o después de la producción
de la lesión neural. Preferentemente, el CM101 se administra dentro
de una ventana temporal apropiada tras la lesión. Se prefiere la
administración de CM101 poco después de la lesión. Por ejemplo, la
administración dentro del día o preferentemente dentro de las seis
primeras horas es lo mejor. La administración de CM101 poco después
de la lesión del SNC es necesaria para aumentar la probabilidad (en
relación a pacientes con lesiones similares pero que no reciben
CM101) de que el paciente sobrevivirá los primeros días siguientes a
la lesión. Mientras la duración de este "periodo crítico
postlesión" varía en función del tipo y la magnitud de la lesión,
la supervivencia a las 72, 98 y 120 horas tras la lesión son hitos
significativos.
La cantidad de CM101 que se administra a un
paciente es aquella que resulta suficiente para ayudar al
restablecimiento de la conectividad neuronal y para minimizar la
cicatrización. Un rango preferente de dosis se sitúa entre 1 a 100
g/Kg de peso corporal. Un rango más preferible, sin embargo está
entre 1 g/Kg y 50 g/Kg de peso corporal, y una dosis más preferida
está en el rango de 1 g/Kg a 25 g/Kg. Debe entenderse, sin embargo,
que el nivel de dosis específico para cualquier paciente en
particular dependerá de una variedad de factores incluyendo la edad,
el peso corporal, el estado de salud general, el sexo, la dieta, y
la gravedad de la lesión neural. La cantidad debe seleccionarse de
forma que sea suficiente como para inhibir la gliosis, al menos
parcialmente. Esto debe minimizar el riesgo de epilepsia
postraumática. Cada dosis se administra preferentemente en una
infusión de hasta 120 minutos, con un rango preferible de duración
entre 5 y 60 minutos, siendo el rango más preferido entre 5 y 30
minutos. Se prefiere que el tratamiento se realice una vez a la
semana lo que debe ser suficiente para tener resultados
evidentes.
Una lesión neural se produce cuando una porción
de una neurona o nervio, un haz de fibras o procesos es perforado,
desgarrado, cortado, aplastado, magullado o sea como fuere
incapacitado para transmitir o recibir señales electroquímicas. El
reestablecimiento de la conectividad neuronal implica la formación
de nuevo de una estructura sináptica normal o la reanudación de una
función sináptica normal. Esto puede ser analizado mediante un
examen neurológico, procedimientos de diagnóstico neurológicos tales
como una electroencefalografía, una resonancia magnética y escaner
CT o registros electrofisiológicos o visualización sináptica.
Otro aspecto de la presente invención es un
artículo de fabricación, como un equipo reactivo, y todo aquel
procedimiento para hacer dicho artículo o manufactura. El artículo
incluye una composición farmacéutica que engloba una toxina GBS, y
particularmente CM101, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La
composición farmacéutica puede colocarse en un recipiente adecuado,
tal y como se conoce en la materia. También se incluyen
instrucciones para el tratamiento de pacientes según los
procedimientos de la presente invención.
La invención que hasta ahora se ha descrito de
forma general puede entenderse mejor haciendo referencia a los
siguientes ejemplos no limitantes, los cuales se presentan
únicamente a modo ilustrativo.
Ejemplo
1
Los efectos del CM101 sobre el reestablecimiento
de la conectividad neuronal y la readquisición de la función neural
se investigaron en sistemas nerviosos centrales aislados que han
sufrido un traumatismo.
Se prepararon cultivos de SNC aislados según
modificaciones de procedimientos publicados (Nicholls y col., 1990;
Stewart y col., 1991). El cerebro y la médula espinal con las raíces
ventrales y dorsales adheridas se diseccionaron de embriones de
ratón E5 (día 5 de gestación), y se indujo la lesión en la médula
espinal mediante una contusión suave con pinzas quirúrgicas. Se
incubaron preparaciones del SNC lesionado a temperatura ambiente
23-25ºC durante 5-7 días. (Stewart y
col ., 1991; Mollgard y col., 1994). El medio de cultivo fue
Eagles's Minimal Essential Medium (MEM) que contenía un 0,2% de
suero fetal bovino (GIBCO), 30 ng/ml de NGF 7s (Sigma), 10 g/ml de
insulina y 0,1 mg/ml de sulfato de gentamicina.El pH del medio de
cultivo fue de 7,4 después de equilibrarse mediante una atmosfera
con un 5% de CO_{2} en el incubador. El medio se cambiaba 3 veces
a la semana. Al medio de cultivo de un grupo de SNSs aislados
lesionados (n=6) se añadió 0,3 g/ml de CM101. Un grupo control de
SNCs aislados (n=4), no se les practicó la lesión, pero por lo demás
fueron cultivados de forma idéntica al grupo no tratado.
