ES2245039T3 - Un supresor de tumor designado ts10qs3.3. - Google Patents

Abstract

Un método para diagnosticar el síndrome de Cowden que comprende la determinación en las células de una muestra de un sujeto de la presencia de una mutación en la secuencia codificante para el supresor de tumores designado TS10q23.3, donde dicha mutación se elige de: (a) una mutación del marco de lectura resultante de la inserción de AT en la posición 791 del exón 7; (b) una mutación del marco de lectura resultante de la deleción de 13 nucleótidos en la posición 915-927 de exón 8; y

Description

Un supresor de tumor designado TS10q23.3.

Antecedentes de la invención I. Campo de la invención

Esta invención se relaciona con los campos de la oncología, la genética y la biología molecular. En particular, la invención se relaciona con la identificación, en el cromosoma 10 humano, de un gene supresor de tumores. Los defectos de este gene están asociados con el desarrollo de cánceres, como por ejemplo gliomas.

II. Arte relacionado

La oncogénesis fue descrita por Foulds (1958) como un proceso biológico de etapas múltiples, cuya presencia se conoce en la actualidad por la acumulación de daño genético. A un nivel molecular, el proceso de múltiple etapas de la tumorigénesis involucra la disrupción de los efectores reguladores tanto positivos [activadores] como negativos [supresores] (Weinberg, 1989). La base molecular de los carcinomas de colon humanos se ha postulado, por Vogelstein y colaboradores (1990), que involucra un número de oncogenes, genes supresores de tumores y genes reparadores. De la misma manera, los defectos que conducen al desarrollo de retinoblastoma han sido conectados a otro gene supresor de tumores (Lee et al., 1987). Todavía más, se han identificado otros oncogenes y supresores de tumores en una diversidad de otros tumores malignos. Desafortunadamente, queda un número inadecuado de cánceres tratables, y los efectos del cáncer son catastróficos -más de medio millón de muertes por año sólo en los Estados Unidos.

Un ejemplo de la naturaleza devastadora del cáncer involucra los tumores que surgen de las células de linaje astrocítico que son los tumores primarios más comunes del sistema nervioso central (Russell & Rubinstein, 1989). La mayoría de estos tumores ocurre en la población adulta. Los tumores cerebrales primarios también son el origen más común de cáncer en la población de pacientes pediátricos y la segunda causa principal de las muertes por cáncer en los niños de menos de 15 años de edad. Se estima que en 1994 se diagnosticaron unos 18.500 nuevos casos de tumores cerebrales primarios (Boring et al., 1994). Los estudios epidemiológicos muestran que la incidencia de los tumores cerebrales está en aumento y representa la tercera causa más común de muertes por cáncer de los pacientes entre 18 y 35 años de edad. Debido a su ubicación dentro del cerebro y a la infiltración típica de las células tumorales en el tejido circundante, el éxito de las intervenciones terapéuticas es a menudo limitado. Desafortunadamente, cerca de las dos terceras partes de los individuos que sufren esta enfermedad sucumben a la misma dentro de los dos años. Los más comunes tumores intracraneales surgen de las células de linaje glial y ocurren a una frecuencia aproximada de 48% glioblastomas multiformes (GBM), 21% astrocitomas (A) (anaplásicos (AA) y de bajo grado) y 9% ependimomas y oligodendrogliomas (Levin et al., 1993).

Los estudios genéticos han implicado diversos genes y sus correspondientes productos de proteína en la oncogénesis de los tumores cerebrales primarios. Entre las diversas alteraciones que se han reportado se encuentran: amplificación del receptor del factor de crecimiento epidérmico y uno de sus ligandos, transformación del factor de crecimiento alfa, N-myc; gli, alteración de empalme y expresión de los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos y la pérdida de función de los genes p53, p16, Rb, tipos 1 y 2 de la neurofibromatosis, DCC y los putativos supresores de tumores en los cromosomas 4, 10, 17 (no p53), 19, 22 y X (Wong et al., 1987; El-Azouzi et al., 1989; Nishi et al., 1991; James et al., 1988; Kamb et al., 1984; Henson et al., 1994; Yamaguchi et al., 1994; Bianchi et al., 1994; Ransom et al., 1992; Rasheed et al., 1992; Scheck y Coons, 1993; Von Demling et al., 1994; Rubio et al., 1994; Ritland et al., 1995).

Las alteraciones más frecuentes incluyen la amplificación del receptor del factor de crecimiento epidérmico o EGF (por sus siglas en inglés) (\sim40%), pérdida de la función de la p53 (\sim50%), p16 (\sim50%) y Rb (\sim30%) y las deleciones en el cromosoma 10 (>90%). Además, el grado de la malignidad histológica de los tumores astrocíticos se correlaciona con una acumulación incrementada del daño genético similar al carcinoma de colon. Más aún, algunos cambios parecen ser relativamente específicos al linaje o grado. Por ejemplo, las pérdidas en el cromosoma 19q ocurren predominantemente en los oligodendrogliomas, mientras que las deleciones en el cromosoma 10 y la amplificación y mutación del receptor del EGF ocurre principalmente en los GBM. La deleción de una copia entera o de segmentos del cromosoma 10 se indica firmemente como el más común evento genético asociado con la forma más común de los tumores cerebrales primarios, los GBM.

Estudios citogenéticos y posteriormente de deleción alélica en los GBM han claramente demostrado alteraciones genéticas moleculares extensas y frecuentes asociadas con el cromosoma 10 (Bigner et al., 1988; Ransom et al., 1992; Rasheed et al., 1992; James et al., 1988: Fujimoto et al., 1989; Fults et al., 1990, 1993; Karlbom et al., 1993; Rasheed et al., 1995; Sonoda et al., 1996; Albarosa et al., 1996). Los análisis citogenéticos han demostrado claramente que la alteración del cromosoma 10 ocurre comúnmente en los GBM, con un 60% de los tumores con esta alteración. Los estudios de deleción alélica de los GBM también han revelado desequilibrios alélicos muy frecuentes asociados con el cromosoma 10 (90%). Sin embargo, las pérdidas son tan extensas y frecuentes que no se ha podido definir mediante estos análisis, en forma inequívoca, ninguna sublocalización cromosómica de una pérdida consistente.

Diversos estudios recientes han implicado la región 10q25-26, específicamente una región 17 cM desde D10S190 a D10S216. Una región telomérica desde D10S587 a D10S216 fue implicada mediante un análisis de deleción alélica utilizando una serie de gliomas de bajo y alto grado que presentaron solamente una pérdida parcial del cromosoma 10 (Rasheed et al., 1995). Esta región (\sim1cM) fue perdida o no informativa en 11 GBM, 4 AA, 1 A y 1 oligodendroglioma, lo que sugiere una localización de una región candidato. Este estudio también muestra que las deleciones al cromosoma 10 ocurren en gliomas de grado más bajo. Albarosa et al (1996) sugiere una región candidato centromérica basado en una deleción alélica pequeña en un tumor cerebral pediátrico desde los marcadores D10S221 a D10S209. Steck y Saya, utilizando una serie de GBM, han sugerido dos regiones comunes de deleciones, 10q26 y 10q24 (D10S192).

El brazo corto del cromosoma 10 también ha sido implicado como conteniendo otro gene supresor de tumores. Los estudios proporcionaron primero una prueba funcional de un gene supresor de tumores en 10p en gliomas (Steck et al., 1995), lo que más tarde fue mostrado en la próstata (Sanchez et al., 1995; Murakami et al., 1996). Este último estudio implicó una región 11cM entre D10S1172 y D10S527. Los estudios de deleción alélica de gliomas han mostrado una deleción extensa en l0p pero, nuevamente, no se ha logrado ninguna localización firme (Karlbom et al., 1993; Kimmelman et al., 1996; estas regiones del cromosoma 10 se muestran más abajo en la Fig. 1). Más aún, se ha mostrado que la amplificación del receptor del EGF ocurre casi exclusivamente en tumores con deleciones en el cromosoma 10, lo que sugiere una posible conexión entre estas alteraciones genéticas (Von Deimling et al., 1992).

También se han reportado deleciones en el brazo largo, particularmente en 10q24, en carcinomas de próstata, renales, uterinos, pulmonares de las células pequeñas y endiometriales, meningiomas y leucemias agudas de las células T (Carter et al., 1990; Morita et al., 1991; Herbst et al., 1984; Jones et al., 1994; Rempel et al., 1993; Peiffer et al., 1995; Petersen et al., 1997). Recientemente, estudios detallados de carcinomas de próstata han mostrado que (1) los brazos corto y largo del cromosoma 10 parecen convincentemente contener genes supresores de tumores, y (2) la localización del gene supresor del brazo largo mapea en la frontera de 10q23-24 (Gray et al., 1995; Ittmann, 1996, Trybus et al., 1996). La región de deleción común identificada por estos grupos se centra alrededor de D10S215 y se extiende cerca de 10 cM (Fig. 1). La región se superpone a nuestra región candidato, pero no se ha informado de ninguna localización adicional dentro de la región, para el carcinoma de próstata. Las pérdidas alélicas asociadas con el carcinoma de próstata también parecen ocurrir sólo en aproximadamente 30-40% de los tumores examinados. Más aún, las deleciones se observaron en tumores en un estadío más avanzado, similar al de los GBM, y pueden estar relacionadas a la capacidad metastásica (Nihei et al., 1995; Komiya et al., 1996). La combinación de estos resultados sugiere que múltiples cánceres humanos implican la región 10q23-24.

Las diferencias en la localización de las regiones candidatas sugieren varias posibilidades. Primero, es posible la presencia de dos o más genes supresores de tumores en l0q. Segundo, no todas las deleciones pueden efectuar el locus génico supresor de tumores. Estas alternativas no son mutualmente excluyentes. En apoyo de la última posibilidad, se ha sugerido que un centrómero latente potencial ocurre en 10q25, lo que podría dar lugar a alteraciones genéticas, particularmente de rotura (Vouiilaire et al., 1993).

A pesar de toda esta información, la identidad del gene (o genes) involucrado (o involucrados) con la supresión de tumores relacionada a 10q23-24 continúa siendo evasiva. Sin la identificación del gene específico y la deducción de la proteína para la que codifica, es imposible comenzar a desarrollar una terapia efectiva que tenga como objetivo este producto. Por lo tanto, es un objetivo de importancia aislar el supresor o supresores de tumores localizados en está región y determinar su estructura y función.

En aún otra materialización, esta invención proporciona un método de diagnóstico del síndrome de Cowden que comprende las etapas de obtener una muestra de un sujeto y de determinar la expresión de un producto génico de TS10q23.3 funcional en las células de la muestra. En materializaciones particularmente preferidas, las células pueden seleccionarse del grupo que consiste en células del pecho, ovarios, tiroides y endometrio. En otras materializaciones, la muestra puede ser de tejidos o fluidos. En otros aspectos de la invención, la determinación comprende un ensayo de un ácido nucleico de la muestra. En aspectos más preferidos, el método puede comprender además someter la muestra a las condiciones apropiadas para amplificar el ácido nucleico. En otras materializaciones, el método puede comprender además la etapa de comparar la expresión de TS10q23.3 con la de TS10q23.3 en muestras que no sean del síndrome de Cowden. En materializaciones específicas, la comparación puede involucrar evaluar el nivel de la expresión de TS10q23.3. En materializaciones aún más específicas, la muestra del síndrome de Cowden comprende una mutación en la secuencia codificante del TS10Q23.3. La mutación puede ser del marco de lectura, de deleción, de inserción o de cambio de sentido. En materializaciones más particulares, la mutación es en el exón 7. En otras materializaciones específicas, la mutación resulta en una terminación prematura del producto génico de TS10q23.3. En otras materializaciones, la mutación de deleción es en el exón 8. En ciertas materializaciones, la inserción es en el exón 2. En materializaciones particularmente preferidas, la mutación es una inserción de AT en la base 791 del exón 7. En otras materializaciones particularmente preferidas, la mutación es una deleción de trece pares de bases en la base 915 del exón 8. En otra materialización preferida, la mutación es una inserción de tres pares de bases en la base 137 del exón 2. Más específicamente, el resultado de la inserción de tres pares de bases codifica para un ASN en el producto génico de TS10q23.3.

En un aspecto adicional, se proporciona también un método para diagnosticar a un sujeto predispuesto al cáncer de pecho que comprende las etapas de obtener una muestra del sujeto y de determinar la expresión del producto génico de TS10q23.3 funcional en células de la muestra. En materializaciones particulares, las células pueden ser seleccionadas del grupo que consiste en células del pecho, los ovarios, la tiroides y el endometrio. En otras materializaciones, la muestra es una muestra de tejido o fluido. En un aspecto particularmente preferido, el método comprende además el paso de comparar la expresión del TS10q23.3 con la expresión del TS10q23.3 en muestras normales. En aspectos más definidos, la muestra comprende una mutación en la secuencia codificante del TS10Q23.3. La mutación puede ser del marco de lectura, de deleción, de inserción o de cambio de sentido. En materializaciones más particulares, la mutación es en el exón 7. En otras materializaciones particulares, la mutación resulta en una terminación prematura del producto génico de TS10q23.3. En otras materializaciones, la mutación de deleción es en el exón 8. En ciertas materializaciones la inserción es en el exón 2. En materializaciones particularmente preferidas, la mutación es una inserción de AT en la base 791 del exón 7. En otras materializaciones particularmente preferidas, la mutación es una deleción de trece pares de bases en la base 915 del exón 8. En otra materialización preferida, la mutación es una inserción de tres pares de bases en la base 137 del exón 2. Más específicamente, el resultado de la inserción de tres pares de bases codifica para un ASN en el producto génico de TS10q23.3.

Descripción breve de los dibujos

Los dibujos siguientes forman parte de esta memoria técnica y se incluyen para demostrar mejor ciertos aspectos de esta invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las materializaciones específicas que se presentan en este documento:

Fig. 1. - Localización de los locus supresores de tumores candidatos en el cromosoma 10 humano. Diversos locus en el cromosoma 10 humano han sido implicados como sitios posibles de la actividad supresora de tumores. En esta figura se representan estas locaciones y el grupo indicador.

Fig. 2. - Ilustración de deleciones homocigóticas en líneas de células gliomas. Se evaluaron diversas líneas de células gliomas por la presencia de deleciones en ambas copias de los locus del cromosoma 10. Los locus se indican en el eje vertical y las líneas de células se listan a lo largo del eje horizontal. La pérdida homocigótica se indica por un óvalo oscurecido. Las líneas de células glioma D54, EFC-2, A172 y LG11 se examinaron por la presencia del marcador AFMA086WG9 (AFM086). Se mostró que el marcador fue delecionado por reacciones en cadena de la polimerasa múltiples y simultáneas utilizando diversos alelos polimórficos del cromosoma 10 adicionales en reacciones independientes. El alelo Dl0S196 se muestra como el control de la reacción PCR™. Las células EFC-2 presentaron deleción homocigótica de 4 marcadores contiguos (vea la Fig. 2).

Fig. 3. - Ilustración de las regiones del cromosoma 10: Presencia o ausencia de marcadores microsatélite del ADN en un clon híbrido. Se muestran regiones del cromosoma 10 con presencia (círculo ennegrecido) o ausencia (círculo sin ennegrecer) del ADN correspondiente a marcadores microsatélite específicos del cromosoma 10 de once subclones del clon híbrido de células somáticas U251.N10.7 que fueron transferidos a células A9 de ratón. Los híbridos de células somáticas U251.N10.6 y U251.N10.8 son clones completamente suprimidos, que exhiben poco o ningún crecimiento en agarosa suave, y los subclones U251.10.5A y C son parcialmente suprimidos (Steck et al., 1995). La diferencia entre los clones total o parcialmente suprimidos proporciona una localización funcional del gene supresor de tumores Las posibles regiones que contienen el gene supresor de tumores se indican por cajas sombreadas. La caja sombreada en 10q23.3 se superpone con las deleciones homocigóticas y la región implicada por el análisis de deleción alélica (vea Fig. 2 y Fig. 4).

Fig. 4. - Mapa de deleciones del cromosoma 10 en gliomas humanos. La región delimitada por los marcadores D10S551 al D10S583 está ubicada en una región 10 cM. Los microsatélites se muestran en su orden de conexión más probable y son mapeados en su locación cromosómica aproximada con base en el mapa híbrido de radiación, como se describe por Gyapay et al., 1994. La región del cromosoma 101 que no está involucrada en astrocitomas anaplásicos y un glioma se muestran en las regiones encajonadas del tumor. La región crítica definida por el análisis de deleciones homocigóticas y no excluida por este análisis se muestra mediante una barra sólida en el costado derecho.

Fig. 5. - Mapeo del BAG 106dl6. Se ilustra el mapeo del BAG designado 106dl6 y la demostración de la deleción homocigótica mediante una transferencia Southern (Southern blotting). Se presenta el mapa de restricción parcial del 106dl6. La ilustración de la transferencia (blot) muestra la deleción homocigótica de la banda Eco Nº 14 (Mr aprox. 11 kb) en las células EFC-2.

Fig. 6. - Secuencia codificante y regiones flanqueantes 3' y 5' de TS10q23.3. La región codificante están en negrita como lo está el primer codón de terminación en marco.

Fig. 7. - Secuencia de aminoácidos predicha del producto de TS10q23.3. Las abreviaturas son: A, alanina; C, cisteína; D, ácido aspártico; E, ácido glutámico; F; fenilalanina; G, glicina; H, histidina; I, isoleucina; K, lisina; L, leucina; M, metionina; N, asparagina; P; prolina; Q, glutamina; R, arginina; S, serina; T, treonina; V, valina; W, triptófano; Y, tirosina. El sitio consenso fosfatasa está en negrita; los sitios de fosforilación de la tirosina están en cursiva y subrayados.

Fig. 8. - Análisis delecional de 10q23.3. Una línea glioma que inicialmente se indicó como teniendo deleciones homocigóticas en 10q23.3 fue reanalizada por la presencia del gene TS10q23.3. Un óvalo oscurecido indica que la región génica está presente; un óvalo sin oscurecer indica una deleción homocigótica en la región génica. * - indicata exones atrapados.

Fig. 9. - Comparación homológica del TS10q23.3 humano con los homólogos de ratón y perro. El codón ATG de iniciación y el aminoácido metionina están designados en la posición de comienzo (1). El codón de terminación es TGA (1210). Las alteraciones entre las secuencias humana y del perro o ratón al nivel genómico o de aminoácidos se designan con una estrella en la secuencia comparada. Las secuencias de aminoácidos canina y humana son idénticas; la secuencia de ratón difiere en la posición 398, donde la de ratón tiene una serina, mientras que la de perro y la humana tienen una treonina.

Fig. 10. - Secuencia de exones y regiones intrónicas circundantes del TS10q23.3. Los exones se denotan con letras mayúsculas comenzando en la posición uno, y los intrones se designan con letras minúsculas; excepto por el primer exón donde el codón de iniciación comienza en la posición uno y la frontera exón/intrón 3' está en las posiciones 79 y 80, respectivamente. La letra minúscula designada (Tabla 5) corresponde a la numeración de la secuencia presentada en esta figura, excepto por el primer exón. Las mutaciones para U87 y U138 están en el primer residuo intrónico G [G+1>T] después del exón (exones 7 y 8, respectivamente). Para T98G y KE, las mutaciones puntuales están en las posiciones 46 y 28 del exón 2, respectivamente. Para las células LnCap, la mutación es una deleción de las bases 16 y 17 en el primer intrón.

Figs. 11A-G. - Análisis de estructuras secundarias en TS1023.3. Fig. 11A: Diagrama de hidrofilicidad; Fig. 11B: Diagrama de probabilidad de superficie; Fig. 11C: Diagrama de flexibilidad; Fig. 11D: Diagrama de índice antigénico; Fig. 11E: Diagrama de hélice anfifílica; Fig. 1 IF: Diagrama de hoja anfifílica; Fig. 11G: Diagrama de estructuras secundarias.

Figs. 12A-I. - Comparación de las características predichas en TS10q23.3 y los mutantes puntuales T98G y KE. Fig. 12 A: Diagrama de hidrofilicidad de los residuos 1-60 del polipéptido de tipo salvaje; Fig. 12B: Diagrama de probabilidad de superficie de los residuos 1-60 del polipéptido de tipo salvaje; Fig. 12C: Diagrama de estructuras secundarias de los residuos 1-60 del polipéptido de tipo salvaje; Fig 12D: Diagrama de hidrofilicidad de los residuos 1-60 del mutante KE; Fig. 12E: Diagrama de probabilidad de superficie de los residuos 1-60 del mutante KE; Fig. 12 F: Diagrama de estructuras secundarias de los residuos 1-60 del mutante KE; Fig. 12G: Diagrama de hidrofilicidad de los residuos 1-60 del mutante T98G; Fig. 12H: Diagrama de probabilidad de superficie de los residuos 1-60 del mutante T98G; Fig. 12I: Diagrama de estructuras secundarias de los residuos 1-60 del mutante T98G. La mutación T98G (Leu ->> Arg) en el residuo 42 resulta en la pérdida de la propuesta estructura secundaria helicoidal del TS10q23.3. La mutación de KE en el residuo 36 (Gly -> Glu) aumentaría de forma significativa la longitud de la propuesta estructura helicoidal de la región. Ambas mutaciones afectarían la misma estructura helicoidal. También surgen cambios menores en la hidrofilicidad y en la probabilidad de superficie.

Fig. 13A. La deleción homocigótica del gene TS10Q23.3 en líneas de células de tumores humanos y los niveles de expresión del ARNm del TS10Q23.3 en glioblastomas primarios. Se muestran cuatro líneas de células, carcinoma de pecho TCL11A11, melanoma TCL11D7, melanoma TCL11D9 y leucemia TCL10G9 (muestra de control sin TS10Q23.3 delecionado homocigóticamente), cada una examinada por amplificación PCR™ utilizando los siguientes sitios de secuencia marcada: (1) exón 1 de TS10Q23.3, (2) exón 2 de TS10Q23.3, (3) exón 3 de TS10Q23.3, (4) exón 4 de TS10Q23.3, (5) exón 5 de TS10Q23.3, (6) exón 6 de TS10Q23.3, (7) exón 7 de TS10Q23.3 (8) exón 8 de TS10Q23.3, (9) exón 9 de TS10Q23.3, (10) exón 8 de control MKK4.

Fig. 13B. Deleción homocigótica del gene TS10Q23.3 en líneas de células de tumores humanos y niveles de expresión de ARNm de TS10Q23.3 en glioblastomas primarios. Esquema de las deleciones homocigóticas observadas en el gene TS10Q23.3 en las líneas de células tumorales (TCL) examinadas. Los círculos ennegrecidos representan exones que no fueron delecionados homocigóticamente mientras que los círculos sin ennegrecer representan exones que se perdieron.

Fig. 13C. Deleción homocigótica del gene TS10Q23.3 en líneas de células de tumores humanos y niveles de expresión de ARNm de TS10Q23.3 en glioblastomas primarios. Expresión del mensaje del TS10Q23.3 en el cerebro humano normales y en especímenes de GBM como se detectan por el análisis RT-PCR™. Se muestra el amplicón de terminal 5' del TS10Q23.3. Los carriles que se muestran incluyen un amplicón (C) de control del ADNc de un glioma de bajo grado PL-1, junto con siete especímenes normales y de tumores. Seis de los 10 GBM examinados fueron estudiados por LOH alrededor del locus del TS10Q23.3 y alteraciones génicas del TS10Q23.3. Todas las seis muestras presentaron LOH pero no se detectaron mutaciones cuando los inventores analizaron sus ADN mediante secuenciamiento. Los niveles de expresión del mensaje GADPH se usaron para controlar las cantidades y calidades de molde equivalentes.

Fig. 13D. Deleción homocigótica del gene TS10Q23.3 en líneas de células de tumores humanos y niveles de expresión de ARNm de TS10Q23.3 en glioblastomas primarios. Cociente de intensidades del amplicón RT-PCR™ de TS10Q23.3 a GADPH para cada espécimen normal y de GBM.

Fig. 14. Representación de los dominios funcionales putativos del TS10Q23.3 y locación de las alteraciones identificadas. La mitad terminal N del TS10Q23.3 es homóloga a las fosfatasas, así como a las proteínas citoesqueléticas, tensina y auxilina (caja marrón). También se muestran las locaciones del domino fosfatasa núcleo (caja roja), tres sitios potenciales de fosforilación de la tirosina (cajas azules) y dos sitios potenciales de fosforilación de la serina (cajas amarillas). El motivo PDZ, ITKV, está ubicado en el terminus C de la proteína. Se muestran variantes de TS10Q23.3 identificadas por Steck et al (1997), Li et al., (1997) y Liaw et al (1997) y las alteraciones detectadas en este estudio; las flechas azules marcan sustituciones de cambio de sentido, las flechas negras indican inserciones en marco o deleciones, las flechas verdes marcan variantes de empalme potenciales y las flechas rojas representan mutaciones del marco de lectura o de cambio de sentido que resultan en truncamientos del TS10Q23.3. Los asteriscos indican mutaciones germinales que fueron detectadas en pacientes con el síndrome de Cowden (Liaw et al., 1997), mientras que los círculos ennegrecidos indican lesiones que se observaron en dos muestras de ADN presuntamente independientes.

Fig. 15. Construcción haplotípica con marcadores en el cromosoma 10 en cuatro familias con CS.

Fig. 16. Secuenciamiento del ADN del TS10Q23.3 en una familia con CS e iniciación temprana de cáncer de pecho. La madre afectada (círculo negro) demuestra una inserción de 2 pares de bases (AT) en el exón 5, lo que no se observa en el hermano no afectado (cuadrado sin ennegrecer). Su hija afectada ha heredado la inserción AT.

Fig. 17. Expresión de la proteína MMAC1 exógena. Las células U87MG fueron infectadas con MMCB o GFCB a las concentraciones indicadas (número de partículas por ml) durante 24 horas, entonces se prepararon los lisatos, inmediatamente (24 horas) o 24 horas más tarde (48 horas). Se llevó a cabo un análisis de transferencia Western (Western blotting) como se describe en la sección Métodos. Marcadores del tamaño de proteínas se muestran a la izquierda. La proteína MMAC1 migró a aproximadamente 55 kD en acuerdo con Li et al., 1997.

Fig. 18. Ensayo de infectividad FACS. Las células U87MG se infectaron con GFCB en las concentraciones indicadas por 24 horas. La fracción de células que expresaron proteína fluorescente verde fue cuantificada por citometría de flujo. pn/ml: número de partículas de adenovirus por ml.

Fig. 19A y Fig. 19B. Inhibición de la proliferación in vitro por MMCB. Fig. 19A. Captación de la ^{3}H-timidina. Fig. 19B. Ensayo de conteo de células viables. Las barras de error representan desviaciones estándar (S.D.). (3 replicaciones). Pn/ml: número de partículas de adenovirus por ml.

Fig. 20. Formación de colonias en agar suave. Las células U87MG se infectaron con GFCB, MMCB o FTCB a las concentraciones indicadas por 24 horas. Se grafica el número de colonias promedio \pm S.D., pn/ml: número de partículas de adenovirus por ml.

Resumen de las secuencias

SEQ ID NO:1 = secuencia del gene TS10q23.3 humano (Figuras 6 y 9); SEQ ID NO:2 = secuencia del péptido TS10q23.3 humano del CDS de la SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3 = traducción de las bases 3-119 de la SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:4 = traducción de las bases 123-242 de la SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:5 = traducción de las bases 246-272 de la SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:6 = traducción de las bases 276-317 de la SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:7 = traducción de las bases ases 321-449 de la SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:8 = traducción de las bases 453-2243 de la SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:9 = secuencia del gene TS10q23.3 de ratón (Figura 9); SEQ ID NO:10 = secuencia del péptido TS10q23.3 de ratón del CDS de la SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:11 = traducción de las bases 14-55 de la SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:12 = traducción de las bases 59-166 de la SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:13 = traducción de las bases 172-222 de la SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:14 = traducción de las bases 223-273 de la SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:15 = traducción de las bases 283-1959 de la SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:16 = secuencia del gene TS10q23.3 canino (Figura 9); SEQ ID NO:17 = secuencia del péptido TS10q23.3 canino del CDS de la SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:18 = traducción de las bases 1-1290 de la SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:19 = exón 1 (Figura 10); SEQ ID NO:20 = exón 2 (Figura 10); SEQ ID NO:21 = exón 3 (Figura 10); SEQ ID NO:22 = exón 4 (Figura 10); SEQ ID NO:23 = exón 5 (Figura 10); SEQ ID NO:24 = exón 6 (Figura 10); SEQ ID NO:25 = exón 7 (Figura 10); SEQ ID NO:26 = exón 8 (Figura 10); SEQ ID NO:27 = exón 9 (Figura 10); SEQ ID NO:28 = un motivo de los residuos 88 a 98; SEQ ID NO:29 = dominio catalítico conservado de una proteína tirosina fosfatasa (Denu et al., 1996); SEQ ID NO:30 = residuos 1-60 del polipéptido TS10q23.3 de tipo salvaje (Figuras 12A-12C); SEQ ID NO:31 = residuos 1-60 del mutante T98G del polipéptido TS10q23.3 (Figuras 12D-12F); SEQ ID NO:32 = residuos 1-60 del mutante KE del polipéptido TS10q23.3 (Figuras 12G-12I); SEQ ID NO:33 = cebador CA6.ex8.FB; SEQ ID NO:34 = cebador CA6.ex8.RQ; SEQ ID NO:35: = cebador CA6.ex8.FC; SEQ ID NO:36 = cebador CA6.ex8.RR; SEQ ID NO:37 = cebador anidado FB-RQ del exón 8 usado para obtener amplicones secundarios; SEQ ID NO:38 = cebador anidado FB-RR del exón 9 usado para obtener amplicones secundarios; SEQ ID NO:39 = cebador M5T; SEQ ID NO:40 = cebador M5' R; SEQ ID NO:41 = cebador M3'F; SEQ ID NO:42: = cebador F3'R; SEQ ID NO:43 = cebador en la primera vuelta de PCR™ en cerebro fetal humano; SEQ ID NO:44 = cebador en la primera vuelta de PCR™ en cerebro fetal humano; SEQ ID NO:45 = cebador en la segunda vuelta de PCR™ en cerebro fetal humano; SEQ ID NO:46 = cebador en la segunda vuelta de PCR™ en cerebro fetal humano; SEQ ID NO:47 = cebador usado para generar un producto 303 bp específico del pseudogene y no del TS10q23; SEQ ID NO:48 = cebador usado para generar un producto 303 bp específico del pseudogene y no del TS10q23; SEQ ID NO:49 = secuencia de la proteína MMAC1 de ratón; SEQ ID NO:50 = secuencia del péptido; SEQ ID NO:51 = traducción de las bases 321-1034 de la SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:52 = traducción de las bases 169-750 de la SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:53 = traducción de las bases 1-108 de la SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:54 = secuencia del gene MMAC1 canino; SEQ ID NO:55 = secuencia de la proteína MMAC1 canina del CDS de la SEQ ID NO:54; SEQ ID NO:56 = secuencia del gene MMAC en ratones; SEQ ID NO: 57 = secuencia de la proteína MMAC1 de ratón del CDS de la SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:58 = secuencias apareadas del cebador MAC 1.6f en el exón 2 de MMAC1; SEQ ID NO:59 = secuencias apareadas del cebador MACl,6r en el exón 5 de MMAC1; SEQ ID NO:60 = traducción de las bases 1-54 de la SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:61 = traducción de las bases 58-96 de la SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:62 = traducción de las bases 98-178 de la SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:63 = traducción de las bases 182-208 de la SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:64 = secuencia del seudogene TS10q23.3 humano.

Descripción detallada de las materializaciones preferidas I. Esta invención

Como se expresa con anterioridad, un número de grupos distintos han mostrado una actividad supresora de tumores asociada con la región l0q del cromosoma 10 humano. A pesar de la considerable cantidad de trabajo realizada, no se ha determinado la identidad del gene o genes responsables por dicha actividad. Las investigaciones previas hicieron un planteamiento funcional que involucra la transferencia del cromosoma, o de fragmentos del mismo, del que se sospecha de albergar al gene o genes supresores de tumores en células glioma tumorigénicas. Estos esfuerzos permitieron la definición de la actividad biológica del gene supresor de tumores putativo y ayudaron en la localización de tal actividad. Los cromosomas 2 y 10 fueron transferidos a las células gliomas U251 y los cromosomas 2 y 10 a las células LG-11. Se demostró que las células LG-11 no tienen copias intactas del cromosoma 10 y, posteriormente, que la ruptura ocurre en 10q24. La transferencia del cromosoma 10 resultó en células híbridas que presentaron un fenotipo suprimido y exhibieron una pérdida de tumorigenicidad (no hay formación de tumor) y de la capacidad para crecer en agarosa suave (una disminución de 50X a 1000X; Pershouse et al., 1993). La velocidad de crecimiento exponencial del híbrido fue similar a la de las células paternas, aunque la densidad de saturación de la célula híbrida fue significativamente menor (de 10X a 20X). La transferencia del cromosoma 2 resultó en células híbridas que actuaron en forma similar a las células paternas.

Uno de los objetivos de estos estudios fue localizar al gene supresor del cromosoma 10 por fragmentación del cromosoma 10 marcado por neomicina y, posteriormente, transferir el cromosoma fragmentado a las células gliomas. Sin embargo, los inventores observaron que algunas de las células híbridas habían sufrido reacomodos cromosómicos espontáneos para producir células híbridas que retenían sólo varias de las regiones del cromosoma 10 insertado (Pershouse et al., 1993). Los inventores entonces subclonaron los híbridos y los analizaron, en lugar de comenzar estudios de fragmentación (Steck et al., 1995). La retención del cromosoma 10 insertado o de sus fragmentos fue seguida mediante marcadores RFLP informativos y análisis FISH. Es de interés destacar que sólo el cromosoma insertado fue sujeto a reacomodo. La inserción de una copia completa del cromosoma 10 resultó en la inhibición de la propiedad transformada de la célula híbrida de proliferar en agarosa suave y formar tumores en ratones
desnudos.

Estos dos fenotipos ahora parecen ser parcialmente separables mediante este análisis. Algunos subclones (U251.
N10.5a-j), que revelaron una pérdida de una parte principal del brazo largo del cromosoma 10, crecieron en agarosa suave pero no formaron tumores en ratones desnudos indicando, por lo tanto, que un locus supresor de tumores reside en la porción restante del cromosoma (de l0pter a l0ql1). En contraste, los clones que retuvieron la región distal del brazo largo, de 10q24.a 10q26, no proliferaron ni en agarosa suave ni en ratones desnudos (véase la Fig. 4). Esto sugiere otra región supresora fenotípica residente en la región distal del cromosoma. La falta de material adicional asociado a 10 sugeriría además que el material remanente del cromosoma 10 es responsable por el fenotipo biológico alterado. Estos resultados implican la presencia de dos regiones supresoras fenotípicamente independientes en el cromosoma 10 involucradas en la evolución de los gliomas (Steck et al., 1995).

De acuerdo con esta invención, los inventores han usado diversas estrategias independientes para localizar un gene supresor de tumores, designado TS10q23.3, que esté involucrado en gliomas, cáncer del pecho, de la próstata y otros cánceres. Estos planteamientos, descritos en mayor detalle en los Ejemplos que siguen, incluyen (i) identificación de deleciones homocigóticas en una serie de líneas de células de gliomas humanos; (ii) determinación de una región (o regiones) consistente de retención en clones suprimidos por tumorigenicidad; y (iii) estudios de deleción alélica en diversos grados de glioma y en las muestras normales correspondientes. Con el gene en la mano, se ha vuelto ahora posible explotar la información codificada por el gene para desarrollar planteamientos terapéuticos y de diagnóstico novedosos relacionados con el cáncer humano.

II. El supresor de tumores 10q23.3

De acuerdo con esta invención, se ha identificado un supresor de tumores, codificado por un gene en el locus 10q23.3, y designado aquí como TS10q23.3. Esta molécula es capaz de suprimir fenotipos tumorales en varios cánceres. El término supresor de tumores es bien conocido para aquellas personas versadas en el arte. Ejemplos de otros supresores de tumores son p53, Rb y p16, para nombrar algunos. Aunque estas moléculas son estructuralmente distintas, forman un grupo de moléculas relacionadas funcionalmente, del cual forma parte TS10q23.3. Son de igual aplicación aquí los usos en los cuales se utilizan hoy estos otros supresores de tumores.

Además de la molécula de TS10q23.3 completa, esta invención también se relaciona con los fragmentos del polipéptido que pueden o no retener la actividad supresora de tumores (u otra actividad). Los fragmentos, incluida la terminal N de la molécula, pueden ser generados por manipulación genética de los sitios de terminación de la traducción dentro de la región codificante (lo que se discute más abajo). Alternativamente, el tratamiento de la molécula TS10q23.3 con las enzimas proteolíticas, conocidas como proteasas, puede producir una diversidad de fragmentos terminal N, terminal C e internos. Ejemplos de estos fragmentos pueden incluir los residuos contiguos de la secuencia del TS10q23.3. que se presenta en las Figuras 7 y 9, de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400 o más aminoácidos de longitud. Estos fragmentos pueden ser purificados por métodos conocidos tales como precipitación (por ejemplo, con sulfato de amonio), cromatografía líquida de alto rendimiento (o HPLC, por sus siglas en inglés), cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad (incluyendo crromatografía de inmunoafinidad) o separaciones de diversos tamaño (sedimentación, electrofóresis en gel, filtración en gel).

A. Características estructurales del polipéptido

El gene para TS10q23.3 codifica un polipéptido de 403 aminoácidos. El peso molecular predicho de esta molécula es 47.122, con un pI resultante de 5,86. Por lo tanto, como mínimo, esta molécula puede usarse como estándar en ensayos donde se examinen el peso molecular y pi.

Un sitio consenso fosfatasa está ubicado en los residuos 122-131, correspondiéndose perfectamente con la secuencia consenso de la tirosina fosfatasa (PTP):[I/V]HCxAGxxR[S/T]G. Afuera de los dominios activos, las secuencias difieren grandemente. Las PTP proceden mediante fosfoenzimas intermediarias. La reacción enzimática involucra la formación de un intermediario fosforil-cisteína luego de un ataque nucleofílico del átomo de fósforo del sustrato por el anión tiolato de la cisteína. La reacción puede representarse como un proceso químico de dos etapas: una transferencia de fosforil a la enzima acompañada por una rápida liberación del producto desfosforilado; y la hidrólisis del intermediario tiol fosfato concomitante con una rápida liberación de fosfato. Para formar el complejo catalíticamente competente, la enzima se une y reacciona con el dianión del sustrato que contiene fosfato. En la enzima, se debe protonar el ácido aspártico y la cisteína nucleofílico debe ser deprotonada (anión tiolato) por transferencia fosforil a la enzima. También son de importancia los sitios potenciales de fosforilación de tirosina ubicados en los residuos 233-240 y 308-315 y los sitios de fosforilación de AMPc ubicados en los residuos 128, 164, 223 y 335. Las fosfatasas son conocidas por tener sitios quinasa, y la actividad fosfatasa de estas enzimas puede ser modulada por fosforilación en estos sitios. Las proteínas fosfatasas generalmente se dividen en dos categorías: serina/treonina fosfatasas y tirosina fosfatasas. Ciertas tirosina fosfatasas también tienen actividad contra la fosfoserina y la fosfotreonina.

La interacción entre las quinasas y las fosfatasas y los diversos estados de fosforilación de los polipéptidos han sido demostrados como características importantes de la fisiología celular. A través de diversos distintos mecanismos, las quinasas y las fosfatasas actúan a través de distintas rutas dentro de las células que están involucradas con el señalización, el almacenaje de energía y la regulación celular. Desde la identificación de una función tirosina quinasa intrínsica en la transformación de la proteína src (Collett & Erickson, 1978), el papel de la fosforilación, particularmente en los residuos de tirosina, ha mostrado ser crítico en el control de la proliferación celular y la inducción del cáncer (Hunter, 1991; Bishop, 1991). El papel que las proteínas fosfatasas desempeñan en la regulación del crecimiento, así como en muchas otras actividades biológicas y bioquímicas, se ha correlacionado con el estado de fosforilación de moléculas biológicamente importantes (Cohen, 1994).

Basándose en su secuencia, TS10q23.3 parece codificar una tirosina fosfatasa o fosfatasa de especificidad dual con homología a las proteínas asociadas al citoesqueleto, tensina de pollos y auxilina bovina (Steck et al., 1997; Li et al., 1997). La mitad terminal N de TS10q23.3 es homóloga a varias fosfatasas y su motivo central fosfatasa putativo está presente en los residuos 122-134 (Denu et al., 1996; Tonks y Neel, 1996). Por lo tanto, la región terminal N de TS10q23.3 puede tener actividades de localización celular y enzimática. La porción terminal C de TS10q23.3 contiene tres sitios potenciales de fosforilación de la tirosina en los residuos 240, 315 y 336. Si es fosforilada, la tirosina 315 representaría un sitio de enlace de SH2 potencial ya que hay un residuo de leucina ubicado tres residuos de la terminal C de la tirosina (Songyang et al., 1995). Los dos sitios potenciales de fosforilación de la serina también están presentes dentro de la mitad terminal C de TS10Q23.3. El residuo 338 de la serina representa un sitio potencial de la proteína quinasa II dependiente de Ca2+/calmodulina, mientras que el serina 355 representa un sitio potencial de la caseína quinasa II (Hardie y Hanks, 1995). Los últimos cuatro aminoácidos de la terminal C, ITKV, representan un potencial dominio de unión PDZ (Fanning y Anderson, 1996; Saras y Heldin, 1996). Los dominios PDZ están presente en una diversidad de proteínas intracelulares y se piensa que median las interacciones proteína-proteína mediante el enlace directo con los extremos de la terminal C de las proteínas dianas.

Se debe también mencionar que los aproximadamente 60 aminoácidos de la terminal N de la molécula muestran alguna homología a la tensina, una proteína citoesquelética implicada en las placas de adhesión. Esto sugiere que TS10q23.3 puede estar involucrado en fenómenos de superficie celular como, por ejemplo, inhibición por contacto, invasión, migración o señalización de célula a célula. Las mutaciones puntuales de TS10q23.3 identificadas en ciertas líneas de células de tumores afectan las estructuras secundarias propuestas de esta región.

