ES2244310A1 - 3-indoxil fosfato como sustrato de las peroxidasas. - Google Patents
3-indoxil fosfato como sustrato de las peroxidasas.Info
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Abstract
3-indoxil fosfato como sustrato de las peroxidasas. El 3-indoxil fosfato es oxidado en presencia de la peroxidasa de rábano silvestre (HRP) por el agua oxigenada (H2O2) a azul de índigo, heterociclo aromático insoluble en medio acuoso. A través de la cuantificación, previa solubilización o no, del azul de índigo, se logra medir la actividad de la peroxidasa. El hecho de que la fosfatasa alcalina y la HRP puedan utilizar el mismo sustrato enzimático (3-indoxil fosfato) y generar el mismo producto (azul de índigo) implica el empleo de la misma instrumentación analítica para la cuantificación de ambas enzimas. Esta invención resulta particularmente útil en la unificación de los reactivos e instrumentación necesaria para el desarrollo de ensayos ELISA, de aplicación al sector de los análisis clínicos.
Description
3-Indoxil fosfato como sustrato
de las peroxidasas.
Las peroxidasas son un grupo de enzimas que
catalizan reacciones de reducción-oxidación por
ello son clasificadas como oxidorreductasas.
En su modo general de actuación, las peroxidasas
reducen peróxido de hidrógeno a agua mientras oxidan una gran
variedad de sustratos. Son, por tanto, oxidorreductasas que
utilizan peróxido de hidrógeno como aceptor electrónico para
catalizar diferentes reacciones de oxidación. El proceso es el
siguiente:
Dador +
H_{2}O_{2} \rightarrow Dador \ oxidado + 2
H_{2}O
Múltiples tipos o especies de peroxidasas han
sido estudiadas. Todas ellas tienen una estructura básica similar,
pero en su conjunto presentan marcadas diferencias. Dentro del
amplio grupo de las peroxidasas se encuentra la peroxidasa de
rábano silvestre (HRP) (EC 1.11.1.7) (R.Huang, N.Hu,
Bioelectrochemistry, 2001, 54, 75), glicoproteina con peso
molecular aproximado de 44 kDa (A. Johannsson, Principles and
practice of immunoassay, Ed. C.P.Price, D.J.Newman, Stockton
Press, 1991, New York, pp. 300). En el centro activo de la HRP se
encuentra ubicado un grupo hemo, donde el átomo de hierro está
covalentemente unido a un átomo de nitrógeno de un resto de
histidina.
Estudios previos han mostrado que la HRP actúa
mediante un mecanismo que se desarrolla en tres etapas, del
siguiente modo:
1) formación del complejo I
HRP + H_{2}O_{2}
\longleftrightarrow Complejo
I
2) transición del complejo I al complejo II
Complejo I + AH
\longleftrightarrow Complejo II +
A
3) recuperación del enzima por reducción del
complejo II
Complejo II +
AH \longleftrightarrow HRP + A +
2H_{2}O
donde AH es el dador en la forma
reducida y A es el dador en la forma
oxidada.
4) formación del producto
2A
\longleftrightarrowA_{2}
La especificidad de la HRP por el sustrato para
formar el complejo I es elevada y sólo el H_{2}O_{2}, MeOOH y
el EtOOH son capaces de combinarse con la HRP para generar dicho
complejo I.
Sin embargo la especificidad del enzima (en su
forma complejo I y II) por los dadores representados por AH, en las
ecuaciones 2 y 3 es bastante baja. Además, existe una gran variedad
de compuestos que pueden actuar como dadores. Se han utilizado una
amplia gama de sustratos para este enzima aunque se pueden destacar
algunos de los siguientes: antioxidantes fenólicos (S.M.Khopde,
K.I.Priyadarsini, Biophysical Chemistry, 2000, 88, 103),
compuestos como la hidroquinona y el catecol (S.Cosnier,
I.C.Popescu, Analytica Chimica Acta, 1996, 319, 145), el
ácido 1,7-dimetilúrico (R.N.Goyal, A.K.Jain,
N.Jain, J.Chem.Soc, 1996, 2, 1154), ácido
1-metilúrico (R.N.Goyal, M.S.Verma, N.Kumar,
Bioelectrochem.Bioenerg, 1997, 43, 205),
p-benzoquinona (E.Casero, M.Darder, F.Pariente,
E.Lorenzo, Analytica Chimica Acta, 2000, 403, 1), compuestos
de la familia de los indoles (T.Hu, G.Dryhurst,
J.Electroanalytical Chemistry, 1997, 432, 7), de las
fenotiazinas (S.S.Razola, E.Aktas, J-C.Viré,
J-M.Kauffmann, Analyst, 2000, 125, 79) y una
multitud de variados compuestos orgánicos.
