ES2245364T3 - Mezcla que comprende un inhibidor o supresor de un gen y una molecula que se une a un producto de expresion de ese gen. - Google Patents
Mezcla que comprende un inhibidor o supresor de un gen y una molecula que se une a un producto de expresion de ese gen.Info
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Abstract
Una mezcla que comprende al menos un inhibidor o supresor de la expresión de un gen, donde dicho al menos un inhibidor o supresor se selecciona del grupo de oligonucleótido, oligonucleótido antisentido, ribozima, sus derivados y/o proteínas y al menos una molécula que inhibe la actividad funcional de un producto de la expresión del mencionado gen, donde dicha al menos una molécula se selecciona del grupo de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos Fab, anticuerpos de cadena única o combinaciones de éstos y una molécula de ADN o ARN o un derivado de éstas incluyendo aptámeros y espiegélmeros que se unen al producto de expresión del gen.
Description
Mezcla que comprende un inhibidor o supresor de
un gen y una molécula que se une a un producto de expresión de ese
gen.
Clásicamente, las moléculas, incluyendo los
medicamentos, utilizadas para modular funciones biológicas a través
de productos génicos o sus derivados- como, por ejemplo, productos
génicos glicosilados, fosforilados o modificados de otra manera,
han estimulado o inhibido productos génicos y/o sus derivados. La
estimulación o la inhibición se han conseguido, por ejemplo,
utilizando agonistas o antagonistas, incluyendo moléculas de bajo
peso molecular, péptidos, anticuerpos, etc. Ejemplos conocidos son
los antagonistas de H2, y bloqueantes \beta o anticuerpos que se
unen a la proteína HER2 o a receptores modulados inmunológicamente
así como moléculas que se unen a receptores
hormonales.
hormonales.
La unión también puede conseguirse mediante
derivados de ácidos nucleicos como aptámeros y espiegélmeros.
Más recientemente, también se ha utilizado la
inhibición de productos génicos mediante la inhibición de su
expresión a través de ligandos antisentido, ribozimas, ligandos de
la triple hélice etc. Como ejemplos están la inhibición de la
expresión de receptores de neurotransmisores en el cerebro o la
inhibición de proteínas que regulan el crecimiento celular,
citoquinas y factores de crecimiento.
Las dos aproximaciones, tanto la inhibición de
productos génicos mediante la unión de moléculas a los productos
génicos y a sus derivados como la inhibición de la expresión se han
utilizado para una gran variedad de productos génicos y sus
derivados.
La invención se refiere a una mezcla que
comprende al menos un inhibidor o supresor de la expresión de un
gen y al menos una molécula que se une a un producto de la
expresión del mencionado gen que inhibe la actividad funcional del
producto de la expresión.
De manera sorprendente, esta combinación presenta
un efecto supra-aditivo. "Supra aditivo" se
define como una eficacia de una mezcla que es al menos 20%,
preferiblemente más de 50%, más preferiblemente más de 100% mejor
que la suma de los efectos de los compuestos de la mezcla por
separado. Esto puede ensayarse en cualquier sistema in vitro
o in vivo, que a) exprese el gen respectivo y b) la expresión
del gen tiene un efecto que se puede medir en el sistema.
Las ventajas son las dosis menores y/o una
eficacia mayor comparado con cada aproximación individual.
La Patente de EEUU 5.891.858 (Rubenstein)
describe polinucleótidos antisentido frente al factor de
crecimiento transformante humano alfa (TGF-\alpha)
y al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFr).
Describe la combinación de un polinucleótido antisentido para EGFr
con anticuerpos contra EGFr (anti-EGFr) pero el
anti-EGFr no es capaz de inhibir la actividad del
receptor de EGF. Por el contrario, anti-EGFr
estimula el receptor.
Preferiblemente, el inhibidor o supresor es una
molécula de ácido nucleico o un derivado de ésta. La molécula de
ácido nucleico es preferiblemente un oligonucleótido, un
oligonucleótido antisentido y/o una ribozima que inhibe o interfiere
la expresión de un gen que juega un papel en un evento
pato-fisiológico.
Los derivados de los productos génicos son, por
ejemplo, productos génicos modificados después de la transcripción
o de la traslación, por ejemplo, ARN o proteínas que han sufrido
modificación química, por ejemplo, metilación, fosforilación,
glicosilación, etc.
