ES2245453T3 - Produccion de fibrinogeno en animales transgenicos. - Google Patents

Produccion de fibrinogeno en animales transgenicos.

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ES2245453T3 ES95912701T ES95912701T ES2245453T3 ES 2245453 T3 ES2245453 T3 ES 2245453T3 ES 95912701 T ES95912701 T ES 95912701T ES 95912701 T ES95912701 T ES 95912701T ES 2245453 T3 ES2245453 T3 ES 2245453T3
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Abstract

SE REVELAN MATERIALES Y METODOS PARA PRODUCIR FIBRINOGENO EN MAMIFEROS NO HUMANOS TRANSGENICOS. LOS SEGMENTOS DE ADN QUE CODIFICAN CADENAS A{AL}, B{BE} Y {GA} DE FIBRINOGENO SON INTRODUCIDOS EN LA LINEA GERMINAL DE UN MAMIFERO NO HUMANO, Y EL MAMIFERO O SU DESCENDENCIA FEMENINA PRODUCE LECHE QUE CONTIENE FIBRINOGENO EXPRESADO DE LOS SEGMENTOS DE ADN INTRODUCIDOS. TAMBIEN SE REVELAN EMBRIONES DE MAMIFEROS NO HUMANOS Y MAMIFEROS NO HUMANOS TRANSGENICOS QUE PORTAN SEGMENTOS DE ADN QUE CODIFICAN CADENAS POLIPEPTIDICAS DE FIBRINOGENO HETEROLOGAS

Description

Producción de fibrinógeno en animales transgénicos.
Antecedentes de la invención
La etapa final en la cascada de coagulación sanguínea es la conversión catalizada por trombina de la proteína plasmática soluble, fibrinógeno, en fibrina insoluble. La trombina escinde un péptido pequeño (fibrinopéptido A) de una de las tres cadenas componentes (la cadena A\alpha) del fibrinógeno. Los monómeros de fibrina se polimerizan posteriormente y se reticulan mediante el factor XIII activado para formar un coágulo estable.
El fibrinógeno es un componente clave de los adhesivos tisulares biológicos (véanse, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. números 4.377.572 y 4.442.655), que imita la formación de los coágulos sanguíneos naturales para estimular la hemostasia y reparar el tejido dañado. Los adhesivos tisulares proporcionan un complemento o alternativa a las suturas, grapas y otros medios mecánicos para el cierre de heridas. Sin embargo, los principales componentes de estos productos (fibrinógeno, factor XIII y trombina) se prepararan a partir de mezclas de plasmas humanos por crioprecipitación (por ejemplo, patentes de los EE.UU. números 4.377.572; 4.362.567; 4.909.251) o precipitación en etanol (por ejemplo, patente de los EE.UU. número 4.442.655) o a partir de plasma de un único donante (por ejemplo, patente de los EE.UU. número 4.627.879; Spotnitz et al., Am. Surg. 55: 166-168, 1989). La preparación resultante de fibrinógeno / factor XIII se mezcla con trombina bovina inmediatamente antes de su uso para convertir el fibrinógeno en fibrina y activar el factor XIII, iniciando así la coagulación del adhesivo.
Los adhesivos comercialmente disponibles tienen como origen la mezcla de plasmas. Dado que los productos derivados de la sangre se han asociado con la transmisión del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la hepatitis y otros agentes etiológicos, la aceptación y la disponibilidad de tales adhesivos es limitada. En la actualidad no están aprobados para su uso en los Estados Unidos.
Aunque el uso de plasma autológo reduce el riesgo de transmisión de enfermedades, los adhesivos autólogos sólo pueden utilizarse en la intervención quirúrgica programada en la que el paciente puede donar la sangre necesaria por adelantado.
Tal como se indicó anteriormente, el fibrinógeno consiste en tres cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales está presente en dos copias en la molécula unida. Estas cadenas, denominadas cadenas A\alpha, B\beta y \gamma, se expresan, se unen y se secretan por el hígado de manera coordinada. Aunque podría esperarse que la tecnología del ADN recombinante podría proporcionar una alternativa al aislamiento del fibrinógeno a partir del plasma, este objetivo ha demostrado ser difícil de alcanzar. Las tres cadenas de fibrinógeno se han expresado individualmente en E. coli (Lord, ADN 4: 33-38, 1985; Bolyard y Lord, Gene 66: 183-192, 1988; Bolyard y Lord, Blood 73: 1202-1206), pero no se ha producido fibrinógeno funcional en un sistema procariota. No se ha informado de expresión de fibrinógeno biológicamente competente en levaduras. Se han utilizado células de mamífero transfectadas en cultivo para expresar fibrinógeno biológicamente activo (Farrell et al., Blood 74: 55a, 1989; Hartwig y Danishefsky, J. Biol. Chem. 266: 6578-6585, 1991; Farrell et al., Biochemistry 30: 9414-9420, 1991), pero los niveles de expresión han sido tan bajos, que la producción de fibrinógeno recombinante en cantidades comerciales no es factible. Las pruebas experimentales sugieren que las tasas de transcripción inferiores en las células en cultivo, en comparación con el hígado, pueden ser un factor en las bajas tasas de expresión logradas hasta la fecha, pero el aumento de la cantidad del ARNm de las cadenas del fibrinógeno en células BHK transfectadas no produjo los aumentos correspondientes en la secreción de la proteína fibrinógeno (Prunkard y Foster, XIV Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (XIV Congreso de la Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasia), 1993). Estos últimos resultados indican que la unión y el procesamiento apropiados del fibrinógeno implican mecanismos específicos de tejido no presentes en las líneas celulares comunes de los laboratorios.
Sigue habiendo una necesidad en la técnica de métodos para producir grandes cantidades de fibrinógeno de alta calidad para su uso en adhesivos tisulares y otras aplicaciones. Además hay una necesidad de fibrinógeno que esté libre de patógenos transmitidos por la sangre. La presente invención cumple estas necesidades y proporciona otras ventajas relacionadas.
Sumario de la invención
Es un objeto de la presente invención proporcionar cantidades comercialmente útiles de fibrinógeno recombinante, particularmente fibrinógeno humano recombinante. Es otro objeto de la invención proporcionar materiales y métodos para expresar fibrinógeno en el tejido mamario de animales transgénicos, particularmente de animales de cría, tales como ganado, ovejas, cerdos y cabras.
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para producir fibrinógeno que comprende (a) proporcionar un primer segmento de ADN que codifica para una señal de secreción operativamente unido a una cadena A\alpha de fibrinógeno, un segundo segmento de ADN que codifica para una señal de secreción operativamente unido a una cadena B\beta de fibrinógeno, y un tercer segmento de ADN que codifica para una señal de secreción operativamente unido a una cadena \gamma de fibrinógeno, en el que cada uno de los segmentos primero, segundo y tercero está operativamente unido a segmentos de ADN adicionales requeridos para su expresión en la glándula mamaria de un mamífero hembra huésped; (b) introducir los segmentos de ADN en un huevo fertilizado de una especie de mamífero no humano; (c) insertar el huevo en un oviducto o útero de una hembra de la especie para obtener descendencia que lleve los constructos de ADN; (d) cruzar la descendencia para producir progenie femenina que exprese los segmentos de ADN primero, segundo y tercero y producir leche que contenga fibrinógeno biocompetente codificado por los segmentos; (e) recoger la leche de la progenie femenina; y (f) recuperar el fibrinógeno de la leche. En una realización, el huevo que contiene los segmentos introducidos se cultiva durante un periodo de tiempo antes de su inserción.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir fibrinógeno que comprende las etapas de (a) incorporar un primer segmento de ADN que codifica para una señal de secreción operativamente unido a una cadena A\alpha de fibrinógeno en un gen de \beta-lactoglobulina para producir una primera fusión génica; (b) incorporar un segundo segmento de ADN que codifica para una señal de secreción operativamente unido a una cadena B\beta de fibrinógeno en un gen de \beta-lactoglobulina para producir una segunda fusión génica; (c) incorporar un tercer segmento de ADN que codifica para una señal de secreción operativamente unido a una cadena \gamma de fibrinógeno en un gen de \beta-lactoglobulina para producir una tercera fusión génica; (d) introducir las fusiones génicas primera, segunda y tercera en la línea germinal de un mamífero no humano de manera que los segmentos de ADN se expresen en una glándula mamaria del mamífero o su progenie femenina y se secrete fibrinógeno biocompetente en la leche del mamífero o su progenie femenina; (e) obtener leche del mamífero o su progenie femenina; y (f) recuperar el fibrinógeno de la leche. En las realizaciones preferidas, el mamífero es una oveja, cerdo, cabra o vaca.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir fibrinógeno que comprende las etapas de (a) proporcionar un mamífero transgénico hembra no humano que lleva en su línea germinal segmentos heterólogos de ADN que codifican para las cadenas de fibrinógeno A\alpha, B\beta y \gamma, en el que los segmentos de ADN se expresan en una glándula mamaria del mamífero y el fibrinógeno codificado por los segmentos de ADN se secreta en la leche del mamífero; (b) recoger la leche del mamífero; y (c) recuperar el fibrinógeno de la leche.
En otro aspecto, la invención proporciona un embrión de mamífero no humano que contiene en su núcleo segmentos heterólogos de ADN que codifican para las cadenas de fibrinógeno A\alpha, B\beta y \gamma. En un aspecto relacionado, la invención proporciona un mamífero transgénico hembra no humano que produce cantidades recuperables de fibrinógeno humano en su leche.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir una descendencia transgénica de un mamífero que comprende las etapas de (a) proporcionar un primer segmento de ADN que codifica para una cadena A\alpha de fibrinógeno, un segundo segmento de ADN que codifica para una cadena B\beta de fibrinógeno, y un tercer segmento de ADN que codifica para una cadena \gamma de fibrinógeno, en el que cada uno de dichos segmentos primero, segundo y tercero está operativamente unido a segmentos adicionales de ADN requeridos para su expresión en la glándula mamaria de un mamífero hembra huésped y la secreción en la leche del mamífero hembra huésped; (b) introducir los segmentos de ADN en un huevo fertilizado de un mamífero de una especie no humana; (c) insertar el huevo en un oviducto o útero de una hembra de la especie no humana para obtener una descendencia que lleve los segmentos de ADN primero, segundo y tercero. En un aspecto relacionado, la invención proporciona mamíferos no humanos producidos según este procedimiento.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un mamífero no humano que lleva en su línea germinal segmentos de ADN que codifican para las cadenas A\alpha, B\beta y \gamma heterólogas de fibrinógeno, en el que la progenie femenina del mamífero expresa los segmentos de ADN en la glándula mamaria para producir fibrinógeno biocompetente.
