ES2245783T3 - Dominio intracelular de la proteina her-2/neu para la prevencion o el tratamiento de neoplasias malignas. - Google Patents

Dominio intracelular de la proteina her-2/neu para la prevencion o el tratamiento de neoplasias malignas.

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ES2245783T3
ES2245783T3 ES96912393T ES96912393T ES2245783T3 ES 2245783 T3 ES2245783 T3 ES 2245783T3 ES 96912393 T ES96912393 T ES 96912393T ES 96912393 T ES96912393 T ES 96912393T ES 2245783 T3 ES2245783 T3 ES 2245783T3
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Abstract

SE DESCUBREN COMPUESTOS Y COMPOSICIONES PARA PROVOCAR O ESTIMULAR REACTIVIDAD INMUNITARIA A LA PROTEINA HER COMPUESTOS INCLUYEN POLIPEPTIDOS Y MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN DICHOS PEPTIDOS. LOS COMPUESTOS PUEDEN UTILIZARSE PARA LA PREVENCION O TRATAMIENTO DE TUMORES ASOCIADOS AL ONCOGEN HER

Description

Dominio intracelular de la proteína HER-2/neu para la prevención o el tratamiento de neoplasias malignas.
Campo de la técnica
La presente invención generalmente se refiere a los polipéptidos, y las moléculas de ácido nucleico que codifican tales polipéptidos, para inducir o reforzar una respuesta inmunitaria a la proteína HER-2/neu, que incluye el uso en el tratamiento de las neoplasias malignas a las que se asocia el oncogén HER-2/neu.
Antecedentes de la invención
A pesar de numerosas inversiones de recursos humanos y económicos, el cáncer sigue siendo una de las principales causas de muerte. Por ejemplo, el cáncer es la causa principal de muerte en las mujeres con edades entre 35 y 74 años. El cáncer de mama es la neoplasia maligna más común en las mujeres y la incidencia de padecer cáncer de mama está en alza. Una de nueve mujeres será diagnosticada con la enfermedad. Los métodos convencionales para curar el cáncer de mama se han centrado en torno a una combinación de intervención quirúrgica, radioterapia y quimioterapia. Estos enfoques han dado lugar a algunos éxitos espectaculares en determinadas neoplasias malignas. Sin embargo, estos métodos no han tenido éxito con todas las neoplasias malignas y, muy a menudo, el cáncer de mama es incurable cuando se intenta tratarlo más allá de una determinada etapa. Se necesitan unos métodos alternativos para la prevención y el tratamiento.
Una característica común de las neoplasias malignas es el desarrollo incontrolado de las células. Las células neoplásicas parecen haberse sometido a un procedimiento de transformación desde el fenotipo normal a un fenotipo maligno, capaz de desarrollarse de manera autónoma. La amplificación y la sobreexpresión de genes de las células somáticas se considera un acontecimiento primario común que da lugar a la transformación de las células normales en células malignas. Las características fenotípicas malignas codificadas por los genes oncógenos se pasan a la progenie de las células transformadas durante la división celular.
La investigación en marcha en relación con los oncogenes ha identificado, al menos, cuarenta oncogenes que actúan en las células malignas y que son responsables de la transformación, o que se asocian a ella Los oncogenes se han clasificado en diferentes grupos sobre la base de la función putativa o de la ubicación de sus productos génicos (como la proteína expresada por el oncogén).
Se cree que los oncogenes son esenciales para determinados aspectos del funcionamiento celular normal. Respecto a esto, el oncogén de HER-2/neu es un miembro de la familia de oncogenes con tirosina-cinasa y comparte un elevado grado de homología con el receptor del factor de crecimiento epidérmico. Presumiblemente, HER-2/neu desempeña una función en el crecimiento y/o diferenciación celulares. Parece ser que HER-2/neu induce neoplasias malignas por medio de mecanismos cuantitativos que son resultado del aumento o la desregulación de la expresión, esencialmente, de un producto génico normal.
HER-2/neu (p185) es el producto proteico del oncogén de HER-2/neu. El gen de HER-2/neu está amplificado y la proteína HER-2/neu se sobreexpresa en multitud de neoplasias malignas, como el cáncer de mama, de ovario, de colon, el carcinoma broncopulmonar y el cáncer de próstata. HER-2/neu se relaciona con la transformación maligna. Se encuentra en el 50% al 60% de los carcinomas ductales in situ y en el 20% al 40% de todos los cánceres de mama, así como en una fracción significativa de adenocarcinomas que se producen en los ovarios, la próstata, el colon y los pulmones. HER-2/neu se encuentra íntimamente asociada no sólo al fenotipo maligno, sino también a la agresividad de la neoplasia maligna, que se encuentra en una cuarta parte de los cánceres de mama invasores. La sobreexpresión de HER-2/neu se correlaciona con un mal pronóstico en el cáncer de mama y en el de ovario. HER-2/neu es una proteína transmembranaria con una masa molecular relativa de 185 kDa que tiene, aproximadamente, 1255 aminoácidos (aa) de longitud. Tiene un dominio de unión extracelular (DUE) de aproximadamente 645 aa, con una homología del 40% con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE), un dominio de anclaje transmembranario muy hidrófobo (DTM) y un dominio citoplásmico (DC) carboxiterminal de aproximadamente 580 aa con una homología del 80% con el RFCE.
En Disis et al. (Cancer Res. 54, 16-20, 1994) se informa sobre la inmunidad de HER-2/neu en las pacientes que tienen cánceres de mama.
Debido a las dificultades de las actuales metodologías para el tratamiento de las neoplasias malignas en las que está asociado el oncogén de HER-2/neu, hay una necesidad en la técnica de mejorar los compuestos y las composiciones. La presente invención satisface esta necesidad y, además, proporciona otras ventajas relacionadas.
Compendio de la invención
De manera breve, la presente invención proporciona polipéptidos, moléculas de ácidos nucleicos (que dirigen la expresión de tales polipéptidos) y vectores víricos (que dirigen la expresión de tales polipéptidos) para usarlos en la inmunización, o en la fabricación de un medicamento para la inmunización, de un animal de sangre caliente contra una neoplasia maligna a la que está asociado el oncogén de HER-2/neu. Un polipéptido o una molécula de ácido nucleico según esta invención puede estar presente en una composición que incluye un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Se puede usar tal polipéptido, molécula de ácido nucleico, vector vírico o composición farmacéutica para la inmunización con una pauta "de una vez" (p. ej., cuando se sospecha una neoplasia maligna) o una administración periódica (p. ej., para un individuo con un riesgo elevado de adquirir o volver a adquirir una neoplasia maligna). Un medicamento para la inmunización puede ser útil para tratar un tumor existente o para prevenir la aparición o la recidiva de un tumor.
En una realización, la presente invención proporciona un polipéptido codificado por una secuencia de ADN de los nucleótidos 2026 a 3765 de la SEQ ID n.º 1, en la que la secuencia de ADN codifica un polipéptido que produce una respuesta inmunitaria a la proteína HER-2/neu. En una realización preferida, un polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID n.º 2 desde lisina, el aminoácido 676, hasta valina, el aminoácido 1255, o una variante del mismo que produce, al menos, una respuesta inmunitaria equivalente. Se proporciona una composición que comprende un polipéptido de la presente invención en combinación con un excipiente o un diluyente farmacéuticamente aceptables.
En otra realización, se proporciona un polipéptido o composición de la presente invención para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una neoplasia maligna a la que está asociado el oncogén de HER-2/neu. En otra realización, se usa tal polipéptido o composición para fabricar un medicamento para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una neoplasia maligna a la cual se asocia el oncogén de HER-2/neu.
En otra realización, se proporciona según la presente invención una molécula de ácido nucleico que dirige la expresión de un polipéptido para inmunizar al transfectar las células de un animal de sangre caliente con la molécula de ácido nucleico. En otra realización, se usa tal molécula de ácido nucleico para fabricar un medicamento para inmunizar un animal de sangre caliente contra una neoplasia maligna a la cual se asocia el oncogén de HER-2/neu.
