ES2244972T3 - Microorganismos gram-positivos que expresan ftsy con propiedades de secrecion aumentada. - Google Patents

Abstract

LA SECRECION DE PROTEINAS HETEROLOGAS DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS, EN PARTICULAR DE BACILOS, NO SE HA LOGRADO CON EXITO SALVO EN ALGUNAS EXCEPCIONES. LA INCOMPATIBILIDAD DE LAS PROTEINAS HETEROLOGAS CON LA MAQUINARIA DE SECRECION DE PROTEINAS DEL HUESPED ES LA CAUSA PRINCIPAL DE ESTE EFECTO. ESTE FACTOR LIMITANTE PARA LA PRODUCCION DE PROTEINAS HETEROLOGAS EN CONCENTRACIONES IMPORTANTES DESDE EL PUNTO DE VISTA COMERCIAL A PARTIR DE BACILLUS SUBTILIS ES ELIMINADO MEDIANTE LA SOBRE EXPRESION DE LA PROTEINA FTSY DE BACILLUS SUBTILIS O LA PROTEINA FTSY, JUNTO CON LA SOBRE - EXPRESION DE OTROS MIEMBROS DE LA PARTICULA DE RECONOCIMIENTO DE SEÑAL BACTERIANA. ESTE GEN(ES) ES SOBRE - EXPRESADO EN CELULAS HUESPED DE BACILLUS QUE EXPRESAN UNA PROTEINA HETEROLOGA, QUE ENTONCES MUESTRAN UNA MAYOR CANTIDAD DE PROTEINA HETEROLOGA SEGREGADA HACIA EL MEDIO CIRCUNDANTE.

Description

Microorganismos Gram-positivos que expresan FtsY con propiedades de secreción aumentada.

Esta invención se refiere a procedimientos para la producción de proteínas por microorganismos. Específicamente, se refiere a la secreción de proteínas heterólogas por microorganismos, en particular por bacterias Gram-positivas, especialmente por el hospedante bacteriano Bacillus.

También se refiere a (la sobreexpresión de) un nuevo gen que codifica una proteína implicada en las etapas tempranas de secreción de proteína procariota. Específicamente, se refiere a la sobreexpresión de dicho gen dentro de un hospedante Bacillus que sobreexpresa proteínas heterólogas.

El B. subtilis y bacilos relacionados (estrechamente) segregan proteínas directamente en el medio de crecimiento hasta altas concentraciones. La secreción como modo de producción de proteínas de interés, sean homólogas al hospedante o heterólogas al hospedante, sean de origen recombinante o no, proporciona varias ventajas sobre la producción intracelular. Facilita, por ejemplo, la purificación del producto, conduce teóricamente a un mayor rendimiento, no tiene lugar agregación del producto y da la posibilidad de cultivo y producción continuos. Sin embargo, los intentos por segregar proteínas heterólogas a partir de B. subtilis y organismos relacionados (estrechamente) con concentraciones significativas comercialmente han tenido, con pocas excepciones, pequeño éxito.

Casi todas las proteínas segregadas usan una extensión de proteína amino-terminal, conocida como péptido señal, que juega un papel crucial en la fijación de objetivo hacia, y en la translocación de proteínas precursoras a través de la membrana, y que se separa proteolíticamente por una peptidasa señal durante o inmediatamente después de la transferencia de membrana. Las proteínas precursoras recién sintetizadas son reconocidas por proteínas específicas en el citoplasma denominadas colectivamente chaperones. Estos chaperones impiden que polipéptidos, destinados a translocación, se agreguen o plieguen prematuramente conduciendo a una conformación incompatible con la exportación.

Por ejemplo, SecB, GroEL/GroES y DnaK/DnaJ son los chaperones conocidos actualmente en la trayectoria de exportación de E. coli. Para la unión productiva de proteínas precursoras a lugares de translocación en la membrana citoplásmica, se necesita SecA. SecA, una proteína de la que se han detectado formas citoplásmica, periférica así como de membrana integral, tiene una actividad de ATPasa que media en la canalización inicial de proteínas precursoras a la trayectoria de exportación.

La subunidad SecA actúa como un receptor que reconoce los dominios líder y maduro de las preproteínas (Lill et al. 1990), así como el chaperón SecB (Hartl et al. 1990). Se ha sugerido que SecA penetra en la membrana, tras la unión de ATP, y promueve así la coinserción de la preproteína. Después de la hidrólisis de ATP unido, la preproteína se libera de la proteína SecaA (Schiebel et al. 1991). La translocación se completa con la fuerza motora protónica como principal fuerza impulsora y requiere miembros de la parte de membrana integral del complejo de preproteína translocasa como SecY, SecE y SecG (p12/Bandl). SecD y SecF son también proteínas de membrana integrales y participan probablemente en las etapas tardías de translocación de proteína.

Durante muchos años, la maquinaria de secreción de proteínas en procariotas se ha considerado independiente del sistema de secreción de proteínas encontrado en eucariotas superiores (Luirink et al., 1992). En mamíferos, la fijación de objetivo de proteínas secretoras al retículo endoplásmico (ER) es mediada por la partícula de reconocimiento de señal (SRP), que es una partícula de ribonucleoproteína compuesta por una molécula de ARN (ARN 7S de SRP) y seis polipéptidos de 9, 14, 19, 54, 68 y 72 kD. Las proteínas de SRP están asociadas con el ARN como monómeros (SRP19 y SRP54) o heterodímeros (SRP9/14 y SRP68/72).

Tan pronto como el péptido señal de proteínas segregadas y transmembrana ha salido del ribosoma, es reconocido y unido por SRP, que tiene también afinidad por el ribosoma. Esta asociación retarda el alargamiento de la cadena de polipéptido (detención de alargamiento). Cuando el complejo de SRP, cadena de polipéptido naciente y ribosoma se une al receptor de SRP (SR o proteína de atraque) asociado con la membrana del ER, la cadena de polipéptido naciente se desplaza desde SRP en una reacción dependiente de GTP y se reanuda la traducción de proteína.