B. Aspectos funcionales

Cuando en la presente solicitud se refiere a la función del TS10q23.3 o actividad de "tipo salvaje", se está significando que la molécula en cuestión tiene la capacidad de inhibir la transformación de una célula desde un estado normalmente regulado de proliferación a un estado maligno, es decir, uno asociado con cualquier tipo de regulación anormal del crecimiento, o inhibir la transformación de una célula desde un estado anormal a uno altamente maligno, esto es, prevenir la metástasis o crecimiento invasor de tumores. Otros fenotipos que pueden considerarse que son regulados por el producto génico de TS10q23.3 normal son la angiogénesis, adhesión, migración, señalización de célula a célula, crecimiento y proliferación celular, crecimiento dependiente de la densidad, crecimiento dependiente del anclaje y otros. Se puede determinar que las células poseen esta actividad mediante ensayos conocidos por aquellas personas versadas en el arte. Por ejemplo, la transferencia de genes codificantes de TS10q23.3, o sus variantes, a células que no tienen un producto TS10q23.3 funcional, y por lo tanto exhiben un control de crecimiento deteriorado, identificará, por virtud de la supresión del crecimiento, a aquellas moléculas que tengan función TS10q23.3.

Como se ha expresado con anterioridad, hay ciertas indicaciones de que TS10q23.3 es una fosfatasa. La porción de la proteína ubicada en los residuos 88 a 98 es un perfecto apareamiento para el dominio catalítico conservado de la proteína tirosina fosfatasa. También, dianas quinasas putativas están ubicadas en la molécula, lo que es otra de las características de las fosfatasas. Debido a que se han identificados otros supresores de tumores con este tipo de actividad, será deseable determinar la función fosfatasa en el papel de supresor de tumores de TS10q23.3. Esto también puede ser un planteamiento provechoso para el desarrollo de ensayos de evaluación de la ausencia de la función TS10q23.3 o de terapias para el cáncer, por ejemplo, para tomar como objetivo la función fosfatasa de TS10q23.3, direccionarse al sustrato sobre el cual actúa TS10q23.2 y/o la quinasa o quinasas que actúan sobre el TS10q23.3.

C. Variantes de TS10Q23.3

Las variantes de las secuencias de aminoácidos del polipéptido pueden ser variantes de substitución, inserción o deleción. Las variantes de deleción carecen de uno o más de los residuos de la proteína nativa que no son esenciales para la función o actividad inmunogénica, y están ejemplificadas por las variantes que carecen de la secuencia de transmembrana anteriormente descrita. Otro tipo común de variante de deleción es una que carezca de secuencias señal secretorias o secuencias señal que dirijan a una proteína a unirse a una parte específica de una célula. Los mutantes de inserción típicamente involucran la adición de material en un punto no terminal del polipéptido. Esto puede incluir la inserción de un epítopo inmunoreactivo o simplemente un residuo único. Las adiciones terminales, llamadas proteínas de fusión, se discuten más abajo.

Las variantes de sustitución típicamente contienen el intercambio de un aminoácido por otro en uno o más sitios dentro de la proteína y pueden ser diseñadas para modular una o más propiedades del polipéptido, tales como la estabilidad contra la escisión proteolítica, sin la pérdida de otras funciones o propiedades. Las substituciones de esta clase son preferentemente conservativas, es decir, se reemplaza un aminoácido con otro de forma y carga similar. Las sustituciones conservativas son bien conocidas en el arte e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina a serina; arginina a lisina; asparagina a glutamina o histidina; aspartato a glutamato; cisteína a serina; glutamina a asparagina; glutamato a aspartato; glicina a prolina; histidina a asparagina o glutamina; isoleucina a leucina o valina; leucina a valina o isoleucina; lisina a arginina; metionina a leucina o isoleucina; fenilalanina a tirosina, leucina o metionina; serina a treonina; treonina a serina; triptófano a tirosina; tirosina a triptófano o fenilalanina; y valina a isoleucina o leucina.

En aspectos específicos se contempla que las personas versadas en el arte emplearán tecnologías estándar bien conocidas por ellas para producir los mutantes. Se contemplan específicamente las deleciones de terminal N, de terminal C e internas, así como mutagénesis puntuales y aleatorias.

Las deleciones de terminal N y terminal C son formas de mutagénesis de deleción que aprovechan, por ejemplo, la presencia de un sitio de restricción único apropiado cerca del extremo de la región de terminal C o N. El ADN es escindiodo en el sitio y los extremos del corte se degradan por nucleasas tales, como por ejemplo, BAL31, exonucleasa III, desoxirribunocleasa I y SI nucleasa. Volviendo a unir los dos extremos produce una serie de ADN con deleciones de diversos tamaños alrededor del sitio de restricción. Las proteínas expresadas por dichos mutantes pueden ser analizadas por inhibición de apoptosis y/o función chaperona como se describe en toda esta memoria técnica. Se emplean técnicas similares para mutantes de deleción interna; sin embargo, estos mutantes se generan utilizando dos sitios de restricción colocados de manera apropiada, lo que permite que se haga una deleción definida con precisión, y los extremos se religan como se ha descrito previamente.

También se contemplan mutantes de digestión parcial. En tales ocasiones, una persona versada en el arte emplearía un "cortador frecuente", que corte el ADN en numerosos lugares dependiendo de la longitud del tiempo de reacción. Por lo tanto, mediante cambios de las condiciones de reacción será posible generar una serie de mutantes de diversos tamaños, los que pueden ser evaluados por actividad.

También se puede llevar a cabo una mutación de inserción aleatoria cortando la secuencia del ADN con desoxirribunocleasa I, por ejemplo, e insertando una tira de nucleótidos que codifiquen 3, 6, 9, 12, etc., aminoácidos y religando el extremo. Una vez que se ha logrado una mutación, los mutantes pueden ser examinados por las diversas actividades que presenta la proteína de tipo salvaje.

Una vez que se identifican las zonas generales del gene como dominios codificantes de proteínas específicas, se puede emplear mutagénesis puntual para identificar con particularidad que residuos de aminoácidos son importantes para las actividades específicas asociadas con TS10Q23.3. Por lo tanto, una persona versada en el arte podrá generar cambios individuales de bases en la cadena del ADN que resultarán en un codón modificado y una mutación de cambio de sentido.

La siguiente es una discusión acerca de cambios de los aminoácidos de una proteína para crear una molécula de segunda generación equivalente, o aún una mejorada. Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros en la estructura de una proteína sin pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión de antígenos de los anticuerpos o sitios de unión en moléculas sustrato. Dado que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína lo que define esa actividad funcional biológica de la proteína, se pueden hacer ciertas sustituciones de aminoácidos en la secuencia de una proteína, y su secuencia codificante de ADN subyacente, y sin embargo obtenerse una proteína con propiedades similar. Por lo tanto, los inventores contemplan que pueden hacerse diversos cambios en las secuencias de ADN de los genes sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica, como se discute más abajo. La Tabla 1 muestra los codones que codifican aminoácidos específicos.

Al hacer tales cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína es generalmente entendida en el arte (Kyte & Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, lo que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares.

Cada aminoácido ha sido asignado un índice hidropático en base de su hidrofobicidad y características de carga (Kyte & Doolittle, 1982); estos son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); mecionina t(+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5).

Se conoce en el arte que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros que tengan un índice o valoración hidropática similar y todavía resultar en una proteína con una actividad biológica similar, es decir, obtener una proteína que desde un punto de vista biológico sea funcionalmente equivalente. Al hacer estos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos estén dentro de \pm2, aquellos para los que este índice se encuentre dentro de \pm1 son particularmente preferidos, y aquellos para los que el índice se encuentre dentro de \pm0.5 son aún más particularmente preferidos.

También se entiende en el arte que la sustitución de aminoácidos similares puede ser hecha efectivamente sobre la base de la hidrofilicidad. La patente de los Estados Unidos Nº 4.554.101, incorporada aquí por esta referencia, expresa que el promedio máximo local de la hidrofilicidad de una proteína, que se rige por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla en la patente de los Estados Unidos Nº 4.554.101, los siguientes valores de hidrofilicidad han sido asignados a los residuos de aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0 \pm 1); glutamato (+3.0 \pm 1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 \pm 1); alanina (-0.5); histidina *-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptófano (-3.4).

Se entiende que un aminoácido puede ser sustituido por otro que tenga un valor hidrofílico similar y aún así obtenerse una proteína biológica e inmunológicamente equivalente. En dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores hidrofílicos estén dentro de \pm 2, aquellos para los que estos valores se encuentren dentro de \pm 1 son particularmente preferidos, y aquellos para los que se encuentren dentro de \pm 0.5 son aún más particularmente preferidos.

Como se bosqueja precedentemente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de las cadenas laterales de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Sustituciones ejemplares que toman en consideración varias de las características precedentes son bien conocidas por las personas versadas en el arte e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Otra materialización para la preparación de polipéptidos de acuerdo con esta invención es el uso de péptidos miméticos. Los miméticos son moléculas que contienen péptidos que imitan elementos de la estructura secundaria de la proteína. Véase, por ejemplo, Johnson et al., "Péptido Turn Mimetics" in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al., Eds., Chapman y Hall, New York (1993). La razón subyacente detrás del uso de péptidos miméticos es que el esqueleto peptídico de las proteínas existe principalmente para orientar las cadenas laterales de los aminoácidos de tal manera de facilitar las interacciones moleculares, como, por ejemplo, la interacción entre anticuerpo y antígeno. Se espera que un péptido mimético permita interacciones moleculares similares a la molécula natural. Estos principios pueden utilizarse, conjuntamente con los principios bosquejados con anterioridad, para manipular moléculas de segunda generación que tengan muchas de las propiedades naturales del TS10q23.3, pero con características modificadas y aún mejoradas.

D. Cambio de dominio

Como se describe en los ejemplos, los inventores han identificado homólogos murinos y caninos putativos del gene TS10q23.3 humano. Además, se han identificado mutaciones en TS10q23.3 que se creen alteran su función. Estos estudios son importantes por al menos dos razones. Primero, crean una expectativa razonable de que todavía otros homólogos, variantes alélicas y mutantes de este gene puedan existir en especies relacionadas tales como, por ejemplo, ratas, conejos, monos, gibones, chimpancés, simios, mandriles, vacas, cerdos, ovejas y gatos. Una vez aislados estos homólogos, variantes y mutantes, y conjuntamente con otros análisis, se pueden identificar ciertos dominios activos o funcionales. Segundo, esto proveerá un punto de partida para otros análisis mutacionales de la molécula. Una manera en que se puede explotar esta información es mediante "cambios de dominio."

Un cambio de dominio involucra la generación de moléculas quiméricas usando polipéptidos distintos pero, en este caso, relacionados. Mediante la comparación de las secuencias del TS10q23.3 humano, canino y de ratón con la del TS10q23.3 de otras especies, y con mutantes y variantes alélicas de estos polipéptidos, se pueden hacer predicciones sobre las regiones funcionalmente significativas de estas moléculas. Es posible, entonces, cambiar dominios relacionados de estas moléculas en un esfuerzo para determinar la criticidad de estas regiones para la función TS10q23.3. Estas moléculas tienen el valor adicional de que estas "quimeras" pueden distinguirse de las moléculas naturales, mientras que, posiblemente, poseen la misma función.

Con base en la identidad secuencial, al nivel de aminoácidos, de las secuencias humana, canina y de ratón, se puede inferir que aún cambios pequeños en la secuencia primaria de la molécula afectarán la función. Análisis adicionales de las mutaciones y sus previstos efectos sobre la estructura secundaria expandirán este entendimiento.

Otro aspecto estructural del TS10q23.3 que proporciona un terreno fértil para experimentos de cambio de dominio es el dominio similar al de la tirosina fosfatasa y los sitios putativos de la fosforilación de la tirosina. Este dominio puede ser sustituido por otros dominios fosfatasa para alterar la especificidad de esta función. Esta observación justifica una investigación adicional sobre la homología entre el TS10q23.3 y otras fosfatasas.

E. Las proteínas de fusión

Una clase especializada de variante de inserción es la proteína de fusión. Esta molécula generalmente tiene toda o una parte sustancial de la molécula nativa, conectada en la terminal N o C, a todo o a una porción de un segundo polipéptido. Por ejemplo, las fusiones típicamente emplean secuencias líder de otras especies para permitir la expresión recombinante de una proteína en un anfitrión heterólogo. Otra fusión útil incluye la adición de un dominio inmunológico activo, como por ejemplo un epítopo de anticuerpo, para facilitar la purificación de la proteína de fusión. La inclusión de un sitio de escisión en o cerca de la conexión de fusión facilitará la extracción del polipéptido extraño luego de la purificación. Otras fusiones útiles incluyen la conexión de dominios funcionales, como por ejemplo sitios activos de enzimas, dominios de glicosilación, señales de direccionamiento celular o regiones de transmembrana.

Una fusión de particular interés incluiría una construcción de deleción que carezca del sitio fosfatasa de TS10q23.3 pero que contenga otras regiones que puedan unirse a la molécula sustrato. La fusión a un polipéptido que pueda usarse para la purificación del complejo sustrato-TS10q23.3 serviría para aislar el sustrato para su identificación y análisis.

Ejemplos de sistemas de expresión de proteínas de fusión incluyen los sistemas glutatiiona S-transferasa (GST) (Pharmacia, Piscataway, NJ), de proteína enlazante de maltosa (NEB, Beverley, MA), FLAG (IBI, New Haven, CT) y 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA).

Algunos de estos sistemas producen polipéptidos recombinantes que llevan sólo un número pequeño de aminoácidos adicionales que son poco probable que afecten la capacidad antigénica del polipéptido recombinante. Por ejemplo, tanto el sistema FLAG como el 6xHis agregan sólo secuencias cortas, ambos se conocen por ser antigénicos deficientes y no afectan adversamente el doblado del polipéptido a su conformación.

En todavía otros sistemas, es posible crear construcciones de proteínas de fusión para incrementar la inmunogeneicidad de un TS10q23.3. El uso de construcciones de fusión para potenciar la inmunogenicidad es bien conocido por las personas versadas en el arte. Por ejemplo, una fusión de TS10q23.3 con un antígeno auxiliar como, por ejemplo, hsp70 o secuencias peptídicas tales como una cadena de la toxina de la difteria o una citoquina como la IL2 serán útiles para inducir una respuesta inmune. En otras materializaciones, se pueden hacer construcciones de fusión que potencien el direccionamiento de las composiciones relacionadas al TS10q23.3 a una célula o sitio específicos. Por ejemplo, fusionar TS10q23.3 o una proteína tipo TS10q23.3 a un ligando es un medio efectivo de direccionar la composición a un sitio que exprese el receptor para dicho ligando. De esta manera el TS10q23.3 o una composición relacionada a TS10q23.3 puede ser repartida a una célula por medio de un reparto mediado por un receptor. La proteína TS10q23.3 puede unirse covalentemente o fusionarse a un ligando. Esto puede utilizarse como un mecanismo de reparto a una célula. El ligando con la proteína ligada puede entonces ser internalizado por una célula que lleve el receptor.

Otros sistemas de fusión producen híbridos de polipéptido cuando es deseable escindir el socio de fusión del polipéptido deseado. En una materialización, el socio de fusión se une al polipéptido TS10q23.3 recombinante mediante una secuencia peptídica que contiene una secuencia de reconocimiento específico para una proteasa. Ejemplos de secuencias apropiadas son aquellas reconocidas por la Virus proteasa del virus Tobacco Etch (Life Technologies, Gaithersburg, MD) o el Factor Xa (New England Biolabs, Beverley, MA).

F. Purificación de proteínas

Es deseable purificar TS10q23.3 o sus variantes. Las técnicas de purificación de proteínas son bien conocidas para aquellas personas versadas en el arte. Estas técnicas involucran, en un nivel, el fraccionamiento crudo del medio celular en fracciones de polipéptido y no polipéptido. Habiéndose separado el polipéptido de las otras proteínas, el polipéptido de interés puede ser ulteriormente purificado mediante técnicas cromatográficas y electroforéticas para lograr una purificación parcial o completa (o purificación a homogeneidad). Los métodos analíticos particularmente apropiados para la preparación de un péptido puro son la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de exclusión ; la electroforesis en gel de poliacrilamida; enfoque isoeléctrico. Un método particularmente eficiente de purificar péptidos es la cromatografía líquida rápida de proteínas o aún HPLC.

Ciertos aspectos de esta invención conciernen a la purificación, y en materializaciones específicas, a la purificación sustancial, de una proteína o péptido codificado. El término "proteína o péptido purificado" como se usa en este documento, se refiere a una composición, aislable de otros componentes, donde la proteína o el péptido es purificado a un grado cualquiera deseado con respecto a su estado naturalmente obtenible. Por lo tanto, una proteína o péptido purificado también se refiere a una proteína o péptido, libre del medio en el que puede ocurrir naturalmente.

Generalmente, "purificado" se referirá a una composición de proteína ó péptido que ha sido sujeta a fraccionamiento para extraer diversos otros componentes y que retiene sustancialmente su actividad biológica expresada. Cuando se use el término "sustancialmente purificado", esta designación se referirá a una composición en la que la proteína o el péptido forma el componente principal de la misma, de manera que constituya aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o más de las proteínas en la composición.

A la luz de esta divulgación, una persona versada en el arte conocerá diversos métodos para cuantificar el grado de purificación de la proteína o el péptido. Estos métodos incluyen, por ejemplo, la determinación de la actividad específica de una fracción activa o la evaluación de la cantidad de polipéptidos dentro de una fracción mediante un análisis SDS/PAGE. Un método preferido de evaluar la pureza de una fracción es calcular la actividad específica de la misma, compararla a la actividad específica del extracto inicial, y entonces calcular el grado de pureza, evaluada aquí mediante un "número de veces de purificación" ("-fold purificación number"). La unidad que se utilice en realidad para representar la cantidad de la actividad será, por supuesto, dependiente de la técnica de evaluación elegida para seguir la purificación y de si la proteína o péptido expresados exhiben una actividad que pueda detectarse.

Una persona versada en el arte conocerá diversas técnicas apropiadas para la purificación de proteínas. Estas incluyen, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos y similares o por desnaturalización por calor, seguida de centrifugación; pasos cromatográficos tales como, por ejemplo, intercambio iónico, filtración en gel, fase inversa, hidroxilapatita y cromatografía de afinidad; enfoque isoeléctrico; electroforesis en gel; y combinaciones de las mismas y otras técnicas. Como se conoce generalmente en el arte, se cree que se puede cambiar el orden en que se lleven a cabo los diversos pasos de la purificación u omitir algunos de ellos, y aún así llegar a un método apropiado para la preparación de una proteína o péptido substancialmente purificado.

No hay ningún requisito general de que la proteína o el péptido se proporcionen siempre en su estado de mayor purificación. Por cierto, se contempla que productos menos purificados sean de utilidad en ciertas materializaciones. La purificación parcial puede lograrse usando en combinación menos etapas de purificación o utilizando formas diferentes del mismo esquema general de purificación. Por ejemplo, se puede notar que una cromatografía de columna de intercambio catiónico realizada en un aparato HPLC resultará en una purificación X veces mayor que la misma técnica llevada a cabo en un sistema cromatográfico a baja presión. Los métodos que exhiben un grado menor de purificación relativa pueden tener ventajas en lo que hace a la recuperación total de la proteína o a la preservación de la actividad de la proteína expresada.

Se sabe que la migración de un polipéptido puede variar, a veces significativamente, con las diferentes condiciones de SDS/PAGE (Capaldi et al, 1977). Por lo tanto, se podrá apreciar que, bajo diferentes condiciones de electroforesis, puede variar el peso molecular aparente de los productos de expresión purificados o parcialmente purificados.

La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC, por sus siglas en inglés) se caracteriza por una separación muy rápida con una resolución de picos extraordinaria. Esto se logra mediante el uso de partículas muy finas y presiones altas para mantener un caudal adecuado. La separación puede lograrse en cuestión de minutos, o a lo sumo en una hora. Más aún, sólo se necesita un volumen muy pequeño de la muestra porque las partículas son tan pequeñas y muy empaquetadas que el espacio vacío es una fracción muy pequeña del volumen del lecho. También, la concentración de la muestra no necesita ser muy grande porque las bandas son tan angostas que hay muy poca dilución de la muestra.

La cromatografía en gel, o cromatografía en tamices moleculares, es un tipo especial de partición cromatográfica que se basa en el tamaño molecular. La teoría de la cromatografía en gel es que la columna, la que se prepara con partículas minúsculas de una sustancia inerte de poros pequeños, separa las moléculas más grandes de las más pequeñas a medida que pasan a través o alrededor de los poros, dependiendo de su tamaño. En la medida que el material de las partículas no adsorba las moléculas, el único factor determinante de la velocidad de flujo es el tamaño. Por lo tanto, las moléculas se elucionan de la columna en tamaños decrecientes, siempre que la forma sea relativamente constante. La cromatografía en gel no tiene parangón para separar moléculas de diferentes tamaños porque la separación es independiente de todos los otros factores tales como pH, fuerza iónica, temperatura, etc. Virtualmente no hay ninguna adsorción, la separación de zonas es menor y el volumen de elución se relaciona de una manera simple con el peso molecular.

La cromatografía de afinidad es un procedimiento cromatográfico que descansa en la afinidad específica entre la sustancia a ser aislada y la molécula a la que puede unirse específicamente. Esta es una interacción de tipo receptor-ligando. El material de la columna se sintetiza acoplando covalentemente uno de los socios de la unión a una matriz insoluble. El material de la columna es capaz entonces de adsorber específicamente la sustancia de la solución. La elución ocurre cambiando las condiciones a aquellas en las cuales no ocurrirá la unión (modificando el pH, la fuerza iónica, la temperatura, etc.).

Un tipo especial de cromatografía de afinidad útil para la purificación de compuestos que contengan carbohidratos es la cromatografía de afinidad de lectinas. Las lectinas son una clase de sustancias que se unen a una diversidad de polisacáridos y glucoproteínas. Las lectinas se acoplan normalmente a la agarosa por el bromuro de cianógeno. La conconavalina A acoplado a la sefarosa fue el primer material de esta clase que se usó y ha sido ampliamente empleado para aislar polisacáridos y glucoproteínas. Otras lectinas que se han empleado incluyen la lectina de lenteja, el aglutinante de germen de trigo que ha sido útil en la purificación de residuos de N-acetil glucosaminilo y la lectina de Helix pomatia. Las mismas lectinas se purifican usando cromatografía de afinidad con ligandos carbohidrato. Se ha usado lactosa para purificar lectinas de ricino (Ricinus comunis) y maní; la maltosa ha sido útil en la extracción de lectinas de las lentejas y del frijol papa (Canavalia ensiformis); la N-acetil-D galactosamina se usa para purificar lectinas de la soja; el N-acetil glucosaminilo se enlaza a lectinas del germen de trigo; se ha utilizado D-galactosamina para obtener lectinas de almejas y la L-fucosa se une a las lectinas de las plantas de lotus.

La matriz debe ser una sustancia que no adsorba moléculas de ninguna manera significativa y que tenga un rango amplio de estabilidad química, física y térmica. El ligando debe acoplarse de tal manera que no afecte sus propiedades de enlace. El ligando debe proporcionar también una unión relativamente fuerte y debe ser posible elucionar la sustancia sin destruir la muestra o el ligando. Una de las formas más comunes de la cromatografía de afinidad es la cromatografía de inmunoafinidad. En lo que sigue se discute la generación de anticuerpos que cuyo uso sería apropiado de acuerdo con esta invención.

G. Péptidos sintéticos

Esta invención también describe péptidos más pequeños relacionados al TS10q23.3 para uso en diversas materializaciones de la misma. Debido a su tamaño relativamente pequeño, los péptidos de la invención también pueden sintetizarse en solución o sobre un soporte sólido de acuerdo con técnicas convencionales. Diversos sintetizadores automatizados se encuentran comercialmente disponibles y pueden ser usados de acuerdo con protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, Stewart y Young, (1984); Tarn et al., (1983); Merrifield, (1986); y Barany y Merrifield (1979), publicaciones que son incorporadas por referencia a este documento. Secuencias cortas de péptido, o genotecas de péptidos superpuestos, normalmente de aproximadamente 6 a aproximadamente 35 a 50 aminoácidos, los que corresponden a las regiones seleccionadas descritas en este documento, pueden ser fácilmente sintetizadas y luego examinadas mediante ensayos de evaluación diseñados para identificar péptidos reactivos. Alternativamente, se pueden emplear métodos de la ingeniería genética para insertar en un vector de expresión una secuencia de nucleótidos que codifique un péptido de la invención, transformar o transfectar el vector en una célula hospedadora apropiar y cultivar bajo condiciones apropiadas para la expresión.

La patente de los Estados Unidos Nº 4.554.101 (incorporada a este documento por referencia) también enseña la identificación y preparación de epítopos a partir de las secuencias de aminoácidos primarios sobre la base de la hidrofilicidad. A través de los métodos divulgados por Hopp, una persona versada en el arte seria capaz de identificar epítopos dentro de cualquier secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de las secuencias de ADN divulgadas en este documento.

H. Composiciones de antígenos

Esta invención también provee por el uso de proteínas o péptidos de TS10q23.3 como antígenos para la inmunización de animales en relación a la producción de anticuerpos. Se contempla que ya sea el TS10q23.3, o porciones del mismo, sean acopladas, enlazadas, unidas, conjugadas o conectadas químicamente a uno o más agentes por medio de aminoácidos ligadores, poliligadores o derivados. Esto puede llevarse a cabo de tal manera que se produzca una vacuna o composición de especificidad dual o multivalente. Además, se considera que los métodos utilizados en la preparación de estas composiciones serán familiares para aquellas personas versadas en el arte y serán apropiadas para ser administradas a animales, es decir, que sean farmacológicamente aceptables. Los agentes preferidos como portadores son la hemocianina del molusco Megathura crenulata (lapa californiana) (KLH, por sus siglas en inglés) o la albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés).

III. Ácidos nucleicos

Esta invención también provee, en otra materialización, genes que codifiquen TS10q23.3. Se han identificado genes para la molécula TS10q23.3 humana, canina y murina. Esta invención no se limita en su alcance a estos genes, sin embargo, ya que una persona versada en el arte, utilizando estos ácidos nucleicos, podría fácilmente identificar homólogos relacionados en diversas otras especies (por ejemplo, ratas, conejos, monos, gibones, chimpancés, simios, mandriles, vacas, cerdos, caballos, ovejas, gatos y otras especies). El haber encontrado homólogos de ratón y perro hace verosímil que otras especies más cercanas al hombre tengan también un homólogo.

Además, debería estar claro que esta invención no se limita a los ácidos nucleicos específicos divulgados en este documento. Como se discute en lo que sigue, un "gene TS10q23.3" puede contener una diversidad de bases diferentes y, aún así, producir un polipéptido correspondiente que sea funcional y, en algunos casos, estructuralmente indistinguible de los genes humanos y de ratones divulgados en este documento.

De la misma manera, toda referencia a un ácido nucleico debe entenderse como englobando a una célula hospedadora que contenga ese ácido nucleico y, en algunos casos, sea capaz de expresar el producto de tal ácido nucleico. Además de las consideraciones terapéuticas, las células que expresen los ácidos nucleicos de esta invención pueden probar ser útiles en el contexto de una búsqueda de agentes para inducir, reprimir, inhibir, aumentar, interferir, bloquear, anular, estimular o potenciar la función del TS10q23.3.

A. Ácidos nucleicos que codifican 10q23.3

El gene humano divulgado en las Figuras 6 y 9, y el murino divulgado en la Figura 9 son genes TS10q23.3 de esta invención. De acuerdo a esta invención, los ácidos nucleicos pueden codificar un gene TS10q23.3 completo, un dominio de TS10q23.3 que exprese una función supresora de tumores o fosfatasa, o cualquier otro fragmento de las secuencias de TS10q23.3 secuencias expuestas en este documento. El ácido nucleico puede derivarse del ADN genómico, es decir, clonado directamente del genoma de un organismo en particular. En las materializaciones preferidas, sin embargo, el ácido nucleico comprendería ADN complementario (ADNc). También se contempla un ADNc más un intrón natural o un intrón derivado de otro gene; dichas moléculas, manipuladas por métodos de la ingeniería genética, son referidas a veces como "mini-genes". Como mínimo, estos y otros ácidos nucleicos de esta invención pueden ser utilizados como estándares de pesos moleculares en, por ejemplo, la electroforesis en gel.

El termino "ADNc" se refiere a un ADN preparado utilizando el ARN mensajero (ARNm) como molde. La ventaja de usar un ADNc, en lugar del ADN genómico o un ADN polimerizado de un molde de ARN genómico, sin procesar o parcialmente procesado, es que el ADNc contiene principalmente secuencias codificantes de la proteína correspondiente. Puede haber situaciones en que se prefiera la secuencia genómica, total o parcial, como, por ejemplo, cuando se requieran regiones no codificantes para una expresión óptima o cuando las regiones no codificantes como, por ejemplo, los intrones sean el objetivo de una estrategia antisentido.

También se contempla que un dado TS10q23.3 de una especie en particular pueda ser representado por variantes naturales que tengan secuencias de ácidos nucleicos ligeramente diferentes pero que, a pesar de ello, codifiquen la misma proteína (véase la Tabla 1 siguiente).

Como se utiliza en esta solicitud, la frase "un ácido nucleico que codifica un TS10q23.3" se refiere a una molécula de ácido nucleico que haya sido aislada libre del ácido nucleico celular total. En las materializaciones preferidas, la invención concierne a una secuencia de ácidos nucleicos, básicamente como se expresa en las Figuras 6 y 9. La frase "como se expresa en las Figuras 6 y 9" significa que la secuencia de ácidos nucleicos corresponde sustancialmente a una porción de las Figuras 6 o 9. La frase "codón funcionalmente equivalente" se usa en este documento para referirse a codones que codifican el mismo aminoácido como, por ejemplo, los 6 codones para la arginina o serina (Tabla 1, abajo), y también se refiere a codones que codifican aminoácidos biológicamente equivalentes, como se discute en las páginas siguientes.

TABLA 1

Aminoácidos			Codones*
Alanina	Ala	A	GCA GCC GCG GCU
Cisteína	Cys	C	UGC UGU
Ácido aspártico	Asp	D	GAC GAU
Ácido glutámico	Glu	E	GAA GAG
Fenilalanina	Phe	F	UUC UUU
Glicina	Gly	G	GGA GGC GGG GGU
Histidina	His	H	CAC CAU
Isoleucina	He	I	AUA...AUC AUU
Lisina	Lys	K	AAA AAG
Leucina	Leu	L	UUA UUG CUA CUC CUG CUU
Metionina	Met	M	AUG
Asparagina	Asn	N	AAC AAU
Prolina	Pro	P	CCA CCC CCG CCU

TABLA 1 (continuación)

Aminoácidos			Codones*
Glutamina	Gin	Q	CAA CAG
Arginina	Arg	R	AGA AGG CGA CGC CGG CGU
Serina	Ser	S	AGC AGU UCA UCC UCG UCU
Treonina	Thr	T	ACA ACC ACG ACU
Valina	Val	V	GUA GUC GUG GUU
Triptófano	Trp	W	UGG
Tirosina	Tyr	Y	UAC UAU

Dando lugar a la degeneración del código genético, serán secuencias que son "establecidas en la Fig. 9" las secuencias que tengan al menos cerca de un 50%, normalmente al menos cerca de un 60%, más normalmente cerca de un 70%, aún más normalmente cerca de un 80%, preferentemente al menos cerca de un 90% y más preferentemente cerca de un 95% de nucleótidos que sean idénticos a los nucleótidos de la Fig. 9. Las secuencias que son esencialmente las mismas que las establecidas en la Fig. 9 pueden también definirse funcionalmente como secuencias capaces de hibridar a un segmento de ácido nucleico que contenga el complemento de la Fig. 9 bajo condiciones estándar.

Los segmentos de ADN de esta invención incluyen aquellos que codifican proteínas y péptidos funcionales biológicamente equivalentes a TS10q23.3, como se describe precedentemente. Tales secuencias pueden surgir como una consecuencia de una redundancia codónica y una equivalencia funcional aminoácida que se conocen que ocurren naturalmente dentro de las secuencias de ácido nucleico y las proteínas así codificadas. Alternativamente, las proteínas o péptidos funcionalmente equivalentes pueden crearse mediante la aplicación de métodos de la ingeniería genética, con los que se pueden generar, considerando las propiedades de los aminoácidos que son intercambiados. Los cambios diseñados por el hombre pueden introducirse mediante la aplicación de técnicas de mutagénesis dirigidas al sitio o pueden ser introducidos aleatoriamente y evaluados luego por la función deseada, como se describe más abajo.

B. Sondas y cebadores oligonucleótidos

Naturalmente, esta invención también engloba segmentos de ADN que son complementarios, o esencialmente complementarios, a la secuencia establecida en las Figuras 6 y 9. Las secuencias de ácido nucleico que son "complementarias" son aquellas capaces de apareamiento de bases de acuerdo con las reglas estándar de complementariedad de Watson-Crick. Como se usa en este documento, la frase "secuencias complementarias" significa secuencias de ácido nucleico que son sustancialmente complementarias, como puede ser evaluado mediante la misma comparación de nucleótidos establecida precedentemente, o como se define por ser capaz de hibridar al segmento de ácido nucleico de las Figuras 6 y 9 bajo condiciones relativamente estrictas como las que se describen en este documento. Tales secuencias pueden codificar la proteína TS10q23.3 completa o fragmentos, funcionales o no, de la misma.

Alternativamente, los segmentos hibridantes pueden ser oligonucleótidos más cortos. Secuencias de 17 bases de longitud deberían ocurrir sólo una vez en el genoma humano y, por lo tanto, sería suficiente especificar una única secuencia diana. Aunque los oligómeros más cortos son más fácil de producir e incrementar la accesibilidad in vivo, numerosos otros factores están involucrados en la determinación de la especificidad de la hibridación. Tanto la afinidad de unión como la especificidad de la secuencia de un oligonucleótido a su diana complementaria aumentan con el aumento de la longitud. Se contempla que se usarán oligonuclétidos ejemplares de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más pares de bases, aunque otros son también contemplados. También se contemplan polinucleótidos más largos, codificando 250, 500, 1000, 1212, 1500, 2000, 2500, 3000 o 3431 bases y aún más largos. Tales oligonucleótidos tendrán uso, por ejemplo, como sondas en Southern y Northern blots (transferencias Southern y Northern) y como cebadores en reacciones de amplificación.

Las condiciones apropiadas de hibridación son bien conocidas para las personas versadas en el arte. En ciertas aplicaciones, por ejemplo, en sustituciones de aminoácidos por mutagénesis dirigida a un sitio, se reconoce que se necesitan condiciones menos severas. Bajo estas condiciones, la hibridación puede ocurrir aún cuando las secuencias de la sonda y la hebra diana no sean perfectamente complementaria, si no que están mal emparejadas en una o más posiciones. Condiciones menos severas pueden lograrse aumentando la concentración de la sal y bajando la temperatura. Por ejemplo, una condición de severidad media puede proporcionarse mediante una solución de NaCl aproximadamente 0.1 a 0.25 M, a temperaturas desde aproximadamente 37ºC a aproximadamente 55ºC, mientras que una condición de baja severidad puede ser proporcionada por una solución de aproximadamente 0.15 M a aproximadamente 0.9 M de la sal, a temperaturas entre aproximadamente 20ºC y aproximadamente 55ºC. Por lo tanto, las condiciones de hibridación pueden ser fácilmente manipuladas y, por lo tanto, serán un método de elección dependiendo de los
resultados deseados.

En otras materializaciones, la hibridación puede lograrse mediante, por ejemplo, 50 mM de Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM de KCl, 3 mM de MgCl_{2}, 10 mM de ditiotreitol, a temperaturas entre aproximadamente 20ºC y aproximadamente 37ºC. Otras condiciones de hibridación utilizadas podrían incluir aproximadamente 10 mM de Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM de KC1, 1.5 uM de MgCl_{2}, a temperaturas entre aproximadamente 40ºC y aproximadamente 72ºC. Formamida y SDS también pueden ser usados para modificar las condiciones de hibridación.

Un método de usar sondas y cebadores de esta invención es la búsqueda de genes relacionados al TS10q23.3 o, más específicamente, homólogos del TS10q23.3 de otras especies. La existencia de un homólogo murino enfáticamente sugiere que otros homólogos del TS10q23.3 humano se descubrirán en especies más cercanas, y aún más remotas, quizás, que el ratón. Normalmente, el ADN diana será un genómico o una genoteca de ADNc, aunque la evaluación puede involucrar un análisis de las moléculas de ARN. Variando la severidad de la hibridación y la región de la sonda, se pueden descubrir diferentes grados de homología.

Otra manera de explotar las sondas y cebadores de esta invención es una mutagénesis dirigida por un sitio o de sitio específico. La mutagénesis de sitio específico es una técnica útil para la preparación de péptidos individuales, o de proteínas o péptidos funcionalmente equivalentes de un punto de vista biológico, por medio de la mutagénesis específica del ADN subyacente. La técnica, además, proporciona una capacidad fácilmente disponible para preparar y ensayar variantes de secuencias, incorporando una o más de las consideraciones precedentes, mediante la introducción de uno o más cambios de la secuencia de nucleótidos en el ADN. La mutagénesis de sitio específico permite la producción de mutantes a través del uso de secuencias de oligonucleótidos específicas que codifican la secuencia del ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia de cebador de suficiente tamaño y complejidad de la secuencia como para formar un dúplex estable a ambos lados de la conexión de la deleción que se recorre. Típicamente, se prefiere un cebador de aproximadamente 17 a 25 nucleótidos de longitud, con aproximadamente de 5 a 10 residuos a ambos lados de la secuencia que se altera.

La técnica típicamente emplea un vector bacteriófago que existe tanto en forma monocatenaria como bicatenaria. Los vectores típicos para una mutagénesis dirigida por un sitio incluyen vectores tales, como por ejemplo, el fago Ml 3. Estos vectores fagos se encuentran disponibles comercialmente y su uso es generalmente bien conocido por las personas versadas en el arte. En mutagénesis dirigida por un sitio también se usan de rutina plásmidos bicatenarios, lo que elimina la etapa de transferir el gene de interés de un fago a un plásmido.

En general, la mutagénesis dirigida por un sitio se lleva a cabo obteniendo primero un vector monocatenario, o la fusión de dos hebras de un vector bicatenario que incluya dentro de su secuencia una secuencia de ADN codificante de la proteína deseada. Se prepara sintéticamente un cebador oligonucleótido que acarree la secuencia mutada deseada. Este cebador es entonces apareado con el preparado de ADN monocatenario, tomando en cuenta el grado de desapareamiento cuando se seleccionen las condiciones de hibridación, y sujeto a enzimas polimerizantes de ADN como, por ejemplo, el fragmento de Klenow de la polimerasa I de E. coli, para completar la síntesis de la hebra que acarrea la mutación. Por lo tanto, se forma un heterodúplex donde una hebra codifica la secuencia no mutada original y la segunda hebra acarrea la mutación deseada. Se usa entonces este vector heterodúplex para transformar las células apropiadas como, por ejemplo, células de E. coli, y se seleccionan clones que incluyan vectores recombinantes que acarreen el arreglo de la secuencia mutada.

La preparación de variantes de secuencias del gene seleccionado utilizando mutagénesis dirigida por un sitio se proporciona como un medio de producir especies potencialmente útiles y no tiene el propósito de ser limitante, ya que hay otras maneras en que se pueden obtener variantes de las secuencias de los genes. Por ejemplo, los vectores recombinantes que codifican el gene deseado pueden ser tratados con agentes mutagénicos como, por ejemplo, la hidroxilamina, para obtener variantes de la secuencia.

C. Construcciones antisentido

En algunos casos, los supresores de tumores mutantes pueden no ser no funcionales. En vez, pueden tener funciones aberrantes que no pueden ser superadas por terapia génica de reemplazo, aún cuando la molécula de "tipo salvaje" sea expresada en cantidades excesivas del polipéptido mutante. Los tratamientos antisentido son una manera de responder a esta situación. La tecnología antisentido también puede usarse para inhibir ("knock-out") la función del TS10q23.3 en el desarrollo de líneas de células de ratón transgénico con fines de investigación, diagnóstico y evaluación.

La metodología antisentido se aprovecha del hecho que los ácidos nucleicos tienden a aparearse con secuencias "complementarias". Por complimentaria se entiende se entiende que los polinucleótidos son aquellos que son capaces de apareamiento de bases de acuerdo con las reglas estándar de complementariedad de Watson-Crick. Esto es, las purinas más grandes aparearán bases con las pirimidinas más pequeñas para formar combinaciones de guanina apareada con citosina (G:C) y de adenina apareada con ya sea timina (A:T) en el caso del ADN, o adenina apareada con uracil (A:U) en el caso del ARN. La inclusión de bases menos comunes como, por ejemplo, inosina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina y otras en secuencias hibridantes no interfiere con el apareamiento.

Tomar como diana de los polinucleótidos a un ADN bicatenario conduce a la formación de una triple hélice, y tomar como diana a un ARN conduce a la formación de una doble hélice. Cuando los polinucleótidos antisentido son introducidos en una célula diana, éstos se unen específicamente a su polinucleótido diana e interfieren con la transcripción, el procesamiento del ARN, el transporte, la traducción y/o la estabilidad. Las construcciones de ARN antisentido, o de ADN codificante de dichos ARN antisentido, pueden ser empleadas para inhibir la transcripción o la traducción de genes o ambas dentro de una célula anfitriona, ya sea in vitro o in vivo, como por ejemplo dentro de un animal anfitrión, incluso un ser humano.

Las construcciones antisentido pueden ser diseñadas para unirse al promotor y a otras regiones de control, exones, intrones o aún las fronteras exón-intrón de un gene. Se contempla que las construcciones antisentido más efectivas incluirán regiones complementarias a las zonas de unión intrón/exón. Por lo tanto, se propone que una materialización preferida incluya una construcción antisentido con complementariedad a las regiones dentro de 50-200 bases de una zona de empalme intrón-exón. Se ha observado que algunas secuencias de exón pueden ser incluidas en la construcción sin afectar seriamente la selectividad diana de la misma. La cantidad de material exónico incluido variará dependiendo de las secuencias específicas de exón e intrón utilizadas. Se puede fácilmente verificar si se ha incluido demasiado ADN del exón simplemente por ensayo de las construcciones in vitro para determinar si está afectada ya sea la función normal celular o la expresión de los genes relacionados que tengan secuencias complementarias.

