ES2245656T3 - Utilizacion de un vector que comprende un acido nucleico que codifica un factor anti-angiogeno para el tratamiento de las neovascularizaciones de la cornea. - Google Patents

Abstract

Uso de un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un factor anti-angiógeno para la preparación de una composición farmacéutica destinada a administrarse por impregnación de una lentilla blanda y la aplicación de la mencionada lentilla sobre la córnea para la prevención, la mejora y/o el tratamiento de las neovascularizaciones corneales.

Description

Utilización de un vector que comprende un ácido nucléico que codifica un factor anti-angiógeno para el tratamiento de las neovascularizaciones de la córnea.

La presente invención se refiere a la utilización de un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un factor anti-angiógeno para la prevención, la mejora y/o el tratamiento de las neovascularizaciones de la córnea. También se refiere a unas composiciones farmacéuticas y a un dispositivo que permiten la administración local y la eficacia de este vector.

Las queratopatías son enfermedades de la córnea de origen traumático, químico, infeccioso o genético. Las más frecuentes son de origen infeccioso vírico, como las queratopatías por herpes simple o zóster (zona oftálmica, queráticas neuroparalíticas). Las queratopatías traumáticas están provocadas por proyecciones de pequeños objetos como la rotura del parabrisas durante accidentes de circulación, y las queratopatías químicas se pueden deber a las proyecciones de sustancias químicas sobre el globo ocular.

Con frecuencia, el conjunto de estas enfermedades se complica con neovascularizaciones que, en gran parte, son responsables de que la córnea se haga opaca, lo que conduce a la ceguera. El único tratamiento actualmente disponible para devolver la vista al paciente que padece una queratopatía que provoca ceguera complicada por la neovascularización es el injerto de córnea. Aunque es eficaz, sin embargo, este enfoque está considerablemente limitado por la ausencia de injertos: así, en Francia se observa un déficit anual de 3000 injertos. Este dato ilustra la necesidad de nuevos tratamientos de las queratopatías que provocan ceguera.

El ojo está formado por un segmento anterior que comprende la córnea, una cámara anterior llena de un humor acuoso, el iris y el cristalino, y un segmento posterior del que forman parte la retina, la coroides y la parte posterior de la esclerótica. La córnea comprende desde la superficie hasta el fondo del ojo, el epitelio corneal, la membrana basal de Bowman, el estroma corneal y la membrana de Descernet sobre la que descansa el endotelio corneal. La córnea, una envoltura fibrosa y transparente, no contiene ningún vaso sanguíneo ni linfático. Se nutre por difusión de los metabolitos a partir del humor acuoso y de los vasos sanguíneos del limbo (unión esclerocorneal) y recibe una parte del O_{2} directamente a partir del entorno exterior.

La red sanguínea del ojo se deriva de la arteria oftálmica por dos sistemas separados: los vasos de las retina y el sistema vascular uvéal, que comprende las redes vasculares del iris, del cuerpo ciliar y de la coroides. Este árbol vascular se puede modificar en circunstancias patológicas, caracterizadas por una disminución del flujo sanguíneo o de la cantidad de oxígeno. Entonces, los neovasos se originan a partir de pequeños bucles vasculares del que emergen vénulas, en el reborde de zonas de isquemia. La membrana basal de estas vénulas se fragmenta por el efecto de las enzimas proteolíticas y, así, permite una migración de las células endoteliales. Éstas cambian de forma, se multiplican, luego se llenan de vacuolas que progresivamente confluyen y se organizan para formar verdaderas luces vasculares. La mala impermeabilidad de las uniones interendoteliales y la interrupción de la membrana basal de estos neovasos aumenta su permeabilidad y supone una extravasación de hematíes.

Así, esta neovascularización o angiogenia se encuentra en el origen de la mayoría de las enfermedades visuales que provocan una disminución de la agudeza visual, incluso la ceguera. La proliferación de los vasos límbicos en las capas superficiales de la córnea aparece en numerosas condiciones patógenas como determinadas queratoconjuntivitis víricas, especialmente las causadas por el virus del herpes, y los edemas. Otra forma de neovascularización susceptibles de causar la ceguera se encuentra en el caso de los terigiones en los que la membrana de origen conjuntivo con portavasos progresa desde la conjuntiva periocular hacia la superficie corneal y, a veces, profundiza hacia el estroma corneal. Los terigiones pueden igualmente obligar a los injertos de la córnea, algunas veces muy difíciles y susceptibles, de nuevo, a provocar neovascularizaciones corneales.

Los inventores han puesto a punto un método particularmente eficaz para prevenir y/o tratar las neovascularizaciones corneales, que consiste en la administración en el ojo de una composición farmacéutica que comprende un vector que codifica un factor anti-angiógeno, combinada con la aplicación de una lente de contacto blanda sobre la córnea. La lente de contacto se puede aplicar antes, de manera concomitante, o después de la administración de la composición que comprende el vector. Preferiblemente, la administración de la composición que contiene el vector es concomitante a la aplicación de la lente de contacto, y más preferiblemente, la administración se lleva a cabo mediante la impregnación previa de la lente de contacto con la composición que comprende el mencionado vector, antes de aplicar la mencionada lentilla sobre la córnea.

La composición farmacéutica que comprende el vector puede estar en cualquier forma adaptada a un uso ocular y, particularmente, en forma de colirio o de pomada oftálmica. Preferiblemente, la composición farmacéutica se presenta en forma de colirio.

Para estudiar el efecto de los factores anti-angiógenos en la prevención y el tratamiento de las enfermedades oculares relacionadas con la neovascularización, la solicitante ha utilizado dos modelos animales de ratas que presentan neovascularizaciones corneales. La transferencia de ácidos nucleicos que codifican factores anti-angiógenos se ha realizado en el medio de adenovirus recombinantes defectuosos que codifican diferentes factores anti-angiógenos, administrados por instilación ocular o por aplicación de lentillas flexibles previamente empapadas de una disolución que contiene los adenovirus. Inesperadamente, la solicitante ha puesto de manifiesto que la transferencia a la córnea de un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un factor anti-angiógeno por medio de una lente de contacto, preferiblemente impregnada de una disolución que comprende dicho vector, permite prevenir y tratar las neovascularizaciones corneales con una eficacia nunca igualada hasta entonces.

