ES2245458T3 - Preparaciones de hialuronidasa para el tratamiento de la sangre hemorragica intravitrea. - Google Patents

Preparaciones de hialuronidasa para el tratamiento de la sangre hemorragica intravitrea.

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ES2245458T3 ES96944203T ES96944203T ES2245458T3 ES 2245458 T3 ES2245458 T3 ES 2245458T3 ES 96944203 T ES96944203 T ES 96944203T ES 96944203 T ES96944203 T ES 96944203T ES 2245458 T3 ES2245458 T3 ES 2245458T3
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Abstract

PREPARACION DE HIALURONIDASA SIN TIMEROSAL EN LA QUE LA ENZIMA HIALURONIDASA PREFERIDA NO TIENE FRACCIONES MOLECULARES INFERIORES A 40.000 PM, DE 60-70.000 PM, Y MAYORES DE 100.000 PM. SE DESCRIBE TAMBIEN UN METODO PARA ACELERAR LA ELIMINACION DE SANGRE HEMORRAGICA DEL HUMOR VITREO DEL OJO; ESTE METODO COMPRENDE LA ETAPA DE PONER EN CONTACTO AL MENOS UNA ENZIMA QUE ELIMINA LA HEMORRAGIA (P.EJ., UNA BE GLUCURONIDASA, MATRIZ DE METALOPROTEINASA, CONDROTOINASA, SULFATASA DE CONDROITINA O PROTEINCINASA) CON EL HUMOR VITREO EN UNA CANTIDAD QUE ES EFICAZ PARA ACELERAR LA ELIMINACION DE LA SANGRE EN EL HUMOR VITREO

Description

Preparación de hialuronidasa para el tratamiento de la sangre hemorrágica intravítrea.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a preparaciones de hialuronidasa para la administración terapéutica en los ojos de los seres humanos u otros mamíferos, y más particularmente a) al uso de las mismas para acelerar la velocidad a la que desaparece la sangre hemorrágica del cuerpo vítreo del ojo mamífero y b) a una preparación de hialuronidasa mejorada para la administración oftálmica.
Antecedentes de la invención i. Anatomía del ojo humano
En los seres humanos, la anatomía del ojo incluye un "cuerpo vítreo" que ocupa aproximadamente cuatro quintas partes de la cavidad del globo ocular detrás del cristalino. El cuerpo vítreo está formado por un material gelatinoso, conocido como humor vítreo. Normalmente, el humor vítreo de un ojo humano normal contiene aproximadamente un 99% de agua junto con un 1% de macromoléculas que incluyen: colágeno, ácido hialurónico, glicoproteínas solubles, azúcares y otros metabolitos de peso molecular bajo.
La retina es esencialmente una capa de tejido nervioso formada en la superficie posterior interna del globo ocular. La retina está rodeada por una capa de células conocida como capa coroidea. La retina puede dividirse en a) una parte óptica, que participa en el mecanismo visual, y b) una parte no óptica, que no participa en el mecanismo visual. La parte óptica de la retina contiene los bastoncillos y los conos, que son los órganos efectivos de la visión. Varias arterias y venas se introducen en la retina por el centro, y se expanden hacia fuera para proporcionar la circulación sanguínea en la retina.
La parte posterior del cuerpo vítreo está en contacto directo con la retina. Unas redes de haces fibrilares se extienden desde la retina y penetran o se insertan en el cuerpo vítreo con el fin de fijar el cuerpo vítreo a la retina.
ii. Causas, tratamientos y secuelas clínicas de la hemorragia intravítrea
La retinopatía diabética, los traumas y otros trastornos oftalmológicos a veces ocasionan la rotura o fisura de los vasos sanguíneos retinales, ocasionando un derramamiento de sangre en el humor vítreo del ojo (es decir, "hemorragia intravítrea"). Este tipo de hemorragia intravítrea se manifiesta normalmente como un oscurecimiento u opacificación del humor vítreo.
La hemorragia intravítrea va a veces, pero no siempre, acompañada de desgarro o desprendimiento de retina. En los casos en los que la hemorragia intravítrea está acompañada de un desgarro o desprendimiento de retina, es importante que dicho desgarro o desprendimiento de retina sea rápidamente diagnosticado y quirúrgicamente reparado. Si no se logra diagnosticar y reparar rápidamente el desgarro o desprendimiento de retina, se puede permitir que las células fotorreceptoras de la retina, en la región del desgarro o desprendimiento, se vuelvan necróticas. Dicha necrosis de las células fotorreceptoras de la retina puede dar como resultado la pérdida de visión. Además, si se permite que el desprendimiento de retina permanezca sin reparar durante mucho tiempo, se puede ocasionar una nueva hemorragia intravítrea y/o la formación de tejido fibroso en el lugar de la hemorragia. Dicha formación de tejido fibroso puede ocasionar la formación de una fijación fibrosa no deseable entre el cuerpo vítreo y la retina.
El procedimiento quirúrgico típico usado para la reparación de desgarros o desprendimientos de retina requiere que el cirujano pueda mirar a través del humor vítreo, para visualizar la región dañada de la retina (es decir, "visión transvítrea de la retina"). Cuando se ha producido una hemorragia intravítrea, la presencia de sangre hemorrágica dentro del vítreo puede hacer que el vítreo se vuelva tan oscuro que el cirujano no pueda visualizar la retina a través del vítreo. Este oscurecimiento hemorrágico del vítreo puede tardar de 6 a 12 meses o más en desaparecer lo suficiente para permitir la visión transvítrea de la retina. No obstante, debido a las complicaciones potenciales que pueden originarse por una diagnosis o tratamiento tardío de un desgarro o desprendimiento de retina, generalmente no es deseable esperar a que se produzca dicha desaparición natural de la sangre hemorrágica.