De acuerdo con la invención, puede resultar útil
integrar la molécula antisentido y/o la molécula de ribozima en un
sistema de administración de ADN. El sistema de administración de
ADN comprende vectores víricos o no víricos o ambos y de manera
adicional, lípidos aniónicos, lípidos catiónicos, lípidos no
catiónicos o mezclas de éstos.
Preferiblemente, la molécula antisentido y/ o la
molécula de ribozima presenta modificaciones en una o más
fracciones de azúcar, en las uniones de las bases y/o en las
uniones internucleótido, por ejemplo, en los enlaces fosfato. Por
ejemplo, la modificación de los oligonucleótidos, de las ribozimas
y/o de los ácidos nucleicos comprende modificaciones como uniones
internucleótido fosforotioato (S-ODN), uniones
internucleótido metilfosfonato, uniones fosforamidato, uniones
peptídicas, modificaciones
2'-O-alquil del azúcar, en
particular metil, etil, propil, butil y semejantes, modificaciones
2'-metoxietoxi del azúcar y/o modificaciones de las
bases. Las diferentes modificaciones pueden combinarse en un oligo o
polinucleótido.
La molécula antisentido y/o la molécula de
ribozima puede modificarse también acoplándola a un amplificador de
la captación y/o de la actividad inhibitoria.
En una realización adicional preferida de la
invención, las moléculas de ácido nucleico están acopladas a o
mezcladas con ácido fólico, hormonas, hormonas esteroides como
estrógeno, progesterona, corticosteroides, corticoides minerales,
péptidos, proteoglicanos, glicolípidos, fosfolípidos y derivados de
éstos.
En una realización muy preferida, la molécula de
ácido nucleico se selecciona de moléculas de ácido nucleico que
comprenden una o más de las secuencias de nucleótido
siguientes:
Las personas especializadas en el tema conocen
secuencias de ácidos nucleicos adecuadas adicionales. Se pueden
encontrar más secuencias y métodos para seleccionar dichas
secuencias en, por ejemplo, WO 94/25588 o WO 98/33904.
En una realización adicional, el inhibidor o
supresor es un péptido, una proteína y/o una sustancia de bajo peso
molecular, que es capaz de unirse al ADN o al ARN que codifica el
gen, inhibiendo o suprimiendo, de esta manera, la expresión del gen.
Las proteínas adecuadas también comprenden anticuerpos y fragmentos
de anticuerpos.
La mezcla de la invención comprende
preferiblemente como molécula que se une al producto de la
expresión del gen un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, tal
como un fragmento F_{ab}, un anticuerpo de cadena única o
combinaciones de éstos. El anticuerpo, el fragmento de anticuerpo,
tal como un fragmento F_{ab}, el anticuerpo de cadena única o las
combinaciones de éstos se pueden obtener, por ejemplo, mediante el
rastreo de bibliotecas de anticuerpos y ensayando los productos de
la expresión para comprobar su unión a un producto de la expresión
del gen.
En una realización adicional la molécula que se
une a un producto de la expresión del gen es preferiblemente un
péptido y/o una proteína. El péptido y/o la proteína se pueden
obtener, por ejemplo, mediante el rastreo de una biblioteca de
expresión y ensayando los productos de la expresión para comprobar
su unión a un producto de la expresión del gen.
El péptido y/o la proteína sintéticos se pueden
obtener también mediante el rastreo de péptidos y/o polipéptidos
sintetizados al azar determinando su unión a un producto de la
expresión del gen. Los péptidos que se unen a productos de expresión
se describen, por ejemplo, en EMBO J. 20 (2001)
340-349. Los péptidos se unen a MIA (Actividad
Inhibitoria de Melanoma), inhibiendo de esta manera, la actividad
funcional de MIA. Los péptidos adecuados (SEC ID No.
18-41) son, por ejemplo,
VPHIPPN
MPPTQVS
QMHPWPP
QPPFWQF
TPPQGLA
IPPYNTL
AVRPAPL
GAKPHPQ
QQLSPLP
GPPPSPV
LPLTPLP
QLNVNHQARADQ
TSASTRPELHYP
TFLPHQMHPWPP
VPHIPPNSMALT
RLTLLVLIMPAP
RKLPPRPRR
VLASQIATTPSP
TPLTKLPSVNHP
PPNSFSSAGGQRT
EQDSRQGQELTKKGL
ETTIVITWTPAPR
TSLLISWDAPAVT
NSLLVSWQPPRAR
En otra realización, la mezcla de la invención
comprende una molécula de bajo peso molecular que se une a un
producto de la expresión del gen. En particular, la molécula de
bajo peso molecular se puede obtener utilizando química combinatoria
y ensayando los productos para determinar su unión a un producto de
la expresión del gen.