Entre los diferentes factores anti-angiógenos utilizables en el ámbito de la presente invención, se puede citar especialmente: el fragmento del extremo amino del activador del plasminógeno uPA (ATF) (Apella et al. J. Biol. Chem. 263, 4437-4440 (1987)), la angiostatina (M. O'Reilly et al, Cell 79, 1157-1164 (1994)) y, en particular, la angiostatina K3 (fragmento amino terminal 1-333 del plasminógeno humano), la endostatina (M. O'Reilly et al. Cell 88, 277-285 (1997)), el fragmento de 16 kDa de la prolactina (C. Clapp et al. Endocrinol. 133, 1292-1299 (1993)) o el factor plaquetario 4 PF-4 (S. K. Gupta et al. P.N.A.S USA 92, 7799-7803 (1995)).

Un primer objeto de la invención se refiere a la utilización de un vector que comprende un ácido nucleico que codifica, al menos, un factor anti-angiógeno para la preparación de una composición farmacéutica destinada a administrarse por impregnación de una lentilla flexible y la aplicación de la mencionada lentilla sobre la córnea para la prevención, la mejora y/o el tratamiento de neovascularizaciones corneales.

Preferiblemente, el ácido nucleico que codifica el factor anti-angiógeno es un ácido nucleico que codifica un polipéptido escogido entre el fragmento amino terminal del activador del plasminógeno uPA (ATF), la angiostatina, la angiostatina K3, la endostatina, el fragmento de 16 KDa de la prolactina o el factor plaquetario 4 (PF-4), o una combinación de ácidos nucleicos que codifican, al menos, dos de estos factores. Más preferiblemente aún, el factor anti-angiógeno se escoge entre el fragmento amino terminal del activador del plasminógeno uPA (ATF) y la angiostatina K3.

Según un modo particular, el factor anti-angiógeno es una variante de los factores citados anteriormente. Según la presente invención, se entiende por "variante" de un polipéptido o de una proteína a cualquier análogo, fragmento, derivado o forma mutada que se deriva de un polipéptido o de una proteína, y que conserva la función anti-angiógena de dicho polipéptido o de dicha proteína. Pueden existir, en estado natural, diferentes variantes de un polipéptido o de una proteína. Estas variantes pueden ser variaciones alélicas caracterizadas por diferencias en la secuencia nucleotídica de los genes estructurales que codifican la proteína o pueden ser el resultado de un ayuste diferencial o de modificaciones pos-traduccionales. Estas variantes se pueden obtener por sustitución, deleción, adición y/o modificación de uno o más restos de aminoácidos. Estas modificaciones se pueden realizar por medio de todas las técnicas conocidas por el experto en la técnica.

Estas variantes son, especialmente, moléculas que tienen una mayor afinidad por sus sitios de fijación, secuencias que permiten mejorar la expresión in vivo, moléculas que presentan un mayor resistencia a las proteasas, moléculas que tienen una mayor eficacia terapéutica o menores efectos secundarios o, posiblemente, nuevas propiedades biológicas.

Otras variantes utilizables en el ámbito de la invención son, especialmente, las moléculas en las que se han sustituido uno o varios restos, los derivados obtenidos por deleción de las regiones que intervienen poco o nada en la interacción con los sitios de unión considerados, o que expresan una actividad no deseable, y los derivados que contienen, con relación a la secuencia natural, restos adicionales, como, por ejemplo, una señal de secreción y/o un péptido de unión.

La secuencia de ADN que codifica el factor anti-angiógeno utilizada en el ámbito de la presente invención puede ser un ADNc, un ADN genómico (ADNg) o una construcción híbrida que consiste, por ejemplo, en un ADNc en el que se insertarían uno o varios intrones. Se puede tratar de un ácido nucleico de origen animal o humano, y preferiblemente se trata de un ácido nucleico de origen humano. También se puede tratar de secuencias sintéticas o semisintéticas. De manera particularmente ventajosa, se utiliza un ADNc o un ADNg. Particularmente, la utilización de un ADNg puede permitir mejorar la expresión en las células humanas.

Ventajosamente, la secuencia que codifica el factor anti-angiógeno se coloca bajo control de señales que permiten su expresión en las células del epitelio corneal. Preferiblemente, se trata de señales de expresión heterólogas, es decir, señales diferentes de aquéllas naturalmente responsables de la expresión del factor anti-angiógeno. En particular, se puede tratar de secuencias responsables de la expresión de otras proteínas, o de secuencias sintéticas. Particularmente, se puede tratar de secuencias promotoras de genes eucarióticos o víricos. Por ejemplo, se puede tratar de secuencias promotoras procedentes del genoma de la célula que se desea infectar. Así mismo, se puede tratar de secuencias promotoras procedentes del genoma de un virus, incluido el adenovirus utilizado. En cuanto a esto, se pueden citar, por ejemplo, los promotores EIA, MLP, CMV, LTR-RSV, etc. Por otra parte, se pueden modificar estas secuencias de expresión por la adición de secuencias de activación, de regulación, o que permiten una expresión específica del tejido. En efecto, puede ser particularmente interesante utilizar señales de expresión activas, específicamente o mayoritariamente, en las células de la córnea, de manera que no se exprese la secuencia del ADN ni se produzca su efecto salvo cuando el vector realmente infecte estas células.

El ácido nucleico que codifica uno o varios factores anti-angiógenos se introduce en un vector. En la presente invención, por "vector" se entiende todo medio que permite la transferencia de un ácido nucleico en una célula hospedadora, preferiblemente en los tejidos del ojo y, más particularmente, en la córnea. El término "vector" comprende los vectores víricos y los no víricos para la transferencia de un ácido nucleico en una célula in vivo o ex vivo. Un tipo de vector para poner en funcionamiento la invención puede ser, por ejemplo, un plásmido, un cósmido o cualquier ADN no encapsulado por un virus, un fago, un cromosoma artificial, un virus recombinante, etc. Preferiblemente, se trata de un plásmido o de un virus recombinante.