Una de las principales utilidades de la HRP es su
capacidad para unirse como agente de marcaje a anticuerpos o hebras
de ADN. De este modo y con la ayuda de algún sustrato adecuado se
podrá seguir la reacción inmunológica o de hibridación en toda su
extensión. Idealmente para el desarrollo de inmunoensayos con
detección electroquímica se requieren sustratos no electroactivos
que se transformen en productos electroactivos, que se oxiden o
reduzcan a potenciales adecuados. En el caso de que sustrato y
producto sean electroactivos, deben serlo a diferentes potenciales
para evitar interferencias. Además, para analizar muestras
biológicas es preferible utilizar potenciales inferiores a +0.5 V
debido a la posible interferencia de sustancias electroactivas que
se encuentren en la
misma.
misma.
Entre los sustratos de la HRP que suelen ser
utilizados para el revelado de ensayos de tipo ELISA se puede
mencionar a la o- fenilendiamina (OPD) cuya oxidación es catalizada
por la HRP generando 2,3-diaminofenazina. Se puede
seguir el desarrollo de la reacción cuantificando el producto
coloreado a 405 nm. El guayacol incoloro es también utilizado. Se
genera tetraguayacol que es de color marrón y que se detecta a 470
nm.
Finalmente otros sustratos que se emplean para
revelar esta marca pueden ser: tetrametilbenzidina (TMB),
o-dianisidina (ODA),
2,2'-azinobis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato
de diamonio (ABTS), 3,3'-diaminobenzidina
(DAB).
En la presente invención se utiliza el
3-indoxil fosfato (3-IP) como
sustrato de las peroxidasas, y en concreto de la HRP. Este compuesto
aromático ha sido utilizado como sustrato electroquímico de la
fosfatasa alcalina por nuestro grupo de investigación, llevando a
cabo la detección electroquímica del producto enzimático generado,
el azul de índigo (C.F. Sánchez, A. Costa García,
Electroanalysis, 1998, 10, 249; C.F. Sánchez, M. B. González
García, A. Costa García, Biosensors & Bioelectronics,
2000, 14, 917).
Al añadir ácido sulfúrico concentrado sobre el
azul de índigo, heterociclo aromático insoluble en medios acuosos,
se consigue un proceso de sulfonación que conlleva la generación de
índigo carmín. El comportamiento electroquímico de esta molécula ya
ha sido estudiado (M.D. González, C.F. Sánchez, A. Costa García,
Electroanalysis, 2002, 14, 665) con anterioridad por nuestro
grupo de investigación sobre dos tipos diferentes de electrodos
serigrafiados comerciales, haciendo uso de varias técnicas
voltamperométricas. Si se hace un barrido cíclico entre -0.4V y
+0.1V de índigo carmín (generado enzimáticamente) en ácido sulfúrico
2.5 M, se observará una señal reversible a -0.15V (vs
pseudo-referencia Ag).
La presente invención es de aplicación a la
determinación de la actividad de enzimas del grupo de las
peroxidasas. Se basa en el empleo del 3-indoxil
fosfato como sustrato de las peroxidasas y más concretamente como
sustrato de la peroxidasa de rábano silvestre. Este sustrato o
algún otro derivado suyo como el
5-bromo-4-cloro-3-indoxil
fosfato son utilizados como tales con enzimas del grupo de las
fosfatasas y más concretamente con la fosfatasa alcalina. Esta
invención presenta, el primer sustrato válido para la peroxidasa de
rábano silvestre y para la fosfatasa alcalina, principales enzimas
utilizadas como "marcas" en análisis clínicos. Esta invención
resulta, por tanto, particularmente útil en la unificación de la
instrumentación y reactivos necesarios para el desarrollo de
ensayos ELISA.
La presente invención emplea el
3-indoxil fosfato (3-IP) como
sustrato de las peroxidasas en presencia de peróxido de hidrógeno.
El producto enzimático insoluble en disolución acuosa es el azul de
índigo.
El 3-indoxil fosfato puede ser
utilizado como sustrato tanto en forma de sal disódica
preferentemente, como de sal
di-p-toluidínica. Otros derivados
indoxílicos como el
5-bromo-4-cloro-3-indoxil
fosfato (BCIP) pueden ser utilizados, en su forma de sal disódica,
dipotásica o di-p toluidínica, como sustratos de la
peroxidasa. El BCIP puede ser adicionado al medio de reacción en
cualquier formato líquido comercial. El
5-bromo-6-cloro-3-indoxil
fosfato también puede ser utilizado como sustrato de las
peroxidasas, así como cualquier otro derivado indoxílico que genere
un compuesto de la familia del índigo como producto de la reacción
enzimática.
