ES2245587B1 - Metodo analitico para la medida de la actividad enzimatica basado en la deteccion de leucoindigo. - Google Patents
Metodo analitico para la medida de la actividad enzimatica basado en la deteccion de leucoindigo. Download PDFInfo
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Abstract
Método analítico para la medida de la actividad enzimática basado en la detección de leucoindigo, para la cuantificación de enzimas que catalizan la hidrólisis de ésteres indoxílicos, como el 3-indoxil fosfato, generando azul de índigo o algún otro derivado suyo como producto. Los enzimas que intervienen en estos ensayos son del tipo de la fosfatasa alcalina (AP) y la peroxidasa de rábano silvestre (HRP), comunmente utilizados como marcas en inmunoensayos o en reacciones de hibridación de ADN. La metodología descrita se basa en la determinación del azul de índigo a través de su solubilización en medio básico y en presencia de un agente reductor. De este modo se genera leucoíndigo, especie detectable por técnicas con fundamento electroquímico u óptico-espectroscópico. De aplicación al sector de los análisis clínicos.
Description
Método analítico para la medida de la actividad
enzimática basado en la detección de leucoíndigo.
El método objeto de la presente invención
resulta de aplicación a ensayos de afinidad, principalmente en el
sector de los análisis clínicos.
La detección sensible de sustancias de tipo
biológico haciendo uso de ensayos de afinidad, tales como
inmunoensayos o hibridación de ADN, es muy importante en diferentes
áreas: química clínica, microbiología, genética etc.
Para desarrollar ensayos con una alta
sensibilidad es necesario emplear reactivos marcados, generalmente
con enzimas. Aunque un gran número de enzimas han sido empleadas
como "marcas", sin duda alguna, las más utilizadas son la
fosfatasa alcalina y la peroxidasa de rábano silvestre.
La fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1) es una
fosfohidrolasa que cataliza la ruptura de enlaces monofosfóricos
para generar fosfato inorgánico y el correspondiente alcohol, según
el siguiente esquema de reacción:
Este enzima presenta un peso molecular
aproximado de 140 kDa, contiene al menos dos átomos de zinc por
molécula y la presencia de magnesio es considerada esencial para
una actividad máxima. La principal fuente de obtención del enzima es
el intestino de ternero que resulta muy adecuado ya que puede ser
modificado fácilmente sin pérdidas apreciables de actividad.
La fosfatasa alcalina se desnaturaliza
lentamente a 37°C y presenta una actividad óptima a pH comprendido
entre 9-10. Agentes quelantes del Zn y el Mg como
el AEDT actúan como inhibidores, al igual que el fosfato inorgánico.
Las disoluciones reguladoras más empleadas con éste enzima son
determinados aminoalcoholes como la dietanolamina, el
2-amino-1-propanol,
tris(hidroximetil)-aminometano (Tris) y otros
(M.P.Kreuzer, C.K. O'Sullivan, G.G.Guibault, Anal.Chim.Acta,
1999, 393, 95). De todos ellos, el Tris es uno de los más usados.
Estas disoluciones reguladoras no sólo fijan el pH sino que
favorecen la reacción enzimática. ya que son capaces de aceptar
grupos fosfato.
Como marca en ensayos de afinidad la fosfatasa
alcalina presenta la ventaja de que mantiene constante su actividad
catalítica durante elevados periodos de tiempo. Los límites de
detección pueden ser mejorados, por tanto, con un simple aumento
del tiempo de reacción.
Los reactivos inmunológicos conjugados con HRP
presentan una ventaja principal sobre aquellos que están marcados
con AP, ya que el enzima mantiene una mayor actividad específica.
Además, una elevada estabilidad y bajo coste hacen de la HRP el
enzima elegido en la mayoría de estas aplicaciones.