En otra realización, se proporciona según la presente invención un vector vírico que dirige la expresión de un polipéptido para inmunizar mediante la infección de las células de un animal de sangre caliente con el vector. En otra realización, se usa tal vector vírico para fabricar un medicamento para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una neoplasia maligna a la cual se asocia el oncogén de HER-2/neu.
Estos y otros aspectos de la presente invención quedarán claros tras referirse a la siguiente descripción detallada y a los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra los resultados de la sensibilización con células dendríticas (CD) de los linfocitos T indiferenciados para el polipéptido de HER-2/neu. Las CD derivadas de la médula ósea se generaron con el GM-CSF e IL6 de hemocitoblastos CD34+. Las CD tratadas con un pulso de polipéptido de HER-2/neu indujeron la proliferación específica de proteína de los linfocitos T autógenos CD4+/CD45RA+ después de 7 días de cultivar linfocitos T con las CD. Los hemocitoblastos CD35+ derivados de la médula ósea cultivados durante una semana en un medio sin suero que contenía GM-CSF e IL-6 se usaron como APC. Se colocaron las APC en placas de 96 pocillos de fondo redondeado (Corning, Corning, NY, EEUU) en varias concentraciones y se incubaron durante 16 a 18 horas con 20 a 25 \mug/ml del polipéptido recombinante de HER-2/neu. Los linfocitos T CD4+ se aislaron de las células mononucleares autógenas de la sangre periférica por medio de una selección positiva, mediante columnas de inmunoafinidad (CellPro, Inc., Bothell, WA, EEUU). Se irradiaron (10 Gy) las APC tratadas con un pulso de antígeno y se añadieron linfocitos T CD4+ a razón de 10^{5} por pocillo. La respuesta proliferativa de los linfocitos T se calculó por la captura de [^{3}H]-timidina (1 \muCi/pocillo) añadida en el día 7 durante 16 a 18 horas. Los ensayos de proliferación se realizaron en un medio sin suero y sin citocinas en 5 pocillos de réplica. Los símbolos representan: ---\medbullet--- CD + polipéptido de HER-2/neu + linfocitos T CD4+/CD45RA+; ---\medcirc--- CD + linfocitos T CD4+/CD45RA+; y –-\Box--- CD + polipéptido de HER-2/neu.
La figura 2 muestra la respuesta de los linfocitos CD4+ al polipéptido de HER-2/neu. Mediante el ensayo de sensibilización descrito para la figura 1, se probaron las respuestas al polipéptido recombinante humano de HER-2/neu en los linfocitos T CD4+ de donantes normales. Los símbolos representan: ---\blacksquare--- HC + CD4; y \cdot\cdot\cdot\blacklozenge\cdot\cdot\cdot SC + CD4 + polipéptido de HER-2/neu. "HC" son los hemocitoblastos.
La figura 3 muestra que las ratas inmunizadas con el polipéptido de rata HER-2/neu generan anticuerpos específicos contra el neu de rata. Las ratas se inmunizaron con 25 \mug del polipéptido recombinante de HER-2/neu de rata en MPL o vaccel adyuvante. Se aplicaron tres inmunizaciones, separadas 20 días cada una. Veinte días después de la inmunización final, se evaluaron las respuestas con anticuerpos contra el neu de rata en las ratas. Los animales inmunizados con el polipéptido de rata HER-2/neu y el vaccel adyuvante mostraron unas respuestas específicas contra el neu de rata de elevado título. El control fue un animal inmunizado con el polipéptido de HER-2/neu humano (proteína extraña). En experimentos separados, las ratas inmunizadas con 100 \mug y 300 \mug del neu completo purificado no desarrollaron anticuerpos detectables específicos contra neu (no se muestran los datos). Los datos representan la media y la desviación estándar de 3 animales. Los símbolos representan: ---\blacksquare--- polipéptido de HER-2/neu de rata/MPL; \cdot\cdot\cdot\blacklozenge\cdot\cdot\cdot polipéptido de HER-2/neu de rata/vaccel; \cdot\cdot\cdot\Box\cdot\cdot\cdot MPL solo; \cdot\cdot\cdot\medcirc\cdot\cdot\cdot vaccel solo; y 1 control. "MPL" y "vaccel" son adyuvantes (Ribi, Bozeman, MT, EEUU). "Neu" es la proteína HER-2/neu.
La figura 4 muestra que las pacientes con cáncer de mama tienen una inmunidad preexistente al polipéptido de HER-2/neu. Se evaluaron los LMSP de las pacientes mediante la incorporación de timidina tritiada en 24 pocillos replicados. Los pocillos que respondieron están puntuados como mayores que la media y 3 desviaciones estándares (372 cpm) de los pocillos de control. Esta paciente con cáncer de mama de etapa II con positividad para HER-2/neu tiene una respuesta significativa al polipéptido humano recombinante de HER-2/neu. Los símbolos "p" representan péptidos para la proteína HER-2/neu, "tt" representa la vacuna antitetánica y "PHNh" representa el polipéptido de HER-2'neu humano recombinante.
Descripción detallada de la invención
Antes de exponer la invención, puede ser útil comprender la misma para presentar definiciones de determinados términos que se usarán más adelante.
Polipéptido de HER-2/neu: tal y como se usa en la presente invención, se refiere a una porción de la proteína HER-2/neu (la proteína conocida también como p185 o c-erbB2) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde lisina, el aminoácido 676, hasta valina, el aminoácido 1255, y se puede obtener naturalmente, producir sintéticamente, manipularse genéticamente o ser una variante funcionalmente equivalente de la misma, p, ej., donde se reemplaza uno o más aminoácidos por otro(s) aminoácido(s) o no aminoácido(s), que no afecta(n) significativamente la inducción o el refuerzo de una respuesta inmunitaria a la proteína HER-2/neu (p. ej., la variante estimula una respuesta por medio de los linfocitos T cooperadores o los linfocitos T citotóxicos).
Proliferación de linfocitos T: tal y como se usa en la presente invención, incluye la multiplicación de los linfocitos T así como la estimulación de los linfocitos T que conducen a la multiplicación, a saber, el inicio de acontecimientos que conducen a la mitosis y la misma mitosis. Los métodos para detectar la proliferación de los linfocitos T se discuten más adelante.
Como se observó anteriormente, la presente invención está dirigida hacia compuestos y composiciones para inducir o reforzar la inmunidad al producto proteico expresado por el oncogén de HER-2/neu, incluidas las neoplasias malignas, en un animal de sangre caliente, en el cual un gen de HER-2/neu amplificado está asociado con la neoplasia maligna. La asociación de un gen de HER-2/neu amplificado con una neoplasia maligna no requiere que el producto proteico de la expresión del gen esté presente en el tumor. Por ejemplo, la sobreexpresión del producto de la expresión proteico puede estar implicada en la iniciación de un tumor, pero, posteriormente, se puede perder la expresión de la proteína. Un uso de la presente invención es inducir o reforzar una respuesta inmunitaria autóctona eficaz para convertir el tumor que expresa HER-2/neu en un tumor que no expresa HER-2/neu.
Más específicamente, la descripción de la presente invención, en un aspecto, demuestra que los linfocitos dependientes del timo (de aquí en adelante, "linfocitos T") pueden reconocer un polipéptido basado en una porción particular (polipéptido de HER-2/neu) del producto de expresión proteico del gen de HER-2/neu y, por lo tanto, se puede utilizar la respuesta inmunitaria autóctona del linfocitos T profilácticamente o para tratar neoplasias malignas, en las que tal proteína está sobreexpresada o se ha sobreexpresado. En otro aspecto, la descripción de la presente invención también demuestra que, para la inmunización, las moléculas de ácidos nucleicos que dirigen la expresión de tal péptido se pueden usar solas o en un vector vírico.