Al cabo de un día y de cinco días en cultivo, se
realizaron experimentos electrofisiológicos para analizar la
conectividad sináptica en el sitio de aplastamiento de la médula
espinal. Para aquellos SNCs aislados y lesionados que recibieron
CM101 durante el cultivo, siempre se trabajó con 0,3 g/ml de CM101
durante los experimentos electrofisiológicos. Los experimentos, que
se realizaron a 37ºC, utilizaron la técnica de registro con
microelectrodo intracelular dual (Wamil y col., 1994; Sotelo and
Alvarado-Mallart, 1991). Se implantó un
microelectrodo en el tejido, a cada lado de la lesion de la médula
espinal (Fig. 1A). Un experimento consistió en un microelectrodo que
dispara un solo pulso eléctrico (Fig. 1E; cabeza de flecha) y el
otro microlectrodo registra cualquier despolarización resultante o
emisión de potenciales de acción en el otro lado de la lesión.
En los días 1,2,3,4,5,10 y 16 se recogió el
tejido del SNC aislado para realizar un examen histológico de los
axones reconectados en segmentos adyacentes de médula espinal.
En SNCs aislados lesionados tras un día en
cultivo, un pulso de estimulación (500 ms, 2-8 nA)
produjo una breve respuesta de despolarización y pocos, si es que
hubo alguno, potenciales de acción (Fig 1B). La latencia de esta
respuesta fue de 4-20 s. En comparación cultivos de
SNC control tuvieron un periodo de latencia de 0,5-3
ms (no se muestra). Cuando los SNCs aislados y lesionados tratados
con CM101 se estimularon con un pulso de 500 ms y
2-8 nA, se observó una respuesta de despolarización
breve y potenciales de acción raros o ausentes (Fig 1C). La latencia
de esta respuesta fue de 10-20 s. Estos resultados
muestran que tanto los SNCs tratados con CM101 como los no tratados
han restablecido algunas conexiones neuronales a lo largo del sitio
de aplastamiento. No se observaron diferencias significativas entre
los SNCs tratados y no tratados tras un día de tratamiento con
CM101.
Cinco días tras la lesión, una estimulación
similar en SNCs aislados y lesionados no tratados producían
amplitudes de despolarización mayores, más duración de la respuesta
y emisiones de potenciales de acción más intensos sin potenciales
postsinápticos que los observados previamente (comparar Fig. 1D con
Fig. 1B). La latencia de emisión fue de 2-4 s. Los
potenciales postsinápticos excitadores (PPSEs) predominaron sobre
los potenciales postsinápticos inhibidores (PPSI). En los SNCs que
habían sido expuestos al CM101 durante 5 días tras la lesión, la
estimulación mediante pulso produjo una actividad bidireccional
intensiva (despolarización e hiperpolarización) en forma de APs
excitadores e hiperpolarización inhibidora (Fig 1E). Este aumento en
la actividad excitadora e inhibidora en relación con los SNCs
lesionados no tratados muestra que el tratamiento con CM101 facilita
la reconexión neuronal y la recuperación de la función de la médula
espinal.
Ejemplo
2
Se estudiaron los efectos del CM101 sobre la
recuperación de una lesión física aguda al sistema nervioso central
de mamíferos. Se desarrolló un modelo de lesión de médula ósea en
ratón por compresión/aplastamiento para la observación de cambios en
el comportamiento a largo plazo que resultan de un traumatismo agudo
y del tratamiento con CM101.