La catálisis enzimática tiene lugar en presencia
de peróxido de hidrógeno preferentemente, aunque otros peróxidos (o
precursores suyos) como el peróxido de hidrógeno de urea pueden ser
también empleados. Estos reactivos peróxidos son añadidos al medio
de la reacción en forma líquida o sólida.
El enzima que cataliza la reacción ha de
pertenecer a la familia de las peroxidasas, independientemente de
su origen. De forma preferente se utiliza la peroxidasa de rábano
silvestre así como la lactoperoxidasa. El enzima puede estar libre
en disolución o actuando como agente de marcaje de reactivos
inmunológicos, hebras de ADN o cualquier otro reactivo que
intervenga en ensayos de afinidad.
El producto de la catálisis enzimática es de la
familia de los indigoides. Su detección se puede realizar en base a
su insolubilidad en medio acuoso, preferentemente con técnicas con
fundamento gravimétrico, electroquímico u
óptico-espectroscópico. La detección a través de
estas técnicas también se realiza previa solubilización del
producto enzimático. La solubilización del índigo tiene lugar con
ácidos concentrados o con disolventes orgánicos polares o apolares.
Otra forma de solubilizarlo es a través de su sulfonación con la
adición de ácido sulfúrico concentrado, de este modo se genera un
derivado suyo denominado índigo carmín.
La reacción enzimática tiene lugar en medio
acuoso y preferentemente en disolución reguladora a pH ligeramente
ácido. Las disoluciones reguladoras más empleadas son de citrato y
de acetato.
La reacción enzimática se lleva a cabo
preferentemente a una temperatura de 37ºC o a temperatura ambiente.
La catálisis está favorecida por la presencia de un pequeño
porcentaje (0-1%) de alguna proteína inerte como la
seroalbúmina bovina.
La concentración de este reactivo así como de
todos los anterior y posteriormente mencionados han de ser
ajustados en cada ensayo particular. Activadores de la reacción
enzimática como detergentes no fónicos (Tween 20, Triton
X-100) o compuestos halogenados
(p-iodofenol, p-clorofenol) pueden
ser también adicionados al medio de reacción.
El 3-indoxil fosfato o sus
derivados y el producto enzimático, indigo, no son agentes
carcinógenos ni mutagénicos como sucede con alguno de los sustratos
comúnmente utilizados con la HRP.
Ejemplo de realización de la
invención
La eficacia del procedimiento se ilustra
adicionalmente mediante el siguiente ejemplo que no pretende ser
limitativo de su alcance. Este ejemplo muestra el uso del
3-indoxil fosfato como sustrato para la medida de
la actividad de la peroxidasa de rábano silvestre en disolución,
caracterizado por la generación de azul de índigo como producto de
la reacción enzimática. La detección se lleva a cabo a través de la
generación de índigo carmín, tras la sulfonación del azul de índigo
con ácido sulfúrico concentrado. El índigo carmín soluble en
disolución acuosa es detectado electroquímicamente sobre electrodos
de carbono.
La metodología empleada consta de las siguientes
etapas:
- Bloqueo de la superficie del pocillo con
albúmina. Para ello se añaden a cada uno de los pocillos 200 \muL
de una disolución reguladora PBS 10mM de pH 7.4 (8 g/L de NaCl, 2
g/L de KCI) con un 3% de albúmina de suero bovino (BSA) y se deja
descansar toda la noche a 4ºC. De este modo se evita la posible
adsorción del enzima al pocillo asegurándose que todos los centros
activos del mismo están disponibles.
- Etapa de lavado. Los pocillos se vacían de su
contenido y se lavan 3-4 veces con una disolución
reguladora correspondiente al mismo medio en el que se realizará la
siguiente etapa.
- Desarrollo de la reacción enzimática. Se
mezclan 50 \muL de una disolución de 3-indoxil
fosfato 12 mM (preparada en disolución reguladora de acetato 0.1 M
de pH 5.0), 50 \muL de una disolución acuosa de H_{2}O_{2}
2\cdot10^{-4} M y 8 \muL de una disolución acuosa de HRP de
la concentración deseada. La temperatura y el tiempo de reacción son
47ºC y 30 minutos respectivamente. La reacción enzimática se lleva
a cabo a pH 5.0. Durante toda esta etapa se mantiene una ligera
agitación.
- Parada de la reacción y formación de índigo
carmín. Se realiza con la adición de 100 \muL de H_{2}SO_{4}
concentrado a cada uno de los pocillos que serán agitados durante
un tiempo de 5 minutos para lograr una buena homogeneización.