En general, se considera que las poblaciones de linfocitos T CD4+ funcionan como cooperadores/inductores por medio de la liberación de linfocinas cuando un antígeno específico las estimula; no obstante, un subconjunto de linfocitos CD4+ puede actuar como linfocitos T citotóxicos (LTC). Similarmente, se considera que los linfocitos T CD8+ funcionan directamente lisando las dianas antigénicas; sin embargo, en una variedad de circunstancias, pueden secretar linfocinas para proporcionar una función cooperadora o DTH. A pesar del que las funciones se puedan solapar, los marcadores fenotípicos CD4 y CD8 están relacionados con el reconocimiento de los péptidos unidos a los antígenos del CMH de clase I o II. El reconocimiento del antígeno en el contexto del CMH de clase I o II hace que los linfocitos T CD4+ y CD8+ respondan a diferentes antígenos o al mismo antígeno presentado en diferentes circunstancias. La unión de los péptidos inmunógenos a los antígenos del CMH de clase II se produce, más comúnmente, en los antígenos ingeridos por las células presentadoras de antígenos. Por lo tanto, generalmente, los linfocitos T CD4+ reconocen antígenos que son ajenos a las células tumorales. En cambio, en circunstancias normales, la unión de péptidos al CMH de clase I se produce sólo para las proteínas presentes en el citosol y sintetizadas por la propia diana, de manera que las proteínas en el medio externo quedan descartadas. Una excepción es la unión de péptidos exógenos con un motivo de unión de clase I preciso que se encuentran fuera de la célula en grandes concentraciones. Así, los linfocitos T CD4+ y CD8+ tienen funciones ampliamente diferentes y tienden a reconocer diferentes antígenos como reflejo de donde residen los antígenos normalmente.
Como se describe dentro de la presente invención, los linfocitos T reconocen una porción del polipéptido del producto proteico expresado por el oncogén de HER-2/neu. El polipéptido de HER-2/neu en circulación es degradado a fragmentos peptídicos. Los fragmentos peptídicos del polipéptido se unen a antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Mediante el despliegue de un péptido unido al antígeno del CMH en la superficie celular y el reconocimiento de la combinación del péptido más el antígeno del propio CMH por los linfocitos T del hospedador, el polipéptido de HER-2/neu (incluido el que se expresa en una célula maligna) será inmunógeno para los linfocitos T. La especificidad tan delicada del receptor del linfocito T permite que los linfocitos T individuales discriminen entre los péptidos que difieren en un resto de un sólo aminoácido.
Durante la respuesta inmunitaria a un fragmento peptídico del polipéptido, los linfocitos T que expresan un receptor del linfocito T con una gran afinidad de unión por el complejo péptido-CMH se unirán al complejo péptido-CMH y, por lo tanto, se activarán e inducirán a proliferar. En el primer encuentro con un péptido, unas pequeñas cantidades de linfocitos T inmunes secretarán linfocinas, proliferarán y se diferenciarán en linfocitos T efectores y en linfocitos T de memoria. La respuesta inmunitaria primaria se producirá in vivo aunque ha sido difícil detectarla in vitro. El posterior encuentro del linfocito T de memoria con el mismo antígeno conducirá a una respuesta inmunitaria más rápida e intensa. La respuesta secundaria se producirá in vivo o in vitro. La respuesta in vitro se mide fácilmente calculando el grado de proliferación, el grado de la producción de citocinas o la generación de actividad citolítica de la población de linfocitos T reexpuesta en el antígeno. Se considera que una proliferación significativa de la población de linfocitos T en respuesta a un antígeno particular es indicativa de una exposición previa o de una sensibilización al antígeno.
Por lo general, los compuestos de esta invención comprenden polipéptidos de HER-2/neu o moléculas de ADN que dirigen la expresión de tales péptidos, en los que las moléculas de ADN pueden estar presentes en un vector vírico. Como se observó anteriormente, los polipéptidos de la presente invención incluyen variantes del polipéptido de la SEQ ID nº. 2 desde el aminoácido 676 hasta el aminoácido 1255, que conserva la capacidad de estimular una respuesta inmunitaria. Tales variantes incluyen formas estructurales del polipéptido natural. Debido a la presencia de grupos amino y carboxilo ionizables, por ejemplo, un polipéptido de HER-2/neu puede estar en forma de una sal ácida o básica, o puede estar en forma neutra. Los restos de cada uno de los aminoácidos también se pueden modificar por oxidación o reducción.
Las variantes dentro del alcance de esta invención también incluyen los polipéptidos en los que se modifica la estructura primara de los aminoácidos del polipéptido del HER-2/neu natural al formar conjugados covalentes o en agregación con otros péptidos o polipéptidos, o radicales químicos como grupos glucosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Se pueden preparar derivados covalentes, por ejemplo, uniendo determinados grupos funcionales a cadenas laterales de aminoácidos o al extremo amino o al extremo carboxilo.
La presente invención también incluye los polipéptidos de HER-2/neu con o sin glucosilación. Los polipéptidos expresados en los sistemas de expresión de la levadura o de los mamíferos pueden ser similares o ligeramente diferentes en la masa molecular y el patrón de glucosilación que las moléculas naturales, según el sistema de expresión. Por ejemplo, la expresión en bacterias como E. coli de ADN que codifique polipéptidos normalmente proporciona unas moléculas sin glucosilar. Los sitios de la N-glucosilación de las proteínas eucariotas se caracterizan por el triplete de aminoácidos Asn-A_{1}-Z_{1}, en el que A_{1} es cualquier aminoácido salvo Pro y Z_{1} es Ser o Thr. Las variantes de los polipéptidos de HER-2/neu, que tienen sitios de N-glucosilación inactivados, se pueden producir por técnicas conocidas por los expertos en la técnica, como las técnicas de síntesis y ligación de oligonucleótidos o de mutagénesis específica de sitio, y se encuentra dentro del alcance de esta invención. Alternativamente, los sitios de N-glucosilación se pueden añadir al polipéptido de HER-2/neu.
Los polipéptidos de esta invención también incluyen variantes del polipéptido de la SEQ ID nº. 2 (a saber, variantes de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 a partir del aminoácido 676 hasta el aminoácido 1255) que tienen una secuencia de aminoácidos diferente de esta secuencia, debido a una o más deleciones, inserciones, sustituciones u otras modificaciones. En una realización, tales variantes son considerablemente homólogas al polipéptido natural de HER-2/neu y conservan la capacidad de estimular una respuesta inmunitaria. "Homología considerable", como se usa en la presente invención, se refiere a secuencias de aminoácidos que pueden estar codificadas por secuencias de ADN, que pueden hibridarse en condiciones moderadamente rigurosas para una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ADN que se produce naturalmente y que codifica la porción del polipéptido especificada de la SEQ ID nº. 2 descrita en la presente invención (a saber, los nucleótidos 2026 a 3765 de la SEQ ID nº. 1). Las condiciones moderadamente rigurosas adecuadas incluyen el prelavado en una disolución de SSC 5X, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH8,0); la hibridación a 50ºC-65ºC en SSC 5 X durante una noche; seguida de dos lavados a 65ºC durante 20 minutos, cada uno con SSC 2X, 0,5X y 0,2X (que contienen SDS al 0,1%). Tales secuencias de ADN que hibriden también se encuentran dentro del alcance de esta invención. Se puede determinar, fácilmente, el efecto de cualquier modificación por la capacidad de un polipéptido de HER-2/neu para producir una respuesta inmunitaria (p. ej., analizando la capacidad del polipéptido de HER-2/neu mutado para inducir una respuesta de linfocitos T mediante, por ejemplo, los métodos descritos en la presente invención).
Generalmente, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos por diversos modos para proporcionar otras realizaciones de variantes dentro de la presente invención. Primero, por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos de manera conservativa; a saber, un aminoácido sustitutivo reemplaza un aminoácido que tiene unas propiedades similares, de tal manera que el experto en la técnica de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido no cambiasen de manera significativa. En general, los siguientes grupos de aminoácidos representan cambios conservativos: 1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; 2) cys, ser, tyr, thr; 3) val, ile, leu, met, ala, phe; 4) lys, arg, his; y 5) phe, tyr, trp, his. Un ejemplo de un cambio no conservativo es reemplazar un aminoácido de un grupo con un aminoácido de otro grupo.