Entre los vectores de tipo plasmídico, se pueden citar todos los plásmidos de clonación y/o de expresión conocidos por el experto en la técnica y que, generalmente, contienen un origen de replicación. También se pueden citar plásmidos portadores de orígenes de replicación y/o marcadores de selección perfeccionados, como los descritos, por ejemplo, en las solicitudes de las patentes internacionales WO 96/26270 y WO 97/10343.

Entre los vectores de tipo virus recombinante, se pueden citar preferiblemente los virus adenovirus, retrovirus, virus del herpes, los lentivirus, los virus adenoasociados recombinantes o el virus SV40. La construcción de este tipo de virus recombinantes de replicación defectuosa se ha descrito ampliamente en la bibliografía, así como las propiedades de infección de estos vectores (véanse, especialmente, S. Baeck y K. L. March (1998), Circul. Research vol 82, pp 295-305), T. Shenk, B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley et al (1996), Adenoviridae: the viruses and their replication (in virology). pp 211-2148, Eds- Ravenspublishers, Filadelfia, P. Yeh y M. Perricaudet (1997), FASEB, vol. 11, pp 615-623.

Un virus recombinante particularmente preferible para la realización de la invención es un adenovirus recombinante defectuoso.

Los adenovirus son virus de ADN bicatenario lineal de un tamaño aproximado de 36 kilobases (kb). Existen diferentes serotipos, cuya estructura y propiedades varían un poco, pero que presentan una organización genética comparable. Más particularmente, los adenovirus recombinantes pueden ser de origen humano o animal. Con respecto a los adenovirus de origen humano, se pueden citar preferiblemente los clasificados en el grupo C, en particular los adenovirus de tipo 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) ó 12 (Ad12). Entre los diferentes adenovirus de origen animal, se pueden citar preferiblemente los adenovirus de origen canino y, especialmente, todas las cepas de los adenovirus CAV2 [cepa Manhattan o A26/61 (ATCC VR-800), por ejemplo]. Se citan otros adenovirus de origen animal especialmente en la solicitud de patente internacional WO 94/26914.

El genoma de los adenovirus comprende especialmente una secuencia invertida repetida (ITR) en cada extremo, una secuencia de encapsidación (Psi), genes tempranos y genes tardíos. Los principales genes tempranos se sitúan en las regiones E1, E2, E3 y E4. Entre estos, los genes que aparecen en la región E1 son especialmente necesarios en la propagación vírica. Los principales genes tardíos se sitúan en las regiones L1 a L5. Se ha secuenciado totalmente el genoma del adenovirus Ad5 y se puede acceder a él en las bases de datos (véase, particularmente, Genbank M73260). Así mismo, también se han secuenciado partes, incluso la totalidad, de otros genomas adenovíricos (Ad2, Ad7, Ad12, etc).

Para su utilización como vectores recombinantes, se han preparado diferentes construcciones derivadas de adenovirus que incorporan diferentes genes terapéuticos. En cada una de estas construcciones se ha modificado el adenovirus para hacerlo incapaz de replicarse en la célula infectada. Así, las construcciones descritas en la técnica anterior son adenovirus a los que se ha delecionado la región E1, esencial para la replicación del virus, en lugar de la cual se insertan las secuencias del ADN heterólogo (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161). Por otro lado, para mejorar las propiedades del vector, se ha propuesto crear otras deleciones o modificaciones en el genoma del adenovirus. Así, se ha introducido una mutación puntual termosensible en el mutante ts125, lo que permite inactivar la proteína de 72 KDa de unión al ADN (DBP). (Van der Vliet et al., J. Virol., 1975, 15(2) 348-354). Otros vectores comprenden una deleción de otra región esencial para la replicación y/o la propagación del virus: la región E4. La región E4 está, de hecho, implicada en la regulación de la expresión de los genes tardíos, en la estabilidad de los ARN nucleares tardíos, en la extinción de la expresión de las proteínas de la célula hospedadora y en la eficacia de la replicación del ADN vírico. Así pues, los vectores adenovíricos en los que se han eliminado las regiones E1 y E4 poseen un ruido de fondo de transcripción y una expresión de genes víricos muy reducidos. Tales vectores se han descrito, por ejemplo, en las solicitudes de patentes internacionales WO 94/28152, WO 95/02697 y WO 96/22378. Además, se han descrito también vectores que portan una modificación en el gen IVa2 (patente internacional WO 96/10088).

En un modo preferido de realización de la invención, el adenovirus recombinante es un adenovirus humano del grupo C. Más preferiblemente, se trata de un adenovirus Ad2 o Ad5.

Ventajosamente, el adenovirus recombinante utilizado en el ámbito de la invención comprende una deleción en la región E1 de su genoma. Aún más particularmente, comprende una deleción de las regiones E1a y E1b. A modo de ejemplo, se pueden citar deleciones que afectan los nucleótidos 454 a 3328, 386 a 3446 ó 357 a 4020 (por referencia al genoma del Ad5).

Según otra variante, el adenovirus recombinante utilizado en el ámbito de la invención comprende, además, una deleción en la región E4 de su genoma. Más particularmente, la deleción en la región E4 afecta al conjunto de las marcos abiertos. A modo de ejemplo preciso, se pueden citar las deleciones 33466 a 35535 ó 33093 a 35535. Otros tipos de deleciones en la región E4 se describen en las solicitudes de patentes internacionales WO 95/02697 y WO 96/22378.

El casete de expresión que contiene el ácido nucleico que codifica un factor anti-angiógeno se puede insertar en diferentes sitios del genoma recombinante. Se puede insertar en la región E1, E3 o E4, como sustitución de las secuencias eliminadas o sobrantes. También se puede insertar en cualquier otro sitio, fuera de las secuencias necesarias en cis para la producción de virus (secuencias ITR y secuencias de encapsidación).