La translocación del polipéptido en el ER tiene lugar co-traduccionalmente a través de un poro de proteína, el translocón (Gilmore et al., 1993). Así, la SRP funciona como un chaperón citosólico que previene el pliegue prematuro de la preproteína por traducción de acoplamiento a translocación y como piloto para guiar la preproteína al complejo de receptor de SRP en la membrana. La subunidad de 54 kD de SRP (SRP54) se une al péptido señal cuando sale del ribosoma y parece por tanto tener una función clave en el proceso mediado por SRP de secreción de proteína.

Hasta la fecha, se dispone de más y más datos indicando que una trayectoria de exportación mediado por SRP puede funcionar también en otros organismos. Se han aislado de levadura homólogos de componentes de SRP de mamífero (Hann et al. 1989), E. coli (Bernstein et al. 1989 y Rymisch et al. 1989), Micoplasma mycoides (Samuelson, 1992) y Bacillus subtilis (Struck et al. 1989 y Honda et al. 1993).

Es probable así que una trayectoria mediada por SRP funcione en procariotas en una trayectoria secretora separada o pueda formar parte de la trayectoria secretora general.

Se identificaron en E. coli miembros de una trayectoria secretora tipo SRP. Estos miembros son Ffh (homólogo de cincuenta y cuatro) y una molécula de ARN 4.5S que son homólogos del ARN de SRP54 y SRP 7S de SRP eucariota (Ribes et al. 1990). Se ha mostrado que Ffh interactúa específicamente con la secuencia señal de proteínas presecretoras nacientes (Luirink et al. 1992). La proteína de E. coli FtsY, que se ha implicado originalmente en división celular (porque su gen está situado en un operón junto con FtsE y FtX) muestra similitud de secuencia notable con la subunidad de proteína de atraque de mamífero. Varias observaciones sugieren que FtsY es el homólogo de E. coli funcional del receptor de SRP de mamífero (Luirink et al. 1994). La reducción de FtsY, Ffh o el componente de ARN de la SRP de E. coli afecta a la exportación de varias proteínas secretoras.

También se han encontrado en B.subtilis componentes de la trayectoria secretora de tipo SRP. Se mostró que el ARN citoplásmico de SmaII (scARN) tiene una relación funcional con el ARN de SRP 7S humano y el ARN 4.5S de E. coli (Nakamura et al., 1992). El scARN de B. subtilis se transcribe desde el gen scr como un precursor de 354 nucleótidos que se elabora después a un ARN de 271 nucleótidos en el extremo 5' y 3' (Struck et al., 1989), que se similar a su homólogo eucariota (300 nucleótidos) pero mucho mayor que el ARN 4.5S de E. coli (114 nucleótidos). También la estructura secundaria del scARN es muy similar al ARN SRP 7S eucariota, careciendo sólo del dominio III (Struck y Erdmann, 1990). Esto está en contraste con los otros ARNs de tipo SRP eubacterianos, que se pliegan sólo en una horquilla simple correspondiente al dominio IV (Poritz et al., 1988). Por tanto, el scARN de B.subtilis es en tamaño y estructura secundaria un intermedio entre ARN de tipo SRP procariota y eucariota.

Además del gen scr, se ha aislado de B. subtilis otro gen que codifica un constituyente de SRP. Se encontró que el gen ffh codifica la proteína Ffh que muestra homología con la proteína de E. coli y SRP54 eucariota (Honda et al., 1993).

No es improbable que chaperones o miembros de la trayectoria de secreción de tipo SRP puedan convertirse en una etapa limitadora de proporción en la trayectoria de secreción, siendo el resultado de lo cual que la mayoría de la proteína heteróloga expresada se agregará o plegará prematuramente. Este efecto podría ser la razón por la que han tenido poco éxito intentos por segregar proteínas heterólogas en cantidades elevadas a partir de microorganismos Gram-positivos, en particular B. subtilis y microorganismos relacionados (estrechamente). La sobreexpresión de miembros particulares de la maquinaria de secreción de B. subtilis, especialmente de proteínas de tipo chaperón, que son la etapa limitadora de proporción en la trayectoria de secreción, resolvería este problema. Ha de entenderse que las expresiones "chaperón" y "factor de secreción" no se han definido de manera completamente clara. Ambos grupos de proteínas se superponen al menos y en algunos casos pueden ser idénticos. Debido a que el mecanismo de acción de estas proteínas no se entiende aún claramente, ambas expresiones se usarán aquí intercambiablemente.

La invención proporciona así un método para proporcionar una célula hospedante Gram positiva que es capaz de secreción aumentada de una proteína de interés, cuyo método comprende:

proporcionar la célula hospedante Gram positiva con (i) una primera secuencia de ADN que codifica la proteína de interés y (ii) una segunda secuencia de ADN que tiene más del 85% de homología de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7 y que codifica una proteína que tiene una función de chaperón;

de modo que el cultivo de la célula hospedante Gram positiva en condiciones adecuadas permite una secreción aumentada de la proteína de interés.

Cuando se proporcionan bacterias Gram-positivas, especialmente especies Bacillus y en particular Bacillus subtilis y sus organismos estrechamente relacionados, con la sustancia proteínica, de los que la funcionalidad se define como capaz de reconocer una proteína de interés a segregar y conducirla a la trayectoria secretora, tienen una capacidad aumentada de segregar proteínas. Es muy probable que las proteínas a segregar deban tener una secuencia señal, que puede ser su propia secuencia señal o una secuencia señal de una proteína homóloga de la bacteria hospedante o una secuencia señal homóloga al microorganismo del que se deriva la sustancia proteínica, es decir, el factor de secreción según la invención.

La proteína de interés puede ser cualquier proteína que se haya considerado hasta ahora para expresión en procariotas, en tanto en cuanto pueda proporcionarse o tenga por sí misma una secuencia señal que la haga adecuada para secreción en un hospedante Gram-positivo. Por supuesto, también debe ser capaz de ser reconocida (si es posible no muy eficazmente) y conducir a la trayectoria secretora por las proteínas de tipo chaperón usadas en el método de la invención. Puede no ser el caso que las proteínas de tipo chaperón sean capaces de reconocer y conducir a secreción cada una y todas las proteínas por sí mismas.

