ES2244975T3 - Biomateriales para la prevencion de adherencias postquirurgicas, formados por derivados de acido hialuronico. - Google Patents

Abstract

NUEVOS MATERIALES CONSTITUIDOS ESENCIALMENTE POR DERIVADOS ESTERIFICADOS DEL ACIDO HIALURONICO O POR DERIVADOS ENTRECRUZADOS DEL ACIDO HIALURONICO PARA USO EN EL SECTOR QUIRURGICO, PARTICULARMENTE PARA USO EN LA PREVENCION DE ADHERENCIAS POSQUIRURGICAS.

Description

Biomateriales para la prevención de adherencias postquirúrgicas, formados por derivados de ácido hialurónico.

La presente invención se refiere a nuevos biomateriales esencialmente constituidos por derivados esterificados de ácido hialurónico o por derivados reticulados de ácido hialurónico a utilizar en la prevención de adherencias post-quirúrgicas.

La formación de adherencias post-operatorias es una complicación habitual en cirugía abdominal o de la pelvis, que puede conducir a una morbilidad sustancial. Muchos factores pueden influir en el desarrollo de las adherencias: trauma mecánico, agentes químicos, secado de la serosa en combinación con la sangre, isquemia, infección y materiales extraños, todos ellos son conocidos como causa de incremento de la formación de adherencias. Otras causas son las enfermedades inflamatorias e intrabdominales y anormalidades congénitas. El mecanismo patofisiológico sigue siendo todavía poco claro, pero se ha sugerido una vía principal común en la que la fibrinólisis peritoneal juega un papel importante.

El trauma quirúrgico de los tejidos provoca la liberación de un exudado de suero sanguíneo que forma un puente de fibrina que persiste varios días, durante los cuales tiene lugar el crecimiento celular. Si el exudado no es absorbido o es objeto de lisis dentro de este período, pasa a ser un crecimiento de fibroblasto, y el depósito subsiguiente de colágeno conduce a la formación de una cicatriz permanente que conecta las dos superficies adyacentes, que es lo que se llama una adherencia. En conclusión, la formación de adherencias parece ser resultado de una respuesta inflamatoria.

En este último caso, las investigaciones se han enfocado principalmente en la búsqueda de materiales bioabsorbibles con un corto tiempo de persistencia in vivo, que actúan como barrera para la formación de adherencia hasta que ha tenido lugar la curación; para obviar el problema provocado por materiales no absorbibles (infección, calcificación de los implantes, formación de cicatrices, etc.).

Un polímero particularmente prometedor es el ácido Hialurónico (HA), un componente de matriz extracelular que se encuentra ampliamente dentro del cuerpo humano. Se ha demostrado que las soluciones de ácido hialurónico reducen la formación post-operatoria de adherencias, después de operaciones abdominales (Urman, B. y otros., Effect of Hyaluronic Acid on Postoperative Intraperitoneal Adhesions Formation in the Rat Model, Fertil. Steril. 1991; 56:563; Shushan A. y otros., Hyaluronic Acid for Preventing Experimental Postoperative-intraperitoneal Adhesions, J. Reprod. Med. 1994; 39:398) y operaciones ortopédicas (Hagberg, L, Gerdin, B., Sodium Hyaluronate as an adjunctive in adhesion prevention after flexor tendon surgery in rabbits, J. Hand. Surg. 1992; 17A:935).

Fidia Advanced Biopolymers ha desarrollado derivados químicos del ácido hialurónico, es decir, ésteres internos (serie ACP) y ésteres con alcoholes no activos (series HYAFF) Rastrelli, A. y otros., Hyaluronic Acid Esters, A New Class of Semisynthetic Biopolymers: Chemical and Physico-chemical Properties, Clinical Implant Materials, Advanced in Biomaterials, G. Heinrike, V. Sollz y AJC Lee (Eds), Elsevier, Amsterdam 1990; 9:199-205, que muestran propiedades fisicoquímicas distintas de las de HA (es decir, tiempo de permanencia más elevado y facilidad de fabricación para la producción de dispositivos, pero que poseen características de tolerancia y de biocompatibilidad típicas del polímero biológico original). Además, estos derivados se caracterizan desde un punto de vista químico y toxicológico.

El objetivo de la presente invención ha sido desarrollar lotes de gel de ACP en un intento de evaluar el efecto en la prevención de adherencias.

El inicio de las adherencias, o masas fibrosas que se forman entre tejidos adyacentes afectados por trauma o isquemia después de cirugía, es todavía una de las complicaciones más serias en numerosos procesos quirúrgicos. Se ha propuesto un gran número de métodos para evitar esta complicación, pero el problema permanece básicamente sin solucionar.

Un método que se ha propuesto ha sido la utilización de suspensiones de dextrano (diZerega G.S., "Contemporary adhesion prevention" Fertility and Sterility, Vol. 61, Nº2, febrero 1994) inyectado en la cavidad peritoneal después de la cirugía. Los resultados clínicos de la utilización de estas soluciones de dextrano han sido ampliamente discordantes. Además, la utilización de soluciones de dextrano se ha visto acompañada de frecuentes complicaciones, incluyendo edemas, dolores abdominales y dispnea.

La utilización de barreras en forma de estructuras definidas (por ejemplo, rejillas, membranas) (diZerega G.S., "Contemporary adhesion prevention" Fertility and Sterility, Vol. 61, Nº 2, febrero 1994) o geles viscosos (Genzyme patente USA Nº 4.937.270, patente USA Nº 5.017.229) para su colocación entre los órganos heridos ha sido también objeto de propuesta. No obstante, estas barreras se han mostrado en general ineficaces porque provocan reacciones isquémicas o inflamatorias, debido a la presencia de cuerpos extraños. Los únicos materiales actualmente probados para utilización clínica son barreras basadas en celulosa regenerada oxidada (Interceed®) y barreras basadas en politetrafluoroetileno expandido (e-PTFE) (Goretex®, patente USA Nº 4.478.665 y patente USA Nº 4.482.516) o polietileno o polipropileno.

Además del hecho de que las investigaciones clínicas sobre la eficacia de dichas barreras han producido resultados altamente discordantes, también se debe observar que ambos materiales antes mencionados han sido asociados con contraindicaciones importantes. La utilización de membranas barrera de e-PTFE o de polietileno o polipropileno comporta la implantación de un material sintético, que es una materia extraña con respecto al cuerpo humano y que no es biodegradable, y que puede requerir una segunda operación quirúrgica para eliminar o reponer la membrana barrera a causa de reacciones de tipo inflamatorio no deseables.

En modelos preclínicos y clínicos, se han demostrado eficaces en la prevención de la formación de adherencias las mallas o rejillas basadas en celulosa regenerada oxidada, pero solamente si su aplicación viene precedida de hemostasis completa.

La utilización de soluciones viscosas de ácido hialurónico de alto peso molecular (HA) se ha propuesto, por lo tanto, como ayuda en la prevención de adherencia (Grainger D.A. y otros., "The use of hyaluronic acid polymers to reduce postoperative adhesions", J. Of Gynecol. Surg., Vol. 7, Nº 2, 1991; Hurman B. y otros., "Effect of hyaluronic acid on postoperative intraperitoneal adhesion formation in the rat model", Fertility and Sterility, Vol. 56, Nº 3, septiembre 1991; Shushan A. y otros., ``Hyaluronic acid for preventing experimental postoperative intraperitoneal adhesions:, J. Of Reproductive Med., Vol. 39, Nº 5, mayo 1994; Mitchell J. D. y otros., "Reduction in experimental pericardial adhesions using a hyaluronic acid bioabsorbable membrane", Eur. J. Cardio-thorac. Surg., 8, 149-152, 1994). El ácido hialurónico como tal, no obstante, se caracteriza por tiempos de absorción muy rápidos, que son incompatibles con el tiempo de permanencia necesario para impedir adherencias. Además, el ácido hialurónico natural no puede ser procesado y no puede ser transformado en una forma de biomaterial. A efectos de prolongar sus tiempos de degradación y posibilitar su proceso en diferentes formas físicas para su utilización en diferentes sectores quirúrgicos, se han desarrollado ésteres de ácido hialurónico y derivados reticulados del ácido hialurónico. La preparación de ésteres de ácido hialurónico, en los que la totalidad o una parte de los grupos carboxi están esterificados, la preparación de derivados reticulados de ácido hialurónico, en los que una parte de los grupos carboxi sufren reticulación y sus utilizaciones en los sectores farmacéutico, cosmético y quirúrgico, y en el de los materiales plásticos biodegradables se describen en las patentes USA Nº 4.851.521 y 4.965.353, patente europea Nº 0 216 453 y patente europea Nº 0 341 745.

La presente invención da a conocer un biomaterial compuesto, destinado a impedir adherencias quirúrgicas de tejidos, formado por:

un bencilo éster del ácido hialurónico, en el que de 75 a 99% de los grupos carboxi del ácido hialurónico se encuentran esterificados con un radical bencilo y hasta el 25% de los grupos carboxilos están esterificados con el radical alquilo de un alcohol alifático C_{10} a C_{20}, con la condición de que, como mínimo, 80% de los grupos carbóxilo están esterificados, de manera que dicho biomaterial adopta forma de un gel, una membrana, una rejilla o una tela tejida o no tejida, o combinaciones de los mismos.

El biomaterial compuesto que comprende un derivado autorreticulado de ácido hialurónico, en el que 0,5 a 20% de los grupos carbóxilos del ácido hialurónico están reticulados al grupo hidróxilo de la misma molécula de ácido hialurónico o a una molécula distinta, en el que dicho biomaterial de (a) y (b) adopta forma de un gel, una membrana, una rejilla o una tela tejida o no tejida, o combinaciones de los mismos, se utiliza para la preparación de un compuesto para impedir la adherencia post-quirúrgica de tejidos.

Las figuras 1 a 10 son gráficos de los resultados de estudios de adherencia en modelos de animales constituidos por ratas.

La presente invención describe, por lo tanto, la preparación de artículos destinados a cuidados sanitarios y quirúrgicos, basados en un bencil éster de ácido hialurónico o en derivados reticulados de ácido hialurónico, utilizados solos o en mezclas entre sí, caracterizándose por una elevada biocompatibilidad y que son transformables en formas físicas que los hacen adecuados para diferentes utilizaciones en cirugía, incluyendo cirugía laparoscópica. Los materiales son también completamente biodegradables y no necesitan ser eliminados del lugar de aplicación, evitando de esta manera una segunda operación quirúrgica. Cuando se preparan en forma de geles, los derivados reticulados presentan materiales con viscosidad significativamente superior a la de un polímero no modificado y con tiempos de degradación variables. Además, tanto los materiales basados en bencil éster y los materiales reticulados basados en derivados de la presente invención pueden adoptar forma de membranas, telas tejidas o rejillas y telas no tejidas (preparadas de acuerdo con los procedimientos descritos en las patentes USA 4.851.521; USA 4.956.353; WO 93/11804; WO 93/11803, WO 94/17837 y EP 0 341 745) y se caracterizan por las siguientes especificaciones técnicas:

-

las membranas varían en su grosor entre 10 \mum y 1,5 mm, especialmente 20-50 \mum;

-

los tejidos o rejillas pueden variar en grosor entre 200 \mum y 1,5 mm;

-

las telas no tejidas se caracterizan esencialmente por un peso base que varía entre 20 g/m^{2} y 500 g/m^{2} y un grosor entre 0,2 mm y 5 mm, especialmente <1 mm.

Estos materiales pueden ser utilizados solos o en asociación entre sí, o con otros materiales constituidos por polímeros sintéticos (por ejemplo, geles basados en ácido hialurónico reticulado + polipropileno, o membranas esencialmente constituidas por derivados esterificados de HA + polipropileno o membranas formadas por derivados esterificados de HA, dotados de un recubrimiento de un gel de HA autorreticulado).

