ES2245085T3

ES2245085T3 - Adn y polipeptidos acpl.

Info

Publication number: ES2245085T3
Application number: ES99903320T
Authority: ES
Inventors: John E. Sims; Teresa L. Born
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1998-01-23
Filing date: 1999-01-22
Publication date: 2005-12-16
Anticipated expiration: 2019-01-22
Also published as: US20090004674A1; AU2337399A; US20030003542A1; JP4409763B2; US6692740B2; ATE301195T1; CA2318030A1; IL212140A0; DE69926480D1; US20110027805A1; DE69926480T2; EP1049777A1; IL137037A0; US6693171B2; US7993845B2; IL137037A; CA2318030C; IL212140A; NZ505499A; US20040138421A1

Abstract

Una molécula de ácidos nucleicos aislada que comprende la secuencia de ADN seleccionada entre el grupo constituido por: (a) la región codificante de la SEC ID Nº: 1; (b) la región codificante de la SEC ID Nº: 6; y (c) ADN capaz de hibridar en condiciones de rigurosidad moderada con el ADN de (a) y (b), donde las condiciones de rigurosidad moderada incluyen formamida al 50% y 6XSSC, a 42ºC con condiciones de lavado a 60ºC, 0,05XSSC, SDS al 0,1%, y, donde el ADN codifica un polipéptido que coopera con IL-1Rrp1 en presencia de IL-18 para inducir la señalización de NF Kappa B.

Description

ADN y polipéptidos ACPL.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La invención se refiere a polipéptidos ACPL purificados y aislados, a los ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos, a procedimientos para la producción de formas recombinantes de tales polipéptidos, a anticuerpos generados contra estos polipéptidos, a péptidos fragmentados obtenidos de estos polipéptidos, al uso de tales polipéptidos y a péptidos fragmentados como marcadores de peso molecular, al uso de tales polipéptidos y a péptidos fragmentados como controles para la fragmentación peptídica, y a kits que comprenden estos reactivos. La invención también se refiere al uso de polipéptidos ACPL, a los ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos, y a anticuerpos generados contra estos polipéptidos en el estudio de la señalización celular en respuesta a la estimulación con IL-18, y a sistemas de expresión proteica inducible basados en la implicación de polipéptidos ACPL en la señalización celular.

Descripción de la técnica relacionada

El receptor tipo I de IL-1 (IL-1R) media los efectos biológicos de IL-1. Las actividades atribuidas a IL-1\alpha y a IL-1\beta incluyen inducción de citoquinas inflamatorias y otras respuestas inflamatorias incluyendo prostaglandinas, metaloproteinasas, moléculas de adhesión, proteínas de fase aguda, hematopoyesis, fiebre, resorción ósea, y crecimiento y diferenciación de células Th2.

IL-1 ha estado implicada en enfermedades inflamatorias crónicas, tales como artritis reumatoide y enfermedad inflamatoria del intestino. Hay más pruebas de que IL-1 juega un papel en la osteoporosis. Todas estas actividades se inician por la función de señalización de la porción citoplásmica de IL-1R tipo 1. IL-1ra inhibe las actividades de IL-1 uniéndose al receptor IL-1 tipo 1, bloqueando por lo tanto el acceso a IL-1\alpha e IL-1\beta aunque no suscita por si misma respuesta biológica.

IL-18 es un homólogo de IL-1\alpha e IL-1\beta, y puede mediar sus actividades mediante un receptor homólogo a IL-1R, la proteína 1 relacionada con el receptor de IL-1 (IL-1RrpI) (Véase Parnet y col., J. Biol. Chem 271: 3967, 1996, y Torigoe y col. J. Biol. Chem 272: 25737, 1997). IL-18 actúa como estimulador del crecimiento y diferenciación de células TH-1, y es un potente inductor de la producción de interferones a partir de células TH-1. IL-18 potencia la actividad de muerte celular NK y está implicada en el choque séptico, destrucción del hígado, y diabetes. Además, IL-18 muestra efectos antitumorales in vivo en ratones, que están inmunológicamente mediados (Micallef y col. Cancer Immunol. Immunother. 43:361, 1997).

El descubrimiento e identificación de proteínas está en la vanguardia de la biología y bioquímica molecular moderna.

La identificación de la estructura primaria, o secuencia, de una proteína de muestra es la culminación de un procedimiento arduo de experimentación. Para identificar una proteína de muestra desconocida, el investigador puede contar con la comparación de la proteína de muestra desconocida con péptidos conocidos usando diversas técnicas conocidas para los especialistas en la técnica. Por ejemplo, las proteínas se analizan de manera rutinaria usando técnicas tales como electroforesis, sedimentación cromatografía y espectrometría de masas.

La comparación de una muestra proteica desconocida con polipéptidos de pesos moleculares conocidos permite una determinación del peso molecular aparente de la muestra proteica desconocida (T.D. Brock y M.T. Madigan, Biology of Microorganisms 76-77 (Prentice Hall, 6d ed. 1991)). Los patrones de peso molecular proteico están disponibles en el mercado para ayudar a estimar los pesos moleculares de muestras proteicas desconocidas (New England Biolabs Inc. Catalog: 130-131, 1995; J. L. Hartley, Patente de Estados Unidos Nº 5.449.758). Sin embargo, los patrones de peso molecular pueden no equivaler suficientemente en tamaño a la proteína de muestra desconocida para permitir una estimación precisa del peso molecular aparente.

La dificultad en la estimulación del peso molecular se agrava en el caso de proteínas que están sometidas a fragmentación por medios químicos o enzimáticos (A.L. Lehninger, Biochemistry 106-108 (Worth Books, 2d ed. 1981)). La fragmentación química puede conseguirse por incubación de una proteína con un agente químico, tal como bromuro de cianógeno, que conduce a la escisión del enlace peptídico en el extremo carboxilo de restos de meteonina (E. Gross, Methods in Enz. 11.238-255, 1976). La fragmentación enzimática de una proteína puede conseguirse por incubación de una proteína con una proteasa que se escinde en múltiples restos aminoacídicos (D.W. Cleveland y col., J. Biol. Chem. 252:1102-1106, 1977). La fragmentación enzimática de una proteína también puede conseguirse por incubación de una proteína con una proteasa, tal como proteasa 1 de Achromobacter (F. Sakiyama y A. Nakata, Patente de Estados Unidos Nº 5.248.599; T. Masaki y col., Biochim. Biophys. Acta 660:44-50, 1981; T. Masaki y col., Biochim. Biophys. Acta 660:51-55, 1981), que conduce a la escisión del enlace peptídico en el extremo carboxilo de restos de lisina. Los pesos moleculares de los péptidos fragmentados pueden cubrir un gran intervalo de pesos moleculares y los péptidos pueden ser numerosos. También pueden conseguirse variaciones en el grado de fragmentación (D.W. Clevaland y col., J. Biol. Chem. 252:1102-1106, 1977).

La naturaleza única de la composición de una proteína con respecto a sus constituyentes aminoacídicos específicos da como resultado un posicionamiento único de sitios de escisión en la proteína. La fragmentación específica de una proteína por escisión química y enzimática da como resultado un "huella digital peptídica" única (D. W. Clevaland y col., J. Biol. Chem. 252:1102-1106, 1977; M. Brown y col., J. Gen. Virol. 50:309-316, 1980). Por consiguiente, la escisión en sitios específicos da como resultando la fragmentación reproducible de una proteína dada en péptidos de pesos moleculares precisos. Además, estos péptidos poseen características de carga únicas que determinan el pH isoeléctrico del péptido. Estas características únicas pueden explotarse usando diversas técnicas electroforéticas y otras técnicas (T.D. Brock y M.T. Madigan, Biology of Microorganisms 76-77 (Prentice Hall, 6d ed. 1991)).

Cuando se obtiene una huella digital peptídica de una proteína desconocida, ésta puede compararse con una base de datos de proteínas conocidas para ayudar en la identificación de la proteína desconocida (W.J. Henzel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5011-5015, 1993; B. Thiede y col., Electrophoresis 1996, 17:588-599, 1996). Diversos programas de software informáticos están disponibles a través de Internet para los especialistas en la técnica para facilitar tales comparaciones, tales como MultiIdent (página web: www.expasy.ch/multiident.html) PeptideSearch (página web: www.mann.embl-heiedelberg.de...deSearch/FR PeptideSearchForm.html), y ProFound (página web:
www.chait-sgi.rockefeller.edu/cgi-bin/prot-id-frag.html). Estos programas permiten al usuario especificar el agente de escisión y los pesos moleculares de los péptidos fragmentados en una tolerancia designada. Los programas comparan estos pesos moleculares con bases de datos de proteínas para ayudar a aclarar la identidad de la proteína de muestra. Se requiere una información precisa con respecto al número de péptidos fragmentados y el peso molecular preciso de esos péptidos para una identificación precisa. Por lo tanto, aumentando la precisión en la determinación del número de péptidos fragmentados y el peso molecular preciso de estos péptidos debe dar como resultado un éxito potenciado en la identificación de proteínas desconocidas.

La fragmentación de proteínas también se emplea para la producción de fragmentos para el análisis de composición de aminoácidos y secuenciación proteica (P. Matsudiara, J. Biol. Chem. 262:10035-10038, 1987; C. Eckerskorn y col. Electrophoresis 1988, 9:830-838, 1988), particularmente la producción de fragmentos a partir de proteínas con un extremo N-terminal "bloqueado"). Además, la fragmentación de proteínas puede usarse en la preparación de péptidos para la espectrometría de masas (W.J. Henzel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5011-5015, 1993; B Thiede y col., Electrophoresis 1996, 17:588-599, 1996), para inmunización, para la selección de afinidad (R.A. Brown, Patente de Estados Unidos Nº 5.151.412), para la determinación de sitios de modificación (por ejemplo, fosforilación), para la generación de compuestos biológicos activos (T.D. Brock y M.T. Madigan, Biology of Microorganisms 300-301 (Prentice Hall, 6d ed. 1991)), y para la diferenciación de proteínas homólogas (M. Brown y col., J. Gen, Virol. 50:309-316, 1980).

La purificación y caracterización del receptor de interleuquina 18 humano, por Torigoe K. y col, "Purification and Characterization of the human interleukin-18 receptor", Journal of Biological Chemistry Vol. 273, Nº 41, 10 de octubre de 1997, págs. 25737-25742, describe que la interleuquina (IL)-18 se identificó como una molécula que induce la producción de IFN-\gamma y potencia la citotoxicidad de células NK.

En vista del interés continuado en la investigación de proteínas y la aclaración de la estructura y propiedades de proteínas, existe una necesidad en la técnica de polipéptidos adecuados para uso en estudios de fragmentación peptídica y en mediciones del peso molecular.

Sumario de la invención

La invención abarca moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden las secuencias de ADN de la región codificante de la SEC ID Nº 1, la región codificante de la SEC ID Nº 6, y moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N º2 y SEC ID Nº 7. La invención también abarca moléculas de ácido nucleico complementarias a estas secuencias. Por tanto, la invención incluye moléculas de ácido nucleico de doble cadena que comprenden la región codificante de la SEC ID Nº 1 y la región codificante de la SEC ID Nº 6, y moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican las secuencias de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº: 7. La invención también abarca moléculas de ácido nucleico de ACPL de ARN y ADN tanto monocatenarias como de doble cadena. Estas moléculas pueden usarse para detectar variantes de ARN y ADN tanto monocatenarias como de doble cadena de ACPL incluidas en la invención. Una sonda de ADN de doble cadena permite la detección de moléculas de ácido nucleico equivalentes a cada cadena de la molécula de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico aisladas que hibridan con un ADN de doble cadena desnaturalizado que comprenden la región codificante de la SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 6, o una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 o SEC ID Nº 7 en condiciones de dificultad moderada en formamida al 50% y 6XSSC, a 42ºC con condiciones de lavado de 60ºC, 0,5XSSC, SDS al 0,1% se incluyen en la invención.

La invención también abarca moléculas de ácido nucleico aisladas obtenidas por mutagénesis in vitro a partir de la SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 6. La mutagénesis in vitro incluirá numerosas técnicas conocidas en la técnica incluyendo, aunque sin limitación, mutagénesis de localización dirigida, mutagénesis aleatoria, y síntesis de ácidos nucleicos in vitro. La invención también abarca moléculas de ácido nucleico aisladas degeneradas a partir de la SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 6, como resultado del código genético; moléculas de ácido nucleico aisladas que son variantes alélicas de ADN de ACPL humana, o una especie homóloga de ADN de ACPL. La invención también abarca vectores recombinantes que dirigen la expresión de estas moléculas de ácido nucleico y células huésped tranformadas o transfectadas con estos vectores.

La invención también abarca polipéptidos aislados codificados por estas moléculas de ácido nucleico, incluyendo polipéptidos asilados que tienen un peso molecular de aproximadamente 70 kD como se determina por SDS-PAGE y polipéptidos aislados en forma no glicosilada. Los anticuerpos policlonales o monoclonales aislados que se unen a estos polipéptidos se incluyen en la invención. La invención también abarca procedimientos para la producción de polipéptidos ACPL incluyendo el cultivo de una célula huésped en condiciones que promueven la expresión y recuperación del polipéptido a partir del medio de cultivo. Especialmente, la expresión de polipéptidos ACPL en bacterias, levaduras, plantas, y células animales se incluye en la invención.

Además, la invención incluye ensayos que utilizan polipéptidos ACPL para seleccionar inhibidores potenciales de actividad asociados con moléculas de contra-estructura de polipéptidos ACPL o proteínas de unión a ACPL, y procedimientos para usar polipéptidos ACPL como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades mediadas por moléculas de contra-estructura de polipéptidos ACPL o proteínas de unión a ACPL. Además, también son un aspecto de la invención procedimientos para usar polipéptidos ACPL en el diseño de inhibidores de los mismos.

La invención también abarca los péptidos fragmentados producidos a partir de polipéptidos ACPL por tratamiento químico o enzimático. Además, son un aspecto de la invención formas de marcadores de peso molecular de polipéptidos ACPL y péptidos fragmentados de los mismos, donde al menos uno de los sitios necesarios para la fragmentación por medios químicos o enzimáticos se ha mutado.

La invención también abarca un procedimiento para la visualización de marcadores de peso molecular de polipéptidos ACPL y péptidos fragmentados de los mismos usando electroforesis. La invención también incluye un procedimiento para usar marcadores de peso molecular de polipéptidos ACPL y péptidos fragmentados de los mismo como marcadores de peso molecular que permiten estimar el peso molecular de una proteína o de una muestra proteica fragmentada. La invención también abarca procedimientos para usar polipéptidos ACPL y péptidos fragmentados de los mismos como marcadores, que ayudan en la determinación del punto isoeléctrico de la proteína de muestra. La invención también abarca procedimientos para usar polipéptidos ACPL y péptidos fragmentados de los mismos como controles para establecer el alcance de la fragmentación de una muestra proteica.

Se prevén kits para ayudar a determinar los pesos moleculares de una proteína de muestra utilizando marcadores de peso molecular de polipéptidos ACPL, péptidos fragmentados de los mimos, y formas de marcadores de peso molecular de polipéptidos ACPL, donde al menos uno de los sitios necesarios para fragmentación por medios químicos o enzimáticos se ha mutado.

Esta invención también abarca procedimientos asociados con sistemas de expresión proteica inducibles basados en la inducción dependiente de ACPL. Dichos sistemas pueden incluir, pero sin limitación, la inducción dependiente de ACPL de la señalización mediada por NFkB en respuesta a la estimulación con IL-18 y señalización mediada por Ap-1 en respuesta a la estimulación con IL-18. La presente invención también abarca procedimientos que están asociados con respuestas a la inducción por IL-18 de la familia de la quinasa MAP, quinasas JNK y p38.

Descripción detallada de la invención

En las SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 6 se han aislado y descrito ADNc que codifican polipéptidos ACPL humanos y de ratón. Este descubrimiento de los ADNc que codifican polipéptidos ACPL permiten la construcción de vectores de expresión que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos ACPL y fragmentos de polipéptidos ACPL; la construcción de células huésped transfectadas o transformadas con los vectores de expresión; la construcción de polipéptidos ACPL biológicamente activos y marcadores de peso molecular de ACPL como proteínas asiladas y purificadas; y la preparación de anticuerpo inmuno-reactivos con polipéptidos ACPL.

Los nucleótidos y polipéptidos ACPL se obtuvieron del siguiente modo. Se obtuvo y se secuenció el clon IMAGE de secuencia EST AA203986, que se obtuvo del timo de ratón. Esta información de secuencias se usó para seleccionar una biblioteca de ADNc de células T de ratón (EL4), y se aisló y secuenció un clon murino de longitud completa de ADN de ACPL. La secuencia de ACPL represente la secuencia de al menos 3 aislados independientes sobre la fase de lectura abierta completa. La secuencia de la región codificante de ADN de ACPL de ratón se da en la SEC ID Nº 1. La secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID Nº 1 se presenta en la SEC ID Nº 2. El ACPL de ratón codificado por la SEC ID Nº 1 incluye un dominio extracelular de 356 aminoácidos (restos 1-356 del extremo N- a C-terminal de la SEC ID Nº 2) que incluye un péptido señal de 14 aminoácidos (restos 1-14 de la SEC ID Nº 2); una región transmembrana de 24 aminoácidos (restos 357-380 de la SEC ID Nº 2) y un domino citoplásmico de aminoácidos (restos 381-614 de la SEC ID Nº 2).

La secuencia de este clon muestra similitud con la secuencia de miembros de la familia del receptor de IL-1 lo que demuestra que el ADN de ACPL de ratón (SEC ID Nº 1) codifica un receptor (SEC ID Nº 2) que es un miembro de la familia del receptor de IL-1.

Un clon obtenido de una biblioteca de células NK humanas, QQ1352, se identificó como homólogo humano de ADN de ACPL de ratón. El clon QQ1352 representa un clon de ARNm parcialmente sometido a corte y empalme, y parte de esta secuencia es idéntica a la secuencia de un exón encontrado en un clon de ADN genómico de un BAC, que se depositó en Genbank con el número de acceso 64403. Además, esta secuencia (nucleótidos 179-244 de la SEC ID Nº 5) corresponde en posición al exón 7 del IL-1R de tipo 1 humano e indica una implicación del polipéptido ACPL en la mediación de respuestas inflamatorias.

La secuencia de aminoácidos codificada por el clon QQ1352 se comparó con la secuencia del polipéptido ACPL de ratón. Las comparaciones mejor ajustadas se realizaron con una secuencia del polipéptido ACPL de ratón con traducciones en 3 fases diferentes de la secuencia QQ1352, comenzando en el nucleótido 522. Es evidente a partir de estas alineaciones que hay al menos dos desplazamientos de fase que conducen a una homología significativa entre las secuencias de ratón y humanas en las tres fases dependiendo de la posición en la secuencia, demostrando que QQ1352 contiene una porción de ACPL humano.

Para obtener ACPL humano de longitud completa, el clon de ADNc humano, QQ1352 se usó para sondear clones a partir de bibliotecas de ADNc de PBL, PBT y NK. La región del clon QQ1352 usada como sonda era homóloga a los nucleótidos 1196 a 1753 de ACPL murino. No se obtuvo un clon de longitud completa de ninguna de las bibliotecas, de modo que se realizó una PCR anclada al vector en cada una de las bibliotecas para obtener el extremo 5' de la fase de lectura abierta. La secuencia de ADN completa de ACPL humano se describe en la SEC ID Nº 6. La secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID Nº 6 se presenta en la SEC ID Nº 7. El ACPL codificado por la SEC ID Nº 6 incluye un domino extracelular de 356 aminoácidos (restos 1-356 del extremo N- a C-terminal de la SEC ID Nº 7) que incluye un péptido señal de 14 aminoácidos (restos 1-14 de la SEC ID Nº 7); una región transmembrana de 25 aminoácidos (restos 357-381 de la SEC ID Nº 7) y un domino citoplásmico de aminoácidos (restos 382-599 de la SEC ID Nº 7).