Otro modo de realizar sustituciones de aminoácidos para producir variantes de la presente invención es identificar y reemplazar aminoácidos en los motivos de los linfocitos T que sirven para unirse a las moléculas del CMH de clase II (para la respuesta de los linfocitos T CD4+) o a moléculas del CMH de clase I (para la respuesta de los linfocitos T CD8+). Los segmentos peptídicos (de un polipéptido de HER-2/neu) con un motivo con la capacidad teórica de unirse a las moléculas del CMH de clase II se pueden identificar por análisis informático. Por ejemplo, se puede usar un paquete de análisis de secuencias de proteínas, el T Sites, que incorpora varios algoritmos informáticos diseñados para distinguir potenciales sitios para el reconocimiento de los linfocitos T (Feller y de la Cruz, Nature, 349: 720-721, 1991). Se usan dos algoritmos de búsqueda: 1) el algoritmo AMPHI descrito por Margalit (Feller y de la Cruz, Nature, 349: 720-721, 1991; Margalit et al., J. Immunol. 138: 2213-2229, 1987) identifica motivos de epítopos según la periodicidad alfa-helicoidal y la anfipatía; 2) el algoritmo de Rothbard y Taylor identifica motivos de epítopos según la distribución de las cargas y la polaridad (Rothbard y Taylor, EMBO 7: 93-100, 1988). Los segmentos con ambos motivos son más apropiados para unirse a moléculas del CMH de clase II. Los linfocitos T CD8+ reconocen los péptidos unidos a las moléculas del CMH de clase I. Falk et al han determinado que los péptidos que se unen a unas determinadas moléculas del CMH comparten unos motivos de secuencia perceptibles (Falk et al., Nature, 351:290-296, 1991). Con la degradación de Edman de los péptidos despojados de las moléculas de HLA-A2.1 de una estirpe celular cultivada se ha definido un motivo peptídico para la unión en el surco del HLA-A2.1 (tabla 2, de Falk et al., véase más arriba). El método identificó el péptido de unión a HLA-A2.1 típico o promedio, que es de 9 aminoácidos de longitud con unos restos de anclaje dominantes que se producen en las posiciones 2 (L) y 9 (V). Se han identificado restos de fuerte unión que se producen comúnmente en las posiciones 2 (M), 4 (E,K), 6 (V) y 8 (K). El motivo identificado constituye el promedio de muchos péptidos de unión.
El motivo de restricción de HLA-A2.1
Posición de los aminoácidos Asignación de
1 2 3 4 5 6 7 8 9 puntos
Resto dominante L V +3
del anclaje de la
unión
Resto de fuerte M E V K +2
unión K
Resto de unión I A G I I A E L +1
débil L Y P K L Y S
F F D Y T H
K P T N
M M G
Y S V
H
El motivo peptídico obtenido que se ha definido actualmente no es particularmente riguroso. Algunos péptidos de unión de HLA-A2.1 no contienen ambos restos de anclaje dominante y los aminoácidos que flanquean los restos de anclaje dominante desempeñan papeles muy importantes al permitir o impedir la unión. No se unirán todos los péptidos con el motivo de unión antes descrito y se unirán algunos péptidos sin dicho motivo. Sin embargo, el motivo actual es lo suficientemente válido como para permitir la identificación de algunos péptidos capaces de unirse. Cabe observar que el motivo actual de HLA-A2.1 coloca 6 aminoácidos entre los aminoácidos de anclaje dominante en los restos 2 y 9.
Después de identificar los motivos peptídicos dentro de un polipéptido de HER-2/neu, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos de manera conservativa o no conservativa. El último tipo de sustituciones pretenden producir un polipéptido mejorado que es más potente y/o que reaccione cruzadamente con más facilidad (polimorfismo del CMH). Un ejemplo de un polipéptido más potente es el que se une con una mayor afinidad a la molécula del mismo CMH como un polipéptido natural, sin afectar al reconocimiento del polipéptido natural por los linfocitos T. Un ejemplo de un polipéptido con una reactividad cruzada más amplia es el que induce unas respuestas inmunitarias cruzadas más ampliamente (a saber, se une a un mayor abanico de moléculas del CMH) que el polipéptido natural. Similarmente, se puede sustituir de manera conservativa o no conservativa uno o más aminoácidos que residan entre los motivos peptídicos y que tengan una función espaciadora (p. ej., no interaccionan con una molécula del CMH o con el receptor de los linfocitos T). A los expertos en la técnica les resultará evidente que se pueden probar las interacciones inmunológicas beneficiosas o adversas de los polipéptidos que contienen sustituciones de uno o más aminoácidos por medio de diversos ensayos, incluidos aquéllos descritos en la presente invención para la capacidad de estimular el reconocimiento por los linfocitos T.
Las variantes dentro del alcance de esta invención pueden contener también, o alternativamente, otras modificaciones, incluidas la deleción o adición de aminoácidos, que influyan mínimamente sobre las propiedades inmunológicas deseables del polipéptido. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden usar las formas truncadas o las formas extendidas no naturales de un polipéptido de HER-2/neu, siempre que las propiedades inmunológicas deseadas sean, al menos, aproximadamente equivalentes a las del polipéptido natural de HER-2/neu completo. Los restos de cisteína se pueden eliminar o reemplazar por otros aminoácidos para prevenir la formación de puentes de disulfuro intramoleculares incorrectos tras la renaturalización. Otros enfoques para la mutagénesis implican la modificación de restos de aminoácidos dibásicos adyacentes para mejorar la expresión en los sistemas de levadura en los que haya actividad de la proteasa KEX2.
Por lo general, se puede obtener un polipéptido de HER-2/neu usando un clon genómico o de ADNc que codifica la proteína. En la SEQ ID nº. 1 se muestra una secuencia genómica que codifica el HER-2/neu completo, y en la SEQ ID nº. 2 se presenta la secuencia de aminoácidos deducida. Se pueden aislar tales clones rastreando una genoteca de expresión adecuada en busca de clones que expresan la proteína HER-2/neu. Generalmente, la preparación y la detección de la genoteca se pueden llevar a cabo mediante los métodos que conocen los expertos en la técnica, tal que los métodos descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, que se incorpora en la presente invención mediante referencia. Brevemente, se puede sembrar en placas una genoteca de expresión en bacteriófagos y transferirse a filtros. Luego, los filtros se pueden incubar con un reactivo de detección. En el contexto de esta invención, un "reactivo de detección" es cualquier compuesto capaz de unirse a la proteína HER-2/neu que, luego, se puede detectar por medio de uno cualquiera de los métodos que los expertos en la técnica conocen. Los reactivos de deleción típicos contienen un "agente de unión", tales como la proteína A, la proteína G, la IgG o una lectina, acoplado a un grupo indicador. Los grupos indicadores preferidos incluyen enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, colorantes, radionúclidos, grupos luminiscentes, grupos fluorescentes y biotina. Más preferiblemente, el grupo indicador es la peroxidasa de rábano, que se puede detectar al incubarla con un sustrato como tetrametilbencidina o ácido 2,2'-azino-di-3-etil-benzotiazolina sulfónico. Las placas que contienen secuencias genómicas o de ADNc que expresan la proteína HER-2/neu se aislan y se purifican por medio de técnicas que conocen los expertos en la técnica. Se pueden encontrar métodos adecuados, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989.
Generalmente, se pueden identificar las variantes del polipéptido que conservan la capacidad de estimular una respuesta inmunitaria al modificar la secuencia en uno o más de los aspectos descritos anteriormente y analizando la capacidad del polipéptido resultante de estimular una respuesta inmunitaria, p, ej., una respuesta de linfocitos T. Por ejemplo, generalmente, se pueden realizar tales ensayos haciendo contactar los linfocitos T con el polipéptido modificado y analizando la respuesta. También se pueden aislar las variantes del polipéptido que se producen naturalmente mediante, por ejemplo, el rastreo de una genoteca genómica o de ADNc adecuada con una secuencia de ADN que codifica el polipéptido o una variante del mismo.
