ES2244480T3 - Precursor placentario humano de neuroquinina b. - Google Patents

Precursor placentario humano de neuroquinina b.

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ES2244480T3 ES00974680T ES00974680T ES2244480T3 ES 2244480 T3 ES2244480 T3 ES 2244480T3 ES 00974680 T ES00974680 T ES 00974680T ES 00974680 T ES00974680 T ES 00974680T ES 2244480 T3 ES2244480 T3 ES 2244480T3
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Abstract

Uso de un asociado de unión a un producto genético del precursor de neuroquinina B o variante o fragmento del mismo en la preparación de un kit de diagnóstico para utilizarse en el pronóstico o diagnóstico de hipertensión inducida por el embarazo, pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas.

Description

Precursor placentario humano de neuroquinina B.
La presente invención se refiere a la detección de la producción del precursor humano de neuroquinina B por la placenta y a la detección de la producción de productos genéticos de neuroquinina B, o variantes o fragmentos de los mismos, como medio para predecir el inicio de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas (o para seguir su curso). La invención se refiere también a la prevención o tratamiento de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia mediante la supresión de los efectos de un exceso de neuroquinina B secretada en la sangre materna.
La hipertensión inducida por el embarazo (PIH) y la pre-eclampsia, dos de las condiciones más elusivas y complejas del embarazo, han sido difíciles de definir y tratar. La pre-eclampsia es todavía una de las complicaciones del embarazo más comunes y amenazantes para la vida en el mundo occidental. La causa principal de la pre-eclampsia ha sido difícil de elucidar debido a que sus signos y síntomas se han presentado siempre como un racimo de condiciones. De aquí que se haya definido como un síndrome, que normalmente se presenta con las características de hipertensión y proteinuria maternas, pero incluyendo complicaciones extensivas que implican a los sistemas hepático, de coagulación y nervioso maternos (Henriksen, T., (1998) Scand. J. Rheumatol. Suppl. 107 86-91). Los problemas clínicos de la pre-eclampsia normalmente llegan a ser solo evidentes en la segunda mitad del embarazo y se cree que emergen durante el primer trimestre. Al parecer las complicaciones pre-eclámpticas únicamente surgen en el caso de que esté presente tejido placentario en el útero de la madre. En realidad, pueden presentarse casos de mola hidatidiforme con pre-eclampsia cuando el útero solo contiene tejido placentario desarreglado (Nugent, C.E., et al. (1966) Obstet. Gynecol. 87 829-31). Una vez diagnosticada la pre-eclampsia en el transcurso del embarazo y una vez que el tejido placentario ha sido retirado quirúrgicamente o expulsado durante el nacimiento, la condición desaparece finalmente. Existen muchas sugerencias alrededor de las causas de la pre-eclampsia que van desde el desarrollo de un pobre sistema vascular placentario/uterino hasta la inmunología de incompatibilidad entre la madre y el feto. Aunque estas teorías tienen cierta entidad, las mismas no tienen en cuenta los efectos sistémicos de este síndrome. Muchos síntomas son probablemente el resultado de efectos secundarios de hipertensión y no la causa directa del síndrome. Por tanto, la detección precoz del desarrollo de PIH o pre-eclampsia sería de gran beneficio a la hora de poder tomar medidas de precaución, incluyendo el tratamiento específico de hipertensión y otras complicaciones asociadas con la pre-eclampsia, tales como aprehensiones, problemas de coagulación,
etc.
El daño placentario visible y la hipertensión observada en una madre que presenta al parecer pre-eclampsia se han relacionado con un mayor riesgo de complicaciones fetales incluyendo retardo del crecimiento e hipoxia fetal. En casos extremos, ello podría ser la causa de aborto. En otros estudios, la pre-eclampsia ha sido postulada como una adaptación materna y fetal al retardo del crecimiento fetal. Puesto que no todas las mujeres con retardo del crecimiento fetal desarrollan pre-eclampsia, el factor decisivo es una respuesta materna (Walter, J. (2000) The Lancet 356 1260-1265). Las características de esta adaptación están presentes no solo en la pre-eclampsia, sino también en el retardo del crecimiento fetal y aborto. Por ejemplo, el fallo de la expansión normal del volumen de plasma en la madre está asociado con un crecimiento fetal deteriorado y la pre-eclampsia (Gulmezoglu AM, Hofmeyr GJ (2000) Cochrane Database Syst Rev 2 CD000167). Se ha sugerido que los problemas observados en la pre-eclampsia, tal como trombofilia, son el resultado de lesiones trombóticas en una placenta patológica (Mousa HA, Alfirevici Z (2000) Hum Reprod151830-3). Por tanto, es evidente la conexión entre la pre-eclampsia y el retardo del crecimiento fetal y la hipoxia fetal y, a este respecto, los métodos de diagnóstico y los tratamientos de la pre-eclampsia pueden ser también adecuados a la hora de predecir, diagnosticar y/o tratar dichas condiciones feta-
les.
La neuroquinina B (NKB) pertenece a una familia de péptidos conocidos como taquiquininas, la primera de las cuales y la más conocida es la sustancia P que fue descubierta en 1931 (von Euler, U.S. y Gaddum, J.H. (1931) J Physiol 72:74-87). Se necesitaron otras cinco décadas antes del descubrimiento de dos miembros más de la familia de las taquiquininas, uno de ellos designado como sustancia K o neuroquinina A (Kimura, S., et al. (1983) Proc. Japan Acad 59B 101-104) y el otro designado como neuromidina K, conocida ahora como neuroquinina B (Kangawa, K., et al (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 114 533-540). Las taquiquininas han sido relacionadas con presentar una amplia variedad de acciones biológicas que van desde la contracción del músculo liso, vasodilatación, transmisión de dolor, inflamación neurogénica, hasta la activación del sistema inmunológico (Longmore, J., et al (1997) Canadian J. Physio. & Pharmacol. 75 612-621). Se ha comprobado que la neuroquinina B es la neuroquinina más potente causante de vasoconstricción del lecho vascular mesentérico (D'Orleans-Juste, P. et al (1991) Euro. J. Pharmacol. 204 329-334) y contracción de la vena portal hepática (Mastrangelo, D., et al (1987) Eur J Pharmacol. 134, 321-6). La neuroquinina B es también el miembro más potente de la familia que actúa en el receptor NK_{3} y, si bien las sustancias P y K deceleran el ritmo cardiaco, los agonistas del receptor NK_{3} tienen el efecto opuesto ya que aumentan el ritmo cardiaco cuando son perfusionados en la corriente sanguínea de la arteria coronaria canina (Thompson, G.W. et al (1998) American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology 275 (5), 1683-1689). En un modelo animal, se ha demostrado que las inyecciones intravenosas de neuroquinina B en cobayos produce una hipertensión relacionada con la dosis y que niveles muy altos de agonista de neuroquinina B condujeron a molestias en el animal (Roccon, A., et al (1996) Brit. J. Pharmacol. 118 1095-1102). Experimentos similares han demostrado un incremento en la presión sanguínea tras la infusión intravenosa de neuroquinina B en ratas (Page et al., (2000) Nature 405 797-800). La neuroquinina B no ha sido encontrada de forma fiable en ninguno de los tejidos periféricos tomados de los animales experimentales; por ejemplo, Moussaoui et al (Neuroscience (1992) 48, 967-678) ensayaron una amplia variedad de tejidos periféricos empleando un sistema de ensayo muy sensible y específico y no encontraron en absoluto trazas de neuroquinina B.
Ha sido identificado un precursor de neuroquinina B humana que, tras el tratamiento, da lugar a un péptido idéntico a neuroquinina B de otras especies de mamíferos (bovinos, porcinos, ratas y ratones) (Incyte Pharmaceuticals Inc. Solicitud de Patente Internacional no. WO98/57986). La entidad solicitante ha descubierto, de forma muy sorprendente, que dicho precursor de neuroquinina B humana es producido por el tejido placentario durante el embarazo y que la neuroquinina B y fragmentos del precursor pasan a la corriente sanguínea materna.
La entidad solicitante ha comprobado que en el embarazo normal, se encuentran niveles importantes (por ejemplo del orden de 100 picomolar) de neuroquinina B (y otros productos de disgregación del precursor de neuroquinina B humana) en la corriente sanguínea materna cerca del término, pero que con anterioridad al término los niveles son de cero o muy bajos. Sin embargo, en algunos casos se han identificado niveles cerca del término en una fase inicial del embarazo (por ejemplo, después de solo 9 semanas) y, en casos de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia, se han encontrado concentraciones muy altas (nanomolares) de neuroquinina B en el plasma materno cerca del término. De este modo, la detección de niveles elevados en plasma de neuroquinina B, precursor de neuroquinina B, sus productos de disgregación, o variantes de los mismos, en una fase precoz proporcionará una indicación del posible desarrollo de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia, e incluso puede proporcionar una indicación de la probable severidad futura de dichas condiciones. Por otro lado, la reducción de los niveles de neuroquinina B en circulación (o reducción de sus efectos) aliviará los efectos adversos sobre la madre apreciados en estas condiciones. Como resultado de la relación existente entre la pre-eclampsia y las complicaciones fetales, incluyendo retardo del crecimiento fetal y/o hipoxia fetal, los agonistas o antagonistas de neuroquinina B pueden ser de utilidad a la hora de aliviar dichas condiciones. La producción en exceso del precursor de neuroquinina B humana puede ser también un factor causante de ciertas condiciones hipertensivas en personas no embarazadas (a través del efecto de la neuroquinina B o de uno o más de los diferentes productos de disgregación del precursor).