Ratones CD-1 de 4 semanas de edad
se designaron aleatoriamente a un grupo control (n=6) o a un grupo
tratado con CM101 (n=6). Todos los ratones recibieron una incisión
en la piel y una lesión bilateral de la médula espinal al nivel
T11-T12. Dentro de los 5 minutos tras el
traumatismo, todos los animales recibieron una inyección de 100 l en
la vena dorsal de la cola. Los animales tratados con CM101
recibieron inyecciones de 20, 60, o 120 g/Kg (n=2 para cada
concentración), y los animales control recibieron Tampón fosfato
salino de Dulbecco. Los animales se observaron durante siete días.
Cuando los ratones morían o se sacrificaban después del séptimo día,
se reservaban fragmentos de las médulas espinales con la lesión por
aplastamiento para examen histopatológico para determinar el tiempo
de gliosis estándar y la calidad de la conectividad neuronal.
En las primeras 48 horas, todos los animales
estuvieron sedados y no presentaban prácticamente actividad
locomotora. Durante los primeros cuatro días después de la lesión,
todos los ratones arrastraban sus extremidades traseras, y no se
observaron diferencias entre los ratones control y los tratados con
CM101. De los cinco ratones que sobrevivieron hasta el día cinco,
los tres ratones tratados (dos de los que recibieron 20 g/Kg y uno
de los que recibieron 60 g/Kg) fueron capaces de caminar con una
cojera moderada de ambas patas traseras, mientras que las
extremidades traseras de los ratones control permanecieron
paralizadas. Uno de los ratones tratados (CM101 a 60 g/Kg) y uno de
los ratones control sobrevivieron siete días después de la lesión.
El ratón control tenía paraplejía de las extremidades traseras en el
séptimo día. En comparación, el día siete, el ratón tratado con
CM101 era capaz de caminar, de aguantar el peso corporal mientras
caminaba hacia delante, y de trepar por un plano inclinado 60º. El
defecto más sobresaliente en el ratón tratado con CM101 en el día
siete fue que arrastraba ligeramente un dedo de la pata izquierda.
Estos resultados indican que el CM101 facilita la recuperación de la
función de la médula espinal tras una compresión o aplastamiento de
la médula espinal torácica inferior.
Ejemplo
3
Los efectos del tratamiento con CM101 sobre la
recuperación de una lesión por compresión de la médula espinal se
verifican y amplían en una serie de experimentos similar a los
indicados en el ejemplo 2.
Cada uno de los 40 ratones adultos anestesiados
con ketamina y xilazina (80:20, 50-100 mg/Kg por
inyección intraperitoneal) recibieron una incisión de
5-10 mm en la zona afeitada, se retrajeron la piel
descontaminada por encima de la columna vertebral y los músculos,
exponiendo los vértebras T8-T13. Los procesos
medulares posteriores de T10 y T11 se separaron con tijeras de
microcirugía y se expuso la duramadre intacta. El segmento de la
médula espinal entre T10 y T11 se comprimió gradualmente con puntas
de fórceps fino (de 1 mm de ancho). La compresión y la lesión por
aplastamiento resultante se limitó a un solo lado de la médula
espinal (monoplégico) en 15 de los ratones. Los 25 ratones restantes
recibieron lesiones por compresión bilateral (paraplégico)
implicando el segmento espinal completo entre T10 y T11. Para todos
los ratones, la compresión redujo el diámetro de segmento de 2 mm a
0,1-0,2 mm. El procedimiento se completó cerrando
las capas internas con hilo quirúrgico y sellando la piel con
adhesivo tisular estéril. A cada animal operado se le permitió
recuperarse de la cirugía con acceso ilimitado a agua y comida. Se
tuvo cuidado durante el periodo postoperatorio de minimizar el daño
a las uniones vertebrales y tejidos blandos.
Los ratones lesionados quirúrgicamente se
asignaron aleatoriamente a los grupos control y tratado. Los
animales control (monoplégicos, n=5; paraplégicos n=9) recibieron
tampón fosfato salino de Dulbecco ("PBS") mientras los animales
tratados recibieron cada uno 30 g/Kg de CM101 (monoplégicos, n=4;
paraplégicos, n=8) o 60 g/Kg de CM101 (monoplégicos, n=5;
paraplégicos, n=8) diluido en PBS. Todos los ratones recibieron
inyecciones de 100 \mul en la vena dorsal de la cola una hora
después de la cirugía y 2,4,6,8 y 10 días después de la cirugía.