Otros factores de secreción pueden convertirse en la etapa limitadora de proporción, si se proporciona el factor de secreción inventado actualmente en cantidades suficientes. En ese caso, se prefiere proporcionar también los hospedantes con los factores de secreción que puedan convertir también la etapa limitadora de proporción en cantidades suficientes. Puesto que los inventores creen que hay una vía tipo SRP en la especie Bacillus y otras bacterias gram-positivas, sería ventajoso proporcionar los microorganismos con cantidades aumentadas de FtsY, el scARN 7S y Ffh.

La proteína de interés puede ser homóloga o heteróloga al hospedante. En el primer caso, sobreexpresión debe leerse como expresión por encima de los niveles normales en dicho hospedante. En el último caso, básicamente cualquier expresión es por supuesto sobreexpresión.

La sustancia proteínica usada en los métodos descritos aquí, a la que se hará referencia a menudo por conveniencia como chaperón, factor de secreción o proteína de tipo chaperón, puede ser homóloga al hospedante, lo que se prefiere, pero también puede ser heteróloga al hospedante, siempre que sea compatible con la maquinaria de secreción del hospedante. Es razonable que esto será más probablemente en organismos relacionados estrechamente. Así, en el caso de un factor de secreción de Bacillus subtilis, se preferiría usarlo en un Bacillus.

La secuencia representada para dar una representativa de una secuencia que codifica una proteína de tipo chaperón usada en el método de la invención se da con el fin de permitir a la persona experta en la técnica encontrar secuencias homólogas que codifican proteínas de tipo chaperón similares o funcionalmente las mismas en otras bacterias Gram-positivas, en particular de otra especie de Bacillus. Dado el nivel general de experiencia en la técnica, será rutinario el trabajo para preparar, por ejemplo, cebadores basados en la secuencia dada y examinar otras secuencias homólogas que codifican dichas proteínas de tipo chaperón. Estas proteínas de tipo chaperón de otros organismos relacionados deben considerarse por tanto como parte de la presente invención. Sus secuencias de ADN y/o aminoácidos serán usualmente bastante homólogas. Como regla, la homología será mayor del 70% global, siendo de esperar en particular homologías de más del 85% global. Se entiende que pueden usarse en el método de la invención todos los genes homólogos que puedan hibridarse con la secuencia representada en SEQ. IN NO. 7 y que codifiquen una proteína de esencialmente la misma estructura o función. Puede usarse la siguiente ecuación, que se ha derivado de analizar la influencia de diferentes factores en la estabilidad del híbrido:

Tm = 81 + 16,6 (log_{10} Ci) + 0,4 (% G + C) - 600/n -1,5% de desadaptación (Ausubel et al., supra) en la que

n = longitud de la cadena más corta de la sonda

Ci = fuerza iónica (M)

G + C = composición de base,

para determinar que nivel de homología puede detectarse usando técnicas de hibridación ADN-ADN.

Por tanto, la expresión "esencialmente de una estructura" se pretende que abarque secuencias que pueden incluir mutaciones conservadoras, en las que la secuencia codifica el mismo aminoácido, pero que puede diferir en hasta el 35% en la secuencia de ADN según la ecuación anterior, más típicamente en hasta el 10%. No es necesario siempre tener una proteína de tipo chaperón completa para realizar las funciones de reconocer la proteína a segregar y conducir dicha proteína a la trayectoria de secreción. Cuando sea posible, debe proporcionarse así a los hospedantes también partes funcionales de dicho factor de secreción. También es posible e incluso probable que pueda tener lugar la asociación con material no proteínico tal como el ARN 7S cuando el factor de secreción realiza sus funciones. La expresión sustancia proteínica se escoge para incluir tales asociaciones. Es actualmente muy conocido en la técnica que mutaciones en proteínas pueden conducir a actividad más alta, vidas medias más largas y mejor estabilidad de la proteína mutada. Tales derivados de los factores de secreción pueden usarse en el método de la invención, porque, dada la información presentada aquí, es un trabajo rutinario encontrar sitios débiles, u otros lugares interesantes para mutación en los factores de secreción según la invención y hacer mutaciones dirigidas al lugar.

Una realización preferida de la presente invención emplea una sustancia proteínica que es una proteína de tipo chaperón, que es codificada al menos parcialmente por el gen ftsY de una especie Bacillus. Las especies Bacillus son organismos altamente preferidos para expresar genes de interés y se dispone de mucha experiencia de desarrollo y producción. No obstante, como se ha indicado antes, ha habido siempre un problema con la secreción de proteínas especialmente heterólogas de Bacillus. Este problema puede resolverse en muchos casos proporcionando organismos Bacillus con proteínas de tipo chaperón de otras especies relacionadas, pero estará claro que las posibilidades de un buen factor de secreción funcional en Bacillus, incluyendo el reconocimiento de la proteína heteróloga, son más altas usando una proteína de tipo chaperón que se deriva de un factor de secreción en una especie Bacillus. Es de especial interés como proteína de tipo chaperón una sustancia proteínica que es codificada al menos parcialmente por el gen ftsY de Bacillus subtilis u otra especie Bacillus. Estas sustancias proteínicas son muy probablemente análogas de la proteína de atraque eucariota (o receptor de SRP), como es el caso con productos derivados del gen ftsY de E. coli. La falta de cantidades suficientes de esta proteína de tipo chaperón tendrá definitivamente una gran influencia en la capacidad de microorganismos hospedantes para segregar cualesquiera proteínas, dejadas proteínas heterólogas solas. Se cree actualmente que puede segregarse principalmente proteína heteróloga usando la vía tipo SRP, es decir, uniéndose a Ffh, el ARN 7S y el FtsY, mientras que proteínas homólogas usan la trayectoria de secreción general. También es claro que si se proporciona una proteína heteróloga a segregar con una señal homóloga o relacionada muy estrechamente con una señal presente en proteínas secretoras de Bacillus, la presencia de una cantidad suficiente del factor de secreción que tiene normalmente la función de reconocer tal señal conducirá a una secreción aumentada.