Dentro de la presente invención, por "casete de expresión" se entiende un ácido nucleico, un fragmento de ADN que se puede insertar en un vector en los sitios de restricción específicos; el fragmento del ADN comprende, además de la secuencia nucleotídica que codifica un ARN o un polipéptido de interés, las secuencias necesarias para la expresión (potenciador(es), promotor(es), secuencia de poliadenilación ...) de dicha secuencia de interés. El fragmento del ADN y los sitios de restricción se han concebido para asegurar una inserción de dicho fragmento en un marco de lectura apropiado para la transcripción y/o la traducción.

Los adenovirus recombinantes se producen en una estirpe de encapsidación, es decir, un linaje de células capaces de complementar en trans una o más de las funciones defectuosas del genoma del adenovirus recombinante. Entre las estirpes de encapsidación que conoce el experto en la técnica, se puede citar, por ejemplo, la estirpe 293 en la que se ha integrado una parte del genoma del adenovirus. Más precisamente, la estirpe 293 es una línea de células embrionarias humanas de riñón que contiene el extremo izquierdo (aproximadamente, del 11 al 12%) del genoma del adenovirus serotipo 5 (Ad5), que comprende la ITR izquierda, la región de encapsidación, la región E1, incluidas E1a y E1B, la región que codifica la proteína pIX y una parte de la región que codifica la proteína pIVa2. Esta estirpe puede trans-complementar los adenovirus recombinantes con una región E1 defectuosa, es decir, desprovistos de toda o de parte de la región E1, y producir soluciones de virus que tengan titulaciones elevadas. Esta estirpe también puede producir, a la temperatura permisiva (32ºC), surtidos de virus que contienen, además, la mutación E2 termosensible. Se han descrito otras estirpes celulares que pueden complementar la región E1, que particularmente se basan en células del carcinoma de pulmón humano A549 (patente internacional WO 94/28152) o en retinoblastos humanos (Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Además, también se han descrito estirpes capaces de trans-complementar varias funciones del adenovirus. En particular, se pueden citar estirpes que complementan las regiones E1 y E4 (Yeh et al., J. Virol. vol. 70 (1996) pp 559-565; Cancer Gen. Ther. 2 (1995) 322; Krougliak et al., Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1975) y estirpes que complementan las regiones E1 y E2 (patentes internacionales WO 94/28152, WO 95/02697, WO 95/27071).

Los adenovirus recombinantes normalmente se producen al introducir el ADN vírico en la estirpe de encapsidación, seguido de una lisis de las células después aproximadamente 2 ó 3 días (la cinética del ciclo del adenovirus es de 24 a 36 horas). Para llevar a cabo el procedimiento, el ADN vírico introducido puede ser el genoma vírico recombinante completo, posiblemente construido en una bacteria (patente internacional WO 96/25506) o en una levadura (patente internacional WO 95/03400), transfectado en las células. También se puede tratar de un virus recombinante utilizado para infectar la estirpe de encapsidación. También se puede introducir el ADN vírico en forma de fragmentos que portan cada uno una parte del genoma vírico recombinante y una zona de homología que permite, después de introducirlo en la célula de encapsidación, reconstituir el genoma vírico recombinante por recombinación homóloga entre los diferentes fragmentos.

Después de la lisis de las células, se aíslan las partículas víricas recombinantes por centrifugación en gradiente de cloruro de cesio. Se ha descrito un método alternativo en la solicitud de patente internacional WO 98/00528 incorporada en la presente invención por referencia.

A modo de ejemplo del vector adecuado para la realización de la presente invención, se pueden citar particularmente: el adenovirus recombinante defectuoso que comprende el gen que codifica el fragmento ATF (Ad.CMV.ATF) como se describe en la solicitud de patente internacional WO 98/49321, el adenovirus recombinante defectuoso que comprende el gen que codifica la angiostatina K3 (Ad-K3) como se describe en la solicitud de patente internacional WO 98/49321.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un vector como el descrito anteriormente y un vehículo fisiológicamente aceptable para una formulación destinada a administrarse en el ojo, particularmente, por instilación. Particularmente, se puede tratar de soluciones salinas (fosfato monosódico, disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, etc, o de mezclas de tales sales) estériles, isotónicas o de composiciones secas, particularmente liofilizadas, que por adición, según caso, de agua esterilizada o de suero fisiológico permiten constituir disoluciones destinadas a una instilación ocular.

Las dosis utilizadas para la instilación o la impregnación de las lentes de contacto se pueden adaptar en función de diferentes parámetros y, particularmente, en función del modo de administración utilizado, de la naturaleza química de las lentes de contacto, del gen a expresar, o incluso de la duración de la expresión buscada. Generalmente, los virus recombinantes según la invención se formulan y se administran en forma de dosis comprendidas entre 10^{4} y 10^{14} ufp, preferiblemente de 10^{6} a 10^{10} ufp. El término "ufp" (unidades formadoras de placas) corresponde al poder infeccioso de una disolución vírica y se determina infectando un cultivo celular apropiado, y mide el número de calvas de células infectadas. Las técnicas de determinación del título de las ufp de una disolución de virus se documentan bien en la bibliografía.

Además, las composiciones según la invención también pueden comprender un agente de transferencia químico o bioquímico. Por "agente de transferencia químico o bioquímico" se entiende cualquier compuesto (a saber, cualquiera que no sea un virus recombinante) que facilite la penetración de un ácido nucleico en una célula. Se puede tratar de agentes no víricos catiónicos, como lípidos catiónicos, péptidos, polímeros (polietilenimina, polilisina), nanopartículas; o de agentes no víricos no catiónicos, como liposomas no catiónicos, polímeros o nanopartículas no catiónicas.