Ciertamente, la presente invención se refiere también a la utilización de materiales compuestos en forma de geles (para los derivados reticulados), membranas, rejillas, telas tejidas o no tejidas, esencialmente constituidas por los bencil ésteres o derivados reticulados de ácido hialurónico en asociación con materiales no biodegradables en forma de rejillas o membranas de telas no tejidas, tales como e- PTFE, polietileno, polipropileno, poliéster (Dacron®). La presente invención se refiere, por lo tanto, a una nueva clase de artículos para cuidados sanitarios y quirúrgicos a utilizar en el campo de la cirugía, para la prevención de formación de adherencias post-quirúrgicas.

Materiales

Tal como se ha indicado anteriormente, la presente invención se caracteriza por materiales formados por derivados de ácido hialurónico, especialmente derivados bencil éster y derivados reticulados internamente.

El término "ácido hialurónico" (al que se hará referencia también a continuación como "HA") se utiliza en esta literatura para designar un polisacárido ácido con diferentes pesos moleculares, constituido por residuos de ácido D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina, que se presentan de forma natural en superficies celulares, en sustancias extracelulares básicas de los tejidos conectivos de vertebrados, en el fluido sinovial de las articulaciones, en el humor vítreo de los ojos, en los tejidos de los cordones umbilicales humanos y en las cretas de gallos.

El ácido hialurónico juega un importante papel en el organismo biológico, en primer lugar como soporte mecánico de las células de muchos tejidos, tales como la piel, tendones, músculos y cartílagos, y es por lo tanto el componente principal de la matriz extracelular. Sin embargo, el ácido hialurónico lleva a cabo también otras funciones en los procesos biológicos, tales como la hidratación de tejidos, lubrificación, emigración celular, función celular y diferenciación. (Ver, por ejemplo, A. Balazs y otros., Cosmetics & Toiletries, Nº 5/84, páginas 8-17). El ácido hialurónico puede ser extraído de los tejidos naturales antes mencionados, tales como las crestas de gallos, o también de ciertas bacterias. En la actualidad, el ácido hialurónico puede ser también preparado por métodos microbiológicos. El peso molecular del ácido hialurónico completo obtenido por extracción se encuentra entre 8 y 13 millones. No obstante, la cadena molecular del polisacárido se puede degradar de manera muy fácil bajo la influencia de diferentes factores físicos y químicos, tales como influencias mecánicas o bajo la influencia de radiación, hidrólisis, oxidación o agentes enzimáticos. Por esta razón, se obtienen frecuentemente en los procesos de purificación ordinarios de extractos originales, fracciones degradadas con un peso molecular más bajo. (Ver Balazs y otros, anteriormente citado). El ácido hialurónico, sus fracciones moleculares y las respectivas sales han sido utilizadas como medicamentos, y su utilización se ha propuesto también en cosméticos (ver, por ejemplo, el artículo antes mencionado de Balazs y otros, y la patente francesa Nº 2478468).

Si bien el término "ácido hialurónico" se utiliza habitualmente en sentido impropio, con el significado, tal como se puede apreciar de lo anterior, de una serie completa de polisacáridos con alternancias de residuos de ácido D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina con diferentes pesos moleculares o, incluso, fracciones degradadas de los mismos y, si bien el plural de "ácidos hialurónicos" puede parecer más apropiado, la siguiente explicación continuará utilizando la forma singular para hacer referencia al ácido hialurónico en sus diferentes formas, incluyendo sus fracciones moleculares, y la abreviatura "HA" se utiliza también frecuentemente para describir este término colectivo.

1. Derivados de bencil éster

El primer material preferente de la invención se basa en el bencil éster de ácido hialurónico, tal como se define en las reivindicaciones, especialmente los ésteres 80-99%, en los que 80 a 99% de grupos carbóxilo del HA están esterificados. Estos bencil ésteres, en los que se han esterificado 80-99% de los grupos carbóxilo del HA con un grupo bencilo son los que se designan como "ésteres parciales", porque solamente una parte de los grupos carboxilos están esterificados y el resto de grupos carbóxilo se encuentran libres o salificados con un metal alcalino o alcalino térreo, tal como sodio, calcio o potasio.

Son más preferentes para los biomateriales de la invención los llamados bencil ésteres "totales", en los que la totalidad de los grupos carbóxilo del HA se encuentran esterificados. En estos ésteres totales, una parte (75 a 99%) de los grupos carbóxilo del HA se encuentra esterificada con un grupo bencilo, y la totalidad de los grupos carbóxilo restantes se encuentran esterificados con el residuo alquílico/cadena del lípido desde un alcohol alifático C_{10}-C_{20} para producir lo que se puede designar como ésteres "mixtos". De estos alcoholes alifáticos son los más preferentes el alcohol palmítico (C_{16}-hexadecílico) y alcohol esteárico (c_{18} octadecílico). Estos ésteres mixtos pueden adoptar también la forma de ésteres parciales, es decir, derivados en los que una parte (75 a 99%) de los grupos carbóxilo están esterificados con un grupo bencilo y algunos, pero no todos, de los grupos carbóxilo restantes están esterificados con el alcohol C_{10}-C_{20} alifático. De estos, son más preferentes aquellos en los que, como mínimo, están esterificados al 75% de bencilo y, como mínimo, 5% esterificados con un alcohol alifático C_{10}-C_{20}.

Los bencil ésteres de ácido hialurónico, según la invención, pueden ser preparados por métodos conocidos para la esterificación de ácidos carboxílicos, por ejemplo, por tratamiento de ácido hialurónico libre con el alcohol (alcohol bencílico y/o C_{10}-C_{20}) en presencia de sustancias catalizadoras, tales como ácidos inorgánicos fuertes o cambiadores de iones de tipo ácido, o con un agente esterificante capaz de introducir el residuo alcohólico deseado en presencia de bases orgánicas o inorgánicas.

Los ésteres bencil hialurónicos pueden ser preparados, no obstante, de manera ventajosa, de acuerdo con un método específico que se describe en EP 0 216 453. Este método consiste en tratar una sal de amonio cuaternario de ácido hialurónico con un agente eterificante, preferentemente en un disolvente orgánico aprótico.

Para la preparación de los bencil ésteres, es posible utilizar ácidos hialurónicos de cualquier origen, tales como, por ejemplo, los ácidos extraídos de los materiales iniciales naturales antes mencionados, por ejemplo, crestas de gallos. La preparación de estos ácidos se describe en la literatura; preferentemente, se utilizan ácidos hialurónicos purificados. De acuerdo con la invención, se utilizan especialmente ácidos hialurónicos que comprenden fracciones moleculares de los ácidos integrales obtenidos directamente por extracción de materiales orgánicos con pesos moleculares, variables dentro de una amplia gama, por ejemplo de 90-80% (M = 11,7 - 10,4 millones) a 0,2% (M = 30.000) del peso molecular del ácido integral, que tiene un peso molecular de 13 millones, preferentemente entre 5% y 0,2%. Estas fracciones se pueden obtener por varios procedimientos descritos en la literatura, tales como, por ejemplo, hidrolización, oxidación, procesos enzimáticos o físicos, tales como procesos mecánicos o de radiación. Se forman, por lo tanto, extractos primordiales durante estos mismos procesos de purificación (ver, por ejemplo, el artículo de Balazs y otros, citado anteriormente en "Cosmetics & Toiletries"). La separación y purificación de las fracciones moleculares obtenidas se llevan a cabo mediante técnicas conocidas, por ejemplo, por filtrado molecular.

Una fracción del HY purificado adecuada para su utilización de acuerdo con la presente invención es, por ejemplo, la conocida como "hialuronato sódico no inflamatorio-NIF-NaHa de sodio", descrito por Balazs en el folleto
"Healon" - A guide to its use in Ophthalmic Surgery, D. Miller & R. Stegmann, eds. John Wiley & Sons, N.Y., 81983: p 5.

Son especialmente importantes como materiales de partida para el bencil éster dos fracciones purificadas que se pueden obtener a partir del ácido hialurónico, por ejemplo, las extraídas a partir de crestas de gallo, conocidas como "Hialastine" y "Hialectin". La fracción Hialastine tiene un peso molecular promedio aproximado de 50.000 a 100.000, mientras que la fracción Hialectin tiene un peso molecular promedio comprendido entre 500.000 y 730.000. Una fracción combinada de estas dos fracciones ha sido también aislada y caracterizada con un peso molecular promedio de 250.000 a 350.000 aproximadamente. Esta fracción combinada se puede obtener con un rendimiento del 80% del ácido hialurónico total disponible en el material inicial específico, mientras que la fracción Hialectin puede ser obtenida con un rendimiento del 30% y la fracción Hialastine con un rendimiento del 50% del HA inicial. La preparación de estas fracciones se describe en EP 0 138 572.

Si bien la presente invención no incluye productos basados en HIAF-11, los ejemplos que se refieren a los mismos se mantienen a efectos ilustrativos.

Los siguientes ejemplos describen la preparación de los bencil ésteres de HA.

Ejemplo 1

Preparación del bencil éster del ácido hialurónico (HA)

12,4 g de sal del ácido HA de tetrabutilamonio, con un peso molecular de 170.000 correspondiente a 20 m.Eq. de una unidad monómera, se solubilizan en 620 ml de dimetilsulfóxido a 25º, se añaden 4,5 g (25 m.Eq.) de bromuro de bencilo y 0,2 g de ioduro de tetrabutilamonio, manteniéndose la solución durante 12 horas a 30º.

La mezcla resultante es vertida lentamente en 3.500 ml de acetato de etilo con agitación constante. Se forma un precipitado que es filtrado y lavado 4 veces con 500 ml de acetato de etilo y, finalmente, secado en vacío durante 24 horas a 30º.

Se obtienen 9 g del producto de bencil éster del título. La determinación cuantitativa de los grupos éster es llevada a cabo de acuerdo con el método descrito en las páginas 169-172 de la obra de Siggia S. y Hann J.G. "Quantitative organic analysis via functional groups" 4ª edición, John Wiley and Sons.

Ejemplo 2

Preparación del bencil éster del ácido hialurónico (HA)

3 g de la sal de potasio del ácido HA, con un peso molecular de 162.000 son suspendidos en 200 ml de dimetil sulfóxido; se añaden 120 mg de ioduro de tetrabutilamonio y 2,4 g de bromuro de bencilo.

La suspensión se mantiene en agitación durante 48 horas a 30ºC. La mezcla resultante es vertida lentamente en 1.000 ml de acetato de etilo con agitación constante. Se forma un precipitado que es filtrado y lavado 4 veces con 150 ml de acetato de etilo y finalmente es secado en vacío durante 24 horas a 30º.

Se obtienen 3,1 g del producto de bencil éster del título. La determinación cuantitativa de los grupos éster se lleva a cabo de acuerdo con el método descrito en las páginas 1698-172 de Siggia S. y Hanna J.G. "Quantitative organic analysis via functional groups" 4ª edición, John Wiley and Sons.

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Ejemplo 3

Preparación de un derivado de un ácido Hialurónico con 75% de sus funciones carbóxilo esterificadas con alcohol bencílico y el 25% restante esterificadas con Octadecil Alcohol (Alcohol Estearílico, CH_{3}-(CH_{2})_{16}-CH_{2}-OH)

6,21 g de una sal de tetrabutil amonio de ácido hialurónico, con un peso molecular de 180.000 Daltons (10 mEq), se solubilizan en 248 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) a temperatura ambiente.