La coexpresión de ACPL e IL-1Rrp1 da como resultado un aumento radical de la actividad de NFkB en células estimuladas con IL-18. En contraste, la expresión de ACPL o IL-1Rrp1 solo no da como resultado sensibilidad a IL-18. Por lo tanto, ACPL juega un papel en la mediación de respuestas a IL-18, y puede ser un componente del complejo del receptor de IL-18. Además, puede usarse un receptor para IL-18 como inhibidor de respuestas inflamatorias inducidas por IL-18. Por consiguiente, una realización de la presente invención incluye la porción extracelular.

Las realizaciones preferidas de ADN y aminoácidos de la presente invención incluyen la región codificante de la SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 6 y los aminoácidos codificados por la SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 6, mostrados en la SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 7, respectivamente. Son realizaciones preferidas adicionales dominios de las secuencia de aminoácidos de ACPL y secuencias de nucleótidos que codifican los dominios. Para la SEC ID Nº 7 los dominios incluyen: un dominio extracelular de 356 aminoácidos (restos 1-356 del extremo N- a C-terminal de la SEC ID Nº 7) que incluye un péptido señal de 14 aminoácidos (restos 1-14 de la SEC ID Nº 7); una región transmembrana de 25 aminoácidos (restos 357-381 de la SEC ID Nº 7) y un dominio citoplásmico de aminoácidos (restos 382-599 de la SEC ID Nº 7). Para la SEC ID Nº 2, los dominios de la secuencia de aminoácidos de ACPL de la presente invención incluyen: un dominio extracelular de 356 aminoácidos (restos 1-356 del extremo N- a C-terminal de la SEC ID Nº 2) que incluye un péptido señal de 14 aminoácidos (restos 1-14 de la SEC ID Nº 2); una región transmembrana de 24 aminoácidos (restos 357-380 de la SEC ID Nº 2) y un dominio citoplásmico de aminoácidos (restos 381-614 de la SEC ID Nº 2).

El descubrimiento de los ácidos nucleicos de la invención permite la construcción de vectores de expresión que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos; células huésped transfectadas o transformadas con los vectores de expresión; y polipéptidos asilados y purificados biológicamente activos y fragmentos de los mismos. Además, el descubrimiento de los ácidos nucleicos descritos, y fragmentos u oligonucleótidos de los mismos, permite su uso como sondas para identificar ácidos nucleicos que codifican proteínas que tienen homología con IL-1 y para identificar ácidos nucleicos que codifican proteínas que tienen un papel en respuestas mediadas por IL-18. Además, los ácidos nucleicos y oligonucleótidos de la presente invención encuentran uso en el mapeo de ADN en el cromosoma humano 2q y para identificar genes asociados con ciertas enfermedades, síndromes u otras afecciones humanas asociadas con el cromosoma humano número 2q. La siguiente tabla identifica varias de tales enfermedades, síndromes o afecciones.

Localización	Nombre del Gen	Nombre de la enfermedad

2q11	\begin{minipage}[t]{80mm}Canal abierto por nucleótido cíclico, alfa-3\end{minipage}	Acromatopsia-2

2q11	Fosfatasa 2 de especificidad dual

2q11	Distrofia muscular tibial	Distrofia muscular tibial

2q11-q12	Proteína 2 de unión a RAN de tipo 1

2q11-q13	Displasia ectodérmica-3, anhidrótico	\begin{minipage}[t]{45mm}Displasia ectodérmica-3, anhidrótico\end{minipage}

(Continuación)

Localización	Nombre del Gen	Nombre de la enfermedad

2q11-q14	\begin{minipage}[t]{80mm}Familia 20 de vehículos de soluto, transportador de fosfato, miembro 1 (receptor 1 del virus de leucemia del mono Gibbon)\end{minipage}

2q11-q11,2	Sulfotransferasa 1C1

2q11,2	Barren, Drosophila, homologo, 1

2q11,2	\begin{minipage}[t]{80mm}Familia 9 de vehículos de soluto (intercambiador sodio/hidrógeno, isoforma 2)\end{minipage}

2q11,2-q12	Proteína nuclear linfoide relacionada con AF4

2q12	Receptor de interleuquina 1, tipo 1

2q12	\begin{minipage}[t]{80mm}Proteína quinasa asociada con la cadena zeta, 70 kD (tirosina quinasa relacionada con syk)\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{45mm}Defecto selectivo de células T\end{minipage}

2q12-q14	\begin{minipage}[t]{80mm}Cuatro y medio dominios 2 de LIM (regulado negativamente en la proteína LIM de rabdomiosarcoma)\end{minipage}

2q12-q14	inmunoglobulina orphon (elemento transpuesto) 1

2q12-q14	\begin{minipage}[t]{80mm}Gen homeótico de caja emparejada 8 congénito\end{minipage}	hipotiroides

		\begin{minipage}[t]{45mm}debido a oripoplasia de disgenesis tiroidea\end{minipage}

2q12-q21	Inhibidor de unión a diacepam

2q12-q22	Receptor de interleuquina 1, tipo 2

2q12-qter	Nucleolina

2q13	Proteína BENE

2q13	mal, proteína diferenciación de células T

2q13	Nefronoftisis -1 (infantil)	Nefronoftisis-1 (infantil)

2q13-q14pro	\begin{minipage}[t]{80mm}Proteína C (inactivador de factores de coagulación Va y VIIIa)\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{45mm}Trombofilia debida a deficiencia de proteína C\end{minipage}

		Purpura fulminans, neonatal

2q13-q21	Engrailed-1

2q14	\begin{minipage}[t]{80mm}Tipo anfifisina (proteína 1 de interacción con MYC-dependiente de caja)\end{minipage}

2q14	miembro de la familia GLI-Kruppel GLI2 (oncogen GLI2)

2q14	Interleuquina-1 alfa

Los ácidos nucleicos de la presente invención permiten el uso de oligonucleótidos monocatenarios con sentido o antisentido a partir de ácidos nucleicos que inhiben la expresión de polinucleótidos codificados por el gen ACPL. Los polipéptidos y fragmentos solubles de la presente invención (por ejemplo, dominios extracelulares de la SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 7 y fragmentos activos de los mismos) pueden usarse para inhibir respuestas mediadas por IL-18 y para estudiar procedimientos asociados con sistemas de expresión proteica inducibles que se basan en la inducción dependiente de ACPL. Tales sistemas pueden incluir, pero sin limitación, inducción dependiente de ACPL de la señalización mediada por NFkB en respuesta a la estimulación con IL-18 y señalización mediada por Ap-1 en respuesta a la estimulación con IL-18. De manera similar, tales procedimientos incluyen los que están asociados con respuestas a la inducción por IL-18 de la familia de quinasa MAP, quinasas JNK y p38.

Los polipéptidos y sus péptidos fragmentados de la presente invención también encuentran uso adicional como marcadores de peso molecular, como reactivos de control para la fragmentación de péptidos, y como componentes de kits que comprenden estos reactivos. Adicionalmente los polipéptidos y fragmentos de polipéptidos de la presente invención son útiles en la generación de anticuerpos. Los anticuerpos generados de este modo están incluidos en la presente invención y son útiles como agentes terapéuticos y en procedimientos para purificar polipéptidos y fragmentos de polipéptidos de la presente invención.

Ácidos Nucleicos

En una realización, la presente invención se refiere a ciertas secuencias de nucleótidos asiladas que están libres de material endógeno contaminante. Una "secuencia de nucleótidos" se refiere a una molécula polinucleotídica en forma de un fragmento separado o en forma de un componente de una construcción de ácidos nucleicos mas grande. La molécula de ácidos nucleicos se ha obtenido de ADN o ARN aislado al menos una vez en forma sustancialmente pura y en una cantidad o concentración que permite la identificación, manipulación y recuperación de sus secuencias nucleotídicas componentes por procedimientos bioquímicos convencionales (tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª sed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Tales secuencias se proporcionan y/o construyen preferiblemente en forma de una fase de lectura abierta ininterrumpida por secuencias no traducidas internas, o intrones, que están típicamente presentes en genes eucarióticos. Las secuencias de ADN no traducido pueden estar presentes en 5' ó 3' a partir de la fase de lectura abierta, donde la misma no interfiere con la manipulación o expresión de la región codificante.

Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención incluyen ADN tanto en forma monocatenaria como de doble cadena, así como el complemento de ARN del mismo. El ADN incluye, por ejemplo, ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado químicamente, ADN amplificado por PCR, y combinaciones de los mismos. El ADN genómico puede aislarse por técnicas convencionales, por ejemplo, usando el ADNc de la SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 6, o un fragmento apropiado de los mismos, como una sonda.

Las moléculas de ADN de la invención incluyen genes de longitud completa así como polinucleótidos y fragmentos de los mismos. El gen de longitud completa puede incluir el péptido señal N-terminal. Otras realizaciones incluyen ADN que codifica una forma soluble, por ejemplo, que codifica el dominio extracelular de la proteína, con o sin el péptido señal.

Los ácidos nucleicos de la invención se obtienen preferentemente de fuentes humanas, pero la invención también incluye los obtenidos de especies no humanas.

Debido a la degeneración conocida del código genético, donde más de un codón puede codificar el mismo aminoácido, una secuencia de ADN puede variar de la mostrada en la SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 3 y SEC ID Nº 6 y también codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 7. Tales secuencias de ADN variantes pueden resultar de mutaciones silenciosas (por ejemplo, mutaciones que producen durante la amplificación por PCR), o pueden ser el producto de la mutagénesis deliberada de una secuencia nativa.

De esta forma la invención proporciona secuencias de ADN aisladas que codifican polipéptidos de la invención, seleccionadas entre: (a) ADN que comprende la secuencia codificante de la SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 6; (b) ADN que codifica los polipéptidos de la SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 7; (c) ADN capaz de hibridar con un ADN de (a) o (b) en condiciones de rigurosidad moderada y que codifican polipéptidos que tienen actividad ACPL; (d) ADN capaz de hibridar con un ADN de (a) o (b) en condiciones de alta rigurosidad y que codifican polipéptidos de la invención, y (e) ADN que está degenerado como resultado del código genético a un ADN definido en (a), (b), (c), o (d) y que codifica polipéptidos de la invención. Por su puesto, la invención abarca los polipéptidos codificados por tales secuencias de ADN.

Como se usa en este documento, las condiciones de rigurosidad moderada pueden determinarse fácilmente por parte de los especialistas habituales en la técnica en función de, por ejemplo, la longitud del ADN. Las condiciones básicas se exponen por Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, págs. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), e incluyen el uso de una solución prelavada para los filtros de nitrocelulosa 5X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), condiciones de hibridación de aproximadamente formamida al 50%, 6X SSC a aproximadamente 42ºC (u otra solución de hibridación similar, tal como solución de Stark, formamida en aproximadamente formamida al 50% a aproximadamente 42ºC), y condiciones de lavado de aproximadamente 60ºC, 0,5X SSC, SDS al 0,1%. Las condiciones de alta rigurosidad también pueden determinarse fácilmente por parte de un especialista en la técnica en función de, por ejemplo, la longitud del ADN. Generalmente, tales condiciones se definen como condiciones de hibridación como anteriormente, y con un lavado a aproximadamente 68ºC, 0,2X SSC, SDS al 0,1%. Los especialistas en la técnica reconocerán que la temperatura y concentración salina de la solución de lavado pueden ajustarse si es necesario de acuerdo con factores tales como la longitud de la sonda.

También se incluyen como realización de la invención fragmentos polipeptídicos codificados por ADN y polipéptidos que comprenden un sitio o sitios de N-glicosilación, un sitio o sitios de procesamiento de proteasas inactivados, o una sustitución o sustituciones de aminoácidos conservativas, como se describe más adelante.

En otra realización, las moléculas de ácidos nucleicos de la invención también comprenden secuencias de nucleótidos que son al menos un 80% idénticas a una secuencia nativa. También se contemplan realizaciones en las que una molécula de ácidos nucleicos comprende una secuencia que es al menos un 90% idéntica, al menos un 95% idéntica, al menos un 98% idéntica, al menos un 99% idéntica, o al menos un 99,9% idéntica a una secuencia nativa.

El porcentaje de identidad puede determinarse por inspección visual y cálculo matemático. Como alternativa, el porcentaje de identidad de dos secuencias de ácidos nucleicos puede determinarse comparando la información de secuencia usando el programa informático GAP, versión 6.0 descrito por Devereux y col. (Nucl. Acids Res.12:387, 1984) y disponible en la University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Los parámetros preferidos por defecto del programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene una valor de 1 para identidades y de 0 para no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acid. Res. 14:6745, 1986, como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo en cada hueco y (3) sin penalización para huecos finales. También pueden usarse otros programas usados por un especialista en la técnica de comparación de secuencias.

La invención también proporciona ácidos nucleicos aislados útiles en la producción de polipéptidos. Tales polipéptidos pueden preparase por cualquier de numerosas técnicas convencionales. Una secuencia de ADN que codifica un polipéptido ACPL, o fragmento deseado del mismo puede subclonarse en un vector de expresión para la producción del polipéptido o fragmento. La secuencia de ADN se fusiona de manera ventajosa a una secuencia que codifica un líder o péptido señal adecuado. Como alternativa, el fragmento deseado puede sintetizarse químicamente usando técnicas conocidas. Los fragmentos de ADN también pueden producirse por digestión con endonucleasas de restricción de una secuencia de ADN clonada de longitud completa, y asilarse por electroforesis en geles de agarosa. Si es necesario, los oligonucleótidos que reconstruyen los extremos 5' o 3' hasta un punto deseado pueden unirse a un fragmento de ADN generado por digestión con enzimas de restricción. Tales oligonucleótidos pueden contener adicionalmente un sitio de escisión de endonucleasas de restricción cadena arriba de la secuencia codificante deseada, y colocar un codón de inicio (ATG) en el extremo N-terminal de la secuencia codificante.

También puede emplearse el procedimiento bien conocido de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para aislar y amplificar una secuencia de ADN que codifica un fragmento de proteína deseado. Los oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de ADN se emplean como cebadores 5' y 3'. Los oligonucleótidos pueden contener adicionalmente sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción, para facilitar la inserción del fragmento de ADN amplificado en un vector de expresión. Las técnicas de PCR se describen en Saiki y col., Science 239:487 (1988); Recombinant ADN Methodology, Wu y col., eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989), págs. 189-196; y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis y col., eds., Academic Press, Inc, (1990).

Polipéptidos y fragmentos de los mismos

La invención abarca polipéptidos y fragmentos de los mismos en diversas formas, incluyendo las que son de origen natural o se producen a través de diversas técnicas tales como procedimientos que implican tecnología de ADN recombinante. Tales formas incluyen, pero sin limitación, derivados, variantes, y oligómeros, así como proteínas de fusión o fragmentos de las mismas.

El especialista en la técnica reconocerá que los límites descritos anteriormente de los dominios de polipéptidos ACPL (por ejemplo, el dominio extracelular, péptido señal, región transmembrana, y domino citoplásmico) son aproximados y que los límites de la región transmembrana y del péptido señal (que pueden predecirse usando programas informáticos disponibles para este propósito) pueden diferir de los descritos anteriormente.

Los polipéptidos de la invención pueden estar unidos a membrana o pueden secretarse y por tanto ser solubles. Los polipéptidos solubles pueden secretarse a partir de células en las que se expresan. En general, los péptidos solubles pueden identificarse (y distinguirse de homólogos unidos a membrana no solubles) separando células intactas que expresan el polipéptido deseado del medio de cultivo, por ejemplo, por centrifugación, y ensayando el medio (sobrenadante) con respecto a la presencia del polipéptido deseado. La presencia de polipéptidos en el medio indica que el polipéptido se secretó a partir de las células y por tanto es una forma soluble de la proteína.

En una realización, los polipéptidos solubles y fragmentos de los mismos comprenden todo o parte del dominio extracelular, pero carecen de la región transmembrana que provocará la retención del polipéptido en la membrana celular. Un polipéptido soluble pueden incluir el dominio citoplásmico, o una parte del mismo, mientras que el polipéptido se secreta de la célula en la que se produce. Son ejemplos adicionales de polipéptidos solubles los que carecen no sólo del dominio citoplásmico y de la región transmembrana, sino también de todo o parte de la región espaciadora descrita anteriormente.

En general, el uso de formas solubles es ventajoso para ciertas aplicaciones. La purificación de los polipéptidos a partir de células huésped recombinantes se facilita, ya que los polipéptidos solubles se secretan de las células. Los polipéptidos solubles generalmente son más adecuados para administración intravenosa. Además, los polipéptidos solubles pueden ser útiles para inhibir la actividad asociada con proteínas de unión a ACPL.

La invención también proporciona polipéptidos ACPL y fragmentos de los mismos que retienen una actividad biológica deseada (por ejemplo, el dominio extracelular). Las realizaciones particulares se refieren a fragmentos polipeptídicos que conservan la capacidad de unir una proteína de unión a ACPL o molécula de unión. Tal fragmento puede ser un polipéptido soluble, como se ha descrito anteriormente. En otra realización, los polipéptidos y fragmentos incluyen de manera ventajosa regiones que se conservan en la familia del receptor de IL-1 como se ha descrito anteriormente.

También se proporcionan en este documento fragmentos polipeptídicos que comprenden al menos 20 o al menos 30, aminoácidos contiguos de la secuencia de SEC ID Nº 2 o SEC ID Nº 7. Los fragmentos obtenidos del dominio citoplásmico encuentran uso en estudios de transducción de señales, y en la regulación de procedimientos celulares asociados con la transducción de señales biológicas. Los fragmentos polipeptídicos también pueden emplearse como inmunógenos, en la generación de anticuerpos.

Variantes

En este documento se proporcionan variantes de origen natural así como variantes derivadas de los polipéptidos y fragmentos.

Las variantes pueden mostrar secuencias de aminoácidos que son al menos un 80% idénticas. También se contemplan realizaciones en las que un polipéptido o fragmento comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica, al menos un 95% idéntica, al menos un 98% idéntica, al menos un 99% idéntica, o al menos un 99,9% idéntica al polipéptido o fragmento del mismo preferido. El porcentaje de identidad puede determinarse por inspección visual y cálculo matemático. Como alternativa, el porcentaje de identidad de dos secuencias proteicas puede determinarse comparando la información de secuencias usando el programa informático GAP, basado en el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Bio. 48:443, 1970) y disponible en la University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de puntuación, blosum62, como se describe por Henikoff y Henikoff (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915, 1992); (2) un tamaño del hueco de 12; (3) un tamaño de longitud de hueco de 4; y (4) sin penalización para huecos finales. También pueden usarse otros programas usados por parte de un especialista en la técnica de comparación de secuencias.

Las variantes de la invención incluyen, por ejemplo, las que son el resultado de sucesos de corte y empalme de ARNm alternativo o de escisión proteolítica. El corte y empalme alternativo de ARNm puede producir, por ejemplo, una proteína truncada pero biológicamente activa, tal como una forma soluble de origen natural de la proteína. Las variaciones que se pueden atribuir a la proteolisis incluyen, por ejemplo, diferencias en los extremos N- o C-terminal después de la expresión en diferentes tipos de células huésped, debido a la retirada proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de la proteína (generalmente de 1-5 aminoácidos terminales). En este documento también se contemplan proteínas en las que las diferencias en la secuencia de aminoácidos se pueden atribuir a polimorfismo genético (variación alélica entre individuos que producen la proteína).

Las variantes adicionales dentro del alcance de la invención incluyen polipéptidos que pueden modificarse para crear derivados de los mismos formando conjugados covalentes o de agregación con otros restos químicos, tales como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Los derivados covalentes pueden preparase uniendo los restos químicos a grupos funcionales en las cadenas laterales de aminoácidos o en el extremo N-terminal o C-terminal de un polipéptido. Los conjugados que comprenden agentes de diagnóstico (detectables) o terapéuticos unidos a los mismos se contemplan en este documento, como se analiza con más detalle a continuación.