En un primer aspecto de la invención, se proporciona el uso de un asociado de unión a un producto genético precursor de neuroquinina B o una variante o fragmento del mismo en la preparación de un kit (equipo) de diagnóstico para utilizarse en la predicción o diagnóstico de hipertensión inducida por el embarazo, pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas.
En la puesta en práctica del primer aspecto, el kit de diagnóstico puede comprender además instrucciones para la realización de una prueba para medir los niveles de neuroquinina B en una muestra biológica y para correlacionar los resultados de la prueba con el probable desarrollo futuro de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas, respectivamente.
En un segundo aspecto de la invención, se proporciona el uso de un asociado de unión a un producto genético precursor de neuroquinina B o variante o fragmento del mismo, junto con instrucciones para la realización de una prueba para medir los niveles de neuroquinina B en una muestra biológica y correlacionar los resultados de la prueba con la severidad futura pronosticada de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas, respectivamente, en la producción de un kit de diagnóstico para estimar una probable severidad futura de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o condiciones fetales relaciona-
das.
Preferentemente, en los aspectos primero y segundo de la invención, el asociado de unión es un anticuerpo específico para el precursor de neuroquinina B, neuroquinina B o sus variantes epitópicas o fragmentos epitópicos. Más preferentemente, el asociado de unión es un anticuerpo específico para el precursor de neuroquinina B humana que tiene la secuencia de la figura 2 (SEQ ID NO:1) o sus variantes epitópicas o fragmentos epitópicos.
En un tercer aspecto de la invención, se proporciona el uso de un agente que inhibe el efecto biológico de la neuroquinina B en la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas.
En una modalidad preferida del tercer aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente que inhibe el efecto biológico de la neuroquinina B, para utilizarse en la prevención o tratamiento de hipertensión inducida por el embarazo, pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas.
En un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un método para pronosticar o diagnosticar hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas en un sujeto humano mediante evaluación de la concentración en una muestra biológica de producto genético precursor de neuroquinina B humana o una variante o fragmento del mismo.
En un quinto aspecto de la invención, se proporciona un método para pronosticar o diagnosticar hipertensión inducida por el embarazo en una fase precoz en un sujeto humano o para pronosticar pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas en un sujeto humano mediante evaluación de la concentración en una muestra biológica de neuroquinina B o su precursor o una variante epitópica o fragmento epitópica de la misma.
Preferentemente, los métodos de los aspectos cuarto y quinto comprende evaluar la concentración en una muestra biológica, por ejemplo sangre, de neuroquinina B. La neuroquinina B y su precursor pueden tener las secuencias SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, respectivamente.
En un sexto aspecto de la invención, se proporciona un método para estimar el probable grado futuro de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas en un sujeto humano mediante evaluación de la concentración en una muestra biológica, por ejemplo sangre, de precursor de neuroquinina B humana o una variante o fragmento del mismo, y correlación de los resultados con la severidad futura pronosticada de pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas.
Preferentemente, el método del sexto aspecto comprende evaluar la concentración en una muestra biológica, por ejemplo sangre, de neuroquinina B, y correlacionar los resultados con la severidad futura pronosticada de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas, respectivamente. La concentración puede ser evaluada utilizando un anticuerpo específico para neuroquinina B.
Por tanto, se puede emplear un producto genético precursor de neuroquinina B humana o una variante o fragmento del mismo en la producción de un kit de diagnóstico para utilizarse en la predicción o diagnóstico de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas.
Se puede emplear una variante epitópica o fragmento epitópico del precursor de neuroquinina B humana. Alternativamente, se puede emplear neuroquinina B.
Un kit para utilizarse en la predicción o diagnóstico de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas, puede comprender un asociado de unión, por ejemplo un anticuerpo, a un producto genético precursor de neuroquinina B o variante o fragmento del mismo.
Un kit para utilizarse en la predicción o diagnosis de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas, puede comprender un asociado de unión, por ejemplo un anticuerpo, a producto genético precursor de neuroquinina B o variante o fragmento del mismo, junto con instrucciones para la realización de una prueba para pronosticar los niveles de neuroquinina B en una muestra biológica y correlacionar los resultados de la prueba con el probable desarrollo futuro de pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas.
Un kit para utilizarse en la estimación del probable grado futuro de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas, puede comprender un asociado de unión, por ejemplo un anticuerpo, a un producto genético precursor de neuroquinina B o variante o fragmento del mismo, junto con instrucciones para la realización de una prueba para predecir los niveles de neuroquinina B en una muestra biológica y correlacionar los resultados de la prueba con la severidad futura pronosticada de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas.
Se puede emplear un agonista de neuroquinina B o neuroquinina B en la preparación de un medicamento para la reducción del volumen de sangre en casos de hipertensión.
La figura 1 muestra la secuencia de polipéptidos del precursor humano clonado de neuroquinina B, disponible con el No. de Registro aaf76980.
La figura 2 muestra la secuencia de polipéptidos del péptido activo de neuroquinina B.
La figura 3 muestra la secuencia de polinucleótidos de cDNA placentario del precursor humano de neuroquinina B, en donde ATG es el codón de iniciación; TAG es el codón de parada; AATAAA es una señal de poliadenilación; AAAAA es la cola de poliA; y GGCACAGAGCTGCTCCACAGGCACC es el cebador de PCR basado en el clon de cDNA de Homo sapiens 138761 (No. de Registro R63635) similar al clon bovino de precursor de neuroquinina B No. de Registro P08858 utilizado para amplificar el gen completo.
La figura 4 muestra la secuencia genómica de neuroquinina B, incluyendo la región promotora de 27928 pares de bases, los intrones y siete exones (subrayados).
La figura 5 muestra los resultados de la PCR semi-cuantitativa para el precursor humano completo de neuroquinina B empleando mRNA recogido en las semanas 9, 13 y a término. La PCR de transcripción inversa fue realizada empleando mRNA recogido en las semanas 9, 13 y a término (T) para amplificar un cDNA del precursor de neuroquinina B de longitud completa de 733 pb. Se emplearon cebadores para \beta-actina como controles (257 pb). M1 representa una sucesión de DNA de 1 kb y M2 representa una sucesión de DNA de 100 pb.
La figura 6 muestra los resultados de HPLC para neuroquinina B oxidada y reducida en plasma humano de embarazo y placenta humana a término. Los extractos placentarios revelaron que el péptido estaba presente en cantidades importantes (21 pg g^{-1} en placenta precoz y 25 pg g^{-1} en placenta a término) y su comportamiento cromatográfico fue idéntico al de NKB sintética. La oxidación parcial de NKB placentaria durante la extracción se tradujo en la producción de tres formas oxidadas en donde uno o ambos residuos de dos metioninas estaban oxidados (a en plasma y b en placenta). Los sulfóxidos de metionina resultantes confirieron una hidrofobicidad reducida, de manera que los mismos eluyeron antes que la forma reducida. Este modelo de elución coincidía con el producido por la oxidación parcial de NKB sintética por peróxido de hidrógeno. La oxidación completa por peróxido de hidrógeno dio lugar a que toda la NKB eluyera en la posición del primer pico. Se observó también un modelo de elución similar después de la extracción de NKB de muestras de placenta a término (b).
La figura 7 muestra el efecto cardiovascular de neuroquinina B en ratas conscientes. Cambios en la presión sanguínea y ritmo cardiaco durante la infusión de salina o dosis cada vez mayores de NKB en ratas hembras conscientes sin reprimir. La NKB fue infusionada a dosis de 1,8 nmol h^{-1} (por kg) desde el tiempo = 0,18 nmol h^{-1} (por kg) desde el tiempo = 16 h y 180 nmol h^{-1} (por kg) desde el tiempo = 20 h. Los valores son valores medios \pm media s.e.;
* representa una diferencia importante respecto de la línea de referencia original y respecto de los valores en t = 20 h (ensayo de Friedman).
La figura 8 muestra una hibridación in situ de mRNA de neuroquinina B en la placenta de humanos y ratas; a, humana a término (39 semanas) con sonda antisentido humana b, humana a término (39 semanas) con sonda de sentido humana c, placenta de rata a los 18 días con sonda antisentido de rata y d, alto aumento que muestra células gigantes de la placenta de rata que expresan neuroquinina B. Aumento: a, 10x tamaño original, b 10x, c 16x, d 40x.