Como ya sea ha expresado anteriormente, "complementaria" o "antisentido" significa secuencias de polinucleótidos que son sustancialmente complementarias en toda su longitud y tienen muy pocos desapareamiento de bases. Por ejemplo, secuencias de quince bases de longitud pueden ser llamadas complementarias cuando tienen nucleótidos complementarios en trece o catorce posiciones. Naturalmente, las secuencias que sean completamente complementarias serán secuencias que son enteramente complementarias a lo largo de toda su longitud y no tienen ningún desapareamiento de bases. También se contemplan otras secuencias con grados menores de homología. Por ejemplo, se podría diseñar una construcción antisentido que tenga regiones limitadas de alta homología, pero que también contenga una región no homóloga (por ejemplo, un ribosoma; véase más abajo). Estas moléculas, aunque tengan menos de un 50% de homología, podrían unirse a secuencias diana bajo las condiciones apropiadas.

Puede ser ventajoso combinar porciones de ADN genómico con ADNc o secuencias sintéticas para generar construcciones específicas. Por ejemplo, cuando se desee un intrón en la construcción final, se necesitará usar un clon genómico. El ADNc o polinucleótido sintetizado puede proporcionar sitios de restricción más convenientes para la porción restante de la construcción y, por lo tanto, sería usado para el resto de la secuencia.

D. Ribozimas

Otro enfoque para dirigirse al supresor de tumores mutante "negativo dominante" es mediante el uso de ribozimas. Aunque tradicionalmente se han usado proteínas para la catálisis de ácidos nucleicos, ha surgido otra clase de macromoléculas que son útiles para este esfuerzo. Las ribozimas son complejos ARN-proteína que escinden los ácidos nucleicos en sitios específicos. Las ribozimas tienen dominios catalíticos específicos que poseen actividad endonucleasa (Kim y Cook, 1987; Gerlach et al. 1987; Forster y Symons, 1987). Por ejemplo, un número grande de ribozimas aceleran las reacciones de transferencia fosfoéster con un alto grado de especificidad, a menudo escindiendo sólo uno de los diversos fosfoésteres en un sustrato oligonucleótido (Cook et al., 1981; Michel y Westhof, 1990; Reinhold-Hurek y Shub, 1992). Esta especificidad se ha atribuido al requisito de que el sustrato se una mediante interacciones de apareamiento de bases específicas a la secuencia guía interna ("IGS", por sus siglas en inglés) de la ribozima antes de la reacción química.

La catálisis por ribozimas se ha observado principalmente como parte de reacciones de escisión y ligación de secuencia específica que involucran ácidos nucleicos (Cook et al., 1981). Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos Nº No. 5.354.855 informa que ciertas ribozimas pueden actuar como endonucleasas con una especificidad de secuencia mayor que las ribonucleasas conocidas y que se aproxima a la de las enzimas de restricción del ADN. Por lo tanto, la inhibición de secuencia específica mediada por la ribozima de la expresión génica puede ser particularmente apropiada para aplicaciones terapéuticas (Scanlon et al., 1991; Sarver et al., 1990). Recientemente se informó que las ribozimas inducen cambios genéticos en algunas de las líneas de células a las que fueron aplicadas; los genes alterados incluyeron los oncogenes H-ras, c-fos y los genes del VIH. La mayoría de este trabajo involucró la modificación de un ARNm diana, y se basó en un codón mutante específico que es escindido por una ribozima específica.

E. Vectores para la clonación, la transferencia y la expresión génica

En ciertas materializaciones, los vectores de expresión se emplean para expresar el producto polipeptídico de TS10q23.3, el que puede entonces ser purificado y, por ejemplo, utilizado para vacunar animales para generar antisueros o anticuerpos monoclonales con los que se pueden llevar a cabo estudios adicionales. En otras materializaciones, los vectores de expresión se utilizan en terapia génica. La expresión requiere que se provean en los vectores señales apropiadas, las que incluyen diversos elementos regulatorios, tales como potenciadores/promotores de fuentes víricas y mamíferas que conduzcan la expresión de los genes de interés en las células anfitrionas. También se definen elementos diseñados para optimizar la estabilidad y traducibilidad del ARN mensajero en las células anfitrionas. Se proporcionará también las condiciones para el uso de un número de marcadores de selección de droga dominantes para establecer clones celulares estables permanentes, como es un elemento que conecta la expresión de los marcadores de selección de droga a la expresión del polipéptido.

(i) Elementos reguladores

Promotores. En toda esta solicitud, el término "construcción de expresión" tiene el propósito de incluir todo tipo de construcción genética que contenga un ácido nucleico que codifique para productos génicos y en la que toda o parte de la secuencia codificante del ácido nucleico sea capaz de ser transcrita. El transcrito puede ser traducido en una proteína, pero no es necesario que lo sea. En ciertas materializaciones, la expresión incluye tanto la transcripción de un gene como la traducción de ARNm en un producto génico. En otras materializaciones, la expresión sólo incluye la transcripción de los genes codificantes del ácido nucleico de interés.

El ácido nucleico que codifica un producto génico se encuentra bajo el control transcripcional de un promotor. Un "promotor" se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintetizante de la célula, o la maquinaria sintetizante introducida, requerida para iniciar la transcripción específica de un gene. La frase "bajo control transcripcional" significa que el promotor esta en la ubicación y orientación correctas con relación al ácido nucleico para controlar la iniciación de la ARN polimerasa y la expresión del gene.

El término promotor se usará aquí para referirse al grupo de módulos de control transcripcional agrupados alrededor del sitio de iniciación de la ARN polimerasa II. Muchas de las ideas acerca de como los promotores están organizados se derivan de los análisis de diversos promotores víricos, incluyendo aquellos para la timidina kinasa (tk) del virus herpes simplex (HSV) y las unidades de transcripción temprana SV40. Estos estudios, aumentados por trabajos más recientes, han mostrado que los promotores están compuestos de módulos funcionales discretos, cada uno consistente en aproximadamente 7-20 bp de ADN, y con unos o más sitios de reconocimiento de proteínas activadoras o represoras de la transcripción.

Al menos uno de los módulos de cada promotor funciona para posicionar el sitio de iniciación para la síntesis de ARN. El ejemplo mejor conocido es la caja TATA, pero en algunos promotores que carecen de la caja TATA, como por ejemplo, el promotor para el gene mamífero de la deoxinucleotidil transferasa terminal y el promotor para los genes tar-
díos SV40, un elemento discreto ubicado por encima del sitio de iniciación mismo ayuda a fijar el lugar de iniciación.

Elementos adicionales del promotor regulan la frecuencia de la iniciación de la transcripción. Típicamente, estos elementos están ubicados en la región 30-110 bp corriente arriba del sitio de inicio, aunque recientemente se ha demostrado que un número de promotores también contienen elementos funcionales corriente abajo del sitio de inicio. El espaciamiento entre elementos del promotor es frecuentemente flexible, de tal manera que la función promotor se conserva cuando los elementos se invierten o se mueven en relación del uno al otro. En el promotor tk, el espaciamiento entre los elementos del promotor puede incrementarse a 50 bp antes de que la actividad comience a declinar. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden funcionar ya sea cooperativa o independientemente para activar la transcripción.

No se cree que sea importante el promotor específico que se emplee para controlar la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés, siempre que sea capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico en la célula diana. Por lo tanto, para una célula diana humana, es preferible posicionar la región codificante del ácido nucleico adyacente a un promotor, y bajo su control, que sea capaz de ser expresado en una célula humana. Hablando en términos generales, dicho promotor podría incluir un promotor ya sea humano o vírico.

En diversas materializaciones, se pueden utilizar el promotor génico temprano inmediato del citomegalovirus (CMV) humano, el promotor temprano SV40, la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, la p-actina, el promotor de la insulina en ratas y la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa para obtener un alto nivel de expresión de la secuencia codificante de interés. Se contempla también la utilización de otros promotores celulares víricos o mamíferos o fágicos bacteriales bien conocidos en el arte para lograr la expresión de una secuencia codificante de interés, siempre que los niveles de expresión sean suficientes para un propósito dado. Se puede optimizar el nivel y el patrón de la expresión de la proteína de interés luego de la transfección o transformación, mediante el uso de un promotor con propiedades bien conocidas.

La selección de un promotor que sea regulado en respuesta a señales sintéticas o fisiológicas específicas puede permitir la expresión inducible del producto génico. Por ejemplo, en el caso de que la expresión de un transgene, o transgenes si se utiliza un vector multicistrónico, sea tóxica para las células en las cuales se produce el vector, puede ser deseable prohibir o reducir la expresión de uno o más de los transgenes. Ejemplos de transgenes que pueden ser tóxicos para la línea de células productoras son los genes pro-apoptóticos y citoquinos. Diversos sistemas de promotores inducibles se encuentran disponibles para la producción de vectores virales donde el producto transgénico pueda ser tóxico.

El sistema ecdisona (Invitrogen, Carlsbad, CA) es uno de esos sistemas. El mismo está diseñado para permitir la expresión regulada de un gene de interés en células mamíferas. Consiste en un mecanismo de expresión estrechamente regulado que virtualmente no permite ninguna expresión del transgene a nivel basal, pero tiene una inducibilidad de más de 200 veces. El sistema se basa en el receptor de ecdisona heterodimérico de la Drosophila, y cuando la ecdisona o un análogo como la muristerona A se une al receptor, éste activa un promotor para iniciar la expresión del transgene corriente abajo, obteniéndose alto niveles de transcritos de ARNm. En este sistema, ambos monómeros del receptor heterodimérico son expresados constitutivamente de un vector, mientras que el promotor sensible a la ecdisona que dirige la expresión del gene de interés está en otro plásmido. Sería por lo tanto útil realizar este tipo de sistema en el vector de transferencia génica de interés. La cotransfección de plásmidos que contengan el gene de interés y los monómeros del receptor en las líneas de células productoras permitiría entonces la producción del vector de transferencia génica sin la expresión de un transgene potencialmente tóxico. En el momento apropiado, la expresión del transgene puede ser activada con ecdisona o muristerona A.

Otros sistemas inducibles que podrían ser útiles son los sistemas Tet-Off™ o Tet-On™ (Clontech, Palo Alto, CA) desarrollado originalmente por Gossen y Bujard (Gossen y Bujard, 1992; Gossen et al., 1995). Estos sistemas permiten que niveles altos de expresión génica sean regulados en respuesta a la tetraciclina o derivados de la misma como, por ejemplo, la doxiciclina. En el sistema Tet-On™, la expresión génica se activa en la presencia de doxiciclina, mientras que en el sistema Tet-Off™, la expresión génica se activa en la ausencia de doxiciclina. Estos sistemas se basan en dos elementos reguladores derivados del operón de resistencia a la tetraciclina del E. coli, la secuencia del operador de tetraciclina al cual se enlaza el represor de tetraciclina y la proteína represora de tetraciclina. El gene de interés es clonado en un plásmido detrás de un promotor que tiene presente los elementos que responden a la tetraciclina. Un segundo plásmido contiene un elemento regulador llamado el transactivador controlado por la tetraciclina, el que está compuesto, en el sistema Tet-Off™, del dominio VP16 del virus herpes simplex y del represor de la tetraciclina de tipo salvaje. Por lo tanto, en la ausencia de doxiciclina, la transcripción está constitutivamente activa. En el sistema Tet-On™, el represor de la tetraciclina no es de tipo salvaje y en la presencia de doxiciclina activa la transcripción. Para la producción de vectores para terapia génica, sería preferible el sistema Tet-Off^{M} de tal manera que las células productoras pudieran crecer en la presencia de tetraciclina o doxiciclina y prevenir la expresión de un transgene potencial-
mente tóxico, pero cuando el vector se introdujera al paciente, la expresión génica estaría constitutivamente activada.

En algunas circunstancias puede ser deseable regular la expresión de un transgene en un vector de terapia génica. Por ejemplo, se pueden utilizar distintos promotores víricos con diversas intensidades de actividad dependiendo del nivel deseado de expresión. En células mamíferas, se usa a menudo el promotor temprano inmediato CMV para proveer una activación intensa de la transcripción. También se han usado versiones modificadas del promotor CMV que son menos potentes, cuando se desean niveles reducidos de expresión del transgene. Cuando se desea la expresión de un transgene en células hematopoéticas, a menudo se utilizan promotores retrovíricos tales como los LTR de MLV o MMTV. Otros promotores víricos que pueden usarse dependiendo del efecto deseado incluyen SV40, RSV LTR, HIV-1 y HIV-2 LTR, promotores adenovirales tales como las de las regiones ElA, E2A o MLP, AAV LTR, virus del mosaico de la coliflor, HSV-TK y virus del sarcoma de las aves.

Similarmente, se pueden usar promotores de tejido específico para efectuar la transcripción en tejidos o células específicos para reducir la toxicidad potencial o los efectos indeseables para los tejidos que no son el objetivo. Por ejemplo, promotores tales como PSA, probasina, fosfatasa del ácido prostático o calicreína glandular específico de la próstata (hK2) pueden ser utilizados para la expresión génica en la próstata. De la misma manera, los siguientes promotores pueden utilizarse para dirigir la expresión génica en otros tejidos (Tabla 2).

TABLA 2 Promotores de tejido específico

Tejido	Promotor
Páncreas	insulina
	elastina
	amilasa
	pdr-1 pdx-1
	glucoquinasa
Hígado	albúmina EPCK
	potenciador HBV
	a-fetoproteína
	apolipoproteína C
	alfa-1 antitripsina
	vitelogenina, NF-AB
	Transtiretina
Músculo esquelético	cadena H de la miosina
	creatina quinasa muscular
	distrofina
	calpaina p94
	alfa-actina esquelética
	troponina 1 rápida

TABLA 2 (continuación)

Tejido	Promotor
Piel	queratina K6
	queratina Kl
Pulmón	CFTR
	citoqueratina humana 18 (K18)
	proteínas surfactantes pulmonares A, B y C
	CC-10
	PI
Músculo suave	sm22 alfa
	SM-alfa-actina
Endotelio	endotelina-1
	E-selectina
	Factor de von Willebrand
	TIE (Korhonen et al., 1995)
	KDR/flk-1
Melanocitos	tirosinasa
Tejido adiposo	lipoproteína lipasa (Zechner et al., 1988)
	adipsina (Spiegelman et al., 1989)
	acetil-CoA carboxilasa (Pape y Kim, 1989)
	glicerofosfato deshidrogenasa (Dani et al., 1989)
	adipocito P2 (Hunt et al., 1986)
Sangre	p-globina

En ciertas indicaciones, puede ser deseable activar la transcripción en momentos especificados luego de la administración del vector de terapia génica. Esto puede lograrse con promotores que sean regulables por hormonas o citoquinas. Por ejemplo, en aplicaciones de terapia génica donde la indicación es un tejido gonadal en el que producen o introducen esteroides específicos, puede ser ventajoso el uso de promotores regulados por andrógeno o estrógeno. Estos promotores regulables por hormonas incluyen MMTV, MT-1, ecdisona y RuBisco. Se espera que otros promotores regulados por hormonas como, por ejemplo, promotores que responden a las hormonas tiroidea, pituitaria y suprarrenal también sean útiles en esta invención. Promotores que responden a la citoquiina y la proteína inflamatoria que pueden utilizarse Quininógeno K y T (Kageyama et al., 1987), c-fos, TNF-alfa, proteína C-reactiva (Arcone et al., 1988), haptoglobina (Oliviero et al., 1987), suero amiloide A2, C/EBP alfa, IL-1, IL-6 (Poli y Cortese, 1989), Complemento C3 (Wilson et al., 1990), IL-8, ácido glucoproteína alfa-1 (Prowse y Baumann, 1988), antitipsina alfa-1, lipoproteína lipasa (Zechner et al., 1988), angiotensinógeno (Ron et al., 1991), fibrinógeno, c-jun (inducible por ésteres forbólicos, TNF-alfa, radiación UV, ácido retinoico y peróxido de hidrógeno), colagenasa (inducida por ésteres forbólicos y ácido retinoico), metalotioneina (inducible por metales pesados y glucocorticoides), Estromelisina (inducible por forbol éster, interleuquina-1 y EGF), macroglobulina alfa-2 y antiquimotripsina alfa-1.

Se contempla que los promotores regulables por el ciclo celular puedan ser útiles en esta invención. Por ejemplo, en un vector para terapia génica bicistrónica, el uso de un promotor CMV fuerte para conducir la expresión de un primer gene como, por ejemplo, p16 que detenga las células en la fase Gl podría ser seguido por la expresión de un segundo gene como, por ejemplo, p53 bajo el control de un promotor que sea activo en la fase Gl del ciclo celular, proveyendo, por lo tanto, un "segundo golpe" que podría empujar a la célula a la apoptosis. Podrían usarse otros promotores como, por ejemplo, los de diversas ciclinas, PCNA, galectina-3, E2F1, p53 y BRCA1.

Se pueden usar también promotores de tumores específicos como, por ejemplo, osteocalcina, elemento que responde a la hipoxia (HRE), MAGE-4, CEA, alfa-fetoproteína, GRP78/BiP y tirosinasa para regular la expresión génica en células de tumores. Otros promotores que también podrían usarse de acuerdo a esta invención incluyen aquellos regulados por Lac, inducibles por quimioterapia (por ejemplo, MDR), y promotores inducibles por calor (hipertermia), inducibles por radiación (por ejemplo, EGR (Joki et al., 1995)), alfa-inhibina, ARN pol III tARN met y otros promotores aminoácidos, Ul snARN (Bartlett et al., 1996), MC-1, PGK, 3-actina y a-globina. Muchos otros promotores que pueden ser útiles se listan en Walther y Stein (1996).

Se contempla que cualquiera de los promotores presentes, solos o en combinación con otros, puedan ser útiles de acuerdo con esta invención dependiendo de la acción deseada. Además, esta lista de promotores no debe interpretarse como exhaustiva o limitante, ya que aquellos versados en el arte conocerán otros promotores que pueden ser utilizados conjuntamente con los promotores y métodos divulgados en este documento.

Potenciadores: Los potenciadores son elementos genéticos que incrementan la transcripción desde un promotor localizado en una posición distante de la misma molécula de ADN. Los potenciadores se organizan de una manera similar a los promotores. Esto es, están compuestos de muchos elementos individuales, cada uno de los cuales se enlaza a una o más proteínas de transcripción. La distinción básica entre potenciadores y promotores es operacional. Una región potenciadora en su conjunto debe ser capaz de estimular la transcripción a distancia; esto no es necesariamente verdad de una región promotora o de sus elementos componentes. Por otra parte, un promotor debe tener uno o más elementos que dirijan la iniciación de la síntesis de ARN en un sitio y en una orientación específicos, mientras que los potenciadores carecen de esa especificidad. A menudo, los promotores y los potenciadores son contiguos y superpuestos y parecen tener una organización modular muy similar.

Abajo se presenta una lista de promotores adicionales a los promotores de tejido específico que se listaron precedentemente, promotores/potenciadores celulares e inducibles que pudieran usarse en combinación con el ácido nucleico que codifique un gene de interés en una construcción de expresión (Tabla 3 y Tabla 4). Además, cualquier combinación promotor/potenciador (según la Base de Datos de Promotores Eucarióticos, EPDB por sus siglas en inglés) podría también utilizarse para conducir la expresión del gene. Las células eucarióticas pueden sostener una transcripción citoplásmica desde ciertos promotores bacterianos si se provee la polimerasa bacteriana apropiada, ya sea como parte del complejo de reparto o como una construcción de expresión genética adicional.

TABLA 3

Promotor/Potenciador

Cadena pesada de la inmunoglobulina

Cadena liviana de la inmunoglobulina

Receptor de las células T

HLA DQ\alpha y DQ\beta

Interferón \beta

Interleuquina 2

Receptor de la interleuquina 2

MHC Clase II 5

MHC Clase II HLA-DR\alpha

Actina \beta

Creatina quinasa muscular

Prealbúmina (Transtiretina)

Elastasa I

Metalotioneína

Colagenasa

Gene de la albúmina

Fetoproteína \alpha

Globina \tau

Globina \beta

E-fos

TABLA 3 (continuación)

Promotor/Potenciador

c-HA-ras

Insulina

Molécula de adhesión celular (NCAM)

Antitripsina \alpha1

H2B (TH2B) histona

Colágeno tipo I o de ratón

Proteínas reguladas por glucosa (GRP94 y GRP78)

Hormona de crecimiento de las ratas

Suero amiloide humano A (SAA)

Troponina I

Factor de crecimiento derivado de plateletas

Distrofia muscular Duchenne

SV40

Polioma

Retrovirus

Virus papiloma

Virus de la hepatitis B

Virus de la inmunodeficiencia humana

Citomegalovirus

Virus de la leucemia de simios y gibones

TABLA 4

Elemento	Inductor
MT II	Éster de forbol (TPA)
	Metales pesados
MMTV (virus del tumor mamario en ratones)	Glucocorticoides
Interferón \beta	Poli(rI)X
	Poli(rc)
Adenovirus 5 E2	Ela
c-jun	Éster de forbol (TPA), H_{2}O_{2}
Colagenasa	Éster de forbol (TPA)
Estromelisina	Éster de forbol (TPA), IL-1

TABLA 4 (continuación)

Elemento	Inductor
SV40	Éster de forbol (TPA)
Gene MX murino	Interferón, virus de la enfermedad de Newcastle
Gene GRP78	A23187
Macroglobulina \alpha-2	IL-6
Vimentina	Suero
MHC Clase I Gene H-2kB	Interferón
HSP70	Ela, antígeno T grande SV40
Proliferina	Éster de forbol (TPA)
Factor de necrosis de tumores	FMA
Gene de la hormona \alpha estimulante de la tiroides	Hormona de la tiroides
Caja de la insulina E	Glucosa

Señales de poliadenilación. Cuando se emplea un inserto de ADNc, típicamente se deseará incluir una señal de poliadenilación para efectuar la poliadenilación apropiada del gene transcrito. No se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la práctica exitosa de esta invención, y puede utilizarse cualquiera de esas secuencias como, por ejemplo, la hormona del crecimiento humano o bovino y las señales de poliadenilación SV40. También se contempla que un elemento del casete de expresión sea un terminador. Estos elementos pueden servir para incrementar los niveles del mensaje y minimizar la ultralectura del casete a las otras secuencias.

IRES. En ciertas materializaciones de la invención, se contempla el uso de elementos del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) para crear mensajes multigénicos o policistrónicos. Los elementos IRES son capaces de evitar el modelo de escaneo ribosómico de la traducción dependiente de la caperuza metilada 5' y comenzar la traducción en los sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988). Los elementos IRES de dos miembros de la familia de picornavirus (poliovirus y encefalomiocarditis) han sido descritos (Pelletier y Sonenberg, 1988), así como un IRES de un mensaje mamífero (Macejak y Sarnow, 1991). Los elementos IRES pueden conectarse a marcos de lectura abiertos heterólogos. Los marcos de lectura abiertos múltiples pueden ser transcritos juntos, cada uno separado por un IRES, creando mensajes policistrónicos. Por virtud del elemento IRES, cada marco de lectura abierto es accesible a los ribosomas para una traducción eficiente. Múltiples genes pueden ser expresados eficientemente usando un promotor/potenciador único para transcribir un mensaje único.

Cualquier marco de lectura abierto heterólogo puede ser conectado a elementos IRES. Esto incluye genes para proteínas secretadas, proteínas de subunidades múltiples, codificada por genes independientes, proteínas intracelulares o unidas a la membrana y marcadores seleccionables. De esta manera, la expresión de varias proteínas puede ser simultáneamente realizada en una célula con una construcción y un marcador seleccionable únicos.

(ii) Marcadores seleccionables

En ciertas materializaciones de la invención, las células contienen construcciones de ácido nucleico de esta invención; una célula puede ser identificada in vitro o in vivo incluyendo un marcador en la construcción de expresión. Dichos marcadores conferirían a la célula un cambio identificable permitiendo una fácil identificación de las células que contengan la construcción de expresión. Normalmente, la inclusión de un marcador de selección de droga ayuda en la clonación y en la selección de transformantes; por ejemplo, genes que confieran resistencia a la neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol son marcadores seleccionables útiles. Alternativamente, enzimas tales como, por ejemplo, la timidina quinasa (tk) del virus herpes simplex o la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) pueden ser empleadas. También se pueden emplear marcadores inmunológicos. No se cree que el marcador seleccionable empleado sea importante, siempre que sea capaz de ser expresado simultáneamente con el ácido nucleico que codifique un producto génico. Ejemplos adicionales de marcadores seleccionables son bien conocidos por las personas capacitadas en el arte.

(iii) Reparto de los vectores de expresión

Existe un cierto número de maneras por las cuales se pueden introducir vectores de expresión en las células. En ciertas materializaciones de la invención, la construcción de expresión comprende un virus o una construcción de la ingeniería genética derivada de un genoma vírico. La capacidad de ciertos virus de entrar en las células mediante endocitosis mediada por receptor para integrarse en el genoma de la célula anfitriona y expresar genes víricos de una manera estable y eficiente los ha convertido en candidatos atractivos para transferir genes foráneos en células de mamíferos (Ridgeway, 1988; Nicolas y Rubenstein, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Temin, 1986). Los primeros virus que se utilizaron como vectores génicos fueron virus de ADN incluidos los papovavirus (virus simio 40, virus papiloma bovino y polioma) (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986) y los adenovirus (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986). Estos tiene una capacidad relativamente baja para secuencias de ADN foráneo y un espectro anfitrión restringido. Además, sus efectos oncogénicos y citopáticos potenciales en células permisivas presentan cuestiones de seguridad. Sólo pueden acomodar hasta 8 kb material genético foráneo, pero pueden ser fácilmente introducidos en una diversidad de líneas de células y animales de laboratorio (Nicolas y Rubenstein, 1988; Temin, 1986). El vector puede ser capaz de replicarse dentro de las células. En la alternativa, el vector puede ser una replicación deficiente y replicarse en células auxiliares antes del reparto. Se conocen vectores apropiados, como se divulga en la patente de los Estados Unidos Nº 5.252.479 y la solicitud de patente publicada conforme al PCT WO 93/07282 y las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.691.198; 5.747.469; 5.436.146 y 5.753.500.

Adenovirus. Uno de los métodos preferidos para un reparto in vivo involucra el uso de un vector de expresión adenoviral. La frase "vector de expresión adenoviral" incluye aquellas construcciones que contengan secuencias de adenovirus suficientes para (a) soportar el empaquetamiento de la construcción y (b) expresar un polinucleótido antisentido que ha sido clonado en el lugar. En este contexto, la expresión no requiere que el producto génico sea sintetizado.

El vector de expresión comprende una forma de adenovirus obtenida mediante métodos de la ingeniería genética. El conocimiento de la organización genética del adenovirus, un virus de ADN bicatenario, lineal, de 36 kb, permite la sustitución de pedazos grandes de ADN adenovírico con secuencias foráneas de hasta 7 kb (Grunhaus y Horwitz, 1992). En contraste con el retrovirus, la infección adenovírica de las células anfitrionas no resulta en una integración cromosómica porque el ADN adenovírico puede replicarse de una manera episómica sin genotoxicidad potencial. Además, los adenovirus son estructuralmente estables, y no se ha detectado ningún reacomodo del genoma luego de una amplificación extensa. El adenovirus puede virtualmente infectar a todas las células epiteliales sin importar su etapa del ciclo celular. Por el momento, la infección adenovírica parece estar conectada sólo con enfermedades leves como, por ejemplo, la enfermedad respiratoria aguda en los humanos.

El adenovirus es particularmente apropiado para ser utilizado como un vector de transferencia génica debido a su genoma de tamaño medio, fácil de manipular, de alto título, con una amplia gama de células diana y altamente infeccioso. Ambos extremos del genoma vírico contienen 100-200 repeticiones reversas de pares de bases (ITR, por sus siglas en inglés), elementos cis necesarios para la replicación y el empaquetamiento del ADN vírico. Las regiones temprana (E) y tardía (L) del genoma contienen unidades de transcripción diferentes que son divididas por el comienzo de la replicación del ADN vírico. La región E1 (ElA y E1B) codifica proteínas responsables de la regulación de la transcripción del genoma vírico y unos pocos genes celulares. La expresión de la región E2 (E2A y E2B) resulta en la síntesis de las proteínas para la replicación del ADN vírico. Estas proteínas están involucradas en la replicación del ADN, la expresión génica tardía y el cierre de la célula (Renan, 1990). Los productos de los genes tardíos, incluyendo la mayoría de las proteínas de la cápsida vírica, son expresados sólo luego de un procesamiento significativo de un transcrito primario único emitido por el promotor tardío principal (MLP, por sus siglas en inglés). El MLP, (ubicado en 16.8 m.u.) es particularmente eficaz durante la fase tardía de la infección, y todos los ARNm emitidos de este promotor poseen una secuencia líder triparental 5'-(TPL) que los hace los ARNm preferidos para la traducción.

En un sistema actual, el adenovirus recombinante se genera mediante una recombinación homóloga entre el vector lanzadera y el vector provirus. Debido a todas las posibles recombinaciones entre dos vectores províricos, el adenovirus de tipo salvaje puede ser generado por este proceso. Por lo tanto, es crítico aislar a un clon único del virus de una placa individual y examinar su estructura genómica.

La generación y propagación de los vectores adenovirales actuales, que son de replicación deficiente, depende de una línea de células auxiliares única, designada como 293, la que fue transformada de células renales embriónicas humanas por fragmentos de ADN de Ad5 y constitutivamente expresa proteínas El (Graham et al., 1977). Ya que se puede prescindir de la región E3 del genoma del adenovirus (Jones y Shenk, 1978), los vectores adenovirales actuales, con el auxilio de las células 293, llevan el ADN foráneo ya sea en la región El, la D3 o en ambas (Graham y Prevec, 1991). En la naturaleza, el adenovirus puede empaquetar aproximadamente 105% del genoma de tipo salvaje (Ghosh-Choudhury et al., 1987), proveyendo una capacidad de cerca de 2 kb extra de ADN. Combinado con los aproximadamente 5.5 kb de ADN que es reemplazable en las regiones El y E3, la capacidad máxima del vector adenoviral actual está por debajo de los 7.5 kb, o aproximadamente 15% de la longitud total del vector. Más de un 80% del genoma vírico del adenovirus permanece en el esqueleto del vector y es la fuente de la citotoxicidad acarreada por el vector. También, la deficiencia de replicación del virus delecionado por El es incompleta. Por ejemplo, se ha observado filtración de la expresión génica viral con los vectores actualmente disponibles a altas multiplicidades de infección (MOI) (Mulligan, 1993).

Las líneas de células auxiliares pueden derivarse de células humanas tales como células renales embriónicas humanas, células musculares, células hematopoyéticas u otras células mesenquimáticas o epiteliales. En la alternativa, las células auxiliares pueden derivarse de las células de otras especies de mamíferos que sean permisivas para el adenovirus humano. Dichas células incluyen, por ejemplo, células Vero u otras células mesenquimáticas o epiteliales de los monos. Como se expresa con anterioridad, la línea de células auxiliares preferida es la 293.

Recientemente, Racher et al., (1995) divulgaron métodos mejorados para cultivar células 293 y propagar el adenovirus. En un formato, se hacen crecer agregados de células naturales mediante la inoculación de las células individuales en matraces rotatorios siliconados de 1 litro (Techne, Cambridge, UK) que contienen 100-200 ml de medio de cultivo. Luego de agitar a 40 rpm, se estima la viabilidad de la célula con azul de tripano. En otro formato, se emplean microportadores Fibra-Cel (Bibby Sterlin, Stone, UK) (5 g/l) como se describe a continuación. Un inóculo celular se resuspende en 5 ml de medio, se agrega al portador (50 ml) en un matraz de Erlenmeyer de 250 ml y se deja en reposo, agitando de vez en cuando, de 1 a 4 horas. Se reemplaza entonces el medio con 50 ml de medio fresco y se comienza a agitar. Para producir el virus, se deja crecer las células hasta aproximadamente un 80% de confluencia, luego de lo cual se reemplaza el medio (al 25% del volumen final) y se agrega el adenovirus a un MOI de 0,05. Los cultivos se dejan reposar durante la noche luego de lo cual se incrementa el volumen al 100% y se comienza a agitar por otras 72 horas.

De no ser por el requisito de que el vector adenovirus sea de replicación deficiente, o al menos condicionalmente deficiente, no se cree que la naturaleza del vector adenoviral sea crucial para la práctica exitosa de la invención. El adenovirus puede ser cualquiera de los 42 distintos serotipos o subgrupos A-F conocidos. El adenovirus tipo 5 del subgrupo C es el material de iniciación preferido para obtener el vector adenoviral de replicación condicionalmente deficiente para ser usado en esta invención. Esto se debe a que el adenovirus tipo 5 es un adenovirus humano acerca del cual se conoce una gran cantidad de información bioquímica y genética e, históricamente, se ha utilizado para la mayoría de las construcciones que emplean el adenovirus como vector. Como se ha expresado con anterioridad, el vector típico de acuerdo con esta invención es de replicación deficiente y no tendrá una región E1 del adenovirus. Por lo tanto, lo más conveniente será introducir el polinucleótido que codifica el gene de interés en la posición de la cual se han quitado las secuencias codificantes de E1. Sin embargo, la posición de inserción de la construcción dentro de las secuencias del adenovirus no es crítica para esta invención. El polinucleótido que codifica el gene de interés también puede insertarse en lugar de la región E3 delecionada en vectores de reemplazo de E3 como lo describen Karlsson et al., (1986) o en la región E4 donde una línea de células auxiliares o un virus auxiliar complementa el defecto de E4.

El adenovirus es fácil de cultivar y manipular y exhibe un amplio rango anfitrión in vitro e in vivo. Este grupo de virus puede obtenerse en títulos altos, por ejemplo, de 10^{9} a 10^{11} unidades formadoras de placas por ml, y es altamente infeccioso. El ciclo de vida del adenovirus no requiere integración en el genoma de la célula anfitriona. Los genes foráneos repartidos por los vectores adenovirales son episómicos y, por lo tanto, tienen baja genotoxicidad para las células anfitrionas. No se ha informado de ningún efecto colateral en estudios de vacunación con adenovirus de tipo salvaje (Couch et al., 1963; Top et al., 1971), lo que demuestra su seguridad y potencial terapéutico como vector de transferencia génica in vivo.

Los vectores adenovirales se han utilizado en la expresión de genes eucarióticos (Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992) y en el desarrollo de vacunas (Grunhaus y Horwitz, 1992; Graham y Prevec, 1991). Recientemente, estudios con animales han sugerido que el adenovirus recombinante podría utilizarse para una terapia génica (Stratford-Perricaudet y Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993). Los estudios de administración de adenovirus recombinante a distintos tejidos incluyen instilación en la tráquea (Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992), inyección muscular (Ragot et al., 1993), inyecciones intravenosas periféricas (Herz y Gerard, 1993) y inoculación estereotáctica en el cerebro (Le Gal La Salle et al., 1993).

Retrovirus. Los retrovirus son un grupo de virus de ARN monocatenario caracterizados por una capacidad de convertir su ARN a ADN bicatenario en las células infectadas por un proceso de transcripción inversa (Coffin, 1990). El ADN resultante entonces se integra en forma estable en el cromosoma celular como un provirus y dirige la síntesis de proteínas víricas. La integración resulta en la retención de las secuencias génicas víricas en la célula receptora y sus descendientes. El genoma retrovírico contiene tres genes, gag, pol y env que codifican para las proteínas de la cápsida, la enzima polimerasa, y los componentes de la envoltura, respectivamente. Se encontró una secuencia corriente arriba del gene gag que contiene una señal para empaquetar el genoma en viriones. Dos secuencias de repeticiones terminales largas (LTR) están presentes en los extremos 5' y 3' del genoma vírico. Estas contienen secuencias robustas de promotor y potenciador y son también requeridas para la integración en el genoma de la célula anfitriona (Coffin, 1990).

Para construir un vector retroviral, se inserta un ácido nucleico que codifique a un gene de interés en el genoma vírico en el lugar de ciertas secuencias víricas para producir un virus de replicación deficiente. Para producir viriones, se construye una línea de células empaquetadoras que contengan los genes gag, pol y env pero sin las LTR y los componentes de empaquetamiento (Mann et al., 1983). Cuando un plásmido recombinante que contenga un ADNc, junto con las LTR retrovirales y las secuencias de empaquetamiento, se introduce en esta línea de células (por precipitación con fosfato de calcio, por ejemplo), la secuencia de empaquetamiento permite al transcrito de ARN del plásmido recombinante ser empaquetado en las partículas virales, las que entonces son secretadas en el medio de cultivo (Nicolas y Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Se recoge entonces el medio que contiene los retrovirus recombinantes, opcionalmente se lo concentra y se lo usa para la transferencia génica. Los vectores retrovirales son capaces de infectar una amplia gama de tipos de células. Sin embargo, la integración y expresión estable requiere la división de las células (Paskind et al., 1975).

Recientemente se desarrolló un planteo novedoso diseñado para permitir el direccionamiento específico de los vectores retrovirales basándose en la modificación química de un retrovirus mediante la adición química de residuos de lactosa a la envoltura del virus. Esta modificación podría permitir la infección específica de hepatocitos vía receptores de sialoglicoproteína.

Un planteo distinto de direccionar los retrovirus recombinantes utiliza anticuerpos biotinilados contra la proteína del envoltorio retroviral y contra un receptor de célula específica. Los anticuerpos se acoplan por medio de los componentes de la biotina utilizando estreptavidina (Roux et al., 1989). Usando anticuerpos contra los antígenos de clase I y clase II de los complejos de histocompatilidad principales, se demostró la infección de diversas células humanas que acarrean estos antígenos de superficie con un virus ecotrópico in vitro (Roux et al., 1989).

Hay ciertas limitaciones en el uso de vectores retrovirales en todos los aspectos de esta invención. Por ejemplo, los vectores retrovirales normalmente se integran en sitios al azar del genoma de la célula. Esto puede conducir a una mutagénesis insercional por medio de la interrupción de los genes anfitriones o por medio de secuencias reguladoras víricas que pueden interferir con la función de los genes flanqueantes (Varmus et al., 1981). Otra preocupación relacionada con el uso de vectores retrovirales deficientes es la aparición potencial de virus de tipo salvaje capaces de replicación en las células de empaquetamiento. Esto puede resultar de una recombinación de eventos en los que la secuencia intacta del virus recombinante se inserte corriente arriba de la secuencia gag, pol, env integrada en el genoma de la célula anfitriona. Sin embargo, nuevas líneas de células de empaquetamiento se encuentran ahora disponibles, lo que debería disminuir grandemente las chances de recombinación (Markowitz et al., 1988; Hersdorffer et al., 1990).

Herpesvirus. Ya que el virus herpes simplex (HSV) es neurotrópico, ha generado un interés considerable para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso. Más aún, la capacidad del HSV de establecer infecciones latentes en células neuronales que no se dividen sin integrarse en el cromosoma de la célula anfitriona o de otra manera alterar el metabolismo de la misma, junto con la existencia de un promotor que es activo durante la latencia, ha convertido al HSV en un vector atractivo y, aunque se ha prestado mucha atención a las aplicaciones neurotrópicas del HSV, este vector también puede ser explotado para otros tejidos dado su amplio rango anfitrión.

Otro factor que hace que el HSV sea un vector atractivo es el tamaño y la organización del genoma. Dado que el HSV es grande, la incorporación de genes múltiples o de casetes de expresión es menos problemática que en otros sistemas virales más pequeños. Además, la disponibilidad de distintas secuencias de control viral de diverso rendimiento (temporal, intensidad, etc.) hacen posible controlar la expresión en una medida mayor que en otros sistemas. Tiene también la ventaja de que el virus posee relativamente pocos mensajes empalmados, lo que facilita aún más las manipulaciones genéticas.

El HSV es también relativamente fácil de manipular y puede cultivarse a títulos altos. Por lo tanto, el reparto es menos problemático, tanto en término de los volúmenes necesarios para alcanzar un MOI suficiente como en la menor necesidad de repetir las dosis. Para una revisión del HSV como vector para la terapia genética, véase Glorioso et al. (1995).

Los HSV, designados con los subtipos 1 y 2, son virus envueltos que se encuentran entre los agentes infecciosos más comunes para el ser humano, infectando millones de sujetos en todo el mundo. El genoma de ADN bicatenario, complejo y grande codifica para docenas de productos génicos diferentes, algunos de los cuales se derivan de transcritos empalmados. Además del virión y de los componentes estructurales de la envoltura, el virus codifica otras numerosas proteínas, entre las que se incluyen una proteasa, una reductasa de ribonucleótidos, una ADN polimerasa, una proteína enlazante de ADNmc, una helicasa/primasa, una ATPasa dependiente del ADN, una dUTPasa y otras.

Los genes HSV forman diversos grupos cuya expresión se regula coordinadamente y se ordena secuencialmente en forma de cascada (Honess y Roizman, 1974; Honess y Roizman 1975; Roizman y Sears, 1995). La expresión de los genes a, el primer conjunto de genes a ser expresado luego de una infección, se potencia por la proteína viriónica número 16 o un factor transductor-a (Post et al., 1981; Batterson y Roiznarn, 1983; Campbell et al., 1983). La expresión de los genes p requiere a productos génicos funcionales a, notablemente ICP4, que se codifica por el gene ct4 (DeLuca et al., 1985). Los genes y, un grupo heterogéneo de genes que codifican principalmente proteínas estructurales del virión, requieren el comienzo de la síntesis de ADN vírico para una expresión óptima (Holland et al., 1980).

En línea con la complejidad del genoma, el ciclo de vida del HSV es bastante intrincado. Además del ciclo lítico, que resulta en la síntesis de partículas víricas y, finalmente, la muerte de la célula, el virus tiene la capacidad de entrar en un estado latente en el cual el genoma se mantiene en los ganglios neurales hasta que una señal no identificada todavía desencadena una recurrencia del ciclo lítico. Se han desarrollado variantes no virulentas del HSV que se encuentran fácilmente disponibles para usos en el contexto de terapias génicas (Patente de los Estados Unidos Nº 5,672,344).

Virus adeno-asociados. Recientemente, los virus adeno-asociados (AAV, por las siglas en inglés) han surgido como una alternativa potencial a los vectores retrovirales y adenovirales más comúnmente usados. Mientras que los estudios de transferencia génica mediada por retrovirus y adenovirus presentan inquietudes acerca de las posibles propiedades oncogénicas del primero de los nombrados, y problemas inmunogénicos asociados con el último, el AAV no ha sido asociado con ninguna de dichas indicaciones patológicas.