El método preferido para proporcionar una bacteria Gram-positiva, en particular una especie Bacillus con la posibilidad de expresar cantidades suficientes de las proteínas de tipo chaperón (y, por ejemplo, scARN) usadas en el método de la invención es por supuesto proporcionando dichos microorganismos con la información genética para sobreexpresar dicha proteína de tipo chaperón. El método de la invención emplea también por tanto una molécula de ADN recombinante que comprende al menos parte de un gen ftsY que codifica una proteína de tipo chaperón de bacteria Gram-positiva, codificando dicha parte al menos una parte funcional de dicha proteína de tipo chaperón, por lo que un representante de dicho gen tiene la secuencia de SEQ. ID NO. 7.

Como es cierto para las sustancias proteínicas usadas en el método de la invención, la secuencia dada se da por la razón de permitir a la persona experta encontrar secuencias homólogas que codifiquen factores de secreción similares. Pueden existir variantes dentro de la especie Bacillus y otras bacterias Gram-positivas. Permitirá también a la persona experta en la técnica construir mutaciones tácitas, construir mutaciones beneficiosas o mutaciones que no tengan efecto sobre la actividad del chaperón resultante de la expresión. Para diferentes especies puede ser diferente la preferencia de codones, pudiendo tenerse en cuenta la degeneración. Para definir qué genes pueden emplearse aún en el método de la invención, sólo puede hacerse realmente por su funcionalidad. Si codifican una sustancia que tenga la misma actividad (de clase, no de cantidad) como las proteínas de tipo chaperón inventadas ahora, puede emplearse el gen (o la molécula de ADN recombinante) en el método de la presente invención, si la molécula se deriva de una bacteria Gram-positiva, en particular una especie Bacillus. Habitualmente, esto coincidirá con un grado de homología bastante alto, por ejemplo del 70-95% global.

Una realización preferida adicional del método emplea un gen o una molécula de ADN recombinante que comprende al menos parte del gen ftsY de una especie Bacillus. La principal razón para esta preferencia es por supuesto que las especies Bacillus son organismos de producción muy conocidos en los que por razones ya mencionadas sería provechoso proporcionar una proteína de tipo chaperón autóloga (también denominada a veces homóloga). La proteína de tipo chaperón más preferida en este momento es la codificada por una molécula de ADN recombinante que comprende al menos parte del gen ftsY de Bacillus subtilis.

Para una transferencia fácil de la información genética de los factores de secreción usados en el método de la invención, se prefiere proporcionar la molécula de ADN recombinante como un vector. La invención emplea así también un vector recombinante que comprende una molécula de ADN recombinante como se ha descrito antes y elementos reguladores adecuados para replicación y/o expresión. La naturaleza y clase de tal vector no es importante en tanto en cuanto sea capaz de transferir la información genética deseada al microorganismo deseado, y capaz preferiblemente de replicarse o ser replicado en tal microorganismo. Pueden comprender muchos aspectos ventajosos adicionales tales como genes marcadores, lugares de restricción, etc. La integración cromosómica del (parte del) gen según el factor de secreción también está comprendida dentro de esta invención. Sería por supuesto ventajoso tener sólo que transferir un microorganismo con un vector. Preferiblemente, el método de la invención emplea un vector recombinante como se ha descrito antes que comprende además un gen que codifica una proteína de interés a segregar.

El método de la presente invención puede emplear microorganismos que se hayan proporcionado con la información genética para codificar un tipo de chaperón por cualquier método. La invención puede emplear así una célula derivada de una célula hospedante Gram-positiva que comprenda una molécula de ADN recombinante o un vector como se ha definido antes aquí. Preferiblemente la célula se deriva de una especie Bacillus. En una realización preferida adicional, se ha provisto también la célula con la capacidad para sobreexpresar alguno o ambos scARN 7S y Ffh de manera similar a como se ha proporcionado con la (sobre)expresión de FtsY.

En una realización preferida adicional, se ha proporcionado también la célula con la capacidad de sobreexpresar una proteína homóloga o de expresar una proteína heteróloga. Una forma adecuada de llegar a tal célula es proporcionarla con la información genética para dicha proteína de interés, conduciendo a una célula que comprende un vector que tiene la información genética que codifica una proteína de tipo chaperón usada en el método de la invención, que comprende además un vector que comprende un gen que codifica una proteína de interés a segregar. Todos los métodos que conducen a los productos de la invención son también, por supuesto, parte de esta invención. En particular, son importantes los métodos que conducen a la producción aumentada de proteínas segregadas en el medio de cultivo. La invención incluye así también un método para aumentar la secreción de una proteína de interés desde un microorganismo Gram-positivo, que comprende las etapas de proporcionar dicho microorganismo con la posibilidad de sobreexpresar la proteína de interés, proporcionar el microorganismo con la posibilidad de sobreexpresar una sustancia proteínica según la invención y cultivar dicho microorganismo en condiciones adecuadas.

Preferiblemente, la posibilidad de sobreexpresar la proteína de interés es proporcionada por un vector como se ha descrito antes aquí, y la posibilidad de sobreexpresar una sustancia proteínica según la invención también es proporcionada por un vector como se ha descrito anteriormente.

La invención se ilustrará ahora adicionalmente en la siguiente descripción detallada y los ejemplos.