La presente invención está basada parcialmente en el descubrimiento de que la liberación precoz y/o excesiva de neuroquinina B en la corriente sanguínea materna por la placenta en desarrollo, puede ser una causa de hipertensión inducida por el embarazo y pre-eclampsia. En particular, se ha postulado que aquellas personas que probablemente padezcan de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia presentan niveles ligeramente elevados de neuroquinina B en la corriente sanguínea materna a las 10-12 semanas aproximadamente de embarazo. El control de neuroquinina B en la fase inicial del embarazo, por ejemplo a las 10-12 semanas o antes, es útil para pronosticar si el individuo es probable que padezca de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia en la parte final del embarazo, y si el individuo es probable que padezca de complicaciones fetales relacionadas con la pre-eclampsia, tales como retardo del crecimiento fetal, hipoxia fetal o aborto. La medición de los niveles de neuroquinina B después de 10-12 semanas de embarazo, por ejemplo a las 18 semanas, puede permitir la confirmación del pronóstico y puede efectuarse el diagnóstico de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas. Además, se ha observado que el grado de incremento de los niveles de neuroquinina B después de cualquier pronóstico inicial de hipertensión o pre-eclampsia está correlacionado con la severidad futura de la condición. En particular, se ha demostrado que existe una relación entre el grado de incremento de neuroquinina B y la severidad futura de la condición. Estas observaciones se pueden emplear en el pronóstico de la severidad futura de la condición. Igualmente, otros fragmentos del post-tratamiento del precursor humano de neuroquinina B pueden estar implicados en el desarrollo de dichas condiciones. Además, la producción de neuroquinina B y/u otros fragmentos de precursor humano de neuroquinina B puede estar asociada con el desarrollo de hipertensión en personas no
embarazadas.
En la presente invención, las complicaciones fetales incluyen cualquier condición fetal que esté relacionada con la pre-eclampsia. Concretamente, las complicaciones fetales incluyen retardo del crecimiento fetal, hipoxia fetal, dolores de parto antes del término y, en casos severos, aborto.
Para los fines de la presente invención, los productos genéticos del precursor de neuroquinina B incluyen secuencias de polinucleótidos que codifican precursor de neuroquinina B o neuroquinina B, y polipéptidos del precursor de neuroquinina B. Las secuencias de polinucleótidos incluyen secuencias genómicas o de cDNA, por ejemplo, aquellas de las figuras 3 o 4, y RNA, preferentemente mRNA. Con preferencia, los polipéptidos del precursor de neuroquinina B tienen las secuencias mostradas en la figura 1. Los fragmentos de los productos genéticos del precursor de neuroquinina B son fragmentos que se derivan de los productos genéticos del precursor e incluyen las secuencias de polinucleótidos o polipéptidos que codifican neuroquinina B, fragmentos de la misma, y otros fragmentos de post-tratamiento del precursor. Preferentemente, el péptido de neuroquinina B derivado del precursor tiene la secuencia de la figura 2. Los fragmentos o variantes epitópicos son aquellos que comprenden una secuencia de aminoácidos, habitualmente de al menos 4 residuos, que constituye un sitio al cual se puede unir el anticuerpo. Un fragmento epitópico preferido es la secuencia de aminoácidos DMHD de la figura 1.
También quedan incluidas las variantes de productos genéticos del precursor de neuroquinina B. Con preferencia, las variantes comparten al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% y con suma preferencia al menos 99% de la identidad de secuencia con los productos genéticos del precursor de neuroquinina B o fragmentos de los mismos, y preferentemente retienen la misma actividad biológica que el producto genético o fragmento del mismo.
El "% de identidad", como es conocido en la técnica, es una medida de la relación entre dos secuencias de polipéptidos o dos secuencias de polinucleótidos, tal como se determina comparando sus secuencias. En general, las dos secuencias a comparar son alineadas para proporcionar una correlación máxima entre las secuencias. Se examina la alineación de las dos secuencias y se determina el número de posiciones que dan lugar a una correspondencia exacta de aminoácidos o nucleótidos entre las dos secuencias, se divide por la longitud total de la alineación y se multiplica por 100 para proporcionar una cifra de % de identidad. Esta cifra de % de identidad se puede determinar en toda la longitud de las secuencias a comparar, lo cual resulta particularmente adecuado para secuencias de la misma o muy similar longitud y que son altamente homólogas, o bien en longitudes definidas más cortas, lo cual resulta más adecuado para secuencias de longitud desigual o que tienen un nivel más bajo de homología.
Los métodos para comparar la identidad de dos o más secuencias son bien conocidos en la técnica. Así, por ejemplo, los programas disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 9.1 (Devereux J et al., Nucleic Acids Res. 12:387-395, 1984, suministrado por Genetics Computer Group, Maidson, Wisconsin, USA), por ejemplo los programas BESTFIT y GAP, se pueden utilizar para determinar el % de identidad entre dos polinucleótidos y el % de identidad entre dos secuencias de polipéptidos. El BESTFIT utiliza el algoritmo de "homología local" de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1981) y encuentra la mejor región individual de similitud entre dos secuencias. El BESTFIT resulta más adecuado para comparar dos secuencias de polinucleótidos o dos secuencias de polipéptidos que son diferentes en cuanto a longitud, asumiendo el programa que la secuencia más corta representa una porción de la más larga. En comparación, el GAP alinea dos secuencias encontrando una "similitud máxima" de acuerdo con el algoritmo de Neddleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-354, 1970). El GAP resulta más adecuado para comparar secuencias que son aproximadamente de la misma longitud y en donde cabe esperar una alineación en toda la longitud. Preferentemente, los parámetros "Gap Wieght" y "Length Weight" empleados en cada programa son 50 y 3 para secuencias de polinucleótidos y 12 y 4 para secuencias de polipéptidos, respectivamente. Preferentemente, se determinan los % de identidades y similitudes cuando las dos secuencias que están siendo comparadas están alineadas de forma óptima.
También se conocen en la técnica otros programas para determinar la identidad y/o similitud entre secuencias, por ejemplo, la familia de programas BLAST (Altschul S.F. et al, J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990, Altschul S.F. et al, Nucleic Acids Res., 25:289-3402, 1997, suministrados por el National Center for Biotechnology Information (NCB), Bethesda, Maryland, USA y accesibles a través de la página del NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson W.R. y Lipman D.J., Proc. Nat. Acac. Sci., USA, 85:2444-2448, 1988, disponible como parte del Wisconsin Sequence Analysis Package). Preferentemente, se emplea la matriz de sustitución de aminoácidos BLOSUM62 (Henikoff S. y Henikoff J.G., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 89:10915-10919, 1992) en las comparaciones de secuencias de polipéptidos incluyendo en donde las secuencias de nucleótidos son traducidas primeramente a secuencias de aminoácidos antes de la comparación.
Preferentemente, el programa BESTFIT se emplea para determinar el % de identidad de un polinucleótido interrogante o de una secuencia de polipéptidos con respecto a un polinucleótido o una secuencia de polipéptidos de la presente invención, alineándose de forma óptima la secuencia interrogante y la secuencia de referencia y fijándose los parámetros del programa en el valor de defecto.
Ciertos aspectos de la invención se refieren a la predicción o diagnóstico de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas en un sujeto humano. Estos aspectos pueden incluir, por ejemplo, la evaluación de la concentración en una muestra biológica de un producto genético del precursor de neuroquinina B, o variantes o fragmentos del mismo. Dichos aspectos comprenden preferentemente la comparación de los resultados de una evaluación de la concentración del producto genético humano de neuroquinina B (por ejemplo, neuroquinina B o su precursor) en una muestra con los valores esperados o con los valores encontrados en el sujeto en una fecha anterior.
Preferentemente, dichos aspectos se efectúan en una fase inicial del embarazo, por ejemplo 10-12 semanas para el pronóstico o 18 semanas para el diagnóstico.
Se puede incluir cualquier medio para la medición de productos genéticos de neuroquinina B conocido por los expertos en la materia. Preferentemente, se emplean los kits aquí descritos. Además de determinar la presencia de mRNA de neuroquinina B, neuroquinina B o su precursor, o variantes o fragmentos de la misma, en una muestra biológica, también se pueden incluir otras etapas. Estas otras etapas pueden incluir una o más de las siguientes: recogida de la muestra biológica; preparación de la muestra biológica; medición de la concentración de productos genéticos diana de neuroquinina B tal como polipéptido o polipéptidos en la muestra; preparación de curvas estándar para predecir las concentraciones esperadas de los productos genéticos diana de neuroquinina B en personas no embarazadas o en personas embarazadas en las mismas o diferentes fases del embarazo; comparación de los resultados obtenidos a partir de una muestra biológica particular con los valores esperados adecuados o con la curva estándar adecuada para determinar la severidad de la condición; o repetición de algunas o todas las etapas anteriores en una fecha posterior para determinar si ha cambiado la severidad de la condición.
Para los expertos en la materia resultarán evidentes los métodos adecuados de detección utilizando kits, los cuales incluyen radioinmunoensayo (RIA), ensayo de inmunosorbente asociado con enzimas (ELISA), ensayo inmunoradiométrico (IRMA), tecnología de antisentido o ensayo de radiorreceptores (RRA). En este último, por ejemplo se puede emplear el receptor de NK_{3} u otro asociado de unión de neuroquinina B en un sistema de detección o en un sistema biosensor. Se pueden emplear también otros métodos de detección, así como métodos radiométricos, métodos no radioactivos tales como fluorescencia y luminiscencia.