Otros derivados incluyen conjugados covalentes o de agregación de los polipéptidos con otras proteínas o polipéptidos, tales como por síntesis en cultivos recombinante como fusiones N-terminales o C-terminales. Los ejemplos de proteínas de fusión se analizan más adelante con respecto a oligómeros. Además, las proteínas de fusión pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación e identificación. Dichos péptidos incluyen, por ejemplo, poli-His o los péptidos de identificación antigénicos descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.011.912 y en Hopp y col., Bio/Technology 6:1204, 1988. Uno de tales péptidos es el péptido FLAG®, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, que es altamente antigénico y proporciona un epítope unido de manera reversible por un anticuerpo monoclonal específico, permitiendo el ensayo rápido y la fácil purificación de la proteína recombinante expresada. Un hibridoma murino denominado 4E11 produce un anticuerpo monoclonal que se une al péptido FLAG® en presencia de ciertos cationes metálicos divalentes, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.011.912, incorporada por la presente como referencia. La línea celular del hibridoma 4E11 se ha depositado en la American Type Culture Collection con el número de acceso HB 9259. Los anticuerpos monoclonales que se unen al péptido FLAG® están disponibles de Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut.

Entre los polipéptidos variantes proporcionados en este documento hay variantes de polipéptidos nativos que mantienen la actividad biológica nativa o el equivalente sustancial del mismo. Un ejemplo es una variante que se une a su proteína de unión o molécula de unión esencialmente con la misma afinidad de unión con que lo hace la forma nativa. La afinidad de unión puede medirse por procedimientos convencionales, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.512.457 y como se expone más adelante.

Las variantes incluyen polipéptidos que son sustancialmente homólogos a la forma nativa, pero que tienen una secuencia de aminoácidos diferente de la de la forma nativa a causa de una o más deleciones, inserciones o sustituciones. Las realizaciones particulares incluyen, pero sin limitación, polipéptidos que comprenden de una a diez deleciones, inserciones o sustituciones de restos de aminoácidos, cuando se comparan con una secuencia nativa.

Un aminoácido dado puede reemplazarse, por ejemplo, por un residuo que tiene características fisicoquímicas similares. Los ejemplos de tales sustituciones conservativas incluyen sustitución de un resto alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala por otro; sustituciones de un resto polar por otro, tal como entre Lys y Arg, Glu y Asp o Gln y Asn; o sustituciones de un resto aromático por otro, tal como Phe, Trp o Tyr por otro. Son bien conocidas otras sustituciones conservativas, por ejemplo, que implican sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similares.

De manera similar, los ADN de la invención incluyen variantes que difieren de una secuencia de ADN nativa debido a una o más deleciones, inserciones o sustituciones, pero que codifican un polipéptido biológicamente activo.

La invención incluye adicionalmente polipéptidos de la invención con o sin patrón nativo de glicosilación asociado. Los polipéptidos expresados en sistemas de expresión de levaduras o de mamífero (por ejemplo, células COS-1 o COS-7) pueden ser similares a o diferir de manera significativa de un polipéptido nativo en el peso molecular y patrón de glicosilación, dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión de polipéptidos de la invención en sistemas de expresión bacterianos, tales como E. coli, proporciona moléculas no glicosiladas. Además, una preparación dada puede incluir múltiples especies glicosiladas de manera diferente de la proteína. Los grupos glicosilo pueden retirarse a través de procedimientos convencionales, en particular los que utilizan glicopeptidasa. En general, los polipéptidos glicosilados de la invención pueden incubarse con un exceso molar de glicopeptidasa (Boehringer Mannheim).

Por consiguiente, la invención abarca construcciones de ADN similares que codifican diversas adiciones o sustituciones de restos o secuencias de aminoácidos, o deleciones de restos o secuencias terminales o internos. Por ejemplo, los sitios de N-glicosilación en el dominio extracelular polipeptídico pueden modificarse para impedir la glicosilación, permitiendo la expresión de un análogo de carbohidratos reducido en sistemas de expresión de mamíferos y levaduras. Los sitios de N-glicosilación en polipéptidos eucarióticos se caracterizan por un triplete de aminoácidos Asn-X-Y, donde X es cualquier aminoácido excepto Pro e Y es Ser o Thr. Las sustituciones, adiciones, o deleciones apropiadas para la secuencia de nucleótidos que codifica estos tripletes hará que se evite la unión de los restos de carbohidratos en la cadena lateral de Asn. La alteración de un único nucleótido, elegido de modo que Asn esté reemplazado por un aminoácido diferente, por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glicosilación. Como alternativa, Ser o Thr puede reemplazarse con otro aminoácidos, tales como Ala. Los procedimientos conocidos para inactivar sitios de N-glicosilación en proteínas incluyen los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.071.972 y en el documento EP 276.846, incorporados por la presente como referencia.

En otro ejemplo de variantes, las secuencias que codifican restos Cys que no son esenciales para la actividad biológica pueden alterarse para hacer que los restos Cys se delecionen o reemplacen con otros aminoácidos, evitando la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos después del plegamiento o renaturalización.

Pueden prepararse otras variantes por modificación de restos de aminoácidos dibásicos adyacentes, para potenciar la expresión en sistemas de levaduras en los que la actividad de proteasa KEX2 está presente. El documento EP 212.914 describe el uso de mutagénesis específica de sitio para inactivar los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 en una proteína. Los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 se inactivan delecionando, añadiendo o sustituyendo estos para alterar los pares Arg-Arg, Arg-Lys, y Lys-Arg para eliminar la aparición de estos restos básicos adyacentes. Los pares Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles a escisión con KEX2, y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg en Lys-Lys representa un enfoque conservador y preferido para inactivar sitios de KEX2.

Oligómeros

En la invención se abarcan oligómeros o proteínas de función que contienen polipéptidos ACPL. Tales oligómeros pueden estar en forma de multímeros unidos covalentemente o unidos no covalentemente, incluyendo dímeros, trímeros, u oligómeros superiores. Como se ha observado anteriormente, los polipéptidos preferidos son solubles y por tanto estos oligómeros pueden comprender polipéptidos solubles. En un aspecto de la invención, los oligómeros mantienen la capacidad de unión de los componentes del polipéptido y proporcionan por lo tanto sitios de unión bivalentes, trivalentes, etc.

Una realización de la invención se refiere a oligómeros que comprenden múltiples polipéptidos unidos mediante interacciones covalentes o no covalentes entre restos peptídicos fusionados a los polipéptidos. Talas polipéptidos pueden ser engarces peptídicos (espaciadores), o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Las cremalleras de leucina y ciertos polipétidos obtenidos de anticuerpos están entre los péptidos que pueden promover la oligomerización de los polipéptidos unidos a ellos, como se describe con más detalle a continuación.

Oligómeros basados en Inmunoglobulina

Como alternativa, un oligómero se prepara usando polipéptidos obtenidos de inmunoglobulinas. Se ha descrito la preparación de proteínas de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados a diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio FC), por ejemplo, por Ashkenazi y col. (PNAS Estados Unidos 88:10535, 1991); Byrn y col., (Nature 344:677, 1990); y Hollenbaugh y Aruffo ("Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", en Current Protocols in Immunology, Suppl. 4. Páginas 10.19.1 - 10.19.11, 1992).

Una realización de la presente invención de refiere a un dímero que comprende dos proteínas de fusión creadas fusionando un polipéptido de la invención a un polipéptido Fc obtenido de un anticuerpo. Una fusión génica que codifica la proteína de fusión polipéptido/Fc se inserta en un vector de expresión apropiado. Las proteínas de fusión polipéptido/Fc se expresan en células huésped trasformadas con el vector de expresión recombinante, y se dejan ensamblar como moléculas de anticuerpo, después de lo cual se forman puentes disulfuro intercatenarios entre los restos Fc para producir moléculas divalentes.

El término "polipéptido Fc" como se usa en este documento incluye formas nativas y de muteínas de polipéptidos hechos de la región Fc de un anticuerpo que comprende cualquier o todos los dominios CH de la región Fc. También se incluyen formas truncadas de tales polipéptidos que comprenden la región bisagra que promueve la dimerización. Los polipéptidos preferidos comprenden un polipéptido Fc obtenido de un anticuerpo IgG1 humano.

Un polipéptido Fc adecuado, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151 (incorporada por la presente como referencia), es un polipéptido monocatenario que abarca de la región bisagra N-terminal al extremo C-terminal nativo de la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano. Otro polipéptido Fc útil es la muteína Fc descrita en la Patente de Estados Unidos Nº 5.457.035 y en Baum y col., (EMBO J. 13:3992-4001, 1994) incorporado en este documento como referencia. La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a la de la secuencia de Fc nativa presentada en el documento WO 93/10151, excepto en que el aminoácido 19 se ha cambiado de Leu a Ala, el aminoácidos 20 se han cambiado de Leu a Glu, y el aminoácido 22 se ha cambiado de Gly a Ala. La muteína muestra afinidad reducida por receptores Fc.

Las proteínas de fusión descritas anteriormente que comprenden restos Fc (y oligómeros formados de los mismos) ofrecen la ventaja de facilitar la purificación por cromatografía de afinidad en columnas de proteína A o proteína G.

En otras realizaciones, los polipéptidos de la invención pueden sustituirse con respecto a la porción variable de una cadena pesada o ligera de anticuerpo. Si las proteínas de fusión están hechas tanto con cadenas pesadas como ligeras de un anticuerpo, es posible formar un oligómero con hasta cuatro regiones extracelulares de ACPL. Como alternativa, las proteínas de fusión pueden prepararse de modo que la porción variable de una cadena pesada o ligera de anticuerpo se sustituya por ACPL o un fragmento soluble de ACPL, por ejemplo, la región extracelular, e IL-1Rrp1 o un fragmento soluble de IL-1Rrp1, por ejemplo, la región extracelular.

Oligómeros basado en engarces peptídicos

Como alternativa, el oligómero es una proteína de fusión que comprende múltiples polipéptidos, con o sin engarces peptídicos (péptidos espaciadores). Entre los engarces peptídicos apropiados están los descritos en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.751.180 y 4.935.233, que se incorporan por la presente como referencia. Una secuencia de ADN que codifica un engarce peptídico deseado puede insertarse entre, y en la misma fase de lectura que, las secuencias de ADN de la invención, usando cualquier técnica convencional apropiada. Por ejemplo, puede ligarse un oligonucleótido químicamente sintetizado que codifica el engarce entre las secuencias. En realizaciones particulares, una proteína de fusión comprende de dos a cuatro polipéptidos ACPL solubles, separados por engarces peptídicos. De manera similar, como se ha descrito anteriormente, la proteína de fusión puede incluir dos polipéptidos o fragmentos de ACPL y dos polipéptidos o fragmentos de IL-1Rrp1.

Cremalleras de Leucina

Otro procedimiento para preparar los oligómeros de la invención implica el uso de un cremallera de leucina. Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron en un principio en varias proteínas de unión a ADN (Landschulz y col., Science 240:1759, 1988), y desde entonces se han encontrado en diversas proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas están los péptidos de origen natural y derivados de los mismos que dimerizan o trimerizan.

El dominio de cremallera (también mencionado en este documento como un dominio oligomerizante, o formador de oligómeros) comprende una repetición héptada repetitiva, a menudo con cuatro o cinco restos de leucina intercalados con otros aminoácidos. Son ejemplos de dominios de cremallera los que se encuentran en el factor de transcripción de levaduras GCN4 y una proteína de unión a ADN estable al calor encontrada en el hígado de rata (C/EBP; Landshulz y col., Science 245:646, 1989). Dos proteínas de transformación nuclear, fos y jun, también muestran dominios de cremallera, así como el producto génico del proto-oncogen murino c-myc (Landschulz y col., Science 240:1759, 1988). Los productos de los oncogenes nucleares fos y jun comprenden dominios de cremallera que forman preferentemente heterodímeros (O'Shea y col., Science 245:646, 1989, Turner y Tjian, Science 243:1689, 1989). El dominio de cremallera es necesario para la actividad biológica (unión a ADN) en estas proteínas.

Las proteínas fusogénicas de varios virus diferentes, incluyendo paramixovirus, conoravirus, virus del sarampión y muchos retrovirus, también tienen dominios de cremallera (Buckland y Wild, Nature 338:547, 1989; Britton, Nature 353:394, 1991; Delwart y Mosialos, AIDS Research and Human Retroviruses 6:703, 1990) Los dominios de cremallera en estas proteínas virales fusogénicas están cerca de la región transmembrana de las proteínas; se ha sugerido que los dominios de cremallera podrían contribuir a la estructura oligomérica de las proteínas fusogénicas. Las oligomerización de proteínas virales fusogénicas está implicada en la formación de poros por fusión (Spruce y col, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:3523, 1991). También se ha informado recientemente de que los dominios de cremallera juegan un papel en la oligomerización de factores de transcripción de choque por calor (Rabindran y col., Science 259:230, 1993).

Los dominios de cremallera se pliegan como hélices enrolladas paralelas cortas (O'Shea y col., Science 254:539; 1991). La arquitectura general de las hélices enrolladas paralelas se ha caracterizado bien, con una aglomeración de "bultos en los huecos" como propuso Crick en 1953 (Acta Crystallogr. 6:689). El dímero formado por un dominio de cremallera se estabiliza por la repetición héptada, denominada (abcdefg)_{n} de acuerdo con la anotación de McLachlan y Stewart (J. Mol. Biol. 98:293; 1975), en la que los restos a y d generalmente son restos hidrófogos, siendo d una leucina, que se alinean en la misma cara de una hélice. Los restos cargados de manera opuesta habitualmente aparecen en las posiciones g y e. Por tanto, en una hélice enrollada paralela formada por dos dominios de cremallera helicoidales, los "bultos" formados por las cadenas laterales hidrófobas de la primera hélice se rellenan en los "huecos" formados entre las cadenas laterales de la segunda hélice.

Los restos en la posición d (a menudo leucina) contribuyen mucho a las energías de estabilización hidrófoga, y son importantes para la formación del oligómero (Krystek: y col., Int. J. Peptide Res. 38:229, 1991). Lovejoy y col (Science 259:1288, 1993) informaron recientemente de que las síntesis de un ovillo á-helicoidal de triple cadena en el que las hélices van arriba-arriba-abajo. Sus estudios confirmaron que la energía de estabilización hidrófoga proporciona la principal fuerza directriz para la formación de hélices enrolladas a partir de monómeros helicoidales. Estos estudios también indican que las interacciones electroestáticas contribuyen a la estequiometría y geometría de las hélices enrolladas. En Harbury y col (Science 262:1401, 26 de noviembre de 1993) se encuentra un análisis adicional de la estructura de las cremalleras de leucina.

Se describen ejemplos de dominios de cremallera de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles en la solicitud PCT WO 94/10308, así como la cremallera de leucina obtenida de la proteína D tensioactiva de pulmón (SPD) descrita en Hoppe y col. (FEBS Letters 344:191, 1994), incorporada por la presente como referencia. El uso de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada a la misma se describe en Fanslow y col. (Semin. Immunol. 6:267-278, 1994). Las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un polipéptidos fusionado a un péptido de cremallera de leucina se expresan en células huésped apropiadas, y el oligómero soluble que forma se recupera del sobrenadante de cultivo.

Ciertos restos de cremallera de leucina forman de manera preferente trímeros. Un ejemplo es una cremallera de leucina obtenida de la proteína D tensioactiva de pulmón (SPD) indicada anteriormente, como se describe en Hoppe y col (FEBS Letters 344:191, 1994) y en la Patente de Estados Unidos 5.716.805, incorporada por la presente como referencia en su totalidad. Este péptido de cremallera de leucina obtenido de SPD de pulmón comprende la secuencia de aminoácidos Pro Asp Val Ala Ser Leu Arg Gln Gln Val Glu Ala Leu Gln Gly Gln Val Gln His Leu Gln Ala Ala Phe Ser Gln Tyr.

Otro ejemplo de una cremallera de leucina que promueve la trimerización es un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Leu Ile Gly Glu Arg, como se describe en la Patente de Estados Unidos 5.716.805. En una realización alternativa, se añade un resto Asp N-terminal; en otra, el péptido carece del resto Arg N-terminal.

También pueden emplearse fragmentos de los péptidos de cremallera anteriores que mantienen la propiedad de promover la oligomerización. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen, aunque sin limitación, péptidos que carecen de uno o dos de los restos N-terminales o C-terminales presentados en las secuencias de aminoácidos anteriores. Las cremalleras de leucina pueden obtenerse de péptidos de cremalleras de leucina de origen natural, por ejemplo, mediante sustitución o sustituciones conservativas en las secuencias de aminoácidos nativas, donde se mantiene la capacidad de los péptidos para promover la oligomerización.

Otros péptidos obtenidos de proteínas triméricas de origen natural pueden emplearse en la preparación de ACPL ologomérico, incluyendo ACPL trimérico. Como alternativa, pueden emplearse péptidos sintéticos que promueven la oligomerización. En realizaciones particulares, los restos de leucina en un resto de cremallera de leucina se reemplazan por restos de isoleucina. Tales péptidos que comprenden isoleucina pueden mencionarse como cremalleras de isoleucina, pero se incluyen por el término "cremalleras de leucina" como se emplea en este documento.

Producción de polipéptidos y fragmentos de los mismos

La expresión, aislamiento y purificación de los polipéptidos y fragmentos de la invención pueden conseguirse por cualquier técnica adecuada, incluyendo pero sin limitación las siguientes:

Sistemas de Expresión

La presente invención también proporciona vectores de clonación y expresión recombinantes que contienen ADN, así como células huésped que contienen los vectores recombinantes. Los vectores de expresión que comprenden ADN pueden usarse para preparar los polipéptidos o fragmentos de la invención codificados por el ADN. Un procedimiento para producir polipéptidos comprende cultivar células huésped transformadas con un vector de expresión recombinante que codifica el polipéptido, en condiciones que promueven la expresión del polipéptido, recuperando después los polipéptidos expresados del cultivo. El especialista en la técnica reconocerá que el procedimiento para purificar los polipéptidos expresados variará de acuerdo con factores tales como el tipo de células huésped empleadas, y de si el polipéptido está unido a membrana o es una forma soluble que se secreta a partir de la célula huésped.

Puede emplearse cualquier sistema de expresión adecuado. Los vectores incluyen un ADN que codifica un polipéptido o fragmento de la invención, unido de manera operativa a secuencias de nucleótidos reguladoras de la trascripción o la traducción adecuadas, tales como las obtenidas de un gen de mamífero, microbiano, viral o de insecto. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, operadores o potenciadores de la trascripción, un sitio de unión a ARNm ribosómico, y secuencias apropiadas que controlan el inicio y la finalización de la transcripción y la traducción. Las secuencias de nucleótidos están unidas de manera operativa cuando la secuencia reguladora está relacionada funcionalmente con la secuencia de ADN. Por tanto, una secuencia de nucleótidos promotora está unida de manera operativa a una secuencia de ADN si la secuencia de nucleótidos promotora controla la trascripción de la secuencia de ADN. En el vector de expresión generalmente se incorporan un origen de replicación que confiere la capacidad de replicar en células huésped deseadas, y un gen de selección por el que los transformantes se identifican.

Además, en los vectores de expresión puede incorporarse una secuencia que codifica un péptido señal apropiado (nativo o heterólogo). Una secuencia de ADN para un péptido señal (líder secretor) puede fusionarse en la fase a la secuencia de ácidos nucleicos de la invención de modo que el ADN se transcriba inicialmente, y se traduzca el ARNm, en un proteína de fusión que comprende el péptido señal. Un péptido señal que es funcional en las células huésped deseadas promueve la secreción extracelular del polipéptido. El péptido señal se escinde del polipéptido después de la secreción del polipéptido a partir de la célula.

El especialista en la técnica también reconocerá que la posición o posiciones en las que el péptido señal se escinde puede(n) diferir del que se pronostica por un programa informático, y puede variar de acuerdo con factores tales como el tipo de células huésped empleadas en la expresión de un polipéptido recombinante. Una preparación proteica puede incluir una mezcla de moléculas proteicas que tienen diferentes aminoácidos N-terminales, que resultan de escisión del péptido señal en más de un sitio.

Las células huésped apropiadas para la expresión de polipéptidos incluyen células procariotas, de levadura o eucariotas superiores. Las células de mamífero o insecto se prefieren generalmente para uso como células huésped. Los vectores de clonación y expresión apropiados para uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura, y de mamíferos, se describen, por ejemplo, en Pouwels y col. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, (1985). Los sistemas de traducción libres de células también pueden emplearse para producir polipéptidos usando ARN obtenidos de construcciones de ADN descritas en este documento.