Según un modo preferido, las composiciones de acuerdo con la invención comprenden un vector recombinante defectuoso que comprende un gen que codifica un factor anti-angiógeno, y éstas se formulan para una instilación intraocular. Ventajosamente, las composiciones de la invención comprenden de 10^{4} a 10^{4} ufp y, preferiblemente, de 10^{6} a 10^{10} ufp. El título de las disoluciones utilizadas para la impregnación de las lentes de contacto se encuentra entre 1 x 10^{6} y 1 x 10^{12} ufp/ml y, preferiblemente, entre 1 x 10^{8} y 1 x 10^{10} ufp/ml.

La invención también se refiere a un kit que comprende un recipiente que contiene una composición tal cual precipitada y, al menos, una lente de contacto y la utilización del kit para la preparación de un medicamento destinado a administrarse por impregnación de una lentilla para la prevención, la mejora y/o el tratamiento de las neovascularizaciones corneales.

Las lentes de contacto utilizables en el ámbito de la presente invención las conoce bien el experto en la técnica y, preferiblemente, son lentes de contacto blandas, como las descritas particularmente en Künzler et al. [Chemistry & Industry, 651-655 (1995); Künzler et al. (TRIP, vol. 4 (2) 52-59 (1996); J. Singh et al. (J. M. S. Rev. Macromol. Chem. Phys. C32 (3&4), 521-534 (1992); J. C. Wheeler et al. (Journal of long-term effects of Medical implants, 6 (3&4): 207-217 (1996)].

La invención también tiene por objeto un procedimiento de preparación de un medicamento útil para la prevención, la mejora y/o el tratamiento de las neovascularizaciones corneales, caracterizado por que se mezcla un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un factor anti-angiógeno con uno o varios adyuvantes compatibles y farmacéuticamente aceptables.

La presente invención se describirá más en detalle con la ayuda de los ejemplos que siguen, que se deben considerar como ilustrativos y no limitantes.

Leyenda de las figuras

Figura 1: revelado de la expresión de la \beta-galactosidasa por inmunohistoquímica sobre un corte de córnea de rata adulta incluida en parafina (5 \mum) y que ha estado en contacto con una lentilla impregnada de 2,10^{7} ufp con Ad.\beta-gal) durante 72 h. Tinción con Hémalun. A: córnea neovascularizada originada por una raspadura superficial, aumento x 265. B: marcación nuclear de células epiteliales reveladas con un anticuerpo anti-\beta-gal, aumento x 1310. C: córnea avascular normal de testigo, aumento x 525 (e: epitelio; en: endotelio; neovs: neovasos; s: estroma).

Figura 2: fotografía de una neovascularización corneal (triángulo negro) inducida por suturas (flechas negras) colocadas en la córnea de una rata adulta dos semanas antes. Aumento x 24.

Figura 3: efecto anti-angiógeno preventivo de una lentilla impregnada de una disolución adenovírica (Ad.CMV.ATF, figuras B y D; Adk3, figuras A y C). Aumento x 20. A y B corresponden a las córneas que han permanecido en contacto con la lentilla durante una semana. C y D corresponden a las córneas que han permanecido en contacto con la lentilla durante dos semanas.

Materiales y métodos Técnicas generales de la biología molecular

Los métodos utilizados clásicamente en biología molecular como las extracciones preparativas del ADN plasmídico, la centrifugación del ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio, la electroforesis en geles de agarosa o de acrilamida, la purificación de fragmentos de ADN por electroelución, las extracciones de proteínas con fenol o con fenol-cloroformo, la precipitación del ADN en una solución salina con etanol o isopropanol, la transformación de Escherichia coli, etc., los conoce bien el experto en la técnica y se describen abundantemente en la bibliografía [Maniatis T. et al. "Molecular cloning, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (eds), "Current protocols in Molecular biology", John Wiley & Sons, Nueva York, 1987].

Para las ligaciones, se pueden separar los fragmentos del ADN según su tamaño por electroforesis en geles de agarosa o de acrilamida, extraerlos con fenol o con una mezcla fenol/cloroformo, precipitarlos en etanol, y luego incubarlos en presencia de la ADN ligasa del fago T4 (Biolabs), según las recomendaciones del fabricante.

El relleno de los extremos 5' protuberantes se puede efectuar mediante el fragmento Klenov de la ADN polimerasa I de E. coli (Biolabs), según las especificaciones del fabricante. La destrucción de los extremos 3' protuberantes se efectúa en presencia de la ADN polimerasa del fago T4 (Biolabs) utilizada según las recomendaciones del fabricante. La destrucción de los extremos 5' protuberantes se efectúa mediante un tratamiento a cargo de la nucleasa S1.

La mutagénesis dirigida realizada in vitro por oligodesoxinucleótidos sintéticos se puede efectuar según el método desarrollado por Taylor et al., [Nucleic Acid Res. 13 (1985) 8749-8764], utilizando el kit distribuido por Amersham.

La amplificación enzimática de los fragmentos del ADN por la técnica denominada PCR [ Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al. Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K. B. y Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] se puede efectuar utilizando un "termociclador de ADN" (Perkin Elmer Cetus), según las especificaciones del fabricante.

La verificación de las secuencias nucleotídicas se puede efectuar con el método desarrollado por Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci USA, 74 (1977) 5463-5467], utilizando el kit distribuido por Amersham.

Modelo de neovascularización corneal en ratas

Treinta ratas Wistar macho adultas, de 150 g, se anestesian por una inyección intraperitoneal de 15 mg de ketamina y 1,5 mg de xilazina. La anestesia general se completa con una anestesia tópica con ayuda de una gota de clorhidrato de oxibuprocaína (Novésine®) en la córnea. Se han probado dos modelos: un modelo por suturas dentadas y un modelo para raspadura.

