ES2244861T3

ES2244861T3 - Dispositivo cromatografico y procedimiento de deteccion de un analito en una muestra de sangre.

Info

Publication number: ES2244861T3
Application number: ES03009811T
Authority: ES
Inventors: Toru Yoshimura; Toshihiro Ogasawara; Michihiro Saito; John P. Groff
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1998-01-15
Filing date: 1998-12-29
Publication date: 2005-12-16
Anticipated expiration: 2018-12-29
Also published as: KR100575390B1; CZ20002606A3; CN1125343C; AR014312A1; CN1213303C; TW594012B; IL136236A; DK1047943T3; PT1371984E; DE69816339D1; NO20003569L; LT2000071A; HU225975B1; TR200002051T2; EP1371984A1; BR9814007A; CN1285918A; DK1371984T3; DE69830675D1; US6673629B2

Abstract

Un dispositivo de ensayo de cromatografía para detectar la presencia de un analito en una muestra de sangre incluyendo: un soporte de cromatografía que define un recorrido para flujo de fluido y soporta flujo capilar, un lugar de aplicación para dicha muestra de sangre en contacto de flujo de fluido con dicho soporte de cromatografía, un lugar de detección en dicho soporte de cromatografía separado de dicho lugar de aplicación al que está unido de forma no difusiva una sustancia de atrapamiento, una sustancia marcada unida de forma difusiva situada en dicho lugar de aplicación, un policatión unido de forma difusiva para separar plasma o suero de dicha muestra de sangre hacia arriba de dicho lugar de detección, y un polianión unido de forma difusiva para neutralizar el policatión hacia abajo de dicho policatión unido y hacia arriba de dicho lugar de detección.

Description

Dispositivo cromatográfico y procedimiento de detección de un analito en una muestra de sangre.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a dispositivos de ensayo de cromatografía y un método de detectar un analito en una muestra de sangre entera, y más en particular a un dispositivo y método que emplean un agente separador de glóbulos rojos para agregar glóbulos rojos, y un agente neutralizante para neutralizar el efecto negativo que el agente separador de glóbulos rojos pueda tener en el sistema de ensayo.

Antecedentes de la invención

Se realizan rutinariamente métodos modernos de diagnóstico clínico en muestras de sangre. Por desgracia, los glóbulos rojos interfieren con muchas determinaciones de diagnóstico. En ensayos de un analito, los glóbulos rojos pueden inhibir la unión entre elementos específicos del par de unión. Igualmente, los glóbulos rojos tienen actividad enzimática que, dependiendo del ensayo empleado, puede interferir con la señal producida. Además, en un formato de prueba rápida usando un dispositivo de ensayo de cromatografía, en particular un dispositivo de inmunoensayo de cromatografía, los glóbulos rojos pueden inhibir el flujo de fluido que es necesario para que se produzcan reacciones en el dispositivo. Por esta y otras razones, muchas metodologías de ensayo se realizan en plasma o suero que primer hay que separar de una muestra de sangre entera.

Hay muchas técnicas conocidas para separar glóbulos rojos de plasma en una muestra de sangre entera. La centrifugación es un método conocido en la técnica por el que se separa plasma (antes de la coagulación) y suero (después de la coagulación) de la sangre entera. En este procedimiento, los glóbulos rojos sedimentan en la parte inferior del tubo de prueba, y el suero se separa por decantación o algún otro método. Sin embargo, la estratificación de sangre entera por centrifugación tiene muchas desventajas. En general, la centrifugación requiere tomar una muestra grande de sangre. Además, el proceso es lento y requiere equipo engorroso de laboratorio frecuentemente no mantenido en un consultorio médico. Finalmente, la manipulación adicional de la sangre aumenta la exposición a los peligros potenciales de patógenos transportados en la sangre.

Para reducir o eliminar la necesidad de centrifugación, se han desarrollado dispositivos de ensayo que emplean membranas de gradiente o membranas de atrapamiento para separar glóbulos rojos de la porción líquida de la sangre. También se han usado anticuerpos antiglóbulos rojos inmovilizados.

Otras técnicas conocidas para separar glóbulos rojos de plasma o suero incluyen (1) combinar una muestra de sangre entera con un agente de unión de glóbulos rojos filtrando la mezcla a través de un elemento bíbulo sólido al que se une al menos un elemento específico del par de unión para quitar los glóbulos rojos aglutinados; (2) pasar sangre entera a través de un filtro de microfibras de vidrio que puede tener o no un agente aglutinante incorporado; (3) emplear una capa de barrera o exclusión de material polisacárido para evitar que pasen glóbulos rojos a su través e interfieran con la detección o visualización de una señal en una tira de prueba seca; y (4) usar un soporte que tiene una superficie policatiónica que une glóbulos rojos pero no plasma.

Muchas de estas técnicas para la separación de glóbulos rojos del plasma son costosas, complicadas, pueden dar lugar a separación incompleta de glóbulos rojos, y pueden producir hemolisis. La hemolisis conduce a unión no específica o alto ruido de fondo que produce una pérdida de la sensibilidad del ensayo. Esto puede ser el resultado de la hemoglobina libre que puede colorear la zona de detección de tal manera que la zona pueda obtener un color del orden de rosa a granate oscuro. Como resultado, la producción de una señal química visual puede ser oscurecida total o parcialmente por la presencia del color de la hemoglobina en la zona de detección. Además, el uso de un agente separador, tal como un policatión, en un sistema de ensayo tiende a interferir con el sistema, agregando frecuentemente otros reactivos o elementos de unión además de los glóbulos rojos.

Por consiguiente, se necesita un dispositivo y método para detectar un analito en una muestra de sangre sin afectar adversamente al sistema de ensayo. Dicho dispositivo y método deberán ser adecuados para muestras de sangre entera de varios tamaños, incluyendo muestras pequeñas.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un dispositivo de cromatografía incluyendo un soporte de cromatografía que define un recorrido para flujo de fluido capaz de soportar flujo capilar, un lugar de aplicación para dicha muestra de sangre en contacto de flujo de fluido con el soporte de cromatografía, un lugar de detección en el soporte de cromatografía separado del lugar de aplicación, una sustancia marcada unida de forma difusiva situada hacia abajo del lugar de aplicación, un agente separador de glóbulos rojos unido de forma difusiva para separar plasma o suero de la muestra de sangre hacia arriba del lugar de detección, y un agente neutralizante unido de forma difusiva capaz de unión con el agente separador hacia abajo del agente separador unido y hacia arriba de dicho lugar de detección, por lo que se neutraliza una carga positiva de dicho agente separador. Preferiblemente, el agente separador de glóbulos rojos está situado en el lugar de aplicación de manera que los glóbulos rojos se separarán del suero o plasma antes de que el suero o plasma se baje por el soporte de cromatografía.

EP-A-0 325 413 describe un dispositivo de prueba inmunocromatográfica incluyendo una zona con un reactivo policatiónico unido de forma difusiva situado hacia arriba del lugar de detección para capturar/separar glóbulos rojos de suero de plasma. El dispositivo no tiene medios para neutralizar el exceso de reactivo policatiónico. US-A-5.670.381 describe un dispositivo de prueba inmunocromatográfica incluyendo un reactivo policatiónico unido de forma no difusiva en la zona de detección, un reactivo de marcación, y un reactivo de captura que consta de un conjugado de captura de molécula-polianión, donde la marca y reactivo de captura están unidos de forma difusiva a la zona de aplicación de muestra. El reactivo policatiónico tiene la función de facilitar la migración de conjugado de captura en la zona de detección. WO-A-96/31270 describe un dispositivo de prueba inmunocromatográfica incluyendo una zona con un poliol unido de forma difusiva situado hacia arriba del lugar de detección para filtrar glóbulos rojos de suero de plasma. EP-A-0 735 369 describe una tira de prueba incluyendo un temporizador químico para minimizar las lecturas de prueba no fiables debidas a alta coloración de la muestra.