Las peroxidasas son un grupo de enzimas que
catalizan reacciones de reducción-oxidación, siendo
por ello clasificadas como oxidorreductasas. Dentro del amplio
grupo de las peroxidasas se encuentra la peroxidasa de rábano
silvestre (EC 1.11.1.7) (R.Huang, N.Hu, Bioelectrochemistry,
2001, 54, 75), glicoproteina que contiene un grupo hemo en su
centro activo y que presenta un peso molecular aproximado de 44kDa
(C.P.Price, D.J.Newman, Principies and Practice of
Immunoassay, Stockton Press, New York, 1991).
En su modo general de actuación, las peroxidasas
reducen peróxido de hidrógeno a agua mientras oxidan una gran
variedad de sustratos. Son, por tanto, oxidorreductasas que
utilizan el peróxido de hidrógeno como aceptor electrónico para
catalizar reacciones de oxidación. El esquema general de reacción
queda del siguiente modo:
La especificidad del enzima por la especie
denominada donor es bastante baja, por lo que existe una
gran variedad de compuestos que pueden desempeñar tal papel.
Continuamente se encuentran en la bibliografía
nuevos sustratos para la HRP, siendo uno de los más recientes el
TPPN
(5,10,15,20-tetrahydro-tetraphenylporphyrinogen)
(A. Manaka, M.Sakai, S.lgarashi, Anal.Chim.Acta, 2003, 478,
37). Éste, se ha propuesto como un sustrato espectrofotométrico.
El más comúnmente utilizado es el TMB
(3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) del que existen
varias formulaciones comerciales. El producto que se genera es
detectado ópticamente a 450 nm después de detener la reacción con
ácido sulfúrico diluido. Otros sustratos comúnmente utilizados en
inmunoensayos que emplean como marca a la HRP son
o-dianisidina (ODA),
2,2'-azinobis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato
de diamonio (ABTS), y 3,3'-diaminobenzidina
(DAB).
El 3-indoxil fosfato, ha sido
propuesto como el primer sustrato válido para la fosfatasa alcalina
y la peroxidasa de rábano silvestre. Se genera como producto un
heterociclo aromático insoluble en medio acuoso denominado azul de
índigo. Este se solubiliza para su cuantificación, a través de la
adición de ácido sulfúrico concentrado. Se genera, por tanto, un
derivado suyo soluble en disolución acuosa, denominado índigo
carmín. Esta vía de solubilización es la más empleada en ELISAS que
utilizan 3-indoxil fosfato como sustrato, sin
embargo, el uso de ácido sufúrico concentrado no está recomendado en
laboratorios de análisis de rutina. Para eliminar este reactivo se
puede hacer uso de un procedimiento ampliamente extendido en la
industria textil.
Desde la coloración de vestimentas en el antiguo
Egipto hasta los vaqueros Levi's, el índigo ha servido para teñir
tejidos de azul durante 3000 años. El índigo es insoluble en
disoluciones acuosas pero su forma reducida es soluble en medio
básico. Así, en el proceso de tinción, las fibras se ponen en
contacto y se impregnan de esta especie reducida exponiéndose
después al aire libre. De esta forma la especie reducida se reoxida
y queda sobre la fibra la tintura azul original. La reacción básica
del proceso se muestra en la figura 1.
La reducción del índigo tiene lugar en medio
básico y en presencia de un agente químico fuertemente reductor,
siendo el más empleado el ditionito sódico. Sin embargo, otras
alternativas están siendo estudiadas como las sales de hierro (II),
agentes reductores orgánicos de la familia de las
\alpha-hidroxicetonas, el uso de un baño de
ultrasonidos en el proceso de solubilización o una reducción
electroquímica directa en ausencia de agentes químicos (A. Roessler,
O. Dossenbach, U. Meyer, W. Marte, P. Rys, Electrochimica
Acta, 2002, 47, 1989).
Hasta este momento la mención del leucoíndigo ha
ido casi exclusivamente ligada a la industria textil; sin embargo
también puede ir unido al de ensayos que impliquen la medida de la
actividad enzimática en análisis clínicos, ambientales etc.