Además, aunque la hemorragia intravítrea no vaya acompañada de un desgarro o desprendimiento de retina, a menudo resulta difícil verificar que no se ha producido un desgarro o desprendimiento de retina, ya que el oscurecimiento hemorrágico del vítreo impide al médico realizar un examen funduscópico rutinario de la retina. Además, la presencia de sangre hemorrágica dentro del vítreo puede perjudicar significativamente la visión del paciente a través del ojo afectado, y continuará haciéndolo hasta que la sangre hemorrágica haya desaparecido sustancial o completamente.
En consecuencia, la presencia de sangre hemorrágica dentro del cuerpo vítreo origina múltiples problemas clínicos, que incluyen a) incapacidad para examinar y diagnosticar visualmente el lugar de la hemorragia y/o cualquier desgarro o desprendimiento de retina asociado, b) deficiencia completa o parcial de la visión en el ojo afectado, y c) incapacidad o impedimento de realización de los procedimientos quirúrgicos transvítreos del tipo normalmente utilizado para reparar el lugar de la hemorragia y/o para reparar cualquier desgarro o desprendimiento de retina asociado.
En los casos en los que la hemorragia intravítrea haya ocasionado un oscurecimiento u opacificación sustancial del vítreo, el médico responsable puede tener la opción de realizar un procedimiento conocido como vitrectomía, mediante el cual todo (o una parte de) el cuerpo vítreo es extraído del interior del ojo y reemplazado por un líquido claro. La realización de este tipo de procedimiento de vitrectomía pretende permitir al cirujano una visualización de la retina suficiente para proceder con el examen necesario de la retina y/o la reparación quirúrgica de la hemorragia y cualquier desgarro o desprendimiento de retina asociado. No obstante, este tipo de procedimientos de vitrectomía requieren una gran habilidad, y están asociados con varios inconvenientes, riesgos y complicaciones significativas. Entre estos inconvenientes, riesgos y complicaciones se encuentra la posibilidad de que el hecho de extraer el vítreo ocasione un nuevo desprendimiento o desgarro de retina y/o que dicha extracción del vítreo ocasione una nueva hemorragia en los ya debilitados vasos sanguíneos retinales.
iii. Aplicaciones oftálmicas previas de la hialuronidasa y otras enzimas
En un esfuerzo por minimizar la posibilidad de provocar un nuevo desprendimiento o desgarro de la retina durante la realización de la vitrectomía, se ha propuesto previamente en la patente U.S. Nº 5,292,509 (Hageman), inyectar determinadas enzimas glicosaminoglicanasas sin proteasa en el cuerpo vítreo, para hacer que el cuerpo vítreo se desacople o "desinserte" de la retina antes de la extracción del cuerpo vítreo. Dicha desinserción o desacoplamiento del cuerpo vítreo pretende minimizar la probabilidad de que se produzca otro desgarro o desprendimiento de la retina al eliminar el cuerpo vítreo. Ejemplos de enzimas glicosaminoglicanasas sin proteasa específicas que pueden ser usadas para llevar a cabo esta desinserción vítrea supuestamente incluyen: condroitinasa ABC, condroitinasa AC, condroitinasa B, condroitina 4-sulfatasa, condroitina 6-sulfatasa, hialuronidasa y \beta-glucuronidasa.
Aunque la enzima hialuronidasa se conoce por poder utilizarse para varias aplicaciones oftálmicas, que incluyen la aplicación adjunta en la vitrectomía descrita en la patente U.S. 5,292,509 (Hageman), los estudios publicados han indicado que la enzima hialuronidasa puede ser tóxica en sí misma para la retina y/o para otras estructuras anatómicas del ojo. Ver, The Safety of Intravitreal Hyaluronidase; Gottleib, J.L.; Antoszyk, A.N., Hatchell, D.L. and Soloupis, P., Invest Ophthalmol Vis Sci 31: 11, 2345-52 (1990).
La toxicidad oftálmica de algunas preparaciones de hialuronidasa ha sido confirmada por otros investigadores, que han propuesto el uso de dichas preparaciones de hialuronidasa como un irritante tóxico para provocar una neovascularización del ojo inducida experimentalmente, en modelos de toxicidad animal. Ver, An Experimental Model of Preretinal Neovascularization in the Rabbit; Antoszyk, A.N., Gottleib, J.L., Casey, R.C., Hatchell, D.L. and Machemer, R., Invest Ophthalmol Vis Sci 32:1, 46- 51 (1991).