Además, el AAV posee varias características únicas que lo hacen más deseable que los otros vectores. Distinto de los retrovirus, el AAV puede infectar células que no se dividen; el AAV de tipo salvaje ha sido caracterizado por una integración, en una manera de sitio específico, en el cromosoma 19 de las células humanas (Kotin y Bems, 1989; Kotin et al., 1990; Kotin et al., 1991; Samulski et al., 1991); y el AAV también posee propiedades anti oncogénicas (Ostrove et al., 1981; Berns y Giraud, 1996). Los genomas de AAV recombinante se construyen clonando molecularmente las secuencias de ADN de interés entre los ITR del AAV, eliminando las secuencias codificantes completas del genoma de AAV de tipo salvaje. Los vectores AAV así producidos carecen de toda secuencia codificante de AAV de tipo salvaje, pero aún así retienen la propiedad de una integración cromosómica estable y la expresión de los genes recombinantes luego de la transducción tanto in vitro como in vivo (Berns, 1990; Berns y Bohensky, 1987; Bertran et al., 1996; Kearns et al., 1996; Ponnazhagan et al., 1997a). Hasta hace poco, se creía que el AAV infectaba a casi todos los tipos de células y que aún cruzaba la barrera entre las especies. Sin embargo, ahora se ha determinado que la infección de AAV es mediada por receptor (Ponnazhagan et al., 1996; Mizukami et al., 1996). El AAV utiliza un ADN monocatenario lineal de aproximadamente 4700 pares de bases. Repeticiones de terminal invertidas flanquean el genoma. Dos genes se encuentran presente dentro del genoma, dando lugar a un número de productos génicos distintos. El primero, el gene cap, produce tres proteínas de virión (VP, por sus siglas en inglés) diferentes, designadas VP-1, VP-2 y VP-3. El segundo, el gene rep, codifica para cuatro proteínas no estructurales (NS, por sus siglas en inglés). Uno o más de estos productos génicos rep es responsable por la transactivación de la transcripción del AAV. La secuencia del AAV está dada por Srivastava et al. (1983) y en la patente de los Estados Unidos Nº 5.252.479 (cuyo texto completo se incorpora a este documento mediante esta referencia).

Los tres promotores en el AAV están designados por su locación, en unidades de mapa, en el genoma. Estos son, de izquierda a derecha, p5, p19 y p40. La transcripción da lugar a seis transcritos, dos iniciados en cada uno de los tres promotores, con uno de cada par cortado y empalmado. El sitio de corte y empalme, derivado de las unidades 42-46 del mapa, es el mismo para cada transcrito. Las cuatro proteínas no estructurales se derivan aparentemente del más largo de los transcritos, y las tres proteínas del viriónicas surgen todas del más pequeños de los transcritos.

El AAV no está asociado con ningún estado patológico en los humanos. Es de interés que, para una replicación eficiente, el AAV requiere funciones de ayuda de virus tales como herpes simplex I y II, citomegalovirus, virus de la seudo rabia y, por supuesto, adenovirus. El auxiliar mejor caracterizado es el adenovirus, y muchas funciones "tempranas" de este virus se han demostrado que ayudan en la replicación del AAV. Se cree que los bajos niveles de expresión de las proteínas rep del AAV mantienen bajo control la expresión estructural del AAV y se piensa que la infección del virus auxiliar quita este bloqueo.

Virus vaccinia. Los vectores virales vaccinia se han usado extensamente por la facilidad de su construcción, los niveles relativamente altos de expresión obtenidos, el amplio rango anfitrión y la gran capacidad de acarrear ADN. El virus vaccinia contiene un genoma de ADN bicatenario lineal de aproximadamente 186 kb que exhibe una preferencia "A-T" marcada. Repeticiones terminales invertidas de 10.5 kb flanquean el genoma. La mayoría de los genes esenciales parecen mapear dentro de la región central, que es la más altamente conservada entre los poxvirus. El número de marcos de lectura abiertos en el virus vaccinia es entre 150 a 200. Aunque ambas hebras son codificantes, no es común una superpopsición extensa de marcos de lectura.

Se pueden insertar al menos 25 kb en el genoma del virus vaccinia (Smith y Moss, 1983). Los vectores vaccinia prototípicos contienen transgenes insertados en el gene viral de la timidina quinasa vía una recombinación homóloga. Los vectores se seleccionan sobre la base de un fenotipo tk. Incluyendo la secuencia líder sin traducir del virus de la encéfalomiocarditis, el nivel de expresión es más alto que el de los vectores convencionales, con los transgenes que acumulan 10% o más de la proteína de las células infectadas en 24 horas (Elroy-Stein et al., 1989).

Transferencia no viral. Para efectuar la expresión de construcciones génicas de sentido o antisentido, La construcción de expresión debe repartirse dentro de la célula. Este reparto puede lograrse in vitro, como en los procedimientos de laboratorio para transformar líneas de células, o in vivo o ex vivo, como en el tratamiento de ciertos estados de enfermedades. Un mecanismo para el reparto es vía infección viral donde la construcción de expresión es encapsidada en una partícula vírica infecciosa.

Esta invención contempla también diversos métodos no virales para la transferencia de construcciones de expresión en células mamíferas. Estos métodos incluyen precipitación con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe et al., 1990) DEAE-dextran (Gopal, 1985), electroporación (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), microinyección directa (Harland y Weintraub, 1985), liposomas cargados de ADN (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979) y complejos lipofectamina-ADN, sonicación celular (Fechheimer et al., 1987), bombardeo génico con microproyectiles de alta velocidad (Yang et al., 1990) y transfección mediada por receptor(Wu y Wu, 1987; Wu y Wu, 1988). Algunas de estas técnicas pueden adaptarse con éxito para un uso in vivo o ex vivo.

Una vez que la construcción de expresión ha sido repartida dentro de la célula, el ácido nucleico que codifica el gene de interés puede ser posicionado y expresado en sitios diferentes. En ciertas materializaciones, el ácido nucleico que codifica el gene puede integrarse de una manera estable en el genoma de las células. Esta integración puede ser en la locación y orientación afines vía una combinación homóloga (reemplazo génico) o puede ser al azar, en una locación no específica (aumentación génica). En aún otras materializaciones adicionales, el ácido nucleico puede ser mantenido en forma estable en la célula como un segmento episómico de ADN separado. Tales "episomas" o segmentos de ácido nucleico codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la replicación independientes del ciclo de la célula anfitriona, o en sincronía con dicho ciclo. Como se reparte la construcción de expresión a la célula y dónde en ésta permanece el ácido nucleico dependen del tipo de construcción de expresión empleado.

En aún otra materialización de la invención, la construcción de expresión puede consistir simplemente de ADN recombinante desnudo o plásmidos. La transferencia de la construcción puede realizarse mediante cualquiera de los métodos mencionados precedentemente que física o químicamente permeabilicen la membrana de la célula. Esto es aplicable particularmente para transferencias in vitro pero también puede ser aplicado para usos in vivo. Dubensky et al (1984) inyectaron con éxito ADN del poliomavirus en la forma de precipitados de fosfato cálcico en el hígado y el bazo de ratones adultos y recién nacidos, demostrando una replicación viral activa y una infección aguda. Benvenisty y Neshif (1986) también demostraron que la inyección intraperitoneal directa de plásmidos precipitados con fosfato de calcio resulta en la expresión de los genes transfectados. Se contempla que un ADN que codifique un gene de interés pueda también ser transferido de una manera similar in vivo y expresar el producto génico.

En todavía otra materialización de la invención, transferir una construcción de expresión de ADN desnudo dentro de células puede involucrar un bombardeo de partículas. Este método depende de la capacidad de acelerar microproyectiles recubiertos de ADN a una velocidad alta que les permita penetrar la membrana celular y entrar en las células sin matarlas (Klein et al., 1987). Se han desarrollado diversos dispositivos para acelerar partículas pequeñas. Uno de esos dispositivos depende de una descarga de alto voltaje para generar una corriente eléctrica, la que a su vez proporciona la fuerza motivo (Yang et al., 1990). Los microproyectiles utilizados han consistido de sustancias biológicamente inertes tales como bolitas de oro o tungsteno.

Se han bombardeado in vivo órganos seleccionados, incluyendo tejidos del hígado, la piel y los músculos de ratas y ratones (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Esto puede requerir la exposición quirúrgica del tejido o de las células para eliminar cualquier tejido intermedio entre el arma y el órgano diana, es decir, se puede requerir un tratamiento ex vivo. De nuevo, se puede repartir el ADN que codifica un gene particular mediante este método y todavía estar abarcado por esta invención.

En una materialización adicional de la invención, la construcción de expresión puede ser atrapada en un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana de doble capa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen capas múltiples de lípidos separadas por medios acuosos. Se forman espontáneamente cuando se suspenden fosfolípidos en un exceso de solución acuosa. Los componentes lípidos sufren una auto reacomodación antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las capas dobles de lípido (Ghosh y Bachhawat, 1991). También se contemplan complejos lipofec-
tamina-ADN.

El reparto de ácido nucleico mediado por liposomas y la expresión del ADN foráneo in vitro han sido muy exitosos. Wong et al., (1980) demostraron la factibilidad del reparto mediado por liposomas y la expresión de ADN foráneo en cultivos de embriones de pollo, células hepatomas y HeLa. Nicolau et al., (1987) llevaron a cabo con éxito la transferencia genética mediada por liposomas en ratas luego de una inyección intravenosa.

En ciertas materializaciones de la invención, el liposoma puede ser acomplejado con un virus hemaglutinante (HVJ). Se ha mostrado que esto facilita la fusión con la membrana de la célula y promueve la entrada celular del ADN encapsulado por liposoma (Kaneda et al., 1989). En otras materializaciones, el liposoma puede ser acomplejado o empleado conjuntamente con proteínas cromosómicas no histonas nucleares (HMG-1) (Kato et al., 1991). En aún otras materializaciones, el liposoma puede ser acomplejado o empleado conjuntamente con ambos HVJ y HMG-1. Se han utilizado con éxito dichas construcciones de expresión en la transferencia y expresión de ácidos nucleico in vitro e in vivo y son entonces aplicables a esta invención. Cuando se emplee un promotor bacteriano en la construcción de ADN, será también deseable incluir dentro del liposoma una polimerasa bacteriana apropiada.

Se pueden emplear otras construcciones de expresión para repartir un ácido nucleico que codifique un gene en particular dentro de células que sean vehículos de reparto mediado por receptores. Este método aprovecha la incorporación selectiva de macromoléculas por endocitosis mediada por receptores en casi todas las células eucarióticas. Debido al reparto de tipo de célula específico de varios receptores, el reparto puede ser altamente específico (Wu y Wu, 1993).

Los vehículos de direccionamiento génico generalmente consisten en dos componentes: un ligando de receptor específico celular y un agente enlazante de ADN. Se han utilizado diversos ligandos para la transferencia génica mediada por receptores. Los ligandos caracterizados más extensamente son el asialoorosomucoide (ASOR) (Wu y Wu, 1987) y transferrina (Wagner et al., 1990). Recientemente, se ha utilizado una neoglicoproteína sintética que reconoce el mismo receptor que ASOR como vehículo de reparto génico (Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994), y también se ha utilizado el factor de crecimiento epidérmico (EGF) para repartir genes a células de carcinoma escamosas (Myers, EPO 0273085).

En otras materializaciones, el vehículo de reparto puede comprender un ligando y un liposoma. Por ejemplo, Nicolau et al., (1987) emplearon lactosil-ceramida, un asialgangliósido de terminal galactosa, incorporado en los liposomas y observaran un aumento de la incorporación del gene de la insulina por los hepatocitos. Por lo tanto, es factible que un ácido nucleico que codifique un gene en particular también pueda ser repartido a tipos de células como, por ejemplo, pulmonares, epiteliales o tumorales, por un número de sistemas receptor-ligando con o sin liposomas. Por ejemplo, se puede utilizar el factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés) como el receptor para el reparto mediado de un ácido nucleico que codifique un gene en muchas células de tumores que exhiban regulación ascendente del receptor de EGF. Se puede utilizar manosa para dirigir al receptor de manosa a las células del hígado. De la misma manera, pueden utilizarse como porciones de direccionamiento a los anticuerpos contra CDS (CLL)_{S} CD22 (linfoma), CD25 (leucemia de la célula T) y MAA (melanoma).

En ciertas materializaciones, la transferencia génica puede llevarse a cabo más fácilmente bajo condiciones ex vivo. La terapia génica ex vivo se refiere al aislamiento de células de un animal, el reparto de un ácido nucleico a las células in vitro y el posterior regreso de las células modificadas al animal. Esto puede involucrar la separación quirúrgica de los tejidos u órganos de un animal o el cultivo primario de células y tejidos.

Los cultivos de células mamíferas primarias pueden prepararse de varias maneras. Para que las células permanezcan viables in vitro y en contacto con la construcción de expresión, es necesario asegurarse de que las células se mantengan en contacto con la proporción adecuada de oxígeno y dióxido de carbono y con nutrientes, pero que sean protegidas de toda contaminación microbiana. Las técnicas para el cultivo de células están bien documentadas y se divulgan en este documento por referencia (Freshner, 1992).

Una materialización de lo precedente involucra el uso de la transferencia génica para inmortalizar células para la producción de proteínas. El gene para la proteína de interés puede transferirse como se describió anteriormente a células anfitrionas apropiadas seguido por un cultivo de las células bajo condiciones apropiadas. El gene para virtualmente cualquier polipéptido puede emplearse de esta manera. La generación de los vectores de expresión recombinantes, y los elementos incluidos allí, se han discutido con anterioridad. En la alternativa, la proteína a ser producida puede ser una proteína endógena normalmente sintetizada por la célula en cuestión.

Ejemplos de líneas de células anfitrionas mamíferas de utilidad son las células Vero y HeLa y las líneas de células de ovario del hámster chino, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, NIH3T3, RIN y MDCK. Además, se puede elegir una cepa de células anfitrionas que module la expresión de las secuencias insertadas o que modifique y procese el producto génico de la manera deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamientos (por ejemplo, escisión) de los productos proteicos pueden ser importante para la función de la proteína. Las distintas células anfitrionas tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento y modificación de las proteínas luego de la traducción. Se pueden elegir las líneas de células o sistemas anfitriones apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína foránea expresada.

Se puede utilizar un número de sistemas de selección incluyendo, pero sin limitarse a ellos, la timidina quinasa del HSV, y los genes de la hipoxantina-guanina, la fosforribosiltransferasa y la adenina fosforribosiltransferasa genes, en las células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. También, se puede utilizar una resistencia anti-metabolito como la base de selección para: dhfr, que confiere resistencia a; gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico acid; neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G418; e higro, que confiere resistencia a la higromicina.

Las células animales pueden ser propagadas in vitro de dos modos: como células no dependientes del anclaje que crezcan en suspensión en toda la masa del cultivo o como células dependientes del anclaje que necesitan adherirse a un sustrato sólido para su propagación (es decir, un crecimiento de células de tipo monocapa).

Los cultivos no dependientes del anclaje o en suspensión de líneas de células establecidas continuas son los medios más ampliamente usados en la producción en gran escala de células y productos de células. Sin embargos, las células cultivadas en suspensión tienen sus limitaciones, como, por ejemplo, un potencial tumorigénico y una producción más baja de proteínas que las células T adherentes.

El cultivo en suspensión en gran escala de células mamíferas en tanques agitados es un método común para la producción de proteínas recombinantes. Dos diseños de reactores para cultivos en suspensión se encuentran en amplio uso: el reactor agitado y el reactor de arrastre por aire. El diseño agitado se ha utilizado exitosamente en un tanque de 8000 litros de capacidad para la producción de interferón. Se cultivan las células en un tanque de acero inoxidable con una relación de altura a diámetro de 1:1 a 3:1. El cultivo normalmente se mezcla con uno o más agitadores, basados en patrones de discos de cuchillas o hélice marina. Se han descrito sistemas de agitación que presentan fuerzas de corte menores que las cuchillas. La agitación puede ser accionada directa o indirectamente por impulsores magnéticamente acoplados. Los impulsores indirectos reducen el riesgo de una contaminación microbiana mediante sellos en los ejes de los agitadores.

El reactor de arrastre por aire, inicialmente descrito para fermentaciones microbianas y luego adaptado para cultivos mamíferos, se basa en una corriente de gas tanto para mezclar como para oxigenar el cultivo. La corriente de gas se introduce por una sección de entrada ascendente del reactor y provoca la circulación. El gas se desprende en la superficie del cultivo, causando que el líquido mas denso libre de las burbujas de gas, se desplace hacia abajo en la sección de salida descendente del reactor. Las ventajas principales de este diseño son su simplicidad y el no necesitar un mezclado mecánico. Típicamente, la relación altura a diámetro es de 10:1. El reactor de arrastre por aire es relativamente fácil de incrementar en escala, tiene una buena transferencia de masa de los gases y genera fuerzas de corte relativamente bajas.

Los anticuerpos de esta invención son particularmente útiles para el aislamiento de antígenos por inmunoprecipitación. La inmunoprecipitación involucra la separación del componente antígeno diana de una mezcla compleja, y se usa para discriminar o aislar cantidades diminutas de proteína. Para la aislación de las proteínas de la membrana, las células deben solubilizarse en micelas de detergente. Se prefieren sales no iónicas, dado que otros agentes, como por ejemplo las sales de la bilis, precipitan a un pH ácido o en presencia de cationes bivalentes. Los anticuerpos y sus usos se discuten en más detalle en lo que sigue.

III. Generación de anticuerpos reactivos con TS10q23.3

En otro aspecto, esta invención contempla un anticuerpo que sea inmunoreactivo con una molécula del TS10q23.3 de esta invención, o una porción de la misma. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. En una materialización preferida, el anticuerpo es monoclonal. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos son bien conocidos en el arte (véase, por ejemplo, Howell y Lane, 1988).

Brevemente, se prepara un anticuerpo policlonal inmunizando un animal con un inmunógeno que comprende un polipéptido de esta invención y colectando antisuero de ese animal inmunizado. Se puede utilizar una gama amplia de especies animales para la producción de antisuero. Típicamente, el animal utilizado para la producción de antisuero es un animal no humano, incluso conejos, ratones, ratas, hámsters, cerdos o caballos. Los conejos son una elección preferida para la producción de anticuerpos policlonales debido al relativamente alto volumen de sangre de estos animales.

Se pueden preparar anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, específicos para las isoformas de antígeno, utilizando técnicas de inmunización convencionales, como lo conocen generalmente las personas versadas en el arte. Se puede utilizar una composición que contenga epítopos antigénicos de los compuestos de esta invención para inmunizar uno o más animales experimentales, como por ejemplo un conejo o un ratón, que procederán entonces a producir anticuerpos específicos contra los compuestos de esta invención. Se puede obtener antisuero policlonal, luego de que se permita un tiempo para la generación de anticuerpos, simplemente mediante el sangrado del animal y la preparación de muestras de suero de la sangre entera.

Se propone que los anticuerpos monoclonales de esta invención serán útiles en procedimientos inmunoquímicos estándar, como, por ejemplo, los métodos ELISA y Western blot (transferencia Western), y en procedimientos inmunohistoquímicos tales como el tinte de tejidos, así como en otros procedimientos que puedan utilizar anticuerpos específicos a los epítopos de antígenos relacionados con TS10q23.3. Además, se propone que los anticuerpos monoclonales específicos a la TS10q23.3 en particular de las distintas especies pueden utilizarse en otras aplicaciones útiles.

En general, tanto los anticuerpos policlonales como los monoclonales contra TS10q23.3 pueden utilizarse en diversas materializaciones. Por ejemplo, pueden emplearse en protocolos de clonación de anticuerpos para obtener ADNc o genes codificantes que no sean el TS10q23.3. También pueden utilizarse en estudios de inhibición para analizar los efectos de péptidos relacionados con el TS10q23.3 en células o animales. Los anticuerpos anti-TS10q23.3 también serán útiles en estudios de inmunolocalización para analizar la distribución de TS10q23.3 durante diversos eventos celulares, por ejemplo, para determinar la distribución de células o tejidos específicos de polipéptidos de TS10q23.3 en distintos momentos del ciclo celular. Una aplicación particularmente útil de dichos anticuerpos es en la purificación de TS10q23.3 nativo o recombinante, por ejemplo, utilizando una columna de afinidad de anticuerpos. El funcionamiento de todas estas técnicas inmunológicas, será conocido por las personas capacitadas en el arte a la luz de esta divulgación.

Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos son bien conocidos en el arte (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988; incorporado en este documento por esta referencia). Otros ejemplos específicos de la preparación de un anticuerpo monoclonal se proporcionan en los ejemplos que siguen.

Como bien se conoce en el arte, una composición dada puede variar en su inmunogenicidad. Por lo tanto, es a menudo necesario reforzar el sistema inmune del anfitrión, como se puede lograr por acoplamiento de un inmunogene péptido o polipéptido a un portador. Ejemplos de portadores preferidos son hemocianina de Meghatura cronulata (lapa californiana) (KLH, por sus siglas en inglés) y la albúmina serológica bovina (BSA, por sus siglas en inglés). Otras albúminas tales como la ovalbúmina o la albúmina serológica de ratón o conejo pueden también utilizarse como portadores. Los medios para conjugar un polipéptido a una proteína portadora son bien conocidos en el arte e incluyen glutaraldehído, m-maleimidobencoil-N-hidroxisuccinimida éster, carbodiimida y bis-diazobencidina.

Como también es bien conocido en el arte, la inmunogenicidad de una composición inmunogénica particular puede incrementarse mediante el uso de estimuladores no específicos de la respuesta inmune, conocidos como adyuvantes. Ejemplos de los adyuvantes preferidos incluyen el adyuvante de Freund completo (un estimulador no específico de la respuesta inmune que contiene Mycobacterium tuberculosis muertos), los adyuvantes de Freund incompletos y el adyuvante hidróxido de aluminio.

La cantidad de la composición inmunogénica utilizada en la producción de anticuerpos de policlonales depende de la naturaleza del inmunógeno así como del animal utilizada para la inmunización. Diversas rutas pueden utilizarse para administrar el inmunogene (subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal). La producción de anticuerpos policlonales puede ser vigilada tomando muestras de sangre del animal inmunizado en distintos momentos luego de la inmunización. También se puede administrar una segunda inyección de refuerzo. El proceso de administración de refuerzo y titulado se repite hasta que se obtenga un título apropiado. Cuando se obtiene un deseado nivel de inmunogenicidad, el animal inmunizado puede sangrarse y el suero aislado y almacenado, y/o puede usarse el animal para generar los mAb.

Los mAb pueden prepararse fácilmente a través del uso de técnicas bien conocidas, como las ejemplificadas en la patente de los Estados Unidos Nº 4.196.265, incorporada por referencia a este documento. Típicamente, esta técnica involucra la inmunización de un animal apropiado con una composición inmunogénica seleccionada, por ejemplo, una proteína, polipéptido o péptido del TS10q23.3 total o parcialmente purificado o una célula que exprese altos niveles de TS10q23.3. La composición inmunizante se administra de una manera efectiva para estimular las células que producen el anticuerpo. Los roedores tales como las ratas y los ratones son animales preferidos, aunque también es posible utilizar conejos, ovejas y ranas. El uso de ratas puede presentar ciertas ventajas (Goding, 1986), pero se prefieren los ratones, siendo el ratón BALB/c el más preferido y utilizado de rutina, y el que generalmente produce un porcentaje más alto de fusiones estables.

Luego de la inmunización, se seleccionan células somáticas que tengan el potencial de producir anticuerpos, específicamente linfocitos B (células B), para utilizarlas en protocolo de generación de mAb. Estas células pueden obtenerse de biopsias del bazo, amígdalas o nodos linfáticos o de muestras de sangre periférica. Se prefieren las células del bazo y de la sangre periférica, las primeras porque son una fuente rica en células productoras de anticuerpo que se encuentran en la etapa de división de los plasmablastos, y las últimas porque la sangre periférica es fácilmente accesible. A menudo, se inmunizará un panel de animales y se extraerá el bazo del animal con el más alto título del anticuerpo y se obtendrán los linfocitos del bazo homogeneizando el bazo con una jeringa. Típicamente, el bazo de un ratón inmunizado contiene aproximadamente de 5 x 10^{7} a 2 x 10^{8} linfocitos.

Los linfocitos B productores de anticuerpos del animal inmunizado se fusionarán entonces con células de una célula mieloma inmortal, generalmente una de la misma especie del animal que fue inmunizado. Las líneas de células de mieloma que son apropiadas para uso en procedimientos de fusión productores de hibridomas preferentemente no producen anticuerpos, tienen una alta eficiencia de fusión y deficiencias enzimáticas que las vuelven incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que solamente soportan el crecimiento de las células fusionadas deseadas (hibridomas).

Se puede utilizar cualquiera de un número de células mieloma, como es conocido por las personas versadas en el arte (Goding, 1986). Por ejemplo, cuando el animal inmunizado es un ratón, se puede usar P3-X63/Ag8, P3-X63- Ag8.653, NSl/l.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0. Pero, para ratas se pueden usar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210; y U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6, las que son todas útiles en conexión con las fusiones de células.

Los métodos para generar híbridos de células del bazo o de los nodos linfáticos productoras de anticuerpos y de células mieloma normalmente comprenden el mezclado de células somáticas con células mieloma en una proporción de 2:1, aunque esta proporción puede variar desde alrededor de 20:1 a alrededor de 1:1, en la presencia de un agente o agentes (químicos o eléctricos) que promuevan la fusión de las membranas celulares. Se han descrito métodos de fusión que usan el virus Sendai (Kohler y Milstein, 1975; 1976), y otros que usan glicol de polietileno (PEG, por sus siglas en inglés), tal como, por ejemplo, PEG al 37% (v/v), by Gefter et al., (1977). Es también apropiado el uso de métodos de fusión eléctricamente inducidas (Goding, 1986).

Los procedimientos de fusión normalmente producen híbridos viables a frecuencias bajas, de alrededor de 1 x 10^{-6} a lxl0^{-8}. Esto, sin embargo, no presenta ningún problema, ya que los híbridos fusionados viables se diferencian de las células parentales sin fusionar (particularmente de las células mieloma sin fusionar que normalmente continuarían dividiéndose indefinidamente) mediante el cultivo en un medio selectivo. Generalmente, este medio selectivo contiene un agente que bloquea la síntesis de novo de nucleótidos en el medio de cultivo del tejido. Ejemplos de agentes preferidos son aminopterina, metotrexato y azaserina. La aminopterina y el metotrexato bloquean la síntesis de novo tanto de las purinas como de las pirimidinas, mientras que la azaserina bloquea sólo la síntesis de purinas. Cuando se usan aminopterina o metotrexato, el medio se complementa con hipoxantina y timidina como fuente de nucleótidos (medio HAT). Cuando se usa azaserina, el medio se complementa con hipoxantina.

El medio de selección preferido es HAT. Sólo las células capaces de seguir las rutas de rescate de nucleótidos son capaces de sobrevivir en un medio HAT. Las células mieloma son deficientes en las enzimas clave de la ruta de rescate, por ejemplo, la hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), y no pueden sobrevivir. Las células B pueden seguir esta ruta, pero tienen un tiempo de vida limitado en el cultivo y generalmente mueren dentro de aproximadamente las dos semanas. Por lo tanto, las únicas células que pueden sobrevivir en el medio selectivo son aquellos híbridos formados de las células B y mielomas.

Estos cultivos proporcionan una población de hibridomas de la cual se seleccionan hibridomas específicos. Típicamente, la selección de hibridomas se realiza mediante el cultivo de células mediante una dilución de clon único en placas de microtitulación, seguido por el ensayo (después de aproximadamente dos o tres semanas) de la reactividad deseada en los sobrenadantes clonales. El ensayo debe ser sensible, simple y rápido como, por ejemplo, ensayos de radioinmunidad, inmunidad enzimática, citotoxicidad, de placas, dot inmunobinding y similares. Los hibridomas seleccionados serían entonces diluidos serialmente y clonados en líneas de células individuales productoras de anticuerpos, donde los clones pueden entonces propagarse indefinidamente para proporcionar los mAb. Las líneas de células pueden explotarse para producir mAb de dos maneras básicas. Una muestra del hibridoma puede inyectarse (a menudo en la cavidad peritoneal) a un animal histocompatible del tipo que fue utilizado para proporcionar las células somáticas y mieloma para la fusión original. El animal inyectado desarrollará tumores que secretan el anticuerpo monoclonal específico producido por el híbrido celular fusionado. Los fluidos del cuerpo del animal, tales como suero o fluido ascítico, pueden ser colectados para proporcionar los mAb en una concentración alta. Las líneas de células individuales podrían también cultivarse in vitro, donde los mAbs son secretados naturalmente en el medio de cultivo del cual pueden fácilmente obtenerse en altas concentraciones. Los mAb producidos por cualquiera de estos medios pueden ser purificados, si se desea, mediante filtración, centrifugación y diversos métodos cromatográficos tales como HPLC o cromatografía de afinidad.

Las líneas de células individuales también pueden cultivarse in vitro, donde los mAb son secretados naturalmente en el medio de cultivo del cual pueden obtenerse en altas concentraciones.

Los MAbs producidos por cualquiera de estos medios pueden ser aún purificados más por filtración, centrifugación y diversos métodos cromatográficos tales como HPLC o cromatografía de afinidad. Los fragmentos de los anticuerpos monoclonales de la invención pueden obtenerse de los anticuerpos monoclonales purificados por métodos que incluyen la digestión por enzimas, tales como la pepsina o papaina y/o la escisión de los enlaces disulfuro por reducción química. Alternativamente, los fragmentos de anticuerpos monoclonales englobados por esta invención pueden sintetizarse utilizando un sintetizador de péptidos automatizado.

También se contempla que se pueda utilizar una metodología de clonación molecular para generar monoclonales. Para esto, se preparan genotecas combinatorias de fagémidos de inmunoglobina del ARN aislado del bazo del animal inmunizado, y se seleccionan fagémidos que expresen los anticuerpos apropiados mediante una estrategia de reconocimiento y selección (panning) utilizando células que expresen el antígeno y células de control, por ejemplos células del tumor versus células normales. Las ventajas de esta metodología en comparación con las técnicas convencionales de hibridomas son que se puede producir y evaluar en una sola vuelta 10^{4} veces más el número de anticuerpos y que se generan nuevas especificidades por combinación de cadenas H y L lo que incrementa aún más la probabilidad de encontrar anticuerpos apropiados.

Los anticuerpos monoclonales humanizados son anticuerpos de origen animal que se han modificado utilizando técnicas de la ingeniería genética para reemplazar secuencias de entramado de región constante y/o variable con secuencias humanas, al tiempo que se retiene la especificidad antigénica original. Dichos anticuerpos se derivan comúnmente de anticuerpos de roedores con especificidad contra antígenos humanos, y dichos anticuerpos son generalmente útiles en aplicaciones terapéuticas in vivo. Esta estrategia reduce la respuesta anfitrión al anticuerpo foráneo y permite la selección de funciones efectoras humanas.

Las técnicas para producir inmunoglobulinas humanizadas son bien conocidas por las personas versadas en el arte. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5.693.762 divulga métodos para producir inmunoglobulinas humanizadas, y las composiciones de las mismas, que tengan una o más regiones que determinan la complementariedad (regiones CDR, por sus siglas en inglés). Cuando se combinan a un anticuerpo intacto, las inmunoglobulinas humanizadas son sustancialmente no inmunogénicas en los humanos y retienen sustancialmente la misma afinidad al antígeno que la inmunoglobulina donante, tales como una proteína u otro compuesto que contenga un epítopo.

Otras patentes de los Estados Unidos, cada una de las cuales se incorpora por referencia a este documento, que ensañan la producción de anticuerpos útiles para esta invención incluyen la patente de los Estados Unidos Nº 5.565.332, la que describe la producción de anticuerpos quiméricos utilizando un planteamiento combinatorio; la Nº 4.816.567 que describe preparaciones de inmunoglobulina recombinante y la Nº 4.867.973 que describe conjugados de agentes terapéuticos y anticuerpos.

La patente de los Estados Unidos Nº 5.565.332 describe métodos para la producción de anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, que tengan la misma especificidad de enlace que el anticuerpo paterno pero que tengan características humanas incrementadas. Los anticuerpos humanizados pueden obtenerse mediante un entremezclado de cadenas, quizá utilizando una tecnología de visualización fágica; en la medida de que dichos métodos sean útiles en esta invención, el texto completo de la patente de los Estados Unidos Nº 5.565.332 se incorpora a este documento mediante esta referencia. Los anticuerpos humanos pueden también producirse mediante la transformación de células B con EBV y la subsecuente clonación de los secretores como lo describen Hoon et al., (1993).

Los conjugados de anticuerpos en los cuales un anticuerpo de TS10Q23.3 se conecta a una etiqueta detectable o a un agente citotóxico son aspectos adicionales de la invención. Los conjugados de anticuerpos de diagnóstico pueden ser utilizados tanto para diagnósticos in vitro, por ejemplo, en una diversidad de inmunoensayos, como para diagnósticos in vivo como, por ejemplo, en la tecnología de imágenes.

Ciertos conjugados de anticuerpos incluyen aquellos cuyo propósito principal es su uso in vitro, donde el anticuerpo se conecta a un ligando de enlace secundario o a una enzima (una etiqueta enzima) lo que generará un producto coloreado al ser puesto en contacto con un sustrato cromogénico. Ejemplos de enzimas apropiadas incluyen ureasa, fosfatasa alcalina, hidrógeno (rábano picante), peroxidasa y oxidasa de la glucosa. Los ligandos de enlace secundario preferidos son la biotina y los compuestos de avidina o estreptavidina. El uso de estas etiquetas es bien conocido por las personas versadas en el arte, a la luz de y como se describe en, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos N^{os} 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241; las que se incorporan a este documento por esta referencia.

Los anticuerpos monoclonales radioactivamente etiquetados de esta invención pueden ser producidos de acuerdo con métodos bien conocidos en el arte. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden ser yodados por contacto con yoduro de sodio o potasio y un agente químico oxidante como, por ejemplo, hipoclorito de sodio, o un agente enzimático oxidante como, por ejemplo, lactoperoxidasa. Los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención pueden ser etiquetados con tecnecio-^{99}''^{1} mediante un proceso de intercambio de ligandos, por ejemplo, reduciendo pertecnato con una solución estanosa, quelando el tecnecio reducido en una columna Sephadex y aplicando el anticuerpo a esta columna o por técnicas directas de etiquetamiento, por ejemplo, incubando pertecnato, un agente reductor tal como SNC1_{2}, una solución amortiguadora como, por ejemplo, una solución de ftalato de sodio y potasio y el anticuerpo.

Los grupos funcionales intermediarios que a menudo se utilizan para unir radioisótopos que existen como iones metálico al anticuerpo son el ácido dietilentriaminpentaacético (DTPA) y el ácido etilendiamintetraacético (EDTA). Las etiquetas fluorescentes incluyen rodamina, isotiocianato de fluoresceína y renografina.

IV. Diagnóstico de cánceres que involucran al TS10q23.3

Los presentes inventores han determinado que las alteraciones en TS10q23.3 están asociadas con una malignidad. Por lo tanto, TS10q23.3 y el gene correspondiente pueden emplearse como un indicador de cáncer de diagnóstico o pronóstico. Más específicamente, las mutaciones puntuales, deleciones, inserciones o perturbaciones reguladoras relacionadas con el TS10q23.3 pueden causar cáncer o promover su desarrollo, causar o promover el avance del tumor en un sitio primario y/o causar o fomentar la metástasis. Otros fenómenos asociados con las malignidades que pueden ser afectados por la expresión de TS10q23.3 incluyen la angiogénesis y la invasión de tejidos.

A. Diagnóstico genético

Una materialización de esta invención comprende un método para detectar variaciones en la expresión del TS10q
23.3. Esto puede comprender determinar ese nivel del TS10q23.3 o determinar alteraciones específicas en el producto expresado. Obviamente, este tipo de ensayo tiene importancia en el diagnóstico de cánceres relacionados. Dichos cánceres puede incluir cánceres del cerebro (glioblastomas, meduloblastomas, astrocitomas, oligodendrogliomas, ependimomas), pulmón, hígado, bazo, riñón, páncreas, intestino delgado, células de la sangre, nodo linfático, colon, pecho, endometrio, estómago, próstata, testículo, ovario, piel, cabeza y cuello, esófago, médula ósea, sangre u otros tejidos. En particular, esta invención se relaciona al diagnóstico de gliomas.

La muestra biológica puede ser cualquier tejido o fluido. Las diversas materializaciones incluyen células de la piel, músculos, cara, cerebro, próstata, pecho, endometrio, pulmón, cabeza y cuello, páncreas, intestino delgado, células de la sangre, hígado, testículos, ovarios, colon, piel, estómago, esófago, bazo, nodo linfático, médula ósea o riñón. Otras materializaciones incluyen muestras de fluidos tales como sangre periférica, fluido linfático, fluido abdominal, suero, efusión pleural, esputo, fluido cefalorraquídeo, fluido lacrimal, heces fecales u orina.

El ácido nucleico utilizado se aísla de las células de la muestra biológica, de acuerdo con metodologías estándar (Sambrook et al., 1989). El ácido nucleico puede ser ADN genómico o ARN celular entero o fraccionado. Cuando se utiliza ARN, se puede desear convertirlo a un ADN complementario. En una materialización, el ARN es ARN celular entero; en otra es ARN poli-A. Normalmente se amplifica el ácido nucleico.

Dependiendo del formato, el ácido nucleico específico de interés se identifica directamente en la muestra utilizando amplificación o con un segundo ácido nucleico conocido luego de la amplificación. Luego, se detecta el producto identificado. En ciertas aplicaciones, la detección puede llevarse a cabo mediante medios visuales, por ejemplo, manchado de un gel por bromuro de etidio). Alternativamente, la detección puede involucrar una identificación indirecta del producto vía quimioluminiscencia, escintigrafía radioactiva de radioetiqueta o etiqueta fluorescente o aún vía un sistema que utilice señales de impulsos eléctricos o térmicos (Affymax Technology; Bellus, 1994).

Luego de la detección, se pueden comparar los resultados encontrados en un paciente dado con los de un grupo de referencia estadísticamente significativo de pacientes normales y pacientes que tengan patologías relacionadas al TS10q23.3. De esta manera, es posible correlacionar la cantidad o clase del TS10q23.3 detectado con varios estados clínicos.

Los presentes inventores han identificado diversos tipos de defectos. Por lo tanto, las "alteraciones" deben considerarse como incluyendo deleciones, inserciones, mutaciones puntuales y duplicaciones. Las mutaciones puntuales resultan en codones de terminación, mutaciones del marco de lectura o substituciones de aminoácidos. Las mutaciones somáticas son aquellas que ocurren en tejidos no germinales. Una mutación germinal puede ocurrir en cualquier tejido y es heredada. Las mutaciones dentro y fuera de la región codificante también pueden afectar la cantidad de TS10q23.3 producido, ya sea por alterar la transcripción del gene o por desestabilizar o de otra manera alterar el procesamiento ya sea del transcrito (ARNm) o la proteína.

Una célula toma un paso genético hacia una transformación oncogénica cuando un alelo de un gene supresor de tumores se inactiva debido a la herencia de una lesión germinal o a la adquisición de una mutación somática. La inactivación del otro alelo del gene normalmente involucra una micromutación somática o una deleción alélica cromosómica que resulta en la pérdida de heterocigocidad (LOH, por sus siglas en inglés). Alternativamente, ambas copias de un gene supresor de tumores puede perderse por deleción homocigótica.

Los primeros pasos de los inventores hacia la identificación de nuevas mutaciones en el TS10q23.3 fueron conducir un examen previo de tumores primarios y de líneas de células de tumores (TCL, por sus siglas en inglés) por LOH dentro de esta región de 10q23. Se examinaron especímenes de tumores primarios y de TCL por LOH utilizando marcadores de repeticiones cortas en tándem polimórficas en el cromosoma 10 localizadas cerca del locus de TS10q23.3 (Tabla 6). En este panel de muestras, los inventores observaron LOH en especímenes de tumores primarios con frecuencias oscilando entre el 20% en especímenes de colon al 75% en glioblastoma múltiples (GBM), con una frecuencia global de LOH de \sim49%. Para las TCL con tamaños de muestra mayores que nueve, la incidencia de la LOH osciló entre un 28% (colon) a un 82% (GBM), con una frecuencia global de \sim46%.

En los tumores primarios que exhiben LOH rodeando el locus del TS10q23.3, los inventores detectaron una mutación del marco de lectura en carcinoma de pecho, una mutación terminadora en GBM pediátrico, una variante de corte y empalme en GBM pediátrico y una variante de cambio de sentido en melanoma (Tabla 7). Los inventores también investigaron las TCL que exhibieron LOH e identificaron diez deleciones homocigóticas que afectaron las regiones codificantes del TS10q23.3 (Fig. 13A y Fig. 13B). Las deleciones homocigóticas estuvieron presentes en las TCLs de astrocitomas, carcinoma de la vejiga, carcinoma de pecho, glioblastoma, carcinoma del pulmón, melanoma y carcinoma de próstata. Mientras que dos de las líneas de células habían perdido los nueve exones de 10q23.3 exones, las otras ocho TCL habían delecionado homocigóticamente distintas porciones codificantes del gene. El análisis de las restantes TCL reveló una variante del marco de lectura, una variante de terminación y siete variantes de cambio de sentido no conservativas (Tabla 7). Estas mutaciones particulares pueden ser direccionadas con oligonucleótidos específicamente diseñados para identificarlas o con anticuerpos que distinguen estos marcadores del TS10q23.3 de tipo salvaje.

Se contempla que, de acuerdo con esta invención, se pueden identificar otras mutaciones en el gene TS10q23.3. En este respecto, se contemplan diversos ensayos, incluidos, pero sin limitarse a ellos, hibridación fluorescente in situ (FISH -por sus siglas en inglés; patente de los Estados Unidos Nº 5.633.365 y patente de los Estados Unidos Nº 5.665.549; cada una de estas publicaciones incorporada a este documento mediante esta referencia), secuenciamiento directo de ADN, análisis PFGE, Southern o Northern blotting (transferencias Southern o Northern), análisis de conformación monocatenaria (SSCA, por sus siglas en inglés), ensayo de protección de ribunucleasa, oligonucleótido de alelo específico (ASO, por sus siglas en inglés), análisis dot blot (transferencia en mancha), electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (por ejemplo, la patente de los Estados Unidos Nº 5.190.856 incorporada a este documento por esta referencia), RFLP (por ejemplo, la patente de los Estados Unidos Nº 5.324.631 incorporada a este documento por esta referencia) y PCR™-SSCP.