La presente invención también se refiere a un método para detectar la presencia de un analito en una muestra, preferiblemente una muestra de sangre, que incluye disponer un soporte de cromatografía que define un recorrido para flujo de fluido capaz de soportar flujo capilar, a lo largo del que hay (a) un lugar de aplicación para la muestra de sangre en contacto de flujo de fluido con dicho soporte de cromatografía, (b) un lugar de detección en el soporte de cromatografía separado del lugar de aplicación, (c) una sustancia marcada unida de forma difusiva situada hacia abajo del lugar de aplicación, (d) un agente separador de glóbulos rojos unido de forma difusiva para separar plasma o suero de dicha muestra de sangre hacia arriba del lugar de detección, y (e) un agente neutralizante unido de forma difusiva capaz de unión con el agente separador situado hacia abajo del agente separador unido y hacia arriba del lugar de detección por lo que una carga positiva del agente separador es neutralizada; poner el lugar de aplicación en contacto con la muestra de sangre de tal manera que el agente separador de glóbulos rojos separe el plasma o suero de la muestra de sangre, y el agente neutralizante neutralice la carga positiva del agente separador cuando la muestra fluya a lo largo del recorrido de flujo; y detectar la presencia de analito en la muestra de sangre.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 ilustra una realización preferida del dispositivo de ensayo de cromatografía de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en la observación de que los glóbulos rojos en muestras de sangre entera interfieren con las determinaciones de la presencia o cantidad de analito en una muestra de sangre que de otro modo se podrían realizar fácilmente mediante sistemas de ensayo. Por ejemplo, en un inmunoensayo, es improbable que una muestra de sangre entera en contacto con un lugar de aplicación baje por la tira mediante acción capilar debido a la presencia obstaculizante o interferente de los glóbulos rojos. La presente invención supera este problema sin interferir con la sensibilidad del sistema de ensayo.

Las definiciones siguientes pueden ser útiles para comprender las realizaciones de la presente invención.

"Analito" o "analito de interés" se refiere al compuesto o la composición a detectar o medir, que tiene al menos un epítopo o lugar de unión. El analito puede ser cualquier sustancia para la que existe un elemento natural de unión específico de analito o para el que se puede preparar un elemento de unión específico de analito. Los analitos incluyen, aunque sin limitación, toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptidos, microorganismos, aminoácidos, ácidos nucleicos, hormonas, esteroides, vitaminas, medicamentos (incluyendo los administrados a efectos terapéuticos así como los administrados para fines ilícitos), y metabolitos de o anticuerpos para alguna de las sustancias anteriores. El término "analito" también incluye cualesquiera sustancias antigénicas, haptenos, anticuerpos, macromoléculas y sus combinaciones.

"Soporte cromatográfico" se refiere a cualquier material poroso, absorbente, bíbulo, isotrópico o capilar adecuado, que incluya el lugar de detección del dispositivo y mediante el que el analito o la muestra de prueba se pueden transportar por acción capilar o de mecha. Los expertos en la técnica apreciarán que el soporte de cromatografía se puede hacer de un solo material o más de un material (por ejemplo, zonas diferentes, porciones, capas, zonas o lugares se pueden hacer de materiales diferentes) a condición de que las capas múltiples estén en contacto de flujo de fluido una con otra, por lo que es posible el paso de muestra de prueba entre los materiales. El contacto de flujo de fluido permite el paso de al menos algunos componentes de la muestra, es decir analito, entre las zonas del material poroso y es preferiblemente uniforme a lo largo de la interface de contacto entre las zonas diferentes. Se puede usar materiales naturales, sintéticos o naturalmente existentes que están modificados sintéticamente, como el soporte de cromatografía, e incluyen, aunque sin limitación: papel (fibroso), o membranas (microporosas) de materiales de celulosa tal como papel; celulosa y derivados de celulosa tal como acetato de celulosa y nitrocelulosa; fibra de vidrio; tela, tanto natural (por ejemplo algodón) como sintética (por ejemplo nylon); geles porosos; y análogos.

"Marcador" se refiere a cualquier sustancia que sea capaz de producir una señal que es detectable por medios visuales o instrumentales. Varias marcas adecuadas para ser utilizadas en la presente invención incluyen marcas que producen señales mediante medios químicos o físicos. Los ejemplos incluyen enzimas y sustratos, cromógenos, compuestos fluorescentes, compuestos quimiluminiscentes, partículas de color o coloreables de látex de polímero orgánico, y liposomas u otras vesículas conteniendo sustancias visibles directamente. En la presente invención se emplean preferiblemente marcas radiactivas, partículas metálicas coloidales o partículas no metálicas coloidales. Las marcas preferidas incluyen partículas coloidales de oro y látex.

"Sustancia marcada" o "conjugado" se refiere a una sustancia incluyendo una marca detectable unida a un elemento de unión específico. La unión puede ser unión covalente o no covalente, y puede incluir hibridación de ácido nucleico. La marca permite que la sustancia marcada produzca una señal detectable que está relacionada directa o indirectamente con la cantidad de analito en una muestra de prueba. El componente elemento de unión específico de la sustancia marcada se selecciona para unión directa o indirecta al analito.

"Elemento específico de unión" se refiere a un elemento de un par de unión específico, es decir, dos moléculas diferentes donde una de las moléculas se une específicamente a la segunda molécula mediante medios químicos o físicos. Si el elemento de unión específico es un inmunorreactivo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, antígeno, hapteno, o su complejo, y si se utiliza un anticuerpo, puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, una proteína recombinante o anticuerpo, un anticuerpo quimérico, mezcla(s) o fragmento(s) de los mismos, así como una mezcla de un anticuerpo y otros elementos de unión específicos. Los ejemplos específicos de elementos de unión específicos incluyen biotina y avidina, un anticuerpo y su antígeno correspondiente (que no tienen relación con una muestra a analizar), un ácido nucleico de cadena única y su complemento, y análogos.

"Sustancia de atrapamiento" se refiere a uno o varios elementos de unión específicos que están unidos dentro o en una porción del soporte cromatográfico para formar uno o varios "lugares de captura" donde el analito, reactivo marcado, y/o reactivo de control se inmovilizan en el soporte de cromatografía. El método de unión no es crítico para la presente invención. La sustancia de atrapamiento facilita la observación de la señal detectable separando sustancialmente el analito y/o la sustancia marcada de reactivos de ensayo no unidos y los componentes restantes en la muestra de prueba. La sustancia de atrapamiento se puede inmovilizar en el soporte de cromatografía antes o durante la realización del ensayo por medio de cualquier método de unión adecuado. Además, la sustancia de atrapamiento se puede prever en un solo lugar de detección o en lugares múltiples sobre o en el soporte de cromatografía. La sustancia de atrapamiento también puede estar dispuesta en varias configuraciones para producir diferentes formatos de detección o medición. Por ejemplo, la sustancia de atrapamiento se puede configurar como una letra, número, icono o símbolo, o cualquier combinación de los mismos.

En particular, la presente invención proporciona un dispositivo de ensayo de cromatografía para detectar la presencia de un analito en una muestra, preferiblemente una muestra de sangre. El dispositivo tiene preferiblemente forma de una tira cromatográfica que tiene un soporte cromatográfico que define un recorrido para flujo de fluido y que es capaz de soportar flujo capilar, un lugar de aplicación para la muestra de sangre, y un lugar de detección separado del lugar de aplicación para detectar la presencia o cantidad de analito presente en la muestra de sangre. Preferiblemente, el dispositivo también incluye una sustancia marcada (o conjugado) unida de forma difusiva al soporte cromatográfico. En una realización preferida, la sustancia marcada se unirá al analito o competirá con el analito por la unión en el lugar de detección. El dispositivo contiene preferiblemente dos agentes adicionales unidos de forma difusiva al soporte cromatográfico: (1) un agente separador de glóbulos rojos hacia arriba (en adelante, la dirección del movimiento de una muestra producido por acción capilar se denomina "hacia abajo" y la dirección contraria se denomina "hacia arriba") del lugar de detección que es capaz de separar plasma o suero de la muestra de sangre, y (2) un agente neutralizante hacia abajo del agente separador de glóbulos rojos y hacia arriba del lugar de detección para neutralizar cualquier efecto, en particular un efecto adverso, del agente separador de glóbulos rojos en el sistema de cromatografía.

En el contexto de la presente invención, la expresión "unido de forma difusiva" aplicada a un reactivo dado se puede definir como cualquier reactivo utilizado en la presente invención, incluyendo, aunque sin limitación, una sustancia marcada, elemento de unión específico, agente separador de glóbulos rojos o agente neutralizante, para denotar que el (los) reactivo(s) está(n) unido(s) de una forma que permite que el (los) reactivo(s) unido(s) fluyan a lo largo del recorrido de flujo.

A los efectos de la presente invención, se puede emplear cualquier sistema de ensayo. Se prefieren sistemas de inmunoensayo, incluyendo, aunque sin limitación, sistemas de flujo lateral, sistemas de flujo vertical, sistemas de impregnación, y varillas de inmersión. A continuación se expone una descripción general de sistemas de ensayo conocidos.