Diariamente durante los primeros 21 días después
de la cirugía y después semanalmente hasta los 110 días se
analizaron la supervivencia, las deficiencias funcionales y la
recuperación de la parálisis. Se usó una forma modificada del test
de caminar en campo abierto desarrollado por Cheng y col (Spinal
cord repair in adult paraplegic rats: partial restoration of hind
limb function, Science 273:510-513 (1996)) para
determinar la capacidad locomotora de cada ratón durante un periodo
de 3-5 minutos.En este tiempo al animal se le
permite moverse libremente dentro de un recipiente de plástico
(8''x11''x3''). Se filmó la actividad locomotora, y los animales
fueron evaluados por dos observadores independientes y a ciego
usando una escala modificada de Tarlov (Cheng y col., 1996). Esta
escala va del 0 (flacidez o parálisis espástica) a 5 (capacidad
normal de caminar) y refleja de forma bastante precisa el patrón
estándar de recuperación de la función locomotora:
0 - Parálisis espástica y flácida
1 - No existen movimientos espontáneos pero se
recupera la respuesta sensorial a estímulos.
2 - Movimientos espontáneos descoordinados de
grupos de músculos.
3 - Movimientos de 2 o 3 de las 3 articulaciones
principales de las extremidades traseras, y apoyo activo y manera de
caminar no coordinada o bien impulsos cortos de caminar coordinado
(cojera).
4 - Caminar coordinado con pequeños déficits en
las extremidades traseras y en la manera de caminar (incluye caminar
sobre los nudillos o sobre la superficie media del pie, arrastre
moderado de los dedos o caminar sobre base amplia); y
5 - Recuperación total de la función de caminar
normal.
En el día 6, dos ratones de cada grupo de
paraplégicos se sacrificaron para el análisis histológico. Se
tiñeron secciones sagitales de la médula espinal con hematoxilina y
eosina y se analizó y documentó por fotomicrografía el grado de
hemorragia, fibrosis y gliosis en cada animal.
Veintiún días después de la lesión, se realizó un
análisis por la imagen de resonancia magnética (RMI) de los ratones
control y tratados supervivientes para documentar el área espinal de
lesión y el proceso de reparación. La médula espinal se visualizó en
cortes de 300 m usando una bobina de tamaño de ratón de 1 pulgada de
diámetro a 200 MHZ, 4,6 Tesla de campo magnético.
El número de animales supervivientes desde el día
0 (día de la cirugía) hasta el día 110 se muestran en la Tabla I.
Cada columna de la tabla I representa el día indicado tras la
cirugía y cada fila representa el grupo experimental indicado (M:
monoplégico; P: paraplégico). El día 1, 8 de 14 controles habían
muerto y los 26 tratados, todavía estaban vivos. En los siguientes
cuatro días, 2 ratones control más murieron y 2 de los 26 animales
tratados también. La supervivencia media en el día 6 era del 92,3%
en los grupos de tratamiento frente al 28,6% en los grupos control.
Después de ese día, se sacrificaron dos ratones de cada grupo
paraplégico para histología (indicado en la tabla I con asteriscos).
El día 28 murió otro animal control. Los 20 ratones tratados y el
único control superviviente estaban vivos el día 35. El día 110 no
quedaban supervivientes del grupo original de 14 ratones control
(dos de los cuales se sacrificaron el día 6) pero 17 de los 26
ratones tratados (cuatro de los cuales se sacrificaron el día 6)
todavía estaban vivos. Por tanto, los resultados proporcionan
fuertes evidencias de que la administración intravenosa de CM101
proporciona una protección significativa frente a la muerte temprana
asociada con una lesión traumática de la médula espinal. En
particular, la probabilidad de que un ratón tratado sobreviva 5 o
más días tras la lesión es mucho mayor que la probabilidad de
supervivencia de un ratón control.
\vskip1.000000\baselineskip
- \text{*}
- Dos ratores de cada grupo se sacrificaron para histología en el día 6.