Esta solución es suplementada con 0,89 ml de bromuro de bencilo (7,5 mEq) y la solución se deja reposar a 30ºC durante 12 horas. La solución es enfriada a continuación a temperatura ambiente y suplementada con 0,83 g de octadecil bromuro (2,5 mEq). La solución es calentada a 30ºC durante 24 horas. Una solución al 2,5% (peso/peso) de NaCl en agua es añadida a continuación, y la mezcla resultante es vertida en 750 ml de acetona, agitando simultáneamente. Se forma un precipitado que es filtrado y lavado tres veces en 100 ml de acetona/agua 5:1, tres veces con 100 ml de acetona y, a continuación, secado a alto vacío durante 24 horas a 30ºC. Se obtienen, de este modo, 5,1 g del producto deseado. La determinación cuantitativa del bencil alcohol y hexadecil alcohol se lleva a cabo por cromatografía gaseosa después de hidrólisis alcalina. El contenido total de grupos éster es cuantificado de acuerdo con el método de saponificación descrito en las páginas 169-172 de la obra "Quantitative organic analysis via functional group" Cuarta Edición (John Wiley and Sons Publication).

Ejemplo 4

Preparación de un derivado de ácido hialurónico con 75% de sus funciones carbóxilo esterificadas con alcohol bencílico y el 25% restante esterificadas con alcohol hexadecílico (cetil palmitil alcohol, CH_{3}-(CH_{2})_{14}-CH_{2}-OH)

6,21 g de sal de tetrabutil amonio de ácido hialurónico con un peso molecular de 180.000 Daltons (10mEq) se solubilizan en 248 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) a temperatura ambiente.

Esta solución es suplementada con 0,89 ml de bromuro de bencilo (7,5 mEq) y la solución se deja reposar a 30ºC durante 12 horas. La solución es enfriada a continuación a temperatura ambiente y suplementada con 0,76 g de bromuro de hexadecilo (2,5 mEq). La solución es calentada a 30ºC durante 24 horas. A continuación se añade una solución a 2,5% (peso/peso) de NaCl en agua, y la mezcla resultante es vertida en 750 ml de acetona con agitación. Se forma un precipitado que es filtrado y lavado 3 veces en 100 ml de acetona/agua 5:1, tres veces con 100 ml de acetona y, a continuación, se seca a alto vacío durante 24 horas a 30ºC. Se obtienen, de este modo, 5 g del producto deseado. La determinación cuantitativa del bencil alcohol y del hexadecil alcohol se lleva a cabo por cromatografía gaseosa seguida de hidrólisis alcalina. El contenido total de grupos éster se cuantifica de acuerdo con el método de saponificación descrito en las páginas 169-172 de "Quantitative organic analysis via functional group" Cuarta Edición (John Wiley y Sons Publication).

2. Derivados con reticulación interna del ácido hialurónico

Los derivados reticulados del ácido hialurónico utilizados en los materiales de la presente invención se describen en la publicación EP 0 341 745. Estos derivados reticulados son ésteres inter y/o intramoleculares del ácido hialurónico, en los que una parte de los grupos carboxi están esterificados con grupos hidróxilo de la misma molécula y/o de distintas moléculas de ácido hialurónico, formando de este modo enlaces lactona o éster intermoleculares. Estos ésteres "internos", en los que no hay intervención por grupos OH de otros alcoholes, se pueden definir como "ácido hialurónico autorreticulado", dado que la formación de una reticulación mono o polimolecular es la consecuencia de la esterificación interna antes mencionada. El adjetivo "reticulado" se refiere a las conexiones transversales entre los carbóxilos y los hidróxilos de las moléculas de ácido hialurónico.

Los productos autorreticulados son ésteres internos parciales, en los que el porcentaje de "reticulación" varía entre 0,5 y 20%, especialmente entre 4,5/5,0% del número de grupos carboxi del ácido hialurónico. En el proceso de preparación, los grupos carboxi de la molécula de HA son activados por la adición de sustancias capaces de inducir dicha activación. Los productos intermedios inestables obtenidos a partir de la reacción de activación se separan espontáneamente, después de la adición de catalizadores y/o después de una elevación de temperatura, formando los enlaces de ésteres internos antes mencionados con hidróxilos de la misma molécula de ácido hialurónico u otra molécula. De acuerdo con el grado de esterificación interna deseado, la totalidad o una parte proporcional de las funciones carboxi son activadas (la parte proporcional se obtiene utilizando un exceso de sustancias activantes o por métodos de dosificación adecuados).

Los grupos carboxi a convertir en grupos éster internos se pueden activar a partir de ácido hialurónico, que contiene tres grupos carboxi libres o, preferentemente, a partir de HA, que contiene grupos carboxi salificados, por ejemplo, sales metálicas, preferentemente de metales alcalinos o alcalinotérreos, y sobre todo con sales de amonio cuaternario, tales como las que se describen más adelante. No obstante, se pueden utilizar como sustancias iniciales sales con bases orgánicas, tales como aminas.

Los métodos para la activación de grupos carboxi libres o salificados son conocidos por sí mismos, particularmente en el sector de la síntesis de péptidos, y los técnicos en la materia pueden determinar fácilmente cuál es el método más apropiado, especialmente utilizar o no las sustancias iniciales en su forma libre o salificada. Se describen métodos de activación conocidos en sí mismos para procesos de síntesis de péptidos en procedimientos de preparación de la presente invención, por ejemplo, en la obra de Bodanszky, M., In search of new methods in peptide synthesis, Int. J. Peptide Protein Res. 25, 1985, 449-474; y Gross, E. y otros, The Peptides, Analysis Synthesis, Biology, Academic Press, Inc., 1979, Vol 1, capítulo 2. De acuerdo con dichos procedimientos, un componente carbóxilo es activado, es decir, un componente carbóxilo es convertido en una forma reactiva. Esta activación comporta de manera típica una reacción entre un ácido y un agente de activación, según el esquema:

R --- COOH \rightarrow R ---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- X,

en el que X es una fracción que retira o capta un electrón. La mayor parte de derivados activados de ácidos carboxílicos, por lo tanto, son anhídridos mixtos incluyendo, en el sentido amplio, asimismo, acidas de ácido y cloruros de ácido, que se pueden considerar anhídridos mixtos de ácido hidrozoico y HCl como agentes activantes. Además, la activación de un compuesto carbóxilo puede ser conseguida por la formación de "ésteres activados" intermedios. Estos "ésteres activados" pueden ser de varios tipos, pero son particularmente útiles los "ésteres activados" preparados por utilización de diciclohexilcarbodiimida, p-nitrofenil ésteres, triclorofenil ésteres, pentaclorofenil ésteres, y O-acil derivados de hidroxilaminas, particularmente ésteres de N-hidroxisuccinamida.

Todos estos diferentes tipos de procesos de activación son útiles en la preparación de HA reticulado según la invención, dado que todos estos procedimientos se caracterizan por comportar, de modo importante, la reacción de un grupo carbóxilo con un agente activante, lo que tiene como resultado esencialmente la formación de un grupo sustituyente que es fácilmente reactivo con un grupo hidróxilo, a efectos de formar la unión de éster interno, característica de los productos de la invención, dependiendo el número de funciones carboxi a convertir en ésteres internos de la proporción del número de funciones carboxi activadas, y este número depende de la calidad del agente activante utilizado.

El procedimiento preferente para la preparación de HA reticulado se caracteriza, por lo tanto, por tratar HA, que tiene grupos carboxi libres o salificados, con un agente que activa la función carboxi, posiblemente en presencia de un agente auxiliar que favorece la formación de derivados activados intermedios y/o una base terciaria orgánica o inorgánica, exponiendo la mezcla a calentamiento o a irradiación (particularmente mediante luz UV) y, en caso deseado, salificando los grupos carboxi libres o mediante la liberación de grupos carboxi salificados. De las sustancias capaces de activar el grupo carboxi, se pueden utilizar las convencionales descritas en la literatura, por ejemplo, las habitualmente utilizadas en la síntesis de péptidos excepto, no obstante, las que tendrían el efecto de alterar o destruir la estructura molecular del HA inicial, tal como las utilizadas para la formación de haluros de carbóxilo. Son sustancias preferentes que conducen a la formación de ésteres activados aquellas tales como, carbodiimidas, diciclohexilcarbodiimida, bencil-isopropilcarbodiimida, bencil-etil-carbodiimida, etoxiacetileno, reactivo de Woodward (N-etil-5-fenilisoxazolio-3-sulfonato) o derivados halógenos a partir de hidrocarburos alifáticos, cicloalifáticos o aromáticos, o bien de un compuesto heterocíclico con halógeno movilizado por la presencia de un o varios grupos activadores, tales como cloroacetonitrilo y especialmente las sales de 2-cloro-N-alquilpiridina, tal como cloruro de 2-cloro-N-metil-piridina u otros derivados de alquilo con grupos alquilo inferiores, tales como los que tienen hasta 6 átomos de carbono. En lugar de
los derivados de cloruro, se pueden utilizar otros derivados de halógenos, tales como los derivados de bromuro.

Esta reacción de activación puede ser llevada a cabo en disolventes orgánicos, especialmente disolventes apróticos, tales como dialquilsulfóxidos, dialquilcarboxilamidas, tales como, en particular, dialquilsulfóxidos alquilo inferior, particularmente dimetilsulfóxido, polimetilén sulfóxidos, tales como tetrametilén sulfóxido, dialquilos o polimetilén sulfonas, tales como tetrametilén sulfona, sulfolano y alquil dialquiamidas inferiores o ácidos alifáticos inferiores, en los que los grupos alquilo tienen un máximo de 6 átomos de carbono, tales como dimetil o dietilformamida o dimetil o dietilacetamida. No obstante, también se pueden utilizar otros disolventes, y éstos no es necesario que sean siempre apróticos, tales como alcoholes, éteres, cetonas, ésteres, tales como dialquiloxihidrocarburos alifáticos de cadena corta, tales como dimetoxietano y, especialmente, alcoholes alifáticos o heterocíclicos y cetonas con punto de ebullición bajo, tal como N-alquil-pirrolidonas inferiores, tal como N-metilpirrolidona o N-etil-pirrolidona, hexafluorisopropanol y trifluoroetanol. Si se utilizan derivados halógenos como sustancias activadoras de carbóxilos, especialmente en forma de sales, tal como el anteriormente mencionado cloruro de 2-cloro-N-metilpiridinio, es mejor utilizar una sal metálica o una sal de la base orgánica del polisacárido inicial, especialmente una de las sales de monio cuaternario que se describe más adelante, tales como sal de tetrabutilamonio. Estas sales tienen la especial ventaja de ser muy solubles en los disolventes orgánicos antes mencionados, en los que se lleva a cabo mejor la reacción de reticulación, garantizando de esta manera un rendimiento excelente. Es aconsejable añadir a la mezcla una sustancia capaz de sustraer ácido, tal como sustancias orgánicas, carbonatos, bicarbonatos o acetatos alcalinos o alcalinotérreos, o bien bases orgánicas y, especialmente, bases terciarias, tales como piridina y sus homólogos, tal como colidina o bases de aminas alifáticas, tales como trietilamina o N-metil-piperacina.

La utilización de sales de amonio cuaternario representa un proceso especialmente ventajoso. Estas sales amónicas son bien conocidas, y se preparan de igual manera que otras sales conocidas. Se derivan de alquilos que tienen preferentemente entre 1 y 6 átomos de carbono. Es preferible utilizar sales de tetrabutilamonio. Una variación en el procedimiento en el que se utilizan las sales de amonio cuaternario consiste en hacer reaccionar una sal alcalina, por ejemplo, una sal sódica o potásica, en presencia de una cantidad catalizadora de una sal de amonio cuaternaria, tal como ioduro de tetrabutilamonio.

Las sustancias que catalizan la activación de los grupos carbóxilo a añadir a los agentes activantes se indican en la literatura específica, y éstas son también preferentemente bases, tales como las mencionadas anteriormente. Por lo tanto, por ejemplo, cuando se activan los grupos carboxi con sales de isotiazolina es preferible añadir una cierta cantidad de trietilamina a la mezcla de reacción.