Desafortunadamente, no se ha descubierto previamente si las actividades terapéuticas y las toxicidades descritas de la hialuronidasa son universalmente aplicables a todas las preparaciones de hialuronidasa, o si tales eficacias y/o toxicidades son aplicables sólo a preparaciones de hialuronidasa que contienen determinados materiales excipientes o enzimas de hialuronidasa derivadas de fuentes específicas. Se trata de una consideración importante, dado el hecho de que la pureza y la caracterización (p. ej., distribución del peso molecular) de las distintas preparaciones de hialuronidasa usadas en la técnica precedente puede variar, dependiendo de la fuente de la hialuronidasa y los solventes y/o demás componentes de la formulación con los que se combina la hialuronidasa.
iv. Pureza y caracterización de las preparaciones de hialuronidasa previamente usadas para la administración oftálmica
El término "hialuronidasa" se usa normalmente para describir un grupo de enzimas endo-\beta-glucuronidasa que depolimeriza determinados mucopolisacáridos, como el ácido hialurónico. Myer, K. et al., The Enzymes; Vol. 4, 2a Ed., pp 447, Academic Press, Inc., New York (1960).
La hialuronidasa provoca la hidrólisis de los enlaces endo-N-acetil hexosamínicos de ácido hialurónico y de los ácidos de sulfato de condroitina A y C, principalmente en residuos tetrasacáridos.
Pruebas significativas han indicado que las enzimas de hialuronidasa derivadas de distintas fuentes difieren en la distribución del peso molecular de la enzima y en las actividades enzimáticas específicas. Esta variabilidad en la distribución del peso molecular y en la actividad enzimática específica son consideraciones dignas de tener en cuenta, ya que las enzimas de hialuronidasa pueden ser aisladas a partir de una variedad de fuentes, que incluyen testículos bovinos, testículos ovinos, determinadas bacterias como streptomyces y determinados animales invertebrados como las sanguijuelas.
Se ha informado de que la preparación de hialuronidasa Wydase® ha sido previamente administrada en ojos de mamíferos en varias aplicaciones clínicas y experimentales, que incluyen el tratamiento del glaucoma y la estimulación de la licuefacción del cuerpo vítreo durante los procedimientos de vitrectomía en los que el cuerpo vítreo es sacado del ojo.
Aunque se ha comentado que algunas preparaciones de hialuronidasa muestran efectos terapéuticos deseables al ser inyectadas o administradas tópicamente en el ojo, las toxicidades potenciales de la hialuronidasa y/o el conservante timerisol son motivo de preocupación en cuanto a la seguridad de una administración clínica rutinaria de dichas preparaciones por inyección intraocular.
En consecuencia, existe una necesidad en la técnica de formular y desarrollar una nueva preparación de hialuronidasa que pueda ser administrada en el ojo en niveles de dosificación que sean suficientes para producir efectos terapéuticos óptimos, pero que no provoquen toxicidad ocular.
Además, a la vista de los problemas arriba comentados asociados con la lentitud de la desaparición natural de la sangre hemorrágica en el cuerpo vítreo, existe una necesidad en la técnica de discernir y desarrollar métodos y procedimientos nuevos para acelerar la eliminación de la sangre hemorrágica del cuerpo vítreo del ojo, con el fin de permitir la visión transvítrea del aspecto posterior del ojo, incluyendo la retina, sin necesidad de extraer el cuerpo vítreo (es decir, vitrectomía total o parcial).
Resumen de la invención
La presente invención proporciona el uso de una solución de hialuronidasa en la preparación de un medicamento para acelerar la eliminación de sangre hemorrágica del humor vítreo de un ojo de mamífero, donde al entrar en contacto con el humor vítreo, una cantidad de hialuronidasa se activa para acelerar la eliminación de sangre hemorrágica del humor vítreo.
Además, la preparación según la presente invención es una preparación de hialuronidasa mejorada sin timerisol, que es adecuada para la administración sobre o dentro del ojo como un agente terapéutico para el tratamiento de diversos trastornos, que incluyen, aunque sin excluir otros, la aceleración de la eliminación de sangre hemorrágica del humor vítreo según la metodología de eliminación de hemorragias de la presente invención. Esta preparación de hialuronidasa de la presente invención comprende una enzima de hialuronidasa que está sustancialmente desprovista de moléculas de hialuronidasa con pesos moleculares superiores a 100,000, entre 60,000-70,000 y/o inferiores a 40,000. La hialuronidasa preferida de la presente invención puede ser obtenida de testículos ovinos, y puede ser combinada en una solución acuosa con cantidades de lactosa y fosfato, para proporcionar una solución de hialuronidasa acuosa sin timerisol para inyección intraocular.
Otros objetos y ventajas de la presente invención serán evidentes para los expertos en el campo, tras la lectura y comprensión de la siguiente descripción detallada, las figuras anexas y los ejemplos establecidos en la misma.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un gel de electroforesis con las bandas 1-6, dichas bandas indicando 1) los estándares del peso molecular de 31,000 a 200,000 2) hialuronidasa ovina (ACS), 3) hialuronidasa bovina tipo VI-S, 4) hialuronidasa ovina tipo V, 5) hialuronidasa bovina tipo IV-S y 6) hialuronidasa bovina tipo I-S.
La Figura 2 es una tabla que resume la actividad de lisado del ácido hialurónico y las actividades gelatinolíticas y caseinolíticas de la hialuronidasa ACS de la presente invención, determinadas zimográficamente, en comparación con las hialuronidasas bovinas de los tipos VI-S, IV-S y I-S y la hialuronidasa ovina de tipo V.
La Figura 3 es una tabla que resume los efectos tóxicos de las inyecciones intravítreas en una sola dosis de BSS, BSS + timerisol, hialuronidasa (ACS) e hialuronidasa Wydase® en conejos, según el ejemplo I posterior.