(i) Cebadores y sondas

Con el uso del término cebador, como se lo define en este documento, se propone englobar todo ácido nucleico que sea capaz de cebar la síntesis de un ácido nucleico incipiente en un proceso que depende de moldes. Típicamente, los cebadores son oligonucleótidos de diez a veinte pares de bases de longitud, pero se pueden emplear secuencias más largas. Los cebadores suelen suministrarse en forma mono o bicatenaria, pero se prefiere la forma monocatenaria. Las sondas se definen de manera diferente, aunque puedan actuar como cebadores. Aunque quizá sean capaces de cebar, las sondas se diseñan para unirse al ADN o ARN diana y no se necesita usarlas en un proceso de amplificación.

En materializaciones preferidas, las sondas o los cebadores se etiquetan con especies radioactivas (^{32}P, ^{I4}C, ^{35}S, ^{3}H u otra etiqueta), con un fluoróforo (rodamina, fluoresceína) o un quimioluminescente (luciferasa).

(ii) Métodos de amplificación dependientes de moldes

Se encuentra disponible un número de procesos dependientes de moldes para amplificar las secuencias de marcadores presentes en una muestra de molde dada. Uno de los mejores métodos de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa (a la que se refiere como PCR™) que se describe en detalle en la patente de los Estados Unidos Nos. 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159, y en Innis et al., 1990, cada uno de las cuales se incorpora en su totalidad a este documento mediante esta referencia.

Brevemente, en la PCR™, se preparan dos secuencias de cebadores que son complementarias a las regiones en hebras complementarias opuestas de la secuencia del marcador. Se agrega a la mezcla de reacción un exceso de trifosfatos de deoxinucleósido junto con una ADN polimerasa, por ejemplo, Taq polimerasa. Si la secuencia del marcador está presente en una muestra, los cebadores se unirán al marcador y la polimerasa causará que los cebadores sean extendidos a lo largo de la secuencia del marcador agregando nucleotidos. Subiendo y bajando la temperatura de la mezcla reaccionante, los cebadores extendidos se disociarán del marcador para formar productos de reacción, el excedente de los cebedarores unirán al marcador y a los productos de reacción y se repetirá el proceso.

Se puede llevar a cabo un procedimiento de amplificación de la PCR™ de la transcriptasa inversa para cuantificar el monto de ARNm amplificado. Los métodos para la transcripción inversa del ARN en el ADNc son bien conocidos y están descritos por Sambrook et al., 1989. Métodos alternativos para la transcripción inversa utilizan ADN polimerasas dependientes de ARN termoestables. Estos métodos se describen en WO 90/07641 presentada el 21 de diciembre de 1990. Las metodologías de la reacción en cadena de la polimerasa son bien conocidas en el arte.

Otro método para la amplificación es la reacción en cadena de la ligasa ("LCR", por sus siglas en inglés), divulgada en EPO Nº 1 320 308, incorporada en su totalidad en este documento mediante esta referencia. En la LCR, se preparan dos pares de sondas complementarias y, en la presencia de la secuencia diana, cada par se unirá a las hebras complementarias opuestas de la diana de tal manera que ellas se apoyen en la otra. En presencia de una ligasa, los dos pares de sondas se conectarán para formar una sola unidad. Haciendo ciclar la temperatura, como en la PCR™, las unidades ligadas se disasocian de la diana y sirven entonces como "secuencias diana" para la ligación de los pares de sondas excedentes. La patente de los Estados Unidos Nº 4.883.750 describe un método similar al LCR para unir pares de sondas a la secuencia diana.

La Qbeta replicasa, descrita en la solicitud PCT Nº PCT/US87/00880, puede también utilizarse en esta invención como otro método de amplificación. En este método, una secuencia replicativa de ARN que tiene una región complementaria a la de una diana se agrega a una muestra en la presencia de una ARN polimerasa. La polimerasa copiará la secuencia replicativa que puede entonces ser detectada.

Un método de amplificación isotérmico, en el que se utilizan ligasas y endonucleasas de restricción para lograr la amplificación de las moléculas diana que contengan nucleótidos 5'-[alfa-tio]-trifosfatos en una hebra de un sitio de restricción puede también ser útil para la amplificación de los ácidos nucleicos de esta invención, Walker et al (1992a). La amplificación del desplazamiento de la hebra (SDA, por sus siglas en inglés) es otro método de llevar a cabo la amplificación isotérmica de los ácidos nucleicos que involucra múltiple vueltas de desplazamiento de hebra y síntesis, es decir, un traslado de mellas. Véase las patente de los Estados Unidos N^{os} 5.270.184 y 5.455.166 y Walker et al (1992b) para SDA y Spargo et al (1996) para SDA termofílico.

Una reacción en cadena de reparación (RCR) involucra el apareamiento de diversas sondas a través de toda una región direccionada para la amplificación, seguida de una reacción de reparación en la cual sólo dos de las cuatro bases están presentes. Las otras dos bases pueden ser agregadas como derivados biotinilados para facilitar la detección. Un planteamiento similar se utilizó en SDA. Las secuencias diana específicas también pueden detectarse mediante una reacción de sonda cíclica (CPR, por sus siglas en inglés). En CPR, una sonda con secuencias 3' y 5' de ADN no específico y una secuencia media de ARN específico se hibridizan al ADN que está presente en una muestra. Luego de la hibridización, la reacción se trata con ribunucleasa H, y los productos de la sonda identificados como productos distintivos que son liberados luego de la digestión. El molde original se aparea a otra sonda cíclica y se repite la reacción.

Otros métodos de amplificación se describen en la solicitud de Gran Bretaña Nº 2 202 328, y en la solicitud PCT Nº PCT/US89/01025, cada una de las cuales de incorpora en su totalidad a este documento por esta referencia, y pueden utilizarse de acuerdo con esta invención. En la primera solicitud, se usan cebadores "modificados" en una síntesis tipo PCR™, dependiente del molde y la enzima. Los cebadores pueden modificarse mediante un etiquetado con una porción de captura (por ejemplo, biotina) y/o una porción detectora (por ejemplo, una enzima). En una solicitud posterior, se agregó a la muestra un excedente de sondas etiquetadas. En presencia de la secuencia diana, la sonda se une y es escindida catalíticamente. Luego de la escisión, se libera la secuencia diana intacta para que se una con el excedente de sonda. La escisión de la sonda etiquetada señala la presencia de la secuencia diana.

Otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos incluyen los sistemas de amplificación basados en transcripción (TAS, por sus siglas en inglés), incluyendo la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA, por sus siglas en inglés) y 3SR (Kwoh et al., 1989; Gingeras et al., solicitud PCT Nº WO 88/10315, incorporadas en su totalidad por esta referencia a este documento). Véase también la patente de los Estados Unidos Nº 5.409.818, Fahy et al (1991) y Compton (1991) para 3SR y NASBA. En NASBA, los ácidos nucleicos pueden prepararse por amplificación mediante una extracción estándar con fenol/cloroformo, desnaturalización por calor de una muestra clínica, tratamiento con un amortiguador de lisis y columnas minirotatorias para la aislación de ADN y ARN o extracción de ARN con cloruro de guanidinio. Estas técnicas de amplificación involucran el apareamiento de un cebador que tenga secuencias diana específicas. Luego de la polimerización, los híbridos ADN/ARN son digeridos con ribunucleasa H mientras que las moléculas de ADN de doble hebra son nuevamente desnaturalizadas por calor. En cada uno de los casos el ADN de hebra única es transformado completamente en uno de doble hebra mediante el agregado de un segundo cebador diana específico, lo que se sigue por una polimerización. Las moléculas de ADN bicatenario son entonces múltiplemente transcritas por una ARN polimerasa tal como T7 o SP6. En una reacción cíclica isotrósmica, los ARN son inversamente transcritos en un ADN monocatenario, el que entonces es convertido en un ADN bicatenario y luego nuevamente transcrito con una ARN polimerasa tal como T7 o SP6. Los productos resultantes, ya sea truncados o completos, indican secuencias diana específicas.

Davey et al., EPO Nº 329 822 (incorporada por referencia en su totalidad a este documento) divulga un proceso de amplificación de ácidos nucleicos que involucra la síntesis cíclica de ARN monocatenario ("ARNmc"), ADN monocatenario ("ADNmc"), y ADN bicatenario ("ADNbc"), los que pueden ser utilizados de acuerdo con esta invención. El ARN monocatenario, ARNmc, es un molde para un primer oligonucleótido cebador, el que es elongado por una transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente del ARN). El ARN es entonces quitado del dúplex ADN:ARN resultante por la acción de la ribonucleasa H (ARNasa H, una ARNasa específica para el ARN en dúplex con ADN o ARN). El ADN monocatenario, ADNmc, resultante es un molde para un segundo cebador, el que también incluye las secuencias de un promotor de la ARN polimerasa (ejemplificado por la ARN polimerasa T7) 5' para su homología al molde. Este cebador es extendido por la ADN polimerasa (ejemplificada por el fragmento "Klenow" grande de la ADN polimerasa I del E. coli), resultando en una molécula ADN bicatenaria ("ADNbc"), con una secuencia idéntica a la del ARN original entre los cebadores y, además, con una secuencia promotora en un extremo. Esta secuencia promotora puede utilizarse por la ARN polimerasa apropiada para hacer copias ARN del ADN. Estas copias pueden entonces volver a entrar al ciclo lo que lleva a una amplificación muy rápida. Con una elección apropiada de enzimas, esta amplificación puede realizarse isotérmicamente sin adicción de enzimas en cada ciclo. Dada la naturaleza cíclica de este proceso, la secuencia de partida puede elegirse que sea en la forma de un ADN o de un ARN.

Miller et al., en la solicitud PCT Nº WO 89/06700 (incorporada en su totalidad por referencia a este documento) divulga un esquema de amplificación de secuencia de ácido nucleico basada en la hibridación de una secuencia promotor/cebador a un ADN monocatenario diana ("ADNmc") seguido por la transcripción de muchas copias ARN de la secuencia. Este esquema no es cíclico, es decir, no se producen moldes nuevos de la resultante transcripción de ARN. Otros métodos de amplificación incluyen "RACE" y "PCR™ unilateral" (Frohman, 1990; Ohara et al., 1989; cada una de las cuales es incorporada en su totalidad a este documento mediante esta referencia).

Se pueden utilizar también métodos basados en la ligación de dos (o más) oligonucleótidos en la presencia de un ácido nucleico que tenga la secuencia del "dioligonucleótido" resultante, de tal modo que amplificando el di- oligonucleótido, también pueda utilizarse en el paso de amplificación de esta invención, Wu et al., (1989), incorporada en su totalidad por referencia a este documento.

(iii) Transferencia Southern/Northern (Southenn/Northern blotting)

Las técnicas de transferencia (blotting) son bien conocidas por las personas versadas en el arte. Southern blotting involucra el uso de ADN como diana, mientras que la transferencia Northern involucra el uso de ARN como diana. Cada una de ellas proporcionas distintos tipos de información, aunque la transferencia ADNc es análoga, en muchos aspectos, a la transferencia de especies de ARN.

Brevemente, se usa una sonda para dirigirse a una especie de ADN o ARN que haya sido inmovilizada en una matriz apropiada, a menudo un filtro de nitrocelulosa. Las distintas especies deberían estar separadas espacialmente para facilitar el análisis. Esto a menudo se logra mediante electroforesis en gel de la especie de ácido nucleico seguida por "blotting" sobre el filtro.

Subsecuentemente, se incuba la diana "blotted" con una sonda (normalmente etiquetada) bajo condiciones que promueven la desnaturalización y rehibridación. Debido a que la sonda se diseña para aparear las bases con la diana, la sonda se unirá a una porción de la secuencia diana bajo condiciones de renaturalización. Se quitan las sonda no unidas y la detección se realiza como se describe anteriormente.

(iv) Métodos de separación

Es normalmente deseable, en una etapa u otra, separar el producto de la amplificación del molde y del excedente de cebador para determinar si ha ocurrido la amplificación específica. En una materialización, los productos de la amplificación se separan por electroforesis en gel de agarosa, agarosa-acrilamida o poliacrilamida utilizando métodos estándar. Véase Sambrook et al., 1989.

Alternativamente, se pueden utilizar técnicas cromatográficas para efectuar la separación. Hay muchas clases de cromatografía que pueden utilizarse en esta invención: adsorción, partición, intercambio iónico y tamices moleculares, y muchas técnicas especializadas para usarlas que incluyen cromatografía de columna, en papel, de capa fina y de gases (Freifelder, 1982).

(v) Métodos de detección

Los productos pueden visualizarse para confirmar la amplificación de las secuencias de marcadores. Un método de visualización típico involucra manchar un gel con bromuro de etidio y visualizar bajo la luz UV. Alternativamente, si los productos de la amplificación están íntegramente etiquetados con radio nucleótidos o fluorimétricamente, los productos de la amplificación pueden ser expuestos en películas radiográficas o visualizados bajo el espectro estimulante apropiado, luego de la separación.

En una materialización, la visualización se logra indirectamente. Luego de la separación de los productos de la amplificación, una sonda de ácido nucleico etiquetado se pone en contacto con la secuencia del marcador amplificado. La sonda preferentemente se conjuga a un cromoforo pero puede ser radioetiquetada. En otra materialización, la sonda se conjuga a un socio de enlace, como por ejemplo un anticuerpo o biotina, y el otro miembro del par de enlace acarrea una porción detectable.

En una materialización, la detección es mediante una sonda etiquetada. Las técnicas involucradas son bien conocidas por las personas versadas en el arte y pueden encontrarse en muchos libros estándar sobre protocolos moleculares. Véase Sambrook et al., 1989. Por ejemplo, sondas o cebadores cromofóricos o radioetiquetados identifican la diana durante o luego de la amplificación.

Un ejemplo de lo precedente se describe en la patente de los Estados Unidos Nº 5.279.721, incorporada a este documento por referencia, la que divulga un aparato y un método para la electroforesis automatizada y la transferencia de ácidos nucleicos. El aparato permite la electroforesis y el blotting sin ninguna manipulación externa del gel y es ideal para llevar a cabo los métodos conforme a esta invención.

Además, los productos de la amplificación descritos en lo que precede pueden ser sujetos a un análisis de secuencia para identificar clases específicas de variaciones utilizando técnicas de análisis de secuencia estándar. Con ciertos métodos, el análisis exhaustivo de los genes se lleva a cabo mediante un análisis de secuencia que utiliza conjuntos de cebadores diseñados para un secuenciamiento óptimo (Pignon et al., 1994). Esta invención proporciona métodos para los cuales se pueden utilizar todos y cada uno de estos tipos de análisis. Utilizando las secuencias divulgadas en este documento, se pueden diseñar cebadores oligonucleótidos que permitan la amplificación de secuencias en todo el gene TS10q23.3 que puede entonces ser analizado por secuenciamiento directo.

(vi) Componentes de los equipos

Todos los materiales y reactivos esenciales requeridos para detectar y secuenciar TS10q23.3 y sus variantes pueden ser ensamblados conjuntamente en un equipo. Este generalmente comprenderá los cebadores y sondas preseleccionados. También pueden estar incluidas las enzimas apropiadas para amplificar los ácidos nucleicos incluidas varias polimerasas (RT, Taq, Sequenase™ etc.), desoxinucleótidos y amortiguadores para proporcionar la mezcla de reacción necesaria para la amplificación. Dichos equipo en general también comprenderán, en forma apropiada, distintos contenedores para cada reactivo y enzima individuales así como para cada cebador o sonda.

(vii) Diseño y consideraciones teóricas para RT-PCR™ cuantitativa relativa

La transcripción inversa (RT, por sus siglas en inglés) de ARN a ADNc seguido por la PCR™ cuantitativa relativa (RT-PCR™) puede utilizarse para determinar las concentraciones relativas de las especies de ARNm específicas aisladas de los pacientes. La determinación de que la concentración de una especie de ARNm específica varía muestra que el gene que codifica la especie de ARNm específica se expresa en forma diferenciada.

En PCR™, el número de moléculas del ADN diana amplificado aumenta en un factor que se aproxima a dos con cada ciclo de la reacción hasta que algún reactante se vuelva limitante. A partir de ese momento, la velocidad de amplificación disminuye progresivamente hasta que no hay ningún aumento de la diana amplificada entre ciclos. Si se traza una gráfica con el número de ciclos en el eje X y el logaritmo de la concentración del ADN diana amplificado en el eje Y y se conectan los puntos marcados, se generará una línea curva de forma característica. Comenzando con el primer ciclo, la pendiente de la línea es positiva y constante. Esta es la porción lineal de la curva. Después de que un reactante se vuelve limitante, la pendiente de la línea decrece y finalmente se hace cero. En este punto, la concentración del ADN diana amplificado se vuelve asintótica a un cierto valor determinado. Esta se conoce como la porción meseta de la curva.

La concentración del ADN diana en la porción lineal de la amplificación por PCR™ es directamente proporcional a la concentración de la diana antes de que comience la reacción. Determinando la concentración de los productos amplificados del ADN diana en las reacciones PCR™ que han completado el mismo número de ciclos y se encuentran en sus rangos lineales, es posible determinar las concentraciones relativas de la secuencia diana específica en la mezcla mixture original de ADN. Si los ADN en las mezclas son ADNc sintetizados de los ARN aislados de distintos tejidos o células, la abundancias relativas del ARNm específico del cual se derivó la secuencia diana puede determinarse para los respectivos tejidos o células. Esta proporcionalidad directa entre la concentración de los productos de la PCR™ y las abundancias relativas de ARNm es sólo cierta en el rango linear de la reacción PCR™.

La concentración final del ADN diana en la porción meseta de la curve es determinada por la disponibilidad de los reactantes en la mezcla de reacción y es independiente de la concentración original del ADN diana. Por lo tanto, la primera condición que debe satisfacerse antes de que pueda determinarse las abundancias relativas de una especie de ARNm mediante RT-PCR™ de una colección de poblaciones de ARN es que se tomen muestras de las concentraciones de los productos de la PCR™ amplificados cuando las reacciones PCR™ se encuentren en la porción lineal de sus curvas.

La segunda condición que debe satisfacerse para que un experimento RT-PCR™ determine exitosamente la abundancia relativa de una especie de ARNm en particular es que las concentraciones relativas de los DNAc amplificables sean normalizadas con respecto a algún estándar independiente. El objetivo de un experimento RT-PCR™ es determinar la abundancia de una especie de ARNm en particular relativa a la abundancia promedio de todas las especies de ARNm en la muestra. En los experimentos descritos en lo que sigue, se utilizaron los ARNm para p-actina, asparagina sintetasa y lipocortina II como estándares externos e internos con los cuales se compara la abundancia relativa de los otrosARNm.

La mayoría de los protocolos para las PCR™ competitivas utilizan estándares PCR™ internos que son aproximadamente tan abundantes como la diana. Estas estrategias son efectivas si se toman muestra de los productos de las amplificaciones PCR™ durante sus fases lineales. Si se toman muestras de los productos cuando las reacciones se aproximan a la fase meseta, entonces el producto menos abundante se vuelve relativamente sobre representado. Las comparaciones de las abundancias relativas hechas para muchas muestras distintas de ARN, como es el caso cuando se examinan muestras de ARN por una expresión diferencial, se distorcionan de tal manera que hace que las diferencias de las abundancias relativas de los ARN parezca menor de lo que en realidad son. Este no es un problema significativo si el estándar interno es mucho más abundante que la diana. Si el estándar interno es más abundante que la diana, entonces pueden hacerse comparaciones lineales directas entre muestras de ARN.

La discusión precedente describe consideraciones teóricas para un análisis RT-PCR™ de materiales derivados clínicamente. Los problemas inherentes de las muestras clínicas consisten en que ellas son de cantidad variable (haciendo problemática la normalización) y de calidad variable (requiriendo la co-amplificación de un control interno confiable, preferentemente de un tamaño mayor que la diana). Estos dos problemas quedan resueltos si la RT-PCR™ se realiza como una RT-PCR™ cuantitativa relativa con un estándar interno donde este estándar es un fragmento de ADNc amplificable más grande que el fragmento de ADNc diana y donde la abundancia del ARNm que codifica el estándar interno es aproximadamente de 5 a 100 veces más alta que la del ARNm que codifica la diana. Este análisis mide abundancias relativas, no abundancias absolutas, de las especies de ARNm correspondientes.

Se pueden realizar otros estudios utilizando un análisis RT-PCR™ cuantitativo relativo más convencional con un protocolo externo. Estos análisis toman muestras de los productos de la PCR™ en la porción lineal de sus curvas de amplificación. El número óptimo de ciclos de la PCR™ para el muestreo debe determinarse empíricamente para cada fragmento de ADNc diana. Además, los productos de la transcriptasa inversa de cada población de ARN aislada de las diversas muestras de tejido deben normalizarse cuidadosamente para concentraciones iguales de los ADNc amplificables. Esta consideración es muy importante ya que el análisis mide la abundancia absoluta de ARNm. La abundancia absoluta de ARNm puede utilizarse como una medida de la expresión génica diferencial solamente en muestras normalizadas. Mientras que la determinación empírica del rango lineal de la curva de amplificación y la normalización de los preparados de ADNc son procesos tediosos y consumidores de tiempo, los análisis RT-PCR™ resultantes pueden ser superiores a los derivados del análisis RT-PCR™ quantitativo relativo con un estándar interno.

Una razón de esta ventaja es que sin el estándar/competidor interno, todos los reactantes pueden convertirse en un producto PCR™ único en el rango lineal de la curva de amplificación, incrementando, por lo tanto, la sensibilidad del análisis. Otra razón es que con sólo un producto de la PCR™, la visualización del mismo en un gel electroforético u otro método de visualización se vuelve menos compleja, tiene un menor fondo y es más fácil de interpretar.

(viii) Tecnologías de chips

Los inventores contemplan específicamente las tecnologías de ADN basadas en chips como se describe en Hacia et al (1996) y Shoemaker et al. (1996). Brevemente, estas técnicas involucran métodos cuantitativos para analizar rápida y precisamente grandes números de genes. Mediante el marcado de los genes con oligonucleótidos o utilizando arreglos de sondas fijos, se pueden emplear tecnologías de chips para segregar moléculas diana como arreglos de alta densidad y examinar estas moléculas sobre la base de la hibridación. Véase también Pease et al. (1994); Fodor et al. (1991).

B. Immunodiagnosis

Los anticuerpos de esta invención pueden utilizarse para caracterizar el contenido de TS10q23.3 de tejidos sanos y enfermos, mediante técnicas tales como ELISA y Western blotting. Estas técnicas pueden proporcionar un examen de la presencia o ausencia de malignidades o como predictor de un cáncer futuro.

Se contempla el uso de los anticuerpos de esta invención en un análisis ELISA. Por ejemplo, se inmovilizan anticuerpos anti-TS10q23.3 sobre una superficie seleccionada, preferentemente una que exhiba afinidad por proteínas como, por ejemplo, la superficie de los pocillos de una placa de microtitulación de poliestireno. Luego de lavar para eliminar el material incompletamente adsorbido, es deseable unir o recubrir los pocillos de la placa de ensayo con una proteína no específica que sea conocida por ser antigénicamente neutra con respecto a los antisueros de prueba como, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés), caseína o soluciones de leche en polvo. Esto permite bloquear los sitios de adsorción no específicos de la superficie inmovilizante y por lo tanto reducir el fondo causado por la unión no específica de antígenos sobre la superficie.

Después de unir el anticuerpo al pozo, recubrir con un material no reactivo para reducir el fondo y lavar para quitar el material sin unir, se contacta la superficie inmovilizante con la muestra a ser ensayada de una manera que conduzca a la formación del complejo inmune (antígeno/anticuerpo).

Luego de la formación de inmunocomplejos específicos entre la muestra de ensayo y el anticuerpo ligado, y de un subsecuente lavado, se puede determinar la formación del inmunocomplejo y aún su cantidad exponiéndolo al mismo a un segundo anticuerpo que tenga una especificidad para el TS10q23.3 que difiera de la del primer anticuerpo. Las condiciones apropiadas incluyen preferentemente la dilución de la muestra con diluyentes tales como BSA, gamaglobulina bovina (BGG, por sus siglas en inglés) y de un buffer salino con fosfatos (PBS, por sus siglas en inglés)/Tween®. Estos agentes agregados también tienden a ayudar en la reducción del fondo no específico. Se deja entonces incubar al antisuero en capas por aproximadamente 2 a aproximadamente 4 horas, a temperaturas preferentemente de 25º a aproximadamente 27ºC. Luego de la incubación, se lava la superficie contactada por el antisuero para eliminar el material no inmunoacomplejado. Un procedimiento de lavado preferido incluye el lavado con una solución tal como PBS/Tween® o un buffer de boratos.

Para proporcionar un medio de detección, el segundo anticuerpo tendrá preferentemente una enzima asociada que generará un desarrollo de color al ser incubada con un sustrato cromogénico apropiado. Por consiguiente, se deseará, por ejemplo, contactar e incubar la superficie unida al segundo anticuerpo con IgG anti-humano conjugado con una peroxidasa o ureasa por un tiempo, bajo condiciones que favorezcan la formación de inmunocomplejos (por ejemplo, una incubación por 2 horas a temperatura ambiente de una solución que contenga PBS, como por ejemplo, PBS/Tween®).

Luego de la incubación con el segundo anticuerpo marcado por la enzima, y de un subsecuente lavado para quitar el material no ligado, se cuantifica la cantidad de la etiqueta por incubación con un sustrato cromogénico tal como urea y púrpura de bromocresol o ácido 2,2^{1}-azino-di-(3-etil-bencitiazolin)-6-sulfónico (ABTS) y H_{2}O_{2}, en el caso de la peroxidasa como la etiqueta enzimática. La cuantificación se logra midiendo el grado de generación de color, por ejemplo, utilizando un espectrómetro de espectro visible.

El formato precedente puede ser modificado uniendo primero la muestra a la placa de ensayo. Entonces, se incuba el anticuerpo primario con la placa de ensayo, seguido por la detección del anticuerpo primario ligado utilizando un segundo anticuerpo etiquetado con especificidad para el anticuerpo primario.

Los pasos de diversos otros métodos de inmunodetección útiles han sido descritos en la literatura científica, como, por ejemplo, Nakamura et al., (1987); incorporada por referencia a este documento). Los inmunoensayos, en su sentido más simple y directo, son análisis de unión. Ciertos inmunoensayos preferidos son los diversos tipos de radioinmunoensayos (RIA) y el ensayo de inmunobead de captura. El ensayo de detección inmunohistoquímico utilizando secciones de tejidos es particularmente útil. Sin embargo, notará fácilmente que la detección no se limita a dichas técnicas y, en conexión con esta invención, también puede utilizarse Western blotting (transferencia western), dot blotting (transferencia de manchas), análisis FACS y similares.

Las composiciones de los anticuerpos de esta invención encontrarán una aplicación amplia en ensayos inmunoblot o western blot (transferencia western). Los anticuerpos pueden utilizarse como reactivos primarios de alta afinidad para la identificación de proteínas inmovilizadas sobre una matriz de soporte sólida como, por ejemplo, nitrocelulosa, nilón o combinaciones de los mismos. Conjuntamente con la inmunoprecipitación, seguida por electroforesis en gel, se pueden utilizar como reactivos de paso único para detectar antígenos contra los cuales los reactivos secundarios utilizados en la detección del antígeno causan un fondo adverso. Los métodos de detección basados en principios inmunológicos para un uso conjunto con la transferencia Western incluyen anticuerpos secundarios contra la porción toxina que han sido enzimática, radioactiva o fluorescentemente marcados. Las patentes de los Estados Unidos concernientes al uso de tales etiquetas incluyen las patentes N^{os} 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4,366,241, cada una de las cuales incorporada por referencia a este documento. Por supuesto, se pueden obtener ventajas adicionales mediante el uso de un ligando de unión secundario como, por ejemplo, un segundo anticuerpo o un arreglo de ligandos de unión biotina/avidina, como se conoce en el arte.

V. Métodos para examinar compuestos activos

Esta invención también contempla el uso de TS10q23.3 y fragmentos activos del mismo, y de los ácidos nucleicos que codifican para ellos, en exámenes de compuestos referentes a actividades ya sea de estimular la actividad del TS10q23.3, salvar la falta de TS10q23.3 o bloquear el efecto de una molécula TS10q23.3 mutante. Estos ensayos pueden utilizar una diversidad de formatos distintos y pueden depender del tipo de "actividad" para la que se realiza el examen. Las "lecturas" funcionales que se contemplan incluyen la unión a un compuesto, la inhibición de la unión a un sustrato, ligando, receptor u otros socios de unión por un compuesto, actividad fosfatasa, actividad anti-fosfatasa, fosforilación del TS10q23.3, desfosforilación del TS10q23.3, inhibición o estimulación de la señalización de célula-a-célula, crecimiento, metástasis, división celular, migración celular, formación de colonias en agar suave, inhibición por contacto, invasión, angiogénesis, apoptosis, avance tumoral u otros fenotipos malignos.

El polipéptido de la invención también puede utilizarse para examinar compuestos desarrollados como resultado de la tecnología combinatoria de genotecas. Esta tecnología proporciona un manera eficiente de probar un número potencialmente amplio de sustancias distintas con respecto a su capacidad de modular la actividad de un polipéptido. Dichas genotecas y el uso de las mismas son conocidos en el arte. Se prefiere el uso de genotecas de péptidos. Véase, por ejemplo, WO 97/02048.

Brevemente, un método para evaluar si una sustancia modula la actividad de un polipéptido puede incluir contactar una o más sustancias de prueba con el polipéptido en un medio de reacción apropiado, examinar la actividad del polipéptido tratado y comparar dicha actividad con la del polipéptido sin tratar, en un medio de reacción comparable, con la sustancia o sustancias de prueba. Una diferencia en la actividad entre el polipéptido tratado y sin tratar es indicativa de un efecto modulador de la sustancia o sustancias de prueba pertinentes.

Antes o al tiempo del examen de modulación de actividad, las sustancias de prueba se pueden evaluar por su capacidad de interactuar con el polipéptido, por ejemplo, en un sistema de dos híbridos de levaduras (por ejemplo, Bartel et al., 1993; Fields y Song, 1989; Chevray y Nathans, 1992; Lee et al., 1995). Este sistema puede utilizarse como un examen grueso antes de probar una sustancia por su capacidad real de modular la actividad del polipéptido. Alternativamente, el examen puede usarse para evaluar sustancias de prueba por su capacidad de unirse a un socio de unión KVLQT1 o KCNE1 específico o encontrar miméticos del polipéptido KVLQT1 o KCNE1.

Luego de la identificación de una sustancia que module o afecte la actividad del polipéptido, la sustancia puede ser investigada en mayor detalle. Además, puede ser fabricada y/o usada como un preparado, es decir, manufacturada o formulada, o como una composición como, por ejemplo, un medicamento, composición farmacéutica o droga. Se pueden entonces administrar a individuos.

Por lo tanto, esta invención se extiende en varios aspectos no sólo a la sustancia identificada usando una molécula de ácido nucleico como un modulador de la actividad de un polipéptido, de acuerdo con lo que se divulga en este documento, pero también a una composición farmacéutica, medicamento, droga u otras composiciones que comprendan dicha sustancia, a un método que comprenda la administración de una composición que comprenda dicha sustancia, a un método que comprenda la administración de dicha composición a un paciente, por ejemplo, para el tratamiento (lo que puede incluir un tratamiento preventivo) de LQT, al uso de dicha sustancia en la fabricación de una composición para su administración, por ejemplo, para el tratamiento de LQT y a un método de preparar una composición farmacéutica que comprenda mezclar dicha sustancia con un excipiente, vehículo o portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, otros ingredientes.

A. Ensayos In Vitro

En una materialización, la invención se aplica al examen de compuestos que se unan a la molécula de TS10q23.3 o un fragmento de la misma. El polipéptido o el fragmento puede estar libre en solución, fijo sobre un soporte, expresado en una célula o sobre la superficie de la misma. Ya sea el polipéptido o el compuesto puede ser etiquetado, lo que permite determinar la unión.

En otra materialización, el ensayo puede medir la inhibición de la unión de TS10q23.3 a un sustrato o socio de unión natural o artificial. Se pueden realizar ensayos de unión competitiva en los cuales se etiqueta uno de los agentes (el TS10q23.3, el socio de unión o el compuesto). Normalmente, la especie etiquetada es el polipéptido. Se puede medir la cantidad de etiqueta libre versus la ligada para determinar la unión o la inhibición de la misma.

Otra técnica para el examen masivo de compuestos se describe en WO 84/03564. Se sintetiza un número de compuestos de prueba de péptidos de prueba pequeños sobre un sustrato sólido como, por ejemplo, espigas plásticas o alguna otra superficie. Los péptidos de prueba se hacen reaccionar con TS10q23.3 y se lavan. El polipéptido ligado se detecta por diversos métodos.

El TS10q23.3 purificado puede aplicarse como recubrimiento directamente sobre las placas que se usarán en las técnicas de evaluación de drogas previamente mencionadas. Sin embargo, se pueden utilizar anticuerpos no neutralizantes al polipéptido para inmovilizar el polipéptido a la fase sólida. También pueden utilizarse proteínas de fusión que contengan una región reactiva (preferentemente una región terminal) para conectar la región activa del TS10q23.3 a una fase sólida.

Se pueden utilizar diversas líneas de células que contengan mutaciones en TS10q23.3 naturales o de tipo salvaje o generadas por métodos de la ingeniería genética para estudiar diversos atributos funcionales del TS10q23.3 y cómo un compuesto candidato afecta estos atributos. En otras partes de este documento se describen los métodos para manipular mutaciones, como las que ocurren naturalmente en el TS10q23.3, que conducen o contribuyen a malignidades y/o de otra manera las causan. En dichos ensayos, se formularía apropiadamente el compuesto, dada su naturaleza bioquímica, y se lo contactaría con una célula diana. Dependiendo del ensayo, se puede ser requerir un cultivo. La célula puede entonces ser examinada por un número de ensayos fisiológicos distintos. En la alternativa, se puede llevar a cabo un análisis molecular en el cuál se pueda explorar la función del TS10q23.3, o los mecanismos relacionados. Esto puede involucrar ensayos tales como los correspondientes para la expresión de la proteína, la función enzimática, la utilización de sustratos, los estados de fosforilación de diversas moléculas incluso el TS10q23.3, los niveles de cAMP, la expresión de ARNm (incluyendo la visualización diferencial de la célula entera de ARN o el ARN poli A) y otros.

B. Ensayos in vivo

Esta invención también abarca el uso de diversos modelos animales. En este caso, la identidad que se ha visto entre el TS10q23.3 humano y el de ratón provee una excelente oportunidad para examinar la función del TS10q23.3 en el sistema animal entero donde se expresa normalmente. Para desarrollar o aislar líneas de células mutantes que no expresen el TS10q23.3 normal, se pueden generar modelos de cáncer en ratones que serán altamente predictivos de cánceres en humanos y otros mamíferos. Estos modelos pueden emplear la administración ortotópica o sistémica de células tumorales para imitar cánceres primarios y/o metastásicos. Alternativamente, se pueden inducir cánceres en animales suministrando agentes conocidos como responsables de ciertos eventos asociados con la transformación maligna y/o el avance de tumores. Finalmente, los animales transgénicos (que se discuten más abajo) que carezcan de TS10q23.3 de tipo salvaje se pueden utilizar como modelos para el desarrollo y tratamiento del cáncer.

El tratamiento de animales con los compuestos de prueba involucrará la administración del compuesto, en una forma adecuada, al animal. La administración podrá ser por cualquier ruta que pueda utilizarse con fines clínicos y no clínicos, incluyendo sin limitación, una administración oral, nasal, bucal, rectal, vaginal o tópica. Alternativamente, la administración puede ser por instilación intratraqueal o bronquial, o por inyección intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa. Se contemplan específicamente inyecciones intravenosas sistémicas, administración regional por medio del suministro de sangre o líquido linfático e inyecciones intra-
tumorales.

La determinación in vivo de la eficacia de un compuesto puede involucrar una diversidad de criterios distintos. Dichos criterios incluyen, pero sin limitarse a los listados, supervivencia, reducción de la carga o masa del tumor, detención o retardo del avance del tumor, eliminación de los tumores, inhibición o prevención de metástasis, aumento en el nivel de actividad, mejora en la función efectora inmune y mejoras en la absorción de alimentos.

C. Diseño racional de drogas

El propósito del diseño racional de drogas es producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente activos o los compuestos con los cuales interactúan (agonistas, antagonistas, inhibidores, socios de unión, etc.). Mediante la creación de estos análogos, es posible diseñar drogas que sean más activas o estables que las moléculas naturales, que tengan una susceptibilidad a la alteración diferente o que puedan afectar la función de otras diversas moléculas. En una propuesta, se generaría una estructura tridemensional del TS10q23.3 o de un fragmento del mismo. Esto podría lograrse por cristalografía de rayos X, modelado por computadora o una combinación de ambas técnicas. Un planteamiento alternativo, el "escaneo de alanina", involucra el reemplazamiento al azar de residuos en toda la molécula con alanina, y la determinación del efecto resultante.

Es posible también aislar un anticuerpo específico del TS10q23.3, seleccionado mediante un ensayo funcional, y así resolver su estructura cristalina. En principio, este planteamiento resulta en un núcleo fármaco sobre el cual se puede basar los subsecuentes diseños de drogas. Es posible evitar la cristalografía de proteínas en su totalidad mediante la generación de anticuerpos antiidiotípicos a un anticuerpo funcional farmacológicamente activo. Como una imagen especular de otra imagen especular, se espera que el sitio de unión del antiidiotipo sea un análogo del antígeno original. Se podría entonces usar el antiidiotipo para identificar y aislar péptidos a partir de bancos de péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos seleccionados servirían entonces como núcleo fármaco. Los antiidiotipos se pueden generar utilizando los métodos para producir anticuerpos descritos en este documento, usando un anticuerpo como el antígeno.

Por lo tanto, se pueden diseñar drogas que mejoren la actividad del TS10q23.3 o que actúen como estimuladores, inhibidores, agonistas o antagonistas de TS10q23.3 o de las moléculas afectadas por la función TS10q23.3. En virtud de la disponibilidad de secuencias clonadas de TS0q23.3, se pueden producir cantidades suficientes de TS10q23.3 para llevar a cabo estudios cristalográficos. Además, el conocimiento de las secuencias del polipéptido permite predicciones desarrolladas por computadora de las relaciones estructura-función.

Una sustancia identificada como un modulador de la función del polipéptido puede ser de naturaleza peptídica o no. A menudo se prefieren "moléculas pequeñas" no peptídicas para muchos de los usos farmacéuticos in vivo. De esta manera, se puede diseñar un mimético o una mímica de la sustancia (particularmente si la sustancia es un péptido) para un uso farmacéutico.

El diseño de miméticos de un compuesto farmacéuticamente activo conocido es un método conocido para el desarrollo de farmacéuticos basado en un compuesto "punta" ("lead"). Esto podría ser deseable cuando el compuesto activo sea difícil o caro de sintetizar o cuando sea inapropiado para un método particular de administración, por ejemplo, los péptidos puros son agentes activos inapropiados para composiciones orales ya que tienden a ser rápidamente degradados por las proteasas en el conducto de alimentación. El diseño, síntesis y prueba de miméticos, se utiliza generalmente para evitar la evaluación de la propiedad objetivo al azar en un número grande de moléculas.

Hay varios pasos que normalmente se toman en el diseño de un mimético de un compuesto que tenga una dada propiedad objetivo. Primero, se determinan las partes específicas del compuesto que son críticas y/o importantes para determinar la propiedad objetivo. En el caso de un péptido, esto puede hacerse cambiando sistemáticamente los residuos de aminoácido en el péptido, por ejemplo, sustituyendo cada uno de esos residuos uno por vez. Normalmente se usan los escanes de alanina del péptido para refinar los motivos de dicho péptido. Estas partes o residuos constituyentes de la región activa del compuesto se conocen como su "núcleo fármaco" ("pharmacophore").

Una vez que se encontró su núcleo fármaco, su estructura se modela de acuerdo con sus propiedades físicas, por ejemplo, su estequeometría, enlace, tamaño y/o carga, utilizando datos de diversas fuentes, por ejemplo, técnicas espectroscópicas, datos de difracción de rayos X y NMR. En este proceso de modelado, se pueden utilizar el análisis computacional, el mapeo de similitud (que modela las cargas y/o el volumen del núcleo fármaco, en vez del enlace entre átomos) y otras técnicas.

En una variante de este planteamiento, se modelan la estructura tridimensional del ligando y la de su socio de unión. Esto puede ser especialmente útil cuando el ligando y/o su socio de unión cambien de conformación al enlazarse, permitiendo que el modelo tome en cuenta esto en el diseño del mimético.

Se selecciona la molécula molde sobre la cual se injertarán los grupos químicos que imitan el núcleo fármaco. La molécula molde y los grupos químicos injertados sobre ella pueden ser seleccionados convenientemente de tal manera que el mimético sea fácil de sintetizar, probablemente farmacológicamente aceptable y no se degrade in vivo, al tiempo que retenga la actividad biológica del compuesto punta. Alternativamente, cuando el mimético esté basado en péptidos, se puede lograr una mayor estabilidad ciclando el péptido, aumentando su rigidez. El mimético o miméticos desarrollados de esta manera pueden ser examinados para determinar si tienen la propiedad objetivo o en que medida la presentan. Se puede entonces optimizar o hacer modificaciones que conduzcan a uno o más miméticos finales para una prueba in vivo.

VI. Métodos para el tratamiento de malignidades relacionadas con 10q23.3

Esta invención también involucra, en otra materialización, el tratamiento del cáncer. Los tipos de cáncer que pueden ser tratados de acuerdo con esta invención están limitados sólo por la participación del TS10q23.3. La participación no requiere siquiera que el TS10q23.3 sea mutado o anormal -la sobreexpresión de este supresor de tumores puede en realidad superar otras lesiones dentro de la célula. Por lo tanto, se contempla que una diversidad de tumores puedan ser tratados utilizando una terapia de TS10q23.3, incluidos los cánceres del cerebro (glioblastoma, astrocitoma, oligodendroglioma, ependimomas), pulmón, hígado, bazo, riñones, nodos linfáticos, páncreas, intestino delgado, células sanguíneas, colon, estómago, pecho, endometrio, próstata, testículos, ovarios, piel, cabeza y cuello, esófago, médula ósea, sangre u otros tejidos.