La reacción de formación de intermediarios activados, tales como ésteres especialmente, se lleva a cabo a la temperatura recomendada en la literatura, y esta temperatura puede ser variada, no obstante, en caso de que lo requirieran las circunstancias, tal como se puede determinar fácilmente por un técnico en la materia. La formación de los enlaces de éster internos puede tener lugar dentro de una gama de temperatura bastante amplia, por ejemplo, entre 0º y 150º, preferentemente a temperatura ambiente o temperatura ligeramente superior, por ejemplo, entre 20º y 75º. La elevación de la temperatura favorece la formación de enlaces de éster internos, tal como lo hace la exposición a radiaciones de longitud de onda adecuada, tal como rayos ultravioleta.

El sustrato de ácido hialurónico puede ser de cualquier origen, y puede ser de los diferentes tipos que se han indicado anteriormente. Los materiales de HA preferentes son aquellos con un peso molecular promedio comprendido entre 150.000 y 730.000, especialmente entre 150.000 y 450.000 daltons.

Además, la cantidad de reticulación interna puede variar, pero los materiales preferentes de acuerdo con la invención utilizan HA reticulado a un grado de 4,5 a 5,0% de los grupos carbóxilo.

Los ejemplos siguientes describen la preparación de productos de HA reticulados utilizables para realizar los materiales de la invención.

Ejemplo 5

Preparación de ácido hialurónico reticulado a 1% (HA)

Descripción del producto:

1% de grupos carboxi utilizados en esterificación interna.

99% de grupos carboxi salificados con sodio.

6,21 g. de sal de tetrabutilamonio de HA con un peso molecular de 170.000, que corresponde a 10 mEq de una unidad monómera se solubilizan en 248 ml de DMSO a 25ºC, se añaden 0,01 g (0,1 mEq) de trietilamina.

Ejemplo 6

Preparación de ácido hialurónico reticulado al 5%

Descripción del producto:

5% de grupos carboxi utilizados en esterificación interna.

95% de grupos carboxi salificados con sodio.

6,21 g. de sal de tetrabutilamonio de HA con un peso molecular de 85.000, que corresponde a 10 mEq de una unidad monómera se solubilizan en 248 ml de DMSO a 25ºC, se añaden 0,051 g (0,5 mEq) de trietilamina y la solución resultante es sometida a agitación durante 30 minutos.

Una solución de 0,128 gr (0,5 mEq) de ioduro de 2-cloro-1-metil-piridinio en 60 ml de DMSO es añadido lentamente gota a gota durante un intervalo de tiempo de una hora, y la mezcla se mantiene durante 15 horas a
30ºC.

Una solución formada por 100 ml de agua y 2,5 gr de cloruro sódico se añade a continuación, y la mezcla resultante es vertida lentamente en 750 ml de acetona, manteniendo una agitación continuada. Se forma un precipitado que es filtrado a continuación y lavado tres veces en 100 ml de acetona con agua 5:1, y tres veces con 100 ml de acetona, y finalmente se seca en vacío durante 24 horas a 30º.

Se obtienen 3,95 gr del compuesto del título. La determinación cuantitativa de los grupos éster se lleva a cabo de acuerdo con el método de saponificación descrito en las páginas 169-172 de la obra "Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", Cuarta Edición, John Wiley and Sons Publication.

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Ejemplo 7

Preparación de ácido hialurónico reticulado al 10% (HA)

Descripción del producto:

10% de grupos carboxi utilizados en esterificación interna.

90% de grupos carboxi salificados con sodio.

6,21 g. de sal de tetrabutilamonio de HA con un peso molecular de 620.000, que corresponde a 10 mEq de una unidad monómera se solubilizan en 248 ml de DMSO a 25ºC, se añaden 0,101 g (1,0 mEq) de trietilamina y la solución resultante es agitada durante 30 minutos.

Una solución de 0,255 gr (1,0 mEq) de ioduro de 2-cloro-1-metil-piridinio en 60 ml de DMSO es añadida lentamente gota a gota durante un intervalo de tiempo de 1 hora y la mezcla es mantenida durante 15 horas a 30ºC.

A continuación se añade una solución formada por 100 ml de agua y 2,5 gr de cloruro sódico, y la mezcla resultante es vertida a continuación lentamente a 750 ml de acetona, manteniendo agitación continuada. Se forma un precipitado que, a continuación, es filtrado y lavado tres veces en 100 ml de acetona y agua 5:1, y tres veces con 100 ml de acetona y finalmente secado en vacío durante 24 horas a 30º.

Se obtienen 3,93 gr del compuesto del título. La determinación cuantitativa de los grupos éster se lleva a cabo de acuerdo con el método de saponificación descrito en las páginas 169-172 de la obra "Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", Cuarta Edición, John Wiley and Sons Publication.

Ejemplo 8

Preparación de ácido hialurónico reticulado a 10% (HA)

Descripción del producto:

10% de grupos carboxi utilizados en esterificación interna.

90% de grupos carboxi salificados con sodio.

6,21 g. de sal de tetrabutilamonio de HA con un peso molecular de 170.000, que corresponde a 10 mEq de una unidad monómera se solubilizan en 248 ml de DMSO a 25ºC, se añaden 0,118 g (1 mEq) de cloruro de piridina y la solución resultante es agitada durante 30 minutos.

Una solución de 0,16 g (mEq) de N-bencil-N-etilcarbodiimida en 20 ml de DMSO es añadida lentamente gota a gota durante un intervalo de tiempo de 1 hora, y la mezcla es mantenida a una temperatura de 30º durante 45
horas.

Una solución constituida por 100 ml de agua y 2,5 de cloruro sódico es añadida, y la mezcla resultante es vertida lentamente en 750 ml de acetona, manteniendo agitación continuada. Se forma un precipitado que es filtrado a continuación y lavado tres veces con 100 ml de acetona/H_{2}O 5:1 y tres veces con 100 ml de acetona, siendo secado finalmente en vacío durante 24 horas a temperatura de 30º.

Se obtienen 3,9 gr del compuesto del título. La determinación cuantitativa de los grupos éster totales se lleva a cabo de acuerdo con el método de saponificación descrito en las páginas 169-172 de la obra "Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups", Cuarta Edición, John Wiley and Sons Publication.

3. Preparación de los biomateriales

Los siguientes ejemplos describen la preparación de productos quirúrgicos/de cuidados de la salud según la invención, que comprenden el bencil éster total de HA o un derivado autorreticulado de HA, o una combinación de los mismos. Tal como se ha indicado anteriormente, se describen procesos para la preparación de las membranas, telas tejidas, rejillas tejidas y telas no tejidas en los documentos de patentes U.S.A. 4.851.521; U.S.A. 4.965.353, WO 93/11804; WO 93/11803; WO 94/17837 y EP 0 341 745.

Ejemplo 9

Preparación de un producto basado en HYAFF 11 + rejilla de polipropileno

Se prepara una solución de HYAFF 11 (100% benciléster de ácido hialurónico) en DMSO (110 mg/ml). Una vez terminada la solubilización, la solución es filtrada a través de una tela de filtro de 20 \mum y es desgasificada dejándola reposar en vacío durante 2 horas. Se vierten 5 ml de la solución y se extienden sobre una placa de cristal, después de lo cual se coloca la malla de polipropileno (6x11 cm) por encima, y se vierten otros 10 ml de la solución. Ésta es extendida de manera regular sobre la malla y se elimina cualquier exceso.

La placa de cristal es sumergida en un baño que contiene etanol/H_{2}O (90:10) durante 5 horas para permitir que el preparado coagule y que la placa se desprenda; el preparado es sumergido a continuación en un baño de etanol absoluto durante 16 horas. A continuación, es secado sobre una placa en vacío durante 30 minutos a 63ºC.

Ejemplo 10

Preparación de un producto basado en una tela tejida de HYAFF 11 cubierta con una lámina de HYAFF 11

Se prepara una solución de HYAFF 11 en DMSO (110 \mug/ml). Una vez completada la solubilización, la solución es filtrada a través de un filtro de tela de 20 \mum, y es desgasificada dejándola reposar en vacío durante 2 horas. Se vierten 5 ml de la solución y se extienden sobre una placa de cristal, después de lo cual la gasa de HYAFF 11 (10x20 cm) es colocada por encima, teniendo cuidado de que se adhiera sin arrugas o burbujas de aire, y se vierten sobre ella otros 10 ml de la solución. Ésta se extiende de manera regular sobre la gasa y se elimina cualquier exceso.

La placa de cristal es sumergida en un baño que contiene etanol durante 30 minutos para permitir que el preparado coagule y que la placa se desprenda. El preparado se deja a continuación en etanol durante 16 horas y se seca sobre una placa en vacío a 63ºC durante 30 minutos.

Ejemplo 11

Membrana de HYAFF 11 con refuerzo de HYAFF 7

Una membrana compuesta que comprende el bencil éster de ácido hialurónico HYAFF 11, es decir, ácido hialurónico esterificado al 100% con bencil alcohol, con un refuerzo de malla que comprende el etil éster de ácido hialurónico HYAFF 7, es decir, ácido hialurónico esterificado al 100% con etanol, con un peso base de 14 mg/cm^{2}, con un grosor de 0,25 mm, esfuerzo mínimo de tracción en la rotura y alargamiento en seco de 400 Kg/cm^{2} y 7%, respectivamente, mínimo esfuerzo a la tracción y alargamiento en húmedo 50 Kg/cm^{2} y 55%, respectivamente, resistencia a la rotura en seco 90 Kg/cm^{2}, resistencia a la rotura en húmedo 50 Kg/cm^{2}, fue producido de acuerdo con el procedimiento siguiente.

La malla de HYAFF 7 fue obtenida empezando con la solución de HYAFF 7 en dimetilsulfóxido a una concentración de 125 mg/ml. La solución es alimentada mediante una bomba de engranajes a un cabezal de toberas para extrusión en húmedo, compuesta por 100 orificios, cada uno de los cuales medía 65 micras de diámetro.

El hilo múltiple extrusionado es pasado a un baño de coagulación que contiene etanol absoluto, y a continuación es desplazado sobre los rodillos de transporte hacia 3 baños sucesivos de lavado, que contienen también etanol absoluto. La proporción entre la velocidad del tercer rodillo (III) y la velocidad del primer rodillo (I) se llama proporción de estirado, y tiene un valor de 1,05, mientras que las velocidades de los rodillos individuales son: 23 rpm (rodillo I), 24 rpm (rodillos II y III), 25 rpm (rodillo IV). Una vez que el hilo múltiple ha pasado por los baños de lavado, es secado mediante aire caliente a una temperatura de 45ºC y arrollado sobre un armazón de arrollado (8). El hilo tiene una galga de 237 denier. El hilo múltiple es sometido a continuación a torsión 135 veces por metro y es tejido en un telar formando una tela tricotada lisa con una galga 14. Desde el telar, la tela es alimentada a través de una calandrada, que la adelgaza. La figura 2 muestra la malla resultante de este proceso.

La matriz de material polímero es aplicada por dos dispositivos o pinceles neumáticos que efectúan la proyección de una solución de HYAFF 11 en dimetilsulfóxido a una concentración de 40 mg/ml. La malla sometida a pulverización se hace pasar por un baño de coagulación de contiene etanol absoluto, por una cámara de lavado que contiene agua pura destilada, y por una cámara especial de secado con una temperatura de 50ºC (17).

Ejemplo 12

Tela no tejida formada por HYAFF 11

Una tela no tejida comprendiendo bencil éster de ácido hialurónico HYAFF 11, con un peso de 40 g/m^{2} (gr/mq), y un grosor de 0,5 mm, fue producida por el procedimiento siguiente.

Se prepara en un depósito una solución de HYAFF 11 en dimetilsulfóxido a una concentración de 135 mg/ml y se alimenta mediante una bomba dosificadora de engranajes a un cabezal de toberas para su extrusión en húmedo, estando compuesta por 3.000 orificios, cada uno de los cuales tiene una medida de 65 micras.