La Figura 4 es una tabla que resume la eficacia de la hialuronidasa (ACS) intravítrea en una sola dosis en conejos, según el ejemplo II posterior.
La Figura 5 es una tabla que resume la seguridad y eficacia de múltiples dosis de hialuronidasa (ACS) intravítrea en conejos, según el ejemplo III posterior.
La Figura 6 es una tabla que resume la eficacia de la hialuronidasa ACS en dosis individuales para la eliminación de hemorragias en pacientes humanos que tienen retinopatía diabética, según el ejemplo IV posterior.
Descripción detallada de las formas de realización preferidas
La siguiente descripción detallada y los ejemplos asociados están previstos únicamente con el fin de describir y explicar determinadas formas de realización preferidas de la invención, y de ninguna manera están destinados a limitar el objetivo de la invención.
i. Método enzimático para acelerar la desaparición de sangre hemorrágica del vítreo del ojo
Según la invención, el solicitante ha determinado que la hialuronidasa, al entrar en contacto con el humor vítreo tras una hemorragia en el mismo, acelera la velocidad a la que la sangre hemorrágica desaparece del humor vítreo.
A este respecto, el solicitante ha concebido un método para acelerar la eliminación de sangre hemorrágica del vítreo del ojo, dicho método generalmente comprende la fase de poner en contacto con el humor vítreo hialuronidasa en una cantidad activa para acelerar la eliminación de sangre hemorrágica del humor vítreo. Este método de eliminación de la hemorragia puede ser realizado sin vitrectomía ni ninguna otra manipulación quirúrgica o extracción del humor vítreo, evitando de este modo riesgos y complicaciones potenciales asociados con tales procedimientos de vitrectomía.
La forma de administración preferida de esta enzima para la eliminación de la hemorragia es por inyección intraocular, siendo inyectable una solución que contiene la enzima para la eliminación de la hemorragia a través de una aguja, directamente en el cuerpo vítreo situado dentro de la cámara posterior del ojo. De forma alternativa, no obstante, la enzima para la eliminación de la hemorragia según la presente invención puede ser administrada en cualquier otra forma de administración adecuada (p. ej., tópicamente) que resulte en una distribución de la enzima en el cuerpo vítreo suficiente para causar el efecto deseado de eliminación de la hemorragia.
La solución inyectable preferida de la enzima para la eliminación de la hemorragia puede contener, además de la enzima para eliminación de la hemorragia, determinados ingredientes inactivos que hacen que la solución sea sustancialmente isotónica, y con un pH adecuado para la inyección en el ojo. Dicha solución para la inyección puede ser inicialmente liofilizada en un estado seco y, posteriormente, puede ser reconstruida antes del uso.
ii. Preparación de hialuronidasa preferida para la administración oftálmica
Una formulación general para una preparación de hialuronidasa sin timerisol inyectable, según la presente invención, se muestra en la tabla I de la sigue manera:
TABLA I Formulación general
Ingrediente Cantidad
Hialuronidasa (ACS) 0-8000 Unidades Internacionales
Lactosa, USP 13.3 mg-133.0 mg
Fosfato, USP 5-200 mmoles
Estos ingredientes de la formulación son inicialmente disueltos en agua esterilizada, filtrados de forma esterilizada y posteriormente liofilizados en una composición seca. La composición liofilizada es envasada para ser reconstituida posteriormente antes del uso en una solución salina equilibrada. Dicha solución salina equilibrada normalmente contiene: 0.64% de cloruro sódico, 0.075% de cloruro potásico, 0.048% de cloruro cálcico dihidrato, 0.03% de cloruro magnésico hexahidrato, 0.39% de acetato sódico trihidrato, 0.17% de citrato sódico dihidrato, hidruro sódico/ácido clorhídrico para ajustar el pH, y agua para la inyección en cantidad suficiente hasta el 100%.
El término "hialuronidasa ACS", como se utiliza en este caso, describe una hialuronidasa preferida que está desprovista de las fracciones de hialuronidasa de peso molecular superior a 100,000, entre 60,000-70,000 e inferior a 40,000. Dicha hialuronidasa puede ser derivada de testículos ovinos y está disponible comercialmente por Calbiochem Biochemicals, P.O. 12087, La Jolla, Ca 92039-2087. Los solicitantes han determinado que esta distribución del peso molecular específico de la hialuronidasa ACS ocasiona una menor toxicidad oftálmica que otras preparaciones de hialuronidasa, mientras que exhibe una eficacia terapéutica deseable en diversas aplicaciones oftálmicas.
La Figura 1 muestra un gel de electroforesis (SDS-PAGE 10%) que demuestra la distribución del peso molecular de la hialuronidasa ACS preferida en comparación con las distribuciones del peso molecular de las hialuronidasas bovinas de tipo VI-S, IV S y I-S y la hialuronidasa ovina de tipo V obtenidas por Sigma Chemical Company, P.O. Box 14508, St. Loius, Missouri 63178. Se cargaron cantidades estandarizadas (es decir, unidades equivalentes de actividad hialuronidasa) de cada enzima en cada banda (badas 2-6) del gel de electroforesis mostrado en la figura 1. La banda 1 del gel de electroforesis mostrado en la figura 1 contiene marcadores del peso molecular en 200,000 116,000, 97,400, 66,000, 45,000, y 31,000, respectivamente. Las bandas 2-6 del gel de electroforesis mostrado en la figura 1 contienen las respectivas preparaciones de hialuronidasa evaluadas, de la siguiente manera:
Banda Lo que hay en la banda
2 Hialuronidasa ACS
3 Hialuronidasa bovina de tipo VI-S
4 Hialuronidasa ovina de tipo V
5 Hialuronidasa bovina de tipo IV-S
6 Hialuronidasa bovina de tipo IS
La banda 2 muestra que la distribución del peso molecular de la hialuronidasa ACS incluye fracciones de peso molecular de 97,400, 50,000 (aprox.) y 45,000 (aprox.), pero está claramente desprovista de fracciones de peso molecular superior a 100,000, entre 60,000 - 70,000 e inferior a 40,000.