Las moléculas de bajo peso molecular (moléculas
pequeñas) que se utilizan en la presente memoria son moléculas que
tienen hasta 100 átomos de carbono en combinación con átomos
adicionales como N, S, O, P y semejantes. Los compuestos adecuados
que se unen a un producto de expresión pueden encontrarse en la
figura 2, todos ellos se unen a MIA.
La molécula o factor que se une a un producto de
la expresión del gen puede ser también una molécula de ADN o de ARN
o un derivado de éstas incluyendo aptámeros y/o espiegélmeros que
se unen al producto de la
\hbox{expresión del gen.}
En una realización preferida de la invención, el
gen se selecciona del grupo que consiste en
TGF-\beta, erbB-2, MIA,
c-jun, junB, c-fos, VCAM,
NF-kappaB p65, NF-kappa B p50,
ICAM, VEGF y NF-kB 2.
La invención se refiere también a
oligonucleótidos que tienen las secuencias Sec. ID. No 1 a 17.
Un medicamento que comprende la mezcla de la
invención también es objeto de la presente invención.
La invención se refiere además a un método para
utilizar una mezcla que comprende al menos un supresor o inhibidor
de la expresión de un gen y al menos una molécula o factor que se
une a un producto de la expresión del mencionado gen para tratar
tumores, trastornos inmunes, o para mejorar el transplante de
órganos o de células, incluyendo el transplante de células madre
hematopoyéticas y sus derivados incluyendo eritrocitos, células
sanguíneas blancas, plaquetas, trombocitos y sus células
precursoras. El transplante de órganos incluye el transplante de
hígado, riñón, corazón, pulmón, de órganos gastrointestinales,
hueso, páncreas, cartílago, neuronas, células de islote y células
madre a partir de las cuales estos órganos pueden derivarse o
reconstruirse.
La invención se refiere además a un método para
tratar tumores, trastornos inmunes, o para mejorar el transplante
de órganos o de células mediante la administración de una cantidad
eficaz de una combinación de al menos una molécula o factor que
suprime o inhibe una expresión de un gen y de al menos un factor
que se une a un producto de la expresión del mencionado gen, donde
la inhibición del crecimiento tumoral, la mejora del transplante de
órganos o de células, la amplificación o inhibición de la respuesta
inmune, se incrementan de manera supra-aditiva,
incluyendo el transplante de células madre hematopoyéticas y sus
derivados, incluyendo eritrocitos, células sanguíneas blancas,
plaquetas, trombocitos y sus células precursoras. El transplante de
órganos incluye el transplante de hígado, riñón, corazón, pulmón,
de órganos gastrointestinales, hueso, páncreas, cartílago, neuronas,
células de islote y células madre a partir de las cuales estos
órganos pueden derivarse o reconstruirse.
La mezcla de la presente invención también es
útil en la Validación de Medicamentos Diana, es decir, para
identificar genes que son relevantes para un determinado estado
patológico mediante el ensayo del efecto de la mezcla de la presente
invención en un sistema de células o en un organismo.
En una realización adicional, la invención se
dirige a un método para reducir una actividad funcional de un
producto génico en un sistema biológico que comprende el
tratamiento del sistema biológico de manera simultánea o sucesiva
con al menos un inhibidor o supresor de la expresión de un gen y
con al menos una molécula que inhiba la actividad funcional de un
producto de la expresión del mencionado gen. El sistema biológico
puede ser una célula, un cultivo de células, un órgano o un
organismo.
La Fig. 1 muestra un fuerte efecto
supra-aditivo de una combinación del bloqueo de un
gen con una molécula antisentido combinado con un anticuerpo
neutralizante.
La Figura 2 describe moléculas pequeñas capaces
de inhibir el producto génico MIA.
Con el fin de estudiar los efectos del anticuerpo
neutralizante frente a TGF-\beta2 como un
inhibidor del producto génico, y de oligonucleótidos antisentido
frente a TGF-\beta2 como un inhibidor de la
expresión génica y una combinación de los dos, después de la
respuesta de actividad inmune de linfocitos T citotóxicos (CTL) y de
células asesinas activadas por linfoquinas (células LAK) en células
tumorales, se empleó un ensayo CARE-LASS
(Lichtenfels, R., Biddison, W.E.1 Schulz, H.1 Voyt, A.B. y R.