Modelo por suturas dentadas: se utilizan veinte ratas para evaluar este modo de inducción de neovascularización corneal. Se colocan tres suturas dentadas (nilón 8-0, aguja de 50 \mum) a través de la córnea central del ojo derecho del animal en condiciones asépticas, utilizando un microscopio operatorio (Zeiss). El ojo izquierdo no operado sirve de control. Con un biomicroscopio fotográfico se vigila el desarrollo de los neovasos corneales en las córneas. Para cuantificar la neovascularización corneal, con doble anonimato, el ojo se divide en cuatro cuadrantes corneales idénticos y la neovascularización de cada uno se gradúa de 0 a 3, por tramos de 0,5. Así, la puntuación para cada ojo va de 0 a 12 (W. Streilen et al. Invest. Ophtamol. Vis. Sci. 37: 413-424).

Modelo por raspadura: los epitelios corneal y límbico del ojo derecho de diez ratas se retiran por raspadura quirúrgica durante 10 min con la ayuda de un escalpelo a 15º, luego, por desbridamiento en etanol (EtOH) de 100º con un microscopio operatorio (Zeiss), (A. Huang et al. 1988, Ophtalmology, 95, 228-235). Las córneas desnudadas cicatrizan en unos diez días y se vascularizan. Luego, se evalúa la neovascularización corneal como se describe en el modelo por suturas dentadas, y el ojo izquierdo no operado sirve de control.

Preparación y colocación de las lentillas: las lentillas blandas desechables se tallan con un sacabocados de un diámetro inferior al de la córnea de la rata (3 mm), luego se colocan en presencia, durante una a dos hora(s) a temperatura ambiente, de las disoluciones adenovíricas AdK3, Ad.CMV.ATF o Ad.CMV\betagal de 4,5 x 10^{5} ufp (unidad formadora de placas), 10^{6} upf y 2 x 10^{7} ufp por cada lentilla, respectivamente. Las lentillas de control también se realizan con glicerol al 10%, vehículo en el cual se diluye cada adenovirus. Una vez que se ha colocado la lentilla sobre la córnea derecha de la rata, se vuelve a cerrar cuidadosamente el ojo practicando una tarsorrafia (seda 6-0, aguja/ de 50 \mum), y el ojo izquierdo no operado sirve de control.

La expresión del transgén por los adenovirus se detecta gracias a las técnicas 1) de revelado por colorimetría sobre cortes congelados, para revelar únicamente la \beta-galactosidasa, o 2) de inmunohistoquímica sobre cortes en parafi-
na.

1) Las ratas Wistar recién nacidas reciben una lentilla de Ad.CMV\betagal sobre el ojo derecho. Para esto, se anestesian los animales por inmersión en hielo, luego se corta cuidadosamente el párpado paralelamente a su futura línea de apertura, con ayuda de unas tijeras de Dowell combadas a 45º y de unas pinzas microquirúrgicas. Una vez que se ha colocado la lentilla sobre la córnea, se vuelve a cerrar el ojo con la ayuda de hilo de seda 6,0.

2) Doce ratas adultas sin neovascularización corneal (cuatro animales por lote) reciben una lentilla, bien de AdK3, de Ad.CMV.ATF o de Ad.CMV\betagal sobre el ojo derecho, y tres ratas con neovascularización se operan con una lentilla de Ad.CMV\betagal. Se realiza una tarsorrafia para volver a cerrar el ojo operado.

Técnicas de revelado: se utilizan tres técnicas diferentes para detectar la \beta-galactosidasa. Se sacrifican los animales por elongación cervical 72 horas después de colocar la lentilla, se abren los párpados y se enuclean los ojos con las pinzas. La \beta-galactosidasa se detecta en el ojo entero, en cortes congelados de 14 \mum o en cortes en parafina de 5 \mum de grosor.

a) En el ojo entero: después de la fijación en glutaraldehído al 0,5% durante 1 hora a temperatura ambiente, se sumerge cada ojo (de rata adulta o recién nacida) en una disolución de PBS al 1X que contiene 2 mM de MgCl_{2}, y luego se limpia de los tejidos musculares residuales con una lupa binocular (Leica). Entonces, se incuba cada ojo en una disolución de revelado de K_{3}Fe(CN)_{6} a 5 mM, K_{4}Fe(CN)_{6} a 5 mM, MgCl_{2} a 2 mM, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D galactósido (X-gal) a 1 mg/ml durante 2 horas, a 37ºC. Después de varios lavados en PBS al 1x, se fotografía el ojo bajo una lupa binocular.

b) Cortes congelados de 14 \mum: los ojos de rata recién nacida se fijan inmediatamente en glutaraldehído al 0,5% durante 1 hora a temperatura ambiente y después se crioprotegen en sacarosa al 15% durante 30 minutos. Luego, se depositan los ojos en unas copitas de plástico sólido que contienen un medio de inclusión (Tissue Tek) que, una vez congelado en isopentano a -30ºC, permite conservar los tejidos a -80ºC. Se cortan los ojos a 14 \mum en el criostato (Leica). Luego, la disolución de revelado se deposita directamente sobre las copitas, en un cuarto húmedo, durante 2 horas a 37ºC. Después de tres enjuagues de 10 minutos en PBS al 1x, se contra-colerean los cortes con rojo neutro al 1%, se deshidratan en unos baños de graduación de alcohol creciente: 80º, 95º y 100º, y luego se montan entre cubreobjetos y portaobjetos en el eukitt.

c) Cortes en parafina de 5 \mum de grosor: el método de detección de la \beta-galactosidasa por inmunohistoquímica es un técnica mucho más sensible que el método de revelado clásico por colorimetría. Después de 48 horas de inmersión en el fijador de Davidson, se disecan cuidadosamente los ojos de rata adulta para retirar el cristalino, se disponen en un casete de plástico y se colocan en el cesto de un robot que realiza el siguiente ciclo de tratamiento: formol al 10%, 30 minutos; EtOH de 70º, 1 hora; EtOH de 80º, 1 hora; EtOH de 100º, 5 veces durante 1 hora; xileno, 2 veces durante 1 h 30 min; parafina, 4 veces durante 1 hora. Después, los globos se incluyen en parafina y se cortan en secciones de 5 \mum por medio de un microtomo (Leica), sagitalmente, paralelamente al nervio óptico. Los cortes se recogen con portaobjetos pretratados (DAKO).