Un método preferido es el radioinmunoensayo, el cual está basado en la interacción de una pequeña cantidad de péptido radiomarcado, por ejemplo neuroquinina B, con una cantidad limitante de asociado de unión tal como anticuerpo (por ejemplo, específico para NKB). El desplazamiento de péptido radiomarcado por dosis cada vez mayores de péptido estándar se compara con aquel desplazado por desconocidos. Esto se controla normalmente separando el marcador unido al asociado de ligación del marcador libre generalmente utilizando una etapa de precipitación del asociado de unión seguido por centrifugado, si bien existen adsorbentes (por ejemplo, carbón vegetal) que pueden unir la fracción marcada libre y que puede ser separada entonces por centrifugado. El IRMA puede ser de un sitio o de dos sitios y utiliza un exceso de asociado de unión específico tal como anticuerpo el cual, en este caso, está radiomarcado. En el ensayo de un solo sitio, la separación se efectúa mediante un exceso de péptido enlazado a una fase sólida que separa asociado de unión sin reaccionar. En el método de dos sitios, se emplea un segundo asociado de unión específico (normalmente enlazado a una fase sólida) que es específico a un epitopo separado en el péptido. La separación se efectúa fácilmente retirando el complejo de la fase sólida. El RRA es similar al RIA ya que en lugar del anticuerpo se emplea una cantidad limitativa de receptor. Con frecuencia, la preparación del receptor se hará en forma de un preparado de membrana, de manera que pueda realizarse el lavado y separación del marcador unido, por ejemplo, mediante centrifugado. El uso de enzimas como la mitad de señalización en ensayos inmunométricos se consigue normalmente mediante reticulación de una enzima al anticuerpo específico o mediante el uso, por ejemplo, de un anticuerpo de cerdo anti-ratón reticulado a una enzima cuando en la reacción inicial se utiliza un anticuerpo monoclonal de ratón.
La invención se refiere también a métodos para estimar el probable grado futuro de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas. Estos métodos comprenden preferentemente comparar los resultados de una evaluación de la concentración de producto genético humano de neuroquinina B (por ejemplo, neuroquinina B o su precursor) en una muestra con los valores esperados. Se cree que la décima semana de embarazo, o más tarde, por ejemplo después de 18 semanas, puede ser un momento particularmente valioso en el cual pueda evaluarse la presencia (y concentración) de los productos genéticos humanos de neuroquinina B.
Los métodos de la invención se efectúan in vitro en una muestra retirada del cuerpo. Se puede emplear cualquier muestra biológica en los métodos de la invención. Las muestras biológicas preferidas incluyen sangre, saliva u orina.
La invención proporciona también el uso de un agente que inhibe el efecto biológico de la neuroquinina B en la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas. Los agentes que inhiben los efectos biológicos de la neuroquinina B incluyen cualesquiera agentes que actúen, por ejemplo, separando la neuroquinina B del plasma; alterando su estructura para impedir la unión a receptores; uniéndose a los receptores directamente para bloquear la unión de neuroquinina B a los mismos (pero sin causar ellos mismos los efectos en aquellos receptores normalmente causados por la neuroquinina B; ejerciendo un efecto contrario a la neuroquinina B en los mismos o distintos receptores; o reduciendo o evitando la expresión o traducción genética, por ejemplo modulando la actividad del promotor genético de neuroquinina B y/o utilizando tecnología antisentido. También se incluyen los agentes que inhiben la producción o tratamiento del precursor para evitar la producción de neuroquinina B. Dentro de este contexto, los agentes que inhiben el efecto biológico de la neuroquinina B incluyen agentes que inhiben el efecto biológico de cualesquiera variantes o fragmentos de neuroquinina B humana o su precursor que están implicados en el desarrollo de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas. El principal sitio de acción de la neuroquinina B es el receptor NK_{3} y, por tanto, los agentes preferidos que inhiben los efectos biológicos de la neuroquinina B de utilidad en la invención, incluyen antagonistas del receptor NK_{3}. Sin embargo, a las altas concentraciones circulatorias encontradas en el embarazo cerca del término, particularmente en personas con hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclámpticas, la neuroquinina B puede tener también efectos importantes en otros receptores (por ejemplo, los receptores NK_{1} o NK_{2}) y por tanto los agentes que inhiben los efectos biológicos de la neuroquinina B de utilidad en la presente invención, incluyen también agentes que evitan los efectos de la neuroquinina B en tales otros receptores específicos, así como antagonistas de neuroquinina de amplio espectro y combinaciones de los mismos.
Desde 1991, ha sido dado a conocer un número de antagonistas no péptidos de alta afinidad. Zinder R.M., et al., (Science, 251:435 (1991)) y Garret C., et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., 88:10208 (1991)), describieron CP-96.345 y RP 67580, respectivamente, como antagonistas en el receptor NK_{1}, mientras que Advenier C., et al., (Brit. J. Pharmacol., 105:78 (1992)), presentaron datos sobre SR 48968 que demuestran su alta afinidad y selectividad por receptores NK_{2}. Más recientemente, Macleod, et al., (J. Med. Chem., 36:2044 (1993)) han publicado una nueva serie de derivados de triptofano como antagonistas del receptor NK_{1}. Recientemente, se ha descrito FK 888, un "dipéptido" con alta afinidad por el receptor NK_{1} (Fukii J., et al., Neuropeptide, 22:24 (1992)).
Los antagonistas del receptor NK_{3} adecuados para utilizarse en la presente invención incluyen todos los materiales que bloquean o reducen el efecto de la neuroquinina B en el receptor NK_{3}, por ejemplo, aquellos materiales descritos en Gao y Peet (Current Medicinal Chemistry, 1999, 6, 375-388), Khavaga y Rogers (Int. J. Biochem Cell Biol. 1996, 28, 7, 721-738), US 5.942.523, US 5.846.973, US 5.491.140, US 5.328.927, US 5.360.820, US 5.344.830, US 5.331.089, US 4.742.156, US 4.665.157, EP 591.040A, WO 94/01402, WO 94/04494, WO 93/011609, Solicitud de Patente Canadiense 2.154.116, EP 693.489 y Solicitud de Patente Canadiense 2.151.116. Ejemplos específicos de antagonistas adecuados incluyen el ligando selectivo del receptor, SR 142801 (Edmonds-Alt, et al., Life Sciences, 56:27 (1995)), y los decapéptidos de fórmula: A^{1}-D-Pro^{2}-His^{3}-D^{4}-Phe^{5}-D-Trp^{6}-Val^{7}-D-Trp^{8}-Leu^{9}-Nle^{10}-NH^{2} en donde A^{1} y D^{4} son aminoácidos Asp o D-Asp.
Agentes preferidos para inhibir los efectos biológicos de la neuroquinina B incluyen aquellos que modulan la actividad del promotor genético del precursor de neuroquinina B, alterando así el nivel de transcripción del gen del precursor de neuroquinina B. Ejemplos de dichos agentes incluyen antagonistas competitivos o no competitivos de factores de transcripción del promotor genético del precursor de neuroquinina B, agentes que inhiben el efecto biológico de factores de transcripción del promotor genético del precursor de neuroquinina B, agonistas de inhibidores del promotor genético del precursor de neuroquinina B y secuencias de polinucleótidos que se unen al promotor genético del precursor de neuroquinina B e inhiben su actividad. Preferentemente, dichos polinucleótidos cumplimentarán de manera suficiente con la totalidad o parte de la secuencia del promotor, de manera que los mismos se hibridarán a la misma e inhibirán la actividad del promotor, preferentemente in vivo. Ejemplos de secuencias de polinucleótidos adecuadas son aquellas que tienen una identidad de secuencia de al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% y preferentemente 99% con el cumplimiento de la totalidad o parte del promotor. Preferentemente, la secuencia de polinucleótidos será cumplimentaria con una región reguladora del promotor, por ejemplo un sitio de unión de factor de transcripción.
Cuando el agente es una secuencia de polinucleótidos, preferentemente se administra en forma de un vector. El vector puede comprender además una o más secuencias reguladoras para activar la expresión de la secuencia de polinucleótidos, por ejemplo promotores que incluyen elementos de respuesta, sitios de consenso, sitios de metilación, regiones de control del lugar, modificaciones post-transcripcionales, variantes de empalme, homeocajas, factores inducibles, dominios de unión de DNA, secuencias promotoras, codones de iniciación y secuencias de poliA. Dichos agentes se pueden administrar por cualquier técnica de terapia genética adecuada, como ya es bien conocido para los expertos en la materia.
La administración de composiciones farmacéuticas se efectúa por cualquier vía eficaz, por ejemplo oral o parenteralmente. Los métodos de suministro parenteral incluyen la administración tópica, intra-arterial, subcutánea, intramedular, intravenosa o intranasal. La administración se puede efectuar también por técnicas relacionadas con la amniocentesis. La administración oral seguido por inyección subcutánea serán las vías preferidas de absorción; igualmente, podrían utilizarse inmovilizaciones de larga actuación. También, y dado que los efectos de la NKB placentaria serán sobre los receptores periféricos, los fármacos eficaces desprovistos de efectos secundarios para el sistema nervioso central serán preferentemente de tipo péptido en sus propiedades de distribución. Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables, adecuados, que comprenden excipientes y otros compuestos que facilitan la elaboración de los compuestos activos en forma de preparados que se pueden emplear farmacéuticamente. Otros detalles respecto a las técnicas para la formulación y administración se pueden encontrar en la última edición de "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES" (Maack Publishing Co. Easton PA).