Sistemas Procarióticos

Los procariotas incluyen organismos gram-negativos o gram-positivos. Las células huésped procariotas apropiadas para la transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella Typhimurium, y diversas especies diferentes de los géneros Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus. En una célula huésped procariota, tal como E. coli, un polipéptido puede incluir un resto de metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula huésped procariota. La Met N-terminal puede escindirse del polipéptido recombinante expresado.

Los vectores de expresión para uso en células huésped procariotas generalmente comprenden uno o más genes marcadores seleccionables fenotípicos. Un gen marcador seleccionable fenotípico es, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a antibióticos o que satisface una necesidad autotrófica. Los ejemplos de vectores de expresión útiles para células huésped procariotas incluyen los obtenidos de plásmidos disponibles en el mercado tales como el vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). pBR322 contiene genes para la resistencia a ampicilina y tetraciclina y por tanto proporciona medios sencillos para identificar células transformadas. En el vector pBR322 se insertan un promotor apropiado y una secuencia de ADN. Otros vectores disponibles en el mercado incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, Estados Unidos).

Las secuencias promotoras habitualmente usadas para vectores de expresión de células huésped procariotas recombinantes incluyen \beta-lactamasa (penicilinasa), el sistema promotor de lactosa (Chang y col., Nature 275:615, 1978; y Goeddel y col., Nature 281:554, 1979), el sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel y col., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; y EP-A-36776) y el promotor de tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 412, 1982). Un sistema de expresión de células huésped procariotas particularmente útil emplea un promotor del fago \lambdaP_{L} y una secuencia represora termolábil cI857ts. Los vectores plasmídicos disponibles en la American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor \lambdaP_{L} incluyen el plásmido pHUB2 (que reside en la cepa JMB9 de E. coli, ATCC 37092) y pPLc28 (que reside en RR1 de E. coli, ATCC 53082).

Sistemas de Levadura

Como alternativa, los polipéptidos pueden expresarse en células huésped de levadura, preferiblemente del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). También pueden emplearse otros géneros de levadura, tales como Pichia o Kluyveromyces. Los vectores de levadura a menudo contendrán un origen de secuencia de replicación de un plásmido de levadura 2 \mu; una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para la poliadenilación, secuencias para terminar la trascripción, y un gen marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas para vectores de levadura incluyen, entre otras, promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; y Holland y col., Biochem. 17:4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldeido-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para uso en la expresión de levaduras se describen adicionalmente en Hitzeman, EPA-73.657. Otra alternativa es el promotor ADH2 que se reprime por glucosa descrito por Russell y col. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beier y col. (Nature 300:724, 1982). Pueden construirse vectores lanzadera que se replican tanto en levaduras como en E. coli. insertando secuencias de ADN de pBR322 para la selección y replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen de replicación) en los vectores de levaduras descritos anteriormente.

La secuencia líder del factor-\alpha de levaduras puede emplearse para dirigir la secreción del polipéptido. La secuencia líder del factor-\alpha suele insertarse entre la secuencia promotora y la secuencia génica estructural. Véase, por ejemplo, Kurjan y col., Cell 30:933, 1982 y Bitter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 81:5330, 1984. Otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes de huéspedes de levadura son cocidas para el especialista en la técnica. Una secuencia líder puede modificarse cerca de su extremo 3' para que contenga uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder al gen estructural.

Los protocolos de transformación de levaduras son conocidos para los especialistas en la técnica. Uno de tales protocolos lo describe Hinnen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen y col. selecciona transformantes Trp^{+} en un medio selectivo, donde el medio selectivo consta de una base de nitrógeno de levaduras al 0,67%, ácidos casamino al 0,5% glucosa al 2%, 10 mg/ml de adenina y 20 mg/ml de uracilo.

Las células huésped de levaduras trasformadas por vectores que contienen una secuencia del promotor ADH2 pueden cultivarse para inducir la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico es uno que consiste en extracto de levadura al 1%, peptona al 2% y glucosa al 1% suplementado con 80 mg/ml de adenina y 80 mg/ml de uracilo. La depresión del promotor ADH2 se produce cuando la glucosa desaparece del medio.

Sistemas de Mamífero o Insecto

También pueden emplearse sistemas de cultivo de células huésped de mamífero o insecto para expresar polipéptidos ACPL recombinantes. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto de analizan por Luckow y Summers; Bio/Technology 6:47 (1988). También pueden emplearse líneas celulares establecidas de origen de mamífero. Los ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero apropiadas incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman y col., Cell 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, y líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), y la línea celular CV1/EBNA obtenida de la línea celular de riñón de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) como se describe por McMahan y col. (EMBO J. 10:2821, 1991).

Se han descrito procedimientos establecidos para introducir ADN en células de mamífero (Kaufman, RJ., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, págs. 15-69). Pueden usarse protocolos adicionales que usan reactivos disponibles en el mercado, tales como el reactivo de lípido lipofectamina (Gibco/BRL) o reactivo de lípido lipofectamina Plus, para transfectar células (Felgner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 84:7413-7417, 1987). Además, puede usarse electroporación para transfectar células de mamífero usando procedimientos convencionales, tales como los descritos en Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). La selección de transformantes estables puede realizarse usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, resistencia a fármacos citotóxicos. Kaufman y col., Meth. in Enzymology 185:487-511, 1990, describe varios esquemas de selección, tales como resistencia a dihidrofolato reductasa (DHFR). Una cepa huésped adecuada para selección de DHFR puede ser la cepa DX-B11 de CHO, que es deficiente en DHFR (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 77:4216-4220, 1980). Puede introducirse un plásmido que expresa el ADNc de DHFR en la cepa DX-B11, y sólo las células que contienen el plásmido pueden crecer en los medios selectivos apropiados. Otros ejemplos de marcadores de selección que pueden incorporarse en un vector de expresión incluyen ADNc que confieren resistencia a antibióticos, tales como G418 e higromicina B. Las células que contienen en vector pueden seleccionarse en función de la resistencia a estos compuestos.

Las secuencias de control de la trascripción y la traducción para vectores de expresión de células huésped de mamífero pueden escindirse de genomas virales. Las secuencias promotoras y las secuencias potenciadoras habitualmente usadas se obtienen de poliomavirus, adenovirus 2, virus de simio 40 (SV40), y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN obtenidas del genoma viral de SV40, por ejemplo, origen SV40, el promotor temprano y tardío, potenciador, sitios de corte y empalme, y sitios de poliadenilación de SV40 pueden usarse para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia génica estructural en una célula huésped de mamífero. Los promotores tempranos y tardíos virales son particularmente útiles porque son fáciles de obtener de un genoma viral en forma de un fragmento, que también puede contener un origen viral de replicación (Fiers y col., Nature 273:113, 1978; Kaufman, Meth in Enzimology, 1990). También pueden usarse fragmentos de SV40 más pequeños o más grandes, con la condición de que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hind III hasta el sitio Bgl I localizado en el origen viral de SV40 del sitio de replicación.

Las secuencias de control adicionales que demuestran mejorar la expresión de genes heterólogos a partir de vectores de expresión de mamífero incluyen elementos tales como el elemento de secuencia que aumenta la expresión (EASE) obtenido de células CHO (Morris y col., Animal Cell Technology, 1997, págs. 529-534 y solicitud PCT WO 97/25420) y el líder tripartito (TPL) y ARN del gen VA de adenovirus 2 (Gingeras y col., J. Biol. Chem. 257:13475-13491, 1982). Las secuencias internas de sitios de entrada de ribosomas (IRES) de origen viral permiten que ARNm dicistrónicos se traduzcan eficazmente (Oh y Sarnow, Current Opinion in Genetics and Development 3:295-300, 1993, Ramesh y col., Nucleic Acids Research 24:2697-2700, 1996). La expresión de un ADNc heterólogo como parte de un ARNm dicistrónico seguido del gen para un marcador de selección (por ejemplo, DHFR) ha demostrado mejorar la transfectabilidad del huésped y la expresión del ADNc heterólgo (Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990). Son vectores de expresión ilustrativos que emplean ARNm dicistrónicos pTR-DC/GFP descritos por Mosser y col., Biotechniques 22:150-161, 1997, y p2A5I descrito por Morris y col., Animal Cell Technology, 1997, págs. 529-534.

Mosley y col., Cell 59:335-348, 1989 ha descrito un vector de expresión altamente útil, pCAVNOT. Otros vectores de expresión para su uso en células huésped de mamífero pueden construirse como se describe por Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Un sistema útil para un alto nivel de expresión estable de ADNc de mamífero en células epiteliales mamarias murinas C127 puede construirse sustancialmente como se describe por Cosman y col. (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Un vector de alta expresión útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman y col., Nature 312:768, 1984, se ha depositado como ATCC 39890. Se describen vectores de expresión de mamíferos útil adicionales en el documento EP-A-0367566, y en el documento WO 91/18982, incorporados como referencia en este documento. En otra alternativa más. los vectores pueden obtenerse de retrovirus.

También pueden usarse los vectores de expresión útiles adicionales, pFLAG® y pDC311. La tecnología de FLAG® se centra en la fusión de un péptido marcador FLAG® hidrófilo de bajo peso molecular (1 kD), al extremo N-terminal de una proteína recombinante expresada por los vectores de expresión pFLAG®. pDCE311 es otro vector especializado usado para expresar proteínas en células CHO. pDC311 se caracteriza por una secuencia bicistrónica que contiene el gen de interés y un gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) con un sitio de unión a ribosomas interno para la traducción de DHFR, un elemento de secuencia que aumenta la expresión (EASE), el promotor de CMV humano, una secuencia líder tripartita, y un sitio de poliadenilación.

Con respecto a los péptidos señal que pueden emplearse, el péptido señal nativo puede reemplazarse por un péptido señal heterólogo o secuencia líder, si se desea. La elección del péptido señal o líder puede depender de factores tales como el tipo de células huésped en las que el polipéptido recombinante se va a producir. Para ilustrar, los ejemplos de péptidos señal heterólogos que son funcionales en células huésped de mamífero incluyen la secuencia señal para interleuquina-7 (IL-7) descrita en la Patente de Estados Unidos 4.965.195; la secuencia señal para el receptor de interleuquina-2 descrita en Cosman y col., Nature 312:768 (1984); el péptido señal del receptor de interleuquina 4 descrito en el documento EP 367.566; el péptido señal del receptor de interleuquina-1 de tipo I descrito en la Patente de Estados Unidos 4.968.607; y el péptido señal del receptor de interleuquina-1 tipo II descrito en el documento EP 460.846.

Aislamiento y purificación

La invención también incluye procedimientos para asilar y purificar polipéptidos ACPL y fragmentos de los mismos.

Los polipéptidos "asilados" o fragmentos de los mismos incluidos por esta invención son polipéptidos ACPL o fragmentos que no están en un medio idéntico al medio en el que puede o pueden encontrarse en la naturaleza. Los polipéptidos "purificados" o fragmentos de los mismos incluidos por esta invención están esencialmente libres de asociación con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo, en forma de un producto de purificación de sistemas de expresión recombinantes tales como los descritos anteriormente o en forma de un producto purificado de una fuente no recombinantes tal como células y/o tejidos de origen natural.

En una realización preferida, la purificación de péptidos recombinantes o fragmentos puede conseguirse usando fusiones de polipéptidos o fragmentos de la invención a otro polipéptido para ayudar en la purificación de polipéptidos o fragmentos de la invención. Tales moléculas de fusión pueden incluir los péptidos poli His u otros péptidos de identificación antigénicos descritos anteriormente así como los restos Fc descritos previamente.

Con respecto a cualquier tipo de células huésped, conocidas para el especialista en la técnica, los procedimientos para purificar un polipéptido recombinante o fragmento variarán de acuerdo con factores tales como el tipo de células huésped empleadas y si el polipéptido recombinante o fragmento se secreta o no en el medio de cultivo.

En general, el polipéptido ACPL recombinante o fragmento puede aislarse de las células huésped sino se secreta, o del medio o sobrenadante si es soluble y se secreta, seguido por una o más etapas de concentración, desplazamiento salino, intercambio iónico, interacción hidrófoba, purificación por afinidad o cromatografía por exclusión de tamaño. Como medios específicos para realizar estas etapas, el medio de cultivo primero puede concentrarse usando un filtro de concentración de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación tal como un medio de filtración en gel. Como alternativa, puede emplearse una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser de acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en purificación de proteínas. Como alternativa, puede emplearse una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Además, puede emplearse una etapa de cromatoenfoque. Como alternativa, puede emplearse una etapa de cromatografía por interacción hidróbofa. Las matrices adecuadas pueden ser restos fenilo u octilo unidos a resinas. Además, puede emplearse cromatografía de afinidad con una matriz que se une selectivamente a la proteína recombinante. Son ejemplos de tales resinas empleadas columnas de lectina, columnas de colorante y columnas quelantes de metales. Finalmente, pueden emplearse una o mas etapas de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa y (HPLC-FI) empleando medios de HPLC-FI hidrófogos (por ejemplo, gel de sílice o resina polimérica que tiene grupos metilo, octilo, octildecilo u otros grupos alifáticos colgantes) para purificar adicionalmente los polipéptidos. Alguna o todas de las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, son bien conocidas y pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante aislada y purificada.

También es posible utilizar una columna de afinidad que comprende una proteína de unión al polipéptido ACPL, tal como un anticuerpo monoclonal generado contra un polipéptido ACPL o fragmento del mismo, para purificar por afinidad polipéptidos expresados. Estos polipéptidos ACPL purificados pueden retirarse de una columna de afinidad usando técnicas convencionales, por ejemplo, en un tampón de elución de alto contenido salino y después pueden dializarse en un tampón de bajo contenido salino para su uso o cambiando el pH u otros componentes dependiendo de la matriz de afinidad utilizada, o pueden retirarse competitivamente usando el sustrato de origen natural del resto de afinidad, tal como un polipéptido obtenido de la invención.

En este aspecto de la invención, pueden unirse proteínas de unión al polipéptido ACPL, tales como los anticuerpos antipolipéptido de la invención u otras proteínas que pueden interactuar con el polipéptido ACPL, a un soporte en fase sólida tal como una matriz de cromatografía en columna o un sustrato similar adecuado para identificar, separar, o purificar células que expresan polipéptidos de la invención en su superficie. La adherencia de proteínas de unión al polipéptido ACPL a una superficie de contacto en fase sólida puede conseguirse por cualquier medio, por ejemplo, pueden recubrirse microesferas magnéticas con estas proteínas de unión a polipéptidos y pueden mantenerse en el recipiente de incubación a través de un campo magnético. Las suspensiones de mezclas celulares se ponen en contacto con la fase sólida que tiene tales proteínas de unión al polipéptido sobre ella. Las células que tienen polipéptidos ACPL en su superficie se unen a la proteína de unión a polipéptidos fijada y después las células que no se unen se retiran por lavado. Este procedimiento de unión por afinidad es útil para purificar, seleccionar, o separar tales células que expresan polipéptidos de la solución. Los procedimientos para liberar de manera positiva células seleccionadas de la fase sólida se conocen en la técnica y abarcan, por ejemplo, el uso de enzimas. Tales enzimas son preferiblemente no tóxicas y no perjudiciales para las células y se dirigen preferiblemente para que escindan la célula-molécula de unión de superficie.

Como alternativa, las mezclas de células que se sospecha que contienen células que expresan el polipéptido ACPL primero pueden incubarse con una proteína de unión al polipéptido ACPL biotinilada. Los períodos de incubación son típicamente de al menos una hora de duración para asegurar la unión suficiente a los polipéptidos de la invención. Después, la mezcla resultante se pasa a través de una columna rellenada con perlas recubiertas de avidina, por lo que la alta afinidad de la biotina por la avidina proporciona la unión de las células de unión a polipéptidos a las perlas. El uso de perlas recubiertas con avidina es conocido en la técnica. Véase, Berenson, y col., J. Cell. Biochem., 10D:239 (1986). El lavado del material no unido y la liberación de las células unidas se realiza usando procedimientos convencionales.

El grado deseado de pureza depende del uso pretendido de la proteína. Se desea un grado relativamente alto de pureza cuando el polipéptido se va a administrar in vivo, por ejemplo. En tal caso, los polipéptidos se purifican de modo que no se detectan bandas proteicas que corresponden a otras proteínas después del análisis por electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE). Se reconocerá por parte de un especialista en la técnica pertinente que pueden visualizarse múltiples bandas que corresponden al polipéptido por SDS-PAGE, debido a la glicosilación diferencial, procesamiento pos-traduccional diferencial, y similares. Más preferiblemente, el polipéptido de la invención se purifica a homogeneidad sustancial, como se indica por una banda proteica única después del análisis por SDS-PAGE. La banda proteica puede visualizarse por tinción con plata, tinción con azul de coomassie, o (si la proteína está radiomarcada) por auto-radiografía.

Ensayos

Los polipéptidos purificados de la invención (incluyendo proteínas, polipéptidos, fragmentos, variantes, oligómeros y otras formas) pueden ensayarse con respecto a su capacidad de unirse en cualquier ensayo adecuado, tal como un ensayo de unión convencional. Como ilustración, el polipéptido puede marcarse con un reactivo detectable (por ejemplo, un radionúclido, cromóforo, enzima que cataliza una reacción colorimétrica o fluorométrica, y similares). El polipéptido marcado se pone en contacto con células que expresan un proteína de unión a ACPL, por ejemplo un anticuerpo anti-ACPL. Después, las células se lavan para retirar el polipéptido marcado no unido y la presencia del marcador unido a la célula se determina por una técnica apropiada, elegida de acuerdo con la naturaleza del marcador.

Un ejemplo de un procedimiento de ensayo de unión es el siguiente. Se construye un vector de expresión recombinante que contiene un ADNc de proteína de unión a ACPL. Las células CV1-EBNA-1 en placas de 10 cm^{2} se transfectan con el vector de expresión recombinante. Las células CV-1/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) expresan constitutivamente el antígeno nuclear 1 EBV dirigido desde el potenciador/promotor intermedio-temprano de CMV. CV1-EBNA-1 se obtiene de la línea celular de riñón de mono verde africano CV-1 (ATCC CCL 70) como se describe por McMahan y col. (EMBO J. 10:2821, 1991).

Las células transfectadas se cultivan durante 24 horas, y después las células de cada placa se dividen en una placa de 24 pocillos. Después de cultivar durante 48 horas más, las células transfectadas (aproximadamente 4 x 10^{4} células/pocillo) se lavan con BM-NFDM, que es medio de unión (RPMI 1640 que contiene 25 mg/ml de albúmina de suero bovino, 2 mg/ml de acida sódica, Hepes 20 mM, pH 7,2) al que se han añadido 50 mg/ml de leche deshidratada desnatada. Después las células se incuban durante 1 hora a 37ºC con diversas concentraciones de, por ejemplo, una proteína de fusión polipéptido/FC soluble producida como se ha indicado anteriormente. Después las células se lavan y se incuban con una concentración de saturación constante de una ^{125}I-IgG de ratón antihumana en medio de unión, con agitación suave durante 1 hora a 37ºC. Después de un lavado exhaustivo, las células se liberan mediante tripsinización.

La IgG de ratón antihumana empleada anterior se dirige contra la región Fc de IgG humana y puede obtenerse de Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA. El anticuerpo se radioyodina usando el procedimiento de cloramina-T convencional. El anticuerpo se unirá a la porción Fc de cualquier proteína polipéptido/Fc que se ha unido a las células. En todos los ensayos, se ensaya la unión no específica de ^{125}I-anticuerpo en ausencia de la proteína de fusión Fc/Fc, así como en presencia de la proteína de fusión Fc y un exceso molar de 200 veces de anticuerpo IgG de ratón antihumana no marcado.

El ^{125}I-anticuerpo unido a células se cuantifica en un contador Packard Autogamma. Los cálculos de afinidad (Scatchard, Ann. N.Y. Acad, Sci. 51:660, 1949) se generan en RS/1 (BBN Software, Boston, MA) realizado en un ordenador Microvax.

Otro tipo de ensayo de unión adecuado es un ensayo de unión competitivo. Como ilustración, puede determinarse la actividad biológica de una variante de ACPL ensayando la capacidad de la variante de competir con la proteína nativa para unirse a una proteína de unión a ACPL.