Las bandas 3, 4, 5 y 6 del gel de electroforesis de la figura 1 muestran que todas las hialuronidasas testiculares bovinas de tipo VI-S, IV-S y I-S y la hialuronidasa testicular ovina de tipo V evaluadas difieren de la hialuronidasa ACS de la presente invención en que incluyen fracciones de peso molecular entre 60,000-70,000 e inferiores a 40,000. En consecuencia, tres (3) de las cuatro (4) hialuronidasas testiculares bovinas evaluadas (es decir, los tipos VI-S, IV-S y I-S) incluyeron fracciones de hialuronidasa de peso molecular superior a 100,000.
Además, se realizaron zimogramas para comparar las actividades líticas relativas de las cantidades estandarizadas (es decir, unidades equivalentes de actividad hialuronidasa) de la hialuronidasa ACS descrita anteriormente, las hialuronidasas bovinas de tipo VI-S, V, IV-S y I-S en ácido hialurónico, gelatina y caseína. Con respecto a la Figura 2, los métodos específicos mediante los cuales se realizó cada uno de estos zimogramas son los siguientes:
Zimograma para la actividad gelatinolitica
Gelatina - 1 mg/ml de gelatina; 10% de poliacrilamida; tampón durante toda la noche = 50 mM Tris HCl, 5 mM CaCl_{2}, 0.05% de TritonX-100 pH 7.5; solución colorante azul Coomassie; solución decolorante 10% de ácido acético/ 50% de metanol.
Zimograma para la actividad caseinolítica
Caseína - 4 mg/ml; 15% de poliacrilamida; tampón durante toda la noche = 50 mM Tris/HCl, 5 mM CaCl_{2} y 0.05% de Tritón X-100 pH 7.5; solución colorante azul Coomassie; solución decolorante 10% de ácido acético/ 50% de metanol.
Zimograma para la actividad de lisado del ácido hialurónico
Ácido hialurónico - 2 mg/ml, 10% de poliacrilamida; tampón durante toda la noche = solución salina tamponada con fosfato, pH 7.4; 0.5% solución colorante azul alcián en un 3% de ácido acético; solución decolorante 10% de ácido acético/ 50% de metanol.
Los resultados de estos zimogramas de ácido hialurónico, gelatina y caseína están resumidos en la tabla de la figura 2. De forma notable, la hialuronidasa ACS preferida de la presente invención está desprovista de fracciones que lisan el ácido hialurónico de peso molecular superior a aproximadamente 100,000, mientras que cada una de las hialuronidasas testiculares bovinas evaluadas (es decir, los tipos VI-S, IV-S y I-S) contenían fracciones que lisan el ácido hialurónico de peso molecular superior a 100,000.
De forma similar, la hialuronidasa ACS de la presente invención estaba desprovista de las fracciones gelatinolíticas de peso molecular entre aproximadamente 60,000-100,000, mientras que cada una de las hialuronidasas testiculares bovinas evaluadas incluían fracciones gelatinolíticas de peso molecular entre aproximadamente 60,000-100,000.
También, la hialuronidasa ACS de la presente invención estaba desprovista de fracciones caseinolíticas de peso molecular superior a aproximadamente 45,000, mientras que cada una de las hialuronidasas testiculares bovinas (es decir, los tipos VI-S, IV-S y I-S) y la hialuronidasa testicular ovina (tipo V) evaluadas contenían fracciones caseinolíticas de peso molecular superior a aproximadamente 45,000.
La distribución del peso molecular específico y el perfil de actividad enzimática específico de la hialuronidasa (ACS) preferida de la presente invención, y/o la exclusión de timerisol de su formulación, proporciona una preparación de hialuronidasa que no es tóxica al ser administrada en el ojo en niveles de dosificación en los que otras preparaciones de hialuronidasa provocarían efectos tóxicos.
Para el uso en los ejemplos presentados a continuación, la hialuronidasa ACS preferida fue preparada en una formulación sin timerisol con el método y fórmula general descrita a continuación y mostrada en la tabla I. Más específicamente, la hialuronidasa usada en los ejemplos siguientes fue preparada según la formulación específica mostrada en la tabla II a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA II Formulación específica
Ingrediente Cantidad
Hialuronidasa (ACS) 7,200 UI
Lactosa USP 13.3 Mg
Fosfato USP 5 mmoles
Como se describe en los ejemplos siguientes, la formulación específica preferida como hialuronidasa ACS presente en la tabla II (arriba) puede ser inyectada directamente en la cámara posterior del ojo en unos niveles de dosificación que aportan efectos terapéuticos deseables, incluyendo pero no necesariamente limitándose al efecto de eliminación de la hemorragia intravítrea de la presente invención, sin provocar toxicidad significativa en el ojo o las estructuras anatómicas asociadas.