Las composiciones farmacéuticas para administración oral se pueden formular empleando vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica, en dosis adecuadas para administración oral. Dichos vehículos permiten formular las composiciones farmacéuticas como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones, etc, formulaciones todas ellas adecuadas para ser ingeridas por el paciente.
Los preparados farmacéuticos para uso oral se pueden obtener por medio de la combinación de compuestos activos con excipientes sólidos, molturando opcionalmente la mezcla resultante y elaborando la mezcla de gránulos, después de la adición de compuestos adicionales adecuados, si se desea, para obtener así comprimidos o núcleos de grageas. Excipientes adecuados son las cargas de carbohidratos o proteínas. Estas incluyen, pero no de forma limitativa, azúcares, incluyendo lactosa, sucrosa, manitol o sorbitol, almidón de maíz, trigo, arroz, patata o de otras plantas; celulosa tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa sólida; y gomas incluyendo goma arábiga y goma de tragacanto; así como proteínas, tales como gelatina y colágeno. Si se desea, se pueden añadir agentes desintegrantes o solubilizantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato sódico.
Los núcleos de grageas se proporcionan con revestimientos adecuados tales como soluciones concentradas de azúcar, las cuales pueden contener también goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de los mismos. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los comprimidos o revestimientos de grageas para la identificación del producto o para caracterizar la cantidad de compuesto activo (es decir, la dosis).
Los preparados farmacéuticos que pueden ser utilizados oralmente incluyen cápsulas de ajuste suave hechas de gelatina, así como cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un revestimiento tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste suave pueden contener ingredientes activos mezclados con cargas o ligantes tal como lactosa o almidones, lubricantes tal como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden estar disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicol líquido con o sin estabilizantes.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de compuestos activos. Para inyección, las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tal como solución de Hank, solución de Ringer, o bien salina fisiológicamente tamponada. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Además, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones oleosas adecuadas para inyección. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, tal como aceite de sésamo, o bien ésteres de ácidos grasos sintéticos, tal como oleato de etilo o triglicéridos, o bien liposomas. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
Para administración tópica o nasal, se emplean en la formulación agentes de penetración adecuados para la barrera particular que ha de ser penetrada. Dichos agentes de penetración son en general conocidos en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas útiles en la presente invención se pueden preparar de manera similar a los métodos ya conocidos en la técnica (por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, preparación de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, atrapado o liofilización). Las composiciones farmacéuticas pueden modificarse también para proporcionar características de liberación adecuadas, por ejemplo, liberación retardada o liberación direccionada, por medio convencionales, por ejemplo mediante revestimiento.
La composición farmacéutica se pueden proporcionar como una sal la cual se puede formar con muchos ácidos, incluyendo, pero no de forma limitativa, ácidos clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos u otros disolventes protónicos que las correspondientes formas de la base libre. En otros casos, el preparado preferido puede ser un polvo liofilizado en 1 mM-50 mM histidina, 0,1%-2% sucrosa, 2%-7% manitol en un intervalo de pH de 4,5 a 5,5, que se combina con tampón antes de su uso.
Los agentes de utilidad en la invención (por ejemplo, antagonistas del receptor NK_{3}) pueden también modificarse de manera que solo se suministren en sitios diana seleccionados. Por ejemplo, mediante el ajuste de su estabilidad hacia la digestión proteolítica en el intestino o de su capacidad para no pasar la barrera de sangre/cerebro o mediante la producción de moléculas compuestas que incluyen un componente de direccionamiento, por ejemplo, un anticuerpo selectivo para el sitio diana.
Una vez preparadas las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto útil en la invención, formulado en un vehículo aceptable, las mismas se pueden colocar en un recipiente adecuado y etiquetarse para el tratamiento de una condición indicada. Para la administración de antagonistas del receptor NK_{3}, dicho etiquetado incluirá la cantidad, frecuencia y método de administración.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para utilizarse en la presente invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para conseguir la finalidad deseada. Así, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad suficiente para mejorar los síntomas de la enfermedad que está siendo tratada. La cantidad administrada realmente dependerá del individuo al cual se aplica el tratamiento y preferentemente será una cantidad óptima de manera que se consiga el efecto deseado sin efectos secundarios importantes. La determinación de una dosis terapéuticamente eficaz es una operación de sobre bien conocida para los expertos en la materia. Como es lógico, el experto en la materia entenderá que las dosis divididas y parciales quedan también dentro del alcance de la invención.
Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser estimada inicialmente en ensayos con cultivos de células o en cualquier modelo animal adecuado (por ejemplo, primates para pre-eclampsia, ratas y cobayos para hipertensión y otros pequeños animales de laboratorio para utilizarse con hipertensión inducida y pre-eclampsia inducida). Dichos ensayos deberán tener en cuenta la actividad del receptor así como la actividad de tratamiento aguas abajo. El modelo animal se utiliza también para conseguir un intervalo de concentración y una vía de administración convenientes. Dicha información se puede emplear entonces para determinar dosis y vías útiles para la administración en humanos.
Una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad de agente que mejora los síntomas o condición. La eficacia terapéutica y la toxicidad de dichos compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar, en cultivo de células o en animales experimentales (por ejemplo, el valor ED_{50}, la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población; y el valor LD_{50}, la dosis letal para el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación ED_{50}/LD_{50}. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que exhiben grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos a partir de ensayos en cultivos de células y en estudios con animales, se emplean en la formulación de un intervalo de dosificación para uso humano. La dosificación de dichos compuestos reside preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen el valor ED_{50} con poca o nula toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo en función de la forma de dosificación utilizada, sensibilidad del paciente y vía de administración.
La dosificación exacta es elegida por el médico particular a la vista del paciente a tratar. La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes de la mitad activa o para mantener el efecto deseado. Otros factores, que pueden ser tenidos en cuenta, incluyen la severidad del estado de enfermedad. Las composiciones farmacéuticas de larga actividad podrían administrarse cada 3 a 4 días, cada semana o una vez cada dos semanas dependiendo de la vida media y del grado de eliminación de la formulación particular. Una guía para las dosificaciones y métodos de suministro particulares puede encontrarse en la bibliografía al respecto (véase, Patentes US Nos. 4.657.760; 5.206.344 y 5.225.212).
Los agentes que inhiben el efecto biológico de neuroquinina B de utilidad en la preparación de medicamentos para prevenir o tratar la pre-eclampsia, se formulan preferentemente de manera que el uso del agente sea eficaz, pero no de forma exclusiva, en la fase post-prandial. Por ejemplo, los agentes se pueden seleccionar para que resulten eficaces durante un periodo de 24 horas en lugar de ser eficaces exclusivamente en la fase post-prandial. La fase post-prandial es un momento particularmente importante ya que se cree que la pre-eclampsia está asociada con la acumulación de toxinas en el suministro sanguíneo materno debido al fallo de la sangra para pasar a través del hígado (que normalmente elimina las toxinas) como consecuencia de la alta presión en la vena porta. De este modo, el alivio transitorio de la hipertensión después de las comidas permitirá que la pase a través del hígado en el momento en el que estará la concentración más altas de toxinas y, por tanto, proporcionará una reducción grande en el riesgo de pre-eclampsia, produciendo al mismo tiempo solo un descenso corto del efecto causado por la neuroquinina B producida por la placenta. Este efecto limitado en el tiempo puede lograrse seleccionando agentes con cortas duraciones de actividad y empleando formulaciones y programas de dosificación convenientes.
Con preferencia, la prevención o tratamiento de las condiciones aquí contempladas comenzará tan pronto como sea posible una vez realizado el pronóstico o diagnóstico inicial, por ejemplo después de 10 semanas de embarazo. La decisión respecto al inicio de un curso de tratamiento será como es lógico una decisión del médico y, por tanto, puede comenzarse más pronto o más tarde. Habitualmente, el curso de tratamiento será durante todo el embarazo o hasta que cesan los síntomas. Este puede continuar hasta las 8 semanas después del nacimiento. En pacientes que han sido evaluados como presentando riesgo de desarrollo de condiciones fetales, tal como retardo del crecimiento o hipoxia o pre-eclampsia (a través de la consideración de otros factores tales como abortos anteriores o complicaciones en el embarazo), el curso de tratamiento se puede iniciar tan pronto como se confirma el embarazo y puede continuar hasta el término de este último.
Se puede emplear un producto genético del precursor humano de neuroquinina B o una variante o fragmento del mismo en la preparación de un kit de diagnóstico de utilidad en la predicción o diagnóstico de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas. Preferentemente, el producto genético utilizado es neuroquinina B o una variante o fragmento de la misma, por ejemplo en la producción de un kit de diagnóstico que comprende un asociado de unión específico para neuroquinina B. Con preferencia, las variantes o fragmentos son epitópicas. Queda contemplado que podrían utilizarse también otros productos genéticos, por ejemplo secuencias reguladoras de la secuencia genómica del precursor de neuroquinina B, o bien mRNA del precursor de neuroquinina B en la producción de secuencias antisentido.