La masa extrusionada de los hilos pasa a un baño de coagulación conteniendo etanol absoluto. Se desplaza a continuación sobre rodillos de transporte a dos baños de lavado sucesivos que contienen etanol absoluto. La relación de estirado del primer rodillo se ajusta a cero, mientras que la relación de estirado entre los otros rodillos se ajusta a 1,05. Una vez que ha pasado por los baños de lavado, el haz de hilos es secado por soplado con aire caliente a una temperatura de 45º-50ºC y se corta mediante un rodillo cortador en fibras de 40 mm.

La masa de fibras obtenida de este modo es arrojada a una rampa que conduce a una máquina de carda/promoción de capas transversales, de la que emerge en forma de elemento laminar con un grosor de 1 mm y un peso de 40 mg/m^{2} (mg/mq). Dicho elemento laminar es sometido a continuación a pulverización con una solución de HYAFF 11 en dimetilsulfóxido a 80 mg/ml, se coloca en un baño de coagulación de etanol, en una cámara de lavado, y finalmente en una cámara de secado.

El grosor final del material es de 0,5 mm.

Ejemplo 13

Tela no tejida formada por HYAFF 11 y HYAFF 7

Una tela no tejida con un peso de 200 g/m^{2} (gr/mq) y un grosor de 1,5 mm comprendiendo una mezcla del etil éster de ácido hialurónico, HYAFF 7, y de bencil éster de ácido hialurónico, HYAFF 11, en iguales cantidades, se obtuvo por el procedimiento siguiente.

Se mezclaron por completo en un mezclador espiral fibras de HYAFF 7 y HYAFF 11, con una longitud de 3 mm, obtenidas por el proceso de hilatura descrito en el Ejemplo 10. La mezcla de fibras fue alimentada a una máquina de carda, de la cual salió como elemento laminar con un grosor de 1,8 mm y un peso de 200 g/m^{2} (gr/mq).

El elemento laminar se hizo pasar por una máquina punzonadora de agujas, que lo transformó en una tela no tejida con un grosor de 1,5 mm y un peso de 200 g/m^{2} (gr/mq), con los dos materiales perfectamente mezclados entre sí.

Ejemplo 14

Tela no tejida de bencil éster parcial y total

Una tela no tejida con un peso de 40 g/m^{2} (gr/mq) y un grosor de 0,5 mm formada por una mezcla de bencil éster del ácido hialurónico, HYAFF 11, y un bencil éster parcial (75%) de ácido hialurónico, HYAFF 11p75, en iguales porcentajes, fue producida por el procedimiento siguiente.

Se preparó HYAFF 11p75 de la manera siguiente. 10 g de la sal de tetrabutilamonio del ácido hialurónico, peso molecular = 620,76, igual a 16,1 mmoles, se solubilizaron en una mezcla de N-metil pirrolidona/H_{2}O, 90/10, a 2,5% en peso, para obtener 400 ml de solución. La solución es enfriada a 10ºC y, a continuación, se hace burbujear N_{2} purificado por la misma durante 30 minutos. A continuación, se esterifica con 1,49 ml (equivalente a 12,54 mmoles) de bromuro de bencilo. La solución es agitada con suavidad durante 60 horas a una temperatura de 15-20ºC.

La purificación subsiguiente se consigue por precipitación en acetato de etilo seguido de la adición de una solución saturada de cloruro sódico, y lavados sucesivos con una mezcla de acetato de etilo/etanol absoluto, 80/20. La fase sólida es separada por filtrado, y tratado con acetona anhidra. De este modo, se obtienen 6,8 gr de producto, igual a un rendimiento aproximado de 95%.

Se mezclaron de manera completa en un mezclador espiral libras de HYAFF 11 y HYAFF 11p75, con una longitud de 40 mm, obtenidas por el proceso descrito en el Ejemplo 1.

Las fibras mezcladas fueron alimentadas a una máquina de carda de la que salieron en forma de elemento laminar de 1 mm de grosor con un peso de 40 mg/m^{2} (mg/mq). El elemento laminar fue rociado a continuación con una solución de HYAFF 11 en dimetilsulfóxido a 80 mg/ml, colocado en un baño de coagulación de etanol, y a continuación, en una cámara de lavado que contenía agua o una mezcla de agua y etanol con una proporción de 10 a 95% de etanol, y finalmente en una cámara de secado.

El material tiene un grosor final de 0,5 mm, y las fibras de HYAFF 11 y HYAFF 11p75 están perfectamente mezcladas y adheridas entre sí.

Ejemplo 15

Elemento laminar (Tissue) no tejido de capas múltiples basado en HYAFF 11

Un género laminar no tejido de capas múltiples compuesto por una capa de bencil éster de ácido hialurónico, HYAFF 11, y una capa de viscosa no tejida (Jettex 2005 de ORSA), peso base 80 g/m^{2} (g/mq), grosor 2 mm, y porcentaje de absorción de agua de 560% en peso, fue obtenido por el siguiente procedimiento.

La capa que establece contacto con la piel comprende fibras de HYAFF 11 producido por técnica de hilatura en húmedo en forma de una hoja de 30 g/m^{2} (g/mq). Las fibras se constituirán en forma de hojas.

Esta capa es unida por cosido a una segunda capa de una tela de viscosa no tejida con un peso base de 30 g/m^{2} (g/mq).

El producto no tejido final comprende, por lo tanto, dos capas perfectamente adheridas con un peso total base de 80 g/m^{2} (g/mq), un grosor de 2 mm, y un porcentaje de absorción de agua de 560% en peso.

Ejemplo 16

Tela no tejida de capas múltiples basada en HYAFF 11

Una tela de capas múltiples no tejida que comprendía una capa mixta de bencil éster del ácido hialurónico, HYAFF 11, y alginato cálcico en una proporción 1:1 y una tela no tejida de refuerzo de polipropileno (con base de género no tejido de fibras extrusionadas de 50 g/m^{2} (g/mq) de la firma NEUBERGER) con un peso base de 70 g/m^{2} (g/mq), un grosor de 1,5 mm, y un porcentaje de absorción de agua de 450% en peso, fue obtenida por el procedimiento siguiente.

Se mezclaron fibras de HYAFF 11 y alginato cálcico, de 40 mm de longitud, obtenidas por técnicas de hilatura en húmedo de tipo convencional, formando una hoja de 20 g/m^{2} (g/mq), y se unieron por cosido a una tela no tejida de fibras extrusionadas ("spunbonded") con un peso base de 50 g/m^{2} (g/mq).

El material resultante comprende dos capas de tela no tejida con un peso base total de 70 g/m^{2} (g/mq), un grosor de 1,5 mm, y un porcentaje de absorción de agua de 450% en peso.

Ejemplo 17

Tela no tejida de capas múltiples basada en HYAFF 11

Una tela no tejida de capas múltiples comprendiendo una capa de bencil éster del ácido hialurónico HYAFF 11 y una capa de espuma de poliuretano tal como LYOBEND (de DELCON) con un peso base de 100 g/m^{2} (g/mq), un grosor de 6 mm, y un porcentaje de absorción de agua de 860% en peso, se obtuvo por el procedimiento siguiente.

La capa que establece contacto con la piel comprende fibras de HYAFF 11 producidas por la técnica de hilatura en húmedo, y constituye a continuación una hoja de 45 g/m^{2} (g/mq), que está unida por cosido a una segunda capa de espuma de poliuretano.

El producto no tejido resultante comprende dos capas perfectamente adheridas con un peso total base de 100 g/m^{2} (g/mq), un grosor de 6 mm, y un porcentaje de absorción de agua de 860% en peso.

Ejemplo 18

Preparación de una membrana fabricada a partir de un derivado de ácido hialurónico con 80% de las funciones carboxi esterificadas con alcohol bencílico (C_{6}H_{5}-CH_{2}-OH), 10% de las funciones carboxi involucradas en la formación de los enlaces de éster interno y el 10% restante salificado con sodio

6,21 gr de la sal de tetrabutilamonio del ácido hialurónico con peso molecular de 180.000 Daltons (10 mEq) se solubilizan en 248 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) a temperatura ambiente. A esta solución se añaden 0,951 ml de bromuro de bencilo (8,0 mEq) y la solución se deja reposar durante 12 horas a 30ºC. Se añaden 0,101 gr de trietilamina (1,0 mEq) y la solución es agitada durante 30 minutos. Se añade una solución de 0,255 gr (1,0 mEq) de 2-cloro-1-metil-piridina ioduro en 60 ml de DMSO y la mezcla se deja reposar durante 15 horas a 30ºC.

Una solución al 2,5% (peso/volumen) de NaCl en agua se añade, y la mezcla resultante es vertida en 750 ml de acetona con agitación. Se forma un precipitado que es filtrado y lavado tres veces en 100 ml de acetona/agua 5:1, tres veces con 100 ml de acetona y finalmente se seca en vacío durante 24 horas a 30ºC. De este modo se obtienen 4,5 gr del producto deseado. La determinación cuantitativa del contenido de alcohol bencílico se lleva a cabo por cromatografía gaseosa después de hidrólisis alcalina. El contenido total de grupos éster se mide por el método de saponificación descrito en las páginas 169-172 de la obra "Quantitative analysis via functional groups", cuarta edición, John Wiley and Sons Publication.

El derivado éster preparado de esta manera es solubilizado a una concentración de 150 mg/ml en DMSO a una temperatura de 30ºC. El derivado solubilizado es filtrado a través de una malla de 20 micras y es situado en un reactor de extrusión conectado a un extrusionador de elemento laminar con un grosor de <1mm. El producto es extrusionado en un baño de coagulación que contiene un disolvente que posibilita la extracción del DMSO del producto (por ejemplo, etanol), y el material del extrusionador laminar es arrollado sobre una serie de rodillos equipados con ventiladores de aire para secar la membrana.

Estudios preclínicos

Los siguientes estudios dan a conocer resultados que muestran el carácter útil de los productos de la invención en la prevención de adherencias post-quirúrgicas y muestran los resultados mejorados de estos productos en comparación con productos anteriormente existentes.

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Estudio 1

Este estudio demuestra la elevada incidencia de la formación de adherencia quirúrgica observada en un modelo de lesión inducida en el hígado de una rata, establecido como control positivo para comparar la acción preventiva de artículos de cuidados sanitarios y artículos quirúrgicos derivados de HA, en la formación de adherencia.

Para estos experimentos, se utilizaron ratas Sprague Dawley con peso comprendido entre 275 y 300 gr. Se sometieron 21 animales a las lesiones.

Cada uno de los animales fue sometido a laparotomía por incisión abdominal después de anestesia con una dilución de Quetamina, 100 mg/Kg y Xilacina 11 mg/Kg, preparadas en condiciones estériles e inyectadas por la ruta intramuscular.

El hígado fue localizado y puesto a la vista y fue sometido a abrasión en el lóbulo inferior por aplicación de una presión de cera con un tampón estéril hasta extraer sangre. Después de hemostasis de la superficie herida, la laparotomía fue cerrada con una sutura de seda de tamaño 3,0. Los animales fueron sacrificados después de un tiempo de 7 a 21 días.

La adherencia fue evaluada de acuerdo con la facilidad con la que las superficies adyacentes (superior e inferior) del lóbulo podrían ser separadas mediante pinzas quirúrgicas, en base a la escala siguiente:

0

sin adherencia - las dos superficies pueden ser separadas;

1

adherencia ligera a moderada - las superficies pueden ser separadas tirando una con respecto a la otra mediante pinzas;

2

notable adherencia entre las dos superficies, cualquier intento de separarlas provoca su rotura.

En este modelo animal, las adherencias superiores a 2 se consideraron clínicamente significativas.

En este grupo de control positivo (formación de adherencia) 17 animales de 21 (80,9%) presentaron la formación de adherencia con una valoración de 2.