En general, en una tira de cromatografía, se dispone al menos un lugar de aplicación de muestra y un lugar de detección en un soporte de cromatografía. Una solución de muestra, en este caso preferiblemente una muestra de sangre, sospechosa de tener un analito de interés, es decir un analito, se mueve a través del soporte de cromatografía por acción capilar cuando se añade al lugar de aplicación de muestra, y una sustancia marcada o conjugado que se contiene en un medio marcador dispuesto en un soporte de cromatografía con anterioridad se acumula en el lugar de detección en proporción directa o inversa a la presencia o cantidad de la sustancia a analizar en la solución de muestra, efectuada por una reacción de unión (tal como una reacción inmunológica), de manera que la presencia o cantidad de sustancia a analizar en la solución de muestra se pueda hallar midiendo la presencia o cantidad de la sustancia marcada o conjugado así acumulado. Se conocen varios tipos de tiras de cromatografía, y todas estas tiras de cromatografía conocidas, incluyendo las que se describirá más adelante, se pueden usar en la presente invención. El término "dispositivo de ensayo de cromatografía" en el sentido en que se usa aquí significa una tira de cromatografía que se produce de tal forma que se pueda usar en un ensayo y sea capaz de almacenar y transportar.

A continuación se describe un ejemplo típico de una tira de cromatografía. Un lugar de aplicación de muestra puede estar situado en el mismo lugar donde la sustancia marcada está presente, preferiblemente en una posición hacia arriba de la sustancia marcada. Cuando una solución de muestra, sospechosa de contener un analito a analizar, se pone en contacto con el lugar de aplicación de muestra, la solución de muestra se mueve a través del soporte de cromatografía en la dirección hacia abajo junto con el analito por acción capilar. Típicamente, el analito es un compuesto que se une de forma específica a una sustancia de atrapamiento fijada al lugar de detección, o es un compuesto que se une de forma específica a un conjugado que se une específicamente a la sustancia de atrapamiento en el lugar de detección. Por ejemplo, el analito es un anticuerpo cuando la sustancia de atrapamiento es un antígeno o el conjugado contiene un antígeno, y el analito es un antígeno cuando la sustancia de atrapamiento es un anticuerpo o el conjugado contiene un anticuerpo. Como otro ejemplo, el analito puede ser un ácido nucleico que se une a un conjugado y sustancia de atrapamiento complementario.

Cuando el lugar de aplicación de muestra está situado en una posición hacia arriba a una sustancia marcada, la sustancia marcada se puede disponer junto al lugar de aplicación de muestra o en una posición desconectada del lugar de aplicación de muestra.

La adición de la sustancia marcada se puede efectuar por varios medios, por ejemplo añadiéndola a una cierta posición fuera del lugar de detección de la tira de cromatografía después de la adición de la solución de muestra.

Puesto que la sustancia marcada está dispuesta de tal manera que se mueva por la acción capilar de la solución de muestra, la sustancia marcada se mueve en la dirección hacia abajo cuando la solución de muestra se añade a los medios de adición de muestra.

El lugar de detección está situado en general en una posición hacia abajo de la sustancia marcada y a una cierta distancia de la sustancia marcada. En el lugar de detección, una sustancia de atrapamiento que se une solamente a un analito o un conjugado de forma específica, o se une específicamente a cada una de las sustancias a analizar y una sustancia marcada, está fijado al soporte de cromatografía. En consecuencia, en una realización el analito (enlazado a veces a una sustancia marcada), movido por acción capilar de la solución de muestra, se une a la sustancia de atrapamiento o a un conjugado que a su vez se une a la sustancia de atrapamiento. La sustancia marcada se une a la sustancia a analizar así unida, efectuando por ello acumulación de la sustancia marcada en los medios detectores en respuesta a la presencia o cantidad del analito. Alternativamente, la sustancia marcada y el analito, movido por acción capilar, se unen de forma competitiva a la sustancia de atrapamiento o a un conjugado que a su vez se une a la sustancia de atrapamiento, efectuando por ello acumulación de la sustancia marcada en proporción inversa a la cantidad de sustancia a analizar.

Hay un caso en el que una cierta sustancia marcada se une tanto a una sustancia de atrapamiento (o un conjugado que a su vez se une a una sustancia de atrapamiento) y un analito, pero no simultáneamente y, en ese caso, el analito se une en primer lugar a la sustancia marcada y la sustancia marcada restante que no se unió a la sustancia a analizar se une a la sustancia de atrapamiento. En consecuencia, la presencia o cantidad del analito se puede analizar midiendo la sustancia marcada acumulada en los medios detectores.

Según requiera la ocasión, varias sustancias están situadas hacia arriba del lugar de detección. Por ejemplo, un conjugado puede estar situado de forma móvil.

En algunos casos, se puede disponer uno o varios lugares de detección adicionales hacia abajo del primer lugar de detección. Además, hacia abajo del lugar de detección puede haber otra extensión del soporte de cromatografía de manera que una solución de muestra se pueda descargar completamente o el soporte pueda estar equipada con un material para uso en la absorción de la solución de muestra.

Así, la presencia o cantidad de un analito de interés en una solución de muestra se puede hallar midiendo la presencia o cantidad de una sustancia marcada acumulada en el lugar de detección. En un caso, esto se puede llevar a cabo visualmente.

La presente invención pretende usarse con cualquier muestra de sangre, incluyendo suero y plasma, pero se usa preferiblemente con una muestra de sangre conteniendo glóbulos rojos, por ejemplo, sangre entera.

Antes de analizar el analito de interés en la muestra de sangre, los glóbulos rojos se quitan preferiblemente si el ensayo ha de operar con la sensibilidad deseada. Así, según la presente invención, se une un agente separador de glóbulos rojos al soporte de cromatografía. Preferiblemente, el agente separador de glóbulos rojos está unido de forma difusiva al soporte de cromatografía. El agente separador de glóbulos rojos puede unirse al soporte de cromatografía en cualquier posición que sirva para separar los glóbulos rojos del plasma o suero. Es preferible unir de forma difusiva el soporte cromatográfico hacia arriba del lugar de detección. Muy preferiblemente el agente separador de glóbulos rojos está unido de forma difusiva en el lugar de aplicación de muestra. Esta posición es preferible porque produce agregado de los glóbulos rojos tan pronto como se aplican al soporte de cromatografía dando lugar a mínima, o nula, interferencia en el flujo del suero o plasma a lo largo del soporte por acción capilar.

El agente separador de glóbulos rojos de la presente invención puede ser cualquier sustancia capaz de agregar glóbulos rojos. Los agentes preferidos son materiales de carga positiva tal como policationes, incluyendo por ejemplo, hidrobromuro de poli-L-lisina; cloruro de poli(dimetil dialil amonio) (Merquat®-100, Merquat® 280, Merquat® 550); hidrocloruro de poli-L-arginina; poli-L-histidina; poli(4-vinilpiridina), hidrocloruro de poli(4-vinilpiridina); poli(4-vinilpiridina) entrecruzada, sal cuaternaria de cloruro de metilo; poli(4-vinilpiridina-co-estireno); poli(4-vinilpiridinio poli(fluoruro de hidrógeno)); poli(sulfonato de 4-vinilpiridinio-P-tolueno); poli(4-vinilpiridinio-tribromuro); poli(metacrilato de 4-vinilpirrolidona-co-2-dimetilaminoetilo); poli vinilpirrolidona, entrecruzada; poli vinilpirrolidona, poli(melamina-co-formaldehído); parcialmente metilada; bromuro de hexadimetrina; poli(Glu, Lys) 1:4 hidrobromuro; poli(Lys, Ala) 3:1 hidrobromuro; poli(Lys, Ala) 2:1 hidrobromuro; poli-L-lisina succinilada; poli(Lys, Ala) 1:1 hidrobromuro; y poli(Lys, Trp) 1:4 hidrobromuro. El policatión más preferido es cloruro de poli(dimetil dialil amonio) (Merquat®-100).

El agente separador de glóbulos rojos de la presente invención se puede usar en cualquier cantidad adecuada que sirva para separar los glóbulos rojos del resto de la muestra. Preferiblemente, el agente separador de glóbulos rojos puede estar presente en una concentración de desde aproximadamente 0,04% a aproximadamente 1,3% (peso por volumen), siendo más preferido desde aproximadamente 0,13% a aproximadamente 0,33% (peso por volumen), y aproximadamente 0,20% a aproximadamente 0,33% (peso por volumen).