Descripción detallada de la invención

Hay ahora una evidencia creciente de que una pobre expresión y/o secreción es causada por un plegado incorrecto de la proteína heteróloga en la célula hospedante. La causa de este efecto puede ser la incompatibilidad de las proteínas de tipo chaperón de la célula hospedante de la trayectoria secretora regular y la proteína heteróloga. Como resultado, las proteínas heterólogas recién sintetizadas serán reconocidas muy ineficazmente y convertirse de esta forma en una etapa limitadora de proporción en el proceso de translocación. Esto será aún más pronunciado si la proteína heteróloga se sobreexpresa. Una posibilidad para superar este problema es expresar proteínas de tipo chaperón heterólogas que sean homólogas a la proteína heteróloga que ha de segregarse. La expresión de SecB de E. coli en B. subtilis ha mostrado facilitar la secreción de la proteína de unión de maltosa dependiente de SecB de E. coli (Collier, 1994). Esta opción es probable que no sea aplicable cuando la proteína heteróloga y el factor de secreción son de un organismo más distante filogenéticamente. De esta forma, la maquinaria de secreción regular de la célula hospedante podría resultar incompatible con la propia proteína de tipo chaperón heteróloga, conduciendo al mismo efecto: eficacia de secreción extremadamente baja. Otra posibilidad, parte de esta invención, es sobreexpresar una o más de las proteínas de tipo chaperón de la célula hospedante, preferiblemente las proteínas de tipo chaperón de tipo SRP y aumentar así la disponibilidad de estas proteínas de tipo chaperón para la proteína heteróloga.

Puesto que se han identificado en B. subtilis homólogos de SecA (Sadaie et al. 1991), SecE (Jeong et al. 1993), SecY (Su et al. 1990) y Lep (Van Dijl et al. 1992), se sugiere que la secreción de proteína dependiente del péptido señal en B. subtilis utiliza unas trayectoria Sec que es similar a la de E. coli. Hasta ahora SecB, que se considera el principal chaperón en E. coli, parece ser el único chaperón que tiene una afinidad de unión directa por SecA y contribuye así a la fijación de objetivo precisa del complejo preproteína-SecB a la translocasa unida a membrana. La proteína SecB es necesaria para sólo un subgrupo de las proteínas de envoltura de modo que proteínas independientes de SecB entrarán en la trayectoria Sec con la ayuda de proteínas auxiliares como GroEL/GroES, DnaK/DnaJ u otras proteínas como SRP. En un organismo eucariota, SRP es principalmente responsable de la translocación a través de la membrana del ER. Recientemente, se ha dispuesto de más evidencia de la existencia de una vía de secreción mediada por SRP en bacterias. Puesto que la trayectoria eucariota se ha desarrollado probablemente desde la bacteria, es concebible que dichas proteínas sean también dependientes de esta trayectoria cuando se expresan dichas proteínas en bacterias como Bacillus. Así, la optimización de esta trayectoria particularmente en Bacillus será más provechosa para secreción de proteínas heterólogas (eucariotas) que la optimización de la trayectoria sec bien conocida. Esta invención se refiere a la clonación del gen ftsY de Bacillus y su efecto tras (sobre)expresión, solo o en combinación con otros miembros de la SRP bacteriana, en proteínas heterólogas.

Para la clonación de ftsY de B. subtilis, se sintetizaron cebadores degenerados haciendo uso de cajas de homología existentes entre los homólogos SR\alpha de diferentes organismos (Fig. 2a). Después de una reacción PCR inversa usando un fragmento de 110 pb, que se derivó de una reacción PCR encajada, podía detectarse como plantilla un fragmento de 4 kb. Los resultados de determinación de secuencia (Fig. 2b) revelaron un marco de lectura abierto de 329 aminoácidos. Esta proteína participaba del 48,2% de identidad de aminoácidos y del 65% de similitud con el gen ftsY de E.coli.

Como se mostrará en los Ejemplos, los experimentos de hibridación condujeron originalmente a un resultado indeseado, es decir, una mancha de bandas indistintas. Sorprendentemente, los inventores fueron capaces cortando una región alrededor del tamaño esperado del fragmento multiplicado y aplicando de nuevo PCR a esa región, para resolver esta mancha en un grupo de bandas distintas. Desgraciadamente, difícilmente se veía ninguna banda en el tamaño esperado del fragmento que debía haberse multiplicado. Sin embargo, en una tercera ronda de multiplicación, los inventores fueron capaces no obstante de obtener un fragmento que podía usarse adicionalmente.

Ejemplo 1 Construcción de un vector promotor para sobreexpresión de factor de secreción

pHB201 es capaz de replicación autónoma en cepas de E. coli (copia alta) y Bacillus (copia baja). Este plásmido confiere resistencia a los antibióticos cloranfenicol y eritromicina en E. coli y Bacillus. Además, el plasmado lleva un gen de fusión CAT86::lacZ precedido por el promotor 59 de Lactococcus lactis fuerte que actúa también como promotor fuerte en B. subtilis (Van der Vossen et al. 1987).

Sustituyendo el fragmento de SalI/EcoRI de este plásmido por un fragmento de ADN sintético (SEQ ID NO: 1) se suprimió el CAT86::lacZ y se introdujo un lugar de restricción de NdeI único superponiéndose al pHBNde generador de lugar de iniciación de la traducción (Fig. 1a). Esto permite expresar los genes de chaperón directamente aguas abajo del promotor 59 de Lactococco fuerte sin crear proteínas de fusión como sería con el vector pHB201 original (Fig. 1b).

Ejemplo 2 Clonación molecular de fragmentos de ADN de Bacillus subtilis homólogos del gen Sr\alpha humano

Se realizó como sigue un conjunto de tres Reacciones en Cadena de Polimerasa (PCR). Se usó como plantilla ADN cromosómico de B. subtilis 168 en una primera reacción PCR con los cebadores degenerados AB4229 (SEQ ID NO: 2) y AB4230 (SEQ ID NO: 3). Después de 30 ciclos y una temperatura de reasociación de 40ºC, el ADN multiplicado se fraccionó por electroforesis en un gel de agarosa Metaphor del 2% (FMC BioProducts). Los resultados mostraron una mancha de 11 bandas resueltas. Se purificaron fragmentos de ADN de tamaño variable de 220 pb a 300 pb a partir del gel de agarosa con una columna de extracción de gel QIAquick (QIAGEN).