Fijación de los cortes: para beneficiarse de un revelado inmunohistoquímico, con un anticuerpo anti-\beta-galactosidasa (TEBU), se secan los portaobjetos en una estufa a 56ºC durante 48 horas, y después se les quita la parafina con dos baños de xileno de 15 minutos y dos baños de 10 minutos de EtOH de 100º. Luego, se rehidratan unos minutos en agua corriente.

Bloqueo y permeabilización: se colocan los portaobjetos en un tampón de citrato 0,01 M, pH 6, primero a temperatura ambiente durante 5 minutos, y luego en un horno microondas a la potencia 8 (750 vatios), 2 veces durante 5 minutos. De vuelta a la temperatura ambiente, los cortes se enjuagan en agua osmotizada y se rodean con un círculo con el puntero DAKO. Para eliminar las peroxidasas hísticas que puedan interferir con el complejo de revelado y producir, así, la reacción ininterpretable, utilizamos H_{2}O_{2} al 3% durante 10 minutos. Luego, los portaobjetos se preincuban durante 30 minutos en una mezcla de PBS al 1x, gelatina a 2 g/l, tritón al 0,25% y albúmina de suero bovino (ASB) al 3% para saturar los sitios específicos.

Marcación: el anticuerpo primario de conejo anti-\beta-galactosidasa se diluye a 1/1000 en una mezcla de PBS al 1x, gelatina a 2 g/l y tritón al 0,025%. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, se realizan un breve lavado y luego otros cuatro de 5 minutos con la mezcla que ha servido para diluir el anticuerpo. El anticuerpo secundario biotinilado anti-conejo, producido en el burro (DAKO), se diluye a 1/200 en PBS al 1x, a la que se le añade gelatina a 2 g/l y se aplica durante 30 minutos. Luego, se lavan los portaobjetos, primero rápidamente, luego 4 veces durante 5 minutos, con el medio de dilución antes de añadir el complejo de revelado estreptavidina/peroxidasa (DAKO) diluido a 1/400 en la misma mezcla, durante 30 minutos. Después de tres lavados de 5 minutos, se añade el sustrato cromógeno: la diaminobencidina (DAB). El tiempo de revelado varia de 2 a 20 minutos. Se detiene la reacción sumergiendo los portaobjetos en agua osmotizada. Luego, éstas se contra-colorean en el Hémalun durante 1 minuto, se enjuagan rápidamente en el agua osmotizada, y después se distinguen en LiCO_{3} unos segundos. Finalmente, se deshidratan y se conservan en xileno hasta el montaje entre cubreobjetos y portaobjetos en el eukitt.

Ejemplo 1 Construcción de los adenovirus recombinantes defectuosos Ad.CMV.ATF, AdK3 y Ad.CMV\betagal

Los vectores se han construido según el método general descrito por Crouzet et al. (PNAS, vol 94, pág. 1414, 1997). El detalle de la construcción de los vectores Ad.CMV.ATF y AdK3 se describe en la solicitud de la patente internacional WO 98/49321.

Para el AdK3, el transgén de 1 Kb corresponde al fragmento del extremo amino del plasminógeno humano (hasta el resto 333) e incluye los tres primeros dominios kringle de la molécula de angiostatina.

Para el Ad.CMV.ATF, el transgén de 0,5 Kb es un ADNc que codifica el fragmento del extremo amino del uPA murino (aminoácidos 1 a 135) y el transgén del Ad.CMV\betagal comprende un ADNc de 3,1 Kb que codifica el gen indicador de Escherichia coli: lacZ.

La producción y la secreción de moléculas adenovíricas a partir de las construcciones se han verificado mediante las transferencias Northern y Western, respectivamente. Para los AdK3 y Ad.CMV.ATF, se han realizado pruebas de inhibición in vivo, del crecimiento tumoral, de la angiogenia y de la carcinogenia, así cómo pruebas de inhibición in vitro y de la proliferación celular estimulada por el bFGF. También se ha controlado la actividad X-gal del Ad.CMV\betagal.

El título medio de las disoluciones concentradas de los adenovirus recombinantes utilizados es de 4,5 x 10^{8} ufp/ml para el AdK3, de 10^{9} ufp/ml para el Ad.CMV.ATF y de 6,9 x 10^{10} ufp/ml para el Ad.CMV\betagal.

Ejemplo 2 Efecto de un vector que codifica un factor anti-angiógeno en un modelo de neovascularización corneal en ratas

El efecto de la lentilla sobre el ojo derecho del animal se estudia en función 1) de la duración del contacto con la córnea -una o dos semanas-, 2) la presencia o no presencia del vector que codifica un factor anti-angiógeno, y 3) la neovascularización o no de la córnea.

Para buscar un efecto terapéutico "preventivo" del adenovirus sobre la neovascularización corneal, se coloca la lentilla sobre la córnea inmediatamente después de poner 3 suturas dentadas, mientras que se estudia un efecto "curativo" colocando la lentilla sobre los ojos que ya presentan una neovascularización corneal, desde hace una o dos semana(s).

Se prueba cada adenovirus en un lote de 10 ratas: 5 para evaluar el efecto preventivo y 5 para el efecto curativo. Como control sirve un lote de 10 ratas con una lentilla impregnada del vehículo.

Evaluación de dos modelos animales de neovascularización corneal

El modelo de inducción de neovasos corneales por la colocación de tres suturas dentadas es muy eficaz, ya que el 100% de los animales operados presentan una neovascularización corneal, y la córnea de los ojos controles contralaterales es avascular. Los vasos se atraen hacia el centro de la córnea, a partir de arcadas vasculares límbicas y proliferan en las capas superficiales de la córnea desde la primera semana siguiente a la intervención.