Pueden realizarse ensayos de unión competitiva por metodología convencional. Los reactivos que pueden emplearse en ensayos de unión competitivos incluyen ACPL radiomarcado y células intactas que expresan una proteína de unión a ACPL (endógena o recombinante) en la superficie celular. Por ejemplo, pueden usarse un fragmento de ACPL soluble radiomarcado para que competir con una variante de ACPL soluble para la unión a la proteína de unión a ACPL de superficie celular. En lugar de células intactas, se puede sustituir una proteína de fusión de proteína de unión a ACPL soluble/Fc unida a una fase sólida a través de la interacción de la proteína A o proteína G (en la fase sólida) con el resto Fc. Las columnas de cromatografía que contienen la proteína A y la proteína G incluyen las disponibles en Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ.

Otro tipo de ensayo de unión competitiva utiliza proteínas de unión a ACPL solubles radiomarcadas, tales como una proteína de fusión de proteína de unión a ACPL/Fc, y células intactas que expresan ACPL. Pueden obtenerse resultados cualitativos mediante ensayos de unión competitiva en placas auto-radiográficas, aunque pueden utilizarse representaciones gráficas de Scatchard (Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51:660, 1949) para generar resultados cuantitativos.

Uso de ácido nucleico u oligonucleótidos de ACPL

Además de usarse para expresar polipéptidos como se ha descrito anteriormente, los ácidos nucleicos de la invención, incluyendo ADN, y oligonucleótidos de los mismos, pueden usarse:

-: para identificar el cromosoma humano número 2q

-: para mapear genes en el cromosoma humano número 2q

-: para identificar genes asociados con ciertas enfermedades, síndromes, u otras afecciones asociadas con el cromosoma humano número 2q;

-: como oligonucleótidos monocatenarios con sentido o antisentido, para inhibir la expresión de un polipéptido codificado por el gen de ACPL;

-: para ayudar a detectar genes defectuosos en un individuo;

-: para terapia génica.

Sondas

Entre los usos de los ácidos nucleicos de la invención está el uso de fragmentos como sondas o cebadores. Tales fragmentos generalmente comprenden al menos aproximadamente 17 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. En otras realizaciones, un fragmento de ADN comprende al menos 30, o al menos 60, nucleótidos contiguos de una secuenciad de ADN.

Como en este documento se contemplan homólogos de la SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 3 y SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 6 de otras especies de mamíferos, las sondas basadas en la secuencia de ADN de la SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4 y SEC ID Nº 6 pueden usarse para seleccionar bibliotecas de ADNc obtenidas de otras especies de mamíferos, usando técnicas de hibridación de especies cruzadas convencionales.

Usando el conocimiento del código genético en combinación con las secuencias de aminoácidos expuestas anteriormente, pueden prepararse una serie de oligonucleótidos degenerados. Tales oligonucleótidos son útiles como cebadores, por ejemplo, en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), por lo cual se aíslan y se amplifican fragmentos de ADN.

Mapeo de Cromosomas

Los especialistas en la técnica pueden usarse todos o porciones de los ácidos nucleicos de la SEC ID Nº 1, SEC ID Nº 3, y SEC ID Nº 6, incluyendo oligonucleótidos, usando técnicas bien conocidas para identificar el 2q humano, y el locus específico del mismo, que contiene el ADN de los miembros de la familia IL-1R, incluyendo receptores I y II de IL-1, ST2 e IL-1Rrp1. Las técnicas útiles incluyen, pero sin limitación, usar la secuencia o porciones, incluyendo oligonucleótidos, como sonda en diversas técnicas bien conocidas tales como mapeo de híbridos por radiación (alta resolución), hibridación in situ en tramos cromosómicos (resolución moderada), e hibridación por transferencia de Southern para hibridar líneas celulares que contienen cromosomas humanos individuales (baja resolución).

Por ejemplo, los cromosomas pueden mapearse por hibridación por radiación. Primero, se realiza una PCR usando el panel de 93 híbridos de radiación Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research Genebridge4 (http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human STS releases/july97/rhmap/genebridge4.html). Se usan cebadores que se sitúan en un supuesto exón del gen de interés y que amplifican un producto de ADN genómico humano, pero no amplifican ADN genómico de hámster. Los resultados de las PCR se convierten en datos vectoriales que se someten al sitio de mapeo por radiación Whitehead/MIT en Internet (http://www-seq.wi.mit.edu). Se registran los datos y se proporciona la asignación y colocación cromosómica con relación a los marcadores de sitios de secuencia marcada (STS) conocidos en el mapa de hibridación por radiación. La siguiente página web proporciona información adicional acerca del mapeo por hibridación por radiación: (http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human STS releases/july97/07-97.INTRO.html)

Identificación de Enfermedades Asociadas

Como se muestra más adelante, el ADN de la SEC ID Nº 6 se ha mapeado en el cromosoma 2q. Esa región está asociada con enfermedades específicas que incluyen, pero sin limitación, las identificadas en la tabla 1, anterior. De esta forma, los ácidos nucleicos de la SEC ID Nº 6 o un fragmento de los mismos pueden usarse por parte de un especialista en la técnica usando técnicas bien conocidas para analizar anormalidades asociadas con genes que mapean en el cromosoma 2q. Esto permite distinguir afecciones en las que este marcador está reordenado o delecionado. Además, los nucleótidos de la SEC ID Nº 6 o un fragmento de los mismos pueden usarse como marcador de posición para mapear otros genes de localización desconocida.

El ADN puede usarse en el desarrollo de tratamientos para cualquier trastorno mediado (directamente o indirectamente) por cantidades deficientes, o insuficientes de, los genes que corresponden a los ácidos nucleicos de la invención. La descripción de este documento de secuencias de nucleótidos nativas permite la detección de genes deficientes, y el reemplazamiento de los mismos con genes normales. Los genes deficientes pueden detectarse en ensayos de diagnóstico in vitro, y por comparación de una secuencia de nucleótidos nativa descrita en este documento con la de un gen obtenido de una persona que se sospecha que tiene un defecto en este gen.

Sentido-Antisentido

Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos incluyen oligonucleótidos antisentido o con sentido que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos monocatenaria (de ARN o ADN) capaz de unirse a secuencias de ARNm (con sentido) o ADN (antisentido) diana. Los oligonucleótidos antisentido o con sentido, de acuerdo con la presente invención, comprenden un fragmento del ADN de la SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 6. Tal fragmento generalmente comprende al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad para obtener un oligonucleótido antisentido o con sentido, en función de la secuencia de ADNc que codifica una proteína dada se describe en, por ejemplo, Stein y Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988) y van der Krol y col. (BioTechniques 6:958, 1988).

La unión de oligonucleótidos antisentido o con sentido a secuencias de ácidos nucleicos diana da como resultado la formación de dúplex que bloquean o inhiben la expresión proteica mediante uno de varios medios, incluyendo la degradación potenciada del ARNm por la RNAsaH, inhibición de corte y empalme, terminación prematura de la transcripción o traducción, y por otros medios. De esta forma, los oligonucleótidos antisentido pueden usarse para bloquear la expresión de proteínas. Los oligonucleótidos antisentido o con sentido comprenden además oligonucleótidos que tienen estructuras de azúcar-fosfodiéster modificadas (u otros enlaces de azúcar, tales como los descritos en el documento WO 91/06629) y donde tales enlaces de azúcares son resistentes a nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, pueden resistir la degradación enzimática) pero mantienen la especificidad de secuencia para poder unirse a secuencias de nucleótidos diana.

Otros ejemplos de oligonucleótidos con sentido o antisentido incluyen los oligonucleótidos que están unidos de manera covalente a restos orgánicos, tales como los descritos en el documento WO 90/10448, y otros restos que aumentan la afinidad del oligonucleótido por una secuencia de ácidos nucleicos diana, tal como poli-(L-lisina). Además, pueden unirse agentes intercalantes, tales como elipticina, y agentes de alquilación o complejos metálicos a los oligonucleótidos con sentido o antisentido para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido antisentido o con sentido por la secuencia de nucleótidos diana.

Los oligonucleótidos antisentido o con sentido pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos diana por cualquier procedimiento de transferencia de genes, incluyendo, por ejemplo, lipofección, transfección de ADN mediada por CaPO_{4}, electroporación, o usando vectores de transferencia génica tal como el virus de Epstein-Barr.

Los oligonucleótidos con sentido o antisentido también pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos diana mediante la formación de un conjugado con una molécula de unión al ligando, como se describe en el documento WO 91/04753. Las moléculas de unión al ligando adecuadas incluyen, pero sin limitación, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se unen a receptores de superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula de unión al ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión al ligando para unirse a su molécula o receptor correspondiente, o para bloquear la entrada del oligonucleótido con sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula.

Como alternativa, un oligonucleótido con sentido o antisentido puede introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácidos nucleicos diana mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, como se describe en el documento WO 90/10448. El complejo oligonucleótido con sentido o anti-sentido-lípido se disocia preferiblemente en la célula por una lipasa endógena.

Uso de polipéptidos ACPL y polipéptidos fragmentados

Los usos incluyen, pero sin limitación, los siguientes:

-: Purificar proteínas y medir la actividad de los mismos

-: Suministrar agentes

-: Reactivos terapéuticos y de investigación

-: Marcadores de peso molecular y enfoque isoeléctrico

-: Controles para la fragmentación peptídica

-: Identificación de proteínas desconocidas

-: Preparación de anticuerpo

Reactivos de Purificación

Los polipéptidos de la invención encuentran uso como reactivo de purificación de proteínas. Por ejemplo, los polipéptidos ACPL pueden unirse a un material de soporte sólido y pueden usarse para purificar proteínas de unión a ACPL por cromatografía de afinidad. En realizaciones particulares, un polipéptido (en cualquier forma descria en este documento que sea capaz de unirse a una proteína de unión a ACPL) se une a un soporte sólido por procedimientos convencionales. Como ejemplo, están disponibles columnas de cromatografía que contienen grupos funcionales que reaccionarán con grupos funcionales en las cadenas laterales de los aminoácidos de proteínas (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). En un alternativa, se une una proteína polipéptido/Fc (como se ha analizado anteriormente) a una columna de cromatografía que contiene la proteína A o la proteína G a través de la interacción con el resto Fc.

El polipéptido también encuentra uso en la purificación o identificación de células que expresan una proteína de unión a ACPL en la superficie celular. Los polipéptidos se unen a una fase sólida tal como una matriz de cromatografía en columna o un sustrato apropiado similar. Por ejemplo, pueden recubrirse microesferas magnéticas con los polipéptidos y mantenerse en un recipiente de incubación a través de un campo magnético. Las suspensiones de mezclas celulares que contienen células que expresan proteínas de unión a ACPL se ponen en contacto con la fase sólida que tienen los polipéptidos en las misma. Las células que expresan proteínas de unión a ACPL en la superficie celular se unen a los polipéptidos fijados, y después, las células no unidas se retiran por lavado.

Como alternativa, los polipéptidos pueden conjugarse para dar un resto detectable, después pueden incubarse con células a ensayar para la expresión de proteínas de unión. Después de la incubación, se retira la materia marcada no unida y se determina la presencia o ausencia del resto detectable en las células.

En una alternativa adicional, las mezclas de células que se sospecha que contienen proteínas de unión a ACPL se incuban con polipéptidos biotinilados. Los períodos de incubación son típicamente de al menos una hora de duración para asegurar una unión suficiente. Después, la mezcla resultante se pasa a través de una columna rellena con perlas recubiertas con avidina, por lo cual la alta afinidad de la biotina por la avidina proporciona la unión de las células deseadas a las perlas. Los procedimientos para usar perlas recubiertas con avidina son conocidos (véase Berenson, y col. J. Cell. Biochem., 10D:239, 1986). El lavado para retirar el material no unido, y la liberación de las células unidas, se realizan usando procedimientos convencionales.

Medición de la Actividad

Los polipéptidos también encuentran uso en la medición de la actividad biológica de proteínas de unión a ACPL en términos de su afinidad de unión. De esta forma, los polipéptidos pueden emplearse por aquellos que realizan estudios "de garantía de calidad", por ejemplo, para controlar el tiempo durabilidad y estabilidad de una proteína en diferentes condiciones. Por ejemplo, los polipéptidos pueden emplearse en un estudio de afinidad de unión para medir la actividad biológica de una proteína de unión a ACPL que se ha almacenado a diferentes temperaturas, o producido en diferentes tipos celulares. Las proteínas también pueden usarse para determinar si se mantiene la actividad biológica después de la modificación de una proteína de unión a ACPL (por ejemplo, modificación química, truncamiento, mutación, etc.). La afinidad de unión de la proteína de unión a ACPL modificada se compara con la de una proteína de unión ACPL no modificada para detectar cualquier impacto adverso de las modificaciones en la actividad biológica de la proteína de unión a ACPL. De esta forma, la actividad biológica de una proteína de unión a ACPL puede determinarse, por ejemplo, antes de que se use en un estudio de investigación.

Agentes de Suministro

Los polipéptidos también encuentran uso como vehículos para suministrar agentes unidos a los mismos a células que llevan las proteínas de unión a ACPL. De esta forma, los polipéptidos pueden usarse suministrar agentes de diagnóstico o terapéuticos a tales células (o a otros tipos celulares que expresan la proteína de unión a ACPL en la superficie celular) en procedimientos in vitro o in vivo.

Loa agentes detectables (de diagnóstico) terapéuticos que pueden unirse a un polipéptido incluyen, pero sin limitación, toxinas, otros agentes citotóxicos, fármacos, radionúclidos, cromóforos, enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o fluorométrica, y similares, eligiéndose el agente particular de acuerdo con la aplicación pretendida. Entre las toxinas están ricina, abrina, toxina de la difteria, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, proteínas de inactivación ribosómica, micotoxinas tales como tricotecenos, y derivados y fragmentos (por ejemplo, monocatenarios) de los mismos. Los radionúclidos adecuados para uso diagnóstico incluyen, pero sin limitación, ^{123}I, ^{131}I, ^{99m}Tc, ^{111}In, y ^{76}Br. Son ejemplos de radionúclidos adecuados para uso terapéutico ^{131}I, ^{211}At, ^{77}Br, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{212}Pb, ^{212}Bi, ^{109}Pd, ^{64}Cu, y ^{67}Cu.

Tales agentes pueden unirse al polipéptido mediante cualquier procedimiento convencional adecuado. El polipéptido comprende grupos funcionales en las cadenas laterales de los aminoácidos que pueden hacerse reaccionar con grupos funcionales en un agente deseado para formar, por ejemplo, enlaces covalentes. Como alternativa, la proteína o agente puede derivatizarse para generar o unir un grupo funcional reactivo deseado. La derivatización puede implicar la unión de uno de los reactivos de acoplamiento bifuncionales disponible para unir diversas moléculas a proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Se conocen varias técnicas para el radiomarcaje de proteínas. Los metales radionúclidos pueden unirse a polipéptidos usando, por ejemplo, un agente quelante bifuncional adecuado.

Los conjugados que comprenden polipéptidos y un agente de diagnóstico o terapéutico adecuado (preferiblemente unido covalentemente) se preparan de este modo. Los conjugados se administran o emplean de otro modo en una cantidad apropiada para la aplicación particular.

Agentes Terapéuticos

Los polipéptidos de la invención pueden usarse en el desarrollo de tratamientos para cualquier trastorno mediado (directamente o indirectamente) por cantidades deficientes, excesivas o insuficentes de ACPL o cualquier molécula de unión, incluyendo polipéptidos IL. Los polipéptidos ACPL aislados y purificados o un fragmento de los mismos también pueden ser útiles por sí mismos como agente terapéutico en la inhibición de la señalización de IL-1 y TNF. Tales usos terapéuticos de ACPL pueden implicar su administración por la introducción del polipéptido ACPL o fragmento en el medio intracelular por medios bien conocidos. Uno de tales medios es encerrar la proteína en liposomas o acoplarla a un anticuerpo monoclonal dirigido contra un tipo celular específico.

Los polipéptidos también pueden emplearse para inhibir una actividad biológica de una proteína de unión a ACPL, en procedimientos in vitro o in vivo. Por ejemplo, un polipéptido purificado ACPL o fragmento soluble del mismo puede usarse para inhibir la unión de una proteína de unión a ACPL a la molécula de unión a ACPL de superficie celular endógeno. De esta forma se inhiben los efectos biológicos que resultan de la unión de la molécula de unión a receptores endógenos.

Además, los polipéptidos ACPL pueden administrarse a un mamífero para tratar un trastorno mediado por una molécula de unión a ACPL. Tales trastornos mediados por moléculas de unión incluyen afecciones provocadas (directamente o indirectamente) o exacerbadas por la molécula de unión.

Las composiciones de la presente invención pueden contener un polipéptido en cualquier forma descrita en este documento, tal como proteínas nativas, variantes, derivados, oligómeros, y fragmentos biológicamente activos. En realizaciones particulares, la composición comprende un polipéptido soluble o un oligómero que comprende polipéptidos de ACPL solubles, por ejemplo, el dominio extracelular de ACPL o fragmentos biológicamente activos del mismo que se unen a la molécula de unión.

En este documento se proporcionan composiciones que comprenden una cantidad eficaz de un polipéptido ACPL o fragmento del mismo de la presente invención, en combinación con otros componentes tales como un diluyente, vehículo, o excipiente fisiológicamente aceptable. Los polipéptidos pueden formularse de acuerdo con procedimientos conocidos usados para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Pueden combinarse en mezcla, como el único material activo o con otros materiales activos conocidos adecuados para una indicación dada, con diluyentes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, solución salina, Tris-HCL, acetato, y soluciones tamponadas con fosfato), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), emulsionantes, solubilizantes, adyuvantes y/o vehículos. Las formulaciones apropiadas para composiciones farmacéuticas incluyen las descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª ed. 1980, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Además, dichas composiciones pueden complejarse con polietilenglicol (PEG), iones metálicos, o pueden incorporarse en compuestos poliméricos tales como ácidos poliácetico, ácidos poliglicólico, hidrogeles, dextrano, etc o pueden incorporarse en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, fantasmas de eritrocitos o esferoblastos. Tales composiciones influirán en el estado físico, la solubilidad, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo, y en la velocidad de aclarado in vivo, y por tanto se eligen de acuerdo con la aplicación pretendida.

Las composiciones de la invención pueden administrarse de cualquier modo adecuado, por ejemplo por vía tópica, parenteral o por inhalación. El término "parenteral" incluye inyección, por ejemplo, por vías subcutánea, intravenosa, intracelular o intramuscular, incluyendo también administración localizada, por ejemplo, a un sitio de la enfermedad o lesión. La liberación sostenida de implantes también se contempla. Un especialista en la técnica pertinente reconocerá que las dosificaciones adecuadas variarán dependiendo de factores tales como la naturaleza del trastorno a tratar, el peso corporal, la edad y estado general del paciente, y la vía de administración. Las dosis preliminares pueden determinarse de acuerdo con ensayos animales, y la escala de las dosificaciones para administración humana se realiza de acuerdo con prácticas aceptadas en la técnica.

También se contemplan composiciones que comprenden ácidos nucleicos en formulaciones fisiológicamente aceptables. El ADN puede formularse, por ejemplo, para inyección.

Agentes de Investigación

Otro uso del polipéptido de la presente invención es una herramienta de investigación para estudiar los efectos biológicos que resultan de la inhibición de las interacciones de la molécula de unión a ACPL/ACPL en diferentes tipos celulares. Los polipéptidos también pueden emplearse en ensayos in vitro para detectar la molécula de unión a ACPL o ACPL o las interacciones de los mismos.

Los polipéptidos ACPL, y anticuerpos contra polipéptidos ACPL pueden usarse como reactivos en diversos protocolos de investigación. Una muestra de tales protocolos de investigación de da en Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989). Por ejemplo, estos reactivos pueden servir como marcadores para la expresión específica de células o específica de tejidos de ARN o proteínas. De manera similar, estos reactivos pueden usarse para investigar la expresión constitutiva o transitoria de ARN de ACPL o polipéptidos. El ADN de ACPL puede usarse para determinar la localización cromosómica del ADN de ACPL o para mapear genes con respecto a esta locación cromosómica. El ADN de ACPL también puede usarse para examinar la heterogeneidad y herencia genética a través del uso de técnicas tales como huellas digitales genéticas así como para identificar riesgos asociados con trastornos genéticos. El ADN de ACPL puede usarse además para identificar genes adicionales relacionados con el ADN de ACPL y para establecer árboles evolutivos basados en la comparación de secuencias. El ADN de ACPL y polipéptidos pueden usarse para seleccionar los genes o proteínas que son homólogos al ADN de ACPL o polipéptidos, a través de procedimientos de selección positiva tales como transferencia de Southern o inmunotransferencia y través de procedimientos de selección negativa como sustracción.