La recuperación de la capacidad de caminar en
animales monoplégicos y paraplégicos se representa de forma gráfica
en las Figuras 2A y 2B, respectivamente. El día de la cirugía los
ratones de todos los grupos de estudio arrastraban sus extremidades
traseras (Fig. 2A y 2B cabeza de flecha). El día 2, 7 de los 10
ratones monoplégicos tratados y 10 de los 16 ratones paraplégicos
tratados mostraron una restauración parcial de su capacidad de
caminar tal y como se evidencia a través de valores del test de
caminar a campo abierto de al menos 3. Cuando los valores de los
ratones tratados monoplégicos y paraplégicos se compararon con sus
respectivos grupos control, las diferencias fueron significativas
(p<0,001 en el test de Kruskal-Wallis) en los
animales paraplégicos desde el día 3 en adelante (excepto para el
día 6) y en los animales monoplégicos a partir del día 6 en
adelante. La recuperación completa de la función normal de caminar
se observó en 10 de los 10 ratones monoplégicos tratados (30
\mug/Kg de CM101, n=4; 60 \mug/Kg de CM101, n=6) en el día 14, 4
días después del último tratamiento con CM101. Entre los ratones
paraplégicos, 7 de 8 ratones que recibieron 30 \mug/Kg de CM101 y
7 de 8 ratones que recibieron 60 \mug/Kg de CM101 mostraron una
mejora en su capacidad de caminar con puntuaciones de entre 3 y 5
en el día 12. Varios animales tratados se mantuvieron pasados los
110 días; éstos tuvieron valores de 5 (caminar normal) e incluso
recuperaron el control de sus colas.
Estos resultados demuestran que el CM101 produce
una remarcable y rápida regeneración de la médula espinal en
animales con lesión aguda de la médula espinal tal y como se
evidencia de la recuperación de la función motora en los días de
tratamiento.
La evaluación por RMI del área del daño espinal
en el día 21 mostró grandes diferencias en el proceso de reparación
entre animales control y tratados. En la zona de compresión en cada
uno de los animales control, había un área obvia de lesión de
grandes dimensiones que implicaba los tejidos colindantes y la
médula espinal. En comparación, los animales tratados presentaban
áreas de lesión muy limitadas. Por tanto, el tratamiento con CM101
redujo significativamente la región de lesión y inducida por
compresión y de la cicatriz.
Los niveles de gliosis de la médula espinal y la
recuperación global de la estructura tisular se determinó mediante
examen histopatológico del tejido procedente de animales tratados y
no tratados. Los resultados corroboraron el análisis por RM: los
ratones tratados con CM101 presentaban áreas de hemorrágea, gliosis
y fibrosis significativamente reducidas en comparación con los
ratones control.
Ejemplo
4
Se determinó el efecto del CM101 sobre la
reparación de la lesión neuronal en neuronas de médula espinal y
corticales mediante el análisis de la alteración del potencial de
membrana neuronal tras la aplicación de un pulso de ácido
gamma-amino-butírico (GABA).
El GABA, uno de los neurotransmisores
inhibitorios del SNC más importantes, causa la hiperpolarización del
potencial de membrana mediante la apertura de canales de cloruro vía
receptores GABA_{A} y reduciendo los niveles intracelulares de
calcio a través de receptores GABA_{B}. Sin embargo, cuando las
neuronas se lesionan mediante daño físico directo al cuerpo celular
o a los procesos celulares, éstas responden a un breve pulso de GABA
despolarizando sus potenciales de membrana. La severidad de la
lesión neuronal se refleja en la amplitud de la despolarización
causada por GABA. Puesto que la respuesta neuronal al GABA es una
medida del grado de lesión, la respuesta al GABA pede usarse para
analizar el estado de reparación de neuronas lesionadas. Junto a la
documentación de la dependencia del tiempo de la recuperacion normal
de neuronas lesionadas, el ensayo se usó para determinar si el
CM101 afecta la regeneración de neuronas dañadas.
Se prepararon cultivos de células de médula
espinal según procedimientos publicados en detalle (Wamil y col.,
Use-, concentration-, and voltage-dependent
limitation by MK-801 of action potential firing
frecuency in mouse central neurons in cell culture, J Pharmacol.