Éstos y otros aspectos de la invención se harán evidentes para el experto en la técnica con referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 ilustra la subclonación de una secuencia de ADN de la cadena A\alpha del fibrinógeno humano.
La figura 2 es un mapa de restricción parcial del vector Zem228. Los símbolos utilizados son MT-1p,promotor de la metalotioneína de ratón; SV40t, terminador de SV40; y SV40p, promotor de SV40.
La figura 3 ilustra la subclonación de una secuencia de ADN de la cadena B\beta del fibrinógeno humano.
La figura 4 ilustra la subclonación de una secuencia de ADN de la cadena \gamma del fibrinógeno humano.
La figura 5 es un mapa de restricción parcial del vector Zem219b. Los símbolos utilizados son MT-1p, promotor de la metalotioneína de ratón; hGHt, terminador de la hormona de crecimiento humana; SV40p, promotor de SV40; DHFR, gen de la dihidrofolato reductasa; y SV40t, terminador de SV40.
Descripción detallada de la invención
Antes de explicar la invención en detalle, será de utilidad definir ciertos términos utilizados en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, el término "fibrinógeno biocompetente" se usa para indicar fibrinógeno que se polimeriza cuando se trata con trombina para formar fibrina insoluble.
El término "huevo" se usa para indicar un óvulo no fertilizado, un óvulo fertilizado antes de la fusión de los pronúcleos o un embrión en un estadio temprano (óvulo fertilizado con pronúcleos fusionados).
Un "mamífero hembra que produce leche que contiene fibrinógeno biocompetente" es uno que, tras el periodo de gestación y el parto, produce, durante el periodo de lactancia, leche que contiene cantidades recuperables de fibrinógeno biocompetente. Los expertos en la técnica reconocerán que tales animales producirán leche y, por tanto el fibrinógeno, de manera discontinua.
El término "progenie" se usa en su sentido usual para incluir hijos y descendientes.
El término "heterólogo" se usa para indicar el material genético que se origina a partir de una especie diferente a aquella en la que se ha introducido, o una proteína producida a partir de tal material genético.
En la presente invención, se emplea la tecnología de animales transgénicos para producir fibrinógeno en las glándulas mamarias de un mamífero hembra huésped. La expresión en la glándula mamaria y la posterior secreción de la proteína de interés en la leche supera muchas dificultades encontradas en el aislamiento de proteínas a partir de otras fuentes. La leche se recoge fácilmente, está disponible en grandes cantidades y está bien caracterizada bioquímicamente. Además, las principales proteínas de la leche están presentes en la leche en altas concentraciones (desde aproximadamente 1 hasta 15 g/l).
Desde un punto de vista comercial, es claramente preferible utilizar como huésped una especie que tenga una gran producción de leche. Aunque pueden utilizarse animales más pequeños, tales como ratones y ratas (y se prefieren en la fase de prueba de concepto), en la presente invención se prefieren utilizar animales de cría incluyendo, pero sin limitarse a, cerdos, cabras, ovejas y ganado. Las ovejas son particularmente preferidas debido a factores tales como la historia anterior de transgénesis en esta especie, la producción de leche, el coste y la fácil disponibilidad del equipo para recoger leche de oveja. Véase el documento WO 88/00239 para una comparación de los factores que influyen en la elección de las especies huésped. Generalmente es deseable seleccionar una raza de animal huésped que se haya criado para el la obtención de leche, tal como las ovejas East Friesland, o para introducir las reservas de leche cruzando la línea transgénica en una fecha posterior. En cualquier caso, deben utilizarse animales con un buen estado de salud conocido.
El fibrinógeno producido según la presente invención puede ser fibrinógeno humano o fibrinógeno de un animal no humano. Para usos médicos, se prefiere emplear proteínas naturales para los pacientes. La presente invención proporciona así fibrinógeno para su uso tanto en medicina humana como veterinaria. Se describen moléculas de ADN clonadas que codifican para las cadenas componentes del fibrinógeno humano por Rixon et al. (Biochem. 22: 3237, 1983), Chung et al. (Biochem. 22: 3244, 1983), Chung et al. (Biochem. 22: 3250, 1983), Chung et al. (Adv. Exp. Med. Biol. 281: 39-48, 1990) y Chung et al. (Ann. NY Acad. Sci. 408: 449-456, 1983). Se describen clones de fibrinógeno bovino por Brown et al. (Nuc. Acids Res. 17: 6397, 1989) y Chung et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1466-1470, 1981). Otros clones de fibrinógeno de mamífero se describen por Murakawa et al. (Thromb. Haemost. 69: 351-360, 1993). Secuencias representativas de los genes de las cadenas A\alpha, B\beta y \gamma humanas se muestran en las SEQ ID Nº: 1, 3 y 5, respectivamente. Los expertos en la técnica reconocerán que existirán variantes alélicas de estas secuencias; que pueden generarse variantes adicionales mediante sustitución, deleción o inserción de aminoácidos; y que tales variantes son útiles en la presente invención. En general, se prefiere que cualquier variante obtenida por ingeniería genética comprenda sólo un número limitado de sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos, y que cualquier sustitución es conservativa. Por tanto, para producir polipéptidos de cadenas de fibrinógeno se prefiere que al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, y más preferiblemente el 99% o más sea idéntico en secuencia a las cadenas naturales correspondientes. El término "cadena \gamma" pretende incluir una cadena \gamma' de fibrinógeno con corte y empalme alternativos (Chung et al., Biochem. 23:4232-4236, 1984). Se muestra una secuencia de aminoácidos de la cadena \gamma' humana en la SEQ ID Nº: 6. La cadena \gamma más corta se produce mediante cortes y empalmes alternativos en los nucleótidos 9511 y 10054 de la SEQ ID Nº: 5, dando como resultado una terminación de la traducción tras el nucleótido 10065 de la SEQ ID Nº: 5.
Para obtener la expresión en la glándula mamaria, se utiliza un promotor de la transcripción de un gen de una proteína de la leche. Los genes de proteínas de la leche incluyen aquellos genes que codifican para caseínas, beta-lactoglobulina (BLG), \alpha-lactoalbúmina y la proteína ácida del suero. Se prefiere el promotor de la beta-lactoglobulina. En el caso del gen de la beta-lactoglobulina ovina, generalmente se utilizará una región de al menos las 406 pb proximales de la secuencia flanqueante en 5' del gen de la BLG ovina (contenida dentro de los nucleótidos 3844 a 4257 de la SEQ ID Nº: 7). Se prefieren partes más grandes de la secuencia flanqueante en 5', de hasta aproximadamente 5 kpb. Se prefiere particularmente un segmento de ADN más grande que engloba la región del promotor flanqueante en 5' y la región que codifica para la parte no codificante en 5' del gen de la beta-lactoglobulina (contenida dentro de los nucleótidos 1 a 4257 de la SEQ ID Nº: 7). Véase Whitelaw et al., Biochem J. 286: 31-39, 1992. También son adecuados fragmentos similares de ADN promotor de otras especies.
También pueden incorporarse otras regiones del gen de la beta-lactoglobulina en constructos, como pueden ser regiones genómicas del gen que va a expresarse. Generalmente se acepta en la técnica que los constructos que carecen de intrones, por ejemplo, se expresan escasamente en comparación con los que contienen tales secuencias de ADN (véanse Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836-840, 1988; Palmiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478-482, 1991; Whitelaw et al., Transgenic Res. 1: 3-13, 1991; documento WO 89/01343; documento WO 91/02318). A este respecto, generalmente se prefiere, cuando es posible, utilizar secuencias genómicas que contienen todos o algunos de los intrones naturales de un gen que codifica para la proteína o polipéptido de interés. En ciertas realizaciones de la invención, se prefiere la inclusión adicional de al menos algunos intrones del gen de la beta-lactoglobulina. Una de tales regiones es un segmento de ADN que proporciona un corte y empalme de intrones y una poliadelinación de ARN desde la región no codificante en 3' del gen de la beta-lactoglobulina ovina. Cuando se sustituye por las secuencias no codificantes naturales en 3' de un gen, este segmento de beta-lactoglobulina ovina puede aumentar y estabilizar los niveles de expresión de la proteína o el polipéptido de interés. En otras realizaciones, la región que rodea el ATG de iniciación de una o más de las secuencias de fibrinógeno se sustituye por las secuencias correspondientes de un gen de proteína específica de la leche. Tal sustitución proporciona un supuesto entorno de iniciación específico de tejido para aumentar la expresión. Es conveniente sustituir las secuencias no codificantes en 5' y prepro en la cadena del fibrinógeno completa por las de, por ejemplo, el gen de la BLG, aunque pueden sustituirse regiones más
pequeñas.
Para la expresión del fibrinógeno, los segmentos de ADN que codifican para cada una de las tres cadenas polipeptídicas componentes del fibrinógeno están operativamente unidas a segmentos adicionales de ADN necesarios para su expresión para producir unidades de expresión. Tales segmentos adicionales incluyen el promotor del gen de la proteína de la leche mencionado anteriormente, así como secuencias que proporcionan la terminación de la transcripción y la poliadenilación del ARNm. Las unidades de expresión incluirán además un segmento de ADN que codifica para una señal de secreción operativamente unido al segmento que codifica para la cadena polipeptídica del fibrinógeno. La señal de secreción puede ser una señal de secreción de fibrinógeno natural o puede ser la de otra proteína, tal como una proteína de la leche. El término "señal de secreción" se usa en el presente documento para indicar aquella parte de una proteína que la dirige a través de la ruta secretora de una célula hacia el exterior. Las señales de secreción se encuentran lo más comúnmente en el extremo amino-terminal de las proteínas. Véanse, por ejemplo, von Heinje, Nuc. Acids Res. 14: 4683-4690, 1986; y Meade et al., patente de los EE.UU. número 4.873.316, que se incorporan como referencia al presente documento.