Estudio 2

Este estudio muestra la reducción significativa en la formación de adherencias cuando se utiliza un gel realizado en ácido hialurónico reticulado (ACP), o una gasa basada en HYAFF 11 (bencil éster de HA) se utiliza sola o en combinación con sustancias hemostáticas Surgicel^{TM} y ®Heparin 50 IU/ml. El gel ACP fue extendido sobre la superficie a tratar.

El protocolo quirúrgico descrito en el Ejemplo 1 fue utilizado como un modelo animal para inducir la formación de adherencia.

La reducción significativa en formación de adherencia entre las dos superficies adherentes del lóbulo izquierdo del hígado se muestra en la tabla 1.

TABLA 1

Material	Número de animales	% de adherencias significativas
		(evaluación 2)
tela tejida HYAFF 11	6	50%
tela tejida HYAFF 11 + Surgicel^{TM}	6	16%
tela tejida HYAFF 11 + Surgicel^{TM} + heparina	6	16%
tela tejida HYAFF 11 + heparina	6	33%
membrana HYAFF 11 (20 mm grosor)	11	36%
tela no tejida HYAFF 11 + Surgicel^{TM}	6	33%
ACP	24	20%

Es evidente que la utilización de estos biomateriales lentamente biodegradables como barrera impermeable contra células inflamatorias entre dos superficies adyacentes reduce la formación de adherencias, en comparación al 80,9% de adherencia observado en el grupo de control descrito en el Ejemplo 1.

Estudio 3

Este ejemplo muestra la elevada incidencia de la formación de adherencia quirúrgica que se observa en un modelo de lesión quirúrgica, inducida en la pared abdominal de una rata para establecer como control positivo, y comparar ello con la acción preventiva de los artículos de cuidados sanitarios formados por derivados de HA de la invención (HYAFF 11 + malla de polipropileno) en formación de adherencia.

Un total de 24 animales (12 de control, 12 de prueba) sufrieron la lesión.

Cada uno de los animales fue sometido a laparotomía por incisión abdominal después de anestesia con una dilución de Quetamina 100 mg/Kg y Xilacina 11 mg/Kg preparadas en condiciones estériles e inyectadas por la ruta intramuscular.

La aleta en la izquierda de la incisión fue levantada con dos pinzas quirúrgicas, a efectos de dejar visible la pared abdominal. Se retiró un área de 1,5 cm x 1,5 cm de la superficie peritoneal con tijeras quirúrgicas hasta que apareció exudado, sin retirar el haz muscular. En el grupo de control, fue necesario coser una malla de polipropileno (con medida del doble del área de la lesión) con una sutura de Vicil bioabsorbible de tamaño 6,0 sobre la superficie herida, a efectos de garantizar la resistencia a la tracción de la pared abdominal. Antes de aplicar el material, la superficie herida tuvo que ser sometida a hemostasis.

Después de sacrificio a los 14 días, el tiempo intermedio de la gama citada en el Ejemplo 1, se evaluó la adherencia de acuerdo con la escala siguiente:

0

ausencia de adherencia;

1

ligera adherencia sin vascularización, se puede separar fácilmente;

2

adherencia moderada sin vascularización, se puede separar fácilmente por tracción;

3

adherencia firme, opaca y vascularizada, difícil de separar, requiriendo la utilización de un escalpelo;

4

adherencia muy firme, gruesa, opaca y vascularizada, se puede separar por corte solamente con tijeras quirúrgicas, con la destrucción consiguiente de los tejidos.

Las adherencias con valoración >2 se consideraron significativas.

En el grupo de control positivo (formación de adherencia) 12 animales de un total de 12 (100%) presentaron formación de adherencia con una valoración >2; mientras que hubo una reducción significativa en la incidencia de formación de adherencia entre la pared abdominal y órganos internos cuando se utilizó el producto de la invención, tal como se muestra en la tabla 2.

TABLA 2

Material	Número de animales	% de adherencias significativas
		(evaluación 2)
HYAFF 11 + malla de polipropileno	12	25%
Control - malla de polipropileno	12	100%

Es evidente que la utilización de dicho material HYAFF 11 de la invención como barrera (impermeable a células inflamatorias) entre la superficie interna herida (pared abdominal) y órganos adyacentes reduce la formación de adherencias, en comparación con el 100% de adherencias en el grupo de control tratado solamente con una malla de polipropileno.

Estudio 4

Este estudio muestra la capacidad de ácido hialurónico (ACP) autorreticulado en forma de gel y utilizado como recubrimiento para reducir la formación de adherencia quirúrgica, en un modelo de lesión en el intestino ciego de ratas.

Este tipo de lesión induce la formación de adherencias cuando se trata con un lavado salino y hemostasis solamente después de cirugía, tal como se indica más adelante.

Igual que en el Ejemplo 1, se utilizaron ratas Sprague Dawley con un peso de 275-300 gr. Cada uno de los animales fue sometido a laparotomía por incisión abdominal después de anestesia con una dilución de Quetamina, 100 mg/Kg y Xilacina 11 mg/Kg, preparada en condiciones estériles e inyectada por ruta intramuscular. El intestino ciego fue localizado y dejado a la vista. Se indujo una lesión térmica sobre la superficie del intestino con un cuerpo sólido, utilizando un disco de cobre con un diámetro de 1 cm conectado a un dispositivo de soldadura electrónica, ajustado a una temperatura de 69,5ºC. Se dejó en contacto con la superficie del intestino durante 15 segundos. Se produjo una lesión bien definida con exudado. Después del lavado del área herida con solución salina y habiendo realizado hemostasis con Surgicel^{TM}, la laparotomía fue cerrada con una sutura de seda de dimensiones 3,0.

Después de sacrificio a los 14 días, el tiempo intermedio de la gama citada en el Ejemplo 1, la adherencia fue valorada de acuerdo con la escala siguiente:

0

ausencia de adherencia;

1

adherencia ligera sin vascularización, se puede separar fácilmente;

2

adherencia moderada sin vascularización, se puede separar por tracción manualmente;

3

adherencia firme, opaca y vascularizada, difícil de separar, requeriendo la utilización de un escalpelo;

4

adherencia muy firme, gruesa, opaca y vascularizada, solamente puede ser separada por corte con tijeras quirúrgicas, con destrucción consiguiente de tejidos.

En este modelo animal, las adherencias >2 fueron consideradas significativas.

Existe una reducción significativa en la formación de adherencias cuando se utiliza gel de ACP como barrera, en comparación con los controles tratados con un lavado salino y hemostasis solamente (tabla 3).

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TABLA 3

Material	Número de animales	% de adherencias significativas
		(evaluación 2)
Control (solución salina + hemostasis)	17	70%
ACP	11	40%

Es evidente que la utilización de dicho material como barrera reduce la formación de adherencias, en comparación con el tratamiento de control de lavado de solución salina y hemostasis solamente.

Estudio 5

Efecto de derivados de Ácido Hialurónico HYAFF-7 y HYAFF 11p75 en la prevención de adherencias postquirúrgicas en el modelo de lesión hepática en ratas Modelo de animal

Rata macho, Harlan SD con un peso de 250 gr.

Tipo de lesión

El área abdominal fue limpiada por completo con una solución de yodo y, a continuación, se llevó a cabo laparotomía de unos 3 cm para dejar a la vista el hígado. El lóbulo derecho inferior del hígado fue dañado por abrasión y se produjo una lesión con una espátula estéril de madera hasta extracción de sangre.

Materiales de pruebas

Experimento 1: HYAFF 11p75, bencil éster 75% parcial de ácido hialurónico en forma de gasa y tela no tejida.

Experimento 2: HYAFF 7, etil éster total de ácido hialurónico en forma de una gasa y tela no tejida.

Aplicación del material: después de hemostasis cuidadosa con un hemostático convencional, los materiales de prueba y de control fueron colocados entre el lóbulo inferior (zona de la lesión) y el lóbulo hepático superior (superficies adyacentes) sin utilización de sutura a efectos de formar un efecto barrera e impedir la formación de adherencias.

Valoración y observaciones

Se hicieron observaciones entre los siete y veintiún días después de la cirugía. Las adherencias que se habían formado fueron evaluadas en base a la valoración visual siguiente:

0

- ausencia de adherencias

1

- adherencias ligeras

3

- notable presencia de adherencias.

Además de la valoración por la evaluación de la adherencia, se valoró el grado de inflamación por observación microscópica (reacción del tejido a la aplicación del material), manchando las muestras histológicas con hematoxilina/eosina y triple manchado de Mallory.

Resultados

Experimento 1

En el experimento 1, los materiales basados en HYAFF 11p75, bencil éster parcial y ácido hialurónico fueron probados solos, en combinación con Surgicel^{TM} hemostático y en combinación con la saturación hemostática más heparina (1.000 Uml). Estos procedimientos son comunes en la práctica de la cirugía.

La figura 1 es un gráfico que muestra el comportamiento de los biomateriales cuando se utilizan solos. No se observó efecto en la prevención de la adherencia en el caso de los biomateriales basados en HYAFF 11p75 e Interceed®, y aunque la tendencia pareció mejor, si bien no significativamente distinta, en el último caso, los lóbulos hepáticos fueron adheridos por completo y se pudo apreciar una reacción inflamatoria significativa. Lo mismo se observó en la observación histológica de las biopsias, en las que se puede ver una presencia notable de células inflamatorias, neutrófilos y macrófagos, así como fibras de colágeno maduro.

En las figuras 2 y 3 los materiales fueron utilizados en combinación con Surgicel^{TM} y Surgicel^{TM} + heparina. La tendencia observada en la figura 1 fue confirmada por los materiales basados en HYAFF 11p75, mientras que Interceed® saturado con heparina pareció dar mejores resultados. Esta situación fue confirmada por las observaciones histológicas.

En conclusión, los materiales basados en HYAFF 11p75 no pueden ser utilizados en la prevención de adherencias postquirúrgicas, dado que el efecto inflamatorio es probablemente debido a la liberación de oligómeros de ácido hialurónico de bajo peso molecular, en vista de los tiempos de degradación extremadamente reducidos de los productos.

Experimento 2

En el experimento 2, los biomateriales basados en HYAFF 7, etil éster de ácido hialurónico, fueron comprobados en combinación con Surgicel^{TM} y Surgicel^{TM} + heparina. En ningún caso se observó efecto de prevención de adherencias postquirúrgicas. Pareció que el Interceed® utilizado con Surgicel^{TM} + heparina tenía el efecto más positivo (figura 4).

La observación microscópica confirmó estos datos y reveló una notable cantidad de células inflamatorias y de fibras de colágeno en el caso de tratamiento con HYAFF 7. En este caso, tal como en el último, los biomateriales basados en HYAFF 7 no pueden ser utilizados en la prevención de adherencias postquirúrgicas, puesto que es probable que exista una liberación progresiva de etanol en el organismo.

Estudio 6

Eficacia de biomateriales basados en HYAFF 11 en la prevención de adherencias postquirúrgicas en dos modelos distintos de lesión inducida en animales: 1) Abrasión intrahepática en ratas; 2) Lesión de la pared abdominal en ratas Modelo animal 1

Una vez que el área abdominal fue desinfectada con yodo y etanol, se hizo una incisión media para poner a la vista el hígado.

En este modelo animal, la superficie interna del lóbulo hepático inferior fue rascada hasta que empezó a emerger exudado. La abrasión recibió hemostasis cuidadosa con Tabotamp® (Ethicon) y el material se dejó sobre la superficie dañada sin ayuda de sutura, a causa de las características altamente mucoadhesivas del producto.

Se comprobaron dos productos basados en HYAFF 11, ambos versiones comerciales de una membrana continua con un grosor de 20 \mum, llamada Transprocess® y Hyalobarrier 20. La valoración macroscópica fue realizada 14 días después de la cirugía, utilizando un sistema de evaluación descrito anteriormente para definir las adherencias. Se realizó otra valoración del porcentaje de animales con calificación de adherencia=2 (adherencia significativa).