Exp. Ther., 260: 376-383 (1992)). Brevemente, se
cortaron médulas espinales de embriones de ratón (día de gestación
13-14) y se dispersaron por trituración hasta la
obtención de células independientes y de pequeños grupos. Las
neuronas se sembraron en placas tratadas con colágeno y se
mantuvieron in vitro a 35ºC durante 4-16
semanas antes de la experimentación. Durante la primera semana de
cultivo, el medio de cultivo consistió en: 80% (v/v) de medio
Eagle's MEM suplementado con 5,5 mM de glucosa y 24 mM de
bicarbonato sódico; 10% de suero fetal bovino; y 10% de suero de
caballo inactivado por calor con 10 ng/ml del factor de crecimiento
del tejido nervioso 7S y 1 ml/l de "Mito Serum Extender")
(todos los suplementos proceden de Collaborative Research, Bedford,
MA). El pH del medio fue de 7,4 después de equilibrarse con la
atmosfera del incubador conteniendo un 10% de CO_{2},. El medio de
cultivo se renovaba tres veces a la semana. Tras una semana, el
crecimiento de células no neuronales se suprimió mediante un
tratamiento corto con
5-fluoro-2'-deoxiuridina.
A partir de entonces, no se incluyó suero de caballo en el medio de
cultivo.
Los procedimientos utilizados aquí han sido
publicados en detalle (Wamil y col., Use-, concentration-, and
voltage-dependent limitation by
MK-801 of action potential firing frecuency in mouse
central neurons in cell culture, J Pharmacol. Exp. Ther., 260:
376-383 (1992); Wamil y col., Phenytoin Blocks
N-Methyl-D-Aspartate
Responses of Mouse Central Neurons, J Pharmacol. Exp. Ther., 267:
218 (1993)). Antes de la experimentación, el medio de cultivo se
reemplazó por tampón fosfato salino Dulbecco's modificado (mDPBS) el
cual contenía concentraciones elevadas de Mg^{2+} para suprimir la
actividad sináptica espontánea (composición en milimolar: NaCl,
143,4; KCl, 4,2; CaCl_{2}, 0,9; MgCl_{2},
1,0-7,0; y glucosa 5,6 en tampón fosfato sódico a pH
7,4). La placa de cultivo se colocó en un sistema de microincubación
(PDMI-2, Medical Systems Corp., Greenvale, NY) con
una temperatura controlada a 37ºC mediante un controlador de
temperatura bipolar (TC-202, Medical Systems Corp.,
Greenvale, NY) en la estación de un microscopio invertido de
contraste de fases (Nikon Diaphot 300). Las células se perfundían
continuamente con mDPBS.
Durante los experimentos, se estimularon neuronas
individuales con microelectrodos con lo que se pudieron hacer
registros intracelulares del potencial de membrana. Un circuito
puente en el amplificador (Axoclamp 2B, Axon Instruments) permitió
la inyección simultánea de corriente y el registro del
potencial.
Antes de que se investigara el efecto del GABA
sobre el potencial de membrana, se analizó la calidad de los
cultivos mediante la aplicación (mediante un electrodo de registro)
de series de pulsos de corriente de despolarización de 400 ms de
duración y de amplitud variable para producir potenciales de acción
sobrepasados (Pas) en neuronas con potenciales de reposo estables
(Em) más negativo que o igual a -55 mV. El criterio de vitalidad
neuronal lo constituyeron emisiones repetitivas sostenidas de
potenciales de acción y la medida de Em. Las neuronas dañadas
durante la estimulación tenían potenciales de reposo bajos,
potenciales de acción por debajo del umbral los cuales no aumentaban
en amplitud con una corriente hiperpolarizante, y emisiones
limitadas durante las fases de despolarización o emisiones
espontáneas extremadamente rápidas antes de la pérdida del potencial
de membrana y de la muerte celular. Dichas estimulaciones
finalizaron y se seleccionó una nueva neurona para el estudio.
Las neuronas se lesionaron a través de una
compresión física directa de procesos o cuerpos celulares mediante
micropipetas de cristal pulido térmicamente. Un grupo de neuronas
dañadas se expuso al CM101 (0,1 a 6 g/ml, CarboMed, Inc., Brentwood,
TN) en el medio de infusión empezando 5-10 minutos
después de infligir el daño y continuando a través de este y
subsiguientes experimentos electrofisiológicos,. Durante los
periodos de cultivo que seguían a los experimentos, estas neuronas
tratadas recibían medio de cultivo suplementado con 0,3 g/ml de
CM101. El otro grupo de neuronas lesionadas no se expusieron al
CM101.