1/50 de estos fragmentos aislados se usaron en una segunda PCR con cebadores degenerados AB4229 y AB4241 (SEQ ID NO: 4) usando las mismas condiciones de reacción que en la primera PCR. El resultado de esta PCR mostró un cierto número de bandas de zona, aunque era difícilmente visible una banda del tamaño esperado (\pm 120 pb). Se aislaron del gel de agarosa fragmentos de \pm 120 pb como antes y se usaron en una tercera PCR con los mismos cebadores y condiciones usados para la segunda PCR. El fragmento simple resultante se aisló, se purificó y, tras tratamiento con quinasa de polinucleótido T4, se ligó a pUC18 desfosforilado linealizado con SmaI.

Después de electroporación a E. coli JM109 y selección en placas de IPTG/X-gal, se usó el ADN de seis colonias blancas para determinación automatizada de secuencia. Dentro de los seis aislados, podía detectarse un Marco de Lectura Abierto (ORF). Este ORF mostraba más del 70% de similitud con un alineamiento de homólogos de varios otros organismos (Fig. 2b).

Ejemplo 3 Determinación de la secuencia de secuencias de ADN desconocidas adyacentes a una extensión corta de secuencia conocida

Usando un fragmento de ftsY interno marcado derivado del Ejemplo 2, podía detectarse una banda de PstI de 4 kb simple en un experimento de hibridación. Ninguno de los intentos por clonar este fragmento directamente en pUC tuvo éxito, indicando que la clonación de este fragmento podía ser letal en E. coli. Se usó una PCR inversa (IPCR) para determinar la secuencia.

Un digerido de PstI total de ADN cromosómico de B. subtilis 168 se usó como plantilla en la IPCR con cebadores AB5356 (SEQ ID NO: 5) y AB5357 (SEQ ID NO: 6). El fragmento resultante se usó directamente para determinación automatizada de secuencia haciendo uso de los mismos cebadores. La secuencia del resto del fragmento de ADN cromosómico de PstI situado aguas arriba del cebador AB5357 y aguas abajo del cebador AB5357 se determinó por determinación automatizada de secuencia haciendo uso de cebadores recién desarrollados mientras era descubierta la secuencia. La secuencia de ADN de 4370 pb total del fragmento de PstI se muestra en la Figura 3.

El análisis de la secuencia mostró la presencia de varios Marcos de Lectura Abiertos (ORFs), incluyendo el de FtsY. Cuando se compara la estructura total de las proteínas tipo SR\alpha y proteínas tipo SRP54, es evidente un dominio común que comprende cajas de unión GTP (el dominio G, véase Figura 4). También es claro por esta figura que la proteína FtsY de B. subtilis contiene sólo un dominio N-terminal muy corto, en contraste con los homólogos eucariota y de E. coli. Puesto que el dominio N-terminal en estos organismos sirve como ancla de membrana, es posible que en FtsY de B. subtilis funcione con un mecanismo diferente, y es posiblemente más tipo chaperón en su acción, aunque pueda todavía unirse a membrana.

El análisis de la secuencia mostró la presencia de varios ORF's más, incluyendo un ORF truncado que mostraba homología con la proteína Ffh y un ORF truncado que mostraba homología con varias proteínas de segregación de ADN como la proteína de levadura SMC1.

La organización cromosómica de los genes en el fragmento de PstI se muestra en la Figura 5.

Ejemplo 4 Efecto de la reducción de FtsY en la secreción de proteínas heterólogas

Se estudiaron los efectos de reducción de FtsY en Bacillus en la elaboración y/o secreción de proteínas heterólogas poniendo el gen ftsY cromosómico bajo el control del promotor SPAC inducible (Yansura et al.). Para esto, se clonó la parte N-terminal del gen ftsY en el lugar de clonación múltiple de pDG148 directamente aguas abajo del promotor SPAC. El fragmento de SPAC-ftsY-penP-lacI del plásmido pDGFtsY' resultante se reclonó en pPPNeo2 haciendo la construcción de integración final pNSFtsY' (Fig. 6).

pNSFtsY' es capaz de replicación autónoma en E. coli pero no en Bacillus. Confiere resistencia al antibiótica ampicilina que puede usarse para selección en E. coli y neomicina para selección en Bacillus. La integración de pNSFtsY' en el lugar de ftsY produce una copia truncada de ftsY (ftsY') bajo control del promotor auténtico y una copia intacta de ftsY bajo control del promotor SPAC.

Los integrantes de pNSFtsY' resistentes a neomicina podían seleccionarse después de una transformación protoplástica de B. subtilis 168. Los integrantes que crecieron en un medio con IPTG 0,5 mM mostraron características de crecimiento comparables con el hospedante B. subtilis que carecía del plásmido integrado. La proporción de crecimiento de integrantes no disminuyó después de incubación en ausencia de IPTG, ni lo hizo la morfología de la célula.

Los efectos de la reducción de FtsY en translocación de proteínas se examinaron por experimentos de fermentación usando hospedantes que expresan proteínas heterólogas. Se usó un vector tipo pUB110 que contenía secuencias reguladoras del gen de \alpha-amilasa de B. licheniformis o B. amyloliquefaciens para la expresión de proteínas heterólogas. Algunas de las proteínas heterólogas se produjeron hasta niveles ligeramente más altos en células cultivadas en presencia de IPTG; sin embargo, en ausencia de IPTG, no se anuló completamente la producción de las proteínas heterólogas.

Estos efectos eran inesperados porque la reducción de FtsY en E. coli tiene un efecto profundo sobre la morfología celular y la proporción de crecimiento. Por tanto, es posible que haya formación de FtsY a pesar de la ausencia de IPTG, indicando lectura transcripcional completamente. Sería posible corregir esto por inserción de una señal terminadora fuerte aguas arriba del promotor SPAC en la construcción de integración. Para confirmar que la ausencia de FtsY es arriesgada para la célula, se hicieron intentos para romper el gen FtsY.