Ejemplo I Toxicidades oftálmicas del timerisol, la hialuronidasa (ACS) y la hialuronidasa (Wydase©) en conejos
Cincuenta y dos (52) conejos sanos de la variedad de cruce de Nueva Zelanda (26 machos, 26 hembras) con un peso de 1.5 kg a 2.5 kg, fueron marcados individualmente para la identificación y alojados individualmente en jaulas suspendidas. Los animales recibieron diariamente un alimento para conejos granulado comercialmente disponible, con agua corriente disponible ad libitum.
Los animales fueron divididos en trece grupos de 4 animales cada uno (2 machos, 2 hembras). Dos animales de cada grupo (1 macho, 1 hembra) fueron seleccionados para una fotografía del fondo de ojo y una angiografía de fluoresceína como pre-tratamiento.
La fotografía del fondo de ojo fue realizada reteniendo a los animales y visualizando el nervio óptico, los arcos retinales y los fondos de ojo con una cámara KOWA© RC-3 Fundus cargada con un carrete Kodak Gold 200 ASA.
La angiografía de fluoresceína consistió en una inyección de 1.5 ml de solución de fluoresceína esterilizada al 2% a través de la vena marginal de la oreja. Aproximadamente 30 segundos tras la inyección, la fluoresceína fue visualizada para la localización del nervio óptico, los vasos retinales y los fondos de ojo.
Al día siguiente, cada animal fue anestesiado mediante la administración intravenosa de una combinación de 34 mg/kg de hidrocloruro de quetamina y 5 mg/kg de xilazina. Los párpados fueron retirados usando un espéculo de párpado, y los ojos fueron desinfectados con un lavado de yodo-providona.
Se administraron tratamientos experimentales de una solución salina equilibrada (BSS), BSS + timerisol, hialuronidasa (Wydase®) o hialuronidasa (ACS) por inyección usando una jeringuilla de tuberculina de 1 cc con un calibre 30 y una aguja de 0.5 pulgadas unida a la misma. La solución de hialuronidasa (ACS) utilizada en este ejemplo no tenía timerisol y constituía la formulación de hialuronidasa ACS preferida específica presentada en la tabla II arriba.
Los tratamientos experimentales administrados a cada grupo de animales fueron los siguientes:
Grupo # Tratamiento
1 BSS
2 BSS + 0.0075 mg de timerisol
3 BSS + 0.025 mg de timerisol
4 Hialuronidasa (Wydase) 1 UI
5 Hialuronidasa (Wydase) 15 UI
6 Hialuronidasa (Wydase) 30 UI
7 Hialuronidasa (Wydase) 50 UI
8 Hialuronidasa (Wydase) 150 UI
9 Hialuronidasa (ACS) 1 UI
10 Hialuronidasa (ACS) 15 UI
11 Hialuronidasa (ACS) 30 UI
12 Hialuronidasa (ACS) 50 UI
13 Hialuronidasa (ACS) 150 UI
Al día siguiente a las inyecciones (Día 1), los 26 animales que fueron sometidos a la fotografía del fondo de ojo y a la angiografía de fluoresceína fueron observados usando los mismos métodos que para el examen previo a la dosis.
En el Día 2 tras las inyecciones, los 13 conejos machos que habían sido sometidos a la fotografía del fondo de ojo y a la angiografía de fluoresceína previa a la dosis y en el Día 1, así como los 13 conejos hembra que no habían sido seleccionados para la fotografía, fueron eutanizados con un medicamento basado en sodio pentobarbital. Los ojos fueron luego extraídos quirúrgicamente y colocados en una solución de fijación de glutaraldehído al 2.5% con 0.1 M de suero salino tamponado con fosfato con un pH 7.37.
De forma alternativa, un conejo seleccionado de forma aleatoria fue eutanizado por inyección de pentobarbital, pero entonces fue fijado por inyección intracardiaca de la solución de glutaraldehído en el ventrículo izquierdo para determinar el efecto del procedimiento de fijación en las conclusiones histológicas en los ojos extraídos.
En el Día 7, los 13 conejos hembra que habían sido previamente fotografiados y realizada la angiografía fueron sometidos a las mismas observaciones siguiendo los métodos previamente descritos.
Los restantes 26 animales fueron eutanizados del modo descrito anteriormente 7 días después de la dosis. Los ojos fueron fijados de la misma manera que los que habían sido fijados el Día 2. Además, un conejo seleccionado de forma aleatoria fue sometido al mismo procedimiento de fijación intracardiaca de glutaraldehido descrito arriba para el animal seleccionado previamente de forma aleatoria.
Los ojos de los animales tratados en este ejemplo fueron examinados a simple vista y microscópicamente en busca de pruebas de toxicidades relacionadas con el tratamiento. En la figura 3 se presenta una tabla que expone un resumen de las pruebas histológicas de toxicidad o no toxicidad en cada grupo de tratamiento. En resumen, los ojos del grupo de control tratado con BSS no presentaron toxicidad en los días 2 y 7 posteriores la dosis.
Los ojos de los animales del grupo nº 2 tratados con BSS + timerisol (0.0075 mg) no presentaron toxicidad en el día 2, pero mostraron pruebas de que había una perforación de la barrera sangre-retina en el día 7.