La construcción de unidades de expresión se lleva a cabo convenientemente mediante la inserción de una secuencia de cadena de fibrinógeno en un vector de fago o plásmido que contiene los segmentos de ADN adicionales, aunque la unidad de expresión puede construirse esencialmente mediante cualquier secuencia de ligaciones. Es particularmente conveniente proporcionar un vector que contenga un segmento de ADN que codifique para una proteína de la leche y que sustituya la secuencia codificante para la proteína de la leche por la de una cadena de fibrinógeno (que incluye una señal de secreción), creando así una fusión génica que incluye las secuencias de control de la expresión del gen de la proteína de la leche. En cualquier caso, la clonación de las unidades de expresión en plásmidos u otros vectores facilita la amplificación de las secuencias de fibrinógeno. La amplificación se lleva a cabo convenientemente en células huésped bacterianas (por ejemplo, E. coli) por lo que los vectores incluirán normalmente un origen de replicación y un marcador de selección funcional en las células huésped bacterianas.
En vista del tamaño de los genes de las cadenas de fibrinógeno, lo más práctico es preparar tres unidades de expresión separadas, mezclarlas, e introducir la mezcla en el huésped. Sin embargo, los expertos en la técnica reconocerán que pueden seguirse otros protocolos. Por ejemplo, pueden introducirse unidades de expresión para las tres cadenas individualmente en embriones diferentes para combinarse posteriormente en la reproducción. En un tercer enfoque, las tres unidades de expresión pueden unirse en un único vector adecuado, tal como un clon del fago P1 o cromosoma artificial de levadura. Pueden combinarse las secuencias codificantes para dos o tres cadenas en unidades de expresión policistrónicas (véase, por ejemplo, Levinson et al., patente de los EE.UU. número 4.713.339).
La(s) unidad(es) de expresión se introduce(n) entonces en huevos fertilizados (incluyendo embriones en un estadio temprano) de las especies huésped escogidas. La introducción de ADN heterólogo puede llevarse a cabo mediante una de varias vías, incluyendo microinyección (por ejemplo, patente de los EE.UU. número 4.873.191), infección retroviral (Jaenisch, Science 240: 1468-1474, 1988) o integración dirigida al sitio utilizando células madre embrionarias (ME) (revisado por Bradley et al., Bio/Technology 10: 534-539, 1992). Los huevos se implantan entonces en los oviductos o los úteros de hembras seudopreñadas y se deja que se desarrollen hasta término. La descendencia que lleva el ADN introducido en una línea germinal puede pasar el ADN a su progenie de la forma mendeliana normal, lo que permite el desarrollo de rebaños transgénicos. Los procedimientos generales para producir animales transgénicos se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6: 179-183, 1988; Wall et al., Biol. Reprod. 32: 645-651, 1985; Buhler et al., Bio/Technology 8: 140-143, 1990; Ebert et al., Bio/Technology 9: 835-838, 1991; Krimpenfort et al., Bio/Technology 9: 844-847, 1991; Wall et al., J. Cell. Biochem. 49: 113-120, 1992; y las publicaciones de la OMPI, WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; y GB 87/00458, que se incorporan como referencia al presente documento. Las técnicas para introducir secuencias de ADN exógeno en mamíferos y sus células germinales se desarrollaron originalmente en el ratón. Véase, por ejemplo, Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384, 1980; Gordon y Ruddle, Science 214: 1244-1246, 1981; Palmiter y Brinster, Cell 41: 343-345, 1985; Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442, 1985; y Hogan et al. (ibid.). Estas técnicas se adaptaron posteriormente para su uso con animales más grandes, incluyendo especies de animales de cría (véase, por ejemplo, las publicaciones de la OMPI WO 88/00239, WO 90/05188 y WO 92/11757; y Simons et al., Bio/Technology 6: 179-183, 1988). En resumen, en la vía más eficaz utilizada hasta la fecha en la generación de ratones o animales de cría transgénicos, varios cientos de moléculas lineales del ADN de interés se inyectan en uno de los pronúcleos de un huevo fertilizado. También puede emplearse la inyección de ADN en el citoplasma de un zigoto.
Se prefiere obtener una expresión equilibrada de cada cadena de fibrinógeno para permitir la formación eficaz de la proteína madura. Idealmente, las tres unidades de expresión deben estar en la misma molécula de ADN para su introducción en los huevos. Este enfoque, sin embargo, puede generar problemas técnicos, por ejemplo, en las fases de inyección y manipulación. Por ejemplo, el tamaño de las unidades de expresión del fibrinógeno puede necesitar la utilización de cromosomas artificiales de levadura (YAC) o el fago P1 para amplificar y manipular el ADN antes de la inyección. Si se sigue este enfoque, los segmentos de ADN que van a inyectarse, que contienen las tres unidades de expresión, serían muy grandes, requiriendo así la modificación del procedimiento de inyección utilizando, por ejemplo, agujas de mayor calibre. En un enfoque más simple, se utiliza una mezcla de cada unidad de expresión individual. Se prefiere combinar cantidades equimolares de las tres unidades de expresión, aunque los expertos en la técnica reconocerán que esta razón puede variarse para compensar las características de una unidad de expresión dada. Se obtendrá cierta expresión, generalmente un nivel reducido, cuando se utilicen cantidades molares inferiores de una o dos cadenas, y puede esperarse que las eficacias de expresión disminuyan generalmente en una proporción aproximada a la divergencia de la razón equimolar preferida. En cualquier caso, se prefiere utilizar una mezcla que tiene una razón de unidades de expresión A\alpha: B\beta: \gamma en el intervalo de 0,5-1 : 0,5-1 : 0,5-1. Cuando la razón se varía de la cantidad equimolar, se prefiere emplear relativamente más cantidad de la unidad de expresión B\beta. Alternativamente, se introduce una o una mezcla de dos de las unidades de expresión en huevos individuales. Sin embargo, los animales derivados de este enfoque sólo expresarán una o dos cadenas de fibrinógeno. Para generar una molécula de fibrinógeno intacta mediante este enfoque se requiere un programa de reproducción posterior diseñado para combinar las tres unidades de expresión en los individuos de un grupo de animales.
En general, se somete a los animales hembra a superovulación mediante el tratamiento con hormona estimuladora del folículo, y después se aparean. Los huevos fertilizados se recogen y se inyecta el ADN heterólogo en los huevos utilizando métodos conocidos. Véanse, por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 4.873.191; Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384, 1980; Gordon y Ruddle, Science 214: 1244-1246, 1981; Palmiter y Brinster, Cell 41: 343-345, 1985; Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442, 1985; Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al. Bio/Technology 6: 179-183, 1988; Wall et al., Biol. Reprod. 32: 645-651, 1985; Buhler et al., Bio/Technology 8: 140-143, 1990; Ebert et al., Bio/Technology 9: 835-838, 1991; Krimpenfort et al., Bio/ Technology 9: 844-847, 1991; Wall et al., J. Cell. Biochem. 49: 113-120, 1992; las publicaciones de la OMPI WO 88/00239, WO 90/05118 y WO 92/11757; y el documento GB 87/00458, que se incorporan como referencia al presente documento.
Para la inyección en los huevos fertilizados, las unidades de expresión se extraen de sus vectores respectivos mediante digestión con enzimas de restricción apropiadas. Por conveniencia, se prefiere diseñar los vectores de manera que las unidades de expresión se extraigan por escisión con enzimas que no corten ni dentro de las unidades de expresión ni en cualquier otro sitio de los vectores. Las unidades de expresión se recuperan mediante métodos convencionales, tales como electroelución seguida por extracción con fenol y precipitación con etanol, centrifugación con gradiente de densidad de sacarosa o combinaciones de estos enfoques.
El ADN se inyecta en los huevos esencialmente tal como se describe en Hogan et al., ibid. En una inyección habitual, los huevos en una placa de un medio de cultivo embrionario se localizan utilizando un microscopio estereoscópico con zoom (se prefiere de x50 o x63 aumentos). Medios adecuados incluyen Hepes (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico) o medios tamponados con bicarbonato tales como M2 o M16 (disponible de Sigma Chemical Co., St. Louis, EE.UU.) o un medio de oviducto sintético (descrito más adelante). Los huevos se fijan y se transfieren al centro de un portaobjetos de vidrio en un equipo de inyección utilizando, por ejemplo, una pipeta Drummond completa con tubo capilar. En esta fase se utiliza la observación a menor aumento (por ejemplo, x4). Utilizando la pipeta de sujeción del equipo de inyección, los huevos se colocan en el centro del portaobjetos. Los huevos individuales se fijan secuencialmente a la pipeta de sujeción para su inyección. Para cada proceso de inyección, la pipeta de sujeción / huevo se sitúa en el centro del campo de visión. La aguja de inyección se coloca entonces directamente por debajo del huevo. Preferiblemente mediante el uso de objetivos Nomarski x40, se ajustan ambas alturas del manipulador para enfocar tanto al huevo como a la aguja. Los pronúcleos se localizan haciendo girar el huevo y ajustando el montaje de pipeta de sujeción, según sea necesario. Una vez localizado el pronúcleo, se modifica la altura del manipulador para enfocar la membrana pronuclear. La aguja de inyección se coloca por debajo del huevo, de tal manera que la punta de la aguja esté en una posición por debajo del centro del pronúcleo. La posición de las agujas se modifica entonces utilizando el montaje de manipulador de inyección para llevar la aguja y el pronúcleo al mismo plano focal. La aguja se mueve, mediante la palanca de mando del montaje de manipulador de inyección, hasta una posición a la derecha del huevo. Con un corto movimiento de pinchazo continuo, la membrana pronuclear se perfora para dejar la punta de la aguja dentro del pronúcleo. Se aplica presión a la aguja de inyección mediante la jeringa de vidrio hasta que el pronúcleo se hincha hasta aproximadamente el doble de su volumen. En este punto, la aguja se extrae lentamente. Volviendo a la ampliación inferior (por ejemplo, x4), el huevo inyectado se mueve hasta una zona diferente del portaobjetos y el proceso se repite con otro huevo.
Una vez inyectado el ADN, los huevos pueden cultivarse para permitir que los pronúcleos se fusionen, produciendo embriones de una célula o en estadios posteriores. En general, los huevos se cultivan a aproximadamente la temperatura corporal de la especie utilizada en un medio tamponado que contiene sales equilibradas y suero. Los embriones supervivientes se transfieren entonces a hembras receptoras seudopreñadas, normalmente insertándolos en el oviducto o el útero, y permitiendo que se desarrollen hasta término. Durante la embriogénesis, el ADN inyectado se integra de una forma aleatoria en los genomas de un pequeño número de embriones en desarrollo.