- Detección del índigo carmín generado. Esta
etapa puede realizarse de modos diferentes en función de la técnica
empleada en la detección.
1) Voltamperometría cíclica: se hace en
discontinuo, con la adición de 15 \muL del contenido del pocillo
deseado y 25 \muL de H_{2}O sobre el electrodo serigrafiado de
carbono. Se lleva a cabo un barrido de potenciales cíclico desde
-0.4V (potencial que se mantiene durante 45 segundos) hasta
+0.1V.
2) Sistema de flujo con detección amperométrica.
Se introducen 100 \muL del contenido del pocillo deseado para
llenar el loop. Se cambia la posición de la válvula de inyección y
el volumen de muestra mencionado es arrastrado por el fluido
portador H_{2}SO_{4} 1M pasando posteriormente por la celda de
medida. Durante las medidas se mantendrá un potencial constante de
-0.30 V (vs electrodo de pseudo-referencia de
Ag).
A través de la detección del índigo carmín
generado tras la solubilización del azul de índigo se consigue
cuantificar la peroxidasa de rábano silvestre. De modo muy sencillo
con ayuda de un sistema de flujo y detección amperométrica se logra
un límite de detección 27 pg/pocillo (0.25 ppb) de HRP. Con una
detección en discontinuo y voltamperometría cíclica se obtiene un
límite de detección de 32.4 pg/pocillo (0.30 ppb) de HRP.
El 3-indoxil fosfato es, por
tanto, un sustrato válido para la cuantificación de peroxidasas. El
3-indoxil fosfato puede ser utilizado para la
medida electroquímica de la actividad de la fosfatasa alcalina. Por
tanto, ambas enzimas, principales marcas utilizadas en los
inmunoensayos, pueden ser cuantificadas electroquímicamente a través
del mismo producto enzimático, aunque generados bajo diferentes
condiciones de reacción enzimática (pH, temperatura, tiempo de
reacción).
El 3-indoxil fosfato es
totalmente soluble en disolución acuosa. Este sustrato, al igual
que el producto enzimático, azul de índigo, no son agentes
carcinógenos ni mutagénicos como sucede con alguno de los sustratos
comúnmente utilizados con la HRP.
Claims (6)
1. Uso del 3-indoxil fosfato como
sustrato de las peroxidasas, caracterizado porque genera
azul de índigo como producto enzimático.
2. Uso del 3-indoxil fosfato como
sustrato de las peroxidasas o cualquier derivado indoxílico como
sustrato de las peroxidasas, caracterizado porque genera un
compuesto de la familia de los indigoides como base de la
cuantificación enzimática.
3. Uso del 3-indoxil fosfato como
sustrato de las peroxidasas y cualquier otro reactivo según las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque genera
índigo carmín como fundamento de la cuantificación enzimática.
4. Uso del 3-indoxil fosfato,
según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque se
utiliza cualquier reactivo adicional que solubilice el azul de
índigo o sus derivados.
5. Uso del 3-indoxil fosfato,
según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque se
utiliza cualquier técnica electroquímica para la cuantificación de
azul de índigo o sus derivados.
6. Uso del 3-indoxil fosfato,
según la reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque se
utiliza cualquier técnica instrumental para la cuantificación de
azul de índigo o sus derivados.
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|---|---|---|---|
| ES200400260A ES2244310B1 (es) | 2004-02-03 | 2004-02-03 | 3-indoxil fosfato como sustrato de las peroxidasas. |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102924957A (zh) * | 2011-08-09 | 2013-02-13 | 江苏泰丰化工有限公司 | 一种靛蓝塔式氧化新技术 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0381173A2 (en) * | 1989-02-02 | 1990-08-08 | Abbott Laboratories | Method and device for quantitative chromatography |
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2004
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FERNáNDEZ-SáNCHEZ, C. et al.: "3-Indoxyl Phosphate: an Alkaline Phosphatase Substrate for Enzyme Immunoassays with Voltammetric Detection", Electroanalysis (1998), Vol. 10, n‘ 4, pp.: 249-255, todo el documento. * |
| FERNÁNDEZ-SÁNCHEZ, C. et al.: "3-Indoxyl Phosphate: an Alkaline Phosphatase Substrate for Enzyme Immunoassays with Voltammetric Detection", Electroanalysis (1998), Vol. 10, nº 4, pp.: 249-255, todo el documento. * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102924957A (zh) * | 2011-08-09 | 2013-02-13 | 江苏泰丰化工有限公司 | 一种靛蓝塔式氧化新技术 |
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