Se realizaron registros intracelulares de los
potenciales transmembrana 6 horas, 2 días y 5 días después de la
lesión y a tiempos comparables para las neuronas control no dañadas.
Durante el registro, se aplicaba 10 M de GABA (Research Biochemicals
International, Natick, MA) mediante una aplicación a presión de 3 s
desde una micropipeta roma hecha de un electrodo de pinzado de
zonal. La aplicación del fármaco fue finalizada rápidamente mediante
una perfusión continua con tampón libre de fármaco que fluía en
dirección opuesta de la de la aplicación del GABA.
Como se esperaba la aplicación de 10 \muM de
GABA a neuronas intactas después de 12-16 semanas en
cultivo produjo una hiperpolarización de 8,6 \pm 0,7 SE mV durante
10,0 \pm 1,2 s (Fig. 3A, D, G) potencial de membrana de reposo,
Em= -67,5 \pm 2,7, n=10.
Las neuronas no tratadas lesionadas mediante un
daño físico directo al cuerpo o procesos celulares se despolarizaron
por una aplicación a presión de 3 s de 10 \muM de GABA. Seis horas
después de la lesión por aplastamiento de un sistema, el GABA
despolarizó reversiblemente las membranas neuronales de las neuronas
lesionadas de 30 a 55 mV (Fig. 3C). Incluso 2 y 5 días después de
infligir la lesión, la aplicación de 10 \muM de GABA fresco
causaba despolarización (Fig 3F e I, respectivamente). El día 5 del
experimento se registró una despolarización mínima de 20 s (Fig.
3I). Por tanto, en los días posteriores a la lesión, las neuronas
dañadas continúan despolarizándose en respuesta a la aplicación de
GABA, pero la amplitud y duración de la despolarización disminuye
con el
tiempo.
tiempo.
Cuando se aplica el GABA 6 horas después de la
lesión, las neuronas tratadas con CM101 responden despolarizándose
(Fig. 3B). Esta despolarización era similar en amplitud y duración a
la mostrada por las neuronas lesionadas no tratadas tras la
exposición al GABA (compárese Fig. 3B y 3C). Después del tratamiento
de las neuronas con 0,3 \mug/ml de CM101 durante dos días tras la
lesión, la aplicación de GABA causó una despolarización de membrana
(Fig.3E). Sin embargo, la amplitud y duración de la despolarización
se vio significativamente reducida respecto a la despolarización
vista en neuronas no tratadas dos días después de la lesión
(compárese Fig. 3E y 3F). Después de cinco días de exposición
continuada postlesión al CM101, las neuronas dañadas respondieron al
GABA con una pequeña despolarización (2 a 5 mV) y con una pequeña
hiperpolarización (1 a 3 mV) (Fig 3H). Esta respuesta es más similar
a la respuesta de neuronas no dañadas al GABA que a la respuesta al
GABA de neuronas no tratadas cinco días después de la lesión
(compárese Fig. 3H con Figs. 3G y 3I).
Estos resultados muestran que el CM101 facilita
la restauración de una respuesta de hiperpolarización
fisiológicamente normal al GABA. Por tanto, las lesiones neuronales
se reparan más rápidamente cuando se administra CM101. Esto indica
que el CM101 promueve la regeneración neuronal.
Estas investigaciones proporcionan evidencias
in vivo, ex vivo e in vitro del aumento de la
regeneración neuronal y la recuperación de las funciones
fisiológicas de las neuronas lesionadas tratadas con CM101. El
tratamiento con CM101 incrementa dramáticamente la probabilidad de
que las víctimas de una lesión en el sistema nervioso central
sobrevivirán a sus lesiones y recuperarán la función neuronal.
Todas las publicaciones y aplicaciones de
patentes mencionadas en esta especificación se incorporan aquí como
referencias en la misma extensión que si cada publicación individual
o aplicación de patente fuera específicamente e individualmente
indicada para ser incorporada como referencia.