Los polipéptidos ACPL también pueden usarse como reactivo para identificar (a) cualquier proteína que regule el polipéptido ACPL, y (b) otras proteínas con las que puede interaccionar. Los polipéptidos ACPL podrían usarse acoplando la proteína recombinante a una matriz de afinidad, o usándolos como cebo en el sistema doble híbrido. Los polipéptidos ACPL y fragmentos de los mismos pueden usarse como reactivos en el estudio de vías de señalización usadas por receptores de la familia de IL-1R y para bloquear la señalización por IL-18 y posiblemente otros ligandos de la familia IL-1.

Otra realización de la invención se refiere a usos de ACPL para estudiar la transducción de señales celulares. Los polipéptidos ACPL juegan un papel en respuestas inmunes que incluyen transducción de señales celulares. De esta forma, las alteraciones en la expresión y/o activación de ACPL pueden tener efectos profundos en una plétora de procedimientos celulares. La expresión de ACPL clonado, mutantes funcionalmente inactivos de ACPL pueden usarse para identificar el papel que juega una proteína particular en la medición de los eventos de señalización específicos.

La señalización celular suele implicar una cascada de activación molecular, durante la que un receptor propaga una señal mediada por ligando-receptor activando específicamente quinasas intracelulares que fosforilan sustratos diana. Estos sustratos pueden ser por sí mismos quinasas que llegan a activarse después de la fosforilación. Como alternativa, pueden ser moléculas adaptadoras que facilitan la señalización cadena abajo a través de la interacción proteína-proteína después de fosforilación. Independientemente de la naturaleza de la molécula o moléculas sustrato, pueden usarse versiones funcionalmente activas expresadas de ACPL en ensayos tales como el ensayo doble híbrido de levaduras para identificar qué sustrato o sustratos se reconocieron y se activaron por las moléculas de unión a ACPL. De esta forma, estos nuevos ACPL pueden usarse como reactivos para identificar nuevas moléculas implicadas en las vías de transducción de señales.

Además, los polipéptidos ACPL y fragmentos de los mismos pueden usarse como reactivos en el estudio de la vía de señalización de IL-18 como reactivo para bloquear la señalización de IL-18. El descubrimiento de que el polipéptido ACPL juega un papel en la señalización de NFkB permite el uso de polipéptidos ACPL en estudios de señalización por NFkB, particularmente con respecto a la inducción de señalización de NFkB por IL-18. El descubrimiento del polipéptido ACPL y su papel en la señalización por NFkB permite adicionalmente su uso como reactivo en protocolos de investigación para dilucidar el papel de IL-1Rrp1 e IL-18 en señalización celular.

IL-18 induce muchas respuestas de señalización adicionales. Entre tales respuestas de señalización está la inducción de la familia de quinasas MAP, quinasas JNK y p38. De esta forma, los polipéptidos ACPL y fragmentos de los mismos pueden usarse como reactivos en el estudio de respuestas de señalización inducidas por IL-18 de la familia de quinasas MAP, quinasas JNK y p38.

El descubrimiento de que el polipéptido ACPL estimula la producción de una proteínas específica en respuesta a IL-18 permite la generación de sistemas de expresión de proteínas inducibles. En una realización, el gen que codifica la proteína de interés puede colocarse en un vector que contiene 3 sitios de NFkB que median la expresión de la proteína. El especialista reconoce que pueden usarse muchos vectores diferentes para conseguir la expresión unida a la expresión de NFkB, dependiendo del tipo celular deseado para la expresión. A modo de ejemplo, pueden transfectarse 10^{7} células S49.1 por electroporación en 0,7 ml con 40 \mug de un vector de expresión unido a NFkB y 20 \mug de vectores de expresión que codifican el polipéptido ACPL murino e IL-1Rrp1 murino a 969 \muF y 320V. Las células pueden incubarse durante 2 días y después pueden estimularse con 40 ng/ml de IL-18 murino (PeproTech). La adición de IL-18 puede inducir la expresión del gen unido a NFkB 300 veces. Se entiende que pueden usarse muchos enfoques diferentes para conseguir la inducción de la expresión proteica usando el polipéptido ACPL y la estimulación con IL-18, y que esta realización no limita de forma alguna el alcance de la invención.

Debido a la producción regulada de la proteína unida a NFkB, el nivel de esta proteína en estas células puede modularse de acuerdo con la estimulación con IL-18. El uso de un gen marcador, tal como luciferasa, permite aclarar los inhibidores y reguladores de señalización de NFkB estimulada por IL-18. Adicionalmente, el control del nivel y tiempo de la expresión proteica permite a un especialista en la técnica examinar los efectos temporales y cumulativos de la proteína de interés. Los anticuerpos contra polipéptidos ACPL pueden usarse adicionalmente para inhibir señalización de NFkB estimulada por IL-18 en estos experimentos, permitiendo un análisis mas detallado de las etapas implicadas en la señalización de NFkB.

Los polipéptidos ACPL purificados de acuerdo con la invención facilitarán el descubrimiento de inhibidores de polipéptidos ACPL. El uso de un polipéptido ACPL purificado en la selección de inhibidores potenciales del mismo es importante y puede eliminar o reducir la posibilidad de reacciones de interferencia con contaminantes.

Además, los polipéptidos ACPL pueden usarse para el diseño basado en la estructura de inhibidores del polipéptido ACPL. Dicho diseño basado en la estructura también se conoce como "diseño de fármaco racional". Los polipéptidos ACPL pueden analizarse de forma tridimensional por, por ejemplo cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear o modelado por homología, todos los cuales son procedimientos bien conocidos. La invención también abarca el uso de la información estructural del polipéptido ACPL en sistemas de software de modelado molecular para ayudar en el diseño de inhibidores y en la interacción inhibidor-polipéptido ACPL. Tal modelado asistido por ordenador y diseño de fármaco puede utilizar información tal como análisis conformacional químico, potencial electrostático de las moléculas, plegamiento proteico, etc. Por ejemplo, la mayoría del diseño de inhibidores específicos de clase de metaloproteinasas se ha centrado en intentos para quelar o unir el átomo de cinc catalítico. Los inhibidores sintéticos habitualmente se diseñan para que contengan un resto cargado negativamente al que se le une una serie de otros grupos diseñados para ajustar las cavidades de especificidad de la proteasa particular. Un procedimiento particular de la invención comprende analizar la estructura tridimensional de polipéptidos ACPL con respecto a posibles sitios de unión de sustratos, sintetizar una nueva molécula que incorpora un sitio reactivo predictivo, y ensayar la nueva molécula como se ha descrito anteriormente.

Marcadores de Peso Molecular y Punto Isoeléctrico

La presente invención incluye además procedimientos que utilizan polipéptidos ACPL como marcadores de peso molecular para estimar el peso molecular aparente de una proteína de muestra por electroforesis en gel. Un marcador de peso molecular del polipéptido ACPL de ratón aislado y purificado de acuerdo con la invención tiene un peso molecular de aproximadamente 70.040 Daltons en ausencia de glicosilación. El polipéptido ACPL, junto con la proteína de muestra, puede resolverse por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante por medios convencionales (U. K. Laemmli, Nature 227:680-685, 1970) en dos calles separadas de un gel que contiene dodecil sulfato sódico y una concentración de acrilamida entre el 6-20%. Las proteínas en el gel pueden visualizarse usando un procedimiento de tinción convencional. El marcador de peso molecular del polipéptido ACPL puede usarse como marcador de peso molecular en la estimación del peso molecular aparente de la proteína de muestra. Una única secuencia de aminoácidos de ACPL de ratón (SEC ID Nº 2) especifica un peso molecular de aproximadamente 70.048 Daltons. Por lo tanto, el marcador de peso molecular del polipéptido ACPL sirve particularmente bien como marcador de peso molecular para la estimación del peso molecular aparente de proteínas de muestra que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 70.048 Daltons. El uso de este marcador de peso molecular polipeptídico permite una mayor precisión en la determinación del peso molecular aparente de proteínas que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 70.048 Daltons. De manera similar, el polipéptido ACPL humano (SEC ID Nº 7) puede usarse como marcador de peso molecular para la estimulación del peso molecular aparente de proteínas de muestra. Se entiende, por supuesto, que pueden usarse muchas técnicas diferentes para determinar el peso molecular de una proteína de muestra usando polipéptidos ACPL y que esta realización no limita de forma alguna el alcance de la invención.

Otra realización preferida de la invención es el uso de marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL, generado por fragmentación química del polipéptido ACPL, como marcadores de peso molecular para estimar el peso molecular aparente de una proteína de muestra por electroforesis en gel. El polipéptido ACPL aislado y purificado puede tratarse con bromuro de cianógeno en condiciones convencionales que dan como resultado la fragmentación del marcador de peso molecular del polipéptido ACPL por hidrólisis específica en el extremo carboxilo de restos de meteonina en el polipéptido ACPL (E. Gross, Methods in Enz. 11:238-255, 1967). Debido a la secuencia de aminoácidos única del polipéptido ACPL, la fragmentación de los marcadores de peso molecular del polipéptido ACPL con bromuro de cianógeno genera un conjunto único de marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL. Por ejemplo, los polipéptidos ACPL humanos y de ratón generarán cada uno una serie única de marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL. Los tamaños de estos marcadores de peso molecular pueden predecirse usando programas informáticos disponibles. La distribución de los restos de meteonina determina el número de aminoácidos en cada péptido y la composición de aminoácidos única de cada péptido determina su peso molecular.

El conjunto único de marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL generado por el tratamiento del polipéptido ACPL de ratón con bromuro de cianógeno comprende 10 péptidos fragmentados de al menos 10 aminoácidos de tamaño. El péptido codificado por los aminoácidos 2-87 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 9.724 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 88-105 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 2.020 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 111-136 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 3.094 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 137-188 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 5.502 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 189-207 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 2.354 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 208-299 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 10.617 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 300-369 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 8.293 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 307-558 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 21.559 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 568-593 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 2.963 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 594-614 de la SEC ID Nº 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 2.342 Daltons.

Por lo tanto, la escisión del polipéptido ACPL de ratón por tratamiento químico con bromuro de cianógeno genera un conjunto único de marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL. La secuencia de aminoácidos única y conocida de estos péptidos fragmentados de ACPL permite la determinación del peso molecular de estos marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados. En este caso particular, los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL tienen pesos moleculares de aproximadamente 9.724; 2.020; 3.094; 5.502; 2.354; 10.617; 8.293; 21.559; 2.963; y 2.343 Daltons.

Los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL, junto con una proteína de muestra, puede resolverse por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante por medios convencionales en dos calles separadas de un gel que contiene dodecilsulfato sódico y una concentración de acrilamida entre el 10-20%. Las proteínas en el gel pueden visualizarse usando un procedimiento de tinción convencional. Los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL pueden usarse como marcadores de peso molecular en estimación del peso molecular aparente de la proteína de muestra. La secuencia de aminoácidos única de ACPL de ratón específica un peso molecular de aproximadamente 9.724; 2.020; 3.094; 5.502; 2.354; 10.617; 8.293; 21.559; 2.963; y 2.343 Daltons para los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL. Por lo tanto, los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL sirven particularmente bien como marcadores de peso molecular para la estimación del peso molecular aparente de proteínas de muestra que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 9.724; 2.020; 3.094; 5.502; 2.354; 10.617; 8.293; 21.559; 2.963; y 2.343 Daltons. Por consiguiente, el uso de estos marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados permite una mayor precisión en la determinación del peso molecular aparente de proteínas que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 9.724; 2.020; 3.094; 5.502; 2.354; 10.617; 8.293; 21.559; 2.963; o 2.343 Daltons. Se entiende, por supuesto, que la única secuencia de aminoácidos del polipéptido ACPL humano (SEC ID Nº: 13) puede usarse de manera similar para generar un conjunto único de marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL humano. Los tamaños de los fragmentos pueden determinarse fácilmente usando programas informáticos disponibles.

En una realización adicional, la proteína de muestra y el polipéptido ACPL pueden tratarse de manera simultánea, pero por separado, con bromuro de cianógeno en condiciones convencionales que dan como resultado la fragmentación de la proteínas de muestra y el polipéptido ACPL por hidrólisis específica en el extremo carboxilo de los restos de metionina en la proteína de muestra y el polipéptido ACPL. Como se ha descrito anteriormente, los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL generados por escisión del polipéptido ACPL con bromuro de cianógeno tienen pesos moleculares de aproximadamente 9.724; 2.020; 3.094; 5.502; 2.354; 10.617; 8.293; 21.559; 2.963; y 2.343 Daltons.

Los péptidos fragmentados dentro tanto del polipéptido ACPL como de la proteína de muestra pueden resolverse por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante por medios convencionales en dos calles separadas de un gel que contiene dodecilsulfatosódico y una concentración de acrilamida entre el 10-20%. Los péptidos fragmentados en el gel pueden visualizarse usando un procedimiento de tinción convencional. Los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL pueden usarse como marcadores de peso molecular en la estimación del peso molecular aparente de las proteínas fragmentadas obtenidas de la proteína de muestra. Como se ha analizado anteriormente, los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL sirven particularmente bien como marcadores de peso molecular para estimar el peso molecular aparente de péptidos fragmentados que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 9.724; 2.020; 3.094; 5.502; 2.354; 10.617; 8.293; 21.559; 2.963; o 2.343 Daltons. Por consiguiente, el uso de estos marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL permite una mayor precisión en la determinación del peso molecular aparente de péptidos fragmentados que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 9.724; 2.020; 3.094; 5.502; 2.354; 10.617; 8.293; 21.559; 2.963; o 2.343 Daltons. El alcance de la fragmentación del polipéptido ACPL se usa adicionalmente como control para determinar las condiciones esperadas para completar la fragmentación de la proteína de muestra. Se entiende, por supuesto, que podrían usarse muchos compuestos químicos para fragmentar polipéptidos ACPL y que esta realización no limita de forma alguna el alcance de la invención.

En otra realización, pueden generarse conjuntos únicos de marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL a partir de polipéptidos ACPL usando enzimas que escinden el polipéptido en restos de aminoácidos específicos. Debido a la naturaleza única de la secuencia de aminoácidos de polipéptidos ACPL, la escisión en diferentes restos de aminoácidos dará como resultado la generación de diferentes conjuntos de marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados.

Un polipéptido ACPL aislado y purificado puede tratarse con proteasa 1 de Achromobacter en condiciones convencionales que dan como resultado la fragmentación del polipéptido ACPL por hidrólisis específica en el extremo carboxilo de los restos de lisina en el polipéptido ACPL (T. Masaki y col., Biochin. Biophys. Acta 660:44-50, 1981; T Masaki y col., Biochim. Biophys. Acta 660:51-55, 1981). Debido a la secuencia de aminoácidos única del polipéptido ACPL, la fragmentación de los marcadores de peso molecular del polipéptido ACPL con proteasa 1 de Achromobacter genera un conjunto único de marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL. La distribución de restos de lisina determina el número de aminoácidos en cada péptido y la composición de aminoácidos única de cada péptido determina su peso molecular.

El conjunto único de marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL generado por el tratamiento de polipéptidos ACPL de ratón con proteasa 1 de Achromobacter comprende 20 péptidos fragmentados de al menos 10 aminoácidos de tamaño. La generación de 20 péptidos fragmentados con este tratamiento enzimático del polipéptido ACPL, en comparación con la generación de 10 péptidos fragmentados con tratamiento con bromuro de cianógeno del polipéptido ACPL, ilustra claramente que los tamaños de los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados variarán dependiendo del tratamiento de fragmentación utilizado para fragmentar el polipéptido ACPL. Tanto el tamaño como la cantidad de estos fragmentos se determina por la secuencia de aminoácidos del polipéptido ACPL. Por consiguiente, la cantidad de péptidos fragmentados también variará dependiendo del tratamiento de fragmentación utilizado para fragmentar el polipéptido ACPL. Además, la fragmentación del polipéptido ACPL humano (SEC ID Nº: 7) dará como resultado conjuntos únicos de polipéptidos fragmentados, determinados por la secuencia de aminoácidos del polipéptido ACPL.

El polipéptido codificado por los aminoácidos 1-16 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 1.897 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 17-28 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 1.236 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 30-55 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 3.100 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 56-71 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 1.721 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 79-141 de la SEC ID N: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 7.285 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 148-192 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 4.893 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 203-238 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 4.123 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 250-266 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 1.866 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 267-283 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 1.989 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 292-305 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 1.757 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 313-333 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 2.601 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 234-353 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 2.324 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 355-395 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 4.765 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 406-471 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 7.339 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 473-507 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 3.885 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 513-527 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 1.785 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 529-539 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 1.282 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 543-561 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 2.329 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 562-576 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 1.855 Daltons. El péptido codificado por los aminoácidos 596-612 de la SEC ID Nº: 2 tiene un peso molecular de aproximadamente 1.858 Daltons.

Por lo tanto, la escisión del polipéptido ACPL de ratón por tratamiento enzimático con proteasa 1 de Achromobacter genera un conjunto único de marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL. La secuencia de aminoácidos única y conocida de estos péptidos fragmentados permite la determinación del peso molecular de estos marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL. En este caso particular, estos marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL tienen pesos moleculares de aproximadamente 1.897; 1.236; 3.100; 1.721; 7.285; 4.893; 4.123; 1.866; 1.989; 1.757; 2.601; 2.324; 4.765; 7.339; 3.885; 1.785; 1.282; 2.329; 1.855; y 1.858 Daltons.

Una vez mas, los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL, junto con una proteína de muestra, pueden resolverse por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante por medios convencionales en dos calles separadas de un gel que contiene docedilsulfato sódico y una concentración de acrilamida ente el 10-20%. Las proteínas en el gel pueden visualizarse usando un procedimiento de tinción convencional. Los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL pueden usarse como marcadores de peso molecular en la estimación del peso molecular aparente de la proteína de muestra. Los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL sirven particularmente bien como marcadores de peso molecular para estimar el peso molecular aparente de proteínas que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 1.897; 1.236; 3.100; 1.721; 7.285; 4.893; 4.123; 1.866; 1.989; 1.757; 2.601; 2.324; 4.765; 7.339; 3.885; 1.785; 1.282; 2.329; 1.855; o 1.858 Daltons. El uso de estos marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados permite una mayor precisión en la determinación del peso molecular aparente de proteínas que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 1.897; 1.236; 3.100; 1.721; 7.285; 4.893; 4.123; 1.866; 1.989; 1.757; 2.601; 2.324; 4.765; 7.339; 3.885; 1.785; 1.282; 2.329; 1.855; o 1.858 Daltons. Se entiende, por supuesto, que la secuencia de aminoácidos única del polipéptido ACPL humano (SEC ID Nº: 13) puede usarse de manera similar para generar un conjunto único de marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados. Los tamaños de los fragmentos pueden determinarse fácilmente usando programas informáticos disponibles.