Los polipéptidos empleados incluyen neuroquinina B humana o su precursor, o variantes o fragmentos de la misma. Preferentemente, los polipéptidos comprenden la secuencia de la figura 1 o figura 2 respectivamente. Con preferencia, los fragmentos o variantes son epitópicos, como se ha definido anteriormente.
Dichos polipéptidos se pueden producir de forma aislada, sustancialmente pura o como polipéptidos recombinantes. El método para actuar así resultará evidente para el experto en la materia. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas recombinantes o extracción, separación en gel o más generalmente, para péptidos del tamaño de la neuroquinina B, síntesis química, por ejemplo péptido en fase líquida y sólida.
Se proporcionan kits para pronosticar el inicio de, diagnosticar o estimar la severidad futura de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas. Los kits de la invención comprenden un medio para detectar la producción de productos genéticos de neuroquinina B humana tales como polinucleótidos o polipéptidos que codifican neuroquinina B o su precursor o fragmentos o variantes de la misma, por parte del sujeto. De este modo, los kits comprenderán normalmente uno o más de: un asociado de unión a neuroquinina B o su precursor; polipéptido de neuroquinina B o variantes o fragmentos del mismo; y/o secuencias de polinucleótidos que se hibridan a una secuencia que codifica neuroquinina B o una variante o fragmento de la misma.
Por el término "asociado de unión" se quiere dar a entender cualquier sustancia capaz de detectar la diana (y unirse a la misma), por ejemplo, un anticuerpo. Los asociados de unión preferidos para utilizarse en los kits de la invención son anticuerpos específicos para el precursor de neuroquinina B o fragmentos epitópicos o variantes epitópicas de los mismos. Se prefieren los anticuerpos a neuroquinina B y los anticuerpos al precursor de neuroquinina B humana. Sumamente preferidos son los anticuerpos específicos para neuroquinina B, pero también se pueden emplear anticuerpos específicos a cualesquiera otros productos de disgregación del precursor de neuroquinina B que permanecen en el cuerpo durante un tiempo medible. Dichos anticuerpos son capaces de unir fragmentos del precursor humano de neuroquinina B para identificar la producción del precursor por el cuerpo humano. Los anticuerpos de la invención pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos o humanizados o fragmentos de los mismos. Los asociados de unión que reaccionan de forma cruzada con péptidos relacionados, tal como la sustancia P o NKA, por ejemplo, pueden ser útiles como medicamento o en el diagnóstico, dado que los mismos comparten una secuencia común (FVGLM-NH_{2}) con la neuroquinina B.
Los métodos de producción de dichos anticuerpos resultarán evidentes para los expertos en la materia. Por ejemplo, en el caso de anticuerpos policlonales, mediante métodos estándar de inmunización animal o, para anticuerpos monoclonales, mediante los métodos bien conocidos de Köhler y Milstein o mediante el uso de los métodos expuestos en US 5.844.080. Los anticuerpos quiméricos se pueden preparar mediante técnicas de ingeniería genética y son anticuerpos en donde la región constante es de origen humano, pero las regiones variables se derivan, por ejemplo, de un anticuerpo de ratón. La ventaja de los anticuerpos quiméricos es la de reducir la inmunogenicidad. Los anticuerpos humanizados se basan en este principio incluso aún más, ya que solo las regiones determinantes de complementariedad y un número mínimo de otros aminoácidos en las regiones variables se derivan de un animal, tal como un ratón. El resto de la estructura del anticuerpo es de secuencia humana y es reconocido por el sistema inmunológico humano como un anticuerpo humano (véase, por ejemplo, Queen et al., PNAS, USA 86 (Diciembre 1989), 10029-
10033).
Los polinucleótidos de los kits son preferentemente aquellos que se hibridan a una secuencia que codifica neuroquinina B o su precursor o una variante o fragmento de la misma, o complementos de la misma, bajo condiciones rigurosas. Se prefieren las secuencias de polinucleótidos que se hibridan a la secuencia de nucleótidos de la figura 3 o figura 4, o sus complementos, bajo condiciones de hibridación rigurosas. Las condiciones rigurosas son, por ejemplo, 6x SSC a 65º C. Con preferencia, dichas secuencias de polinucleótidos tienen una identidad de secuencia de al menos 85%, de al menos 90%, de al menos 95%, preferentemente de al menos 98% y con suma preferencia de al menos 99% con el cumplimiento de la secuencia de referencia. Dichas secuencias de polinucleótidos son preferentemente de una longitud de al menos 10 nucleótidos y serán útiles en la detección de la expresión de neuroquinina B o su precursor. Dichos polinucleótidos son útiles en la tecnología antisentido o en PCR de diagnóstico. Para los expertos en la materia, serán evidentes los medios para producir los polinucleótidos de la invención, por ejemplo, se pueden producir de forma sintética o mediante sondeo de una biblioteca de cDNA o genómica adecuada (en particular una biblioteca de cDNA placentario).
Los kits empleados en la invención pueden comprender también instrucciones para la realización de una prueba para pronosticar o diagnosticar los niveles de neuroquinina B en una muestra biológica (esta puede ser realizada por medición directa de neuroquinina B o por medición de la concentración de precursor humano de neuroquinina B, o un fragmento del mismo, o utilizando este valor para pronosticar la cantidad de neuroquinina B presente. En la presente invención se pueden emplear los componentes del kit de radioinmunoensayo de neuroquinina B comercial RIK 7357 de Península Laboratorios, Belmont, CA, USA. Los kits útiles en la invención comprenden también preferentemente una clave que muestra la correlación entre los niveles de producto genético de neuroquinina B en la muestra biológica y el diagnóstico de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas, y/o el posible inicio y/o severidad futuro de tales condiciones.
También se proporcionan kits para la prevención o tratamiento de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas, que comprenden medios para inhibir el efecto biológico de neuroquinina B o su precursor en un sujeto. Preferentemente, dichos medios incluyen aquellos agentes definidos anteriormente. En particular, los anticuerpos o secuencias de polinucleótidos que se han descrito anteriormente pueden ser también útiles en dichos kits para inhibir el efecto biológico de neuroquinina B o su precursor. Los kits contienen también preferentemente instrucciones para utilizarlos en la prevención o tratamiento de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas y/o una clave que demuestra la correlación existente entre la cantidad utilizada de agente y el probable efecto sobre la condición.
La pre-eclampsia puede ser también aliviada modificando la dieta de un sujeto humano para reducir el contenido en toxinas (por ejemplo alcaloides) y sustancias generadoras de toxinas. Las sustancias generadoras de toxinas incluyen proteínas que son digeridas en el intestino, y absorbidas desde el intestino, como aminoácidos la mayoría de los cuales son tóxicos en el caso de que circulen por la sangre en concentraciones demasiado altas. Normalmente, cualesquiera aminoácidos en exceso respecto a las necesidades diarias son desaminados inmediatamente por el hígado y metabolizados. El aumento de la proporción de carbohidratos en la dieta puede ser también de una ventaja particular. El modelo dietético del sujeto puede también modificarse para impedir que aparezcan en la vena portal concentraciones pico de toxinas potenciales, por ejemplo, reduciendo sustancialmente la cantidad de comidas individuales (y aumentando la frecuencia de pequeñas comidas).
Los agonistas de neuroquinina B se pueden emplear también como agentes farmacéuticos cuando se considere beneficioso un incremento de la presión sanguínea o un descenso del volumen de sangre. Agentes adecuados incluyen cualquiera que actúe para suplementar o imitar el efecto de neuroquinina B en el receptor NK_{3} (o en cualquier otro receptor), por ejemplo sentida o [MePH^{7}] NKB.
Se pueden proporcionar medios para evaluar los agentes potencialmente eficaces (por ejemplo, antagonistas y agonistas del receptor NK_{3}) ensayando su capacidad para bloquear (o realzar) el efecto hipertensivo de la neuroquinina B en un modelo adecuado. Una vez identificados los agentes adecuados, los mismos pueden ser ensayados entonces adicionalmente para determinar su potencial a la hora de prevenir o tratar hipertensión, hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia, y poderse utilizar consecuentemente. Los métodos de evaluación incluyen técnicas de una gran disposición tal como la tecnología Vilsips™ de Affymetric Inc.; véase, por ejemplo, EPB No.
0476014.
Se podrían utilizar líneas de células transfectadas que contienen el NK_{3} clonado (o NK_{1} o NK_{2}) en la unión del receptor, así como estudios del recorrido de señalización de células, de forma muy clara para el experto en la materia. Esencialmente, para producir preparados de membrana se pueden emplear cualesquiera líneas celulares que expresen niveles endógenamente elevados de receptores de neuroquinina, o bien líneas celulares transfectadas con constructor clonados de cDNA del receptor de neuroquinina. Los preparados de membrana de receptores purificados en solución o después de la reconstitución a membranas fosfolípidas, se pueden emplear entonces para evaluar la unión del receptor con agonistas y/o antagonistas marcados de neuroquinina B. Los efectos de la acción de los agonistas y antagonistas se pueden evaluar empleando ensayos de señalización celular estándar. Estos ensayos son ejemplos típicos de aquellos realizados de forma rutinaria cuando se emplean sistemas de receptores acoplados a proteína G como resultará evidente para el experto en la materia (incluyendo ensayos tales como unión a receptores, determinación de AMP cíclico, proteína quinasa C, concentraciones de trifosfato de inositol, etc). Estos estudios podrían ser realizados también en modelos animales incluyendo el cobayo y la rata que han sido infusionados de forma crónica con agonista para determinar los efectos a largo y corto plazo de neuroquinina B, agonistas de neuroquinina B y antagonistas de neuroquinina B. Se pueden medir efectos tales como cambios en el ritmo cardiaco, presión sanguínea, volumen de sangre y peso de órganos internos (por ejemplo, útero, placenta).