Martín. El ensayo CARE-LASS (ensayo de liberación
de calceína), es un sistema de ensayo basado en fluorescencia
mejorado para medir la actividad citotóxica de los linfocitos. J.
Immunol. Meth., 172: 227-239, 1994).
Se aislaron células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) a partir de sangre venosa de donantes sanos
mediante una centrifugación en gradiente
Ficoll-Hypaque estándar, como se ha descrito
previamente. Brevemente, se mezcló sangre heparinizada con volúmenes
iguales de medio completo (medio RPMI 1640 suplementado con 10%
(v/v) suero fetal de ternera y 1mM L-Glutamina) y
se puso en gradientes Ficoll-Hypaque (Pharmacia,
Uppsala, Suecia). Después de centrifugar a 400 g durante 30 minutos
a temperatura ambiente, se recogieron PBMC situados en la interfase
plasma-Ficoll, se lavaron tres veces y se
resuspendieron en medio completo. La viabilidad celular,
determinada por exclusión con azul de Tripan, fue > 97%. Los
linfocitos se activaron mediante tratamiento con 10 U/ml
IL-1 alfa y 100 U/ml IL-2.
En el día del ensayo, se recogieron células
tumorales de glioma, se lavaron dos veces en una disolución 5%
FCS/PBS y se resuspendieron a 10 células Mio /ml en 5% FCS/PBS. Se
añadió calceína-AM (Molecular Probes, EEUU) a una
concentración final de 25 \muM. Las células se marcaron durante
30 minutos a 37ºC, después se lavaron dos veces en 5% FCS/PBS, se
ajustaron a 1 célula Mio / ml y se cargaron en placas de
microtitulación de 96 pocillos en forma de U a una concentración
final de 0,1 células Mio / 100 \mul / 1 pocillo (Nunc,
Dinamarca).
Se añadió, como se indica en la Figura, bien
- oligonucleótidos fosfotioato antisentido
TGF-\beta2 (c.f. 2-5 \muM),
o
- anticuerpo neutralizante frente a
TGF-\beta2 (c.f. 100 mg/ml)
o
- una combinación de los dos
o
- ninguno de los dos.
Determinación de la actividad citotóxica de las
células efectoras (E) en las células diana (D): para determinar la
actividad citotóxica de las células efectoras, se cargaron los
pocillos con 100 \muM de CTL y de células LAK (E) para producir
las proporciones E : D deseadas de 1 : 20.
Para determinar la liberación espontánea y la
liberación total de calceína, los pocillos se cargaron previamente
con 100 \mul 5% FCS/PBS ó con 100 \mul de tampón de lisis (50
nM borato sódico, 0,1% Triton x 100, pH 9,0) respectivamente.
Después de incubar la placa durante 4 h a 37ºC los sobrenadantes
(50 \mul) se transfirieron a pocillos nuevos y se midieron
utilizando un escáner de fluorescencia automatizado (Titertek
Fluoroskan II, Alemania). La citotoxicidad se determinó a partir de
la ecuación siguiente:
\frac{\text{Ensayo F/CTL - F
liberación espontánea}}{\text{F lisis total - F liberación
espontánea}} x 100 = %
citotoxicidad
Se recogieron mediante aféresis células madre
hematopoyéticas después de movilización a partir de médula ósea con
una dosis diaria de 10 \mug/kg/día de rhG-CSF
durante 5 días o a partir de sangre de cordón umbilical (células
madre del cordón umbilical) y enriquecimiento en células CD34+
conseguido con inmunopurificación.
La fracción progenitora multipotente de ambas,
células madre derivadas de médula ósea y derivadas de sangre del
cordón umbilical, presentan una relevancia crítica para la
aplicación clínica. Un problema del transplante actual de células
madre es el bajo número de células madre generadas mediante mezclas
optimizadas de citoquinas. Aún más, un problema crítico para el
éxito a largo plazo es la quiescencia y la maduración de la fracción
progenitora multipotente mediante el tratamiento actual con mezclas
de citoquinas.
Tanto el número de células como la capacidad
proliferativa de las células madre de la médula ósea pueden
mejorarse mediante tratamiento con anticuerpos que inactivan
TGF-\beta1 o con oligonucleótidos antisentido
TGF-\beta1.