En otra realización, la proteína de muestra y el polipéptido ACPL pueden tratarse de manera simultánea, pero por separado, con proteasa I de Achromobacter en condiciones convencionales que dan como resultado la fragmentación de la proteína de muestra y el polipéptido ACPL por hidrólisis específica en el extremo carboxilo de los restos de lisina en la proteína de muestra y el polipéptido ACPL. Los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL y los péptidos fragmentados obtenidos de la proteína de muestra se resuelven por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante por medios convencionales en dos calles separadas de un gel que contiene dodecilsulfato sódico y una concentración de acrilamida entre el 10-20%. Los péptidos fragmentados en el gen pueden visualizarse usando un procedimiento de tinción convencional. Los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL pueden usarse como marcadores de peso molecular en la estimación del peso molecular aparente de la proteína de muestra. Los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL sirven particularmente bien como marcadores de peso molecular para estimar el peso molecular aparente de péptidos fragmentados que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 1.897; 1.236; 3.100; 1.721; 7.285; 4.893; 4.123; 1.866; 1.989; 1.757; 2.601; 2.324; 4.765; 7.339; 3.885; 1.785; 1.282; 2.329; 1.855; o 1.858 Daltons. El uso de estos marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados de ACPL permite una mayor precisión en la determinación del peso molecular aparente de péptidos fragmentados que tienen pesos moleculares aparentes cercanos a 1.897; 1.236; 3.100; 1.721; 7.285; 4.893; 4.123; 1.866; 1.989; 1.757; 2.601; 2.324; 4.765; 7.339; 3.885; 1.785; 1.282; 2.329; 1.855; o 1.858 Daltons. El grado de fragmentación del polipéptido ACPL se usa adicionalmente como control para determinar las condiciones esperadas para la fragmentación completa de la proteína de muestra. Se entiende, por su supuesto, que podrían usarse muchas enzimas para fragmentar polipéptidos ACPL y que esta realización no limita de forma alguna el alcance de la invención.

En otra realización, pueden generarse anticuerpos monoclonales y policlonales contra polipéptidos ACPL. A ratones Balb/c se les puede inyectar por vía intraperitoneal en dos ocasiones a intervalos de 3 semanas 10 \mug de polipéptido ACPL aislado y purificado o péptidos basados en la secuencia de aminoácidos de polipéptidos ACPL en presencia de adyuvante RIBI (RIBI Corp., Hamilton, Montana). Después se ensayan los sueros de ratón por técnica dot blot convencional o captura de anticuerpos (ABC) para determinar qué animal es mejor para la fusión. Tres semanas después, a los ratones se les estimula por vía intravenosa con 3 \mug del polipéptido o péptidos ACPL, suspendidos en PBS estéril. Tres días después, los ratones se sacrifican y se fusionan las células del bazo con células de mieloma Ag8.653 (ATCC) siguiendo protocolos establecidos. En resumen, las células Ag8.653 se lavan varias veces en medios sin suero y se fusionan a células de bazo de ratón con una relación de tres células de bazo a una célula de mieloma. El agente de fusión es PEG al 50%: DMSO al 10% (Sigma). La fusión se cultiva en 20 placas de fondo liso de 96 pocillos (Coming) que contienen medios DMEM suplementados con HAT y se deja que crezcan durante 8 días. Los sobrenadantes de los hibridomas resultantes se recogen y se añaden a una placa de 96 pocillos durante 60 minutos que primero se recubre con Ig de cabra anti-ratón. Después de los lavados, se añaden polipéptidos o péptidos ^{125}I-ACPL a cada pocillo, se incuban durante 60 minutos a temperatura ambiente y se lavan cuatro veces. Los pocillos positivos se detectan posteriormente por auto-radiografía a -70ºC usando una película Kodak X-Omat S. Los clones positivos pueden cultivarse en cultivo a granel y los sobrenadantes se purifican posteriormente en una columna de proteína A (Pharmacia). Por supuesto, se entiende que podrían usarse muchas técnicas para generar anticuerpos contra polipéptidos ACPL y péptidos fragmentados de los mismos y que esta realización no limita de forma alguna el alcance de la
invención.

En otra realización, los anticuerpo generados contra polipéptidos ACPL y péptidos fragmentados de los mismos pueden usarse en combinación con marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados o polipéptido ACPL para potenciar la precisión en el uso de estos marcadores de peso molecular para determinar el peso molecular aparente y el punto isoeléctrico de una proteína de muestra. Los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados o polipéptido ACPL pueden mezclarse con un exceso molar de una proteína de muestra y la mezcla puede resolverse por electroforesis bidimensional por medios convencionales. Los polipéptidos pueden trasferirse a una membrana de unión a proteínas adecuada, tal como nitrocelulosa, por medios convencionales.

Los polipéptidos en la membrana pueden visualizarse usando dos procedimientos diferentes que permiten una discriminación entre la proteína de muestra y los marcadores de peso molecular. Los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados o polipéptido ACPL pueden visualizarse usando anticuerpos generados contra estos marcadores y técnicas de inmunotransferencia convencionales. Esta detección se realiza en condiciones convencionales que no dan como resultado la detección de la proteína de muestra. Se entiende que puede no ser posible generar anticuerpos contra todos los fragmentos del polipéptido ACPL, ya que los péptidos pequeños pueden no contener epítopes inmunogénicos. Se entiende además que no todos los anticuerpos funcionarán en este ensayo; sin embargo, los anticuerpos que son capaces de unirse a polipéptidos ACPL y fragmentos pueden determinarse fácilmente usando técnicas convencionales.

La proteína de muestra se visualiza usando un procedimiento de tinción convencional. El exceso molar preferido de proteína de muestra con respecto a los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados o polipéptido ACPL es tal que el procedimiento de tinción convencional detecta predominantemente la proteína de muestra. El nivel de marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados o polipéptido ACLP es tal que permite una pequeña o ninguna detección de estos marcadores por el procedimiento de tinción convencional. El exceso molar preferido de la proteína de muestra con respecto a los marcadores de peso molecular del polipéptido ACPL es entre 2 y 100.000 veces. Más preferiblemente, el exceso molecular preferido de proteína de muestra con respecto a los marcadores de peso molecular del polipéptido ACPL es entre 10 y 10.000 veces y especialmente entre 100 y 1.000 veces.

Los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados o polipéptido ACPL pueden usarse como marcadores de peso molecular y de punto isoeléctrico en la estimación del peso molecular y del punto isoeléctrico aparentes de la proteína de muestra. Los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados o polipéptido ACPL sirven particularmente bien como marcadores de peso molecular y punto isoeléctrico para estimar los pesos moleculares y puntos isoeléctricos aparentes de proteínas de muestra que tienen pesos moleculares y puntos isoeléctricos aparentes cercanos a los de los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados o polipéptido ACPL. La capacidad para resolver simultáneamente los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados o polipéptido ACPL y la proteína de muestra en condiciones idénticas permite una mayor precisión en la determinación del peso molecular y punto isoeléctrico aparentes de la proteína de muestra. Esto es de particular interés en técnicas, tales como electroforesis bidimensional, donde la naturaleza del procedimiento determina que cualquier marcador debe resolverse de manera simultánea con la proteína de muestra.

En otra realización, los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados o polipéptido ACPL pueden usarse como marcadores de peso molecular y punto isoeléctrico en la estimación del peso molecular y punto isoeléctrico aparentes de péptidos fragmentados obtenidos por el tratamiento de una proteína de muestra con un agente de escisión. Se entiende que pueden usarse muchas técnicas para determinar el peso molecular y el punto isoeléctrico de una proteína de muestra y péptidos fragmentados de los mismos usando marcadores de peso molecular del polipéptido ACPL y fragmentos peptídicos de los mismos y que esta realización no limita de forma alguna el alcance de la invención.

Los marcadores de peso molecular del polipéptido ACPL incluidos por la invención pueden tener pesos moleculares variables, dependiendo de la célula huésped en la que se expresan. La glicosilación de los marcadores de peso molecular del polipéptido ACPL y fragmentos peptídicos de los mismos en diversos tipos celulares puede dar como resultado variaciones del peso molecular de estos marcadores, dependiendo del grado de modificación. El tamaño de los marcadores de peso molecular del polipéptido ACPL puede ser más heterogéneo con fragmentos del polipéptido ACPL obtenido de la porción extracelular del polipéptido. Pueden obtenerse marcadores de peso molecular uniformes usando polipéptido obtenidos completamente de las regiones transmembrana y citoplasmática, pretratando con N-glicanasa para retirar la glicosilación, o expresando los polipéptidos en huéspedes bacterianos.

Los polipéptidos de la presente invención pueden someterse a fragmentación en péptidos más pequeños por medios químicos y enzimáticos, y los fragmentos peptídicos producidos de este modo pueden usarse en el análisis de otras proteínas o polipéptidos. Por ejemplo, tales fragmentos peptídicos pueden usarse como marcadores de peso molecular de péptidos, marcadores de punto isoeléctrico de péptidos, o en el análisis del grado de fragmentación peptídica. Por tanto, la invención también incluye estos polipéptidos y fragmentos peptídicos. También se prevén, aunque no forman parte de la invención, kits para ayudar a determinar el peso molecular y punto isoeléctrico aparentes de una proteína desconocida y kits para evaluar el grado de fragmentación de una proteína desconocida.

Por supuesto, los péptidos y fragmentos de los polipéptidos de la invención también pueden producirse por procedimientos recombinantes convencionales y procedimientos sintéticos bien conocidos en la técnica. Con respecto a los procedimientos recombinantes, los polipéptidos y fragmentos peptídicos incluidos por la invención pueden tener pesos moleculares variables, dependiendo de la célula huésped en la que se han expresado. La glicosilación de los polipéptidos y fragmentos peptídicos de la invención en diversos tipos celulares pueden dar como resultado variaciones del peso molecular en estas piezas, dependiendo del grado de modificación. El tamaño de estas piezas puede ser más heterogéneo con fragmentos de polipéptidos obtenidos de la porción extracelular del polipéptido. Los polipéptidos y fragmentos peptídicos uniformes pueden obtenerse usando polipéptidos obtenidos completamente de las regiones transmembrana y citoplásmica, pretratando con N-glicanasa para retirar la glicosilación, o expresando los polipéptidos en huéspedes bacterianos.

El peso molecular de estos polipéptidos también puede variarse fusionando secuencias peptídicas adicionales tanto a los extremos amino como carboxilo terminales de los péptidos de la invención. Las fusiones de secuencias peptídicas adicionales en los extremos amino y carboxilo terminales de polipéptidos de la invención pueden usarse para potenciar la expresión de estos polipéptidos o para ayudar a purificar la proteína. Además, las fusiones de secuencias peptídicas adicionales en los extremos amino y carboxilo terminales de polipéptidos de la invención alterarán algunos, aunque normalmente no todos, de los péptidos fragmentados de los polipéptidos generados por tratamiento enzimático o químico. Por su puesto, las mutaciones pueden introducirse en polipéptidos de la invención usando técnicas de rutina y conocidas de biología molecular. Por ejemplo, una mutación puede diseñarse de modo que elimine un sitio de escisión proteolítica por una enzima específica o un sitio de escisión por un procedimiento de fragmentación específico inducido químicamente. La eliminación del sitio alterará la huella digital peptídica de polipéptidos de la invención después de la fragmentación con el procedimiento enzimático o químico específico.

Los polipéptidos y los péptidos fragmentados resultantes pueden analizarse por procedimientos que incluyen sedimentación, electroforesis, cromatografía y espectrometría de masas para determinar sus pesos moleculares. Como la secuencia de ácidos nucleicos única de cada pieza específica un peso molecular, estas piezas pueden servir por tanto como marcadores de peso molecular usando tales técnicas de análisis para ayudar a determinar el peso molecular de una proteína desconocida, polipéptidos o fragmentos de los mismos. Los marcadores de peso molecular de la invención sirven particularmente bien como marcadores de peso molecular para estimar el peso molecular aparente de proteínas que tienen pesos moleculares aparentes similares y, por consiguiente, permiten una mayor precisión en la determinación del peso molecular aparente de proteínas.

Cuando la invención se refiere al uso de marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados, estos marcadores son de preferiblemente 10 aminoácidos de tamaño. Mas preferiblemente, estos marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados son de entre 10 y 10 aminoácidos de tamaño. Son incluso mas preferibles marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados entre 10 y 50 aminoácidos de tamaño y especialmente entre 10 y 35 aminoácidos de tamaño. Son más preferibles marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados entre 10 y 20 aminoácidos de tamaño.

Entre los procedimientos para determinar el peso molecular están sedimentación, electroforesis en gel, cromatografía, espectrometría de masas. Una realización particularmente preferida es electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (U. K. Laemmli, Nature 227:680-685, 1970). Convencionalmente, el procedimiento usa dos calles separadas de un gel que contiene dodecilsulfato sódico y una concentración de acrilamida entre el 6-20%. La capacidad de resolver simultáneamente el marcador y la muestra en condiciones idénticas permite una mayor precisión. Se entiende, por supuesto, que pueden usarse muchas técnicas diferentes para determinar el peso molecular de una proteína desconocida usando polipéptidos de la invención, y que esta realización no limita de forma alguna el alcance de la invención.

Cada polipéptido no glicosilado o fragmento del mismo tiene un pI que se determina intrínsecamente por su secuencia de aminoácidos única (pI puede estimarse por parte del especialista en la técnica usando cualquiera de los programas informáticos diseñados para predecir valores de pI actualmente disponibles, calculados usando cualquier tabla de pKa de aminoácidos bien conocida, o medidos empíricamente). Por lo tanto, estos polipéptidos y fragmentos de los mismos pueden servir como marcadores específicos para ayudar a determinar el punto isoeléctrico de una proteína desconocida, polipéptido, o fragmento peptídico usando técnicas tales como enfoque isoeléctrico. Estos marcadores de péptidos fragmentados o polipéptidos sirven particularmente bien para estimar puntos isoeléctricos aparentes de proteínas desconocidas que tienen puntos isoeléctricos aparentes cercanos a los de los marcadores de péptidos fragmentados o polipéptidos de la invención.

La técnica de enfoque isoeléctrico puede combinarse adicionalmente con otras técnicas tales como electroforesis en gel para separar simultáneamente una proteína en función del peso molecular y de la carga. La capacidad de resolver simultáneamente estos marcadores de péptidos fragmentados o polipéptidos y la proteína desconocida en condiciones idénticas permite una mayor precisión en la determinación del punto isoeléctrico aparente de la proteína desconocida. Esto es de particular interés en técnicas, tales como electroforesis bidimensional (T.D. Brock y M.T. Madigan, Biology of Microorganisms 76-77 (Prentice Hall, 6d ed. 1991)), donde la naturaleza del procedimiento determina que cualquier marcador debe resolverse simultáneamente con la proteína desconocida. Además, con tales procedimientos, estos polipéptidos y péptidos fragmentados de los mismos pueden ayudar a determinar tanto el punto isoeléctrico como el peso molecular de una proteína desconocida o péptido fragmentado.

Los polipéptidos y péptidos fragmentados pueden visualizarse usando dos procedimientos diferentes que permiten una discriminación entre la proteína desconocida y los marcadores de peso molecular. En una realización, los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados o polipéptidos de la invención pueden visualizarse usando anticuerpos generados contra estos marcadores y técnicas de inmunotransferencia convencionales. Esta detección se realiza en condiciones convencionales que no dan como resultado la detección de la proteína desconocida. Se entiende que puede no ser posible generar anticuerpos contra todos los fragmentos polipeptídicos de la invención, ya que los péptidos pequeños pueden no contener epítopes inmunogénicos. Se entiende además que no todos los anticuerpos funcionarán en este ensayo; sin embargo, los anticuerpos que son capaces de unirse a polipéptidos y a fragmentos de la invención pueden determinarse fácilmente usando técnicas convencionales.

La proteína desconocida también puede visualizarse usando un procedimiento de tinción convencional. El exceso molar de la proteína desconocida con respecto a los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados o polipéptidos de la invención es tal que el procedimiento de tinción convencional detecta predominantemente la proteína desconocida. El nivel de estos marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados o polipéptidos es tal que permite una pequeña o ninguna detección de estos marcadores por el procedimiento de tinción convencional. El exceso molar preferido de la proteína desconocida con respecto a los marcadores de peso molecular de polipéptidos de esta invención está entre 2 y 100.000 veces. Más preferiblemente, el exceso molar preferido de la proteína desconocida con respecto a estos marcadores de peso molecular de polipéptidos está entre 10 y 10.000 veces y especialmente entre 100 y 1.000 veces.

Se entiende, por supuesto, que pueden usarse muchas técnicas para determinar y detectar el peso molecular y punto isoeléctrico de una proteína desconocida, polipéptidos, y péptidos fragmentados de los mismos usando estos marcadores de peso molecular de polipéptidos y fragmentos peptídicos de los mismos y que estas realizaciones no limitan de forma alguna el alcance de la invención.

En otra realización, el análisis de la fragmentación progresiva de los polipéptidos de la invención en péptidos específicos (D. W. Cleveland y col., J. Biol. Chem. 252:1102-1106, 1977), tal como alterando el tiempo o temperatura de la reacción de fragmentación, puede usarse como control para el grado de escisión de una proteína desconocida. Por ejemplo, la escisión de la misma cantidad de polipéptido y proteína desconocida en condiciones idénticas puede permitir una comparación directa del grado de fragmentación. Las condiciones que dan como resultado la completa fragmenta-
ción del polipéptido también pueden dar como resultado una fragmentación completa de la proteína desconocida.

Los constituyentes de los kits pueden variarse, pero típicamente contienen los marcadores de peso molecular de péptidos fragmentados y polipéptidos. Además, tales kits pueden contener los polipéptidos en los que se ha retirado un sitio necesario para la fragmentación. Además, los kits pueden contener reactivos para la escisión específica del polipéptido y la proteína desconocida por escisión química o enzimática. Los kits pueden contener adicionalmente anticuerpos dirigidos contra polipéptidos o fragmentos de los mismos de la invención.

Identificación de Proteínas Desconocidas

Como se ha indicado anteriormente, una huella digital polipeptídica o peptídica puede introducirse o compararse con una base de datos de proteínas conocidas para ayudar a identificar la proteína desconocida usando espectrometría de masas (W. J. Henzel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 90; 5011-5015, 1993; D. Fenyo y col., Electrophoresis 19:998-1005, 1998). Están accesibles a través de Internet diversos programas de software informáticos para facilitar estas comparaciones, tales como Protein Prospector (página web: prospector.uscf.edu) MultiIdent (página web: www.expasy,ch/sprot/multiident.html), PeptideSearch (página web: www.mann.embl-heie
delberd.de...deSearch/FR PeptideSearch Fron.html) y ProFound (página web: www.chait-sgi.rockefeller.edu/cgi-bin/
prot-id-frag.html). Estos programas permiten al usuario especificar el agente de escisión y los pesos moleculares de los péptidos fragmentados en una tolerancia designada. Los programas comparan los pesos moleculares observados con pesos moleculares de péptidos pronosticados obtenidos de bases de datos de secuencias para ayudar a determinar la identidad de la proteína desconocida.

Además, un polipéptido o producto de digestión de péptido puede secuenciarse usando espectrometría de masas en tandem (EM/EM) y la secuencia resultante puede investigarse frente a las bases de datos (J. K. Eng, y col., J. Am. Soc. Mass. Spec. 5:976-989 (1994); M. Mann y M. Wilm, Anal. Chem. 66:4390-4399 (1994); J.A. Taylor y R.S. Johnson, Rapid Comm. Mass Spec. 11:1067-1075 (1997)). Los programas de investigación que pueden usarse en este procedimiento existen en Internet, tales como Lutefisk 97 (página web: www.Isbc.com:70/Lutefisk97.html), y los programas Protein Prospector, Peptide Search y ProFound descritos anteriormente.

Por lo tanto, añadiendo la secuencia de un gen y su secuencia proteica pronosticada y fragmentos peptídicos a una base de datos de secuencias puede ayudar en la identificación de proteínas desconocidas usando espectrometría de masas.

Anticuerpos

En este documento se proporcionan anticuerpos que son inmuno-reactivos con los polipéptidos de la invención. Tales anticuerpos se unen específicamente a los polipéptidos mediante los sitios de unión a antígeno del anticuerpo (en oposición a la unión no específica). De esta forma, los polipéptidos, fragmentos, variantes, proteínas de fusión, etc, como se ha expuesto anteriormente pueden emplearse como "inmunógenos" para producir anticuerpos inmuno-reactivos a ellos. Más específicamente, los polipéptidos, fragmentos, variantes, proteínas de fusión, etc, contienen determinantes antigénicos o epítopes que provocan la formación de anticuerpos.