La figura 1 muestra la reducción directa de
índigo en medio básico y en presencia de ditionito sódico.
La figura 2 representa el espectro de excitación
y emisión de la fluorescencia para el leucoíndigo.
La presente invención supone el empleo de un
agente reductor en medio básico para la solubilización de azul de
índigo o de alguno de sus derivados, característicos por su
insolubilidad en medio acuoso. De este modo se genera leucoíndigo y
a través de su cuantificación se realiza la medida de la actividad
de un enzima. Este enzima puede estar libre en disolución o
actuando como agente de marcaje de reactivos inmunológicos, hebras
de ADN o cualquier otro reactivo que intervenga en ensayos de
afinidad.
El azul de índigo se produce a través de una
reacción enzimática donde el enzima pertenece al grupo de las
fosfatasas, peroxidasas,
beta-D-galactosidasas, estearasas,
sulfatasas, beta-D-glucosidasas y
beta-D-glucoronidasas.
Como sustrato de la reacción enzimática se
utiliza cualquier éster indoxílico que presente un grupo: fosfato,
acetato, sulfato, glucoronato, galactopiranósido, glucopiranósido,
fructopiranósido o manopiranósido.
La presente invención emplea ditionito sódico
como agente reductor, sin embargo, sales de hierro (II),
hidroxicetonas, borohidruro de sodio u otros reductores se pueden
utilizar como reactivos para la generación de leucoíndigo.
El leucoindigo puede ser detectado con técnicas
con fundamento electroquímico u
óptico-espectroscópico. Esta vía de solubilización
del azul de índigo generado enzimáticamente es útil para el revelado
de ensayos de afinidad como ELISAS.
La eficacia del procedimiento se ilustra
adicionalmente mediante el siguiente ejemplo que no pretende ser
limitativo de su alcance. Este ejemplo muestra el empleo de una
disolución básica de ditionito sódico para reducir azul de índigo
(generado enzimáticamente) a leucoíndigo y de este modo cuantificar
peroxidasa o fosfatasa alcalina presentes en disolución. El
sustrato empleado en este caso es el 3-indoxil
fosfato y el sistema de detección electroquímico y
espectrofotométrico.
Las reacciones enzimáticas fueron llevadas a
cabo en placas de pocillos ELISA según el siguiente
procedimiento:
- Bloqueo de la superficie del pocillo con
albúmina. Se añaden a cada uno de los pocillos 200 \muL de una
disolución reguladora PBS 10 mM de pH 7,4 - 8 g/L de NaCl - 2 g/L de
KCI - 3% de albúmina (BSA) y se deja descansar toda la noche a 4°C.
De este modo se evita la posible adsorción del enzima al pocillo
asegurándose que todos los centros activos del mismo estén
disponibles.
- Etapa de lavado. Los pocillos se vacían
de su contenido y se lavan 3-4 veces con una
disolución reguladora correspondiente al mismo medio en el que se
trabajará la siguiente etapa.
- Desarrollo de la reacción enzimática.
Se adicionan sobre los pocillos los reactivos necesarios para que
tenga lugar la reacción. El sustrato común es el
3-indoxil fosfato tanto para la AP, como para la
HRP, siendo necesaria la presencia de H_{2}O_{2} con este último
enzima. La principal diferencia en la reacción enzimática será
únicamente el pH del medio. La reacción se lleva a cabo, en
presencia de una cierta cantidad de albúmina y en estufa
termostatizada a 37°C. Durante toda esta etapa se mantiene una
ligera agitación.
- Parada de la reacción y formación de
leucoíndigo. Transcurrido el tiempo necesario para que se haya
desarrollado la reacción enzimática, ésta se detiene con la adición
de 100 \mul de una disolución de NaOH – 4 M saturada de ditionito
sódico. De este modo, el azul de índigo generado es reducido a
leucoindigo, soluble en medio básico.