La posible descendencia transgénica se selecciona mediante muestras de sangre y/o biopsias tisulares. Se prepara ADN a partir de estas muestras y se examina para determinar la presencia del constructo inyectado mediante técnicas tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; véase Mullis, patente de los EE.UU. número 4.683.202) e inmunotransferencia (Southern blotting) (Southern, J. Mol. Biol. 98:503, 1975; Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Los animales transgénicos fundadores, o G0, pueden ser completamente transgénicos, teniendo transgenes en todas sus células, o mosaico, teniendo transgenes sólo en un subconjunto de células (véase, por ejemplo, Wilkie et al., Develop. Biol. 118: 9-18, 1986). En este último caso, grupos de células germinales pueden ser completa o parcialmente transgénicas. En este último caso, el número de progenie transgénica procedente de un animal fundador será inferior al 50% esperado, previsto por los principios mendelianos. Los animales fundadores G0 se hacen crecer hasta la madurez sexual y se aparean para obtener una descendencia, o G1. Los G1 también se examinan para determinar la presencia del transgén, para demostrar la transmisión desde los animales fundadores G0. En el caso de los machos G0, éstos pueden aparearse con varias hembras no transgénicas para generar mucha descendencia. Esto aumenta las posibilidades de observar la transmisión del transgén. Los animales fundadores hembra G0 pueden aparearse naturalmente, inseminarse artificialmente o someterse a superovulación para obtener muchos huevos que se transfieren a madres portadoras. Este último curso ofrece la mejor posibilidad de observar la transmisión en animales que tienen un número limitado de crías. Los procedimientos de reproducción descritos anteriormente se utilizan para obtener animales que pueden pasar el ADN a las generaciones posteriores de descendencia de la forma mendeliana normal, permitiendo el desarrollo, por ejemplo, de colonias (ratones), rebaños (ovejas, cabras), piaras (cerdos), o manadas (ganado) de animales transgénicos.
La leche de las hembras G0 y G1 durante el periodo de lactancia se examina para determinar la expresión de la proteína heteróloga usando técnicas inmunológicas, tales como ELISA (véase Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) e inmunotransferencia (Western blotting) (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354, 1979). Por diversas razones conocidas en la técnica, se esperará que los niveles de expresión de la proteína heteróloga difieran entre los individuos.
Una familia satisfactoria de animales debe satisfacer tres criterios: deben derivarse del mismo animal fundador G0; deben mostrar la transmisión estable del transgén; y deben mostrar niveles de expresión estables de generación en generación y de un periodo de lactancia a otro de los animales individuales. Estos principios se han demostrado y tratado (Carver et al., Bio/Technology 11: 1263-1270, 1993). Los animales de tal familia adecuada se denominan "línea". Inicialmente se utilizan animales macho, G0 o G1, para obtener un rebaño o manada de animales productores mediante inseminación natural o artificial. De esta forma, pueden generarse rápidamente muchos animales hembra que contienen el mismo acontecimiento de integración del transgén a partir del cual puede obtenerse un suministro de leche.
El fibrinógeno se recupera de la leche utilizando prácticas habituales tales como técnicas de desnatado, precipitación, filtración y cromatografía de proteínas.
El fibrinógeno producido según la presente invención es útil en la medicina humana y veterinaria, tal como en la formulación de adhesivos quirúrgicos. Adhesivos de este tipo se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. número 4.377.572; 4.442.655; 4.462.567 y 4.627.879, que se incorporan como referencia al presente documento. En general, el fibrinógeno y el factor XIII se combinan para formar un primer componente que se mezcla justo antes de su uso con un segundo componente que contiene trombina. La trombina convierte el fibrinógeno en fibrina, haciendo que la mezcla gelifique, y activa el factor XIII. El factor XIII activado retícula la fibrina para fortalecer y estabilizar la matriz adhesiva. Tales adhesivos contienen normalmente desde aproximadamente 30 mg/ml hasta aproximadamente 100 mg/ml de fibrinógeno y desde aproximadamente 50 \mug/ml hasta aproximadamente 500 \mug/ml de factor XIII. También pueden contener componentes adicionales, tales como aprotinina, albúmina, fibronectina, agentes de carga y solubilizadores. Se conocen en la técnica métodos para producir el factor XIII. Véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 5.204.447. El fibrinógeno también es útil para recubrir superficies de artículos poliméricos, por ejemplo, injertos vasculares sintéticos, tal como se describe en la patente de los EE.UU. número 5.272.074 (incorporada como referencia al presente documento).
La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo I
El sitio de clonación múltiple del vector pUC18 (Yanisch-Perron et al., Gene 33:103-119, 1985) se eliminó y se sustituyó por un oligonucleótido sintético de doble cadena (cadenas que se muestran en SEQ ID Nº: 8 y SEQ ID Nº: 27) que contiene los sitios de restricción Pvu I / Mlu I / Eco RV / Xba I / Pvu I / Mlu I, y que está flanqueado por proyecciones en 5' compatibles con los sitios de restricción Eco RI y Hind III. pUC18 se escindió tanto con Eco RI como con Hind III, los grupos fosfatos terminales en 5' se eliminaron con fosfatasa intestinal de ternero y el oligonucleótido se ligó en la estructura del vector. La secuencia de ADN a lo largo de la unión se confirmó mediante secuenciación y el nuevo plásmido se denominó pUCPM.
Las secuencias del gen de la \beta-lactoglobulina (BLG) procedentes de pSS1tgXS (descritas en la publicación de la OMPI WO 88/00239) se escindieron como un fragmento Sal I - Xba I y se volvieron a clonar en el vector pUCPM que se había cortado con Sal I y Xba I para construir el vector pUCXS. Por tanto, pUCXS es un derivado de pUC18 que contiene el gen entero de la BLG desde el sitio Sal I hasta el sitio Xba I del fago SS1 (Ali y Clark, J. Mol. Biol. 199: 415-426, 1988).
El plásmido pSS1tgSE (descrito en la publicación de la OMPI WO 88/00239) contiene un fragmento de 1290 pb de la BLG flanqueado por los sitios de restricción Sph I y EcoR I, una región que abarca un único sitio Not I y un único sitio Pvu II que se encuentra en la secuencia líder no traducida en 5' del ARNm de la BLG. En este sitio Pvu II se ligó un ADN conector de doble cadena, de 8 pb (5'-GGATATCC-3') que codifica para el sitio de reconocimiento para la enzima Eco RV. Este plásmido se denominó pSS1tgSE/RV. Las secuencias de ADN unidas mediante los sitios de restricción Sph I y Not I en pSS1tgSE/RV se escindieron mediante digestión enzimática y se utilizaron para sustituir el fragmento equivalente en pUCXS. El plásmido resultante se denominó pUCXSRV. La secuencia del inserto de la BLG en pUCSXRV se muestra en SEQ ID Nº: 7, con el único sitio Eco RV en el nucleótido 4245 en la región líder no traducida en 5' del gen de la BLG. Este sitio permite la inserción de cualquier secuencia adicional de ADN bajo el control del promotor en 3' de la BLG para el sitio de iniciación de la transcripción.
Utilizando los cebadores BLGAMP3 (5'-TGG ATC CCC TGC CGG TGC CTC TGG-3'; SEQ ID Nº: 9) y BL
GAMP4 (5'-AAC GCG TCA TCC TCT GTG AGC CAG-3'; SEQ ID Nº: 10) se produjo por PCR un fragmento de aproximadamente 650 pb a partir de las secuencias inmediatamente en 3' hasta el codón de terminación del gen de la BLG en pUCXSRV. El fragmento por PCR se modificó por ingeniería genética para tener un sitio BamH I en su extremo 5' y un sitio Mlu I en su extremo 3' y se clonó como tal en pGEM7zf(+) (Promega) cortado en BamH I y Mlu I para dar pDAM200(+).
pUCXSRV se sometió a digestión con Kpn I, y la banda más grande que contenía el vector se purificó en gel. Esta banda contenía las secuencias enteras del plásmido pUC y algunas secuencias no codificantes en 3' del gen de la BLG. En esta estructura, se ligó el pequeño fragmento Kpn I de pDAM200(+) que, en la orientación correcta, dio lugar eficazmente por ingeniería genética a un sitio BamH I en el extremo 5' de las 2,6 Kpb de la región flanqueante en 3' de BLG. Este plásmido se denominó pBLAC200. Un fragmento de 2,6 Kpb Cla I - Xba I procedente de pBLAC200 se ligó en el vector pSP72 (Promega) cortado en Cla I - Xba I, colocando así un sitio EcoR V inmediatamente en sentido 5' de las secuencias de la BLG. Este plásmido se denominó pBLAC210.
El fragmento Eco RV - Xba I de 2,6 Kpb procedente de pBLAC210 se ligó en pUCXSRV cortado en Eco RV - Xba I para formar pMAD6. En efecto, éste se escindió en todas las secuencias codificantes y de intrón de pUCXSRV, formando un minigén de BLG que consistía en 4,3 Kpb del promotor en 5' y en 2,6 Kpb de las secuencias en el sentido 3' que flanquean un único sitio EcoR V. Se insertó un oligonucleótido conector (ZC6839: ACTACGTAGT; SEQ ID Nº: 11) en el sitio Eco RV de pMAD6. Esta modificación destruyó el sitio Eco RV y creó un sitio Sna BI para utilizarse con fines de clonación. El vector se designó pMAD6-Sna. El ARN mensajero se inicia en el sentido 5' del sitio Sna BI y termina en el sentido 3' del sitio Sna BI. El transcrito precursor codificará para un único intrón derivado de BLG, el intrón 6, que está completamente dentro de la región no traducida en 3' del gen.
Ejemplo II
Se obtuvieron clones que codifican para cadenas de fibrinógeno individuales del laboratorio del Dr. Earl W. Davie, Universidad de Washington, Seattle. Se obtuvo un clon genómico de la cadena A\alpha del fibrinógeno (Chung et al., 1990, ibid.) a partir del plásmido BS4. Este plásmido contiene el clon A\alpha insertado en los sitios Sal I y Bam HI del vector pUC18, pero carece de la secuencia codificante para los primeros cuatro aminoácidos de la cadena A\alpha. Se aisló un ADN genómico de la cadena B\beta (Chung et al., ibid.) de un clon del fago lambda Charon 4A (denominado \beta\lambda4) como dos fragmentos de EcoRI de aproximadamente 5,6 Kpb cada uno. Los dos fragmentos se clonaron por separado en pUC19 que se había digerido con Eco RI y se había tratado con fosfatasa intestinal de ternero. Los clones resultantes se seleccionaron mediante la digestión con la enzima de restricción Pvu II para distinguir los plásmidos con los insertos B\beta en 5' y 3' (denominados Beta5'RI/puc y Beta3'RI/puc, respectivamente). Se aislaron clones genómicos de la cadena \gamma tal como se describe en Rixon et al. (Biochemistry 24: 2077-2086, 1985). El clon p\gamma12A9 comprende secuencias no codificantes en 5' y aproximadamente 4535 pb de la secuencia codificante para la cadena \gamma. El clon p\gamma12F3 comprende la secuencia codificante restante y los nucleótidos no codificantes en 3'. Ambos son plásmidos basados en pBR322 con las secuencias del fibrinógeno insertadas en el sitio EcoRI. Estos plásmidos se utilizaron como moldes para las reacciones de PCR respectivas.