Los animales del grupo nº 3 tratados con BSS + timerisol (0.025 mg) expusieron severos efectos tóxicos relacionados con el tratamiento, en los días 2 y 7 posteriores a la dosis.
Los animales del grupo nº 4 tratados con Wydase® en una dosis de 1 UI no presentaron toxicidad en los días 2 y 7, no obstante, los ojos de los animales de los grupos nº 5-8 tratados con Wydase® en dosis en la gama de 15 UI a 150 UI expusieron generalmente efectos tóxicos relacionados con la dosis en los días 2 y 7 posteriores a la dosis.
Los ojos de los animales en los grupos de tratamiento nº 9-13 tratados con hialuronidasa (ACS) en dosis en la gama de 1 UI a 150 UI no presentaron muestras de efectos tóxicos en los días 2 y 7 posteriores la dosis.
En consecuencia, se concluye que el timerisol y la formulación de Wydase® que contiene timerisol provocan efectos tóxicos en los ojos de los conejos en las dosis evaluadas, sin embargo, la hialuronidasa (ACS) no provocó efectos tóxicos en estos animales en las dosis evaluadas.
Los resultados de los exámenes llevados a cabo en el día 7 se resumen en la figura 3. Como se muestra en la figura 3, se observaron efectos tóxicos significativos en el día 7 en los ojos de los conejos tratados con BSS + timerisol (0.0075 mg) y hialuronidasa (Wydase) en todas las dosis entre 1 UI y 150 UI. Por el contrario, no se observaron efectos tóxicos en los ojos de los animales tratados con hialuronidasa (ACS) en las dosis entre 1-50 UI.
Ejemplo II Seguridad y eficacia de la hialuronidasa (ACS) inyectada intravitrealmente en ojos de conejo
En este ejemplo, 12 conejos sanos de la variedad de cruce de Nueva Zelanda fueron marcados para la identificación y alojados individualmente en jaulas suspendidas. Los animales recibieron diariamente un alimento para conejos granulado comercial y agua corriente disponible ad libitum.
Los animales fueron divididos de forma aleatoria en cuatro (4) grupos de tratamiento de tres 
\hbox{(3) animales
cada uno.}
Inicialmente, los ojos de cada animal fueron examinados por dilatación con 1-2 gotas de Tropicanide 10% seguido de un examen a simple vista, oftalmoscopia indirecta usando una lente de 20 dioptrías, y un examen con lámpara de hendidura de la anatomía anterior del ojo.
Tras el examen inicial de los ojos de los animales, se inyectaron 100 \mul o 10 \mul de sangre intravitrealmente en cada ojo de cada animal.
En el día 2, los animales de cada grupo de tratamiento recibieron una única inyección intravítrea de BSS o de hialuronidasa (ACS) en el ojo derecho, según el esquema de tratamiento siguiente:
Grupo # Tratamiento
Ojo izquierdo Ojo derecho
A Nada BSS (30 \mul)xl
B Nada 25 UI de hialuronidasa (ACS) en 30 \mul X 1
C Nada 50 UI de hialuronidasa (ACS) en 30 \mul X 1
D Nada 75 UI de hialuronidasa (ACS) en 30 \mul X 1
La preparación dehialuronidasa (ACS) usada en este experimento fue la formulación preferida descrita arriba y mostrada en la tabla II.
En los días 3, 5, 7, 14 y 21 los ojos de cada animal fueron examinados de nuevo con una lámpara de hendidura para evaluar la córnea, la cámara anterior y el iris. Además, los ojos de cada animal fueron dilatados con una solución de Tropicamida 10% y la retina fue examinada por oftalmoscopia indirecta con una lente de 20 dioptrías.
La eficacia observada de la hialuronidasa ACS en la eliminación de la hemorragia se resume en la figura 4. En general, el ojo izquierdo (no tratado) de cada animal en cada grupo de tratamiento tenía un vítreo opacificado y algunos coágulos de sangre, debido a la cantidad de sangre que había sido inyectada en el mismo. Los ojos derechos de los animales tratados con BSS (control) del grupo A también tenían un vítreo opacificado y algunos coágulos de sangre, mientras que los ojos derechos de todos los animales tratados con hialuronidasa en los grupos de tratamiento B-D tenían un vítreo claro y a través del cual era posible la visualización transvítrea de la retina. Además, las retinas de los ojos derechos de todos los animales en los grupos de tratamiento B-D se pudieron observar normales y sin toxicidad relacionada con el tratamiento.
Los resultados de este experimento indican que la hialuronidasa (ACS) administrada intravitrealmente fue eficaz, con dosis únicas de 25-75 UI, para acelerar la velocidad a la que desapareció la sangre de los ojos de los animales tratados y, además, que dichas dosis únicas de hialuronidasa (ACS) administrada en este experimento no causó efectos tóxicos observables en los ojos de los conejos tratados en este experimento.
Las observaciones que siguieron a cada dosis fueron consistentes y se resumen en la figura 5. En general, el ojo izquierdo (no tratado) de cada animal en cada grupo de tratamiento contenía un humor vítreo opacificado y algunos coágulos de sangre, debido a la cantidad de sangre que había sido inyectada en el mismo. Los ojos derechos de los animales tratados con BSS (control) del grupo A también tenían un vítreo opacificado y algunos coágulos de sangre, mientras que los ojos derechos de todos animales en los grupos de tratamiento B-E (es decir, los animales tratados con hialuronidasa (ACS)) tenían un vítreo claro a través del cual era posible la visualización transvítrea de la retina. Además, las retinas de los ojos derechos de todos los animales en los grupos de tratamiento B-D pudieron observarse como normales y sin toxicidad relacionada con el tratamiento, incluso después de múltiples dosis de hialuronidasa ACS.