Las modificaciones de la secuencia descritas anteriormente se pueden introducir mediante las técnicas recombinantes estándares o mediante síntesis automática del polipéptido modificado. Por ejemplo, las mutaciones se pueden introducir en varios locus determinados mediante la síntesis de oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante flanqueados por sitios de restricción que permiten la ligación a fragmentos de la secuencia natural. Después de la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción del aminoácido deseado.
Alternativamente, se pueden utilizar procedimientos de mutagénesis específica de sitio dirigida por oligonucleótidos para proporcionar un gen, en el que se alteran determinados codones según la sustitución, deleción o inserción requerida. Métodos ejemplares para realizar las alteraciones presentadas anteriormente se describen en Walder et al., Gene 42: 133, 1986; Bauer et al., Gene 37: 73, 1985; Craik, BioTechniques, Enero 1985, 12-19; Smith et al., Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981; y las patentes de los EEUU nº. 4 518 584 y nº. 4 737 462.
Las mutaciones en las secuencias de nucleótidos construidas para expresar los péptidos de HER-2/neu deben, por supuesto, conservar el marco de lectura de las secuencias codificantes y, preferiblemente, no crearán unas regiones complementarias que podrían hibridarse para producir estructuras secundarias en el ARNm, tales como bucles u horquillas, que afectarían de manera adversa la traducción del ARNm. Aunque se puede predeterminar un sitio de mutación, no es necesario que la naturaleza de la mutación esté predeterminada per se. Por ejemplo, para seleccionar unas características óptimas de mutantes en un sitio determinado, se puede realizar una mutagénesis al azar en el codón diana, y en los mutantes expresados del polipéptido de HER-2/neu se rastrea la actividad deseada.
No todas las mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de HER-2/neu se expresarán en el producto final. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de nucleótidos para mejorar la expresión, principalmente para evitar unos bucles de estructura secundaria en el ARNm transcrito (véase, p. ej., la solicitud de la patente europea EP 75 444A), o para proporcionar unos codones que el huésped seleccionado traduzca más rápidamente, tal como los codones preferidos conocidos de E. coli para la expresión en E. coli.
Los polipéptidos de la presente invención, tanto los que se producen naturalmente como los modificados, se producen preferiblemente por los métodos de ADN recombinante. Tales métodos incluyen introducir una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de HER-2/neu en un vector de expresión recombinante y expresar la secuencia de ADN en un sistema de expresión celular recombinante en microorganismos, mamíferos o insectos, en unas condiciones que favorecen la expresión. Las secuencias de ADN que codifican los polipéptidos proporcionados por esta invención se pueden reunir a partir de los fragmentos de ADNc y de conectores oligonucleotídicos cortos, o a partir de una serie de oligonucleótidos, para proporcionar un gen sintético que se puede introducir en un vector de expresión recombinante y expresar en una unidad transcripcional recombinante.
Los vectores de expresión recombinantes contienen una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de HER-2/neu operativamente unido a unos elementos reguladores adecuados transcripcionales o traduccionales, derivados de genes de mamíferos, microorganismos, virus o insectos. Tales elementos reguladores incluyen un promotor transcripcional, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión ribosómicos adecuados en el ARNm y secuencias que controlar la terminación de la transcripción y la traducción. Adicionalmente, se puede incorporar un origen de replicación y un marcador de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes.
Las regiones del ADN están operativamente unidas cuando están relacionadas funcionalmente unas a otras. Por ejemplo, el ADN de un péptido señal (líder de secreción) está unido operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operativamente unido a una secuencia codificante si se coloca de manera que permita la traducción. Generalmente, "operativamente unido" significa contiguo y, en el caso de los líderes secretores, en el marco de lectura. Las secuencias de ADN que codifican polipéptidos de HER-2/neu que deben expresarse en un microorganismo no contendrán, preferiblemente, intrones que terminarían, prematuramente, la transcripción del ADN a ARNm.
Los vectores de expresión para uso bacteriano pueden comprender un marcador de selección y un origen bacteriano de replicación derivado de los plásmidos disponibles comercialmente que comprendan elementos genéticos del conocido vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EEUU). Estas secciones "vertebrales" del pBR322 se combinan con un promotor adecuado y la secuencia estructural a expresar. Normalmente, E. coli se transforma usando derivados del pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (Bolivar et al., Gene, 2:95, 1977). El pBR322 contiene genes para la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina y, así, proporciona unos medios sencillos para identificar células transformadas.
Los promotores usados comúnmente en los vectores de expresión microbianos recombinantes incluyen el sistema del promotor de la \beta-lactamasa (penicilina) y la lactosa (Chang et al., Nature, 275: 615, 1978; y Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), el sistema del promotor del triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980); y la solicitud de patente europea EP 36 776) y el promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Un sistema de expresión bacteriano particularmente útil emplea el promotor P_{L} del fago \lambda y el represor termolábil cl857ts. Los vectores plasmídicos disponibles de la American Type Culture Collection, que incorporan derivados del promotor P_{L} de \lambda, incluyen el plásmido pHUB2, residente en la cepa de E. coli JMB9 (ATCC 37092), y el plásmido pPLc28, residente en de E. coli RR1 (ATCC 53082).
Las secuencias del promotor adecuadas en los vectores de levadura incluyen los promotores para la metalotioneína, la 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) u otras enzimas glucolíticas (Hess et al, J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978), como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosa-fosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa. Además, se describen vectores y promotores adecuados para usarse en la expresión en la levadura en R. Hitzeman et al, solicitud de patente europea EP 73 657.
Se pueden reunir los vectores de levadura preferidos usando las secuencias de ADN de pBR322, para la selección y la replicación en E. coli (el gen de Amp^{r} y el origen de replicación) y secuencias de ADN de levadura que incluyan un promotor ADH2 reprimible por glucosa y el líder de secreción del factor a. El promotor ADH2 ha sido descrito por Russel et al (j. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) y Beier et al. (Nature 300: 724, 1982). El líder del factor a de la levadura, que dirige la secreción de proteínas heterólogas, se puede introducir entre el promotor y el gen estructural a expresar (véase, p. ej., Kurjan et al., Cell 30: 933, 1982; y Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984). Se puede modificar la secuencia del líder para que contenga, cerca de su extremo 3', uno o más sitios de restricción útiles para facilitar la fusión de la secuencia líder con genes extraños. Las secuencias de control transcripcional y traduccional en los vectores de expresión a usar para transformar las células de vertebrados se pueden proporcionar por fuentes víricas. Por ejemplo, los promotores y potenciadores usados comúnmente se derivan del polioma, del adenovirus 2, del virus de simio 40 (SV40) y del citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN obtenidas del genoma vírico del SV40, por ejemplo, los sitios del SV40 de origen de replicación, promotores temprano y tardío, potenciador, ayuste y poliadenilación, se pueden usar para proporcionar otros elementos genéticos requeridos para expresar una secuencia de ADN heteróloga. Los promotores tempranos y tardíos son particularmente útiles porque se obtienen fácilmente del virus como un fragmento que también contiene el origen de replicación del virus SV40 (Fiers et al., Nature, 273: 113, 1978). También se pueden utilizar fragmentos menores o mayores de SV40, siempre que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende del sitio HindIII hasta el sitio BglII localizado en el origen de replicación del virus. Además, se pueden utilizar el promotor genómico del virus y las secuencias de control y/o señal, siempre que tales secuencias de control sean compatibles con la célula hospedadora elegida. Se pueden construir vectores ejemplares como se describe en Okayama y Berg, Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983.