Una carga positiva en el agente separador de glóbulos rojos tiene tendencia a agregar cualquier agente con carga negativa presente en la tira. Por ejemplo, una sustancia marcada o conjugado unido al soporte de cromatografía también puede ser agregada por el agente separador de glóbulos rojos que interfiere con la unión del analito al conjugado o, en un ensayo competitivo, la unión de la sustancia marcada y el analito de interés a la sustancia de atrapamiento al lugar de detección o un conjugado. En último término, la sensibilidad y exactitud del sistema de inmunoensayo puede estar en peligro.

Por consiguiente, cuando el agente separador de glóbulos rojos es un material de carga positiva, la presente invención emplea preferiblemente un agente de neutralización. El agente de neutralización es capaz de neutralizar la carga positiva del agente separador de glóbulos rojos, eliminando por ello o al menos minimizando toda la interferencia al sistema de ensayo producido por el agente separador de glóbulos rojos. Preferiblemente, el agente de neutralización está unido de forma difusiva al soporte cromatográfico. El agente neutralizante puede estar unido de forma difusiva en cualquier posición en el soporte cromatográfico donde funcionará para neutralizar un agente separador de glóbulos rojos, pero está situado preferiblemente hacia abajo del agente separador de glóbulos rojos y hacia arriba del lugar de detección, y más preferiblemente está situado en el mismo lugar en la cromatografía como la sustancia marcada de forma difusiva.

El agente neutralizante puede ser cualquier polianión capaz de neutralizar la carga positiva del agente separador de glóbulos rojos. Los polianiones preferidos incluyen poli(ácido acrílico), poli(ácido acrílico, sal Na), poli(ácido metil metacrílico), poli(sulfonato de Na-4-estireno), poli(ácido vinil sulfónico), ácido poli-L-aspártico, y carboximetil celulosa, siendo el más preferido sulfato de dextrano.

El agente de neutralización puede estar presente en cualquier cantidad que sirva para neutralizar la carga positiva del agente separador de glóbulos rojos. En general, la concentración del agente de neutralización depende de la concentración del agente separador de glóbulos rojos que se use. Preferiblemente, el agente neutralizante está presente en una concentración de desde aproximadamente 0,33% a aproximadamente 20% (peso por volumen), siendo más preferido de aproximadamente 0,34% a aproximadamente 10% (peso por volumen) y siendo más preferido de 0,34% a 10% (peso por volumen).

La figura 1 ilustra una realización de un dispositivo de ensayo inmunocromatográfico según la presente invención. El dispositivo 10 incluye un soporte de cromatografía 20. En el soporte de cromatografía 20 hay un lugar de aplicación 30 para la muestra de sangre. En esta realización preferida, el agente separador de glóbulos rojos, es decir, Merquat® 100, está situado en el lugar de aplicación 30. Junto al lugar de aplicación 30 hay una compresa de conjugado 40 conteniendo el conjugado, es decir sustancia de unión marcada con selenio y un agente neutralizante, es decir, sulfato de dextrano. más hacia abajo está el lugar de detección 50 que, después de realizar el ensayo, exhibirá una barra de control 60 y si la sustancia a analizar está presente, una barra de prueba 70.

En otra realización de la presente invención, se puede poner una solución tampón en contacto con el lugar de aplicación, preferiblemente después de haber puesto el lugar de aplicación en contacto con la muestra. La solución tampón contribuye a mantener una tasa aceptable de flujo de fluido a lo largo del recorrido de flujo en el soporte cromatográfico. La solución tampón puede ser cualquier sustancia que sea capaz de fluir por acción capilar a lo largo del recorrido de flujo de fluido incluyendo, aunque sin limitación, solución tampón de fosfato, solución tampón salina de fosfato, solución tampón de tris-HCl, solución tampón de carbonato, solución tampón de citrato, solución tampón HEPES (ácido 2-hidroxipiperacina-N'-2-etanosulfónico), solución tampón MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico), solución tampón MES (ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico), y análogos. Aunque la concentración y el pH pueden ser cualquier concentración y pH que funcionen en el dispositivo de ensayo deseado, preferiblemente la molaridad está en un rango de desde aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM y el pH es desde aproximadamente 5-9 y más preferiblemente desde aproximadamente 6-8. Muy preferiblemente, la solución tampón empleada es 50 mM solución tampón de fosfato, pH 7,4.

El volumen de fluido empleado en la presente invención depende del tamaño del dispositivo. Deseablemente, se utiliza suficiente volumen de fluido para permitir el flujo de fluido a través del dispositivo al lugar de detección. Preferiblemente, el volumen de fluido está en un rango de aproximadamente 25 \mul a aproximadamente 100 \mul, y más preferiblemente desde aproximadamente 40 \mul a aproximadamente 60 \mul. Por consiguiente, la solución tampón, cuando sea necesario, se puede añadir en un rango de volumen de desde aproximadamente 10 \mul a aproximadamente 40 \mul, y más preferiblemente desde aproximadamente 20 \mul a aproximadamente 30 \mul.

La presente invención también se refiere a un método para detectar la presencia de un analito en una muestra de sangre. Preferiblemente, el método emplea el dispositivo de inmunoensayo de cromatografía de la presente invención. Específicamente, el método incluye (1) disponer un soporte de cromatografía que define un recorrido para flujo de fluido capaz de soportar flujo capilar, a lo largo del que hay un lugar de aplicación para la muestra de sangre que está en contacto de fluido con el soporte de cromatografía, un lugar de detección en el soporte de cromatografía separado del lugar de aplicación, una sustancia marcada de forma difusiva (o un conjugado) que se une a o compite con el analito para unión en el lugar de detección, un agente separador de glóbulos rojos unido de forma difusiva para separar plasma o suero de dicha muestra de sangre hacia arriba del lugar de detección, y un conjugado unido al soporte de cromatografía; (2) contactar el lugar de aplicación con la muestra de sangre de tal manera que el agente separador de glóbulos rojos separe los glóbulos rojos del plasma o suero de la muestra de sangre, y el agente neutralizante neutralice la carga positiva del agente separador; y (3) detectar la presencia de analito en la muestra de sangre.

Preferiblemente, el agente separador de glóbulos rojos es un material de carga positiva y el recorrido de flujo de fluido contiene un agente neutralizante unido de forma difusiva, que es capaz preferiblemente de unión con dicho agente separador de glóbulos rojos y está situado hacia abajo de dicho agente separador de glóbulos rojos y hacia arriba de dicho lugar de detección por lo que la carga positiva de dicho agente separador es neutralizada.

Así, en la realización preferida de la figura 1, se aplica una muestra de sangre al lugar de aplicación 30 y el agente separador de glóbulos rojos separa los glóbulos rojos agregándolos y permitiendo que el plasma o suero baje por acción capilar por el soporte cromatográfico 20. El agente neutralizante en la compresa de conjugado 40 neutraliza los efectos del agente separador de glóbulos rojos en el dispositivo 10 y el conjugado y el analito se une al conjugado presente en la compresa de conjugado 40. El analito unido al conjugado sigue moviéndose hacia abajo al lugar de detección 50. Si el analito de interés está presente, aparecerá la barra de prueba 70. Para indicar que la prueba está funcionando adecuadamente, la barra de control 60 aparecerá tanto si el analito de interés está presente como si no.

La presente invención puede incluir preferiblemente una cubierta o recinto no reactivo alrededor del dispositivo. Preferiblemente, la cubierta encierra al menos el soporte de cromatografía para evitar el contacto y la contaminación de los lugares de captura. La cubierta también puede incluir una zona elevada adyacente al lugar de aplicación para facilitar la recepción y/o la contención de un cierto volumen de la muestra. Además, la cubierta puede incluir una zona o zonas cortada(s) en forma de una letra, número, icono, o símbolo, o cualquier combinación de los mismos. En esta realización, la zona o zonas cortadas forman el diseño para lugar(es) de detección particular(es) cuando la tira se cierra completamente. Se prefiere que una porción suficiente de la tira esté encerrada para evitar que la muestra aplicada contacte los lugares de detección sin pasar primero a través de una porción de la tira.