- Detección de leucoíndigo. Esta etapa
puede realizarse de modos diferentes en función de la técnica
empleada.
- a)
- Detección electroquímica: se realiza en un sistema de flujo que lleva acoplado un electrodo de pasta de carbono. Se introducen 50 \mul del contenido del pocillo deseado para llenar el loop. Se cambia la posición de la válvula de inyección y el volumen de muestra mencionado es arrastrado por el flujo portador. Sobre el electrodo, previamente activado, se acumula el leucoindigo a -0,2 V y se registra la señal analítica por voltamperometría de corriente alterna barriendo entre -0,7 V y -0,2 V.
- b)
- Detección espectrofotométrica: se utiliza un lector de placas ELISA (midiendo a 405 nm) siendo el procedimiento muy simple. Se introduce la placa en el dispositivo de medida y en unos minutos se obtienen los resultados registrados en papel térmico. Se ha de evitar la presencia de burbujas en disolución y de suciedad en la base de los pocillos.
Siguiendo la metodología descrita, se realizaron
ensayos para la medida de la actividad enzimática de la peroxidasa
de rábano silvestre y de la fosfatasa alcalina, obteniéndose los
siguientes resultados:
- -
- En la determinación de HRP se consigue un calibrado lineal entre 8.74\cdot10^{-12} M y 4.46\cdot10^{-10} M tanto a través de la detección electroquímica como colorimétrica. La reproducibilidad obtenida en ambos casos, para una concentración de HRP situada en el centro del intervalo lineal es inferior al 5%. La sensibilidad (medida como la pendiente de la recta de calibrado) es mayor en el ensayo realizado con detección voltamperométrica.
- -
- En la medida electroquímica de la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina, se obtiene un intervalo lineal entre 7.69\cdot10^{-13} M y 3.92\cdot10^{-11} M representando I (vs) logC. Realizando el mismo ensayo con detección espectrofotométrica, el intervalo lineal abarca las concentraciones comprendidas entre 3.92.10^{-13} y 3.92.10^{-11} M representando I (vs) C.
El azul de índigo generado como producto
enzimático puede ser detectado directamente a través de su
adsorción: sobre el cristal de cuarzo de una microbalanza
piezoeléctrica (sensores piezoeléctricos) (J.M. Abad, F. Pariente,
L. Hernández, H.D. Abruña, E. Lorenzo, Anal. Chem, 1998, 70,
2848) o sobre un electrodo de pasta de carbono (sensores
electroquímicos) (C. Fernández-Sánchez, M.B.
González-García, A. Costa-García,
Biosens. Bioelectron, 2000, 14, 917). Sin embargo, la
mayoría de las metodologías descritas, para la medida de la
actividad enzimática, se basan en su solubilización con ácido
sulfúrico concentrado (M. Díaz-González, C.
Fernández-Sánchez, A. Costa-García,
Anal. Sciences, 2002, 18, 1209). El índigo carmín (soluble) formado
podrá ser detectado electroquímica (M.
Díaz-González, C. Fernández-Sánchez,
A. Costa-García, Anal. Sciences, 2002, 18, 1209) o
espectrofotométricamente (E. L. Roberts, S. Burguieres, I.M. Warner,
Appl. Spectroscopy, 1998, 52, 1305).
La solubilización de azul de índigo con una
disolución reductora en medio básico se presenta como una buena
alternativa, ya que permite eliminar el ácido sulfúrico concentrado
de la metodología de trabajo. Este modo de solubilización
permitiría el uso de sustratos como el 3-IP o el
BCIP (característicos por generar como producto azul de índigo,
insoluble en disoluciones acuosas) en ensayos tipo ELISA que
requieren productos solubles.