Resultados

La figura 5 es un gráfico representativo de las valoraciones de la adherencia obtenidas en el experimento. La hyalobarrera reduce las incidencias de formación de adherencia en comparación con los controles sin tratamiento y con los tratamientos con ácido hialurónico de alto y bajo peso molecular. Se registró una tendencia similar, aunque sin ninguna diferencia estadísticamente significativa, en el caso de otro material basado en HYAFF ll, Transprocess®. La figura 6 muestra los porcentajes de casos de grado de adherencia=2 en cada grupo de tratamiento (adherencia significativa quirúrgicamente). La tendencia revelada por el gráfico anterior (figura 1) se confirmó también en este caso, con una reducción en las valoraciones de adherencia=2 (porcentajes de menos de 50% para los tratamientos de Hyalobarrier 20 y Transprocess®.

Modelo animal 2

Una vez se desinfectó el área abdominal con yodo y etanol, se realizó una laparotomía media de unos 5 cm de longitud para dejar a la vista la pared abdominal y el peritoneo.

Se realizó una incisión de 2 cm x 2 cm con un escalpelo, y a continuación se quitaron el peritoneo y la capa muscular. En este tipo de operación, es necesario suturar el área dañada con un material que favorece el crecimiento tisular, garantizando simultáneamente la resistencia a la tracción adecuada, a efectos de evitar el colapso de la pared peritoneal. En general, se utilizan materiales no degradables con una matriz de polímero, tal como mallas de polipropileno, poliéster o politetrafluoretileno expandido. La utilización de estos materiales solos, no obstante, no es suficiente para evitar la formación de adherencias en los bucles intestinales, con la consiguiente obstrucción intestinal y dolores crónicos.

Se realizaron evaluaciones macroscópicas 14 días después de la cirugía aplicando valoraciones de la adherencia comprendida entre 0 y 4. Otra valoración fue realizada del porcentaje de animales con una evaluación de la adherencia > 2 (adherencia significativas).

Resultados

Este experimento demuestra que un recubrimiento de HYAFF 11 sobre una malla sintética de Prolene (malla de polipropileno, ampliamente utilizada en cirugía abdominal) y una hoja de HYAFF 11 sobre una malla de Prolene fijada por sutura puede reducir la formación de adherencias postquirúrgicas. La figura 7 muestra que un producto combinado llamado Hyalobarrier Plus (HYAFF 11 extendido y coagulado sobre prolene) y la sutura con una película de Hyalobarrier sobre prolene reduce significativamente las adherencias en comparación con la malla de prolene sola. La figura 8 confirma esta tendencia, con un porcentaje menor de adherencias > 4 (adherencias significativas) después del tratamiento con HYAFF 11 que el observado después del tratamiento con malla de prolene sola.

Estudio 7

Efectos de biomateriales de Gel ACP en la prevención de formación de adherencias postquirúrgicas a los 14 días en un modelo de herida de hígado de rata y en un modelo de herida de intestino de rata

El propósito de este estudio consistía en evaluar la eficacia de biomateriales basados en un gel de ACP, para reducir o prevenir la formación de adherencias postoperatorias. Los comportamientos de los materiales de prueba se evaluaron en comparación con el ácido hialurónico de alto peso molecular y los biomateriales disponibles comercialmente, celulosa regenerada oxidada (TC 7 Interceed*^{TM}) utilizada en cirugía abdominopélvica y ginecológica para prevenir la formación de adherencias.

Se utilizaron un modelo de lesión de hígado de rata y un modelo de quemadura de intestino de rata, dado que son modelos caracterizados de inducción experimental de adherencia. Los efectos de la prueba y los materiales de control en la prevención de adherencia postquirúrgica se evaluaron por observación grosera del lugar de la lesión aplicando una calificación de adherencia.

Se utilizaron un modelo de herida de hígado de rata (experimento l) y un modelo de herida de intestino de rata (experimento 2), dado que son modelos estandarizados y reproducibles de inducción de adherencias experimental. Se utilizaron biomateriales basados en ACP después de la herida como barrera entre superficies adyacentes del lóbulo hepático y de los órganos internos.

En ambos experimentos la eficacia de los geles ACP se evaluó en cuanto a su capacidad de prevenir o reducir formación de adherencias en comparación con TC7 Interceed®, un material barrera contra la adherencia de Celulosa oxidada absorbible ampliamente utilizado en la práctica clínica, una solución de copolímero "Termogel®", una solución de ácido hialurónico de alto peso molecular y un grupo de animales sin tratar (operación convencional).

Fecha de inicialización:

Experimento 1

Abrasión de hígado de rata

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Materiales comprobados

Código del producto	SMK 0002	SMK 0002
Nombre común	ACP Gel	ACP Gel
Nombre comercial	Barrera hialogel	Barrera hialogel
Suministrador	FAB	FAB
Número de lote	101/96	104/96
Fecha de expiración	20-02-96	20-02-96
Almacenamiento	inferior a 30ºC	inferior a 30ºC
Precauciones	ninguna	ninguna

Los geles de ACP fueron suspendidos en agua con una concentración de 60 mg/ml. Los materiales de prueba fueron suministrados en condiciones estériles por acción de autoclave y con una jeringa de 5 ml, y manipulados en condiciones estériles. Los geles de ACP fueron suministrados para recubrir las superficies del glóbulo del hígado sometido a abrasión después de hemostasis con Tabotamp®. Cada uno de los animales recibió una cantidad suficiente para recubrir por completo el área herida (unos 2 ml) por administración única en el momento de la cirugía.

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Material de control

Nombre comercial	TC7 Interceed*®	HYAL	Thermogel®
Fabricante/	johnson \textamp johnson	FAB	BASF Pharma
suministrador	Patient Care, New
	Brunswick, NJ
Descripción	Barrera celulosa	Ácido hialurónico	Ácido plurónico
	regenerada oxidada	(Peso molecular 800.000)
Número de lote	2710TCM	0108 st	1/95
Fecha de caducidad	11-97	05-97	--
Almacenamiento	inferior a 30º	inferior a 30	inferior a 8ºC
Precauciones	ninguna	ninguna

Se cortó Interceed® en condiciones de manipulación estériles, se utilizó sólo y saturado en heparina (500 U/ml), a continuación se aplicó a efectos de mantener separadas las dos superficies adyacentes de los lóbulos hepáticos en unas dimensiones que superaban los bordes del área herida en varios mm. Se adquirieron en jeringa estéril HYAL, ácido hialurónico con elevado peso molecular (solubilizado en agua con una concentración de 10 mg/ml) y Thermogel®.

Se aplicó Interceed® por aplicación directa sin sutura quirúrgica. Se aplicaron a la superficie herida (recubrimiento) HYAL®, ácido hialurónico y Thermogel® con una jeringa después hemostasis. Cada uno de los animales recibió una cantidad suficiente para recubrir de manera completa el área herida por administración única en el momento de la cirugía.

Diseño experimental

Se utilizaron ratas Sprague Dawley (275-300 g) para este experimento. Por la experiencia adquirida de experimentos anteriores, se consideró un período de 14 días un tiempo adecuado para evaluar la formación de adherencia en estos modelos de animales. Dado el número de animales requeridos para este estudio, los animales fueron preparados en días sucesivos.

Se utilizó un número total de 78 animales de acuerdo con el esquema siguiente:

Grupo	Tratamiento	Número de animales
Operación convencional	Sin tratamiento	12
Controles	TC7 Interceed® sólo	12
Controles	TC7 Interceed® + heparina	6
Controles	HYAL®	12
Controles	Thermogel®	12
Tratado	ACP 5% (lote 101/96)	12
Tratado	ACP 5% (lote 104/96)	12

Preparación de los animales

Los animales fueron anestesiados mediante inyección de Ketamine (Gellini Pharmaceutical)/Xylazine (Bayer), se afeitaron y luego se desinfectaron con solución de yodo y etanol. Después de laparotomía en el lado izquierdo, el lóbulo izquierdo del hígado fue reflejado hacia arriba y las superficies internas de los lóbulos izquierdo y medio del hígado fueron sometidas a abrasión por rozamiento suave con un aplicador de madera hasta obtener muestras de sangrado o exudado de suero.

Administración de materiales

Después de hemostasis obtenida con Surgicel® o Tabotamp®, los materiales de prueba y de control fueron colocados entre las superficies de los dos lóbulos a efectos de cubrir toda la zona sometida a abrasión y crear una barrera entre los lóbulos.

El lugar de la cirugía fue cerrado por dos capas con suturas de 3,0 de seda.

Al final de la cirugía se administró durante 4 días un antibiótico (Procacilina sub-cutánea 30.000 I.U./rata) y un analgésico (Temgesic I.M. 0,05 mg/Kg).

Grado de adherencia

14 días después de la cirugía, los animales fueron eutanizados por CO_{2}.

El grado de adherencia fue evaluado por observación grosera. Se aplicó la siguiente calificación de las adherencias:

0 = Sin adherencia

1 = Adherencia de baja a moderada. Los dos lóbulos hepáticos fueron separados quirúrgicamente por tracción mecánica mediante fórceps.

2 = Adherencia notable, los dos lóbulos hepáticos se encontraban completamente pegados, cualquier intento de separación provocaba la rotura de los tejidos.

La capacidad de reabsorción de los materiales se evaluó por valoración visual de la presencia de los materiales. Además se fotografió el lugar de tratamiento.

Después de la realización de observaciones groseras, la totalidad del hígado fue eliminado quirúrgicamente y colocado en formalina tamponada al 10% durante 48 horas. Después de fijación, una sección de 2,0 mm de grosor incluyendo la zona sometida a abrasión fue retirada del hígado utilizando una cuchilla de disección. Las muestras obtenidas de este modo fueron sometidas a análisis histológico.

Análisis de los tejidos Análisis histológico

Se fijaron muestras en formalina tamponada neutra al 10% y posteriormente fueron deshidratadas y embebidas en parafina por técnicas estándar; una sección de 8 \mum fue manchada con Masson's Trichnome (para reacción inflamatoria de tejidos) y en caso necesario con azul de toluidina (para el resto de materiales).

Experimento 2

Quemadura en intestino de rata

Materiales comprobados

Código del producto	SMK 0002	SMK 0002
Nombre común	ACP 5% Alto peso molecular	ACP 5%
Nombre comercial	Hyalogel Barrera	Hyalogel Barrera
Suministrador	FAB	FAB
Número de lote	3/94	ACP 5% (lote 101/94)
Fecha de caducidad	07/95	07/95
Almacenamiento	inferior a 30ºC	inferior a 30ºC
Precauciones	ninguna	ninguna

El lote 3/94 de geles de alto peso molecular de ACP 5% fue suspendido en agua con una concentración de 20 mg/ml, el lote 101/94 de ACP 5% fue suspendido con una concentración de 50 mg/ml. Todos los materiales de pruebas fueron suministrados estériles por autoclave y en jeringa de 5 ml y manipuladas en condiciones estériles. Los geles de ACP fueron aplicados a efectos de recubrir las superficies del intestino con quemaduras después de hemostasis con Tabotamp®. Cada uno de los animales recibió una cantidad suficiente para recubrir por completo el área herida (aproximadamente 2 ml) en una dosis de administración única en el momento de la cirugía.

Materiales de control

	1	2	3
Nombre comercial	TC7 Interceed*^{TM}	HYAL	Thermogel
Fabricante/	Johnson \textamp Johnson	FAB	BASF Pharma
suministrador	Patient Care, New
	Brunswick, NJ
Descripción	Material barrera de	Ácido Hialurónico	Ácido plurónico
	celulosa oxidada	(peso molecular 1.200.000)
Número de lote	2710TCM	0108 st	1/94
Fecha de caducidad	11-97	05-97	- -
Almacenamiento	inferior a 30º	inferior a 30	inferior a 8ºC
Precauciones	ninguna	ninguna

Se cortó Interceed^{TM} en condiciones de manipulación estériles, se utilizó solo y saturado en Heparina (500 U/ml), y a continuación se aplicó a efectos de mantener separadas las dos superficies adyacentes de los glóbulos hepáticos a una dimensión que superaba los bordes del área herida en varios mm. Se adquirieron en jeringas estériles HYAL®, Ácido hialurónico de alto peso molecular (solubilizado en agua a una concentración de 10mg/ml) y Thermogel®.