El dispositivo y método de la presente invención se pueden usar en cualquier sistema de ensayo en el que una muestra de sangre contenga un analito de interés. Los ejemplos de sistemas preferidos incluyen, aunque sin limitación, virus de la hepatitis C ("HCV"), virus de la hepatitis A ("HAV"), virus de la inmunodeficiencia humana ("VIH"), anticuerpo de superficie de hepatitis B ("HBsAb"), antígeno de superficie de hepatitis B ("HBsAg"), anticuerpo de núcleo de hepatitis B ("HBcAb"), antígeno de núcleo de hepatitis B ("HBcAg"), antígeno carcinoembriónico ("CEA"), alfa-fetoproten ("AFP"), un marcador de cáncer pancreático ("CA19-9"), sífilis, tuberculosis, malaria, Leishmania, y fiebre Dengue.

Los ejemplos siguientes ilustran mejor la presente invención, pero no se deberán interpretar, de ninguna forma, como limitativos de su alcance.

Ejemplos Ejemplo 1 Agregación de glóbulos rojos en función de la agregación de conjugado de Se por policationes

A los efectos de la presente invención, se desea la agregación de glóbulos rojos (RBC) en sangre entera mientras que no se desea la agregación del conjugado de selenio. Se comprobaron varios policationes para ver cuál originaría suficiente agregación de RBC aunque agregando sólo únicamente el conjugado de selenio.

Se preparó conjugado de selenio de proteína recombinante VIH-1 de la siguiente manera: En primer lugar, se preparó selenio coloidal reaccionando 32 mM óxido de selenio con 91 mM ácido L-ascórbico en una solución acuosa durante 72 horas a 42ºC. Este selenio coloidal se diluyó a una densidad óptica de 30 a una longitud de onda de 550 nm y después reaccionó con 40 \mul/ml de proteína envolvente de VIH-1 recombinante en 30 mM solución tampón Tris, pH 7,4 durante 20 minutos a temperatura ambiente. Este conjugado de proteína de VIH-1 marcado con selenio coloidal se diluyó posteriormente a una densidad óptica de 30 a una longitud de onda de 550 nm en 10 mM solución tampón Tris, pH 7,4 conteniendo 0,1% caseína, e incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. La solución conjugada se centrifugó posteriormente a 1970 x g durante 20 minutos a 4ºC, se quitó el supernadante y se desechó el pelet. Posteriormente se añadió al supernadante un volumen de 30 mM solución tampón Tris, pH 7,4 conteniendo 2% caseína, equivalente a una décima parte del volumen del supernadante. Finalmente, esta solución conjugada se diluyó a una densidad óptica de 10 a una longitud de onda de 550 nm en 50 mM solución tampón Tris, pH 7,4 conteniendo 1% caseína, 2% sacarosa y 2% lactosa.

Se prepararon soluciones acuosas de los policationes siguientes a 0,25% (p/v): hidrobromuro de Poli-L-Lisina, peso molecular (p.m.) 37000; hidrocloruro de Poli-L-Arginina, p.m. 12100, 42400 y 92000; Poli-L-Histidina, p.m. 18400; bromuro de hexadimetrina, Poli-Lisina, Alanina) 3:1 hidrobromuro, p.m. 35000; Poli (Lisina, Alanina) 2:1 hidrobromuro, p.m. 49300; Poli (Lisina, Alanina) 1:1 hidrobromuro, p.m. 41600, Poli (Lisina, triptófano) 1:4 hidrobromuro, p.m. 38000 (Todos los policationes anteriores se adquirieron de Sigma, St. Louis, MO); Poli(cloruro de dialildimetilamonio), p.m. 10^{5} a 10^{6} (Merquat®-100, Calgon, Pittsburgh, PA).

La capacidad de estos policationes de agregar RBC en sangre entera o el conjugado de selenio se observaron en reacciones separadas añadiendo 350 \mul de 0,25% de las varias soluciones de policationes a un volumen igual de sangre entera o el conjugado de selenio. Las soluciones se mezclaron y almacenaron a temperatura ambiente durante 10 minutos, posteriormente se evaluó visualmente la agregación. Los resultados se resumen en la Tabla 1. Más (+) indica agregado débil, 2+ indica agregado moderado, y 3+ y 4+ indican agregado intenso.

TABLA 1

		Agregación
Policatión	Peso	Glóbulos	Conjugado
	molecular	rojos	de Se
Poli-L-Lys HBr	37000	2+	2+
Merquat®-100	10^{5} a 10^{6}	2+	2+
Poli-L-Arg HCl	12100	2+	2+
Poli-L-Arg HCl	42400	2+	2+
Poli-L-Arg HCl	92000	2+	2+
Poli-L-His	18400	+	4+
Hexadimetrina Br		+	+
Poli (Lys, Ala) 3:1 HBr	35000	2+	2+
Poli (Lys, Ala) 2:1 HBr	49300	+	2+
Poli (Lys, Ala) 1:1 HBr	41600	+	2+
Poli (Lys, Trp) 1:4 HBr	38000	3+	3+

Un policatión que produzca agregación de RBC (2+ o más) produciendo al mismo tiempo mínima agregación de conjugado de selenio (2+ o menos) sería una buena opción. Los policationes con 2+ en ambas categorías encajan en estos criterios. Poli-L-Lisina HBr y Merquat®-100 se eligieron para trabajo adicional, siendo Merquat®-100 el de costo más razonable.

Ejemplo 2 Prevención de agregación de conjugado con neutralización de polianiones A. Flujo de conjugado y prevención de agregación usando sulfato de dextrano

Usando Poli-L-Lisina como el reactivo de agregación de RBC por policatión, se comprobaron varias concentraciones del polianión sulfato de dextrano para ver si la carga positiva del policatión podría ser neutralizada por el sulfato de dextrano, evitando así la agregación del conjugado de selenio producida por el policatión. El sulfato de dextrano se añadió después de que el policatión ya había hecho que se produjese agregación de los RBC, pero antes de la interacción del policatión con el conjugado de selenio. El experimento siguiente evaluó el efecto del policatión y sulfato de dextrano en la agregación del conjugado de selenio y su posterior capacidad de fluir a lo largo de la tira de inmunocromatografía.

Se montó una tira de inmunocromatografía, compuesta de una compresa de muestra, una compresa de neutralización, una compresa de conjugado, y una tira de detección. La compresa de muestra se preparó impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 20 mm de largo (Lypore 9524, Lydall, Rochester, NH) en una solución acuosa de 0,33% hidrobromuro de Poli-L-Lisina, p.m. 37000 (Sigma, St. Louis, MO), secándola posteriormente bajo vacío.

Se prepararon compresas de neutralización, conteniendo diferentes concentraciones de sulfato de dextrano, impregnando filtros de 4 mm de ancho por 13 mm de largo hechos de pasta de madera y poliéster (Sontara 8801, Dupont, Wilmington, Delaware) en soluciones acuosas conteniendo 0%, 1,1%, 3,3% o 10% sulfato de dextrano, p.m. 5000 (Sigma, St. Louis, MO). Las compresas se secaron bajo vacío después de la impregnación.

La compresa de conjugado se preparó impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm de largo (Lypore 9524, Lydall, Rochester, NH) en conjugado de proteína recombinante de VIH-1 marcado con selenio coloidal preparado y diluido como en el Ejemplo 1. La compresa de conjugado se secó bajo vacío después de la impregnación.

La tira de detección era un filtro de membrana de nitrocelulosa de 4 mm de ancho por 40 mm de largo (catálogo #H9643G1, Millipore, Bedford, MA). Se añadió antígeno de envuelta de VIH-1 a una concentración de 5 mg/ml en 100 mM solución tampón Tris, pH 7,4 conteniendo 1% sacarosa a la membrana de nitrocelulosa para formar una línea a lo ancho de la tira en una posición a aproximadamente 1 cm del extremo de la membrana. La región recubierta se reforzó con laminado de poliéster (código # 7733, Adhesives Research Inc., Glen Rock, PA). Se dejó secar suficientemente para fijar el antígeno a la nitrocelulosa.

Se montaron tiras de inmunocromatografía, de 4 mm de ancho, usando los componentes anteriores colocándolos extremo con extremo longitudinalmente con un solapamiento de 1 mm entre cada sección, con la compresa de muestra de 20 mm de largo en un extremo, junto a la que se colocó una de las compresas de neutralización de 13 mm de largo, seguido de una compresa de conjugado de 4,3 mm de largo, y finalmente una tira de detección de 40 mm de largo. La tira montada se cubrió posteriormente con laminado de poliéster (código #8648, Adhesives Research Inc., Glen Rock, PA) desde la parte superior de la tira de detección a 10 mm de la parte inferior de la tira, dejando expuestos aproximadamente 10 mm de la compresa de muestra. A continuación se aplicaron 80 \mul de plasma a las compresas de muestra de cada una de las tiras de inmunocromatografía conteniendo compresas de neutralización con 0%, 1,1%, 3,3% o 10% sulfato de dextrano. La agregación del conjugado de selenio rojo y la capacidad del conjugado de fluir a lo largo de la tira se observaron visualmente.