Habiendo sido descrita en su totalidad la
presente invención, será evidente, para un experto en la materia,
que pueden realizarse muchos cambios y modificaciones
Claims (26)
1. Utilización de una toxina de
Streptococcus \beta-hemolítico del grupo B
(GBS) en la fabricación de un medicamento para ayudar al
restablecimiento de la conectividad neuronal en un paciente con
lesión neural.
2. Utilización de una toxina de
Streptococcus \beta-hemolítico del grupo B
(GBS) en la fabricación de un medicamento para utilizar en la
inhibición, al menos parcial, de la formación de cicatriz en un
paciente con lesión neural.
3. Utilización de una toxina de
Streptococcus \beta-hemolítico del grupo B
(GBS) en la fabricación de un medicamento para utilizar en el
aumento de la probabilidad de supervivencia de un paciente tras una
lesión neural del sistema nervioso central de dicho paciente.
4. Utilización de una toxina de
Streptococcus \beta-hemolítico del grupo B
(GBS) en la fabricación de un medicamento para utilizar en la
minimización de la cicatrización resultante de la extirpación de
tejido cicatrizado de una lesión neural.
5. Utilización de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior, en donde la toxina GBS es sustancialmente
pura.
6. Utilización de acuerdo con la reivindicación
5, en donde la toxina GBS tiene una pureza de al menos un 90%
aproximadamente.
7. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, 2 ó 4, en donde la lesión neural se localiza en el sistema
nervioso central.
8. Utilización de acuerdo con la reivindicación 3
ó 7, en donde la lesión neural se localiza en la médula espinal.
9. Utilización de acuerdo con las reivindicación
3 ó 7, en donde la lesión neural se localiza en el cerebro.
10. Utilización de acuerdo con la reivindicación
9, en donde la lesión neural se localiza en el córtex.
11. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, 2 ó 4, en donde la lesión neural se localiza en el sistema
nervioso periférico.
12. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde la lesión neural es inducida
por un traumatismo.
13. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-11, en donde la lesión neural es
inducida por cirugía.
14. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-11, en donde la lesión neural es
inducida por una isquemia.
15. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde la toxina GBS debe
administrarse al paciente por vía intravenosa.
16. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-14, en donde la toxina GBS debe
administrarse al paciente intra-arterialmente.
17. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-14, en donde la toxina GBS debe
administrarse al paciente intra-tecalmente.
18. Utilización de acuerdo con la reivindicación
1, 2 ó 3, en donde la toxina GBS debe administrarse al paciente en
el día que se inflige la lesión.
19. Utilización de acuerdo con la reivindicación
18, en donde la toxina GBS se administra al paciente en las 6 horas
tras infligir una lesión.
20. Utilización de la reivindicación 1,2 ó 3 en
donde la toxina GBS se administra antes de que se inflija una
lesión.
21. Utilización de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior, en donde el paciente tiene al menos 7 días
de edad.
22. Utilización de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior, en donde la toxina GBS se administra al
paciente en una dosis de 1 \mug/kg a 100 \mug/Kg.
23. Utilización de acuerdo la reivindicación 2,
en donde la toxina GBS se administra en una cantidad suficiente para
inhibir al menos parcialmente la gliosis.
24. Utilización de acuerdo con la reivindicación
2, en donde la toxina GBS se administra en una cantidad suficiente
para inhibir al menos parcialmente la gliosis y por tanto minimizar
la probabilidad de epilepsia post-traumática en el
paciente.
25. Utilización de acuerdo con la reivindicación
4, en donde el medicamento comprende además un compuesto que
promueve la regeneración neural.
26. Utilización de acuerdo con la reivindicación
25, en donde el compuesto que promueve la regeneración neural se
selecciona entre el IGF-1, el bGFG, el TGF\betaS,
BDNF, el NT-3 y el CNTF.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/791,857 US5981508A (en) | 1997-01-29 | 1997-01-29 | Facilitation of repair of neural injury with CM101/GBS toxin |
| US791857 | 1997-01-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2244046T3 true ES2244046T3 (es) | 2005-12-01 |
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ID=25154992
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98904795T Expired - Lifetime ES2244046T3 (es) | 1997-01-29 | 1998-01-29 | Facilitacion de la reparacion de lesiones neuronales con toxina cm101/gbs. |
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| JP (1) | JP2001511136A (es) |
| AT (1) | ATE296636T1 (es) |
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