Ejemplos Ejemplo 1 Producción de cDNA de precursor humano de neuroquinina B
Se utilizó la clonación de cDNA placentario, empleando los siguientes métodos, para identificar el precursor humano de neuroquinina B que tiene la secuencia de polipéptidos mostrada en la figura 1. La secuencia de péptidos de neuroquinina B en el precursor está subrayada (el residuo G en el C-terminal finaliza como la amida en la M en el C-terminal del péptido procesado final de la figura 2). El cDNA placentario clonado del precursor humano de neuroquinina B se muestra en la figura 3 y tiene (subrayado) el codón de iniciación de ATG en 26-28, el codón de parada de TAG en 389-391, la señal de poliadenilación de AATAAA en 659-663 y el comienzo de la cola de poliA en 680.
Se obtuvo tejido placentario humano de embarazos finalizados a las 9 y 13 semanas de gestación y a término. Se recogieron muestras de conformidad y con la aprobación del Local Research Ethics Committee. El RNA se extrajo esencialmente en la forma descrita por Chomczinski, P. y Sacchi, N. (1987) Analytical Biochemistry, 162, 156-159.
El precursor de preproneuroquinina B de longitud completa fue amplificado utilizando RT-PCR a partir de RNA plantario humano total a término. Esto se efectuó empleando el método de amplificación de cDNA SMART RACE (Chenchik, A. et al (1998)). En RT-PCR Methods for Gene Cloning and Analysis. Eds. Siebert, P. and Larrick, J. (BioTechniques Books, MA), 305-319). Esencialmente, después de la extracción del RNA total, se realizó transcripción inversa empleando un cebador de síntesis de cDNA (5'AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTAC(T)_{30}N_{1}N3') que contenía una secuencia de anclaje 3'. Se efectuó un race 3' empleando un cebador específico genético 5' (5'GGCA
CAGAGCTGCTCCACAGGCACCAT 3') derivado del clon de cDNA 138761 de Homo sapiens similar al precursor P08858 bovino de neuroquinina B. El fragmento PCR resultante fue purificado en gel siguiendo electrofóresis en gel y clonado al vector de expresión pGEM-T Easy. Los clones resultantes fueron secuenciados y comparados con secuencias presentadas en la base de datos GenBank empleando el programa BLAST (Altschul, S.F., et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410).
Ejemplo 2 PCR semi-cuantitativa para medir NKB en placenta
Se utilizó PCR semi-cuantitativa como más adelante se describe para medir la expresión de mRNA de neuroquinina B en placenta recogida a las 9 semanas, a las 13 semanas y a término. Esto demostró diferencias en el grado de expresión entre la placenta del primer trimestre y la placenta a término. Los niveles de expresión fueron de hasta 5 veces a término, como se muestra en la figura 5.
El cDNA placentario SMART RACE fue amplificado empleando un cebador específico genético 5' (5'GGCA
CAGAGCTGCTCCACAGGCACCAT 3') derivado del clon de cDNA 138761 de Homo sapiens similar al precursor P08858 bovino de neuroquinina B y un cebador de secuencia de anclaje 3' SMART. Para la normalización se utilizó un par de cebadores específicos para \beta-actina. Las PCRs fueron realizadas empleando 21 ciclos de 95º C durante 30 segundos y 68º C durante 2 minutos. Los cebadores fueron elegidos de forma deliberada para que tuvieran altas temperaturas de templado, de manera que las reacciones PCR pudieron ser realizadas en dos etapas para reducir la posibilidad de la formación de productos no específicos. El número de ciclos requeridos para obtener una amplificación exponencial reproducible del producto RT-PCR de \beta-actina se determinó mediante reacciones de control de la terminación en los ciclos 15, 18, 21, 24 y 30 respectivamente. Dichos experimentos se utilizaron para verificar la precisión, eficacia y cantidad de RNA total necesario para obtener una amplificación semi-cuantitativa con el fin de optimizar los niveles de producto PCR de \beta-actina producido. Los productos PCR fueron visualizados por iluminación UV después de electrofóresis (en la figura 5 se muestran también un ladder de DNA de 1 kb (M1) y un ladder de DNA de 100 pb (M2)).
Ejemplo 3 Extracción de neuroquinina B a partir de tejido y plasma placentarios
El ensayo de extractos placentarios empleando las técnicas descritas a continuación reveló que estaba presente neuroquinina B en cantidades importantes y que sus propiedades cromatográficas en HPLC eran idénticas a las de neuroquinina B sintética. También se comprobó el mismo grado de pérdida de hidrofobicidad (en HPLC) después de la oxidación de sus residuos de metionina. Se encontró que la oxidación proporcionaba tres picos de formas oxidada dos veces (1), oxidada una sola vez (2) y no oxidada (3), véase figura 6. La figura 6(a) muestra neuroquinina B oxidada y reducida, separada por RPHPLC de plasma humano durante el embarazo y la figura 6(b) muestra la separación de neuroquinina condensada y reducida por RPHPLC extraída de placenta humana a término.
Extracción de neuroquinina B de placenta
Se pesó la placenta entera y se lavó inmediatamente después de suministrar solución de cloruro sódico 150 mM conteniendo 10 mM EDTA a pH 7,5. Se cortó una muestra de tejido no mayor de 100 g y se homogenizó en 100 ml de solución de salina/EDTA empleando un mezclador con un recipiente de vidrio. A partir de una solución madre en metanol se añadieron inhibidores de proteasa, fluoruro de fenilmetilsulfonilo, N-etilmaleiimida y pepstatina. Después de 20 segundos, se añadieron 800 ml de metanol y se continuó la mezcla durante 1 minuto más. La mezcla fue decantada en tubos de centrífuga de polipropileno y de 200 ml y sometida a centrifugado a 4º C y 3.000 X g durante 30 minutos. Se separó el sobrenadante y se guardó durante la noche a 4º C dando lugar ello a una precipitación adicional que se retiró por centrifugado. El volumen de cada extracto se redujo a menos de 1/8 del volumen inicial y luego se diluyó por adición de tres volúmenes de agua conteniendo 0,1% de ácido trifluoracético (TFA). Cualquier traza de materia en suspensión se separó mediante una etapa de centrifugado final. Se anotó el volumen de extracto y se reservó una cantidad correspondiente a 20 g de placenta para la extracción en fase sólida utilizando cartuchos Sep-Pak C18 3CC (Waters Chromatography Division, Millipore Corporation, Milford, MA, USA). Los cartuchos fueron cebados antes de su uso mediante perfusión con 2 ml de las siguientes soluciones: 1) agua conteniendo 0,1% de TFA y 0,1% de hidrolizado de gelatina Polypep (Sigma-Aldrich, Poole, UK), 2) agua conteniendo 0,1% de TFA, 3) agua conteniendo 80% v/v de acetonitrilo y 4) agua conteniendo 0,1% de TFA. Cada extracto se pasó a través de un cartucho preparado, el cual fue entonces lavado con 2 ml de TFA al 0,1% en agua, 2 ml de TFA al 0,1% en agua conteniendo 10% de acetonitrilo y 20% de TFA. La columna fue eluida con 2 ml de acetonitrilo al 30%, 40% y 50% en agua conteniendo 0,1% de TFA. Las fracciones eluidas fueron reducidas hasta sequedad bajo vacío después de añadir 1 mg de manitol y 100 \mug de Polypep. Placentas más pequeñas obtenidas de abortos fueron tratadas como anteriormente pero disociadas en un homogenizador de vidrio manteniendo las mismas proporciones de tampón y metanol con respecto al peso de las placentas.
Extracción de neuroquinina B de plasma
Se prepararon referencias de neuroquinina B en plasma reunido de la sangre de cinco varones jóvenes tomada en EDTA. Las referencias contenían 1.280, 640, 320, 160 y 80 pg/ml de neuroquinina B. Cada 2 ml de muestra de referencia de plasma se acidificaron por adición de 220 \mul de 1 M HCl conteniendo glicina 0,21 M. Luego fueron diluidas a 10 ml con salina al 0,9% y sometidas a centrifugado a 3.000 X g durante 20 minutos para asegurar una claridad completa. Se cebaron cartuchos Sep-Pak C18 3CC en la forma anteriormente descrita para los cartuchos Sep-Pak C18 3CC. Después de la carga, los cartuchos se lavaron con 1 ml de 0,1 M HCl conteniendo glicina 0,02 M seguido por 1 ml de TFA al 0,1% en agua. Otros lavados con 1 ml de TFA al 0,1% en agua conteniendo 10 y 20% de acetonitrilo fueron seguidos por elución con 1 ml de TFA al 0,1% en una mezcla de 50% de agua y acetonitrilo. Las fracciones eluidas fueron reducidas hasta sequedad bajo vacío después de añadir 1 mg de manitol y 100 \mug de Polypep. La etapa de acidificación aseguró que se estaba extrayendo péptido maduro ya procesado ya que es posible que pudiera escindirse precursor inactivo en circulación por proteasas de plasma endógenas para producir péptidos inmuno-reactivos salvo que se tomaran las debidas precauciones.