La puntuación media de cada ojo, que indica el desarrollo de la neovascularización corneal, es de 7 \pm 2, dos semanas después de colocar las suturas. En ese momento, la neovascularización corneal es máxima. En el modelo de inducción por raspadura superficial de la córnea, sólo el 70% de las ratas desarrollan una neovascularización corneal. Sin embargo, ésta es más homogénea que la del modelo anterior, porque el conjunto de los cuatro cuadrantes del ojo participa en el desarrollo de la neovascularización, contrariamente a lo que se observa en el modelo de suturas, en la que el número de cuadrantes implicados es variable. Esta variabilidad de la extensión de la superficie corneal neovascularizada depende estrechamente de la posición de las suturas con relación al limbo, de su profundidad en el estroma y de su tamaño. La puntuación media de cada ojo es de 8 \pm 2, dos semanas después de la raspadura.

Sobre un corte de córnea incluida en parafina, teñida con una mezcla de ácido peryódico/base de Schiff/hematoxili-
na, los neovasos aparecen de forma predominante en el epitelio corneal, pero también en el estroma y en contacto con el endotelio corneal.

Eficacia de la transferencia de los vectores de adenovirus por impregnación previa de una lente de contacto

Resultados macroscópicos: después de la incubación con la disolución de X-gal, las copitas oculares de todos los ojos que se han expuesto a una lentilla impregnada con el adenovirus \beta-galactosidasa a 2 x 10^{7} ufp/\mul presentan una coloración azulada acentuada y muy difusa sobre toda la córnea de la rata recién nacida y sobre una gran región de la córnea de los animales adultos. La coloración azulada no se ha encontrado en ninguno de los ojos de control.

Resultados microscópicos: la marcación obtenida por revelado colorimétrico de la \beta-galactosidasa sobre cortes congelados de córneas normales predomina en el núcleo de las células epiteliales corneales.

En los cortes de córneas neovascularizadas incluidas en parafina, la marcación obtenida por inmunohistoquímica se encuentra, principalmente, en los núcleos de las células endoteliales corneales, pero también en los de las células epiteliales corneales y epiteliales de los cuerpos ciliares. Los queratocitos del estroma corneal así como las células endoteliales intraestromales patógenas también están marcados (figura 1). A pesar de la señal de localización nuclear adjunta del transgén lacZ, algunas células presentan una marcación en el citoplasma, sea cual sea la técnica de revelado.

Se han obtenido unos resultados idénticos con ayuda del adenovirus que codifican el ATF murino o la angiostatina humana. Esto se ha podido demostrar por las reacciones inmunohistoquímicas específicas realizadas sobre cortes de globos oculares de rata incluidos en parafina.

Efecto anti-angiógeno de las lentillas previamente impregnadas de los adenovirus Ad.CMV.ATF y AdK3

Las lentillas impregnadas de vehículo y colocadas sobre una córnea sin neovascularización no tienen ningún efecto angiógeno significativo.

Las lentillas empapadas del Ad.CMV\betagal a 2 x 10^{7} ufp/\mul no inducen ningún fenómeno inflamatorio ni ninguna neovascularización corneal.

Igualmente, la lentillas del Ad.CMV.ATF (10^{6} ufp/\mul) y del AdK3 (4,5 x 10^{5} ufp/\mul) no inducen ninguna reacción inflamatoria sobre la córnea, ninguna neovascularización, ni desaparición de la vascularización límbica.

Una lentilla empapada con el Ad.CMV.ATF, colocada sobre una córnea inmediatamente después de colocar tres suturas dentadas, previene el desarrollo de la neovascularización esperada como consecuencia de colocar estas tres suturas, durante la primera semana. Este efecto persiste después de dos semanas. Se observa el mismo efecto anti-angiógeno al cabo de una semana de contacto con la córnea, con una lentilla empapada del AdK3 (figura 3).

Claims (11)

1. El uso de un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un factor anti-angiógeno para la preparación de una composición farmacéutica destinada a administrarse por impregnación de una lentilla blanda y la aplicación de la mencionada lentilla sobre la córnea para la prevención, la mejora y/o el tratamiento de las neovascularizaciones corneales.

2. El uso según la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica el factor anti-angiógeno es un ácido nucleico que codifica un polipéptido elegido entre el fragmento del extremo amino del activador del plasminógeno uPA (ATF), la angiostatina, la endostatina, el fragmento de 16 KDa de la prolactina o el factor plaquetario 4 (PF-4), o una combinación de ácidos nucleicos que codifican, al menos, dos de estos factores.

3. El uso según la reivindicación 2, caracterizado porque el factor anti-angiógeno se elige entre el fragmento del extremo amino del activador del plasminógeno uPA (ATF) y la angiostatina K3.

4. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el vector es un plásmido, un cósmido o cualquier ADN no encapsidado por un virus.

5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el vector es un virus recombinante, preferiblemente derivado de un adenovirus, de un retrovirus, de un lentivirus, de un virus del herpes o de un virus adenoasociado.

6. El uso según la reivindicación 5, caracterizado porque el virus recombinante es un adenovirus recombinante defectuoso.

7. El uso según la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende entre 1 x 10^{6} y 1 x 10^{12} ufp/ml y, preferiblemente, entre 1 x 10^{8} y 1 x 10^{10} ufp/ml.

8. El procedimiento de preparación de un medicamento útil para la prevención, la mejora y/o el tratamiento de las neovascularizaciones corneales, caracterizado porque comprende la mezcla de un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un factor anti-angiógeno con uno o varios adyuvantes compatibles y farmacéuticamente aceptables y la impregnación de una lente de contacto.

9. El kit que comprende un recipiente que contiene una composición farmacéutica que comprende un vector recombinante defectuoso que comprende, al menos, un ácido nucleico que codifica un factor anti-angiógeno y, al menos, una lente de contacto.

10. El kit según la reivindicación 9, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende entre 1 x 10^{6} y 1 x 10^{12} ufp/ml y, preferiblemente, entre 1 x 10^{8} y 1 x 10^{10} ufp/ml.

11. Utilización del kit según la reivindicación 9 ó 10 para preparar un medicamento destinado a administrarse por impregnación de una lente de contacto para la prevención, la mejora y/o el tratamiento de las neovascularizaciones corneales.