Los resultados de este experimento indican que la hialuronidasa (ACS) administrada intravitrealmente fue eficaz en dosis únicas de 25-75 UI x 4, para acelerar la velocidad a la que desapareció la sangre de los ojos de los conejos y, además, que tales dosis de hialuronidasa (ACS) no causaron efectos tóxicos observables en los ojos de los conejos tratados, incluso después de cuatro (4) dosis consecutivas de hialuronidasa ACS administradas a intervalos de 2 semanas.
Ejemplo III Eficacia de la hialuronidasa (ACS) en la eliminación de hemorragias en seres humanos
En este experimento, seis (6) pacientes humanos (5 mujeres, 1 hombre) que presentaban hemorragia intravítrea fueron tratados con inyecciones intravítreas únicas de hialuronidasa (ACS) en dosis de 50-200 UI.
La hialuronidasa (ACS) administrada en este experimento fue preparada según la formulación preferida descrita arriba y mostrada en la tabla II.
Todos los pacientes tratados en este experimento tenían un historial de retinopatia diabética, y se observó que presentaban hemorragias intravítreas de duración variable. En cada paciente, la cantidad de sangre presente en el vítreo era suficiente para evitar la visión de la retina mediante medios fundoscópicos estándares.
Cada paciente recibió una única inyección intravítrea de hialuronidasa (ACS). Cuatro (4) pacientes recibieron una dosis de 50 UI, un (1) paciente recibió una dosis de 70 UI, y un paciente recibió una dosis de 200 UI.
Los resultados observados en este experimento se resumen en la figura 6.
En los seis (6) pacientes tratados en este ejemplo, el vítreo hemorrágico se volvió suficientemente claro para permitir la visión transvitreal de la retina en 6-16 días desde la única inyección intravítrea de hialuronidasa (ACS). Esta clarificación del vítreo fue determinada subjetivamente por haber ocurrido significativamente más rápido de lo que cabría esperar en estos pacientes sin el tratamiento de hialuronidasa.
La anterior descripción detallada, los ejemplos y las figuras anexas han descrito la presente invención en referencia a determinadas formas de realización actualmente preferidas de la misma. Los expertos en la técnica podrán apreciar que se pueden realizar diversas derivaciones de las formas de realización específicas y las formulaciones descritas arriba, sin salirse del objetivo pretendido de la presente invención.

Claims (17)

1. Uso de una solución en la preparación de un medicamento para acelerar la desaparición de sangre hemorrágica del humor vítreo de un ojo de mamífero, para ser administrada intravitrealmente, caracterizado por el hecho de que contiene hialuronidasa definida por provocar la hidrólisis de los enlaces endo-N-acetil hexosamínicos de ácido hialurónico, dicha solución siendo:
(a) sin timerisol, y
(b) esencialmente desprovista de fracciones de hialuronidasa de peso molecular superior a 100,000, entre 60,000 y 70,000, e inferior a 40,000, determinado por electroforesis SDS-PAGE 10%.
2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la dosis de hialuronidasa es de 1 Unidad Internacional.
3. Uso según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la dosis de hialuronidasa es de 1-50 Unidades Internacionales.
4. Uso según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la dosis de hialuronidasa es de 25-75 Unidades Internacionales.
5. Uso según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la dosis de hialuronidasa es de 25 Unidades Internacionales.
6. Uso según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la dosis de hialuronidasa es de 50 Unidades Internacionales.
7. Uso según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la dosis de hialuronidasa es de 70 Unidades Internacionales.
8. Uso según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la dosis de hialuronidasa es de 200 Unidades Internacionales.
9. Uso según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la dosis de hialuronidasa es de 10-300 Unidades Internacionales.
10. Uso según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que dicha solución es en forma de una única dosis.
11. Uso según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que dicha solución es en forma de dosis múltiples.
12. Uso según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que dicha solución además comprende los ingredientes lactosa y fosfato.
13. Uso según la reivindicación 12, caracterizado por el hecho de que los ingredientes están disueltos en agua esterilizada, son filtrados de forma esterilizada, y liofilizados en una composición seca.
14. Uso según la reivindicación 13, caracterizado por el hecho de que la composición seca es disuelta en una solución salina equilibrada.
15. Uso según la reivindicación 14, caracterizado por el hecho de que la solución salina equilibrada es una solución para inyección.
16. Uso según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la hialuronidasa es hialuronidasa testicular ovina.
17. Uso de una solución en la preparación de un medicamento para acelerar la desaparición de sangre hemorrágica del humor vítreo de un ojo de mamífero, para ser administrada intravitrealmente, no como un adjunto a una vitrectomía, caracterizado por el hecho de que contiene hialuronidasa definida por provocar la hidroloisis de los enlaces endo-N-acetil hexosamínicos de ácido hialurónico, dicha solución siendo:
(c) sin timerisol, y
(d) esencialmente desprovista de fracciones de hialuronidasa de peso molecular superior a 100,000, entre 60,000 y 70,000, e inferior a 40,000, determinado por electroforesis SDS-PAGE 10%.
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