De manera sorprendente, una combinación de ambos,
anticuerpos que inactivan TGF-\beta1 y
oligonucleótidos antisentido TGF-\beta1, tuvo un
fuerte efecto supra-aditivo.
Las células madre derivadas de la médula ósea y
de la sangre del cordón umbilical se trataron bien con
- oligonucleótidos antisentido
TGF-\beta1,
o
- anticuerpo neutralizante frente a
TGF-\beta1
o
- una combinación de los dos
o
- ninguno de los dos (controles).
El número de células progenitoras multipotentes
proliferativas se incrementó un 85% con el tratamiento con
oligonucleótidos antisentido TGF-\beta1 comparado
con los controles.
El número de células progenitoras multipotentes
proliferativas se incrementó un 63% con el tratamiento con
anticuerpo neutralizante frente a TGF-\beta1
comparado con los controles.
El número de células progenitoras multipotentes
proliferativas se incrementó más de un 350% con el tratamiento de
una combinación de ambos, anticuerpos que inactivan
TGF-\beta1 y oligonucleótidos antisentido
TGF-\beta1 comparado con los controles.
Una combinación de ambos, péptido que une
TGF-\beta1 y oligonucleótidos antisentido
TGF-\beta1, tuvo un fuerte efecto
supra-aditivo similar en la proliferación de
células progenitoras hematopoyéticas multipotentes
proliferativas.
El número de células progenitoras multipotentes
proliferativas se incrementó un 85% con el tratamiento con
oligonucleótidos antisentido TGF-\beta1 comparado
con los controles.
\newpage
El número de células progenitoras multipotentes
proliferativas se incrementó un 57% con el tratamiento con el
péptido que une TGF-\beta1 comparado con los
controles.
El número de células progenitoras multipotentes
proliferativas se incrementó más de tres veces con el tratamiento
de una combinación de ambos, péptido que une
TGF-\beta1 y oligonucleótidos antisentido
TGF-\beta1 comparado con los controles.
El gen c-erbB-2 (también
llamado p185, HER-2 o neu) está amplificado y/o
expresado por encima de lo normal en 30-45% de los
carcinomas de mama humanos, y hasta un 50% en los carcinomas de
páncreas, cáncer de ovario, carcinomas gástricos, cáncer de pulmón
de células no pequeñas, carcinomas escamosos orales.
Se ha utilizado un anticuerpo que inactiva
cerbB-2 o HER2 con el nombre comercial Herceptin®
para el tratamiento de pacientes con cáncer de pecho. Los estudios
clínicos iniciales mostraron un buen potencial terapéutico, mientras
que los estudios clínicos actuales presentan resultados
controvertidos. Hemos encontrado que una combinación de un inhibidor
de la expresión del gen cerbB-2 con una molécula
que se une al producto del gen cerbB-2 incrementa
el efecto de cada molécula por separado.
Se trataron células de carcinoma de ovario y
células de carcinoma de páncreas bien con
- oligonucleótidos antisentido
c-erbB-2,
o
- anticuerpo neutralizante frente a
c-erbB-2
o
- una combinación de los dos
o
- ninguno de los dos.
La inhibición de la proliferación de las células
tumorales fue de entre 18% y 31% con los oligonucleótidos
antisentido c-erbB-2, entre 13 y 34%
con los anticuerpos, y, sin embargo, más de 85% con una
\hbox{combinación de los dos.}
Inhibición de la síntesis de MIA endógena
mediante un vector de transfección que expresa la secuencia
antisentido:
o partes de esta secuencia en
melanoma humano que secreta MIA, así como en líneas celulares de
cáncer de pecho, redujo su actividad de migración e incrementó su
adhesión a matrices, lo que sugiere un efecto inhibitorio potente
de los inhibidores de MIA en la invasión tumoral y en la
metástasis.
Se lograron efectos
supra-aditivos con una combinación de un péptido que
une MIA con un vector de transfección que expresa la secuencia
antisentido anterior en la reducción de su actividad migratoria,
así como en el incremento de su adhesión a matrices.
También se puede conseguir una inhibición
supra-aditiva combinando un factor de transcripción
o su dominio de unión, unido a una secuencia reguladora de genes de
receptores, enzimas, factores de transcripción, moléculas de
adhesión celular, citoquinas o factores de crecimiento, como
TGF-\beta, MIA, VCAM, ICAM, c-jun,
junB, NF-kappaB, VEGF o integrinas con una molécula
de bajo peso molecular, por ejemplo, derivada mediante química
combinatoria, unida a receptores, enzimas, factores de
transcripción, moléculas de adhesión celular, citoquinas o factores
de crecimiento, como TGF-\beta, MIA, VCAM, ICAM,
c-jun, junB, NF-kappaB, VEGF o
integrinas.