Se obtuvieron las secuencias codificantes de la cadena de fibrinógeno para su inserción en vectores de expresión utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tal como describe generalmente Mullis (patente de los EE.UU. número 4.683.202). Este procedimiento eliminó las secuencias naturales no traducidas en 5' y 3', añadió una secuencia de 9 bases (CCT GCA GCC) en el sentido 5' del primer ATG de cada secuencia codificante, suministró los primeros cuatro codones para la secuencia de la cadena A\alpha, eliminó un sitio Mlu I interno en la secuencia de A\alpha y añadió los sitios de restricción para facilitar las etapas de clonación posteriores.
En referencia a la figura 1, el extremo 5' de la secuencia codificante de A\alpha se obtuvo en una reacción de PCR que contenía 20 pmol de cada uno de los cebadores ZC6632 (SEQ ID Nº: 12) y ZC6627 (SEQ ID Nº: 13), aproximadamente 10 ng del ADN molde del plásmido BS4, 10 \mul de una mezcla que contenía 2,5 mM de cada dNTP, 7,5 \mul 10x de tampón nº 1 de ADN polimerasa de Pyrococcus furiosus (Pfu) (Tris-HCl 200 mM, pH 8,2, KCl 100 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 60 mM, MgCl_{2} 20 mM, 1% de Triton X-100, 100 \mug/ml de albúmina sérica bobina libre de nucleasa) (Stratagene, La Jolla, CA), y agua hasta 75 \mul. La mezcla se calentó hasta 94ºC en un ciclador térmico de ADN (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT). A la mezcla calentada se añadieron 25 \mul de una mezcla que contenía 2,5 \mul 10x de tampón nº1 de Pfu, 22 \mul de H_{2}O and 1 \mul de 2,5 unidades/\mul de ADN polimerasa de Pfu (Stratagene). Las reacciones se dejaron transcurrir en un ciclador térmico de ADN (Perkin-Elmer) durante cinco ciclos de 94º, 45 segundos; 40º, 90 segundos; 72º, 120 segundos; 20 ciclos de 94º, 45 segundos; 45º, 90 segundos; 72º, 120 segundos; después se incubaron a 72º durante 7 minutos. El fragmento generado por PCR en 5' se sometió a digestión con Bam HI y Hind III, y el fragmento Bam
HI - Hind III se ligó entonces a un fragmento interno Hind III - Xba I de 2,91 Kpb y pUC18 digerido con Bam HI, Xba I. Se secuenciaron las secuencias de exón generadas por PCR.
En referencia de nuevo a la figura 1, el extremo 3' de la secuencia codificante de A\alpha se obtuvo en una serie de etapas en las que se mutaron las 563 bases del sitio Mlu I en el sentido 5' desde el codón de terminación de la secuencia A\alpha utilizando una reacción de PCR de extensión por solapamiento (Ho et al., Gene 77: 51-59, 1989). En la primera reacción se combinaron 40 pmol de cada uno de los cebadores ZC6521 (SEQ ID Nº: 14) y ZC6520 (SEQ ID Nº: 15) con aproximadamente 10 ng del ADN molde del plásmido BS4 en una mezcla de reacción tal como se describió anteriormente. La reacción se dejó transcurrir durante 5 ciclos de 94º, 45 segundos; 40º, 60 segundos; 72º, 120 segundos; 15 ciclos de 94º, 45 segundos; 45º, 60 segundos; 72º, 120 segundos; después se incubó a 72º durante 7 minutos. Se llevó a cabo una segunda reacción de la misma manera utilizando 40 pmol de cada uno de los cebadores ZC6519 (SEQ ID Nº: 16) y ZC6518 (SEQ ID Nº: 17) y BS4 como molde. Los fragmentos de ADN generados por PCR a partir de las reacciones primera y segunda se aislaron mediante electroforesis en gel y elución desde el gel. Aproximadamente 1/10 de cada producto de reacción recuperado se combinó con 40 pmol de cada uno de los cebadores ZC6521 (SEQ ID Nº: 14) y ZC6518 (SEQ ID Nº: 17) en una reacción de PCR en la que los extremos 3' complementarios de cada fragmento (que contenía el único cambio de base) hibridaron y sirvieron como cebador para la extensión en 3' de la cadena complementaria. Se llevó a cabo la PCR utilizando las mismas condiciones de reacción que en las etapas primera y segunda de la PCR en 3'. El producto de reacción se sometió entonces a digestión con Xba I y Bam HI, y el fragmento Xba I - Bam HI se clonó en pUC18 digerido con Xba I, Bam HI. Se secuenciaron los exones generados por PCR.
Tal como se muestra en la figura 1, el fragmento Bam HI - Xba I (3,9 Kpb) en 5' y el fragmento Xba I - Bam HI (1,3 Kpb) en 3' se insertaron en el sitio Bam HI del vector Zem228. Zem228 es un derivado de pUC18 que comprende un sitio de clonación Bam HI entre un promotor de ratón MT-1 y el terminador de SV40, y un marcador de resistencia a neomicina flanqueado por el promotor de SV40 y las secuencias de terminación. Véase la publicación de la Oficina Europea de Patentes EP 319.944 y la figura 2. La totalidad de la secuencia codificante de A\alpha se aisló a partir del vector Zem228 como un fragmento Sna BI, que se insertó en el sitio Sna BI del plásmido pMAD6-Sna.
En referencia a la figura 3, el extremo 5' de la cadena B\beta se obtuvo mediante PCR utilizando los oligonucleótidos ZC6629 (SEQ ID NO: 18), ZC6630 (SEQ ID Nº: 19) y ZC6625 (SEQ ID Nº: 20). Estos cebadores se utilizaron en combinaciones por parejas (ZC6629 + ZC6625 o ZC6630 + ZC6625) para generar secuencias codificantes de B\beta que comienzan en el primer codón ATG (posición 470 en la SEQ ID Nº: 3) (denominado N1-Beta) o en el tercer codón ATG (posición 512 en la SEQ ID Nº: 3) (denominado N3-Beta). Se combinaron aproximadamente 5 ng del ADN molde de Beta5'RI/puc con 20 pmol de cada uno de los cebadores (N1-Beta: ZC6629, SEQ ID Nº: 18 + ZC6625, SEQ ID Nº: 20; o N3-Beta:ZC6630, SEQ ID Nº: 19 + ZC6625, SEQ ID Nº: 20) en una mezcla de reacción tal como se describió anteriormente. Las mezclas se incubaron durante 5 ciclos de 94º, 45 segundos; 40º, 120 segundos; (N1-Beta) o 90 segundos (N3-Beta); 72º, 120 segundos; 20 ciclos de 94º, 45 segundos; 45º, 120 segundos; (N1-Beta) o 90 segundos (N3-Beta); 72º, 120 segundos; después se incubaron a 72º durante 7 minutos. Los dos productos de reacción N1, 555 pb o N3, 510 pb) se sometieron a digestión con Eco RI y Bgl II, y los fragmentos se ligaron al fragmento interno Bgl II - Xba I y pUC19 digerido con Eco RI + Xba I. El extremo 3' de la secuencia B\beta se obtuvo en una mezcla de reacción tal como se describió anteriormente utilizando los cebadores oligonucleotídicos ZC6626 (SEQ ID Nº: 21) y ZC6624 (SEQ ID Nº: 22) y aproximadamente 5 ng del molde Beta3'RI/puc. Las mezclas se incubaron durante 5 ciclos de 94º, 45 segundos; 40º, 90 segundos; 72º, 120 segundos; 15 ciclos de 94º, 45 segundos; 45º, 90 segundos; 72º, 120 segundos; después se incubaron a 72º durante 7 minutos. Se aisló un fragmento Bgl II - Eco RI de 990 pb. Este fragmento en 3' se ligó con el fragmento codificante adyacente (340 pb, SphI-Bgl II) y pUC19 digerido con Sph I + Eco RI. Se secuenciaron los exones generados por PCR en 3' y 5'. Se construyó un tercer vector intermedio combinando dos fragmentos internos (Xba I - Eco RI de 4285 pb y Eco RI - Sph I de 383 kb) en pUC19 digerido con Xba I + Sph I. La totalidad de la secuencia codificante de B\beta (dos formas) se unió entonces ligando uno de los fragmentos Eco RI - Xba I en 5', el fragmento interno Xba I - Sph I, el fragmento Sph I - Eco RI en 3' y el vector pUC19 digerido con Eco RI. La secuencia de B\beta se aisló entonces como un fragmento Sna BI de 7,6 Kpb y se insertó en el sitio Sna BI de pMAD6-Sna.