Se puede construir un sistema útil para la expresión estable en gran cantidad de los ADNc del receptor de mamíferos en las células epiteliales de mama murinas de C127 como describen Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986) esencialmente. Un vector eucariótico preferido para la expresión del ADN de la proteína LbelF4A es el pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 10: 2821, 1991) e incluye unas secuencias reguladoras derivadas del SV40, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y del virus de Epstein-Barr (VEB). Otros vectores preferidos incluyen el pDC409 y el pDC410, que se derivan del pDC406. El pDC410 se derivó del pDC406 el sustituir el origen de replicación del VEB por las secuencias que codifican el antígeno T grande del SV40. El pDC409 difiere del pDC406 en que se ha eliminado el sitio de restricción BglII que está fuera del sitio de clonación múltiple, lo que convierte en único al sitio BglII dentro del sitio de clonación múltiple.
La CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478) es una estirpe celular útil que permite la replicación episómica de los vectores de expresión, como el pDC406 y el pDC409, que contienen el origen de replicación del VEB. La estirpe celular CV-L/EBNA se derivó por transfección de la estirpe celular CV-1, con un gen que codificaba el antígeno I nuclear del virus Epstein-Barr (EBNA-1) y que expresa de manera constitutiva el EBNA-1 gracias al potenciador/promotor inmediato-temprano del CMV humano.
Las células transformadas del huésped son células que se han transformado o transfectado con vectores de expresión construidos mediante técnicas de ADN recombinante y que contienen secuencias que codifican un polipéptido de HER-2/neu de la presente invención. Las células transformadas del huésped pueden expresar el polipéptido deseado de HER-2/neu, pero las células transformadas del huésped con el propósito de clonar o amplificar el ADN de HER-2/neu no necesitan expresar el polipéptido de HER-2/neu. Los polipéptidos expresados se secretarán, preferiblemente, en el sobrenadante del cultivo, según el ADN seleccionado, pero también se pueden depositar en la membrana celular.
Las células del huésped adecuadas para la expresión de proteínas recombinantes incluyen procariotas, levadura o células de eucariotas superiores bajo el control de los promotores adecuados. Los procariotas incluyen los organismos gram-negativos o gram-positivos, por ejemplo, E. coli o diversos Bacillus. Las células de los eucariotas superiores incluyen estirpes celulares establecidas de insectos o mamíferos, como se describe más adelante. También se pueden utilizar sistemas de traducción acelular para producir polipéptidos HER-2/neu mediante los ARN derivados a partir de construcciones de ADN. Se describen vectores adecuados de clonación y expresión para usar con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y mamíferos, por ejemplo, en Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985.
Se pueden utilizar huéspedes de expresión procarióticos para la expresión de polipéptidos de HER-2/neu, que no requieren un procesamiento extenso proteolítico ni de formación de disulfuros. Por lo general, los vectores de expresión procarióticos comprenden uno o más marcadores de selección fenotípicos, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confieren resistencia a los antibióticos o que suministran un requisito autótrofo, y un origen de replicación que el huésped reconoce para asegurar la amplificación dentro del huésped. Los huéspedes procarióticos adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también se pueden utilizar otros huéspedes.
Los polipéptidos recombinantes de HER-2/neu también se pueden expresar en huéspedes de levadura, preferiblemente de especies de Saccharomyces, como S. cerevisiae. También se puede utilizar levaduras de otros géneros, como Pichia o Kluyveromyces. Generalmente, los vectores de levadura contendrán un origen de replicación del plásmido 2 \mu de levadura o una secuencia de replicación autónoma (ARS), un promotor, un ADN que codifica el polipéptido de HER-2/neu, secuencias para la poliadenilación y la terminación de la transcripción y un gen de selección. Preferiblemente, los vectores de levadura incluirán un origen de replicación y un marcador de selección que permita la transformación de la levadura y E. coli, p, ej., el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen trp1 de S. cerevisiae, que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carezca de la capacidad de proliferar en triptófano, y un promotor derivado de un gen de levadura muy expresado para inducir la transcripción de una secuencia estructural hacia 3'. Luego, la presencia de lesión del trp1 en el genoma celular de la levadura huésped proporciona un entorno eficaz para detectar la transformación por medio de la proliferación en ausencia de triptófano.
Los expertos en la técnica conocen los protocolos adecuados para transformar levaduras. Una técnica ejemplar descrita por Hind et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978) implica seleccionar transformantes Trp^{+} en un medio selectivo que consiste en una base nitrogenada de levadura al 0,67%, casaminoácidos al 0,5%, glucosa al 2%, adenina a 10 mg/ml y uracilo a 20 g/ml. Se pueden cultivar para expresar las cepas hospedadoras transformadas con los vectores que comprenden el promotor ADH2, en un medio rico que consiste en extracto de levadura al 1%, peptona al 2% y glucosa al 1% complementado con adenina a 80 mg/ml y uracilo a 80 mg/ml. La pérdida de la represión del promotor ADH2 se produce cuando se agota la glucosa del medio. Los sobrenadantes de levadura brutos se recogen por filtración y se mantienen a 4ºC antes de una purificación posterior.
También se pueden utilizar varios sistemas de cultivo de células de mamíferos o insectos (p. ej., Spodoptera o Trichoplusia) para expresar un polipéptido recombinante. Los sistemas del baculovirus para la producción de polipéptidos heterólogos en células de insectos se revisan, por ejemplo, en Luckow y Summers, Biol Technology 6: 47, 1988. Ejemplos de estirpes celulares adecuadas hospedadoras de mamíferos incluyen las estirpes COS-7 de células de riñón de mono, descritas en Gluzman (Cell 23: 175, 1981) y otras estirpes celulares capaces de expresar un vector apropiado, incluidas, por ejemplo, las estirpes celulares CV-1/EBNA (ATCC CRL 10478), células L, C127, ET3, de ovario de hámster chino (CHO), COS, NS-1, HeLa y celulares BHK. Los vectores de expresión en mamíferos pueden comprender elementos no trascritos como un origen de replicación, un promotor adecuado y un potenciador unidos al gen a expresar, y otras secuencias no transcritas flanqueantes en 5' o 3' y secuencias no traducidas en 5' o 3', como los sitios de unión al ribosoma necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donante y receptor del ayuste, y secuencias de terminación de la transcripción.
Se pueden preparar polipéptidos purificados de HER-2/neu cultivando los sistemas huésped/vector adecuados para expresar los productos de traducción recombinantes de los ADN de la presente invención que, luego, se purifican de los medios de cultivo o de los extractos de células. Por ejemplo, se pueden concentrar los sobrenadantes de sistemas, que segregan el polipéptido recombinante en medios de cultivo, usando primero un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, como una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, se puede aplicar el concentrado a una matriz de purificación adecuada. Por ejemplo, una matriz de afinidad adecuada puede comprender una proteína de estructura complementaria (a saber, una proteína a la que se une un polipéptido de HER-2/neu de forma específica en base a la estructura) o una lectina o una molécula de anticuerpo unidas a un soporte adecuado. Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o un sustrato que tenga expuestos grupos de dietil-aminoetilo (DEAE). Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente utilizados en la purificación de proteínas. Alternativamente, se puede emplear una etapa de intercambio de cationes. Los intercambiadores de cationes adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo. La cromatografía de filtración en gel también proporciona un medio para purificar HER-2/neu.
La cromatografía de afinidad es un método preferido para purificar polipéptidos de HER-2/neu. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales contra el polipéptido de HER-2/neu también pueden ser útiles en la purificación por cromatografía de afinidad, mediante el uso de unos métodos que se conocen bien en la técnica.
Finalmente, se puede utilizar una o más etapas de cromatografía líquida de gran resolución en fase inversa (RP-HPLC), utilizando unos medios de RP-HPLC hidrófobos (p, ej., gel de sílice que tenga expuesto un metilo u otros grupos alifáticos), para purificar adicionalmente una composición del polipéptido de HER-2/neu. También se pueden emplear algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en varias combinaciones, para proporcionar un polipéptido recombinante homogéneo.