También se puede conseguir una inhibición
supra-aditiva combinando un péptido o una proteína,
unida a los ARNm transcritos de genes de receptores, enzimas,
factores de transcripción, moléculas de adhesión celular, citoquinas
o factores de crecimiento, como TGF-\beta, MIA,
VCAM, ICAM, c-jun, junB, NF-kappaB,
VEGF o integrinas con una molécula de bajo peso molecular unida a
receptores, enzimas, factores de transcripción, moléculas de
adhesión celular, citoquinas o factores de crecimiento, como
TGF-\beta, MIA, VCAM, ICAM, c-jun,
junB, NF-kappaB, VEGF o integrinas.
También se puede conseguir una inhibición
supra-aditiva combinando un péptido, una proteína,
por ejemplo, un factor de transcripción o su dominio de unión,
unida a una secuencia reguladora de genes de receptores, enzimas,
factores de transcripción, moléculas de adhesión celular, citoquinas
o factores de crecimiento, como TGF-\beta, MIA,
VCAM, ICAM, c-jun, junB, NF-kappaB,
VEGF o integrinas con un Spiegelmero unido a receptores, enzimas,
factores de transcripción, moléculas de adhesión celular,
citoquinas o factores de crecimiento, como
TGF-\beta, MIA, VCAM, ICAM, c-jun,
junB, NF-kappaB, VEGF o integrinas.
También se puede conseguir una inhibición
supra-aditiva combinando un factor de transcripción
o su dominio de unión, unido a una secuencia reguladora de genes de
receptores, enzimas, factores de transcripción, moléculas de
adhesión celular, citoquinas o factores de crecimiento, como
TGF-\beta, MIA, VCAM, ICAM, c-jun,
junB, NF-kappaB, VEGF o integrinas con péptidos
unidos a receptores, enzimas, factores de transcripción, moléculas
de adhesión celular, citoquinas o factores de crecimiento, como
TGF-\beta, MIA, VCAM, ICAM, c-jun,
junB, NF-kappaB, VEGF o integrinas.
Las mezclas de los ejemplos 6 a 9 son
especialmente útiles para la expansión de células madre
neuronales.
También se pueden conseguir efectos
supra-aditivos combinando un inhibidor de la
expresión de c-jun con una molécula que se une al
producto del gen c-jun o un derivado de éstos.
Estas mezclas son útiles para la protección de las neuronas frente a
isquemia, hipoxia, degeneración o sobreestimulacion.
Se investigó el efecto de la combinación del
oligonucleótido antisentido TGF-\beta1 y de un
anticuerpo anti TGF-\beta1 en células
hematopoyéticas humanas Stern. Por esta razón, se cultivaron en
primer lugar células humanas CD34-positivas
purificadas de sangre periférica durante 72 horas en un medio que
contiene citoquinas (IL-3, IL-6,
GM-CSF, G-CSF, SCF) sin
oligonucleótidos o en presencia de oligonucleótidos antisentido
TGF-\beta1 o de un control sin sentido.
Posteriormente, en un ensayo HPP-Q (ensayo celular
quiescente con alto potencial proliferativo) las células se
cultivaron adicionalmente con o sin anticuerpo
anti-TGF-\beta1.
El ensayo HPP-Q compara células
cultivadas en un medio control que incluye citoquinas
(IL-3, IL-6, IL-11,
G-CSF, GM-CSF, SCF y Epo) con
células cultivadas en el mismo medio que contiene citoquinas en
presencia de anticuerpo bloqueante
anti-TGF-\beta1. El control revela
a los progenitores que responden a citoquinas, mientras que la
adición de anticuerpo bloqueante de TGF-\beta
induce progenitores quiescentes.
El ensayo HPP-Q se llevó a cabo
como describe el fabricante (StemBio Research, Villejuif, Francia).
Brevemente, se pusieron en placas 1,6 x 10^{4} células en cultivo
en triplicado para cada medio en alícuotas de 1 ml en placas de
tejido de 35 mm. Después de 18 días se contó el número de colonias
(CFU = células más inmaduras).