En referencia a la figura 4, el extremo 5' de la secuencia de la cadena gamma se obtuvo mediante PCR utilizando los cebadores oligonucleotídicos ZC6514 (SEQ ID Nº: 23) y ZC6517 (SEQ ID Nº: 24) y aproximadamente 50 ng of p\gamma12A9 como molde. La reacción de PCR se realizó tal como se describió anteriormente utilizando 40 pM de cada cebador. La reacción se realizó durante 5 ciclos de 94º, 45 segundos; 40º, 60 segundos, 72º, 120 segundos, seguido por 15 ciclos de 94º, 45 segundos; 45º, 60 segundos; 72º, 120 segundos. El fragmento resultante de 213 pb se sometió a digestión con Bam HI y Spe I, y el fragmento de restricción resultante se ligó con el fragmento adyacente en dirección 3' Spe I - Eco RI de 4,4 kb y pUC19 digerido con Bam HI + Eco RI. El extremo 3' de la secuencia de la cadena gamma se obtuvo utilizando los cebadores oligonucleotídicos ZC6516 (SEQ ID Nº: 25) y ZC6515 (SEQ ID Nº: 26) utilizando 40 pM del primer cebador, aproximadamente 50 ng del molde de p\gamma12F3 y el mismo programa de ciclado térmico que se utilizó para el fragmento en 5'. El fragmento resultante de 500 pb se sometió a digestión con Spe I y Bam HI, y el fragmento de restricción resultante se ligó con el fragmento en el sentido 5' Eco RI - Spe I de 2,77 kb y pUC19 digerido con Eco RI + Bam HI. Se secuenciaron todos los exones generados por PCR. La totalidad de la secuencia codificante de la cadena \gamma se unió entonces ligando un fragmento Bam HI - Eco RII en 5' de 4,5 Kpb, un fragmento interno Eco RI - Pst I de 1,1 Kpb y un fragmento Pst I - Xba I en 3' de 2,14 Kpb en Zem219b digerido con Bam HI + Xba I. Zem219b es un vector derivado de pUC18 que contiene un promotor de la metalotioneína de ratón y un marcador de selección de DHFR (dihidrofolato reductasa) operativamente unido a un promotor de SV40 (figura 5). El plásmido Zem219b se ha depositado en la American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo) como un transformante de E. coli XL1-blue con el número de registro 68979. La totalidad de la secuencia codificante de la cadena \gamma se aisló entonces como un fragmento Sna B1 de 7,8 Kpb y se insertó en el sitio Sna BI de
pMAD6-Sna.
Ejemplo III
Se obtuvieron ratones para las reservas de reproducción iniciales (C57BL6J, CBACA) de Harlan Olac Ltd. (Bicester, RU). Éstos se aparearon en parejas para producir un cruce híbrido F1 (B6CBAF1) para la hembra receptora, hembras sometidas a superovulación, machos sementales y machos sometidos a vasectomía. Todos los animales se mantuvieron en un ciclo de 14 horas de luz / 10 horas de oscuridad y se alimentaron con agua y comida (Special Diet Services RM3, Edimburgo, Escocia) a voluntad.
Se generaron ratones transgénicos esencialmente tal como se describe en Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986, que se incorpora como referencia al presente documento en su totalidad. Los animales hembra B6CBAF1 se sometieron a superovulación a las 4 - 5 semanas de edad mediante una inyección i.p. de gonadotropina sérica de yeguas en periodo de gestación (FOLLIGON, Vet-Drug, Falkirk, Escocia) (5 u.i.) seguido por una inyección i.p. de gonadotropina coriónica humana (CHORULON, Vet-Drug, Falkirk, Escocia) (5 u.i.) 45 horas después. Después se aparearon con un macho semental durante la noche. Tales hembras se examinaron a continuación para determinar tapones de copulación. Las que se habían apareado, se sacrificaron, y sus huevos ser recogieron para realizar la microinyección.
Se inyectó ADN en los huevos fertilizados, tal como se describe en Hogan et al. (ibid.). En resumen, cada uno de los vectores que contenía las unidades de expresión de A\alpha, B\beta y \gamma, se sometió a digestión con Mlu I, y las unidades de expresión se aislaron mediante centrifugación en gradiente de sacarosa. Todos los productos químicos utilizados tenían calidad para reactivo (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.), y todas las soluciones eran estériles y estaban libres de nucleasa. Se prepararon soluciones de sacarosa al 20% y al 40% en NaCl 1 M, Tris 20 mM pH 8,0, EDTA 5 mM utilizando agua UHP (a ultra-alta presión) y se esterilizaron por filtración. Se preparó una solución de sacarosa al 30% mezclando volúmenes iguales de las soluciones al 20% y al 40%. Se preparó un gradiente colocando capas de 0,5 ml de las soluciones de sacarosa al 40%, 30% y 20% en un tubo de polialómero de 2 ml y se dejó en reposo durante una hora. Se cargaron 100 \mul de solución de ADN (máximo 8 \mug de ADN) en la parte superior del gradiente y se centrifugó el gradiente durante 17 - 20 horas a 26.000 rpm, 15ºC en una ultracentrífuga Beckman TL100 utilizando un rotor TLS-55 (Beckman Instruments, Fullerton, CA, EE.UU.). Los gradientes se fraccionaron pinchando el fondo del tubo con una aguja de calibre 20 y se recogieron las gotas en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Se analizaron alícuotas de 3 \mul en un minigel de agarosa al 1%. Las fracciones que contenían el fragmento de ADN deseado se reunieron y se precipitaron con etanol durante la noche a -20ºC en acetato de sodio 0,3 M. Los sedimentos de ADN se resuspendieron en 50 - 100 \mul de agua UHP y se cuantificaron por fluorimetría. Las unidades de expresión se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio ni magnesio (que contenía, por litro, 0,2 g de KCl, 0,2 g de KH_{2}PO_{4}, 8,0 g de NaCl, 1,15 g de Na_{2}HPO_{4}), se mezclaron (utilizando las unidades de expresión N1-Beta o N3-Beta) en una razón molar de 1:1:1, se ajustó la concentración hasta aproximadamente 6 \mug/ml, y se inyectó en los huevos (-2 pl de solución de ADN total por
huevo).
Las hembras receptoras de 6 - 8 semanas de edad se preparan apareando hembras B6CBAF1 en celo natural con machos sometidos a vasectomía. Las hembras que poseen tapones de copulación se retienen entonces para transferir los huevos microinyectados.
Tras el nacimiento de los posibles animales transgénicos, se toman biopsias de la cola, con anestesia, a las cuatro semanas de edad. Se ponen muestras de tejido en 2 ml de tampón de cola (acetato de Na 0,3 M, HCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,5, 0,5% de NP40, 0,5% de Tween 20) que contiene 200 \mug/ml de proteinasa K (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) y se agita con vórtex. Las muestras se agitan (250 rpm) a 55º - 60º durante 3 horas durante la noche. El ADN preparado a partir de las muestras de biopsia se examina para determinar la presencia de los constructos inyectados mediante PCR e inmunotransferencia (Southern blotting). El tejido digerido se agita vigorosamente en vórtex y se ponen alícuotas de 5 \mul en tubos de microcentrífuga de 0,5 ml. Se incluyen como controles muestras positivas y negativas de la cola. Se añaden a cada tubo 40 \mul de aceite de silicona (BDH, Poole, RU) y los tubos se centrifugan brevemente. Los tubos se incuban en un bloque térmico de un ciclador térmico (por ejemplo, Omni-gene, Hybaid, Teddington, RU) a 95ºC durante 10 minutos. Tras esto, a cada tubo se le añade una alícuota de 45 \mul de mezcla de PCR, de manera que la composición final de cada mezcla de reacción sea: KCl 50 mM; MgCl_{2} 2 mM; Tris-HCl 10 mM (pH 8,3); 0,01% de gelatina; 0,1% de NP4O; 10% de DMSO; 500 nM de cada cebador, 200 \muM de los dNTP; 0,02 U/\mul de Taq polimerasa (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania). Los tubos se someten entonces a ciclos mediante 30 cambios de temperatura repetidos según se requiera por los cebadores particulares utilizados. Los cebadores pueden variarse, pero en todos los casos deben tener como diana la región promotora de la BLG. Ésta es específica para los fragmentos de ADN inyectados, porque el ratón no tiene un gen de la BLG. Se añaden entonces a cada tubo 12 \mul de 5x tampón de carga que contiene el colorante marcador Naranja G (0,25% de Naranja G [Sigma] 15% de Ficoll tipo 400 [Pharmacia Biosystems Ltd., Milton Keynes, RU]) y las mezclas de reacción se someten a electroforesis en un gel de agarosa al 1,6% que contiene bromuro de etidio (Sigma) hasta que el colorante marcador haya migrado 2/3 de la longitud del gel. El gel se visualiza con una fuente de luz UV que emite a una longitud de onda de 254 nm. Mediante este enfoque se identifican los ratones transgénicos que tienen uno o más de los fragmentos de ADN inyectados.
Las muestras de la cola positivas se tratan para obtener ADN puro. Las muestras de ADN se seleccionan mediante Southern blotting utilizando una sonda promotora de la BLG (nucleótidos 2523 -4253 de SEQ ID Nº: 7). Escisiones específicas con enzimas de restricción apropiadas (por ejemplo, Eco RI) permiten la distinción de los tres constructos que contienen las secuencias de A\alpha, B\beta y \gamma.
El análisis de Southern blot de los ratones transgénicos preparados esencialmente tal como se describió anteriormente demostró que más del 50% de la progenie contenía las tres secuencias de fibrinógeno. El examen de la leche de los animales positivos mediante electroforesis en gel reductor de SDS-poliacrilamida demostró la presencia de las tres cadenas proteicas a concentraciones de hasta 1 mg/ml. La cantidad de fibrinógeno completamente unido estaba relacionada con las razones de las subunidades individuales presentes en la leche. No se asoció un fenotipo aparente con las altas concentraciones de fibrinógeno humano en la leche de ratón.
Ejemplo IV
Se trataron ovejas donantes con esponjas intravaginales impregnadas de progesterona (CHRONOGEST Goat Sponge, Intervet, Cambridge, RU) en el día 0. Las esponjas se dejan in situ durante diez o doce días.
Se induce superovulación mediante el tratamiento de las ovejas donantes con un total de una unidad de hormona estimuladora del folículo ovina (OFSH) (OVAGEN, Horizon Animal Reproduction Technology Pty. Ltd., Nueva Zelanda) administrada en ocho inyecciones intramusculares de 0,125 unidades por inyección comenzando a las 5:00 p.m. en el día -4 y terminando a las 8:00 a.m. en el día 0. Se inyectó a las donantes por vía intramuscular 0,5 ml de un agente luteolítico (ESTRUMATE, Vet-Drug) en el día -4 para producir regresión del cuerpo lúteo, para permitir volver al celo y a la ovulación. Para sincronizar la ovulación, a los animales donantes se les inyectaron por vía intramuscular 2 ml de un análogo sintético de la hormona de liberación (RECEPTAL, Vet-Drug) a las 5:00 p.m. en el
día 0.
Se privó de comida y agua a las donantes durante al menos 12 horas antes de la inseminación artificial (I.A.). Los animales se inseminaron artificialmente mediante laparoscopia intrauterina bajo sedación y anestesia local en el día 1. Se inyecta por vía intramuscular o bien xilazina (ROMPUN, Vet-Drug) a una tasa de dosificación de 0,05 - 0,1 ml por 10 kg de peso corporal o bien una inyección de ACP a 10 mg/ml (Vet-Drug) a una tasa de dosificación de 0,1 ml por 10 kg de peso muscular, aproximadamente quince minutos antes de la I.A. para proporcionar sedación. La I.A. se lleva a cabo utilizando semen recogido recientemente de un carnero Poll Dorset. El semen se diluye con partes iguales de solución salina tamponada con fosfato filtrada, y se inyectan 0,2 ml de semen diluido por trompa uterina. Inmediatamente antes o después de la I.A., a las donantes se les administra una inyección intramuscular de AMOXYPEN (Vet-Drug).