Ejemplo 5 Construcción de cepas de Bacillus sin un gen ftsY funcional

Puesto que los experimentos descritos en el Ejemplo 4 eran inesperados en el sentido de que la cepa que contiene el gen ftsY bajo el control del promotor SPAC era aún viable y no mostraba un fenotipo claro en ausencia del inductor IPTG, se supuso que la construcción usada era defectuosa de manera que incluso en ausencia de IPTG se produciría una pequeña cantidad de FtsY. Para eliminar la producción de FtsY, se probó romper el gen ftsY por inserción de un marcador de resistencia a neomicina. Se construyó un plásmido pBHdSFtsYNeo que alberga el extremo 5' y 3' del gen ftsY separado por el gen de resistencia a neomicina en un vector incapaz de replicarse en B. subtilis.

El plásmido pBHdSFtsYNeo se linealizó cortando con HpaI y se usó para transformar B. subtilis 168 a resistencia a neomicina. Esto conduciría a cepas que tienen el gen ftsY original sustituido por la construcción ftsY::Neo mediante un encuentro de cruce doble (véase Figura 7). Sin embargo, los inventores fueron incapaces de seleccionar colonias resistentes a neomicina usando este ADN lineal, sugiriendo la posibilidad de que la rotura del gen ftsY es letal para la célula.

Se repitieron por tanto los experimentos de transformación con ADN plásmido intacto, sin cortar. En este caso, la integración del plásmido en el gen ftsY puede tener lugar mediante un encuentro de cruce simple (integración de tipo Campbell), conduciendo a colonias resistentes a neomicina que tienen una copia intacta y una rota del gen ftsY presente (véase Figura 8). Se aislaron cepas integrantes, una de las cuales mostró tener la organización cromosómica representada en la Figura 8. Puesto que en esta cepa están presentes dos copias del extremo 3' del gen ftsY, es posible la recombinación entre ellas, conduciendo a la escisión de las secuencias de plásmido entre ellas y la formación de una cepa que contiene sólo una copia del gen ftsY, roto por el marcador de resistencia a neomicina. A pesar de varios intentos, los inventores fueron incapaces de aislar tales cepas recombinantes, sugiriendo de nuevo que tales cepas son inviables.

Ejemplo 6 Efecto de la sobreexpresión de FtsY en la localización de precursores y proteínas heterólogas maduras

Los efectos de la sobreexpresión de FtsY en Bacillus sobre la elaboración y/o secreción de proteínas heterólogas se estudiaron poniendo el gen ftsY completo bajo control del promotor P59 constitutivo en pHBNde (véase Ejemplo 1), produciendo el plásmido pHBFtsY. Se examinaron los efectos de la sobreexpresión de FtsY en translocación de proteínas por experimentos de persecución de impulsos usando hospedantes que expresan proteínas heterólogas.

Se transformó B. licheniformis T399 con plásmido pLAT-IL3 que contenía el gen de interleuquina-3 humano (h-IL-3) expresado a partir del promotor de \alpha-amilasa de B. licheniformis y provisto de la secuencia señal de \alpha-amilasa de B. licheniformis, o con el plásmido pLP10-AB que contiene el gen de proquimosina bajo las mismas señales de expresión. Las cepas resultantes T399IL y T399Chy se transformaron con plásmido pHBNFtsY que contenían el gen ftsY. Como testigo, se transformaron también ambas cepas T399IL y T399Chy con el vector pHBNde.

Se inocularon colonias simples de todas las cepas en 5 ml de medio de subalimentación S7+ (incluyendo metionina y cisteína) y se hicieron crecer a 37ºC durante la noche. Se inocularon partes alícuotas de 200 \mul en 5 ml de medio S7- (sin metionina y cisteína) y se hicieron crecer durante otras 5 horas.

Después de crecer hasta OD = 0,3-0,7, se centrifugó una muestra de 3,2 ml, se lavó con medio S7- y se resuspendió en 3,2 ml de medio S7- reciente. La muestra se incubó durante 20 minutos a 37ºC y se impulsó con 25 \muCi de L-[^{35}S]-metionina (>1000 Ci/mmol) por ml durante 60 segundos a 37ºC. Se realizó después una persecución por adición de 50 \mul (2 mg/ml) de L-metionina por ml. La persecución se detuvo en diferentes puntos de tiempo (0, 15, 30 y 60 segundos) mezclando 600 \mul de la reacción con 600 \mul de TCA al 20% enfriado con hielo e incubación en hielo durante al menos 30 minutos. Se centrifugaron las muestras y el sobrenadante se usó directamente para inmunoprecipitación, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y autorradiografía usando métodos estándares.

El sedimento de células se lavó con 1 ml de acetona y se secó. Las células se resuspendieron en 50 \mul de tampón de lisis (Tris 10 mM pH 8, MgCl 25 mM, NaCl 200 mM, 5 mg/ml de lisozima) y se incubaron durante 3 minutos a 37ºC. Después de añadir 50 \mul de TES (Tris 20 mM, EDTA 2 mM, 2% de SDS, pH 8), se hirvieron las muestras durante 5 minutos. Se añadieron a las muestras 900 \mul de STDT (Tris 10 mM, 0,9% de NaCl, 1% de Triton, 0,5% de desoxicolato sódico, pH 8,2), se incubó la mezcla durante 15-60 minutos en hielo y se precipitó el residuo. El sobrenadante se usó para inmunoprecipitación con antisuero producido contra h-IL-3 o quimosina y subsiguientes electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y autorradiografía usando métodos estándares.

La sobreexpresión de FtsY aumentó la secreción de la forma madura de interleuquina-3 y la elaboración del precursor de proquimosina.

Ejemplo 7 Efecto de la sobreexpresión de Ffh en la secreción de interleuquina-3 humana

El gen ffh que codifica el homólogo de B. subtilis de la proteína eucariota SRP54 se clonó como un fragmento de PCR obtenido usando cebadores basados en la secuencia de ADN publicada (Honda et al., 1993). El gen se clonó en el vector pHBNde (véase Ejemplo 1) bajo el control del promotor de Lactococco P59 fuerte para formar el plásmido pHBNFfh.