En muchos contextos, no es necesario que se mate la célula tumoral o que se induzca la muerte celular normal o "apoptosis." En vez, para lograr un tratamiento significativo, todo lo que se requiere es que el crecimiento del tumor se desacelere en alguna medida. Esto puede representar que se bloquee completamente el crecimiento del tumor, o que se logre una cierta regresión del tumor. Los términos clínicos de "remisión" o "reducción de la carga tumoral" también son contemplados, de la manera en que se los usan normalmente.

A. Terapias basadas en genética

Una de las materializaciones terapéuticas contempladas por los inventores es la intervención, a nivel molecular, en los eventos involucrados en la tumorigénesis de algunos cánceres. Específicamente, los inventores tienen el propósito de suministrar, a una célula cancerígena, una construcción de expresión que sea capaz de proveer TS10q23.3 a esa célula. Debido a la homología de las secuencias de los genes humanos, caninos y de ratones, se podría utilizar cualquiera de estos ácidos nucleicos en la terapia humana, como también podría utilizarse cualquiera de las variantes de secuencias génicas discutidas precedentemente que codificaran el mismo polipéptido o uno biológicamente equivalente. La extensa discusión sobre vectores de expresión y los elementos genéticos empleados en los mismos se incorpora por referencia a esta sección. Los vectores de expresión particularmente preferidos son los vectores víricos como, por ejemplo, los adenovirus, los virus adeno-asociados, los herpesvirus, los virus vaccinia y los retrovirus. También se prefieren los vectores encapsulados liposómicamente.

Las personas versadas en el arte conocen bien como aplicar el reparto génico en situaciones in vivo y ex vivo. Para vectores víricos, generalmente se prepararán cepas de los mismos. Dependiendo de la clase del virus y del título obtenible, se repartirán 1 X 10^{4}, 1 X 10^{5}, 1 X 10^{6}, 1 X 10^{7}, 1 X. 10^{8}, 1 X 10^{9}, 1 X 10^{10}, 1 X 10^{11} o 1 X 10^{12} partículas infecciosas al paciente. Se pueden extrapolar números similares para formulaciones liposómicas u otras no virales comparando la eficacia relativa de la captación. La formulación como una composición farmacéuticamente aceptable se discute en lo que sigue.

Se contemplan diversas rutas para los diversos tipos de tumores. La sección siguiente sobre rutas contiene una lista extensa de rutas posibles. Se contempla un reparto sistémico para prácticamente cualquier tumor. Esto será especialmente importante para atacar cánceres microscópicos o metastásicos. Cuando pueda identificarse una masa tumoral discreta se puede tomar una diversidad de planteamientos directos, locales y regionales. Por ejemplo, el vector de expresión puede inyectarse directamente al tumor. Éste puede tratarse antes, durante o después de una resección. Luego de la resección, generalmente se reparte el vector mediante un catéter que se deja en su lugar luego de la cirugía. Se puede utilizar la vasculatura tumoral para introducir el vector en el tumor utilizando una vena o arteria de apoyo. También se puede utilizar una ruta de suministro de sangre más distante.

En una materialización distinta, se contempla una terapia génica ex vivo. Este planteamiento es particularmente apropiado para el tratamiento de cánceres asociados a la médula ósea, aunque no se limita al mismo. En una materialización ex vivo, se extraen las células del paciente y se mantienen fuera del cuerpo por al menos un período de tiempo. Durante este período, se reparte una terapia, luego de lo cual se reintroducen las células en el paciente, con la esperanza de que hayan muerto todas las células tumorales en la muestra.

Los transplantes de médula ósea autólogos (ABMT, por sus siglas en inglés) son un ejemplo de terapia génica ex vivo. Esencialmente, el concepto detrás de los ABMT es que el paciente sirva como su propio donante de médula ósea. Por lo tanto, se puede entregar al paciente una dosis normalmente letal de radiación o quimioterapéutica para matar las células tumorales, y repoblar la médula ósea con las propias células del paciente que se han mantenido (y quizás expandido) ex vivo. Dado que la médula ósea está contaminada con células tumorales, es deseable purgarla de estas células. El uso de una terapia génica para lograr este objetivo es todavía otra manera de utilizar el TS10q23.3 de acuerdo con esta invención.

Sistemas de transferencia génica conocidos en el arte pueden ser útiles en la práctica de los métodos de terapia génica de esta invención. Estos incluyen métodos de transferencia vírica y no vírica. Se ha usado un número de virus como vector de transferencia génica o como base para reparar vectores de transferencia génica, incluyendo papovavirus (por ejemplo., SV40, Madzak et al., 1992), adenovirus (Berkner, 1992; Berkner et al., 1988; Gorziglia y Kapikian, 1992; Quantin et al., 1992; Rosenfeld et al., 1992; Wilkinson y Akrigg, 1992; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Schneider et al., 1998), virus vaccinia (Moss, 1992; Moss, 1996), virus adenoasociado (Muzyczka, 1992; Ohi et al., 1990; Russell y Hirata, 1998), los virus herpes incluyendo HSV y EBV (Margolskee, 1992; Johnson et al., 1992; Fink et al., 1992; Breakefield y Geller, 1987; Freese et al., 1990; Fink et al., 1996), lentivirus (Naldini et al., 1996), virus de Sindbis y Semliki Forest (Berglund et al., 1993), y los retrovirus de aves (Bandyopadhyay y Temin, 1984; Petropoulos et al., 1992), murinos (Miller, 1992; Miller et al., 1985; Sorge et al., 1984; Mann y Baltimore, 1985; Miller et al., 1988) y de origen humano (Shimada et al., 1991; Helseth et al., 1990; Page et al., 1990; Buchschacher y Panganiban, 1992).

Los métodos no virales de transferencia génica no vírica conocidos en el arte incluyen técnicas químicas tales, por ejemplo, la coprecipitación con fosfato de calcio (Graham y van der Eb, 1973; Pellicer et al., 1980); técnicas mecánicas, por ejemplo microinyección (Anderson et al., 1980; Gordon et al., 1980; Brinster et al., 1981; Costantini y Lacy, 1981); la transferencia vía liposomas mediada por fusión de membrana (Feigner et al., 1987; Wang y Huang, 1989; Kaneda et al., 1989; Stewart et al., 1992; Nabel et al., 1990; Lim et al., 1991); y la catapción directa de ADN y la transferencia de ADN mediada por receptor (Wolff et al., 1990; Wu et al., 1991; Zenke et al., 1990; Wu et al., 1989; Wolff et al., 1991; Wagner et al., 1990; Wagner et al., 1991; Cotten et al., 1990; Curiel et al., 1992; Curiel et al., 1991). La transferencia génica mediada por virus puede combinarse con la transferencia génica in vivo directa utilizando un reparto liposómico, lo que permite dirigir los vectores víricos a las células tumorales y no a las células no divisibles circundantes. Alternativamente, se puede inyectar la línea de células productora de vectores retrovíricos en los tumores (Culver et al., 1992). La inyección de células productoras proporcionaría entonces una fuente continua de partículas de vectores. Esta técnica ha sido aprobada para su uso en humanos con tumores cerebrales inoperables.

En un planteamiento que combina métodos genicos biológicos y físicos, se combina ADN plasmídico de cualquier tamaño con un anticuerpo conjugado de polilisina específico para la proteína hexón del adenovirus, y el complejo resultante se une a un vector adenovírico. El complejo trimolecular es entonces utilizado para infectar las células. El vector adenovírico permite la unión, internalización y degradación eficaces del endosoma antes de que se dañe el ADN acoplado. Para informarse sobre otras técnicas de reparto de vectores adenovíricos vea Schneider et al. (1998) y las patentes de los Estados Unidos N^{os} 5.691.198; 5.747.469; 5.436.146 y 5.753.500.

Los complejos liposoma/ADN han demostrado ser capaces de mediar transferencias génicas in vivo directas. Mientras que en preparados de liposomas estándar el proceso de transferencia génica es no específico, se ha reportado la captación y expresión in vivo en depósitos tumorales, luego de una administración in situ directa (Nabel, 1992).

Por vectores de expresión, en el contexto de una terapia génica, se entiende que se incluyen construcciones que contengan secuencias suficientes para expresar un polinucleótido que ha sido clonado en el lugar. En los vectores de expresión víricos, la construcción tiene secuencias virales suficientes como para dar apoyo al empaquetamiento de la construcción. Si el polinucleótido codifica un gene TS10q23.3, la expresión producirá la proteína correspondiente. Si el polinucleótido codifica un polinucleótido antisentido o una ribozima, la expresión producirá el polinucleótido antisentido o la ribozima. Por lo tanto, en este contexto, la expresión no requiere que se sintetice un producto proteína. Además del polinucleótido clonado en el vector de expresión, el vector también contiene un promotor funcional en las células eucarióticas. La secuencia del polinucleótido clonado está bajo el control de este promotor. Los promotores eucarióticos apropiados incluyen aquellos descritos anteriormente. El vector de expresión puede también incluir secuencias tales como marcadores seleccionables y otras secuencias descritas en este documento.

B. Inmunoterapias

La immunoterapia, en general, descansa en el uso de células efectoras inmune y en moléculas para tomar como objetivo y destruir células cancerosas. El efector inmune puede ser, por ejemplo, un anticuerpo específico para algún marcador sobre la superficie de la célula tumoral. El anticuerpo en sí mismo puede servir como un efector de terapia o puede reclutar a otras células para efectuar la muerte celular. El anticuerpo también puede estar conjugado a una droga o toxina (quimioterapéutica, radionucleido, cadena A de la ricina, toxina del cólera, toxina de la pertusis, etc.) y servir meramente como un agente direccionante. Alternativamente, el efector puede ser un linfocito que acarree una molécula de superficie que interactúa, ya sea directa o indirectamente, con una célula tumoral diana. Las diversas células efectoras incluyen las células T citotóxicas y las células NK.

De acuerdo con esta invención, es improbable que TS10q233 pueda servir como diana de un efector inmune ya que (i) es improbable que se exprese en la superficie de la célula y (ii) es la presencia, no la ausencia, de TS10q23.3 la que está asociada con el estado normal. Sin embargo, es posible que formas mutantes particulares de TS10q23.3 puedan ser tomadas como objetivos de la inmunoterapia, ya sea utilizando anticuerpos, conjugados de anticuerpos o células efectoras inmune.

Un escenario más probable es que inmunoterapia pudiera utilizarse como una terapia combinada, conjuntamente con una terapia genética dirigida al TS10q23.3. El planteamiento general de esta terapia se discute en lo que sigue. Generalmente, la célula tumoral debe acarrear algún marcador que sea receptivo de ser tomado como diana, es decir, que no esté presente en la mayoría de las otras células. Existen muchos marcadores de tumores y cualquiera de ellos pueden ser apropiados para el direccionamiento en el contexto de esta invención. Los marcadores de tumor comunes incluyen el antígeno carcinoembriónico, el antígeno específico de la próstata, el antígeno asociado con tumores urinarios, el antígeno fetal, la tirosinasa (p97), gp68, TAG-72, HMFG, el antígeno Sialil Lewis, MucA, MucB, PLAP, el receptor de estrógeno, el receptor de laminina, erb B y p155.

Inmunoconjugados. La invención proporciona además inmunotoxinas en las que el anticuerpo que se une a un marcador de cáncer, por ejemplo un TS10q23.3 mutante, se conecta a un agente citotóxico. La tecnología de inmunotoxinas está bastante bien desarrollada y es conocida por aquellas personas versadas en el arte. Las inmunotoxinas son agentes en los que el componente anticuerpo está conectado a otro agente, particularmente un agente citotóxico o de otra manera anticelular, con la capacidad de matar o suprimir el crecimiento o la división de las células.

Como se usa en este documento, los términos "toxina" y "porción tóxica" se emplean para referirse a cualquier agente citotóxico o de otra manera anticelular que tenga una propiedad supresora o destructiva. Las toxinas, por lo tanto, son agentes farmacológhicos que pueden ser conjugados a un anticuerpo y repartidos en una forma activa a la célula, donde ejercerán un efecto nocivo significativo.

La preparación de inmunotoxinas es, en general, bien conocida en el arte (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos Nº 4.340.535, incorporada por referencia a este documento). También se conoce que mientras que las inmunotoxinas basadas en IgG típicamente exhibirán una mejor capacidad de unión y una eliminación renal más lenta de la sangre que sus contrapartes Fab, las inmunotoxinas basadas en fragmentos de Fab generalmente exhibirán una mejor capacidad de penetración de tejidos que las inmunotoxinas basadas en IgG.

Agentes anticelulares ejemplares incluyen agentes quimioterapéuticos, radioisótopos así como citotoxinas. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos son las hormonas como, por ejemplo, los esteroides; antimetabolitos tales como la citosina arabinósida, fluorouracilo, metotrexato o aminopterina; antraciclina; mitomicina C; alcaloides vinca; demecolcina; etoposida; mitramicina; o agentes alquilantes tales como clorambucilo o melfalano.

Las inmunotoxinas preferidas a menudo incluyen una toxina derivada de plantas, hongos o bacterias, tales como la toxina de cadena A, una proteína que inactiva los ribosomas, sarcina a, aspergilina, restirictocina, una ribonucleasa, la toxina de la difteria o la exotoxina del pseudomonas, para mencionar sólo unos pocos ejemplos. El uso de construcciones toxina-anticuerpo es bien conocido en el arte de las inmunotoxinas, como lo es su unión a anticuerpos. Por supuesto, las combinaciones de las diversas toxinas también podrían acoplarse a una molécula del anticuerpo y, por lo tanto, adaptarse a una citotoxicidad variable o aún incrementada.

Un tipo de toxina que se une a anticuerpos es la ricina, prefiriéndose particularmente la cadena A de la ricina desglicosilada. Como se usa en este documento, el término "ricina" tiene el propósito de referirse a la ricina preparada tanto de fuentes naturales como por medios recombinantes. Las diversas formas "recombinantes" o "preparadas por medio de técnicas de la ingeniería genética" de la molécula de ricina son conocidas por las personas versadas en el arte, y todas se pueden emplear de acuerdo con esta invención.

Se prefiere la cadena A de la ricina desglicosilada (dgA) por su extrema potencia, vida media más larga y porque es económicamente posible manufacturarla en un grado y escala clínicos (comercialmente disponible de Inland Laboratories, Austin, TX.). También se puede emplear la cadena A de la ricina truncada, una ricina de la que se han quitado los 30 aminoácidos de la terminal N (producida por Nagarase (Sigma)).

Se puede lograr la conexión o acople de una o más porciones de toxina a un anticuerpo mediante diversos mecanismos, por ejemplo, enlace covalente, unión de afinidad, intercalación, enlace coordinado y formación de complejos. Los métodos de unión preferidos son aquellos que involucran un enlace covalente, usando, por ejemplo, enlazantes químicos entrecruzados, péptidos naturales o enlances bisulfuro.

El enlace covalente puede lograrse mediante la condensación directa de las cadenas laterales existentes o por la incorporación de moléculas puente externas. Muchos agentes bi o polivalentes son útiles para acoplar moléculas de proteínas a otras proteínas, péptidos o funciones amina. Ejemplos de agentes de acoplamiento son las carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehído, diazobencenos y hexametilendiaminas. Esta lista no tiene el propósito de ser exhaustiva de los diversos agentes acoplantes conocidos en el arte; en vez, es simplemente ejemplar de los agentes más comunes que pueden utilizarse.

En materializaciones preferidas, se contempla que se puede desear primero derivar el anticuerpo, y luego unir la componente toxina al producto derivado. Como se usa en este documento, el término "derivar" se usa para describir la modificación química del sustrato anticuerpo con un agente de enlace entrecruzado. Ejemplos de agente de enlace entrecruzado para ser usados de esta manera incluyen los enlace disulfuro con enlazantes SPDP (N-sucinimidil-3-(2-piridilditio)propionato y SMPT(4-sucinimidil-oxicarbonil-a-metil-a(2-piridilditio) tolueno).

Los enlaces biológicamente liberables son de particular importancia para lograr una inmunotoxina clínicamente activa donde la porción toxina sea capaz de ser liberada del anticuerpo una vez que haya entrado en la célula diana. Se conocen numerosos tipos de construcciones de enlace, incluso simplemente la formación de un enlace disulfuro directo entre los grupos sulfihidrilos contenidos en aminoácidos tales como cisteína o de otra manera introducidos en las respectivas estructuras de las proteínas, y conexiones disulfuro que utilicen porciones ligantes disponibles o diseñadas.

Se conocen numerosos tipos de ligantes con enlaces disulfuro que se han empleado con éxito para conjugar porciones toxinas a anticuerpos, pero generalmente se prefieren ciertos ligantes como, por ejemplo, ligantes de enlace disulfuro estéricamente impedidos por su mayor estabilidad in vivo que evita, por lo tanto, la liberación de la porción toxina antes de la unión al sitio de acción. Un reactante de enlace entrecruzado particularmente preferido es SMPT, aunque pueden emplearse otros ligantes tales como SATA, SPDP y 2-iminotiolano.

Una vez conjugados, es importante purificar el conjugado para quitar contaminantes tales como anticuerpos o cadenas A no conjugados. Es importante quitar las cadenas A no conjugadas debido a la posibilidad de un aumento de toxicidad. Más aún, es importante quitar el anticuerpo no conjugado para evitar la posibilidad de competencia por el antígeno entre las especie conjugada y la no conjugada. De todas maneras, se han encontrado diversas técnicas de purificación proporcionan a los conjugados un grado de pureza suficiente para hacerlos clínicamente útiles.

En general, la técnica más preferida incorporará el uso de una columna de Blue Sepharose con una etapa de filtración o permeación en gel. La Blue Sepharose es una columna matriz compuesta de Cibacron Blue 3GA y agarosa, la que es útil en la purificación de inmunoconjugados. El uso de Blue-Sepharose combina las propiedades del intercambio iónico con la unión de la cadena A para lograr una buena separación entre la unión conjugada y la no conjugada. La Blue Sepharose permite la eliminación del anticuerpo libre (no conjugado) del preparado de conjugado. Para eliminar la toxina libre (no conjugada) (por ejemplo, dgA) se puede emplear una etapa de cromatografía de exclusión molecular utilizando ya sea un procedimiento de filtración en gel convencional o una cromatografía líquida de alto rendimiento.

Después de que se haya logrado un conjugado suficientemente purificado, generalmente se deseará prepararlo en una composición farmacéutica que pueda ser administrada parenteralmente. Esto se hace utilizando para la última etapa de la purificación un medio con una composición farmacéutica apropiada. Tales formulaciones típicamente incluyen amortiguadores farmacéuticos, junto con excipientes, agentes estabilizantes y similares. Las composiciones farmacéuticamente aceptables son estériles, no inmunogénicas y no pirogénicas. Los detalles de su preparación son bien conocidos en el arte y están descritos en más detalle en este documento. Se debe notar que la contaminación con endotoxinas debe mantenerse por debajo de un nivel seguro, por ejemplo, menos de 0.5 ng/mg de proteína.

Las composiciones farmacéuticas apropiadas de acuerdo con esta invención generalmente comprenderán de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 mg del conjugado deseado mezclado en un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable como, por ejemplo, una solución acuosa estéril, para dar una concentración final de aproximadamente 0.25 a aproximadamente 2.5 mg/ml del conjugado.

Como se mencionó anteriormente, los anticuerpos de la invención pueden ligarse a uno o más agentes quimioterapéutico como, por ejemplo, drogas anti tumores, citoquinas, antimetabolitos, agentes alquilantes, hormonas, ácidos nucleicos y similares, que pueden por lo tanto ser dirigidos a una célula cancerosa que exprese TS10q23.3 utilizando el anticuerpo conjugado. Las ventajas de los agentes conjugados con anticuerpos sobre sus contrapartes no conjugadas con anticuerpos es la selectividad adicional proporcionada por el anticuerpo.

En el análisis de los diversos agentes quimioterapéuticos y farmacológicos disponibles para ser conjugados a un anticuerpo, sería deseable considerar particularmente aquellos que han previamente mostrado conjugarse con éxito a anticuerpos y funcionarfarmacológicamente. Ejemplos de agentes antineoplásicos que se han utilizado incluyen doxorubicina, daunomicina, metotrexato, vinblastina. Más aún, también se ha descrito el agregado de otros agentes tales como neocarcinostatina, macromicina, trenimona y a-amanitina. Las listas de agentes apropiados que se presentan en este documento son, por cierto, meros ejemplos ya que la tecnología para unir agentes farmacéuticos a anticuerpos para un reparto específico a los tejidos está bien establecida.

Por lo tanto, generalmente se cree que es posible conjugar a anticuerpos cualquier agente farmacológico que tenga un grupo amino primario o secundario, hidrazina o hidrazida o un grupo carboxil alcohol, fosfato o alquilante disponibles para una unión o enlace cruzado a los aminoácidos o grupos carbohidrato del anticuerpo. En el caso de estructuras de proteínas, esto se logra más fácilmente por medio de un agente de enlace enrecruzado, como se ha descrito anteriormente para las inmunotoxinas. El agregado también puede lograrse mediante un ácido lábil acil hydrazona a un vínculo cis aconitil entre la droga y el anticuerpo o utilizando un péptido espaciador como L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala entre el grupo carboxil \gamma de la droga y un aminoácido del anticuerpo.

C. Terapia de proteínas

Otro planteamiento terapéutico es el suministro, a un sujeto, del polilpétido TS10q23.3 o fragmentos activos, péptidos sintéticos, miméticos u otros análogos del mismo. La proteína puede ser producida por medios de expresión recombinante o, si es lo suficientemente pequeña, generada por un sintetizador de péptidos automatizado. Las formulaciones se seleccionarán basándose en la ruta de administración y el propósito de la misma, e incluyen, sin limitación, formulaciones liposómicas y preparados farmacéuticos clásicos.

D. Terapia combinada de inmunoterapia y quimio o radioterapia

La resistencia de la célula tumoral a agentes que dañen el ADN representa un problema mayor en la oncología clínica. Uno de los objetivos de la investigación del cáncer en la actualidad es encontrar maneras de mejorar la eficacia de la quimio y la radioterapia. Una manera es combinar dichas terapias tradicionales con la terapia génica. Por ejemplo, el gene de la timidina quinasa (HS-tk) del herpex simple, cuando se lo reparte a los tumores cerebrales mediante un sistema de vector retrovírico, induce exitosamente la susceptibilidad al agente antivírico ganciclovir (Culver et al., 1992). En el contexto de esta invención, se contempla que de la misma manera se pueda utilizar una terapia de reemplazo de TS10q23.3 conjuntamente con una intervención quimio o radioterapéutica. Puede también probar ser efectivo combinar la terapia génica del TS10q23.3 con inmunoterapia, como se describe anteriormente.

Para matar células, inhibir su crecimiento, la metástasis o la angiogénesis o de otra manera revertir o reducir el fenotipo maligno de las células tumorales, utilizando los métodos y composiciones de esta invención, generalmente se contactaría una célula "diana" con una construcción de expresión de TS10q23.3 y al menos un agente más. Estas composiciones se suministrarían en una cantidad combinada efectiva para matar las células o inhibir su proliferación. Este proceso puede involucrar contactar las células con la construcción de expresión y, al mismo tiempo, con el agente o factor o agentes o factores. Esto se puede lograr contactando la célula con una composición o formulación farmacológica única que incluya ambos agentos, ó contactándola con dos composiciones o formulaciones distintas, al mismo tiempo, donde una de las composiciones incluye la construcción de expresión y las otra el agente.

Alternativamente, el tratamiento de terapia génica puede preceder o seguir el tratamiento con el otro agente a intervalos que pueden fluctuar de minutos a semanas. En las materializaciones donde la construcción de expresión y el otro agente se aplican por separado a la célula, generalmente se aseguraría de que no pase un plazo de tiempo significativo entre ambas entregas, de manera tal que el agente y la construcción de expresión puedan todavía ejercer un efecto combinado ventajoso sobre la célula. En dichas circunstancias, se contempla que se contactaría la célula con las dos modalidades dentro de aproximadamente 12 a 24 horas de cada una y, preferiblemente dentro de aproximadamente 6 a 12 horas de cada una, siendo un tiempo de retardo de aproximadamente 12 horas el más preferido. Sin embargo, en algunas situaciones, puede ser deseable extender el plazo para el tratamiento de manera significativa, con un lapso de varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8) entre las respectivas administraciones.

Es también concebible que se desee más de una administración ya sea de TS10q23.3 o del otro agente. Se pueden emplear diversas combinaciones como las siguientes, donde TS10q23.3 se representa por "A" y el otro agente por "B": A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B. Se contemplan también otras combinaciones. Nuevamente, para lograr la muerte celular, ambos agentes deben ser repartidos a la célula en una cantidad combinada que sea eficaz para matar la célula.

Los agentes o factores apropiados para una terapia combinada son cualquier compuesto químico o método de tratamiento que induzca daño al ADN cuando se lo aplique a una célula. Dichos agentes y factores incluyen radiación y ondas que induzcan daño al ADN tales como por ejemplo, radiaciones \gamma, rayos X, radiación UV, microondas, emisiones electrónicas y similares. Una diversidad de compuestos químicos, también descritos como "agentes quimioterapéuticos," funcionan para inducir daño al ADN; y se tiene el propósito de usar a todos ellos en los métodos combinados de tratamiento divulgados en este documento. Los agentes quimotrosapéuticos que se contempla usar incluyen, por ejemplo, adriamicina, 5-fluorouracilo (5FU), etoposida (VP-16), camptotecina, actinomicina D, mitomicina C, cisplatina (CDDP) y aún peróxido de hidrógeno. La invención también abarca el uso de una combinación de uno o más agentes que dañen el ADN, ya sea basados en radiación o compuestos reales como, por ejemplo, el uso de rayos X con cisplatina o el uso de cisplatina con etoposida. En ciertas materializaciones, se prefiere particularmente el uso de cisplatina en combinación con una construcción de expresión de TS10q23.3.

Para tratar el cáncer de acuerdo con esta invención, se contactarían las células tumorales con un agente, además de contactarlas con la construcción de expresión. Esto puede lograrse irradiando el sitio del tumor localizado con radiación tal como, por ejemplo, rayos X, luz ultravioleta, rayos \gamma o aún microondas. Alternativamente, se pueden contactar las células tumorales con el agente mediante la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprenda un compuesto tal como, por ejemplo, adriamicina, 5-fluorouracilo, etoposida, camptotecina, actinomicina D, mitomicina C, o más preferiblemente, cisplatin. El agente puede prepararse y usarse como una composición terapéutica combinada, o kit, combinándolo con una construcción de expresión de TS10q23.3, como se describe con anterioridad.

Los agentes que forman una unión entrecruzada con ácidos nucleicos, específicamente con el ADN, se consideran que facilitan daños al ADN los que conducen a una combinación sinergética antineoplásica con TS10q23.3. Se pueden utilizar agentes tales como la cisplatina y otros agentes alquilantes del ADN. La cisplatina se ha utilizado ampliamente para tratar el cáncer, usándose en las aplicaciones clínicas dosis eficaces de 20 mg/m^{2} por 5 días cada tres semanas, por un total de 5 aplicaciones. La cisplatina no se adsorbe oralmente y debe entonces ser repartida mediante inyecciones intravenosas, subcutáneas, intratumorales o intraperitoneales.

Los agentes que dañan al ADN también incluyen compuestos que interfieren con la replicación, mitosis y segregación cromosómica del ADN. Tales compuesto quimioterapéuticos incluyen la adriamicina, la que se conoce también como doxorubicina, etoposida, verapamil, podofilotoxina y similares. Ampliamente utilizados en un contexto clínico para el tratamiento de neoplasmas, estos compuestos se administran mediante bolos inyectados intravenosamente en dosis que oscilan entre 25-75 mg/m^{2} en intervalos de 21 días de adriamicina, a 35-50 mg/m^{2} de etoposida intravenosa u, oralmente, el doble de la dosis intravenosa.

Los agentes que interrumpen la síntesis y fidelidad de los precursores y subunidades de los ácidos nucleicos también llevan al daño del ADN. Como tal, se ha desarrollado un número de precursores de ácidos nucleicos. Particularmente útiles son los agentes que han sido sometidos a extensas pruebas y se encuentren fácilmente disponibles. Para tal fin, se prefiere utilizar agentes tales como fluorouracil (5-FU) para tejidos neoplásicos, lo que hace que este agente sea particularmente útil para tomar células neoplásicas como objetivo. Aunque bastante tóxico, el 5-FU es aplicable con una amplia gama de portadores, incluyendo tópicos, aunque comúnmente se use una administración intravenosa que oscila de 3 a 15 mg/kg/día.

Otros factores que causan daño al ADN y que han sido extensamente utilizados incluyen lo que comúnmente se conocen come rayos \gamma, rayos X y/o el reparto directo de radioisótopos a las células tumorales. Se contempla también otras formas de factores que causen daños al ADN como, por ejemplo, microondas y radiación ultravioleta. Es muy probable que todos estos factores causen una amplia gama de daños al ADN, en los precursores del ADN, la replicación y reparación del mismo y el montaje y mantenimiento del cromosoma. Las dosis de rayos X varían entre 50 a 200 roentgens diarios por un período de tiempo prolongado (de 3 a 4 semanas) a dosis únicas de 2000 a 6000 roentgens. Las dosis de radioisótopos pueden variar ampliamente y dependen de la vida media del isotopo, la intensidad y tipo de radiación emitida y su absorción por las células neoplásicas.

Se refiere al artesano versado a "Remington's Pharmaceutical Sciences", edición decimoquinta, capítulo 33 y, en particular, a las páginas 624-652. Alguna variación en las dosis ocurrirá, necesariamente, según sea la condición del sujeto a ser tratado. La persona responsable de la administración determinará, en todo caso, la dosis apropiada para cada sujeto en particular. Más aún, para una administración humana, los preparados deben satisfacer los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por la Oficina de Estándares Biológicos de la FDA.

Los inventores sugieren que el reparto regional de construcciones de expresión de TS10q23.3 a los pacientes con cánceres vinculados a 10q23.3 es un método eficaz de repartir genes terapéuticamente eficaces para contrarrestar la enfermedad clínica. De la misma manera, la quimio o radioterapia puede dirigirse a una región afectada en particular del cuerpo de los sujetos. En la alternativa, el reparto sistémico de las construcciones de expresión y/o los agentes puede ser apropiado en ciertas circunstancias, por ejemplo, cuando haya ocurrido una metástasis extensa.

Además de combinar terapias que tomen al TS10q23.3 como objetivo con quimio o radioterapias, se contempla también que será ventajosa la combinación con otras terapias génicas. Por ejemplo, tomar al mismo tiempo como objetivo al TS10q23.3 y a las mutaciones de p53 o p16 puede producir un tratamiento anticancerígeno mejorado. También se puede tomar como objetivo cualquier otro gene relacionado con tumores como, por ejemplo, p21, Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, BCRA2, pl6, FHIT, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, FCC, MCC, ras, myc, neu, raf erb, src, fins, jun, trk, ret, gsp, hst, bcl y abl.

Se debe hacer notar que cualquiera de las terapias precedentes puede probar ser útil en sí misma para tratar un TS10q23.3. En este respecto, la referencia a una combinación de terapias químicas y génicas no dirigidas al TS10q23.3 debe entenderse también como contemplando que estas terapias puedan ser empleadas por separado.

E. Formulaciones y rutas para la administración a pacientes

Cuando se contemplan aplicaciones clínicas, será necesario preparar composiciones farmacéuticas - -vectores de expresión, cepas de virus, proteínas, anticuerpos y drogas en una forma apropiada para la aplicación que se propone. Generalmente, esto requerirá preparar composiciones que estén esencialmente libres de pirógenos así como de otras impurezas que puedan causar daños a humanos o animales.

Generalmente, se dejará emplear sales y amortiguadores apropiados para producir vectores de reparto estables y permitir su captación por las células diana. También se emplearán amortiguadores cuando se introduzcan células recombinantes en un paciente. Las composiciones acuosas de esta invención comprenden una cantidad efectiva del vector para las células, disuelto o disperso en un portador o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones se refieren como inóculos. La frase "farmacéutica o farrmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no produzcan reacciones adversas, alérgicas o desfavorables cuando se las administra a un animal o a un humano. Como se usa en este documento, un "portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungosos, agentes isotónicos y de retraso de absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en el arte. Excepto en la medida en que cualquiera de estos medios y agentes convencionales sea incompatible con los vectores o las células de esta invención, se contempla su uso en composiciones terapéuticas. Se puede también incorporar ingredientes activos complementarios en las composiciones.

Las composiciones activas de esta invención pueden incluir preparados farmacéuticos clásicos. La administración de estas composiciones conforme con esta invención será por cualquier ruta común siempre que el tejido diana sea accesible por dicha ruta. Esto incluye la vía oral, nasal, bucal, rectal, vaginal ó tópica. Alternativamente, la administración puede ser por inyección. ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa. Tales composiciones serían normalmente administrados como composiciones farmacéuticamente aceptables, como se describe anteriormente.

Los compuestos activos pueden también ser administrados parenteral o intraperitonealmente. Las soluciones de los compuestos activos como bases libres o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua propiamente mezclada con un surfactante, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicol líquido y mezclas de los mismos, y en aceites. Bajo condiciones normales de almacenamiento y uso, estos preparados contienen un preservativo para prevenir el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticamente apropiadas para un uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación ocasional de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos la forma debe ser estéril y, en la medida de que de que se puedan usar jeringas con facilidad, debe ser fluida. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como, por ejemplo, bacterias y hongos. El portador debe ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol liquido y similares), mezclas apropiadas de los mismos y aceites vegetales. Se debe mantener una fluidez apropiada mediante, por ejemplo, el uso de un recubrimiento como, por ejemplo, lecitina, el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de una dispersión y el uso de surfactantes. Se puede prevenir la acción de microorganismos mediante diversos agentes antibacterianos y antifungosos como, por ejemplo, parabens, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible utilizar agentes isotónicos como, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse mediante el uso en las composiciones de agentes retrasantes de la absorción como, por ejemplo, monoestearato de aluminio y
gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente apropiado con diversos otros ingredientes que se enumeran precedentemente, como sean requeridos, seguido por una esterilización por filtrado. Generalmente, las dispersions se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados precedentemente. En el caso de polvos estériles para la preparación de la soluciones inyectable, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y secado por congelamiento que rinden un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución de los mismos previamente esterilizada por filtración.

Como se usa en este documento, la expresión "portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungosos, agentes isotónicos y de retraso de absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en el arte. Excepto en la medida de que cualquiera de estos medios y agentes convencionales sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en composiciones terapéuticas. Se puede también incorporar ingredientes activos complementarios en las composiciones.

Para una administración oral, los polipéptidos de esta invención puede ser incorporados con excipientes y utilizados en la forma de enjuagues bucales no ingeribles y dentífricos. Un enjuague bucal puede ser preparado incorporando el ingrediente activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado como, por ejemplo, una solución de borato de sodio (Solución de Dobell). Alternativamente, el ingrediente activo puede ser incorporado en un lavado antiséptico que contenga borato de sodio, glicerina y bicarbonato de potasio. El ingrediente activo también puede dispersarse en dentífricos, incluyendo geles, pastas, polvos y lechadas. El ingrediente activo puede agregarse en una cantidad terapéuticamente eficaz a una pasta dentífrica que puede incluir agua, aglutinantes, abrasivos, saborizadores y agentes espumantes y humectantes.

Las composiciones de esta invención pueden ser formuladas en una forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición ácida (formadas con los grupos amino de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánica como, por ejemplo, los hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y con bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaina y similares.

Luego de su formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la dosificación formulada y en una cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones son fácilmente administradas en una diversidad de formas de dosificación como, por ejemplo, soluciones inyectables, cápsulas de liberación de drogas y similares. Para la administración parenteral de una solución acuosa, por ejemplo, la solución debería ser apropiadamente amortiguada, si es necesario, y el líquido diluyente hecho isotónico con sales o glucosa en una cantidad suficiente. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente apropiadas para una administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En este respecto, las personas versadas en el arte conocerán, a la luz de esta divulgación, los medios acuosos estériles que pueden ser empleados. Por ejemplo, se podría disolver una dosis en 1 ml de solución isotónica de NaCl y ya sea agregarla a 1000 ml de fluido hipodermoclisis o inyectarla en el sitio de infusión propuesto (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", decimoquinta edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Alguna variación en la dosis ocurrirá, necesariamente, según sea la condición del sujeto que sea tratado. La persona responsable de la administración determinará, en todo caso, la dosis apropiada para cada sujeto en particular. Más aún, para una administración humana, los preparados deben satisfacer los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por la Oficina de Estándares Biológicos de la FDA.

VII. Animales transgénicos/Animales knockout

En una materialización de la invención, se producen animales transgénicos que contienen un transgene funcional que codifica un polipéptido TS10q23.3 funcional o variantes del mismo. Los animales transgénicos que expresan transgenes de TS10q23.3, líneas de células recombinantes derivadas de dichos animales y embrios transgénicos pueden ser útiles en los métodos para examinar e identificar agentes que induzcan o repriman la función del TS10q23.3. Los animales transgénicos de esta invención también pueden utilizarse como modelos para estudiar indicaciones tales como cánceres.

En una materialización de la invención, se introduce un transgene de TS10q23.3 en un anfitrión no humano para producir un animal transgénico que exprese un gene TS10q23.3 humano o murino. El animal transgénico se produce por la integración del transgene en el genoma de una manera que permita la expresión del transgene. Los métodos para producir animales transgénicos son descritos en forma general por Wagner y Hoppe (patente de los Estados Unidos Nº 4.873.191; la que es incorporada por referencia a este documento), Brinster et al. 1985; (también incorporada por referencia en su totalidad a este documento) y en "Manipulating the Mouse Embryo; A Laboratory Manual" 2ª edición (dirigida por Hogan, Beddington, Costantimi y Long, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994; que es incorporada por referencia a este documento en su totalidad).

Puede ser deseable reemplazar el TS10q23.3 endógeno por recombinación homóloga entre el transgene y el gene endógeno; o el gene endógeno puede ser eliminado por deleción como en la preparación de animales "knock-out". Típicamente, se transfiere un gene TS10q23.3 flanqueado por secuencias genómicas por microinyección en un óvulo fertilizado. El óvulo microinyectado se implanta en una hembra anfitriona, y se examine la prole por la expresión del transgene. Los animales transgénicos pueden producirse de óvulos fertilizados de un número de animales incluidos, pero sin limitarse a ellos, reptiles, anfibios, pájaros, mamíferos y peces. En una materialización particularmente preferida, se generan ratones transgénicos que sobreexpresen TS10q23.3 o lo expresen en una forma mutante del polipéptido. Alternativamente, la ausencia de TS10q23.3 en ratones "knock-out" permite el estudio de los efectos que la pérdida de la proteína TS10q23.3 tiene sobre una célula in vivo. Los ratones knock-out también proporcionan un modelo del desarrollo de cánceres relacionados a TS10q23.3.

Los métodos para producir animales knockout están descritos en general por Shastry (1995, 1998) y Osterrieder y Wolf (1998). La producción de animales de knockout condicional, en los que el gene es activo hasta que se lo inactiva (knocked out) en el momento deseado está descrita en forma general por Feil et al. (1996), Gagneten et al. (1997) y Lobe y Nagy (1998). Cada una de estas publicaciones se incorpora por referencia a este documento.

Como se expresó anteriormente, los animales transgénicos y las líneas de células derivadas de dichos animales pueden encontrar uso en ciertos experimentos de prueba. En este respecto, los animales transgénicos y las líneas de células capaces de expresar TS10q23.3 mutante o de tipo salvaje pueden exponerse a las sustancias de prueba. Estas sustancias pueden examinarse por su capacidad de potenciar la expresión y/o la función del TS10q23.3 de tipo salvaje o de deteriorar la expresión o función de TS10q23.3 mutante.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se incluyen para demostrar las materializaciones preferidas de la invención. Las personas versadas en el arte apreciarán que las técnicas divulgadas en los ejemplos que siguen son técnicas descubiertas por los inventores que funcionan bien en la práctica de la invención, y por lo tanto pueden considerarse que constituyen los modos preferidos de practicarla. Sin embargo, las personas versadas en el arte deberían apreciar, a la luz de esta divulgación, que se pueden hacer muchos cambios en las materializaciones específicas que se divulgan y aún así obtener un resultado similar sin apartarse de los conceptos, el espíritu y el alcance de la invención.

Más específicamente, será obvio que los agentes descritos en este documento pueden ser reemplazados por ciertos otros agentes que estén química y fisiológicamente relacionados a los mencionados en primer lugar y, al mismo tiempo, lograrse el mismo resultado o uno similar. Todos estos sustitutos y modificaciones serán obvias para las personas versadas en el arte y se considerarán dentro de los conceptos, el espíritu y el alcance de la invención como se la define en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1 Deleciones homocigóticas en líneas de células gliomas

Los inventores han examinado el ADN de una serie de 21 líneas de células glioma y cultivos primarios, junto con células normales, para identificar deleciones homocigóticas de material genómico en el cromosoma 10. Los marcadores se eligieron por su ubicación aproximada en regiones previamente implicadas o cercana a ellas (Fig. 1). Las células analizadas fueron generadas en el Departamento de Neurooncología de UTMDACC (LG11, EFC-2, PL-1, PC-1, JW, FG-2, FG-0, NG-l, PH-2, KE, PC-3, y D77), se encontraban comercialmente disponibles (U138, A172, U373, U87, U251, U118, y T98G) o se obtuvieron de colaboradores (astro de 13 semanas, D54-MG). Los marcadores se obtuvieron de Research Genetics, Huntsville, AL, o se sintetizaron de secuencias reportadas. Una línea de células, EFC-2, reveló una deleción homocigótica grande asociada con cuatro marcadores circundantes a D10S215 (Fig. 2). Esta deleción se observó también por FISH utilizando YAC 746h6_{s} que mapea en la región. Otras tres líneas de células (D-54, A172, y LG11) también presentaron deleciones homocigóticas en AFM086 y, en consecuencia, implican enfáticamente la región como conteniendo un gene supresor de tumores putativo (Fig. 2). Las deleciones en las reacciones PCR™ se llevaron a cabo en la presencia de dos pares de cebadores (multiplejos) para asegurar las condiciones de amplificación apropiadas. Todas las deleciones se confirmaron mediante (al menos) reacciones en triplicado. La misma región ha sido también implicada en carcinomas de próstata (Gray et al., 1995). Las deleciones homocigóticas de las líneas de células han sido también utilizadas para definir el locus de un gene supresor de tumores en 3p21.3 en carcinomas pulmonares de las células pequeñas (Daly et al., 1993; Kok et al., 1994; Wei et al.,
1996).