Los resultados, expuestos en la Tabla 2 siguiente, indicaron que, sin la presencia de sulfato de dextrano para neutralizar la carga de la solución de policationes, el conjugado de selenio se agregaba y no era capaz de fluir a lo largo de la tira. Había una relación inversa entre agregación de conjugado y flujo, siendo suficientes las concentraciones de sulfato de dextrano de 3,3% o más para evitar la agregación de conjugado y permitir el flujo del conjugado a lo largo de la tira.

TABLA 2

Concentración de	Agregación de	Flujo de conjugado
sulfato de dextrano	conjugado
0%	++	-
1,1%	+	+/-
3,3%	-	+
10%	-	+

B. Agregación de RBC en presencia de sulfato de dextrano

Para evaluar el efecto del sulfato de dextrano en la agregación de RBC, se repitió el experimento anterior usando sangre entera como la muestra con 10% sulfato de dextrano en una compresa de neutralización de 4,3 mm de largo por 4 mm de ancho. Después de montar la tira de inmunocromatografía como antes, usando esta compresa de neutralización, se aplicaron 80 \mul de sangre entera a la compresa de muestra. Quince minutos más tarde, el resultado de la agregación de RBC se observó visualmente y se midió la capacidad del plasma resultante de fluir a lo largo de la tira. Los RBC se agregaron, reteniéndose en la compresa de muestra, y no fluyeron por la tira, mientras que el plasma fluyó 33 mm a lo largo de la tira en 15 minutos. Esto indicó que el policatión en la compresa de muestra todavía era capaz de producir agregado de los RBC en toda la muestra de sangre, y que la presencia del polianión, sulfato de dextrano, en la compresa de neutralización no interfería con esta agregación de RBC.

C. Prevención de agregación del conjugado por polianiones

Se comprobaron otros polianiones para evaluar su capacidad de evitar la agregación del conjugado de selenio como en el Ejemplo 2.A. Se impregnó una compresa de muestra de 15,5 mm de largo por 4 mm de ancho en una solución acuosa conteniendo 0,26% Merquat®-100, secándose después a 55ºC. No se utilizaron compresas de neutralización, y en cambio el conjugado de selenio se diluyó en 10 mM solución tampón Tris, pH 7,4 conteniendo 1% caseína, 2% sacarosa, 2% lactosa y 0%, 1,1% o 3,3% del polianión sulfato de dextrano, p.m. 5000 (Sigma, St. Louis, MO), o 0%, 0,5%, 1% o 2% de uno de los polianiones siguientes (todos de Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI): Poli (ácido acrílico), p.m. 5000; Poli (4-estireno-sulfonato de sodio), p.m. 70.000; Poli (ácido vinil sulfónico, sal de sodio); Poli (metilo ácido metacrílico), p.m. 9500; Poli (ácido acrílico, sal de sodio), p.m. 2100. Se impregnaron compresas de conjugado en las varias soluciones de conjugado de selenio y secaron bajo vacío. La tira de detección se preparó como en el Ejemplo 2.A., y se montaron tiras de inmunocromatografía. Posteriormente se aplicó 50 \mul de plasma a las compresas de muestra de cada una de las tiras de inmunocromatografía conteniendo compresa de conjugados con los varios polianiones. La agregación del conjugado de selenio rojo se observó visualmente. La Tabla 3 muestra la cantidad relativa de agregado de conjugado visto con las varias concentraciones de polianiones comprobadas.

TABLA 3

Agregación de conjugado de selenio
	Concentración de polianión
Polianión	0%	0,5%	1-1,1%	2%	3,3%
Sulfato de dextrano	++	Nt	+	Nt	-
Poli(ácido acrílico)	++	-	-	-	Nt
Poli(sulfonato de Na-4-estireno)	++	++	++	+	Nt
Poli (ácido vinil sulfónico)	++	+/-	-	-	Nt
Poli(ácido metil metacrílico)	++	-	-	-	Nt
Poli(ácido acrílico, sal Na)	++	+	+/-	-	Nt
Nt = no comprobado

Como antes, el conjugado de selenio se agregó si no había un polianión presente para neutralizar la carga positiva del policatión de la compresa de muestra (que es necesario para agregación de RBC al verificar sangre entera). Todos los polianiones utilizados en la compresa de conjugado evitaron que tuviese lugar la agregación de conjugado a al menos una de las concentraciones comprobadas. Este experimento también mostró que el polianión no se tenía que aplicar a una compresa separada, sino que se podría combinar con el conjugado de selenio en la compresa de conjugado.

Ejemplo 3 Uso de sulfato de dextrano en compresa de neutralización en función de la compresa de conjugado en un ensayo de anticuerpo VIH-1

Se prepararon tiras de inmunocromatografía como en el Ejemplo 2.A., con o sin una compresa de neutralización de filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm de largo (Lypore 9524, Lydall, Rochester, NH). Cuando se utilizó, la compresa de neutralización se impregnó en una solución acuosa conteniendo 3,3% sulfato de dextrano, secándose posteriormente bajo vacío. En tiras sin una compresa de neutralización, el conjugado de selenio se diluyó en 10 mM solución tampón Tris, pH 7,4, conteniendo 1% caseína, 2% sacarosa, 2% lactosa y 3,3% sulfato de dextrano, y la compresa de conjugado se impregnó en esta solución secada después bajo vacío. La compresa de muestra usada era como en el Ejemplo 2.A., a excepción de que se impregnó en una solución acuosa de 0,2% Merquat®-100.

Se diluyó suero humano conteniendo anticuerpos VIH-1 a 1:2048 en sangre entera humana VIH negativa (en base al volumen de plasma) con un valor de hematocrito de 50% o en plasma humano VIH negativo. Se hicieron otras tres diluciones serie 1:2, usando de nuevo sangre entera o plasma como el diluyente. Se añadieron 80 \mul de sangre entera negativo o muestras de la dilución serie de sangre entera VIH-1 positiva a la compresa de muestra de tiras de inmunocromatografía preparadas con sulfato de dextrano en una compresa de neutralización separada o sulfato de dextrano en la solución de conjugado de selenio en la compresa de conjugado. Se comprobaron 80 \mul de plasma negativo o muestras de la dilución serie de plasma VIH-1 positivo solamente en tiras de inmunocromatografía con sulfato de dextrano en la compresa de conjugado. Los resultados se leyeron 15 minutos después de la aplicación de la muestra (Tabla 4). Un resultado positivo mostró un color rojo en la tira de detección donde el complejo de conjugado de antígeno VIH-1 de selenio rojo-anticuerpo VIH-1 se unió al antígeno VIH-1 en la región recubierta de la tira. Un resultado negativo no mostró color en esta región en la tira de detección.

TABLA 4

	Sulfato de dextrano en	Sulfato de dextrano en
	compresa de neutralización	compresa de conjugado
Dilución de muestra	Sangre entera	Sangre entera	Plasma
1:2048	+	+	+
1:4096	+	+	+
1:8192	-	+	+
1:16384	Nt	-	-
control negativo	-	-	-
Nt = no comprobado

Los resultados de la Tabla 4 indican que se puede detectar anticuerpos VIH-1 a partir de sangre entera en un ensayo con tira de inmunocromatografía usando el policatión Merquat®-100 para agregar RBC y permitir que la muestra fluya a lo largo de la tira, y el polianión sulfato de dextrano como un agente neutralizante, evitando la agregación del conjugado de selenio por el policatión y permitiendo que el conjugado se una y forme un complejo con una muestra positiva y fluya a lo largo de la tira a la zona de detección. Se demostró que el polianión es efectivo cuando se utiliza en una compresa de neutralización separada o combinada con el conjugado de selenio en la compresa de conjugado. En este ensayo, la sensibilidad para detectar anticuerpos VIH-1 mostró una mejora doble cuando el polianión sulfato de dextrano) se utilizó en la compresa de conjugado en vez de en una compresa de neutralización separada.