Estos determinantes antigénicos o epítopes pueden ser lineales o conformacionales (discontinuos). Los epítopes lineales están compuestos de una sección única de aminoácidos de los polipéptidos, mientras que los epítopes conformacionales o discontinuos están compuestos de secciones de aminoácidos de diferentes regiones de la cadena polipeptídica que se encuentran muy próximos después del plegamiento de la proteína (C. A. Janeway, Jr. y P. Travers, Inmuno Biology 3:9 (Garland Publishig Inc., 2ª ed. 1996)). Como las proteínas plegadas tienen superficies complejas, la cantidad de epítopes disponibles es bastante numerosa; sin embargo, debido a la conformación de la proteína e impedimentos estéricos, la cantidad de anticuerpos que se une realmente a los epítopes es menor de la cantidad de epítopes disponibles (C.A. Janeway, Jr. y P. Travers, Immuno Biology 2:14 (Garland Publishing Inc., 2ª ed. 1996)). Los epítopes pueden identificarse por cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica.

De esta forma, un aspecto de la presente invención se refiere a los epítopes antigénicos de los polipéptidos de la invención. Tales epítopes son útiles para producir anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, como se describe con más detalle a continuación. Adicionalmente, los epítopes de los polipéptidos de la invención pueden usarse como reactivos de investigación, en ensayos, y para purificar anticuerpos de unión específicos de sustancias tales como sueros policlonales o sobrenadantes de hibridomas cultivados. Tales epítopes o variantes de los mismos pueden producirse usando técnicas bien conocidas en la técnica tales como síntesis en fase sólida, escisión química o enzimática de un polipéptido, o usando tecnología de ADN recombinante.

En cuanto a los anticuerpos que pueden producirse por los epítopes de los polipéptidos de la invención, independientemente de si los epítopes se han aislado o forman parte de los polipéptidos, tanto los anticuerpos policlonales como monoclonales pueden prepararse por técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet y col., (eds.), Plenun Press, Nueva York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Land (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988).

En este documento también se contemplan líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos para los polipéptidos de la invención. Tales hibridomas pueden producirse e identificarse por técnicas convencionales. Un procedimiento para producir tal línea celular de hibridoma comprende inmunizar a un animal con un polipéptido; recoger las células del bazo del animal inmunizado; fusionar dichas células del bazo a una línea celular de mieloma, generando de este modo células de hibridoma; e identificar una línea celular de hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal que se una al anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales pueden recuperarse por técnicas convencionales.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales murinos. Tales anticuerpos humanizados pueden prepararse por técnicas conocidas y ofrecen la ventaja de inmunogeneicidad reducida cuando los anticuerpos se administran a seres humanos. En una realización, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo murino (o sólo el sitio de unión a antígeno del mismo) y una región constante obtenida de una anticuerpo humano. Como alternativa, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de la región variable (que carece del sitio de unión a antígeno) obtenido de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales quiméricos y modificados adicionalmente por ingeniería genética incluyen los descritos en Riechmann y col. (Nature 332:323, 1988), Liu y col. (PNAS 84:3439, 1987), Larrick y col. (Bio/Technology 7:934,1989), y Winter y Harris (TIPS 14:139, mayo, 1993). Los procedimientos para generar anticuerpos de manera transgénica pueden encontrarse en el documento GB 2.272.440, en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.569.825 y 5.545.806 y patentes relacionadas que reivindican prioridad de las mismas, todas la cuales se incorporan en este documento como referencia.

La presente invención también abarca fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos, que pueden producirse por técnicas convencionales. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen, pero sin limitación, fragmentos Fab y F(ab')_{2}. También se proporcionan fragmentos y derivados de anticuerpo producidos por técnicas de ingeniería genética.

En una realización, los anticuerpos son específicos para los polipéptidos de la presente invención y no reaccionan de manera cruzada con otras proteínas. Los procedimientos de selección por los que tales anticuerpos pueden identificarse son bien conocidos, y pueden implicar, por ejemplo, cromatografía de inmunoafinidad.

Usos de los mismos

Los anticuerpos de la invención pueden usarse en ensayos para detectar la presencia de los polipéptidos o fragmentos de la invención, in vitro o in vivo. Los anticuerpos también pueden emplearse para purificar polipéptidos o fragmentos de la invención por cromatografía de inmunoafinidad.

Los anticuerpos que pueden bloquear adicionalmente la unión de los polipéptidos de la invención a su molécula de unión pueden usarse para inhibir una actividad biológica que resulte de tal unión. Tales anticuerpos de bloqueo pueden identificarse usando cualquier procedimiento de ensayo apropiado, tal como ensayando anticuerpos con respecto a la capacidad de inhibir la unión de ACPL a ciertas células que expresan la molécula de unión. Como alternativa, los anticuerpos de bloqueo pueden identificarse en ensayos para la capacidad de inhibir un efecto biológico que resulte de la unión de una molécula de unión a ACPL a células diana. Los anticuerpos pueden ensayarse con respecto a la capacidad de inhibir la actividad mediada por la molécula de unión.

Tal anticuerpo puede emplearse en un procedimiento in vitro, o puede administrarse in vivo para inhibir una actividad biológica mediada por la entidad que generó el anticuerpo. Los trastornos provocados o exacerbados (directa o indirectamente) por la interacción de una molécula de unión a ACPL con el receptor de la molécula de unión de superficie celular pueden, por tanto, tratarse. Un procedimiento terapéutico implica la administración in vivo de un anticuerpo de bloqueo a un mamífero en una cantidad eficaz para inhibir una actividad biológica mediada por una molécula de unión. Los anticuerpos monoclonales se prefieren generalmente para uso en tales procedimientos terapéuticos. En una realización, se emplea un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno.

Los anticuerpos pueden seleccionarse con respecto a las propiedades agonistas (es decir, imitan ligandos). Tales anticuerpos, después de la molécula de unión de superficie celular, inducen efectos biológicos (por ejemplo, transducción de señales biológicas) similares a los efectos biológicos inducidos cuando una molécula de unión a ACPL se une al ACPL de superficie celular. Los anticuerpos agonistas pueden usarse para inducir la actividad mediada por IL-18.

En este documento se proporcionan composiciones que comprenden un anticuerpo que está dirigido contra ACPL, y un diluyente, excipiente, o vehículo fisiológicamente aceptable. Los componentes adecuados de tales composiciones son como se han descrito anteriormente para composiciones que contienen proteínas ACPL.

En este documento también se proporcionan conjugados que comprenden un agente detectable (por ejemplo, de diagnostico) o terapéutico, unido al anticuerpo. Los ejemplos de dichos agentes se han presentado anteriormente. Los conjugados encuentran uso en procedimientos in vitro o in vivo.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente realizaciones particulares de la invención, y no se interpretarán como que limitan el alcance de la presente invención. La memoria descriptiva se entenderá mas completamente a la luz de los contenidos de las referencias citadas en la memoria descriptiva, que se incorporan por la presente como referencia. Las realizaciones de la memoria descriptiva y los siguientes ejemplos proporcionan una ilustración de las realizaciones de la invención y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención. El especialista en la técnica reconoce que la invención reivindicada abarca muchas otras realizaciones. En los siguientes ejemplos, todos los procedimientos descritos son convencionales salvo que se especifique otra cosa.

Ejemplo 1

Aislamiento del Acido Nucleico de ratón

Se aisló el ADNc de ACPL de un ratón buscando la base datos de la secuencia de señalización expresada descubriendo que el clon IMAGE 640615 (número de acceso de GenBank AA203097) tiene homología con IL-1RacP. Se obtuvo el clon IMAGE 640615, se marcó con ^{32}P por cebado aleatorio y se usó para sondear una biblioteca de ADNc de EI46.1 (timocito de ratón). La hibridación se realizó a 42ºC en solución de hibridación que contenía formadida al 50%. La fase de lectura abierta de longitud completa se definió por un clon de ADNc de EL46.1, se verificó obteniendo aislados independientes de bibliotecas de ADNc de 7B9 (células T de ratón) y LDA11 (estroma de médula ósea de ratón) usando amplificación por PCR. Los cebadores correspondían a los nucleótidos -15 a +13 y a los nucleótidos 1892 a 1916 (con relación al ATG de inicio que era de +1 a +3) de la secuencia de nucleótidos de ACPL de ratón.

Ejemplo 2

Aislamiento de la Secuencia de Ácidos Nucleicos de ACPL Humano

Se descubrió que un clon de ADNc humano, llamado QQ1352, obtenido por secuenciación aleatoria de una biblioteca de células NK, tenía un grado alto de homología con el ACPL murino asilado como se ha descrito en el ejemplo 1. El clon se usó como sonda para aislar clones de ACPL humano de linfocitos de sangre periférica, células T de sangre periférica, y bibliotecas de ADNc de NK. La región del clon QQ1352 que se usó como sonda era homóloga a los nucleótidos 1196-11753 de ACPL de ratón. No se obtuvo un clon de longitud completa de ninguna de las bibliotecas, de modo que se realizó una PCR anclada a vector en cada una de las bibliotecas para obtener el extremo 5' de la fase de lectura abierta (SEC ID Nº: 6).

Ejemplo 3

Determinación de la Posición en el Mapa Cromosómico

La posición en el mapa cromosómico de ACPL humano se determinó por mapeo de híbridos por radiación usando el Stanford G3 Radiation Hybrid Panel (Research Genetics). Los cebadores se seleccionaron con respecto a su homología con IL-1R. La amplificación se realizó en condiciones de PCR convencionales durante 40 ciclos.

Los resultados colocaron a ACPL humano en el cromosoma 2, unido más estrechamente a AFM316tg5, con un logaritmo de puntuación de odds de 12,72. Esta es la misma región del cromosoma 2 en la que se ha mapeado IL-1R de tipo I, IL-1R de tipo II, IL-1R-rp1, y T1/ST2.

Ejemplo 4

Análisis por transferencia de Northern

Se adquirió una transferencia de tejido múltiple humana en CLONTECH laboratories, Inc. y contenía 2 \mug de ARNm de bazo, timo, próstata, testículo, ovario, intestino delgado, colon, y leucocitos de sangre periférica humanos normales. Esto se hibridó durante una noche con una ribosonda de ACPL humana antisentido marcada con 32P en tampón de hibridación que contenía formamida al 50% a 63ºC y después se lavó a 68ºC en 0,1XSSC/SDS al 0,1%. Después de la exposición, la transferencia se volvió a hibridar con una sonda marcada con cebador aleatorio contra la \beta-actina para la normalización.

Los resultados demostraron que ACPL humano se expresa fuertemente en leucocitos de sangre periférica y bazo. En un menor grado, ACPL humano se expresa en el colon. Los resultados demostraron además que ACPL humano se expresa ligeramente en el ARNm de próstata e intestino delgado. El producto de ARNm predominante fue de aproximadamente 3,8 kilobases, con bandas minoritarias a aproximadamente 2,6 y 8,0 kilobases. La expresión también se detectó en el ARNm de pulmón por análisis de Northern.

Ejemplo 5

Expresión del polipéptido ACPL y fusiones ACPL:FC

Para expresar los polipéptidos ACPL de ratón y seres humanos, se generaron secuencias de nucleótidos de ACPL de ratón y seres humanos de longitud completa por PCR y se clonaron en pDC304, una variante de pDC302. Para expresar la proteína de fusión ACPL:Fc humana, la porción extracelular del vector de expresión de ACPL humano (aminoácidos 1-356) se unió a los dominios CH2 y CH3 de IgG1 humana y se generaron como se describe en Baum y col. EMBO J. 13:3992-4001 (1994).

Ejemplo 6

Inducción de NFkB a través del polipéptido ACPL en células COS y S49

Para determinar si el polipéptido ACPL de ratón (SEC ID Nº: 2) era un receptor implicado en la señalización de IL-18, el polipéptido ACPL se sobreexpresó en células COS y células S49.1 y se evaluó el efecto de la estimulación con IL-18 en la activación de NFkB. Las células COS se transfectaron por el procedimiento de DEAE/Dextrano en un formato de 12 pocillos. Cada pocillo se transfectó con un total de 200 ng de vectores de expresión que codifican el receptor o receptores y 800 ng de un plásmido informador de NFkB-Luc, que contiene 3 sitios de NFkB que median la expresión de luciferasa. Se transfectaron aproximadamente 10^{7} células S49.1 por electroporación en 0,7 ml con 40 \mug del plásmido informador de NFkB-Luc, y un total de 20 \mug de vectores de expresión que codifican receptores. Las eletroporaciones se realizaron a 960 \muF y 320 V.

Las células se incubaron durante 2 días, y después se estimularon con 400 ng/ml de IL-18 murino (PeproTech) durante 4 horas. Las células se lavaron, se lisaron, y se ensayaron con respecto a la actividad de luciferasa usando reactivos de ensayo de luciferasa (Promega Corp.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las células transfectadas con el vector solo, el vector de expresión que codifica IL-1Rrp1 solo, o el vector de expresión que codifica el polipéptido ACPL solo no fueron sensibles a estimulación con IL-18. Además, no se detectó ninguna función de ACPL en la señalización de IL-1 cuando el vector de expresión que codifica el receptor se transfectó solo, o en combinación con un vector de expresión que codifica IL-1R de tipo 1 o IL-1RAcP. Sin embargo, la adición de IL-18 a células cotransfectadas con vectores de expresión que codifican IL-1Rrp1 y polipéptido ACPL indujeron la expresión del gen unido a NFkB 10 veces en células COS y 300 veces en células S40. Esta estimulación drástica de la actividad de NFkB indica que el polipéptido ACPL es un componente del receptor de IL-18 que coopera de manera sinérgica con IL-1Rrp1 para inducir la señalización de NFkB en respuesta a la estimulación con IL-18.

Ejemplo 7 Activación de la Actividad de JNK

La inducción de la actividad de JNK es un suceso de la señalización corriente abajo en la ruta de IL-1. De manera similar a la inducción del experimento de NFkB anterior, se examinó si ACPL solo o en combinación con IL-1Rp era capaz de mediar la inducción de la actividad de JNK por IL-18. La activación de la actividad de JNK se evaluó como se describe en Bird y col. J.Biol. Chem. 269:31836-31844, 1994. Dos (2) días después de la transfección, las células COS7 se estimularon con IL-18 durante 15 minutos, se lisaron, y se inmunoprecipitaron con una combinación de dos anticuerpos anti-JNK (c-17 y FL, Santa Cruz Biotaechnology, Inc). Este inmunocomplejo se ensayó con respecto a la actividad por adición de glutatión S-transferasa-c-Jun (Upstate Biotechnology. Inc.) y [\gamma-^{32}] ATP en tampón quinasa. La reacción se dejó proceder durante 30 minutos a temperatura ambiente, después de lo cual se añadió tampón de carga Laemmli para interrumpir la reacción, y los productos se sometieron a electroforesis en un gel de acrilamida al 4-20%, se tiñeron, se secaron y se analizaron en un PhosphorImager.

De manera similar a los resultados obtenidos con respecto a la activación de NFkB, la actividad de JNK se indujo sólo por IL-18 en células COS7 cuando IL-1R-Rp1 y ACPL se coexpresaron.

<110> Sims, John E.

\hskip1cm

Born, Teresa L.

\hskip1cm

Immunex Corporation

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<120> ADN y Polipéptidos ACPL

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<130> 2872-WO

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<140> - - por asignar - -

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<141> 22-01-1999

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<150> 60/072.301

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<151> 23-01-1998

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<150> 60/078.835

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<151> 20-03-1998

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<160> 7

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 1845

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<212> ADN

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<213> ADN Murino

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1845)

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<400> 1

1

2

3

4

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<210> 2

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<211> 614

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<212> PRT

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<213> ADN Murino

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<400> 2

5

6

7

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<210> 3

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<211> 754

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<212> ADN

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<213> ADN Humano

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<400> 3

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8

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<210> 4

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<211> 523

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<212> ADN

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<213> ADN Humano

\newpage

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<400> 4

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9

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<210> 5

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<211> 22

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<212> PRT

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<212> Humano

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<400> 5

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\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Gly Asp Thr Lys Leu Lys Pro Asp Ile Leu Asp Pro Val Glu Asp}

\sac{Thr Leu Glu Val Glu Leu}

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<210> 6

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<211> 2681

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<212> ADN

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<213> ACPL Humano

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<220>

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<221> CDS

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<222> (484)..(2283)

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<400> 6

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10

11

12

13

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<210> 7

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<211> 599

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<212> PRT

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<213> ACPL Humano

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

16

Claims

1. Una molécula de ácidos nucleicos aislada que comprende la secuencia de ADN seleccionada entre el grupo constituido por:

(a) la región codificante de la SEC ID Nº: 1;

(b) la región codificante de la SEC ID Nº: 6; y

(c) ADN capaz de hibridar en condiciones de rigurosidad moderada con el ADN de (a) y (b), donde las condiciones de rigurosidad moderada incluyen formamida al 50% y 6XSSC, a 42ºC con condiciones de lavado a 60ºC, 0,05XSSC, SDS al 0,1%, y, donde el ADN codifica un polipéptido que coopera con IL-1Rrp1 en presencia de IL-18 para inducir la señalización de NF Kappa B.

2. Una molécula de ácidos nucleicos aislada que codifica un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 7.

3. Una molécula de ácidos nucleicos aislada de acuerdo con la reivindicación 2 que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEC ID Nº: 2 y SEC ID Nº: 7.

4. La molécula de ácidos nucleicos aislada de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicha molécula de ácidos nucleidos aislada se obtiene por mutagénesis in vitro de la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 6.

5. Una molécula de ácidos nucleicos aislada degenerada, como resultado del código genético de un ADN seleccionado entre el grupo constituido por la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 6.

6. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido soluble, en el que dicho polipéptido soluble comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por:

(a) los aminoácidos x_{1} a 356 de la SEC ID Nº: 2, donde x_{1} es el aminoácido 1 ó 15; y

(b) los aminoácidos x_{1} a 356 de la SEC ID Nº: 7; donde x_{1} es al aminoácido 1 ó 15.

7. Un ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 6 que codifica un polipéptido soluble que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por:

(b) los aminoácidos x_{1} a 356 de la SEC ID Nº: 7, donde x_{1} es el aminoácido 1 ó 15.

8. Un polipéptido que comprende un aminoácido que es al menos un 80% idéntico a una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por:

(a) SEC ID Nº: 2;

(b) SEC ID Nº: 7; y

(c) los fragmentos de (a) y (b), donde el fragmento coopera con IL-1Rrp1 en presencia de IL-18 para producir la señalización de NF Kappa B.

9. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionados entre el grupo constituido por (a), (b) o (c).

10. Un polipéptido codificado por un ADN seleccionado entre el grupo constituido por:

(a) la región codificante de la SEC ID Nº: 1;

(b) la región codificante de la SEC ID Nº: 6; y

(c) un ADN capaz de hibridar en condiciones de rigurosidad moderada con el ADN de (a) y (b), donde las condiciones de rigurosidad moderada incluyen formamida al 50% y 6XSSC, a 42ºC, con condiciones de lavado de 60ºC, 0,5XSSC, SDS al 0,1%, y, donde el ADN codifica un polipéptido que coopera con IL-1Rrp1 en presencia de IL-18 para inducir la señalización de NK Kappa B.

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11. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80% idéntica a una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por:

(a) los aminoácidos x_{1} a 356 de la SEC ID Nº: 2, donde x_{1} es el aminoácido 1 ó 15;

(b) los aminoácidos x_{1} a 356 de la SEC ID Nº: 7, donde x_{1} es el aminoácido 1 ó 15; y

(c) los fragmentos de (a) y (b), donde el fragmento coopera con IL-1Rrp1 en presencia de IL-18 para inducir la señalización de NF Kappa B.

12. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 11 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por (a), (b) o (c).

13. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido de la reivindicación 11 y la región Fc de Ig.

14. Un vector de expresión recombinante que comprende el ADN de la reivindicación 2.

15. Un procedimiento para preparar un polipéptido codificado por el ADN de la reivindicación 2, comprendiendo el procedimiento cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión de la reivindicación 14 en condiciones que promueven la expresión de un polipéptido.

16. Una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 14.

17. Un anticuerpo que es inmuno-reactivo con un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12.

18. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 8 a 13.

19. Una composición que comprende el anticuerpo de la reivindicación 17.

20. Una composición de acuerdo con la reivindicación 18 para uso como medicamento.

21. Una composición de acuerdo con la reivindicación 19, en la que el anticuerpo es un anticuerpo agonista para uso en la inducción de la actividad mediada por IL-18.