El polipéptido recombinante de HER-2/neu producido en un cultivo bacteriano se aísla, preferiblemente, por extracción inicial de los sedimentos celulares, seguida de una o más etapas de concentración, precipitación con sal, intercambio acuoso de iones o cromatografía de exclusión por tamaños. Se puede utilizar la cromatografía líquida de gran resolución (HPLC) para las últimas etapas de purificación. Las células microbianas empleadas en la expresión de la proteína recombinante LbeIF4A se pueden lisar por cualquier método conveniente, incluidos los ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o el uso de agentes de lisis celular.
La fermentación de la levadura que expresa el polipéptido de HER-2/neu como una proteína secretada simplifica enormemente la purificación. La proteína recombinante secretada, que es resultado de una fermentación a gran escala, se puede purificar por métodos análogos a los descritos en Urdal et al. (J. Chromatog. 296: 171, 1984). Esta referencia describe dos etapas de HPLC en fase inversa secuenciales para purificar el GM-CSF humano recombinante en una columna preparativa de HPLC.
Las preparaciones de los polipéptidos HER-2/neu sintetizados en un cultivo recombinante pueden contener componentes celulares que no son de HER-2/neu, incluidas proteínas, en unas cantidades y que dependen de las etapas de purificación llevadas a cabo para recuperar el polipéptido de HER-2/neu del cultivo. Ordinariamente, estos componentes serán de procedencia de levadura, procariótica o eucariótica no humana. Típicamente, tales preparaciones están libres de otras proteínas que se puedan asociar normalmente a la proteína HER-2/neu que se encuentra en la naturaleza en su especie de origen.
La síntesis automática proporciona un método alternativo para preparar los polipéptidos de esta invención. Por ejemplo, se puede emplear cualquiera de las técnicas de fase sólida disponibles comercialmente, como el método de síntesis de fase sólida de Merrifield, en el que se añaden secuencialmente aminoácidos a una cadena de aminoácidos en crecimiento (véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963). El equipo para la síntesis automática de polipéptidos está disponible comercialmente de proveedores como Applied Biosystems, Inc. de Foster City, CA (EEUU) y, por lo general, se pueden manejar según las instrucciones del fabricante.
Dentro de un aspecto de la presente invención, se puede detectar el uso de un polipéptido de HER-2/neu (o una molécula de ADN que dirige la expresión de tal péptido) para generar una respuesta inmunitaria a la proteína HER-2/neu (incluida la expresada en una neoplasia maligna a la cual se asocia el oncogén HER-2/neu). Los ejemplos representativos de tales neoplasias malignas incluyen el cáncer de mama, el cáncer de ovario, el cáncer de colon, el carcinoma broncopulmonar y el cáncer de próstata. Una respuesta inmunitaria a la proteína HER-2/neu, una vez generada por un polipéptido de HER-2/neu, puede ser duradera y se puede detectar mucho después de la inmunización, independientemente de si la proteína está presente o ausente en el cuerpo durante las pruebas. Se puede detectar una respuesta inmunitaria a la proteína HER-2/neu, generada por la reacción a un polipéptido de HER-2/neu al examinar la presencia o ausencia, o refuerzo, de la activación específica de los linfocitos T CD4^{+} o CD8^{+}. Más específicamente, los linfocitos T aislados de un individuo inmunizado por técnicas rutinarias (como la centrifugación de los linfocitos de la sangre periférica en un gradiente de densidad de Ficoll/Hypaque) se incuban con la proteína HER-2/neu. Por ejemplo, se pueden incubar los linfocitos T in vitro durante 2 a 9 días (normalmente, 4 días) a 37ºC con la proteína HER-2/neu (normalmente, 5 \mug/ml de la proteína entera o cantidades graduales de células que sintetizan la proteína HER-2/neu). Puede ser deseable incubar otra alícuota de una muestra de linfocitos T en ausencia de la proteína HER-2/neu para servir como un control.
Se puede detectar la activación específica de los linfocitos T CD4^{+} o CD8^{+} de diversos modos. Los métodos para detectar la activación específica de los linfocitos T incluyen detectar la proliferación de los linfocitos T, la producción de citocinas (p. ej., linfocinas) o la generación de actividad citolítica (a saber, la generación de linfocitos T citotóxicos específicos de la proteína HER-2/neu). Para los linfocitos T CD4^{+}, un método preferido para detectar la activación específica de los linfocitos T es la detección de la proliferación de los linfocitos T. Para los linfocitos T CD8^{+}, un método preferido para detectar la activación específica de los linfocitos T es la detección de la generación de una actividad citolítica.
La detección de la proliferación de los linfocitos T se puede llevar a cabo mediante una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, se puede detectar la proliferación de los linfocitos T midiendo la tasa de síntesis del ADN. Los linfocitos T que se han estimulado para que proliferen muestran un aumento de la tasa de la síntesis de ADN. Un modo típico para medir la tasa de síntesis del ADN es, por ejemplo, mediante cultivos de linfocitos T con marcación por pulsos con timidina tritiada, un precursor nucleosídico que se incorpora en el ADN recién sintetizado. La cantidad de timidina tritiada incorporada se puede determinar usando un espectrofotómetro de centelleo líquido. Otros modos para detectar la proliferación de linfocitos T incluyen medir los aumentos en la producción de la interleucina-2 (IL-2), el flujo de Ca^{2+} o la absorción de un colorante, como 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio. Alternativamente, se puede medir la síntesis de las linfocinas (como el interferón gamma) o se puede cuantificar el número relativo de linfocitos T que son capaces de responder a la proteína intacta p185^{HER-2/neu}.
Con el uso o la expresión de un polipéptido de HER-2/neu, se puede hacer proliferar in vivo a los linfocitos T que reconocen la proteína HER-2/neu. Por ejemplo, un medicamento para la inmunización con un péptido de HER-2/neu (a saber, como una vacuna) puede inducir una expansión continua del número de linfocitos T necesarios para el ataque terapéutico contra un tumor al que está asociado el oncogén HER-2/neu. Normalmente, se administrarán desde aproximadamente 0,01 \mug/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por vía intradérmica, subcutánea o intravenosa. Una dosis preferida es desde aproximadamente 1 \mug/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg, con una dosis particularmente preferida desde aproximadamente 5 \mug/kg hasta aproximadamente 200 \mug/kg. Para los expertos en la técnica, será evidente que el número y la frecuencia de administración dependerán de la respuesta del paciente. Puede ser deseable administrar el polipéptido de HER-2/neu repetitivamente. A los expertos en la técnica les resultará evidente que se puede administrar más de un polipéptido de HER-2/neu, tanto simultánea como secuencialmente. Los péptidos preferidos para usar en un medicamento para inmunización son los que incluyen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 que comienza cerca del resto de lisina en la posición del aminoácido 676 y se extiende hasta cerca del resto de valina en la posición del aminoácido 1255. Los expertos en la técnica apreciarán que la presente invención contempla el uso de un polipéptido intacto HER-2/neu así como la división de tal polipéptido en un gran número de péptidos. No se usan solos para la inmunización ni una proteína intacta p185^{HER-2/neu} ni un péptido que tenga la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular completo (a saber, un péptido que tenga una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde la posición del aminoácido 1 hasta la posición del aminoácido 650, con un margen de más o menos cinco posiciones, y con o sin los primeros 21 aminoácidos).
Un polipéptido de HER-2/neu (o ácido nucleico) se formula, preferiblemente, para usarlo en los métodos anteriores como una composición farmacéutica (p. ej., vacuna). Generalmente, las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más polipéptidos en combinación con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos no serán tóxicos para los receptores en las dosis y las concentraciones empleadas. También se contempla el uso de un polipéptido de HER-2/neu junto con fármacos quimioterápicos.
Además del polipéptido de HER-2/neu (que funciona como un antígeno), puede ser deseable incluir otros componentes en la vacuna, como un vehículo para la administración del antígeno y las sustancias inmunoestimuladoras diseñadas para reforzar la inmunogenia de la proteína. Ejemplos de vehículos para la administración del antígeno incluyen sales de aluminio, emulsiones de agua en aceite, vehículos de aceite biodegradable, emulsiones de aceite en agua, microcápsulas biodegradables y liposomas. Ejemplos de sustancias inmunoestimuladoras (adyuvantes) incluyen N-acetilmuramil-L-alanina-D-isoglutamina (MDP), lipopolil-sacáridos (LPS), glucano, IL-2, GM-CSF, interferón gamma e IL-15. A los expertos en esta técnica les resultará evidente que se puede preparar sintéticamente un polipéptido de HER-2/neu para una vacuna u obtenerlo naturalmente.