Ejemplo 2 Retención de los locus 10q en células híbridas suprimidas

La segunda estrategia de los inventores fue examinar las regiones del cromosoma 10 que se retuvieron en los clones híbridos suprimidos, pero en ausencia de clones revertientes. Este análisis extiende los estudios previos de los inventores, demostrando la presencia de dos locus supresores de tumores en el cromosoma 10 y analizando las regiones que se retuvieron. Los híbridos que retuvieron todo o parte de 10q no crecieron en agarosa suave ni en ratones desnudos (clones "totalmente" suprimidos), mientras que las células híbridas que perdieron la mayoría del cromosoma l0q insertado crecieron en agarosa suave, pero fueron no tumorigénicas (clones "parcialmente" suprimidos; Steck et al., 1995; Fig. 3, costado derecho). Previamente se había mostrado que los clones originales U251N10.6, N10.7 y N10.8 sólo retienen fragmentos de 10q (Pershouse et al., 1993; Steck et al., 1995). Utilizando marcadores microsatélite informativos adicionales, se identificó a las tres regiones retenidas en los tres clones suprimidos; una región de 22 cM desde D10S219 a D10S110, una región de 14 cM desde D10S192 a D10S187 y una región de 18 desde D10S169 hasta D10Sl134 (Fig. 3).

Para evitar esta limitación, el cromosoma 10 marcado como resistente a la neomicina transferido originalmente del híbrido U251.N10.7 fue "rescatado" por una transferencia cromosómica mediada por micro células a las células A9 de ratón. Esto permite a todos los marcadores microsatélite humanos ser informativos de la presencia del cromosoma 10. La base de este análisis es que todos los subclones "totalmente" suprimidos deberían retener una región común y que esta región es delecionada en los subclones "parcialmente" suprimidos. Un ímpetu adicional fue que N10.7 visualizó una heterogeneidad considerable en el tamaño del cromosoma 10 retenido, como se determinó mediante FISH utilizando sondas específicas para el cromosoma 10. También, las células híbridas utilizadas para este rescate fueron primero ensayadas por crecimiento en agarosa suave y no mostraron ninguna formación de colonias. Todos los híbridos de ratón con el cromosoma 10 humano transferido contenían el brazo corto del cromosoma 10. La misma región se retuvo en los clones "parcialmente" suprimidos (N10.5a-j) que crecieron en agarosa suave (Steck et al., 1995), excluyendo por lo tanto esta región (l0pter-l0ql.1) como conteniendo el gene supresor de tumores l0q. El examen de las regiones retenidas de l0q presentó una heterogeneidad considerable (Fig. 3). La mayoría de los clones mostraron deleciones parciales o extensas de 10q23-26. Sólo dos regiones fueron retenidas en todos los subclones examinados. La región más centromérica retenida involucró los marcadores D10S210 y D10S219. Sin embargo, estos marcadores estuvieron ausentes en los clones originales N10.6 y/o N10.8, excluyendo esta región (Fig. 3). La otra región fue centromérica de D4S536 pero telomérica de D10S215 (\sim4 cM). Los marcadores AFM086 y D10S536 fueron retenidos en todos los clones examinados (región encajonada en la Fig. 3). Estos marcadores estuvieron ausentes en los clones parcialmente suprimidos (N10.5a-j). Estos resultados demuestran que una región común, circundante a AFM086, se retiene en todas las células híbridas que son fenotípicamente suprimidas. Esta misma región es delecionada en diversas líneas de células glioma.

Este análisis tiene varias limitaciones. Primero, los clones rescatados no pueden ser analizados por su actividad biológica y, por lo tanto, todo cambio en el cromosoma 10 que pudiera haber ocurrido durante o después de la transferencia no podría ser detectado. Para dirigirse parcialmente a esta preocupación, los inventores llevaron a cabo su análisis tan pronto como los clones pudieron ser cosechados. Más aún, la retención de esta parte del cromosoma puede sólo "corregir" una deleción hecha in vitro. Consecuentemente, se llevaron a cabo estudios de deleción alélica para determinar si la región estaba involucrada en gliomas. También, este análisis sugirió una región alternativa en D10S1158, ya que todos los clones excepto uno (C7) retuvieron esta región. Sin embargo, la región retenida en AFM086 también exhibió deleciones homocigóticas y, por lo tanto, fue implicada por dos métodos alternativos en comparación a D10S1158. Es interesante hacer notar que la región génica supresora de tumores parece ser retenida de manera preferencial, mientras que el resto de 10q se fragmenta.

Ejemplo 3 Análisis de deleción alélica de 10q

Se llevó a cabo un estudio de deleción alélica en ADN de una serie de 53 especímenes glioma y los correspondientes linfocitos del paciente usando marcadores microsatélite específicos para el cromosoma 10. Se condujo este estudio para determinar si nuestra región crítica también estaba involucrada en los especímenes glioma. Se observaron deleciones extensas en la mayoría de los especímenes derivados de GBM, con 30 de los 38 GBM que exhibieron deleciones de todos o la mayoría de los marcadores del cromosoma 10. Se observaron deleciones menos extensas en la mayoría de los especímenes derivados de astrocitomas anaplásicos, al tiempo que se observaron deleciones infrecuentes en los astrocitomas y en la mayoría de los oligodendrogliomas (Fig. 4 y datos no mostrados). La mayoría de los marcadores usados en este análisis mapearon en 10q23-26 (Gyapay et al, 1994). De manera similar a otros estudios, no se pudo demostrar convincentemente ninguna región común de deleciones, debido al número grande de deleciones en la mayoría de las muestras de GBM (Fults et al., 1993; Rasheed et al., 1995).

Sin embargo, para los especímenes de GBM examinados, todas las muestras de tumores excepto una (Nº9; Fig. 4) revelaron deleciones que involucraron la región desde D10S579 a D10S541. Más aún, sólo un AA presentó una deleción en la región crítica de los inventores, y ningún astrocitoma. Dos oligodendrogliomas exhibieron deleciones dentro de la región crítica, pero ambos fueron diagnosticados como malignos. Este estudio presenta diversas posibilidades. Primero, las deleciones que involucraron la región crítica de los inventores ocurrieron predominantemente en GBM y no en los tumores de grado bajo. Esto implicaría que la pérdida del gene supresor de tumores del cromosoma 10 en la región crítica de los inventores representaría una alteración genética asociada al avance a GBM. En apoyo de esta hipótesis, aún cuando las deleciones ocurrieron en 10q en tumores de grado bajo, no se identificó ninguna región común de deleciones en 10q en estos especímenes. Estas observaciones darían apoyo a la sugerencia de los inventores de que la deleción del gene supresor de tumores en 10q está asociada predominantemente con los GBM y que no todas las deleciones en 10q afectan dicho gene supresor. La región de D10S216 a D10S587 presentó deleciones extensas, pero varios GBM exhibieron retención de heterocigocidad en esta región (tumores N^{os}2, 9, 13, 26; Fig. 4). También, si se excluyeran de este estudio los tumores de bajo grado, la región de los inventores está implicada en todos los GBM. Esta combinación de planteamientos independientes sugiere enfáticamente que un gene supresor de tumores 10q mapea en la región de D10S215 a D10S541, específicamente en
AFM086.

Ejemplo 4 Mapeo de la región génica candidato supresora de tumores

La región crítica que los inventores han identificado está centrada en AFM086 y limitada por D10S215 y D10S541 (Figuras 2 y 8). Esta región es relativamente pequeña, estando contenida dentro de varios YAC individuales (787d7; 746h8; 934d3). La pintura FISH con YAC 746h8 sobre untos metafásicos de EFC-2 muestra que la deleción homocigótica está contenida dentro del YAC ya que éste se observó parcialmente y estuvieron presente los YAC adyacentes a ambos lados. Se han aislado cromosomas artificiales bacterianos (BAC, por sus siglas en inglés) o PAC para todos los marcadores de la región (Fig. 8). El BAG cóntigo o continuo de la región se construyó de las secuencias finales del mapeo de los BAC en la región. Se identificaron varias características de nota. Primero, se observaron dos BAC superpuestos (46b12 y 2f20) y se verificó la integridad genómica de 106dl6. Segundo, se identificó un sitio Not I en un extremo de los BAC. La presencia del sitio Not I y la digestión de restricción coincidente con SacII, EagI y BssHII sugieren la presencia de una isla CpG dentro de 106dl6.

Los fragmentos EcoRI de BAC 106dl6 se usaron para examinar, mediante transferencia Southern (Southern blotting), la extensión de las deleciones homocigóticas en las células gliomas que previamente mostraron tener AFM086 delecionado homocigóticamente (Figuras 2 y 5). El lado derecho (fragmento EcoRI 14) contiene la probable isla CpG y está presente en tres de las cuatro líneas de células. Un fragmento Not I/EcoRI Nº 3 se usó como sonda en un Southern blot con varios BAC y la línea de células gliomas (Fig. 2). No se han detectado deleciones al lado telómerico (lado derecho) utilizando sondas desde 46b12, excepto para las células EFC-2. Sin embargo, se han observado deleciones homozigóticas adicionales en las células dentro de la región definida por 106dl6 (\sim65 kb). Se observó una deleción homozigótica para la banda 3 para las células LG11 y EFC-2, pero no para las células gliomas adicionales ni para los controles normales. Se ha observado que106dl6 (banda 12) está presente en todas las células (EFC-2 presentó una banda migratoria alterada), lo que sugiere que la deleción homocigótica está contenida completamente dentro de 106dl6.

Ejemplo 5 Identificación de los genes expresados dentro de la región crítica

Se generaron los fragmentos EcoRI de BAC 106dl6 y se separaron por tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa. Las bandas individual o conjuntos de bandas de similar tamaño se ligaron a pSPL3 (GIBCO, Gaithersburg, MD). Los exones putativos se identificaron de la manera que describe el fabricante. Se empalmaron apropiadamente dos exones al vector atrapante. Dichos exones se derivaron del pool de bandas 2, 3, 4 y 5 y de la banda 7. La secuencia de los exones atrapados fue determinada y definida por la secuencia del vector atrapante conocida. Utilizando búsquedas BLAST en la base de datos de etiquetas de secuencia expresada (dbEST), se identificaron cinco etiquetas de secuencia expresada (EST). Se observó que dos EST (gb/H92038, AA009519) contenían ya sea uno o ambos exones (aunque una EST estaba en la orientación equivocada).

Se generaron cebadores secuenciantes de las EST y se usaron para definir los límites exón-intrón putativos utilizando BAC 46bl2 como molde. Se identificaron nueve exones. Se corrigieron las diferencias de las secuencias entre los EST y el molde genómico. Todos los exones estaban contenidos dentro de BAC 46b12. Se generaron cebadores de las secuencias de intrones adyacentes a los exones para generar unidades amplicón para cada exón. Dos de los exones correspondieron a los exones atrapados de las secuencias EcoRI del BAC 106dl6. La secuencia del gene se muestra en la Fig. 6. La lectura de aminoácido prevista se definió por la presencia de un sitio de comienzo, codones de terminación TGA y TAA en marco, la presencia de múltiples codones de parada en los tres marcos de lectura en otros lugares de la secuencia, nueve sitios de corte y empalme y la presencia de señales Kozak cerca del sitio de iniciación. La secuencia de 403 aminoácidos se muestra en las Figuras 7 y 9. El peso molecular previsto es 47.122 con un pI de 5,86.

Un posible rol funcional del producto proteína es sugerido por su homología secuencial a diversos motivos de proteínas. Un motivo crítico de los residuos 88 a 98 [IHCKAGKGRTG](SEQ ID NO:28) tiene un apareamiento exacto para el dominio catalítico conservado de una proteína tirosina fosfatasa [(I/V)HCxAGxxR(S/T)G] (SEQ ID NO:29; Denu et al, 1996). Se identificaron diversos otros motivos que estarían de acuerdo con la función fosfatasa del gene supresor de tumores.

Se generaron amplicones (productos de la PCR™ generados por diversas regiones del gene) de un ADNc cebado al azar. La secuencia de los amplicones correspondió a la secuencia del ADN. Se utilizaron amplicones no superpuestos para indagar transferencias Northern (Northern blots) de tejidos normales de diversos órganos (Clontech, Palo Alto, CA; transferencias de tejidos múltiples). Todos los amplicones identificaron una banda principal de 5.5 a 6 kb en las transferencias Northern y varias bandas menores. El mensaje se expresó en todos los tejidos examinados (corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón, páncreas, bazo, timo, próstata, testículos, ovarios, intestino delgado, colon y linfocitos de sangre periférica).

Ejemplo 6 Análisis mutacional

Los análisis mutacionales procedieron inicialmente en dos direcciones. Primero, las líneas de células gliomas inicialmente presentaron deleciones homocigóticas que fueron analizadas por la presencia del gene candidato. Como se muestra en la Fig. 8, todas las líneas de células que presentaron deleción de AFM086 tuvieron deleciones homocigóticas de múltiples exones del gene candidato. Más aún, las deleciones tuvieron lugar en el medio del gene y, por lo tanto, definieron los límites de deleción (con deleciones similares en todas las líneas de células) entre los exones 2 y 7. Las deleciones que afectan la parte media del gene indican que el gene identificado representa el gene al que se dirigió la mutación.

El análisis preliminar de las mutaciones de secuencias se realizó en una serie de líneas de células gliomas. Se observaron mutaciones y/o deleciones en todas excepto tres de las líneas de células gliomas examinadas (Tabla 5). La referencia al número de la base en la tabla corresponde al exón, no a las secuencias completas, por ejemplo, la base 98ª del exón 7 de U251.

TABLA 5 Mutaciones identificadas en el gene candidato

	Células	Tipo de células	Mutación	Efecto previsto
1	U87	glioma		variante de empalme
2	U138	glioma	sitio de empalme en exón 8; G+1>T	variante de empalme
3	U251	glioma
4	U373	glioma	cambio del marco de lectura en exón 7
5	EFC-2	glioma	-todos los exones	sin producto
6	D54	glioma	-exones 3-9	sin producto
7	A172	glioma	-exones 3-9	sin producto
8	LG11	glioma	-exones 2-9	sin producto
9	T98G	glioma	antisentido en exon 2; T46\rightarrowG	leu>arg
10	KE	glioma	antisentido en exon 2; G28\rightarrowA	gly>glu
11	F60	glioma	mutación terminal en exón 8; C202\rightarrowT

TABLA 5 (continuación)

	Células	Tipo de células	Mutación	Efecto previsto
12	D77	glioma	sin mutación (heterogéneo para 10q)
13	PC-3	bajo grado	sin mutación
14	PH-2	bajo grado	sin mutación
15	nLnCap	próstata	deleción en exon 1, 16-17 del AA; mutación
			en exón 2, C53\rightarrowT

También, se encontraron deleciones de exones en LnCap, una línea de células de próstata. Las células gliomas que no mostraron una mutación o deleción se derivaron de tumores de bajo grado (PC-3 y PH-2) donde no se espera una deleción alélica del cromosoma 10 ni ha sido observada para estas células. Las otras células (D77) fueron un cultivo celular primario, y el cromosoma 10 se mostró como heterocigótico de un polimorfismo de 1 bp dentro del gene. Una línea celular de cáncer de pecho también mostró una mutación. Este análisis preliminar da apoyo a la conclusión de los inventores de que una pérdida del gene supresor de tumores 10q representa un marcador molecular crítico para la evolución de la enfermedad y de los glioblastomas.

Ejemplo 7 Análisis de mutaciones de TS10Q23.3 en especímenes cancerosos y líneas de células tumorales

En un estudio más extenso, los inventores reportaron la incidencia de mutaciones del TS10q23.3 en 342 especímenes de tumores primarios y 164 líneas de células tumorales (TCL, por sus siglas en inglés), los que exhibieron una aparente pérdida de heterocigocidad (LOH, por sus siglas en inglés) a través del locus del TS10q23.3, para varios tipos de cáncer. En las 75 TCL que demostraron una aparente LOH a través del locus del TS10q23.3, los inventores encontraron diez deleciones homocigóticas que quitaron porciones codificantes del TS10q23.3, junto con una variante del marco de lectura, una terminadora y siete de cambio de sentido. En contraste, en los 84 tumores primarios preevaluados por LOH, los inventores sólo detectaron una lesión del marco de lectura, una mutación terminadora, una variante de corte y empalme y una variante de cambio de sentido. Es de interés notar que la expresión del mensaje de TS10q23.3 mostró reducirse significativamente en glioblastomas de alto grado en comparación con los tejidos celulares normales.

Métodos

Análisis de LOH: Se purificó el ADN genómico total de especímenes congelados o secciones desparafinadas. El ADN genómico total se purificó de las líneas de células cancerosas mediante el equipo Easy-ADN (Invitrogen, San Diego, CA). Los análisis LOH se llevaron a cabo de la manera previamente descrita (Teng et al., 1996; Steck et al., 1995). Los marcadores de repeticiones en tándem cortas polimórficas utilizados en este estudio fueron: D10S1687 (índice de heterocigocidad, HX = 0.81; Ldb (Collins et al., 1996) locación en el mapa de radiación desde el p-telómero, R.L. = 85 Mb), D10S579 (H.I. = 0.59; R.L. = 86.4 Mb), D10S541 (H.L = 0.78; R.L. = 86.5 Mb), AFM280WE1 (H.I. = no determinado; R.L. = 87 Mb), AFMA114XB1 (H.I. = 0.70; R.L. = 91.9 Mb) y D10S1753 (H.L = 0.74; R.L. = 92.48 Mb). El TS10q23.3 como es definido por AFM086WE1 está en 86.5 Mb. La LOH se evaluó en especímenes de tumores primarios, en la mayoría de los casos, mediante una comparación cuantitativa de los amplicones de los marcadores STR generados del tumor y los ADN normales de los individuos examinados. En el caso de las TCL y de algunos tumores primarios, la LOH se evaluó sobre la base de homocigocidad combinada aparente de AFMA114XB1, D10S541 y D10S1753; la probabilidad de que estos tres marcadores STR sean homocigóticos en una muestra dada es menor que 0,017.

Evaluación de deleciones homocigóticas: Utilizando como moldes los ADN genómicos de las líneas de células, se realizaron amplificaciones por PCR™ anidadas ya sea con TaqPlus (Strategene, La Jolla, CA) o con AmpliTaq Gold (Perkin Elmer, Foster City, CA). Los cebadores utilizados para generar amplicones de MMK4 y TS10q23.3 y las condiciones usadas para PCR™ se describen más abajo. Veinte \mul de las reacciones secundarias se fraccionaron en geles de agarosa 2-3% Nu Sieve (FMC Bioproducts) y se visualizaron a continuación.

Ensayo de mutaciones: Los inventores llevaron a cabo amplificaciones PCR™ anidadas de los ADN genómicos de los especímenes tumorales o las TCL y evaluaron los amplicones resultantes por variantes de secuencia de acuerdo con los procedimientos de Steck et al., (1997) con diversas modificaciones. Primero, se ensayó el exón 6 con un único amplicón secundario amplificado utilizando el par de cebadores FB-RR del exón 6. Segundo, luego de una amplificación primaria del exón 8 utilizando los cebadores FA-RP, el exón fue ensayado como dos amplicones secundarios utilizando los siguientes cebadores FB-RQ y FC-RR:

CA6.ex8.FB GTTTTCCCAGTCACGACGAGGTGACAGATTTTCTTTTTTA (SEQ IDNO:33)

CA6.ex8.RQ AGGAAACAGCTATGACCATTCGGTTGGCTTTGTCTTTA (SEQ ID NO:34)

CA6.ex8.FC GTTTTCCCAGTCACGACGCATTTGCAGTATAGAGCGT (SEQ ID NO:35)

CA6.ex8.RR AGGAAACAGCTATGACCATAGCTGTACTCCTAGAATTA (SEQ ID NO:36)

Tercero, dado que las tiras de mononucleótidos en ciertos intrones causaron un mal secuenciamiento colorante-cebador, los inventores obtuvieron datos de la secuencia colorante-terminador de los amplicones secundarios FB-RQ del exón 8 y FB-RR del exón 9 utilizando los cebadores anidados 5'-TTTTTTTTTAGGACAAAATGTTTC-3' (SEQ ID NO:37) y 5'-AATTCAGACTTTTGTAATTTGTG-3' (SEQ ID NO:38), respectivamente. Los inventores obtuvieron una cobertura de más del 90% de la secuencia codificante del TS10q23.3 para todas las muestras ensayadas; todas las mutaciones fueron confirmadas por secuenciamiento de un producto nuevamente amplificado.

Expresión por RT-PCR™: El ARN mensajero fue aislado de secciones congeladas de 10 especímenes de tejido normal, 10 de tejido normal alto y 10 de gliobastomas de alto grado. Las secciones congeladas (5 \mum, 20 cada una) se cortaron y utilizaron para aislar el ARNm (Micro-Fast Track; Invitrogen, San Diego, CA). Las secciones adyacentes se examinaron histológicamente y mostraron contener predominantemente células normales o tumorales. Las secciones normales se obtuvieron de regiones que estaban libres de tumor durante el curso normal de craneotomías terapéuticas. El ADN complementario fue hecho utilizando Superscript II y cebadores para amplificar el TS10q23.3 correspondiente desde -28 a 347 o desde 345 a 1232 de la región codificante. Los cebadores utilizados fueron:

M5'F:	TCCTTTTTCTTCAGCCACAG (SEQ ID NO:39)
M5' R:	ATTGCTGCAACATGATTGTC (SEQ ID NO:40);
M3'F:	TGACAATCATGTTGCAGCA (SEQ ID NO:41);
F3'R:	TTTATTTTCATGGTGTTTTATCC (SEQ ID NO:42).

Las condiciones de la PCR™ fueron similares a las descritas previamente excepto por el paso de apareamiento que se llevó a cabo a 53ºC.

Caracterización de un seudogene TS10q23J: Se amplificaron fragmentos de ADN de una genoteca de ADNc del cerebro fetal humano utilizando Pfu polimerasa y una estrategia PCR™ anidada. La reacción inicial de X \mul contenía 100 ng de ADNc. El par de cebadores utilizado en la primera ronda de la amplificación fue CTTCAGCCA
CAGGCTCCCAGAC (SEQ ID NO:43) y GGTGTTTTATCCCTCTTG (SEQ ID NO:44), luego de lo cual la reacción se diluyó 20 veces y se reamplificó con los cebadores CGGGATCCATGACAGCCATCATCAAAGAGATC (SEQ ID NO:45) y CGGAATTCTCAGACTTTTGTAATTG (SEQ ID NO:46). Las condiciones de las PCR™ utilizadas fueron un paso de desnaturalización inicial a 94ºC por 5 minutos seguido por 30 ciclos de 94ºC por 45 segundos, 55ºC por 30 segundos y 72ºC por 1 minuto. Para determinar la locación cromosómica de este seudogene, los inventores realizaron un mapeo híbrido de radiación utilizando el panel Genebridge 4 (Genome Systems) y diseñaron el siguiente par de cebadores para generar un producto específico de 303 bp del seudogene pero no TS10q23.3: ATCCT
CAGTTTGTGGTCTGC (SEQ ID NO:47) y GAGCGTGCAGATAATGACAA (SEQ ID NO:48). Utilizando este STS, los inventores determinaron que el seudogene estaba localizado aproximadamente en 160 cR en el cromosoma 9. Además, los inventores aislaron dos clones artificiales bacterianos (BAC, por sus siglas en inglés), 145c22 y 188122, que acarrean este seudogene y han confirmado su secuencia de ADN genómico. La comparación de la secuencia codificante del TS10q23.3 con la del seudogene reveló las siguientes diferencias de las bases: T2G, C89T, T202C, T242C, G248A, A258G, G397A, A405T, G407A, T531C, T544G, C556G, A672G, C700T, A705G, C720T C900T y A942G. La secuencia de nucleótidos para el seudogene TS10q23.3 humano está dada por la SEQ ID NO:64.

Dado que TS10q23.3 parece codificar un gene supresor de tumores, el primer paso que los inventores tomaron para identificar nuevas mutaciones en este gene fue realizar un ensayo previo de tumores primarios y TCL para determinar LOH dentro de esta región de 10q23. En total se examinaron por LOH 342 especímenes de tumores primarios y 164 TCL utilizando marcadores de repeticiones en tándem cortas polimórficas en el cromosoma 10 localizados cerca del locus TS10q23.3 (Tabla 6). En este panel de muestras, los inventores observaron LOH en los especímenes de tumores primarios en frecuencias que oscilaron desde el 20% en especímenes de colon al 75% en glioblastomas multiformes (GBM), con una frecuencia global de LOH de \sim49%. Para las TCL con tamaños de muestra mayores que nueve, la incidencia de LOH varió desde el 28% (colon) al 82% (GBM), con una frecuencia global de \sim46%.

TABLA 6 Análisis de LOH de especímenes y líneas celulares tumorales

Tipo de tumor	Especímenes de tumor	Líneas celulares tumorales
	LOH/examinadas^{1}	Secuenciadas^{2,3}	LOH/examinadas^{1}	Secuenciadas^{2,4}
Cerebro	40/53^{5} (75%)	26^{5}	9/11^{5} (82%)	7^{5}
(gliomas)
Cerebro,	5/7	7 (2)	-	-
pediátrico
Vejiga	-	-	3/4	2
Pecho	32/67^{5} (20%)	31^{5}	14/22^{5} (64%)	13
Ciego	-	-	1/6	1
Colon	3/15^{6} (20%)	1	7/25 (28%)	7
Duodeno	-	-	1/1	1
Endometrial	6/13 (46%)	0	-	-
Cabeza y	9/14 (64%)	9	-	-
cuello
Riñón	8/20^{3} (40%)	8^{3}	-	-
Leucemia	-	-	11/23 (48%)	11
Pulmón	10/27 (37%)	7	7/17 (41%)	6
Linfoma	-	-	2/3	2
Melanoma	10/21 (48%)	15	7/14 (50%)	3
Neuroblastoma	-	-	0/3	-
Ovario	10/19 (52%)	9	3/8	3
Pancreático	7/19 (37%)	0	5/12 (42%)	5
Próstata	10/24 (42%)	8(2)	1/1^{7}	-
Retinoblastoma	-	-	0/2	-
Sarcomas	4/16 (25%)	6(2)	-	-
Glándula	-	-	1/1	1
submaxilar
Testes	-	-	3/5	3
Tiroides	6/17 (35%)	2	0/2	-
Uterino	-	-	0/4	-
Metastásico^{8}	6/10 (60%)	8(2)	-	-
Total	166/342^{5} (48%)	137(8)^{5,9}	75/164 (46%)	65
^{1} \begin{minipage}[t]{150mm} El porcentaje de LOH se calculó solamente para tamaños de muestras mayores que nueve. ^{2}Muestras que se amplificaron y secuenciaron exitosamente (>90% de la secuencia codificante evaluada). ^{3}El número de muestras no LOH que fueron secuenciadas se muestra entre paréntesis. Los ADN de ciertos tumores primarios, principalmente los carcinomas pancreáticos y endometriales se aislaron de secciones incrustadas en parafina microdisectadas y no secuenciaron a una cobertura >90% debido a la mala calidad del molde. ^{4}Todas las TCL evaluadas mostraron una LOH aparente. Las TCL con deleciones homocigóticas en la porción codificante de TS10q23.3 no fueron evaluadas por secuenciamiento. ^{5}Estos totales incluyen muestras que fueron previamente reportadas por Steck et al. (1997). ^{6}Cinco de estas muestras de colon consistían en cánceres que habían metastizado al hígado, aunque la metástasis del hígado no exhibió LOH. ^{7}La línea de próstata, NCIH660 (TCL10F4), fue caracterizada por Li et al. (1997) y mostró ser delecionada homocigóticamente de los exones 2-9 de TS10q23.3. ^{8}Estos especímenes de tumor metastizado provinieron de adenocarcinomas, un sarcoma, un carcinoma renal y un melanoma. Las lesiones metastizadas eran del pulmón, excepto por el melanoma que era de la ingle. ^{9}45 de estos 137 especímenes analizados habían sido reportados (Steck et al., 1997), 8 fueron no LOH y 84 mostraron LOH. \end{minipage}

Para investigar las variantes codificantes del TS10q23.3 en tumores humanos, los inventores secuenciaron amplicones consistentes en los exones y las juntas de empalme flanqueantes de este gene amplificado de los ADN tumorales que mostraron LOH. Una advertencia a hacerse sobre este planteamiento es que no identifica mutaciones reguladoras que afecten los niveles de expresión de este gene. Además, este ensayo excluye la posibilidad de encontrar homocigotos mutantes y heterocigotos compuestos pero la incidencia de esta clase de mutantes es presuntamente baja. Previamente, los inventores reportaron que la incidencia de las variantes codificantes de TS10q23.3 en glioblastomas y en carcinomas de pecho y riñón eran 6/26 (23%), 2/14 (14%) y 1/4 (25%), respectivamente (Steck et al 1997). En este estudio, de 84 tumores primarios que exhibieron LOH alrededor del locus TS10q23.3, los inventores detectaron una mutación del marco de lectura (carcinoma de pecho), una mutación terminadora (GBM pediátrico), una variante de empalme (GBM pediátrico) y una variante de cambio de sentido (melanoma; Tabla 7).

TABLA 7 Variantes de TS10q23.3 identificadas en tumores primarios y en líneas de células tumorales

Muestra	Tipo	Mutación	Exón/intrón	Codón	Efecto previsto
PGT-2	Glioma pediátrico^{1}	G>T en -1	intrón 2	-	Variante de empalme
MT-1	Melanoma	CC112-113TT	exón 2	38	Pro>Phe
TCL10B1	Pecho	T323G	exón 5	108	Leu>Arg
TCL10H2	Leucemia	T331C	exón 5	111	Trp>Arg
TCL11E12	Glioblastoma	T335G	exón 5	112	Leu>Arg
PGT-5	Glioma pediátrico^{1}	C388T	exón 5	130	Arg>parada
TCL10A7	Pecho	G407A	exón 5	136	Cys>Tyr
TCL10F5	Glándula submaxilar	T455C	exón 5	152	Leu>Pro
TCL10H8	Leucemia	C517T	exón 6	173	Arg>Cys
TCL10F7	Testes	G518C	exón 6	173	Arg>Pro
TCL11F5	Glioblastoma	C697T	exón 7	233	Arg>Parada
BT-88	Pecho^{1,2}	705 del. A	exón 7	235	Truncación de la proteína
TCL10A3	Pecho	823 del. G	exón 7	275	Truncación de la proteína
\begin{minipage}[t]{157mm}^{1}Espec\text{í}menes de tumores primarios. ^{2}Un análisis del ADN normal correspondiente mostró que la mutación del TS10q23.3 de esta muestra de tumor de pecho primario es somática. No fue posible un análisis similar de las alteraciones del TS10q23.3 en los otros tres especímenes debido a que no se encontraba disponible el ADN normal. Los inventores, sin embargo, han determinado que las nueves mutaciones de tumores primarios observadas por Steck et al. (1997) surgieron somáticamente. \end{minipage}

Además de los tumores primarios, los inventores examinaron un conjunto de líneas de células tumorales por alteraciones del gene TS10q23.3. Estas TCL permitieron a los inventores investigar tipos de cáncer que no estaban representados en el panel de tumores primarios evaluados, incluyendo leucemia, linfoma, neuroblastoma, retinoblastoma, así como cánceres de la vejiga, los testículos y el útero. De las 75 TCL que presentaron LOH, los inventores identificaron diez deleciones homocigóticas que afectaron las regiones codificantes de TS10q233 (Figuras 13A y 13B). Las deleciones homocigóticas estuvieron presentes en TCL de astrocitomas (1/1), carcinoma de vejiga (1/3), carcinoma de pecho (1/14), glioblastoma (2/8), carcinoma de pulmón (1/7), melanoma (4/7) y carcinoma de próstata (1/2). Mientras que dos de las líneas celulares habían perdido los nueve exones del TS10Q23.3, las otras ocho TCL habían delecionado homocigóticamente diferentes porciones codificantes del gene. El análisis de las restantes 65 TCL reveló una variante del marco de lectura, una terminadora y siete variantes de cambio de sentido no conservativas (Tabla 7).

Debido a la frecuencia relativamente baja de las mutaciones de TS10q23.3 observadas en tumores primarios en comparación a la observada en las TCL, los inventores examinaron la expresión de TS10q23.3 en una serie de diez GBM y diez especímenes normales. Todas las muestras normales exhibieron expresión de TS10q23.3, mientras que ninguna de las muestras de GBM presentó ninguna expresión significativa de este mensaje (Figuras 13C y 13D). Se observaron señales débiles en ciertas muestras luego de una exposición prolongada, aunque los inventores no pudieron distinguir si estos niveles de mensaje detectados se debieron a una contaminación de células normales en las secciones o a una expresión baja de TS10q23.3 dentro de las células tumorales. Sin embargo, esta observación sugiere que la expresión alterada de TS10q23.3 puede potencialmente jugar un papel en la tumorigénesis de estos GBM. El mecanismo o mecanismos de inhibición de la expresión de TS10q23.3 y el nivel de la misma en otros tipos de tumores primarios se encuentran bajo estudio en estos momentos.

Los inventores han investigado un amplio panel de tumores y TCL, que sometieron a una evaluación previa por LOH, por alteraciones de TS10q23.3. En este conjunto de 84 tumores primarios, los inventores sólo detectaron cuatro mutaciones de TS10Q23.3 potencialmente inactivantes. Junto con los resultados previos de los inventores (Steck et al., 1997), 8 de 31 (26%) de los glioblastomas primarios, 3 de 31 (10%) de los tumores primarios de pecho, 1 de 8 (13%) de los primarios de riñón y 1 de 11 (9%) de los melanomas primarios presentaron alteraciones del TS10q23.3. Es interesante hacer notar que dos de los cinco GBM pediátricos exhibieron alteraciones del TS10q23.3 lo que debería llevar a la expresión de proteína no funcional, sugiriendo que estaría justificado realizar análisis adicionales sobre la participación del TS10q23.3 en esta enfermedad de la niñez. En el conjunto de 75 TCL, los inventores observaron un total de 19 mutaciones del TS10q23.3 inactivantes putativas.

La incidencia real de las mutaciones del TS10q23.3 en los diferentes tipos de cáncer se encontrará probablemente entre la frecuencia observada en tumores primarios y la observada en las líneas de células. Los descubrimientos de los inventores demuestran que en comparación con los tumores primarios, las TCL albergan una incidencia significativamente mayor de mutaciones en TS10q23.3 (Tabla 6). Una observación similar fue reportada por Spruck et al. para mutaciones de p16 en cánceres de la vejiga (Spruck III, et al., 1994). Esta discrepancia se debe probablemente a una o más de las siguientes posibilidades. Primero, para ser cultivadas con éxito in vitro, las células tumorales pueden requerir ciertas combinaciones de lesiones genéticas que son adquiridas in vivo. Segundo, eventos mutacionales en TS10q23.3 pueden conferir una ventaja para el crecimiento o causar una selección clónica durante el pasaje in vitro de las TCL. Tercero, la sustancialmente reducida expresión de TS10q23.3 observada en 10 de 10 especímenes de GBM primarios sugiere que ciertos tumores pueden no tener mutaciones codificantes en este gene pero, en su lugar, pueden expresar niveles disminuidos de TS10q23.3 funcional. Y, cuarto, la contaminación de células normales y la heteregeneidad de los especímenes de tumores primarios pueden prevenir la detección de deleciones homocigóticas, un mecanismo mutacional observado en un número significativo de TCL en el locus TS10q23.3. En los experimentos de control, se determinó que aún la presencia de 5% del ADN de tejido normal contaminante en las muestras tumorales impediría la identificación de las deleciones homocigóticas utilizando estos procedimientos. Por lo tanto, la presencia de deleciones homocigóticas que afecten el TS10q23.3 en los tumores primarios podría fácilmente ser subestimada por el análisis de los inventores y requerirá planteamientos alternativos para su evaluación. Sin embargo, una complicación adicional es la presencia de un seudogene TS10q23.3 aparentemente sin corte y empalme, ubicado en el cromosoma 9q; la secuencia codificante del TS10q23.3 difiere de la de este seudogene putativo en 16 de las 1209 bases (véase Métodos).

Una compilación de las alteraciones del TS10q23.3 muestra que el espectro de las variantes es diverso (Figura 14). Todas las sustituciones de cambio de sentido no conservativas identificadas se encontraron en la porción terminal N de TS10q23.3 dentro de su dominio fosfatasa putativo. En contraste, las lesiones que resultan en la truncación del TS10q23.3 están distribuidas a través de todo el gene. Si todas las formas truncadas del TS10q23.3 son no funcionales, entonces los datos indican que la región terminal carboxi del TS10q23.3 es esencial para la expresión de una proteína activa. Esto es consistente con el concepto de que los sitios de fosforilación potenciales y los motivos PDZ son importante para la función TS10q23.3. Alternativamente, las secuencias de la región de terminal C pueden requerirse para un plegamiento apropiado. Es interesante hacer notar que las únicas mutaciones germinales en TS10q23.3 reportadas hasta la fecha han sido detectadas en individuos con el síndrome de Cowden (Liaw et al., 1997); todas las otras variantes en el TS10q23.3 de tumores primarios caracterizadas han surgido somáticamente (Tabla 7). La diversidad de las alteraciones del TS10q23.3 observadas predice que existen en la población muchas lesiones distintas de este gene. En su conjunto, los datos sugieren que TS10q23.3 es un supresor de tumores que juega un papel significativo en la génesis de muchos tipos de cánceres.

Ejemplo 8 Papel de las mutaciones de TS10Q23.3 en el inicio temprano del cáncer de pecho: causativo en asociación con el síndrome de Cowden y excluido en casos brcal negativos Métodos

Materiales clínicos: Se obtuvieron muestras de sangre luego de un consentimiento informado de individuos que padecían del síndrome de Cowden. De utilizó una alícuota para la extracción de ADN, mientras que se purificaban células mononucleares de sangre periférica de una segunda muestra y se las utilizaba para generar una línea de células linfoblastoides transformadas por EBV. El diagnóstico de CS se realizó mediante los criterios de diagnóstico CD del International Cowden's Consortium (Nelen et al., 1996). Para individuos con un inicio temprano de cáncer de pecho, la muestra consistió en 63 mujeres que desarrollaron cáncer de pecho antes de los 35 años (edad promedio al tiempo del diagnóstico fue de 27,7 años), no tenían un diagnóstico clínico de CS y habían mostrado previamente que no acarreaban claramente deleciones nocivas en BRCA1 (5 mujeres en la muestra acarreaban polimorfismos de cambio de sentido de significado desconocido). Estas mujeres eran un subconjunto de una muestra de 798 individuos no emparentados de 20 organizaciones colaboradoras, elegidos de familias que, en términos generales, se encontraban a un riesgo elevado de acarrear mutaciones de BRCA1. La mayoría de las familias se eligieron debido a casos múltiples de cáncer de pecho, una edad temprana de diagnóstico de dicho cáncer y una incidencia de cáncer de los ovarios, ya que todas estas condiciones habían mostrado previamente estar relacionadas a mutaciones germinales de BRCA1. Algunas de las familias se extendieron a un parentesco de segundo grado. Todas las muestras provenientes de organizaciones en los Estados Unidos se colectaron de individuos participantes en estudios de investigación sobre la genética del cáncer de pecho. Todas las muestras procedentes de organizaciones afuera de los Estados Unidos se colectaron acuerdo con las directrices apropiadas concernientes a investigaciones que involucren sujetos humanos impuestas por las autoridades correspondientes. Solamente se incluyo en la muestra un representante de cada familia, y no se incluyó ninguna de las familias de las que se supiera estar vinculadas por marcadores genéticos a BRCA1. Esta es una muestra heterogénea que representa la diversidad de pacientes que presentan un riesgo clínico alto en comparación al muestreo más controlado conducido para estudios familiares o poblacionales. Esto ha dirigido el análisis de los inventores hacia métodos que no requieren que las frecuencias en las muestras de los subgrupos reflejen las frecuencias en la población en general. Por lo tanto, los inventores pueden evaluar, por ejemplo, la probabilidad de que una mujer diagnosticada con cáncer de pecho a los 30 años de edad acarree una mutación nociva de BRCA1 o TS10q23.3 (también referida como MMAC1), pero los inventores no pueden estimar la frecuencia de dichas mujeres en la población general. Se quitaron todos los identificadores de las muestras utilizadas en el estudio de TS10Q23.3.

Extracción del ADN: Luego de que se obtuvo el consentimiento informado, se extrajo el ADN genómico de los pacientes de la sangre entera o de las líneas de células linfoblastoides utilizando el equipo QIAamp Blood Maxi Kit. Se midió la concentración mediante OD_{250} y se verificó la pureza mediante el cociente OD_{260}/OD_{280}.

Identificación de genotipos: Se obtuvieron pares de cebadores para el locus del cromosoma 10 de Research Genetics. El cebador de hebra delantera fue rotulado en el extremo en presencia de ^{33}P-ATP\gamma y una polinucleótido quinasa. Las reacciones PCR™ se llevaron a cabo en un volumen de reacción total de 30 microlitros. Las reacciones consitieron en 10 mM de cada cebador, 200 mM de desoxinucleótidos, 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa y 50 ng de ADN genómico. La PCR™ se llevó a cabo durante 35 ciclos con 45 segundos de desnaturalización a 94ºC, 45 segundos de apareamiento a 55ºC y una elongación de 1 minuto a 72ºC. Se utilizó una elongación final por 10 minutos. Las reacciones PCR™ se pararon mediante la adición de 20 microlitros de solución de parada (95% formamida, 1 mM EDTA, 0.25% bromofenol azul, 0.25% xileno cianol). Se siguió con la desnaturalización de las reacciones por 5 minutos a 94ºC y se separaron los productos en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 8%. Se determinaron los tamaños de los alelos por comparación a SequaMark (Research Genetics) que fue incluida como un estándar de tamaño en los geles.

Análisis de conexiones: Se llevó a cabo un análisis de conexiones de dos puntos utilizando MLINK. Los individuos de menos de 20 años se consideraron como desconocidos. La frecuencia génica de la enfermedad fue fijada igual a 0.000001 y se estimaron las frecuencias de los alelos marcadores utilizando ILINK. Tanto MLINK como ILINK provienen del paquete LINKAGE versión 5.2 (Lathtop et al., 1984). La reconstrucción de los haplotipos más probables de la familia D se obtuvo utilizando GENEHUNTER (Kruglyak et al., 1996). Los pedigríes se extrayeron utilizando Cyrillic versión 2.02.