Además, los resultados de la Tabla 4 indican que el policatión agrega efectivamente los RBC en la sangre entera como muestra la igual sensibilidad de detección de anticuerpos VIH-1 tanto en sangre entera, donde los RBC deben ser agregados para que la muestra fluya, como en plasma, donde no hay RBC para evitar el flujo de la muestra. Esto también muestra que la presencia del polianión, en una compresa de neutralización separada o en la compresa de conjugado, no interfiere con la capacidad del policatión de producir efectivamente agregación de RBC en sangre entera.

Ejemplo 4 Uso de Merquat® y varios polianiones en un ensayo de HBsAg

Se prepararon tiras de inmunocromatografía para la detección de antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) en muestras de sangre entera. Se utilizó Merquat®-100 como el policatión para la agregación de RBC en la compresa de muestra, y se evaluaron varios polianiones en la compresa de conjugado como reactivos de neutralización de policatión para evitar la agregación del conjugado de selenio.

Se montaron tiras de inmunocromatografía, compuestas de una compresa de muestra, una compresa de conjugado, y una tira de detección. La compresa de muestra se preparó impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 15,5 mm de largo en una solución acuosa de 0,26% Merquat®-100, secándola después a 55ºC.

El conjugado de selenio se preparó usando selenio coloidal, como en el Ejemplo 1, y 12 \mug/ml anticuerpo monoclonal de ratón a HBsAg (antiHBs). Este conjugado antiHBs marcado con selenio coloidal se diluyó posteriormente a una densidad óptica de 2,6 a una longitud de onda de 550 nm en solución tampón Tris conteniendo uno de los polianiones siguientes: 0,5% Poli (ácido acrílico), p.m. 2000 (PAA-2000); 0,5% Poli (ácido acrílico), p.m. 240.000 (PAA-240.000); 0,5% sulfato de dextrano, p.m. 5000; 0,8% Ácido poli-L-aspártico, p.m. 36.300; 0,5% carboximetil celulosa, p.m. 90.000 (CMC). El Sulfato de dextrano y Ácido poli-L-aspártico eran de Sigma, St. Louis, MO, y los polianiones restantes eran de Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI.

La compresa de conjugado se preparó impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm de largo en conjugado antiHBs marcado con selenio coloidal preparado y diluido con uno de los polianiones anteriores. La compresa de conjugado se secó bajo vacío después de la impregnación.

La tira de detección era un filtro de membrana de nitrocelulosa de 4 mm de ancho por 40 mm de largo, preparado como en el Ejemplo 2 usando antiHBs anticlonales de ratón a una concentración de 3 mg/ml y se añadió a la membrana de nitrocelulosa para formar una línea a lo ancho de la tira en una posición a aproximadamente 1 cm del extremo de la membrana. La región recubierta se reforzó con laminado de poliéster. Se dejó secar suficientemente para fijar el anticuerpo a la nitrocelulosa.

Se montaron tiras de inmunocromatografía usando los componentes anteriores colocándolos extremo con extremo longitudinalmente, con un solapamiento de 1 mm, con la compresa de muestra en un extremo, junto a la que se colocó una compresa de conjugado, y finalmente una tira de detección. La tira montada se cubrió posteriormente con laminado de poliéster, dejando expuestos aproximadamente 10 mm de la compresa de muestra.

Se añadió HBsAg recombinante a sangre entera humana HBsAg negativa con un valor de hematocrito de 50% a una concentración de 12,5 ng/ml. Se hicieron otras tres diluciones serie 1:2 en sangre entera. Se añadieron 50 \mul de sangre entera negativa o muestras de la dilución serie de sangre entera HBsAg positiva a la compresa de muestra de tiras de inmunocromatografía preparadas con varios polianiones en la compresa de conjugado. Los resultados se leyeron 15 minutos después de la aplicación de la muestra (Tabla 5). Un resultado positivo mostró un color rojo en la tira de detección donde el complejo de conjugado antiHBs de selenio rojo-HBsAg se unió al antiHBs en la región recubierta de la tira. Un resultado negativo no mostró color en esta región en la tira de detección. La agregación del conjugado de selenio rojo a la entrada a la tira de detección se observó visualmente.

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TABLA 5

	Concentración de HBsAg (ng/ml)
Polianión	12,5	6,25	3,13	1,56	0	Agregación de
						conjugado
PAA-2000	+	+	+	-	-	-
PAA-240.000	+	+	-	-	-	+
Sulfato de dextrano	+	+	+	-	-	-
Poli-L-Asp	+	+	+	-	-	-
CMC	+	-	-	-	-	+

Aunque todos los polianiones dejaron que se produjese detección de HBsAg, los polianiones que evitaron la agregación de conjugado, PAA-2000, Sulfato de dextrano y Ácido poli-L-aspártico, exhibían una detección de 2 a 4 veces más sensible de HBsAg en muestras de sangre entera.

Se repitió el experimento anterior, usando el conjugado marcado con selenio coloidal diluido en solución tampón Tris conteniendo PAA-2000 como el polianión, a excepción de que se añadió 25 de 50 mM solución tampón de fosfato, pH 7,4, a la compresa de muestra un minuto después de la adición de las muestras de sangre entera de HBsAg. Los resultados obtenidos usando este procedimiento, con la adición de la solución tampón después de la aplicación de la muestra, eran idénticos a los resultados sin este paso. Así, estos ensayos se pueden hacer con o sin adición de solución tampón después de la aplicación de la muestra.

Ejemplo 5 Uso de Merquat® y sulfato de dextrano en un ensayo para tuberculosis

Se prepararon tiras de inmunocromatografía para la detección de anticuerpo a Mycobacterium tuberculosis (antiMtb) en muestras de sangre entera. Se utilizó Merquat®-100 como el policatión para la agregación de RBC en la compresa de muestra, y se evaluaron varias concentraciones del polianión sulfato de dextrano en la compresa de conjugado como el reactivo de neutralización por policatión para evitar la agregación del conjugado de selenio.

Se montaron tiras de inmunocromatografía, compuestas de una compresa de muestra, una compresa de conjugado, y una tira de detección. La compresa de muestra se preparó impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 15,5 mm de largo en una solución acuosa de 0,26% Merquat®-100, secándola posteriormente en vacío.

El conjugado de selenio se preparó usando selenio coloidal, como en el Ejemplo 1, y 3,5 \mug/ml de antígeno Mtb recombinante de E. Coli. Este conjugado Mtb marcado con selenio coloidal se diluyó posteriormente a una densidad óptica de 2,5 a una longitud de onda de 550 nm en solución tampón Tris conteniendo 0%, 0,34%, 1,1% o 3,3% sulfato de dextrano.

La compresa de conjugado se preparó impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm de largo en conjugado Mtb marcado con selenio coloidal, preparado y diluido con una de las concentraciones de sulfato de dextrano anteriores. La compresa de conjugado se secó bajo vacío después de la impregnación.

La tira de detección era un filtro de membrana de nitrocelulosa de 4 mm de ancho por 40 mm de largo, se preparó como en el Ejemplo 2 usando antígeno Mtb recombinante a una concentración de 0,15 mg/ml y se añadió a la membrana de nitrocelulosa para formar una línea a lo ancho de la tira en una posición a aproximadamente 1 cm del extremo de la membrana. La región recubierta se reforzó con laminado de poliéster. Se dejó secar suficientemente para fijar el antígeno a la nitrocelulosa.

Se diluyó suero AntiMtb positivo 1:100 en sangre entera humana negativa con un valor de hematocrito de 50%. Se hicieron otras dos diluciones serie 1:2 en sangre entera. Se añadieron 50 \mul de sangre entera negativa o muestras de la dilución serie de sangre entera antiMtb positiva a la compresa de muestra de tiras de inmunocromatografía preparadas con varias concentraciones de sulfato de dextrano en la compresa de conjugado. Los resultados se leyeron 15 minutos después de la aplicación de la muestra (Tabla 6). Un resultado positivo mostró un color rojo en la tira de detección donde el complejo de conjugado de selenio rojo-anti-Mtb se unió al Mtb en la región recubierta de la tira. Un resultado negativo no mostró color en esta región en la tira de detección. La agregación del conjugado de selenio rojo a la entrada a la tira de detección se observó visualmente.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 6

Sulfato de	Dilución anti-Mtb
dextrano
(%)	1:100	1:200	1:400	Control	Agregación de
				negativo	conjugado
0	-	-	-	-	++
0,34	-	-	-	-	++
1,1	+	-	-	-	+
3,3	+	+	-	-	-

Los datos en la Tabla 6 muestran que el ensayo no funciona sin la presencia de un polianión, en este caso Sulfato de dextrano, para evitar la agregación del conjugado. Hay una relación inversa entre agregado de conjugado y sensibilidad del ensayo. A una concentración de sulfato de dextrano de 3,3%, no se produce agregación de conjugado y el ensayo muestra la detección más sensible de antiMtb.