El Interceed^{TM} fue aplicado por aplicación directa sin sutura quirúrgica. Se aplicaron ácido hialurónico y
Thermogel^{TM} a la superficie herida (recubrimiento) con una jeringa después de hemostasis. Cada uno de los animales recibió una cantidad suficiente para el recubrimiento completo o para cubrir el área herida por administración de dosis única en el momento de la cirugía.

Diseño experimental

Se utilizaron ratas Sprague Dawley (275-300 g) para este experimento. Por la experiencia adquirida de experimentos anteriores, se consideró un período de 14 días, un período de tiempo adecuado para evaluar la formación de adherencia en este modelo de animal.

Dado el número de animales requeridos para este estudio, los animales fueron preparados en días sucesivos.

Se utilizó un número total de 59 animales, de acuerdo con el esquema siguiente:

Experimento 2

Grupo	Tratamiento	Número de animales
Operación convencional	Sin tratamiento	10
Control	TC7 Interceed^{TM}	6
Control	Ácido Hialurónico (peso molecular	12
	1.200.000)
Control	Thermogel	13
Tratado	ACP 5% (lote 101/94)	12
Tratado	ACP 5% alto peso molecular (lote 3/94)	6

Preparación de los animales

Los animales se anestesiaron mediante inyección de Ketamina (Gellini Pharmaceutical)/Xilacina (Bayer) intramuscular, se afeitaron y luego se desinfectaron con solución de yodo y etanol. Se realizó una incisión abdominal por el eje medio a través de la piel y tejidos musculares, a efectos de dejar a la vista el intestino. Se produjeron heridas por aplicación a la superficie del ciego de un disco de cobre calentado y controlado electrónicamente (1 cm de diámetro), utilizando una presión estándar durante 15 segundos a 158ºF. (69,3ºC).

Administración de materiales

Después de hemostasis obtenida con Surgicel® o Tabotamp^{TM}, los materiales de prueba y de control fueron colocados sobre la superficie del intestino sin sutura, a efectos de cubrir toda el área sometida a quemadura y crear una barrera entre el peritoneo y los órganos internos.

La capa de músculo peritoneal fue cerrada con suturas continuas de seda 3-0, la capa cutánea con grapas para la piel y sutura de interrupción de seda 3-0.

Al final de la cirugía se aplicó durante 4 días un antibiótico (Procacillina por vía subcutánea 30.000 I.U./rata) y un analgésico (Temgesic I.M. 0,05 mg/Kg).

Observaciones y Determinaciones Grado de adherencia

14 días después de cirugía, los animales fueron eutanizados por CO_{2}.

El grado de adherencia fue evaluado por observación grosera. Se aplicó la siguiente valoración de adherencia:

0

= sin adherencia

1

= baja, avascular, fácilmente diseccionada

2

= moderada, avascular, continua, diseccionada manualmente

3

= opaca, vascular, difícil de seccionar requiriendo separación por escalpelo

4

= densa, opaca, vascular, diseccionada solamente con tijeras quirúrgicas y con daños en los tejidos.

La capacidad de reabsorción de los materiales fue evaluada por evaluación visual de la presencia de los materiales; además, se fotografió el lugar de tratamiento.

Resultados

Experimento 1

Un animal murió durante la administración de la anestesia, la colocación de los biomateriales fue conseguida fácilmente. Se observó que los materiales se adherían a los tejidos del lóbulo hepático inferior. No se observaron signos clínicos de enfermedad o de dolores después de cirugía en los animales tratados con ACP.

Dos animales tratados con ácido hialurónico murieron dos días después de la cirugía. El examen necroscópico mostró hemorragia interna.

Evaluación de la formación de adherencia: las adherencias formadas entre las dos superficies adyacentes del lóbulo hepático después de daños en los tejidos fueron evaluadas a los 14 días. Todos los tratamientos fueron degradados en el momento de la observación; la valoración de la adherencia (figura 9) en los animales tratados con biomaterial ACP 5% (lote 104/96) fue significativamente inferior a todos los materiales de control y control sin tratamiento. En el tratamiento ACP 5% (lote 101/96), la reducción de la adherencia fue superior a la de TC 7 Interceed^{TM} saturado con heparina, pero no se observaron diferencias estadísticas; no obstante, ambos tratamientos mostraron diferencias significativas (p<0,05) en comparación con los controles y sin tratamiento.

Observación histomorfológica: A examen microscópico, 14 días después de cirugía, los tratamientos ACP se observó que eran altamente biocompatibles y se observó una reacción inflamatoria muy reducida, en particular pocas células inflamatorias, tales como neutrófilos y células gigantes se encontraban presentes, no se observó emigración o incrementos de estas células dentro del intersticio entre los dos lóbulos, el TC 7 Interceed*^{TM} demostró reacción de tejidos, como consecuencia en muchos casos las superficies hepáticas se pegaron parcialmente; la observación mostró la presencia de fibrilas de colágeno organizadas, la reacción inflamatoria parece disminuir si este tratamiento es saturado con solución de hepanina. En la mayor parte de las diapositivas, los materiales se mostraron completamente biodegradados. El control sin tratamiento mostró una reacción inflamatoria moderada-elevada.

Experimento 2

Un número total de dos animales murió durante la administración de anestesia, la colocación de los biomateriales se logró fácilmente y no se movieron después de la colocación. No se observó señal clínica de enfermedad o sufrimiento después de la cirugía en el grupo de animales con tratamiento de ACP.

Cuatro animales tratados con ácido hialurónico, con un peso molecular 1,2 \cdot 10^{6} y tres animales con Termogel^{TM} murieron en un período comprendido entre 2 y 5 días después de la cirugía. El examen necroscópico mostró hemorragia interna en todos los animales.

Evaluación de la formación de adherencia: en este experimento, 14 días después de la cirugía (figura 10), los geles ACP 5% 101/94 y 3/94, mostraron una reducción de formaciones de adherencia postquirúrgica en comparación con ácido hialurónico, con un peso molecular 1,2 \cdot 10^{6} y controles sin tratamiento, siendo el comportamiento de los geles ACP comparable al de una barrera de Interceed, saturada de heparina, encontrándose diferencia de estadísticas entre estos tratamientos y grupos de control sin tratamiento (p<0,05); todos los tratamientos y controles fueron completamente absorbidos.

Observación histomorfológica: después de observación a los 14 días, los tratamientos con ACP mostraron menor reacción inflamatoria de los tejidos, el grosor de los tejidos con granulación era muy baja, y no se observó reacción desfavorable del intestino, tales como adherencia a la superficie peritoneal adyacente. Los colágenos de las fibrilas empiezan a organizarse y se completó el proceso de curación. Se observó una reacción inflamatoria en tratamientos con ácido hialurónico, con presencia considerable de fibras de colágeno que inducen adherencia; se apreció un tejido con granulación gruesa. Se observó el mismo aspecto histomorfológico en el control sin tratamien-
to.

Explicación

La formación de adherencias se encuentra entre las causas principales de morbilidad postoperatoria después de cirugía abdominopélvica, lo que conduce frecuentemente a pequeñas obstrucciones del intestino y otras importantes patologías. Cuando están involucradas las vísceras de la pelvis, estas adherencias tienen potencial para dificultar la función fisiológica y tienen como resultado la infertilidad. El mecanismo de formación de adherencia postquirúrgica y reformación siguen siendo poco comprendidos. Las pruebas experimentales sugieren que las adherencias se forman entre dos superficies traumatizadas quirúrgicamente en disposición natural durante el proceso de curación, porque es más eficaz combinar dos lugares de reparación de tejidos en un solo lugar de curación, con el resultado de adherencias por coalescencia entre dos superficies adyacentes.

En esta exploración se descubrió que la utilización de un agente hemostático quirúrgico convencional (Surgicel®) después de cirugía y la colocación sucesiva de una barrera de un derivado de ácido hialurónico biodegradable previene la formación de adherencias. Además, los materiales pueden ser utilizados conjuntamente con agentes fibrinolíticos. La reducción de la adherencia se compara favorablemente con una celulosa regenerada oxidada TC 7 Interceed*^{TM}.

Los biomateriales HYAFF® 11 mostraron buena biocompatibilidad y muy baja inflamación. La tasa de degradación de los biomateriales de FAB sometidos a prueba era distinta y depende de la diferente forma física del tratamiento; los biomateriales HYAFF 11® persistieron varias semanas. La gama de tasas de degradación controlada que se puede conseguir con estos derivados de ácido hialurónico se puede explotar de manera muy útil para la prevención de adherencias postquirúrgicas en diferentes lugares anatómicos y aplicaciones, por ejemplo, áreas ginecológicas o áreas abdominopélvicas.

Los resultados sugieren que los derivados de ácido hialurónico (HYAFF® 11 gasa y membranas) tienen un determinado papel en la prevención de la formación de adherencias después de la cirugía.

Una vez descrita la presente invención, será evidente que la misma se puede variar de muchas maneras. Estas variaciones no se tienen que considerar que se apartan del ámbito de la invención, y todas las modificaciones, que serán evidentes por los técnicos en la materia, se considerarán incluidas dentro del ámbito de las siguientes reivindicaciones.

Claims (8)

1. Biomaterial compuesto para impedir adherencias postquirúrgicas de tejidos, formado por un bencil éster de ácido hialurónico, en el que de 75 a 99% de los grupos carbóxilo de ácido hialurónico están esterificados con el radical bencilo y hasta 25% de los grupos carbóxilo están esterificados con el radical alquilo de un alcohol C_{10} a C_{20} alifático, a condición de que un mínimo de 80% de grupos carbóxilo están esterificados, de manera que dicho biomaterial adopta forma de un gel, una membrana, una malla o una tela tejida o no tejida, o combinaciones de los mismos.

2. Biomaterial compuesto, según la reivindicación 1, en el que dicho derivado es un bencil éster, en el que 80% de los grupos carbóxilo están esterificados con un grupo bencilo.

3. Material compuesto, según la reivindicación 1, en el que dicho derivado es un bencil éster, en el que 75% de los grupos carbóxilo están esterificados con un grupo bencilo y el 25% restante de grupos carbóxilo están esterificados con el residuo alifático de un alcohol C_{10-20} alifático.

4. Material compuesto, según la reivindicación 3, en el que dicho alcohol es esteárico o palmítico.

5. Utilización del biomaterial compuesto, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o de un biomaterial compuesto que comprende un derivado autorreticulado de ácido hialurónico, en el que 0,5 a 20% de los grupos carbóxilos de ácido hialurónico están reticulados al grupo hidróxilo de la misma molécula de ácido hialurónico o en una molécula distinta, de manera que dicho biomaterial adopta la forma de un gel, una membrana, una malla o una tela tejida o no tejida, o combinaciones de los mismos, para la preparación de un compuesto para impedir adherencias postquirúrgicas de tejidos.

6. Utilización, según la reivindicación 5, en la que dicho derivado autorreticulado tiene 4,5 a 5,0% de los grupos carbóxilo de la molécula de ácido hialurónico reticulados.

7. Material compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o utilización, según la reivindicación 5 ó 6, en los que el material compuesto comprende, además, un polímero sintético no biodegradable.

8. Material compuesto o utilización, según la reivindicación 7, en los que dicho polímero sintético es un elemento seleccionado del grupo que consiste en polipropileno, polietileno, poliéster y politetrafluoroetileno.