La Tabla 1 muestra que el antisentido
TGF-\beta1 incrementa más de dos veces el efecto
del anticuerpo anti-TGF-\beta1
(TGF-\beta1 AB) en células CD34 positivas de un
paciente con linfoma, es decir, en presencia de antisentido
TGF-\beta1 el número de células es más del doble
comparado con el anticuerpo solo.
\newpage
| Número de colonias CFU | |
| Control + TGF-\beta1 AC | 17,66 \pm 2,49 |
| Antisentido TGF-\beta1 + TGF-\beta1 AC | 41,33 \pm 2,49 |
La Tabla 2 muestra que el anticuerpo también
amplifica el efecto del antisentido TGF-\beta1 en
células CD34 positivas de dos pacientes con linfoma y un paciente
con mieloma. El número de células conseguido con antisentido
TGF-\beta1 solo se incrementa casi tres veces si
también se añade anticuerpo TGF-\beta1.
| Número de colonias CFU | ||
| Antisentido-TGF-\beta1 | Antisentido-TGF-\beta1 + TGF-\beta1 AC | |
| Linfoma 1 | 19,00 \pm 1,41 | 37,00 \pm 6,48 |
| Linfoma 2 | 24,00 \pm 2,34 | 63,33 \pm 5,31 |
| Mieloma | 23,33 \pm 5,13 | 60,00 \pm 3,45 |
Por lo tanto, la combinación de antisentido
TGF-\beta1 y de anticuerpo
anti-TGF-\beta1 resulta en un
incremento de más de dos veces del número de células comparado con
el antisentido o con el anticuerpo solos.
Claims (10)
1. Una mezcla que comprende al menos un inhibidor
o supresor de la expresión de un gen,
donde dicho al menos un inhibidor o supresor se
selecciona del grupo de oligonucleótido, oligonucleótido
antisentido, ribozima, sus derivados y/o proteínas
y
al menos una molécula que inhibe la actividad
funcional de un producto de la expresión del mencionado gen,
donde dicha al menos una molécula se selecciona
del grupo de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, tales como
fragmentos Fab, anticuerpos de cadena única o combinaciones de
éstos y una molécula de ADN o ARN o un derivado de éstas incluyendo
aptámeros y espiegélmeros que se unen al producto de expresión del
gen.
2. La mezcla de la reivindicación 1, donde el gen
se selecciona del grupo de TGF-\beta,
cerbB-2, MIA, c-jun, junB,
c-fos, VCAM, NF-kappaB p65,
NF-kappaB p50, ICAM, VEGF y NF-kB
2.
3. La mezcla de cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, donde la molécula de oligonucleótido, de
oligonucleótido antisentido y/o de ribozima está integrada en un
sistema de administración de ADN que comprende vectores víricos y/o
no víricos junto a lípidos seleccionados del grupo de lípidos
aniónicos, lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y mezclas de
éstos.
4. La mezcla de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde la molécula del oligonucleótido
antisentido y/o de ribozima está modificada en una o más fracciones
de azúcar, en las bases y/o en las uniones internucleótido y/o
mediante el acoplamiento de la molécula antisentido y/o de ribozima
a un amplificador de la actividad de captación y/o inhibitoria.
5. La mezcla de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde el oligonucleótido tiene una
cualquiera de las secuencias de nucleótido Sec. Id. No 1 a 17.
6. La mezcla de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, donde el anticuerpo, el fragmento de
anticuerpo, tal como un fragmento Fab, el anticuerpo de cadena
única o combinaciones de éstos se derivan del rastreo de bibliotecas
de anticuerpos y del ensayo de los productos de expresión para
detectar su unión a un producto de expresión del gen.
7. La mezcla de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde el péptido y/o la proteína se deriva
del rastreo de una biblioteca de expresión y del ensayo de los
productos de expresión para detectar su unión a un producto de
expresión del gen o se deriva del rastreo de péptidos y/o proteínas
sintetizados al azar para detectar su unión a un producto de
expresión del gen.
8. Un medicamento que comprende la mezcla de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Utilización de la mezcla de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de un
medicamento para tratar tumores, trastornos inmunes, o para mejorar
el transplante de órganos o de células o la expansión celular.
10. Utilización de acuerdo con la reivindicación
9, donde la inhibición del crecimiento tumoral, la mejora del
transplante de órganos o de células, la expansión celular, el
incremento o inhibición de la respuesta inmune, se incrementan de
manera superaditiva.
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