El leucoíndigo generado en disolución es
detectado por espectrofotometría de absorción molecular, pero
además es fuertemente fluorescente por lo que ensayos más sensibles
podrán ser realizados. Este producto permite también una sensible
detección electroquímica al adsorberse sobre electrodos de pasta de
carbono previamente pretratados. Por presentar un proceso
electródico reversible a un bajo potencial, es una especie muy
adecuada para llevar a cabo una detección selectiva, por
voltamperometría de corriente alterna o voltamperometría
cíclica.
Claims (8)
1. Método analítico para la medida de la
actividad enzimática basado en la detección de leucoíndigo,
caracterizado por la reducción en medio básico de azul de
índigo o cualquier otro derivado suyo.
2. Un método, según la reivindicación 1,
caracterizado porque la formación de índigo tiene lugar por
la acción de un enzima adecuado sobre un éster indoxílico.
3. Un método, según la reivindicación 2,
caracterizado porque el éster indoxílico es el
3-indoxil fosfato o el
5-bromo-4-cloro-3-indoxil
fosfato.
4. Un método, según la reivindicación 2,
caracterizado porque el éster indoxílico tiene un grupo
fosfato, acetato, sulfato, glucoronato, galactopiranósido,
glucopiranósido, fructopiranósido o manopiranósido.
5. Un método analítico para la medida de la
actividad enzimática basado en la detección de leucoíndigo, según
la reivindicación 2, donde el enzima empleado es del grupo de las
fosfatasas, peroxidasas,
beta-D-galactosidasas, estearasas,
sulfatasas, beta-D-glucosidasas y
beta-D-glucoronidasas.
6. Un método, según la reivindicación 2,
caracterizado porque utiliza como agente reductor una
disolución básica de ditionito sódico.
7. Un método analítico para la medida de la
actividad enzimática basado en la detección de leucoíndigo, según
las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque
utiliza cualquier técnica de fundamento electroquímico u
óptico-espectroscópico en la detección de
leucoíndigo.
8. Un método, según las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque utiliza cualquier técnica
instrumental para la detección de leucoíndigo o de sus
derivados.
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|---|---|---|---|
| ES200400594A ES2245587B1 (es) | 2004-03-05 | 2004-03-05 | Metodo analitico para la medida de la actividad enzimatica basado en la deteccion de leucoindigo. |
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| ES200400594A ES2245587B1 (es) | 2004-03-05 | 2004-03-05 | Metodo analitico para la medida de la actividad enzimatica basado en la deteccion de leucoindigo. |
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| ES2245587A1 ES2245587A1 (es) | 2006-01-01 |
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| ES (1) | ES2245587B1 (es) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0381173A2 (en) * | 1989-02-02 | 1990-08-08 | Abbott Laboratories | Method and device for quantitative chromatography |
-
2004
- 2004-03-05 ES ES200400594A patent/ES2245587B1/es not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
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| EP0381173A2 (en) * | 1989-02-02 | 1990-08-08 | Abbott Laboratories | Method and device for quantitative chromatography |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ANÓNIMO. "Experiment 7. Aldol Condensation: Synthesis of Indigo. Vat Dyeing" Online edition for students of organic chemistry lab courses at the University of Colorado, Boulder, Dept. of Chem. and Biochem. (2003) [en línea] [recuperado el 29.11.2005] Recuperado de Internet: <URL:http://orgchem.colorado.edu/courses/3341manual/AldolLMSu03. pdf> * |
| FERNÁNDEZ-SÁNCHEZ, C. et al.: "3-Indoxyl Phosphate: an Alkaline Phosphatase for Enzyme Immunoassays with Voltammetric Detection", Electroanalysis (1998), Vol. 10, nº 4, pp.: 249-255, todo el documento. * |
| ROESSLER, A. et al.: "Direct Electrochemical Reduction of Indigo", Electrochimica Acta (2002), Vol. 47, pp.: 1989-1995, todo el documento. * |
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| ES2245587A1 (es) | 2006-01-01 |
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