Ejemplo 6 Ensayo se sífilis usando Merquat® y sulfato de dextrano

Se prepararon tiras de inmunocromatografía para la detección de anticuerpo a Treponema pallidum (antiTP) en muestras de sangre entera o plasma. Comparando la sensibilidad de detección en sangre entera a plasma, se podría determinar si RBC en sangre entera se agregaba efectivamente por el policatión de modo que no interfiera y por lo tanto disminuya la sensibilidad de detección del ensayo. Se utilizó Merquat®-100 como el policatión para la agregación de RBC en la compresa de muestra, y el polianión Sulfato de dextrano se utilizó en la compresa de conjugado como el reactivo de neutralización de policatión para evitar la agregación del conjugado de selenio.

Se montaron tiras de inmunocromatografía, compuestas de una compresa de muestra, una compresa de conjugado, y una tira de detección. La compresa de muestra se preparó impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 15,5 mm de largo en una solución acuosa de 0,2% Merquat®-100, secándola posteriormente a 55ºC.

El conjugado de selenio se preparó usando selenio coloidal, como en el Ejemplo 1, y 7,5 \mug/ml de lisato de Treponema pallidum (TP). Este conjugado de TP marcado con selenio coloidal se diluyó posteriormente a una densidad óptica de 2,8 a una longitud de onda de 550 nm en solución tampón Tris conteniendo 3,3% sulfato de dextrano.

La compresa de conjugado se preparó impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm de largo en el conjugado de TP marcado con selenio coloidal preparado anteriormente. La compresa de conjugado se secó bajo vacío después de la impregnación.

La tira de detección era un filtro de membrana de nitrocelulosa de 4 mm de ancho por 40 mm de largo, preparado como en el Ejemplo 2 usando lisato de Treponema pallidum a una concentración de 44 \mug/ml y añadido a la membrana de nitrocelulosa para formar una línea a lo ancho de la tira en una posición a aproximadamente 1 cm del extremo de la membrana. La región recubierta se reforzó con laminado de poliéster. Se dejó secar suficientemente para fijar el lisato de TP a la nitrocelulosa.

Se diluyó suero humano AntiTP positivo 1:10,8 a sangre entera humana negativa con un valor de hematocrito de 50% o a plasma humano negativo. Se hicieron otras cuatro diluciones serie 1:2, usando de nuevo sangre entera o plasma como el diluyente. Se añadieron 60 \mul de sangre entera negativa o plasma, o muestras de la dilución serie de sangre entera antiTP positiva o de plasma a la compresa de muestra de las tiras de inmunocromatografía. Los resultados se leyeron 15 minutos después de la aplicación de la muestra (Tabla 7). Un resultado positivo mostró un color rojo en la tira de detección donde el complejo de conjugado TP de selenio rojo-anti-TP se unió al lisato de TP en la región recubierta de la tira. Un resultado negativo no mostró color en esta región en la tira de detección.

La Tabla 7 muestra que la sensibilidad para la detección de antiTP era la misma en sangre entera y plasma, indicando que el policatión, Merquat®-100, agregaba efectivamente los RBC en la sangre entera.

TABLA 7

Dilución de muestra anti-TP	Sangre entera	Plasma
1:10,8	+	+
1:21,6	+	+
1:43,2	+	+
1:86,4	+	+
1:172,8	-	-
Control negativo	-	-

Claims

1. Un dispositivo de ensayo de cromatografía para detectar la presencia de un analito en una muestra de sangre incluyendo:

un soporte de cromatografía que define un recorrido para flujo de fluido y soporta flujo capilar,

un lugar de aplicación para dicha muestra de sangre en contacto de flujo de fluido con dicho soporte de cromatografía,

un lugar de detección en dicho soporte de cromatografía separado de dicho lugar de aplicación al que está unido de forma no difusiva una sustancia de atrapamiento,

una sustancia marcada unida de forma difusiva situada en dicho lugar de aplicación,

un policatión unido de forma difusiva para separar plasma o suero de dicha muestra de sangre hacia arriba de dicho lugar de detección, y

un polianión unido de forma difusiva para neutralizar el policatión hacia abajo de dicho policatión unido y hacia arriba de dicho lugar de detección.

2. El dispositivo de ensayo de cromatografía de la reivindicación 1, donde dicho dispositivo es un dispositivo de inmunoensayo.

3. El dispositivo de ensayo de cromatografía de la reivindicación 1, donde dicho policatión está unido en dicho lugar para aplicación de dicha muestra de sangre.

4. El dispositivo de ensayo de cromatografía de la reivindicación 1, donde dicho policatión se selecciona a partir del grupo que consta de hidrobromuro de poli-L-lisina, hidrocloruro de poli-L-arginina, poli-L-histidina, hidrobromuro de poli(lisina, alanina) 3:1, hidrobromuro de poli(lisina, alanina) 2:1, hidrobromuro de poli(lisina, alanina) 1:1, hidrobromuro de poli(lisina, triptófano) 1:4, y poli(cloruro de dialildimetilamonio).

5. El dispositivo de ensayo de cromatografía de la reivindicación 1, donde dicho policatión es poli(cloruro de dialildimetilamonio).

6. El dispositivo de ensayo de cromatografía de la reivindicación 1, donde dicho polianión se selecciona a partir del grupo que consta de sulfato de dextrano, poli(ácido acrílico), poli(4-estireno-sulfonato de sodio), poli(ácido vinil sulfónico), poli(ácido metil metacrílico), ácido poli-L-aspártico y carboximetil celulosa.

7. El dispositivo de ensayo de cromatografía de la reivindicación 1, donde dicho polianión es sulfato de dextrano.

8. El dispositivo de ensayo de cromatografía de la reivindicación 1, donde dicho polianión está unido de forma difusiva al soporte de cromatografía en la misma posición que dicha sustancia marcada.

9. El dispositivo de ensayo de cromatografía de la reivindicación 1, donde dicha sustancia marcada es una sustancia marcada con selenio.

10. Un método para detectar la presencia de un analito en una muestra de sangre incluyendo los pasos de:

disponer un soporte de cromatografía que define un recorrido para flujo de fluido y soporta flujo capilar, a lo largo del que hay (a) un lugar de aplicación para dicha muestra de sangre en contacto de flujo de fluido con dicho soporte de cromatografía, (b) un lugar de detección en dicho soporte de cromatografía separado de dicho lugar de aplicación al que está unido de forma no difusiva una sustancia de atrapamiento, (c) una sustancia marcada situada en dicho lugar de aplicación, (d) un policatión unido de forma difusiva para separar plasma o suero de dicha muestra de sangre hacia arriba de dicho lugar de detección, y (e) un polianión unido de forma difusiva para neutralizar el policatión situado hacia abajo de dicho policatión unido y hacia arriba de dicho lugar de detección;

poner dicho lugar de aplicación en contacto con dicha muestra de sangre; y

detectar la presencia de analito en dicha muestra de sangre.

11. El método de la reivindicación 10, donde dicha sustancia marcada es una sustancia marcada con selenio.

12. El método de la reivindicación 10, donde dicho polianión está unido de forma difusiva al soporte de cromatografía en la misma posición que dicha sustancia marcada.

13. El método de la reivindicación 10, donde dicho policatión se selecciona a partir del grupo que consta de hidrobromuro de poli-L-lisina, hidrocloruro de poli-L-arginina, poli-L-histidina, hidrobromuro de poli(lisina, alanina) 3:1, hidrobromuro de poli(lisina, alanina) 2:1, hidrobromuro de poli(lisina, alanina) 1:1, hidrobromuro de poli(lisina, triptófano) 1:4, y poli (cloruro de dialildimetilamonio).

14. El método de la reivindicación 10, donde el polianión se selecciona a partir del grupo que consta de sulfato de dextrano, poli(ácido acrílico), poli(4-estireno-sulfonato de sodio), poli(ácido vinil sulfónico), poli(ácido metil metacrílico), ácido poli-L-aspártico y carboximetil celulosa.