Ejemplo 4 Medición de NKB en tejidos y plasma placentarios
Se reconstituyeron extractos placentarios y de plasma en 500 \mul de tampón suministrado como parte de un kit de radioinmunoensayo comercial de neuroquinina B RIK 7357 de Peninsula Laboratorios, Belmont, CA, USA, al cual se había añadido 0,2% de detergente no iónico Igepal CA-630 (Sigma). Se tomaron sub-muestras de 25 \mul de las referencias extraídas y no extraídas y se mezclaron con 75 \mul del tampón anterior. Las referencias se prepararon en tampón conteniendo Igepal, pero al cual se habían añadido 200 \mug/ml de Polypep. Se añadió solución de anticuerpo anti-neuroquinina (100 \mul) a todos los tubos de ensayo excepto a los controles y el ensayo se realizó en la forma descrita en las instrucciones del "General Protocol for Radioimmunoassay Kit". Los ensayos fueron realizados por duplicado y los resultados fueron corregidos con respecto a las referencias extraídas.
Los niveles de neuroquinina B en plasma y placenta en varios voluntarios humanos y ratas fueron medidos por los métodos anteriores. Los resultados de las muestras de plasma se resumen en la tabla 1. Las muestras de placenta fueron recogidas en las semanas 7 a 15 de embarazo y se comprobó que las siete contenían cantidades equivalentes importantes de neuroquinina B; sin embargo, las concentraciones de NKB en plasma detectadas a término fueron del orden de 100 picomolar de las que cabría esperar que tuvieran efecto sobre la cardiovasculatura materna. Las muestras de plasma obtenidas de voluntarias no embarazadas tenían todas ellas bajos niveles del péptido, al igual que la mayoría de las muestras de plasma tomadas de personas que habían sido admitidas por abortos electivos en las semanas 7 a 15. Cuatro muestras de este último grupo tenían concentraciones equivalentes a las encontradas a término. Esto sugiere que la placenta de esta persona puede haber comenzado a segregar concentraciones supra-fisiológicas de neuroquinina B a principios del embarazo. Las muestras de pacientes en la fase última de embarazo que padecen de hipertensión y pre-eclampsia tenían todas ellas concentraciones del orden nanomolar, sugiriendo ello que el ascenso de neuroquinina B puede ser responsable de tales síntomas.
TABLA 1
Semana de embarazo Nmol/l NKB en embarazos normotensivos
6 0
9 0
9 0,97
10 0,535
13 0
13 0
13 0,083
13 0,511
14 0
14 0
14 0,511
17 0,182
17 0,182
18 0
23 0,12
24 0
25 0,17
27 0
28 0
28 0,033
31 0
31 0,031
32 0
33 0
37 0
38 0,07
39 0,138
40 0,05
40 0,2
41 0,118
TABLA 2
Semana de embarazo Nmol/l NKB en embarazos pre-eclámpticos
30 3,964
34 6,156
36 3,796
37 2,141
38 2,752
39 2,004
39 6,288
39 0,98 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3
Paciente número Nmol/l NKB en embarazos normotensivos a término
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0,084
9 0,118
10 0,143
11 0,22
12 0,226
13 0,228
14 0,398
15 0,521
16 1,317
<110> Universidad de Reading
\hskip1.1cm
Lowry, Phillip 
\hskip1.1cm
Page, Nigel 
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Precursor placentario humano de neuroquinina B
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P30988WO/PS
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/GBOO/04315
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2000-11-10
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 9927125.6
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1999-11-16
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<212> FRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ERT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido de neuroquinina
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Met His Asp Phe Phe Val Gly Leu Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 706
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> señal de poliA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (659).. (663)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sitio de polyA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (680)..(706)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(391)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión de cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
2
3 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37661
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31566)..(31619)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27927)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28055)..(28638)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28758)..(30769)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (30864)..(31052)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31083)..(31565)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31620)..(31988)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32063)..(34150)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34431)..(37661)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28644).. (28757)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (30770)..(30863)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31053)..(31082)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31989).. (32059)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DMA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR basado en el clon de cDNA 138761 de Homo sapiens (No. de registro R63635)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggcacagagc tgctccacag gcacc 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador PCR derivado del clon de cDNA 138761 de Homo sapiens similar al precursor P08858 bovino de neuroquinina B
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggcacagagc tgctccacag gcaccat 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de síntesis de cDNA que contenía una secuencia de anclaje 3'
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (56)..(57)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es cualquier nucleótido
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagcagtggt aacaacgcag agtacttttt tttttttttt tttttttttt tttttnn 
\hfill
57 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\sa{Phe Val Gly Leu Met}
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Claims (19)

1. Uso de un asociado de unión a un producto genético del precursor de neuroquinina B o variante o fragmento del mismo en la preparación de un kit de diagnóstico para utilizarse en el pronóstico o diagnóstico de hipertensión inducida por el embarazo, pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas.
2. Uso según la reivindicación 1, en donde el kit de diagnóstico comprende además instrucciones para la realización de una prueba para medir los niveles de neuroquinina B en una muestra biológica y correlacionar los resultados de la prueba con el probable desarrollo futuro de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas, respectivamente.
3. Uso de un asociado de unión a un producto genético del precursor de neuroquinina B o variante o fragmento del mismo, junto con instrucciones para la realización de una prueba para medir los niveles de neuroquinina B en una muestra biológica y correlacionar los resultados de la prueba con la severidad futura pronosticada de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas, respectivamente, en la preparación de un kit de diagnóstico para estimar la probable severidad futura de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o condiciones fetales relacionadas.
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el asociado de unión es un anticuerpo específico para precursor de neuroquinina B o neuroquinina B o un fragmento epitópico o variante epitópico de la mis-
ma.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el asociado de unión es un anticuerpo específico para el precursor humano de neuroquinina B que tiene la secuencia SEQ ID NO:1 o una variante epitópica o fragmento epitópico del mismo.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el kit de diagnóstico es un radioinmunoensayo, un kit de ensayo de inmunosorbente enlazado a enzimas, un kit de ensayo inmunoradiométrico o un kit de ensayo de radiorreceptores o un kit basado en fluorescencia o luminiscencia.
7. Uso de un agente que inhibe el efecto biológico de neuroquinina B en la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas.
8. Uso según la reivindicación 7, en donde el agente que inhibe el efecto biológico de neuroquinina B es un antagonista de NK_{1}, NK_{2} o NK_{3}.
9. Uso según la reivindicación 8, en donde el antagonistas de KN_{3} es SR142801 o los decapéptidos con la siguiente fórmula A^{1}-D-Pro^{2}-His^{3}-D^{4}-Phe^{5}-D-Trp^{6}-Val^{7}-D-Trp^{8}-Leu^{9}-Nle^{10}-NH_{2} en donde A^{1} y D^{4} son aminoácidos Asp o D-Asp.
10. Uso según la reivindicación 7, en donde el agente que inhibe el efecto biológico de neuroquinina B es uno que modula la actividad del promotor genético de neuroquinina B.
11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde el medicamento es formulado de manera que el agente sea eficaz durante un periodo de 24 horas.
12. Método para pronosticar o diagnosticar hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas en un sujeto humano mediante evaluación de la concentración en una muestra biológica de producto genético del precursor humano de neuroquinina B o una variante o fragmento del mismo.
13. Método para pronosticar o diagnosticar hipertensión inducida por el embarazo en una fase precoz e un sujeto humano o para pronosticar pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas en un sujeto humano mediante la evaluación de la concentración en una muestra biológica de neuroquinina B o su precursor o de una variante epitópica o fragmento epitópico del mismo.
14. Método según la reivindicación 12 o 13, en donde la neuroquinina B y su precursor tienen las secuencias SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2, respectivamente.
15. Método para estimar la probable severidad futura de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas en un sujeto humano mediante la evaluación de la concentración en una muestra biológica de producto genético del precursor humano de neuroquinina B o una variante o fragmento del mismo, y correlación del resultado con la severidad futura pronosticada de hipertensión inducida por el embarazo o pre-eclampsia o complicaciones fetales relacionadas.
16. Método según la reivindicación 15, que comprende evaluar la concentración en una muestra biológica de neuroquinina B.
17. Método según la reivindicación 15 o 16, en donde la concentración de producto genético del precursor humano de neuroquinina B o una variante o fragmento del mismo se evalúa empleando un anticuerpo específico para neuroquinina B.
18. Método según la reivindicación 17, consistente en un radioinmunoensayo, un ensayo de inmunosorbente enlazado a enzimas, un ensayo inmunoradiométrico o un ensayo de radiorreceptores o un método basado en fluorescencia o luminiscencia.
19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en donde la muestra biológica es sangre.
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