Se realizaron experimentos de persecución de impulsos como se ha descrito en el Ejemplo 6 con cepas de B. licheniformis que contenían el plásmido pHBNffh y el plásmido pLAT-IL3 que albergaba el gen de interleuquina-3 humana (h-IL-3) bajo la expresión y señales de secreción del gen de \alpha-amilasa de B. licheniformis.

Como se muestra en la Figura 9, la elaboración de h-IL-3 es muy rápida, porque no puede detectarse precursor. La cantidad de h-IL-3 madura en la fracción sobrenadante es en todos los casos más alta en las muestras obtenidas de la cepa sobreproductora Ffh comparada con la cepa que contiene sólo el plásmido vector.

Ejemplo 8 Efectos de la sobreexpresión de scARN en la secreción de interleuquina-3 humana

El gen scr que codifica el scARN de B. subtilis se clonó como un fragmento de PCR obtenido usando cebadores basados en la secuencia de ADN publicada (Struck et al., 1989) y siguiendo el método (incluyendo el mismo cebador 5') descrito por Nakamura (Nakamura et al., 1992) introduciendo un lugar de HindIII inmediatamente aguas arriba del scr ADN y un lugar de SphI aguas abajo de la secuencia terminadora.

El promotor P59 se suprimió del vector pHB210 por sustitución del fragmento de AlwNI-SmaI que contenía el origen de replicación (ori) junto con el promotor P59 por el fragamento de AlwNI-PvuII del vector pBR322 que contenía sólo el mismo ori. Este nuevo vector pBHk se usó para intercambiar el fragmento de EcoRI-PvuII por el fragmento de EcoRI-BamHI (hecho de extremos romos por polimerasa T4) que contenía la cassette SPAC-penP-lacI de pDG148 para construir el vector pBHSpac.

El fragmento de PCR que contenía el gen scr se digirió con HindIII y SphI, y se ligó a pBHSpac digerido con las mismas enzimas de restricción para construir el plásmido pBHSscr. De esta forma el gen scr se puso bajo el control del promotor SPAC.

Se realizaron experimentos de persecución de impulsos como se ha descrito en el Ejemplo 6 con cepas de B. licheniformis que contenían el plásmido pBHSscr y el plásmido pLAT-IL3 que albergaba el gen de interleuquina-3 humana (h-IL-3) bajo la expresión y señales de secreción del gen de \alpha-amilasa de B. licheniformis.

También en este caso, la elaboración de h-IL-3 fue muy rápida, porque no podía detectarse precursor. Sin embargo, la cantidad de h-IL-3 madura en la fracción sobrenadante fue en todos los casos más alta en las muestras obtenidas de la cepa sobreproductora scARN comparada con la cepa que contiene sólo el plásmido vector, o con plásmido pBHSscr en ausencia del inductor IPTG.

Ejemplo 9 Efectos de los componentes de Partícula de Reconocimiento de Señal sobreexpresados simultáneamente en la secreción de proteínas heterólogas

Los efectos descritos en los Ejemplos 6, 7 y 8 fueron aún más pronunciados cuando más de uno de los componentes de la partícula de reconocimiento de señal bacteriana se expresaron simultáneamente. Para este fin, el gen ftsY se expresó a partir del promotor inducible IPTG situado en el cromosoma como se ha descrito en el Ejemplo 4 por adición de IPTG 3 mM, mientras que los componentes Ffh o scARN se expresaron a partir de sus vectores derivados pHB210 descritos en los Ejemplos 7 y 8 anteriores.

Referencias

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Yansura, D.G., y D.J. Henner. 1984. Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 439-443.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Genencor International B.V.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Wateringseweg 1

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Delft

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Paises Bajos

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 2600 MA

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Secreción de proteínas heterólogas en Bacillus

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release 1.0. Versión 1.25 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 170 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: .lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: AB4296-4303

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: .lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: AB4229

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGMGTSAAYG GMGTSGGMAA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: .lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: AB4230

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCRSCYGSRC GRWAKRTRTC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: .lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: AB4241

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ARNCKKCCNG CYGTRTC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: .lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: AB5356

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCCTGTCAT TAAGCAGACG GCAGGAAGCG ATCC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: .lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: AB5357

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGCTCATC TCCGCTGTTA TAAATCTCGA CCAG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1016 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: .lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: B. subtilis

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: 168

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

ASPECTOS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE; CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 19..1008

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN:/función = "chaperon de secreción de proteína"

\hskip2.9cm

/producto = "FtsY"

\hskip2.9cm

/gen = "ftsY"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

2

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 329 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: .lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

Claims (9)

1. Un método para proporcionar una célula hospedante Gram positiva que es capaz de secreción aumentada de una proteína de interés, cuyo método comprende:

proporcionar la célula hospedante Gram positiva con (i) una primera secuencia de ADN que codifica la proteína de interés y (ii) una segunda secuencia de ADN que tiene más del 85% de homología de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7 y que codifica una proteína que tiene una función de chaperón;

de modo que el cultivo de la célula hospedante Gram positiva en condiciones adecuadas permite una secreción aumentada de la proteína de interés.

2. Un método que comprende, habiendo proporcionado la célula hospedante Gram positiva según la reivindicación 1ª, la etapa adicional de cultivar la célula hospedante Gram positiva en condiciones adecuadas.

3. El método según la reivindicación 1ª o la reivindicación 2ª, en el que la segunda secuencia de ADN comprende una secuencia que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

4. El método según la reivindicación 3ª, en el que dicha segunda secuencia de ADN comprende SEQ ID NO: 7.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula hospedante comprende además una secuencia de ADN que codifica Ffh, y Ffh se sobreexpresa en la célula hospedante.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además una secuencia de ADN que codifica scARN 7S, y scARN 7S se sobreexpresa en la célula hospedante.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína de interés es heteróloga a la célula hospedante.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula hospedante Gram-positiva se una especie de Bacillus.

9. El método según la reivindicación 8ª, en el que dicha especie de Bacillus es Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus alcalophilus, Bacillus lentus o Bacillus stearothermophilus.