Los huevos fertilizados se recuperan en el día 2 tras la privación de comida y agua de las donantes a partir de las 5:00 p.m. en el día 1. La recuperación se lleva a cabo con anestesia general inducida mediante una inyección intravenosa de tiopentona sódica al 5% (INTRAVAL SODIUM, Vet-Drug) a una tasa de dosificación de 3 ml por 10 kg de peso corporal. La anestesia se mantiene mediante inhalación de 1-2% de halotano/O_{2}/N_{2}O tras intubación. Para recuperar los huevos fertilizados, se realiza una incisión de laparatomía y se exterioriza el útero. Los huevos se recuperan mediante lavado retrógado de los oviductos con Medio de Cultivo Cvum (Advanced Protein Products, Brierly Hill, West Midlands, RU) complementado con albúmina sérica bovina de origen neozelandés. Tras el lavado, el útero se vuelve a colocar en el abdomen y se cierra la incisión. Se permite que las donantes se recuperen tras la operación o se sacrifican. A las donantes que se les ha permitido recuperarse, se les administra una inyección intramuscular de Amoxypen L.A. a la tasa de dosificación recomendada por el fabricante inmediatamente antes o después de la operación.
Los plásmidos que contienen las tres unidades de expresión de las cadenas de fibrinógeno se someten a digestión con Mlu I, y los fragmentos de unidad de expresión se recuperan y se purifican en gradientes de densidad de sacarosa. Las concentraciones de los fragmentos se determinan por fluorimetría y se diluyen en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio ni magnesio, tal como se describió anteriormente. La concentración se ajusta a 6 \mug/ml y se microinyectan aproximadamente 2 pl de la mezcla en un pronúcleo de cada huevo fertilizado con pronúcleos visibles.
Todos los huevos fertilizados que sobreviven a la microinyección pronuclear se cultivan in vitro a 38,5ºC en una atmósfera de 5% de CO_{2} : 5% de O_{2} : 90% de N_{2} a aproximadamente -100% de humedad en un medio de oviducto sintético tamponado con bicarbonato (véase la tabla) complementado con el 20% v/v de suero de carnero sometido a vasectomía. El suero puede inactivarse por calor a 56ºC durante 30 minutos y almacenarse congelado a -20ºC antes de su utilización. Los huevos fertilizados se cultivan durante un periodo de tiempo adecuado para permitir que se produzca la mortalidad temprana del embrión (producida por las técnicas de manipulación). Estos embriones muertos o detenidos se desechan. Los embriones que han desarrollado hasta 5 o 6 divisiones celulares se transfieren a ovejas receptoras sincronizadas.
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TABLA
Medio de oviducto sintético
Reserva A (dura 3 meses)
NaCl 6,29 g
KCl 0,534 g
KH_{2}PO_{4} 0,162 g
MgSO_{4}.7H_{2}O 0,182 g
Penicilina 0,06 g
Jarabe de lactato de sodio al 60% 0,6 ml
Super H_{2}O 99,4 ml
Reserva B (dura 2 semanas)
NaHCO_{3} 0,21 g
Rojo fenol 0,001 g
Super H_{2}O 10 ml
Reserva C (dura 2 semanas)
Piruvato de sodio 0,051 g
Super H_{2}O 10 ml
Reserva D (dura 3 meses)
CaCl_{2}.2H_{2}O 0,262 g
Super H_{2}O 10 ml
Reserva E (dura 3 meses)
Hepes 0,651 g
Rojo fenol 0,001 g
Super H_{2}O 10 ml
Para preparar 10 ml de medio tamponado con bicarbonato
RESERVA A 1 ml
RESERVA B 1 ml
RESERVA C 0,007 ml
RESERVA D 1 ml
Super H_{2}O 7,83 ml
Para preparar 10 ml de medio tamponado con bicarbonato
La osmolaridad debe ser de 265 - 285 mOsm
Añadir 2,5 ml de suero de oveja inactivado por calor y esterilizar por filtración
TABLA (continuación)
Medio de oviducto sintético
Para preparar 10 ml de medio tamponado con HEPES
RESERVA A 1 ml
RESERVA B 0,2 ml
RESERVA C 0,07 ml
RESERVA D 0,1 ml
RESERVA E 0,8 ml
Super H_{2}O 7,83 ml
La osmolaridad debe ser de 265 - 285 mOsm
Añadir 2,5 ml de suero de oveja inactivado por calor y esterilizar por filtración 
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Las ovejas receptoras se trataron con una esponja intravaginal impregnada con progesterona (Chronogest Ewe Sponge o Chronogest Ewe-Lamb Sponge, Intervet) dejada in situ durante 10 o 12 días. A las ovejas se les inyectó por vía intramuscular 1,5 ml (300 u.i.) de un sustituto de la hormona estimulante del folículo (P.M.S.G., Intervet) y 0,5 ml de un agente luteolítico (Estrumate, Coopers Pitman-Moore) en la extracción de la esponja en el día -1. Las ovejas se sometieron a prueba para determinar el celo con un carnero sometido a vasectomía entre las 8:00 a.m. y las 5:00 p.m. en los días 0 y 1.
Los embriones que sobreviven en el cultivo in vitro se devuelven a las receptoras (privadas de comida y agua desde las 5:00 p.m. en el día 5 o 6) en el día 6 o 7. La transferencia del embrión se lleva a cabo con anestesia general, tal como se describió anteriormente. El útero se exterioriza mediante una incisión de laparotomía con o sin laparoscopia. Los embriones se devuelven a una o ambas trompas uterinas sólo en las ovejas con al menos un cuerpo lúteo adecuado. Tras la colocación de nuevo del útero, el abdomen se cierra y se permite que las receptoras se recuperen. A los animales se les administra una inyección intramuscular de Amoxypen L.A. a la tasa de dosificación recomendada por el fabricante inmediatamente antes y después de la operación.
Los corderos se identifican mediante etiquetas en las orejas y se les deja con sus madres para la lactancia. Las ovejas y los corderos o bien se alojan y se alimentan con concentrados dietéticos completos y otros complementos y/o heno a voluntad, o se les deja salir para que pasten.
En la primera semana de vida (o después lo más pronto posible sin perjuicio para la salud), se somete a prueba a cada cordero para determinar la presencia de ADN heterólogo mediante dos procedimientos de obtención de muestras. Se recoge una muestra de sangre de 10 ml extraída de la vena yugular en un vacutainer con EDTA. Si resulta suficientemente adecuado, también se extrae a los corderos una segunda muestra de sangre de 10 ml una semana después de la primera. Se obtienen muestras de tejido mediante biopsia de la cola lo antes posible después de que la cola se haya insensibilizado tras la aplicación de un anillo elastrador de caucho en su tercio proximal (normalmente en el plazo de 200 minutos tras el acoplamiento ("tailing")). El tejido se pone inmediatamente en una solución de tampón de cola. Las muestras de cola se mantienen a temperatura ambiente y se analizan en el día de la recogida. A todos los corderos se les administra una inyección intramuscular de Amoxypen L.A. a la tasa de dosificación recomendada por el fabricante inmediatamente tras la biopsia, y el extremo cortado de la cola se pulveriza con pulverización de antibiótico.
Se extrae ADN de la sangre de las ovejas separando primero los glóbulos blancos. Se diluye una muestra de 10 ml de sangre en 20 ml de solución salina tamponada de Hank (HBS; obtenida de Sigma Chemical Co.). Diez ml de la sangre diluida se coloca en capas sobre 5 ml de Histopaque (Sigma) en cada uno de dos tubos con tampón de rosca de 15 ml. Los tubos se centrifugan a 3000 rpm (2000 x g máximo), se frenan a baja velocidad durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las interfases de glóbulos blancos se trasladan a un tubo limpio de 15 ml y se diluyen hasta 15 ml en HBS. Las células diluidas se centrifugan a 3000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente y el sedimento de células se recupera y se resuspende en 2 - 5 ml de tampón de cola.
Para extraer el ADN de los glóbulos blancos, se añadió SDS al 10% a las células resuspendidas hasta una concentración final del 1%, y el tubo se invirtió para mezclar la disolución. Se añadió un mg de solución de proteinasa K reciente y la mezcla se incubó durante la noche a 45ºC. El ADN se extrajo utilizando un volumen igual de fenol / cloroformo (x3) y cloroformo / alcohol isoamílico (x1). El ADN se precipita entonces añadiendo 0,1 volúmenes de NaOAc 3 M y 2 volúmenes de etanol, y el tubo se invierte para mezclarlo. El ADN precipitado se bobina utilizando una varilla de vidrio limpia con un extremo sellado. La bobina se lava en etanol al 70% y el ADN se deja secar parcialmente, después se vuelve a disolver en tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4).
Las muestras de ADN de la sangre y la cola se analizaron mediante Southern blotting utilizando sondas para la región promotora de la BLG y las regiones codificantes de la cadena de fibrinógeno.
A partir de lo anterior se apreciará que, aunque en el presente documento se han descrito realizaciones específicas de la invención con fines de ilustración, pueden realizarse varias modificaciones sin desviarse del espíritu y el alcance de la invención. En consecuencia, la invención no está limitada, excepto por las reivindicaciones adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: ZymoGenetics, Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
1201 Eastlake Avenue East
\vskip0.800000\baselineskip
Seattle, Washington 98102
\vskip0.800000\baselineskip
Estados Unidos de América
\vskip0.800000\baselineskip
Pharmaceutical Proteins Ltd.