Resultados

El síndrome de Cowden (CS) (Lloyd and Dermis, 1963), o síndrome de hamartomas múltiple (Weary et al., 1972), es un trastorno autosomático dominante asociado con el desarrollo de hamartomas y tumores benignos en una diversidad de tejidos, incluyendo la piel, la tiroides, el pecho, el colon y el cerebro. Se ha sugerido que las mujeres con CS presentan un riesgo incrementado de cáncer de pecho (Brownstein et al., 1978) y, como en otros síndromes de susceptibilidad, parecen desarrollar cáncer de pecho a una edad más temprana. El CS también está asociado con una lesión de la piel específica, el triquilemoma (tumor del infundíbulo folicular) y, por lo tanto, este síndrome de susceptibilidad al cáncer de pecho puede reconocerse por la presencia de un biomarcador cutáneo (Brownstein et al., 1977; 1978). Los inventores han estudiado en detalle los resultados clínicos y patológicos relacionados con este síndrome y han demostrado que la edad media de aparición de una enfermedad maligna del pecho en CS es de 46 años, con un rango de aparición del cáncer de pecho en mujeres desde los 33 a los 74 años. Más aún, muy pocas de las mujeres con CS que estudiaron los inventores tenían una historia familiar de cáncer de pecho. Es interesante notar que los hombres con CS no parecen estar a un riesgo incrementado de desarrollo de cáncer de pecho (Brownstein et al., 1978). Los inventores también mostraron que las mujeres con CS desarrollan una enfermedad de pecho benigna exuberante y frecuentemente reportan una historia de múltiples biopsias de pecho antes del desarrollo del cáncer de pecho. Por lo tanto, el seguimiento de historiales de enfermedades benignas de la piel y de pecho puede permitir identificar a los individuos afectados antes del desarrollo del cáncer de pecho en esta población de alto riesgo.

Se ha demostrado previamente que existe un locus para el CS en el cromosoma 10 (Nelen et al., 1996). En ese estudio, se examinó un total de 10 familias y resultó en la identificación de un intervalo crítico de Cowden entre los marcadores D10S215 y D10S564. Ciertos individuos afectados de esas familias tenían CS y la enfermedad de Lhermette-Duclos (LDD) (Nelen et al., 1996; Liaw et al., 1997), un trastorno cerebral raro caracterizado por un gangliocitoma displásico del cerebelo (Albrecht et al., 1992). La construcción de un mapa fino de esta área refinó los resultados iniciales (Liaw et al., 1997) y dió apoyo a una locación del gene CS entre los marcadores D10S215 y D10S541. Más recientemente, los individuos afectados de cuatro familias con CS han mostrado tener mutaciones germinales (Liaw et al., 1997) en un gene conocido como PTEN (Li et al., 1997), TS10Q23.3 (Steck et al., 1997) o TEP1 (Li et al., 1997) que está localizado en el intervalo crítico de Cowden en el cromosoma 10. Es de interés notar que la proteína TS10Q23.3 prevista contiene motivos de secuencias con una homología significativa al dominio catalítico de las proteínas fosfatasas, y a las proteínas citoesqueléticas tensina y auxilina (Li et al., 1997; Steck et al., 1997). Más aún, se observaron mutaciones de la región codificante de TS10Q23.3 en tumores o líneas celulares tumorales del pecho, cerebro, próstata o riñón humanos (Li et al., 1991; Steck et al., 1997). Aunque se desconoce la función de este gene, es probable que TS10Q23.3 desempeñe un papel en el control de la proliferación celular y que la pérdida de su función sea importante en el desarrollo de tumores humanos.

Análisis de conexión y ensayo de mutaciones en parientes CS

Para extender las observaciones que indican un locus CS en el cromosoma 10, los inventores realizaron un análisis de conexión de dos puntos utilizando cinco marcadores localizados en el intervalo de Cowden crítico, de las cuatro familias con pruebas clínicas de CS (Nelen et al., 1996). Todas las familias fueron examinadas en detalle y se realizó el diagnóstico de este síndrome utilizando los criterios de diagnóstico CD del International Cowden's Consortium (Nelen et al., 1996). Dos familias pequeñas presentaron valuaciones LOD positivas que no podían excluir una conexión con los tres locus del cromosoma 10 (véase, familias A y B, Tabla 8). Otras dos familias con hallazgos clínicos idénticos a los descritos precedentemente mostraron valuaciones LOD negativas significativas para algunos de los marcadores en esta región (familias C y D, Tabla 8). También se llevó a cabo un ensayo de heterogeneidad que dio resultados no significativos. Estos hallazgos se confirmaron mediante la construcción de haplotipos (Figura 15). En particular, en la familia C, el individuo 2 transmitió a sus dos hijos afectados el haplotipo que el individuo heredara de su padre no afectado. Finalmente, en la familia D, los individuos 2 y 20 han heredado un haplotipo distinto de uno de sus parientes afectado.

TABLA 8 Análisis de dos puntos de familias CD con marcadores repetidos CA

	0,0	0,01	0,05	0,1	0,2	0,3	0,4
Familia A
D10S579	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
D10S215	0,30	0,30	0,28	0,26	0,20	0,15	0,08
D10S541	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
D10S1739	0,30	0,30	0,28	0,26	0,20	0,15	0,08
D30S564	0,30	0,30	0,28	0,26	0,20	0,15	0,08
Familia B
D10S579	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
D10S215	0,30	0,29	0,26	0,21	0,13	0,06	0,02
D10S541	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
D10S1739	0,30	0,29	0,26	0,21	0,13	0,06	0,02
D10S564	0,30	0,29	0,26	0,21	0,13	0,06	0,02
Familia C
D10S579	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
D10S215	-infinito	-3,40	-2,00	-1,40	-0,80	-0,44	-0,19
D10S541	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00	0,00
D10S1739	-0,05	-0,06	-0,09	-0,13	-0,16	-0,15	-0,09
D10S564	-infinito	-3,40	-2,00	-1,40	-0,80	-0,44	-0,19
Familia D
D10S579	-infinito	-1,52	-0,28	0,11	0,28	0,19	0,05
D10S215	-infinito	-1,58	-0,33	0,07	0,25	0,18	0,05
D10S541	-infinito	-1,44	-0,39	0,01	0,22	0,18	0,06
D10S1739	-2,20	-0,45	0,14	0,32	0,35	0,23	0,08
D10S564	-0,03	0,08	0,30	0,38	0,35	0,22	0,07

TABLA 9

Mutación	Exón/Intrón	Efecto previsto
1. 791insAT	Exón 7	Cambio del marco de lectura
2. 915dell3	Exón 8	Cambio del marco de lectura
3. 137ins3	Exón 2	Inserción de un aminoácido (Asn)

Utilizando un planteamiento basado en PCR™ y en el secuenciamiento, los inventores examinaron los 9 exones y las juntas de empalme asociadas del TS10Q23.3, utilizando los cebadores descritos (Steck et al., 1997), en 16 individuos afectados de estas 4 familias. Es interesante notar que 4 de estos 16 individuos tenían cáncer de pecho, y 2 de los 4 habían tenido cáncer de pecho antes de los 40 años. Los inventores no detectaron mutaciones en la secuencia codificante en estos 16 individuos de estas 4 familias con los síntomas y signos clásicos de CS.

Análisis mutacional en individuos con CS

Los inventores evaluaron entonces un conjunto de 31 individuos afectados de 23 familias con CS cuyos parientes no se habían utilizado en los estudios de conexión de los inventores. De los 31 individuos, 13 fueron individuos emparentados de 5 familias. Por lo tanto se evaluó un total de 23 probandos no emparentados. Una única mujer afectada (Walton et al., 1986) presentó una mutación del marco de lectura en el exón 7 de la secuencia codificante (véase, Figura 16). Específicamente, los inventores demostraron una inserción AT después del nucleótido 791 (791insAT), la que resultó en un cambio del marco de lectura y un codón de terminación prematura corriente abajo. Es de interés notar que esta mujer había desarrollado un cáncer de pecho con mamograma negativo a la edad de 36 años, que fue descubierto durante una mastectomía profiláctica (Walton et al., 1986). El probando tenía un hermano no afectado, así como una hija afectada. El secuenciamiento directo del exón 7 de estos individuos demostró la presencia de una mutación idéntica en la hija afectada (Figura 16) y la ausencia de la mutación en el hermano no afectado. Estudiando un segundo individuo con CS e inicio temprano de cáncer de pecho (a la edad de 33 años), los inventores demostraron una inserción de tres bases en el exón 2 (137ins3), lo que resultó en la inserción de un aminoácido único (Asn). Finalmente, en otra mujer con cáncer de pecho bilateral y cáncer endometrial, los inventores identificaron una deleción del marco de lectura de 13 pares de bases en el exón 8 (915dell2). Estos datos demuestran 3 alelos mutantes de TS10Q23.3 más que están asociados con CS (Liaw et al., 1997), y en particular, con CS y cáncer de pecho (Brownstein et al., 1978). Sin embargo, en 27 individuos de 20 familias, los inventores no detectaron mutaciones en las secuencias codificantes del TS10Q23.3. En esta población, 7 de estos individuos tenían cáncer de pecho, aunque todas estas mujeres desarrollaron el cáncer de pecho después de los 40 años de edad. Uno de estos 7 individuos tenía cáncer de pecho bilateral. En total, por lo tanto, combinando los datos de las familias, así como los de estos individuos, los inventores detectaron mutaciones de las secuencias codificantes en 4 individuos de 3 familias CS, pero no detectaron alteraciones de las secuencias codificantes (por ejemplo, variantes de cambio de sentido o silenciosas) en otros 43 individuos de 24 familias con CS.

Análisis mutacional en mujeres con un inicio temprano de cáncer de pecho

Se ha hecho un caso sólido de la existencia de un mecanismo genético que regula la formación de tumores de pecho en el inicio temprano del cáncer de pecho (el desarrollo de cáncer de pecho antes de los 40 años de edad) (Claus et al., 1990). Ya que CS se hereda de una manera dominante autosómica, los mecanismos genéticos que regulan el desarrollo del cáncer de pecho en esta población pueden también desempeñar un papel en el inicio temprano de cáncer de pecho. Dado que los inventores detectaron mutaciones de TS10Q23.3 germinales en CS asociadas con el inicio temprano de cáncer de pecho, y las mutaciones en este gene ocurren a una frecuencia relativamente alta en tumores de pecho y líneas de células de tumores de pecho (Steck et al., 1997, Li et al., 1997), los inventores quisieron investigar más el papel que las mutaciones de TS10Q23.3 germinales desempeñan en el inicio temprano del cáncer de pecho. En un esfuerzo para tender hacia un conjunto de muestras potencialmente enriquecidas en mutaciones de TS10Q23.3 germinales, los inventores secuenciaron el gene en 63 mujeres que desarrollaron cáncer de pecho antes de los 35 años de edad (edad promedio al tiempo del diagnóstico: 27.7 años), no parecían tener un diagnóstico clínico de CS y habían previamente mostrado en forma clara no acarrear mutaciones nocivas en BRCA1 (5 mujeres en la muestra acarreaban polimorfismos de cambio de sentido de importancia desconocida). No se detectaron alteraciones de las secuencias codificantes en los 9 exones de TS10Q23.3 en este conjunto de muestras. En contraste, utilizando exactamente los mismos criterios de detección y análisis de mutaciones de un conjunto similarmente investigado de individuos no Ashkenazi afectados por cáncer de pecho (sin excluir portadores de BRCA1), los inventores esperarían detectar 7 mutaciones nocivas y 5 polimorfismos de cambio de sentido de significado desconocido en BRCA1. Más aún, fuera de los 4 pacientes CS que acarreaban mutaciones germinales en TS10Q23.3 anteriormente descritos, los inventores no han detectado polimorfismos de secuencia en la secuencia codificante de este gene en más de 200 cromosomas germinales y, de hecho, encontraron una sola diferencia (silenciosa) de secuencia entre las secuencias humanas y de chimpancés. Si la frecuencia de variantes de secuencia codificante y de junta de empalme próxima en el TS10Q23.3 fuera del 5% en la población de la cual se extrajo la muestra, entonces los inventores habrían tenido una probabilidad del 95% de encontrar una o más de dichas variantes.

Discusión

El síndrome de Cowden se distingue entre los síndromes genéticos dominantes autosomáticos que predisponen al desarrollo de cáncer de pecho por tener un biomarcador subcutáneo único, el triquilemoma (Brownstein et al., 1997; 1978). Más aún, las mujeres con CS frecuentemente tienen un historial de biopsias de pecho múltiples por enfermedades de pecho benignas antes del desarrollo de cáncer de pecho. La mayoría de estas mujeres no tienen un historial familiar de cáncer de pecho. A la fecha, la asociación mejor descrita entre CS y la susceptibilidad al cáncer de un órgano específico es con respecto al pecho femenino (Brownstein et al., 1977). Otros sistemas orgánicos parecen desarrollar cáncer con una frecuencia incrementada en dichos individuos, por ejemplo la tiroides. En contraste con otros síndromes autosómicos de susceptibilidad al cáncer de pecho como, por ejemplo, el asociado con mutaciones en BRCA1 (Ford et al., 1995), el desarrollo de cáncer de los ovarios es bastante raro en este síndrome. Sin embargo, CS comparte con estos síndromes un inicio temprano del cáncer de pecho, así como un aumento de la probabilidad de cáncer de pecho bilateral. Observaciones previas demostraron una conexión de CS con el cromosoma 10q22-23 (Nelen et al., 1996). Más aún, es ahora también obvio que las mutaciones en un gene (Liaw et al., 1997) conocido como PTEN (Li et al., 1997), TS10Q23.3 (Steck et al., 1997) o TEP1 (Li y Sun, 1997) encontrado en el intervalo crítico de Cowden en el cromosoma 10, están asociadas con individuos con CS (Liaw et al., 1997).

En las observaciones que se reportan en este documento, los inventores identifican 3 nuevas mutaciones germinales en la secuencia codificante del TS10Q23.3 asociadas con CS, y, específicamente, en individuos con CS y cáncer de pecho. En dos individuos emparentados con CS, los inventores describieron una mutación del marco de lectura en el exón 7, que resulta en una codón de terminación prematura, que es idéntica en la madre y la hija afectadas. Esta mutación de TS10Q23.3 parece estar asociada con el inicio temprano del cáncer de pecho, ya que uno de los dos individuos afectados desarrolló cáncer de pecho a la edad de 36 años. En un tercer individuo afectado, los inventores identificaron una deleción de 13 pares de bases en el exón 8. Aunque este individuo no desarrolló cáncer de pecho a una edad temprana, ella tenía un historial de cáncer de pecho bilateral. Es de interés notar que ella también desarrolló cáncer endometrial mientras era tratada con tamoxifeno. Dado que se ha asociado el cáncer endometrial con CS (Starink et al., 1986) y con el uso de tamoxifeno (Fornander et al., 1989), se desconoce la contribución de cada uno de estos dos factores de riesgo al desarrollo de la enfermedad en el caso de esta mujer. Sin embargo, esta observación presenta la posibilidad de que la subpoblación de mujeres que desarrollen cáncer endometrial mientras son tratadas con tamoxifeno puede tener CS y/o mutaciones en TS10Q23.3. Finalmente, los inventores identificaron una inserción de 3 bases en el exón 2 en otra mujer que desarrolló cáncer de pecho a los 33 años de edad.

En el conjunto de individuos con CS que estudiaron los inventores, éstos detectaron mutaciones del TS10Q23.3 germinales en 4 individuos de 3 familias, pero no observaron ninguna alteración de las secuencias codificantes en los 43 individuos restantes provenientes de 24 familias no emparentadas. Estos datos dan apoyo a la limitada información de conexión de los inventores y sugieren que todas las familias con CS no pueden conectarse con el locus identificado en el cromosoma 10. Mientras que los estudios que realizaron los inventores no descartan que mutaciones en las regiones reguladoras 5' o en la región 3' no traducida de TS10Q23.3, u otros mecanismos que alteren su nivel de expresión, tal como silenciamiento por metilación, estén asociadas con el CS, tanto los datos de conexión como los resultados del secuenciamiento del ADN dan apoyo a la idea de que el CS pueda ser genéticamente heterogéneo. Se ha mostrado que la esclerosis tuberosa, otro trastorno dominante autosomático asociado con la formación de hamartomas en la piel y otros órganos, es genéticamente heterogénea con distintos locus localizados en el cromosoma 9q34 (Haines et al., 1991) y el cromosoma 16pl3.3 (Kandt et al., 1992). Los resultados de los inventores indican que esto también puede ser cierto para el CS. No es claro por qué esto no fue demostrado en las observaciones iniciales, pero pudo deberse a los antecedentes étnicos de las primeras familias examinadas (Nelen et al., 1996; Liaw et al., 1997). Más aún, algunos de estos individuos presentaron CS y la enfermedad de Lhermette-Duclos, lo que los inventores nunca han visto en un probando CS ni en una familia CS (Nelen et al., 1996; Liaw et al., 1997).

Se ha desarrollado un caso sólido de la existencia de un mecanismo genético que regule la formación de tumores de pecho en el inicio temprano del cáncer de pecho (Claus et al., 1990). Por cierto, se ha asociado el inicio temprano del cáncer de pecho con mutaciones en BRCA1 (Miki et al., 1994) y BRCA2 (Wooster et al., 1995). El CS está asociado con el inicio temprano de cáncer de pecho, y el cáncer es normalmente un carcinoma del conducto (Brownstein et al., 1977; Brownstein et al., 1978). Rachel Cowden, por quién se ha nombrado el síndrome, aparentemente murió de cáncer de pecho a la edad de 31 años (Lloyd and Dennis, 1963; Brownstein et al., 1978). Como se describe en este documento, los inventores han identificado mutaciones de TS10Q23.3 en 2 individuos CS con un inicio temprano de cáncer de pecho, así como en un individuo con cáncer de pecho bilateral. Sin embargo, cuando los inventores buscaron mutaciones de TS10Q23.3 germinales en un subgrupo de mujeres con un inicio temprano de cáncer de pecho, sin signos de CS y que previamente habían mostrado tener secuencias de BRCA1 de tipo salvaje, los inventores no detectaron ninguna variante de secuencias. Estos datos sugieren que las mutaciones germinales en TS10Q23.3 ocurren infrecuentemente al menos en esta subpoblación de casos de inicio temprano de cáncer de pecho.

Ejemplo 9 Supresión de la tumorigenicidad de células de glioblastoma por transferencia génica MMAC1/PTEN mediada por adenovirus

Se diseñaron estudios adicionales para evaluar más la función de MMAC1/PTEN como supresor de tumores. Se construyó un adenovirus de replicación defectuosa (MMCB) para una transducción transiente eficaz de MMAC1 en células tumorales. Los datos presentados en este Ejemplo dan apoyo a una actividad supresora de tumores in vivo de MMAC1/PTEN y sugieren que una transferencia génica in vivo con este vector adenovírico recombinante será útil en una terapia génica del cáncer.

Materiales y métodos

Líneas celulares: Las líneas celulares de glioblastoma de MMACl mutado U87MG se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células se mantuvieron en un medio de cultivo (DME/10% FBS/1% L-glutamina) en una atmósfera humidificada con 7% de CO_{2} a 37ºC. También se obtuvieron de ATCC, 293 células embriónicas de riñón y se hicieron crecer en un medio de cultivo de DME complementado con 10% de FBS.

Análisis RT-PCR: Se aisló el ARN total de las células U87MG (Tri Reagent, Molecular Research Center) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó la transcripción inversa del ARN utilizando MuLV-RT (RNA PCR kit, Perkin-Elmer), un hexámero aleatorio y otros reactantes del equipo, seguido por una PCR utilizando cebadores MAC1.6f (5'-CTG CAG AAA GAC TTG AAG GCG TA-3', SEQ ID NO:58) y MACl,6r (5'-GCC CCG ATG TAA TAA ATA TGC AC-3') (SEQ ID NO:59) apareando las secuencia de los exones 1 y 2 de MMAC1, respectivamente. Las condiciones de amplificación fueron desnaturalización a 95ºC por 1 minuto, seguido por 25 ciclos de 15 segundos a 95ºC y 55ºC por 30 segundos, y luego 72ºC por 5 minutos. El tamaño esperado del producto normal fue de 317 bp. La banda anormal de las U87MG fue cortada de un gel de agarosa, purificada (UltraClean, Mo Bio Labs) y secuenciada directamente utilizando un sistema de secuenciamiento automatizado (ABI 373 A, Perkin Elmer).

Virus: Se construyó un adenovirus recombinante con p53 (FTCB) de tipo salvaje como se describió anteriormente (Wills et al., 1994). El genoma de este vector tiene deleciones de las regiones E1 y E3 y del gene de la proteína IX, y expresa su transgene bajo el control del promotor/potenciador temprano inmediato del citomegalovirus (CMV) humano. El vector MMCB de MMAC1/PTEN se construyó de la misma manera excepto que el p53 fue reemplazado por un MMACI de longitud completa codificante de ADNc (Steck et al., 1997). Se construyó el vector de control GFCB para aparear a MMCB excepto por su transgene, una proteína fluorescente verde potenciada (Clontech). Otro vector de control emparejado, ZZCB, se construyó sin transgene. Se construyó el vector de control BGCA que expresa LacZ del E. coli dirigido por el promotor CMV en un genoma con deleción E4 parcial además de las deleciones de El, E3 y la proteína IX (Wang et al., 1997) debido a limitaciones en el tamaño de empaquetamiento. Todos los virus fueron cultivados en 293 células y purificados por cromatografía de columna DEAE como se ha descrito (Huyghe et al., 1995). Las concentraciones de partículas virales fue determinada por HPLC de Resource Q (Shabram et al., 1997) y la estructura primaria de todos los transgenes verificada por el secuenciamiento automatizado del ADN vírico.

Inmunodetección de la proteína MMAC1: Se infectaron monocapas de células durante 24 horas con GFCB o MMCB a diversos números de partículas víricas por mililitro de medio de cultivo (pn/ml). Se extrajeron soluciones con el virus a las 24 horas y se cosecharon las células en ese momento o se realimentó con el medio de cultivo y se colectaron luego en diversos momentos posteriores. Las células se cosecharon mediante rascado en una solución tampón salina de fosfatos fría (PBS), y se centrifugó y lavó una vez más en PBS fría, luego se licuó el congelado y se volvió a suspender en una lisis amortiguadora [50 mM MOPS, pH 7.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 5% glicerol, 0.4 mM EDTA y complementado con 1 mM de DTT y del cóctel inhibidor de la proteasa completa IX (IX Complete Protease Inhibitor Cocktail) (Boehringer Mannheim)]. Se clarificó el lisado de las células mediante centrifugación a 10.000 g durante 15 minutos y los sobrenadantes se normalizaron por su contenido de proteína. Las muestras se resolvieron por SDS-PAGE utilizando geles premoldeados de TRIS-glicina al 8% (Novex), luego se transfirieron a membranas de difluoruro de vinilideno polimerizado (Immobilon-P) para un ensayo de transferencia Western (Western blotting). Las membranas se bloquearon con TBST que contenía leche descremada al 5%, y luego transferidas con el anticuerpo policlonal de conejo anti MMACl (BL74), seguido de IgG de asno y conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (Amersham). Se detectó el MMAC1 mediante quimo luminiscencia (HCL kit, Pierce) utilizando una película Kodak XAR.

Ensayo de infectividad: FACS: Las células U87MG se colocaron en una placa de 6 pocillos en una cantidad de 2 x 10^{5} células por pocillo y se incubaron durante la noche, se infectaron entonces con GFCB en concentraciones de 1 x 10^{5} a 1 x 10^{9} partículas/ml por 24 horas. Las células se cosecharon por tripsinización y se ensayaron mediante citometría de flujo (Becton Dickenson FACScan) para detectar una fluorescencia verde (pico de detección 525 nm, filtro FL-I). Las células fueron reguladas por diseminación lateral y frontal, y se estableció un corte en la intensidad de la fluorescencia de tal manera que aproximadamente 99% dieran un resultado negativo. Se determinó entonces el porcentaje de las células infectadas por GFCB con una fluorescencia mayor que este valor de corte, lo que representa una estimación mínima del porcentaje de células infectadas.

Ensayo de captación de ^{3}H-thimidina: Las células se colocaron en placas de micro titulación de 96 pocillos (Costar) en una cantidad de 5 x 10^{3} células por pocillo y se dejaron incubar durante la noche. Se agregaron, en triplicado, diluciones de ZZCB, GFCB, FTCB y MMCB en un medio de concentraciones que variaron de 5 x 10^{6} a 1 x 10^{9} partículas/ml a las monocapas celulares y luego se dejó incubar por 24 horas. Se extrajeron soluciones con el virus a las 24 horas de la infección y se reemplazó con un nuevo medio de cultivo de tejidos por 24 horas más. Las células se trataron con 1 \muCi de ^{3}H-timidina por pocillo 4 horas antes de la cosecha. Las células se cosecharon en filtros de fibra de vidrio y se determinó la captación de ^{3}H-timidina mediante centelleo líquido (Top Count, Packard). Los resultados se graficaron como porcentajes de control tratado con el tampón (media \pm desviación estándar (SD)).

Ensayo de conteo de células y viabilidad: Se infectaron monocapas subconfluentes de células U87MG, en triplicado, con adenovirus MMCB o GFCB a diversas concentraciones por 24 horas, luego de lo cual los sobrenadantes se reemplazaron con un medio de cultivo de tejidos fresco por otras 48 horas. Las células fueron entonces cosechadas mediante tripsinización y se contaron las células viables mediante el método de exclusión de azul tripán utilizando un hemocitómetro.

Ensayo de formación de colonias en agar suave: Las células U87MG infectadas como se describe anteriormente con 5 x 10^{6}, 5 x 10^{7}o 5 x 10^{8} partículas/llenado por 24 horas se suspendieron en un medio de cultivo de tejidos con agar al 0,35% y se distribuyeron en capas, por triplicado, sobre agar al 0,7% en pocillos de cultivo de tejidos de 35 mm. Los cultivaron en una atmósfera humidificada que contiene 7% de CO_{2} a 37ºC con un medio de cultivo de tejidos en exceso que fue reemplazado cada cinco días. El crecimiento de colonias se evaluó a los 14 días de la infección.

Ensayo de tumorigenicidad: Las células U87MG se colocaron en placas a una densidad de 1 x 10^{7} células por matraz T225. Luego de dejarse incubar durante la noche, las monocapas de células se infectaron con 5 x 10^{7} o 5 x 10^{8} partículas/ml de adenovirus GFCB, FTCB, BGCA o MMCB por 24 horas. Las células infectadas o no se cosecharon por tripsinización, se lavaron en el medio, se contaron en presencia de Trypan Blue y se inyectaron subcutáneamente (5 x 10^{6} células viables por flanco) en ratones hembras nu/nu atímicos (Simonsen Labs). Los ratones se clasificaron según los tumores a los 21 o 30 días; el diámetro de los tumores en las 3 dimensiones se midieron con un calibre Vernier y el volumen de los tumores se calculó por el producto de los diámetros.

Resultados y discusión de los mismos

Se eligieron para el estudio las células de glioblastoma humano U87MG (Ponten and Macintyre, 1968) por la reportada mutación de MMAC1 (Steck et al, 1997), su capacidad de formar colonias en agar suave y su tumorigenicidad subcutánea en ratones desnudos. Se encontró mediante secuenciamiento que un producto de la RT-PCR anormalmente pequeño derivado del ARN de las U87MG utilizando cebadores en los exones 2 y 5 (véase la sección precedente del Ejemplo 9 sobre métodos) carecía del exón 3, de conformidad con la mutación del sitio donante de emplame del intrón 3 (Steck et al., 1997). Aunque el exón 3 contiene 45 bp (15 codones) y es posible un producto de ultralectura en marco, los residuos faltantes codifican una hélice alfa conservada en la proteína nativa y su pérdida causa la ablación de la actividad inhibidora del crecimiento como fue medida por Fumari et al., (1997).

Se caracterizó el adenovirus recombinante con MMACl (MMCB) mediante la expresión transgénica en las células U87MG por transferencia Western de los lisados celulares con un anticuerpo policlonal de conejo (Fig. 17). No se detectó la proteína MMACl endógena en las células sin infectar ni en las células de control infectadas, pero fue detectada de una manera dependiente de la dosis en las células infectadas por MMCB al final de las 24 horas del período de infección, así como a las 48, 72 y 96 horas (Fig. 17). Este estudio verifico la transducción eficaz y la expresión aguda de la proteína MMACl exógena en las células gliomas U87MG así como validó se su detección por transferencia Western con el anticuerpo BL74.

Se evaluó cuantitativamente la infectividad de las células U87MG mediante un análisis FACS utilizando un adenovirus recombinante idéntico al MMCB excepto por su transgene, el que codifica la proteína fluorescente verde (Fig. 18). Se obtuvo la curva sigmoide de infectividad esperada, de la cual se estimó que un 85-90% de las células fueron infectadas con un dosis viral de 5 x 10^{7} partículas/ml por 24 horas. Debe notarse que los parámetros de dosificación utilizados en este caso no se basaron en la unidad formadora de placas ni en su derivada multiplicidad de infección; se ha demostrado previamente que la concentración adenoviral y el tiempo de infección son los determinantes principales de la transducción in vitro (Nyberg-Hoffman et al., 1997).

La proliferación in vitro de MMCB versus las células U87MG infectadas por el control/adenovirus fue medida mediante la captación de ^{3}H-timidina sobre un rango de concentraciones virales (Fig. 19 A), las U87MG fueron inhibidas diferencialmente por MMCB en comparación con dos adenovirus de control (GFCB y ZZCB) en la mayoría de las dosis virales; a altas concentraciones de adenovirus (por ejemplo, 1 x 10^{9} partículas/ml), predominó un efecto inhibidor no específico, como se había hecho notar anteriormente en algunas líneas celulares (Harris et al., 1995). La inhibición de la síntesis de ADN por MMCB fue comparable a la inducida por transferencia génica adenoviral de p53 gene (FTCB; Fig. 19A).

Se confirmó la inhibición del crecimiento mediante un segundo ensayo in vitro en que se contaron las células viables a las 72 horas luego del comienzo de la infección (Figura 19B); a ese momento, MMCB había reducido el número de células aproximadamente en un 50% en comparación con dosis iguales de GFCB. La magnitud de la inhibición fue comparable a la que se observó utilizando una transfección de plásmido transiente (Fumari et al., 1997). Los cultivos infectados con MMCB y GFCB tuvieron tasas de viabilidad similares a las 72 horas y no se observó en el tratamiento con MMCB ninguna prueba morfológica de muerte celular como, por ejemplo, formación de ampollas en las células o fragmentación nuclear.

Se evaluaron los efectos de MMAC1 en el crecimiento independiente del anclaje así como la formación de colonias en agar suave luego de la transduction por MMCB versus GFCB o FTCB. El último se incluyó para validar el ensayo con un gene supresor de tumores establecido. A una dosis de 5 x 10^{7} partículas/ml durante 24 horas, se inhibió la formación de colonias con MMCB o FTCB en aproximadamente un 50% en comparación con el control GFCB, mientras que se podría lograr una inhibición >85% (relativa al GFCB) a 5 x 10^{8} partículas/ml ya sea de MMCB o FFCB (Figura 20). Por lo tanto, se evidenció en este ensayo in vitro, un efecto de gene específico, dependiente de la dosis, de MMAC1.

Se realizaron dos ensayos de tumorigenicidad con 5 x 10^{6} células U87MG infectadas con MMCB mediante inyección por comparación con el mismo número de células infectadas por tres controles de adenovirus diferentes: GFCB (proteína fluorescente verde en un fondo apareado AEI/AE3), FTCB (p53 en un fondo apareado AEI/AE3), y BGCA (LacZ en un fondo AE1/AE3/AE4) (Tabla 10). Las diferencias entre los experimentos 1 y 2 incluyeron el uso de dos niveles de dosis versus una y la terminación a los 21 días versus a los 30, respectivamente. Las células U87 infectadas con MMCB fueron completamente no tumorigénicas a los 21 o 30 días, excepto por tres tumores muy pequeños (\sim10 mm^{3}) al nivel de dosis más bajo del Experimento 1. Se formaron tumores en todos los 39 ratones inyectados con células sin infectar o infectadas con el Ads de control. Los controles-Ads, GFCB y BGCA, con el gene indicador tuvieron alguna actividad en reducir el tamaño promedio de los tumores comparado con las células tratadas con el buffer, un "efecto adenovírico" no específico notado previamente por los inventores (Wills et al., 1994; Harris et al., 1995). El Ad con p53 tuvo un efecto más drástico en el tamaño promedio de los tumores (\sim68 mm^{3}), pero aún así se formaron tumores en 6 de los 6 ratones. Estos resultados son consistentes con los efectos inhibidores de crecimiento de la transferencia génica adenovírica de p53 en células U87MG reportados en otras partes, aunque estas células contienen alelos de p53 con la secuencia de tipo salvaje (Gomez-Manzani et al., 1996; Kock et al., 1996). De todas maneras, estos datos indican una actividad supresora de tumores de gene específico de MMCB en células U87MG a niveles de dosis moderados.

Utilizando un sistema de transferencia génica adenoviral recombinante, se mostró una actividad de inhibición del crecimiento in vitro de MMAC1/PTEN en las células U87MG. El uso de un adenovirus recombinante fue útil para evitar la conocida dificultad técnica de estudiar células tumorales que expresen en forma estable proteínas que potencialmente inhiban el crecimiento como, por ejemplo, MMAC1. La actividad específica de supresión de tumores de MMAC1 fue más claramente detectada en los ensayos in vivo, lo que da apoyo a la importancia del ensayo de tumorigenicidad en la determinación de la actividad supresora de tumores. Estos datos dan apoyo a un papel para la inactivación de MMAC1 en la tumorigénesis de glioblastomas y sugiere, además, que la transferencia génica MMAC1/PTEN in vivo puede considerarse como un planteamiento terapéutico potencial contra el cáncer.

Mientras que las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en término de materializaciones preferidas, será obvio para las personas versadas en el arte que se pueden aplicar variantes a las composiciones y/o los métodos y a los pasos o secuencias de pasos de los métodos descritos en este documento sin por ello apartarse del concepto, el espíritu y el alcance de esta invención. Más específicamente, será obvio que ciertos agentes que estén relacionados tanto química como biológicamente pueden sustituir los agentes descritos en este documento y todavía obtenerse los mismos resultados o equivalentes. Todos estos sustitutos y modificaciones similares obvias para aquellas personas versadas en el arte se considerarán estar dentro del espíritu, concepto y alcance de la invención de la manera que la misma se define en las reivindicaciones adjuntas.

Referencias

Las siguientes publicaciones, en la medida de que proporcionen ejemplos de procedimientos u otros detalles complementarios a lo que se establece en lo que precede, se incorporan a este documento por referencia:

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Patente de los Estados Unidos 4.800.159

Patente de los Estados Unidos 4.873.191, Wagner y Hoppe

Patente de los Estados Unidos 4.883.750

Patente de los Estados Unidos 5.252.479

Patente de los Estados Unidos 5.270.184

Patente de los Estados Unidos 5.279.721

Patente de los Estados Unidos 5.354.855

Patente de los Estados Unidos 5.409.818

Patente de los Estados Unidos 5.436.146

Patente de los Estados Unidos 5.455.166

Patente de los Estados Unidos 5.672.344

Patente de los Estados Unidos 5.691.198

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<120> UN SUPRESOR DE TUMORES DESIGNADO TS10Q23.3

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<130> 2318-205

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<140>

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<141>

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<210> 1

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<211> 3160

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1035)..(2243)

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<400> 1

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1

2

3

4

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<210> 2

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<211> 403

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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500

5

6

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<210> 3

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<211> 39

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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\sa{Ser Pro Arg Pro Ala Arg Ser Arg Pro Pro Leu Ala Arg Leu Pro Pro}

\sac{Pro Leu Gly Leu Pro Arg Arg Pro Gly Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly}

\sac{Gly Gly Gln Ala Gly Gly Arg}

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<210> 4

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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\sa{Cys Gly Arg Thr Leu Tyr Ala Leu Arg Gln Asp Thr Arg Ser Ala Leu}

\sac{Gly Arg Asp Cya Ala Gln Phe Ser Pro Leu Gly Ser Cys Ser His Asp}

\sac{Gly Ser Leu Arg Val Glu Pro Leu}

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<210> 5

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Ala Gly Leu Arg Arg Gly Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Thr Ala Ala Ala Ala Ala Arg Ser Pro Ser Gln Arg Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Ala Gly Ala Ala Pro Ser Gly Ser Arg Pro Ala Cys Gly Gly}

\sac{Gly Ser Gly Gly Val Ser Arg Leu Leu Phe Val Phe Ser Asn Arg Ala}

\sac{Ala Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Arg Glu Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 597

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1962

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (751)..(1959)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 403

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

13

14

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Thr Ala Ala Ala Thr Ala Gln Ser Pro Ser Gln Arg Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Ala Gly Ala Ala Pro Ser Gly Ser Arg Pro Gly Gly Gly Gly}

\sac{Gly Ser Gly Gly Gly Pro Arg Leu Leu Val Val Cys Ser Asn Arg Ala}

\sac{Ala Ser Glu Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Arg Asp Gly Gly Arg Ser Arg Gly Leu Glu Arg Glu Pro Ala Gln}

\sac{Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Leu His Leu Pro Leu Leu Glu Arg Gly Gly Glu Ala Ala Ala}

\sac{Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 559

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (109)..(1290)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 394

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 430

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1257

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1084

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1104

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 656

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 808

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 670

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 661

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 739

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 970

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile His Cys Lys Ala Gly Lys Gly Arg Thr Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Este ruido aminoácido es ya sea Ile o Val.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Este residuo aminoácido es ya sea Ser o Thr.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Este puede ser cualquier residuo aminoácido.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Estos pueden ser residuos aminoácidos cualesquiera

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio catalítico conservado de un proteína tirosina fosfatasa.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa His Cys Xaa Ala Gly Xaa Xaa Arg Xaa Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttttcccag tcacgacgag gtgacagatt ttctttttta

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggaaacagc tatgaccatt cggttggctt tgtcttta

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttttcccag tcacgacgca tttgcagtat agagcgt

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggaaacagc tatgaccata gctgtactcc tagaatta

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttttttttta ggacaaaatg tttc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattcagact tttgtaattt gtg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcctttttct tcagccacag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attgctgcaa catgattgtc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgacaatcat gttgcagca

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttattttca tggtgtttta tcc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttcagccac aggctcccag ac

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgttttat ccctcttg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatccat gacagccatc atcaaagaga tc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggaattctc agacttttgt aattg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggtgactt tgtggtctgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagcgtgcag ataatgacaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 403

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

42

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Pro Ala Ala Arg Pro Gly Ala Ala Cys Ser Leu Arg Arg Arg Pro}

\sac{Arg Arg Pro Pro Leu Leu Pro Ser Leu Ser Ser Phe Leu Ser Ser His}

\sac{Arg Leu Pro Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1396

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (109)..(1317)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

47

48

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 403

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Canis familiaris

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

50

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2160

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (949)..(2157)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

52

53

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 403

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

55

56

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgcagaaag acttgaaggc gta

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccccgatgt aataaatatg cac

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ala Leu Leu Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Ala Gly}

\sac{Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Gly Gly Thr Leu Cys Ala Leu Arg Gln Asp Thr Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ala Ser Gly Arg Gly Cys Ala Gln Leu Ser Pro Leu Gly Ser Cys}

\sac{Ser His Asp Gly Ser Leu Arg Val Glu Pro Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gln Ala Arg Arg Arg Arg Gly Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1212

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

58

59

Claims (14)

1. Un método para diagnosticar el síndrome de Cowden que comprende la determinación en las células de una muestra de un sujeto de la presencia de una mutación en la secuencia codificante para el supresor de tumores designado TS10q23.3, donde dicha mutación se elige de:

(a)

una mutación del marco de lectura resultante de la inserción de AT en la posición 791 del exón 7;

(b)

una mutación del marco de lectura resultante de la deleción de 13 nucleótidos en la posición 915-927 del exón 8; y

(c)

una mutación de inserción resultante de una inserción de 3 nucleótidos en la posición 137 del exón 2.

2. Un método para diagnosticar a un sujeto predispuesto al cáncer de pecho que comprende la determinación en las células de una muestra del sujeto de la presencia de una mutación en la secuencia codificante para el supresor de tumores designado TS10q23.3, donde dicha mutación se elige de:

(a)

una mutación del marco de lectura resultante de la inserción de AT en la posición 791 del exón 7;

(b)

una mutación del marco de lectura resultante de la deleción de 13 nucleótidos en la posición 915-927 del exón 8; y

(c)

una mutación de inserción resultante de una inserción de 3 nucleótidos en la posición 137 del exón 2.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde dichas células se seleccionan de células del pecho, células de los ovarios, células de la tiroides y células del endometrio.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha muestra es una muestra de tejidos o de fluido.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha determinación comprende un ensayo de un ácido nucleico de dicha muestra.

6. El método de la reivindicación 5 que adicionalmente comprende sujetar dicha muestra a condiciones apropiadas para amplificar dicho ácido nucleico.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha determinación comprende un ensayo de una proteína de dicha muestra.

8. El método de la reivindicación 7 que adicionalmente comprende sujetar proteínas de dicha muestra a un ensayo ELISA.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha determinación es un ensayo seleccionado de secuenciamiento, hibridación de oligonucleótido de tipo salvaje, hibridación de oligonucleótido mutante, SSCP, PCR™ y protección de ribonucleasa.

10. El método de la reivindicación 9, donde dicho ensayo es una hibridación de oligonucleótido mutante o de tipo salvaje y dicho oligonucleótido es configurado en un arreglo sobre un chip o wafer.

11. Un ácido nucleico aislado que comprende un ADN que codifica un mutante del supresor de tumores designado TS10q23.3, en donde dicho ADN abarca una mutación seleccionada de (a) a (c) como se define en la reivindicación 1.

12. Un ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 11 en donde la secuencia codificante para dicho supresor de tumores mutante está vinculada operacionalmente a un promotor.

13. Una sonda de hibridación de oligonucleótidos para detectar una mutación como se define en cualquiera de (a) a (c) de la reivindicación 1.

14. Una sonda de hibridación de oligonucleótidos como se reivindica en la reivindicación 13 configurada en un arreglo sobre un chip o wafer.