\vskip0.800000\baselineskip
Roslin
\vskip0.800000\baselineskip
Edimburgo
\vskip0.800000\baselineskip
Midlothian, Escocia EH25 9PP
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Producción de fibrinógeno en animales transgénicos
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 27
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: ZymoGenetics, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 1201 Eastlake Avenue East
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Seattle
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: WA
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 98102
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO / AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Parker, Gary E
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 31-648
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA / NÚMERO DE EXPEDIENTE: 93-15PC
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN SOBRE COMUNICACIONES A DISTANCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 206-442-6673
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FAX: 206-442-6678
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5943 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: Cadena A-alfa del fibrinógeno humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: CDS (secuencia codificante)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: unión (31..84, 1154..1279, 1739..1922, 3055..3200, 3786..5210)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
1
2
3
4
5
6
7
8 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 644 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
9
10
11 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8878 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: cadena B-beta del fibrinógeno humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: misc_RNA
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1..469
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 470..583
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 584..3257
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3258..3449
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3450..3938
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3939..4122
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4123..5042
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5043..5270
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5271..5830
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5831..5944
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5945..6632
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6633..6758
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6759..6966
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6967..7252
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 7253..7870
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 7871..8102
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: 3'UTR
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 8103..8537
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: misc_RNA
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 8538..8878
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: unión (470..583, 3258..3449, 3939..4122, 5043..5270, 5831..5944, 6633..6758, 6967..7252, 7871..8102)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:
12
13
14
15
16
17
18
19
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 491 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
21
22
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10564 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: cadena gamma del fibrinógeno humano
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: unión (1799..1876, 1973..2017, 2207..2390, 2510..2603, 4211..4341, 4645..4778, 5758..5942, 7426..7703, 9342..9571)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 453 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
34
35
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10807 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: beta-lactoglobulina ovina
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
37
38
39
40
41
42
43
44
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCCGATC GACGCGTCGA CGATATACTC TAGACGATCG ACGCGTA 
\hfill
47 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: BLGAMP3
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGGATCCCT GCCGGTGCCT CTGG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: BLGAMP4
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACGCGTCAT CCTCTGTGAG CCAG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: ZC6839
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACTACGTAGT 
\hfill
10 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: ZC6632
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGACGCGGAT CCTACGTACC TGCAGCCATG TTTTCCATGA 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: ZC6627
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGGGCTTCGG CAAGCTTCAG G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: ZC6521
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCAAAGACT TACTTCCCTC TAGA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: ZC6520
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCATGAACGT CGCGTGGTGG TTGTGCTACC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: ZC6519
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCACGCGAC GTTCATGCTC TAAAACCGTT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: ZC6518
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTGCGGGAT CCTACGTACT AGGGGACAG GGAAGG 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: ZC6629
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGACGCGAAT TCTACGTACC TGCAGCCATG AAAAGGATGG TTTCT 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: ZC6630
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGACGCGAAT TCTACGTACC TGCAGCCATG AAACATCTAT TATTG 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: ZC6625
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGAGATTTT CAGATCTTGT C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: ZC6626
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGAATTACT GTGGCCTACC A 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: ZC6624
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTGCGGAAT TCTACGTACT ATTGCTGTGG GAA 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: ZC6514
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGACGCGGAT CCTACGTACC TGCAGCCATG AGTTGGTCCT TGCAC 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: ZC6517
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCTCTGGTA GCAACATACT A 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: ZC6516
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGTTTCTAG CCCTACTAGT AG 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: ZC6515
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGTTTCTAG CCCTACTAGT AG 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGCTACGCG TCGATCGTCT AGAGTATATC GTCGACGCGT CGATCGG 
\hfill

Claims (29)

1. Método para producir fibrinógeno que comprende:
proporcionar un primer segmento de ADN que codifica para una señal de secreción operativamente unido a una cadena A\alpha de fibrinógeno, un segundo segmento de ADN que codifica para una señal de secreción operativamente unido a una cadena B\beta de fibrinógeno, y un tercer segmento de ADN que codifica para una señal de secreción operativamente unido a una cadena \gamma de fibrinógeno, en el que cada uno de dichos segmentos primero, segundo y tercero está operativamente unido a segmentos adicionales de ADN requeridos para su expresión en la glándula mamaria de un mamífero hembra huésped;
introducir dichos segmentos de ADN en un huevo fertilizado de una especie de mamífero no humano;
insertar dicho huevo en un oviducto o útero de una hembra de dicha especie para obtener descendencia que lleve dichos constructos de ADN;
cruzar dicha descendencia para producir progenie femenina que exprese dichos segmentos de ADN primero, segundo y tercero y producir leche que contenga fibrinógeno biocompetente codificado por dichos segmentos;
recoger la leche de dicha progenie femenina;
y recuperar el fibrinógeno de la leche.
2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha especie se selecciona del grupo que consiste en ovejas, cerdos, cabras y ganado.
3. Método según la reivindicación 1, en el que cada uno de dichos segmentos de ADN primero, segundo y tercero comprenden un intrón.
4. Método según la reivindicación 1, en el que la razón molar de dichos segmentos de ADN primero, segundo y tercero está dentro del intervalo de 0,5-1 : 0,5-1 : 0,5-1.
5. Método según la reivindicación 1, en el que cada uno de dichos segmentos de ADN primero,segundo y tercero está operativamente unido a un promotor de la transcripción seleccionado del grupo que consiste en los promotores génicos de la caseína, \beta-lactoglobulina, \alpha-lactoalbúmina y la proteína ácida del suero.
6. Método según la reivindicación 1, en el que dichos segmentos de ADN primero, segundo y tercero se expresan bajo el control de un promotor de la \beta-lactoglobulina.
7. Método según la reivindicación 1, en el que dicha etapa de introducción comprende inyectar dichos segmentos de ADN primero, segundo y tercero en un pronúcleo de dicho huevo fertilizado.
8. Método según la reivindicación 1, en el que dicho fibrinógeno es fibrinógeno humano.
9. Método según la reivindicación 1, en el que dicho segundo segmento de ADN comprende una secuencia de nucleótidos tal como se muestra en SEQ ID Nº: 3 desde el nucleótido 470 hasta el nucleótido 8100.
10. Método según la reivindicación 1, en el que dicho segundo segmento de ADN comprende una secuencia de nucleótidos tal como se muestra en SEQ ID Nº: 3 desde el nucleótido 512 hasta el nucleótido 8100.
11. Método para producir fibrinógeno que comprende:
incorporar un primer segmento de ADN que codifica para una señal de secreción operativamente unido a una cadena A\alpha de fibrinógeno en un gen de \beta-lactoglobulina para producir una primera fusión génica;
incorporar un segundo segmento de ADN que codifica para una señal de secreción operativamente unido a una cadena B\beta de fibrinógeno en un gen de \beta-lactoglobulina para producir una segunda fusión génica;
incorporar un tercer segmento de ADN que codifica para una señal de secreción operativamente unido a una cadena \gamma de fibrinógeno en un gen de \beta-lactoglobulina para producir una tercera fusión génica;
introducir dichas fusiones génicas primera, segunda y tercera en la línea germinal de un mamífero no humano de manera que dichos segmentos de ADN se expresen en la glándula mamaria de dicho mamífero o su progenie femenina y se secrete fibrinógeno biocompetente en la leche de dicho mamífero o su progenie femenina;
obtener leche de dicho mamífero o su progenie femenina; y
recuperar dicho fibrinógeno de dicha leche.
12. Método según la reivindicación 11, en el que dicho mamífero es una oveja, cerdo, cabra o vaca.
13. Método según la reivindicación 11, en el que dichas fusiones génicas primera, segunda y tercera comprenden un intrón.
14. Método según la reivindicación 11, en el que la razón molar de dichas fusiones génicas primera, segunda y tercera introducidas está dentro del intervalo de 0,5-1 : 0,5-1 : 0,5-1.
15. Método según la reivindicación 11, en el que dicha etapa de introducción comprende inyectar dichas fusiones génicas primera, segunda y tercera en un pronúcleo de un huevo fertilizado e insertar dicho huevo en un oviducto de una hembra seudopreñada para producir descendencia femenina que lleve dichas fusiones génicas en la línea germinal.
16. Método para producir fibrinógeno que comprende:
proporcionar un mamífero transgénico hembra no humano que lleva en su línea germinal segmentos heterólogos de ADN que codifican para las cadenas A\alpha, B\beta y \gamma de fibrinógeno, en el que dichos segmentos de ADN se expresan en la glándula mamaria de dicho mamífero y el fibrinógeno codificado por dichos segmentos se secreta en la leche de dicho mamífero;
recoger la leche de dicho mamífero; y
recuperar dicho fibrinógeno de dicha leche.
17. Método según la reivindicación 16, en el que dicho mamífero es una oveja, cerdo, cabra o vaca.
18. Embrión de mamífero no humano que contiene en su núcleo segmentos heterólogos de ADN que codifican para las cadenas de fibrinógeno A\alpha, B\beta y \gamma.
19. Mamífero transgénico hembra no humano que lleva en su línea germinal segmentos de ADN que codifican para fibrinógeno humano y que producen cantidades recuperables de fibrinógeno humano en su leche.
20. Procedimiento para producir una descendencia transgénica de un mamífero no humano que comprende:
proporcionar un primer segmento de ADN que codifica para una cadena A\alpha de fibrinógeno, un segundo segmento de ADN que codifica para una cadena B\beta de fibrinógeno, y un tercer segmento de ADN que codifica para una cadena \gamma de fibrinógeno, en el que cada uno de dichos segmentos primero, segundo y tercero está operativamente unido a segmentos adicionales de ADN requeridos para su expresión en la glándula mamaria de un mamífero hembra huésped y la secreción en la leche de dicho mamífero hembra huésped;
introducir dichos segmentos de ADN en un huevo fertilizado de un mamífero de una especie no humana;
insertar dicho huevo en un oviducto o útero de una hembra de dicha especie no humana para obtener una descendencia que lleve dichos segmentos de ADN primero, segundo y tercero.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que dicha descendencia es femenina.
22. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que dicha descendencia es masculina.
23. Mamífero no humano producido según el procedimiento de la reivindicación 20.
24. Mamífero no humano según la reivindicación 23, en el que dicho mamífero es hembra.
25. Mamífero hembra según la reivindicación 24, que produce leche que contiene fibrinógeno biocompetente codificado por dichos segmentos de ADN.
26. Mamífero no humano según la reivindicación 23, en el que dicho mamífero es macho.
27. Mamífero no humano que lleva en su línea germinal segmentos de ADN que codifican para las cadenas A\alpha, B\beta y \gamma heterólogas de fibrinógeno, en el que la progenie femenina de dicho mamífero expresa dichos segmentos de ADN en la glándula mamaria para producir fibrinógeno biocompetente.
28. Mamífero según la reivindicación 27, en el que dicho mamífero es hembra.
29. Mamífero según la reivindicación 27, en el que dicho mamífero es macho.
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