Mientras que se puede emplear cualquier excipiente adecuado que conozcan los expertos en la técnica en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo del excipiente variará dependiendo del modo de administración y de si se desea una liberación sostenida. Para la administración parenteral, como una inyección subcutánea, el excipiente comprende, preferiblemente, agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para la administración oral, se puede emplear cualquiera de los excipientes anteriores o un excipiente sólido, como manitol, lactosa, almidón, estereato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato de magnesio. También se pueden emplear las microesferas biodegradables (p. ej., galáctido poliláctico) como excipientes para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Las microesferas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en las patentes de los EEUU nº. 4 897 268 y 5 075 109. Se puede encapsular un polipéptido de HER-2/neu dentro de la microesfera biodegradable o se puede asociar a la superficie de la microesfera. Por ejemplo, en una realización preferida, se encapsula un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde el aminoácido 676 hasta el aminoácido 1255 dentro de una microesfera biodegradable. Respeto a esto, es preferible que la microesfera mida más de unos 25 \mum.
Las composiciones farmacéuticas (incluidas las vacunas) también pueden contener diluyentes como los tampones, antioxidantes como el ácido ascórbico, polipéptidos de baja masa molecular (menos de unos 10 restos), proteínas, aminoácidos, glúcidos incluidos la glucosa, la sacarosa o las dextrinas, quelantes como el EDTA, glutation y otros estabilizantes y excipientes. Son diluyentes ejemplares apropiados una solución salina tamponada neutra o una solución salina mezclada con albúmina de suero inespecífica. Preferiblemente, el producto se formula como un liofilizado usando unas disoluciones de excipiente adecuadas (p, ej, sacarosa) como diluyentes.
Como una alternativa a la presentación de los polipéptidos de HER-2/neu, el objeto de la invención incluye las composiciones capaces de administrar unas moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de HER-2/neu. Tales composiciones incluyen vectores víricos recombinantes [p. ej., retrovirus (véanse, las patentes internacionales WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698 y WO 94/03622), adenovirus (véase Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988; Li et al., Hum. Gene. Ther. 4: 403-409, 1993; Vincent et al., Nat. Genet. 5: 130-134, 1993; y Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 215-219, 1994), virus de la varicela (véanse las patentes de los EEUU nº. 4 769 330, nº. 5 017 587 y la patente internacional WO 89/01973)], ADN desnudo (véase la patente internacional WO 90/11092), molécula de ácido nucleico complejada a una molécula policatiónica (véase la patente internacional WO 93/03709) y ácido nucleico asociado a liposomas (véase Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7851, 1987). En determinadas realizaciones, el ADN puede estar unido a un adenovirus muerto o inactivado (véase Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147-154, 1992; Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6094, 1992). Otras composiciones adecuadas incluyen combinaciones ADN-ligando (véase Wu et al., J. Biol. Chem. 264: 16985-16987, 1989) y lípido-ADN (véase Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1989). Además, se puede aumentar la eficacia de la captación del ADN desnudo en las células recubriendo el ADN en perlas biodegradables.
Además de los procedimientos directos in vivo, se pueden utilizar procedimientos ex vivo en los que se retiran células de un animal, se modifican y se colocan en el mismo u otro animal. Resultará evidente que uno puede utilizar cualquiera de las composiciones anotadas anteriormente para introducir moléculas de ácido nucleico de HER-2/neu en células de tejidos en un contexto ex vivo. En la técnica se conocen bien los protocolos para los métodos víricos, físicos y químicos de captación.
En consecuencia, la presente invención es útil para reforzar o inducir, en un paciente o cultivo celular, una respuesta inmunitaria celular (p. ej., la generación de linfocitos T citolíticos específicos del antígeno). Como se usa en la presente invención, el término "paciente" se refiere a cualquier animal de sangre caliente, preferiblemente un humano. Un paciente puede padecer cáncer, como un cáncer de mama, o estar normal (a saber, sin una enfermedad o infección detectable). Un "cultivo celular" es cualquier preparación de linfocitos T o de células de un componente aislado (incluidos macrófagos, monocitos, linfocitos B y células dendríticas, pero sin limitarse a ellas). Se pueden aislar tales células mediante cualquiera de una variedad de técnicas que los expertos en la técnica conocen bien (como la centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque). Las células se pueden haber aislado (aunque no es necesario) de un paciente que padece una neoplasia maligna asociada a HER-2/neu, y se pueden reintroducir en un paciente después del tratamiento.
La presente invención también describe que el polipéptido de HER-2/neu, además de ser inmunógeno para los linfocitos T, parece estimular los linfocitos B para producir anticuerpos capaces de reconocer el polipéptido de HER-2/neu. Se pueden encontrar anticuerpos específicos (a saber, que muestran una afinidad de unión de aproximadamente 10^{7} litros/mol o mejor) para la proteína HER-2/neu en una variedad de líquidos corporales incluidos los sueros y la ascitis. Brevemente, se aísla una muestra de líquido corporal de un animal de sangre caliente, como un humano, de quien se desea determinar si hay presentes anticuerpos específicos contra el polipéptido de HER-2/neu. Se incuba el líquido corporal con el polipéptido de HER-2/neu en unas condiciones y con un tiempo suficientes como para permitir formar inmunocomplejos entre el polipéptido y los anticuerpos específicos contra la proteína. Por ejemplo, se puede incubar un líquido corporal y un polipéptido de HER-2/neu a 4ºC durante 24 a 48 horas. Después de la incubación, se analiza la presencia de los inmunocomplejos en la mezcla de reacción. La detección de uno o más inmunocomplejos formados entre el polipéptido de HER-2/neu y los anticuerpos específicos contra el polipéptido de HER-2/neu se puede llevar a cabo mediante una variedad de técnicas conocidas, como los radioinmunoensayos (RIA) y los inmunoensayos enzimáticos ligados a enzimas (ELISA).
Los inmunoensayos adecuados incluyen la técnica del inmunoensayo intercalado con un anticuerpo monoclonal doble de David et al. (patente de los EEUU nº. 4 376 110); ensayos intercalados con anticuerpos monoclonal-policlonales (Wide et al., in Kirkham y Hunter, eds. Radioimmunoassay Methods, E y S. Livingstone, Edinburgo, 1970); el método de "inmunotransferencia Western" de Gordon et al. (patente de los EEUU nº. 4 452 901); la inmunoprecipitación del ligando marcado (Brown et al., J. Biol. Chem. 255: 4980-4983, 1980); inmunoensayos enzimáticos ligados a enzimas como los descritos, por ejemplo, por Raines y Ross (J. Biol. Chem. 257: 5154-5160, 1982); técnicas inmunocitoquímicas, incluido el uso de fluorocromos (Brooks et al., Clin. Exp. Immunol. 39: 477, 1980); y la neutralización de la actividad [Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2396-2400 (1984)], todos los cuales se incorporan en la presente invención por referencia. Además de los inmunoensayos descritos anteriormente, están disponibles otra serie de inmunoensayos, incluidos los descritos en las patentes de los EEUU nº. 3 817 827, 3 850 752, 3 901 654, 3 935 074, 3 984 533, 3 996 345, 4 034 074 y 4 098 876, que se incorporan en la presente invención por referencia.
Para propósitos de detección, el polipéptido de HER-2/neu ("antígeno") puede estar marcado o sin marcar. Cuando está sin marcar, el antígeno se usa en los ensayos de aglutinación. Además, se puede usar un antígeno sin marcar en combinación con moléculas marcadas que reaccionan con los inmunocomplejos, o en combinación con anticuerpos marcados (segundos anticuerpos) que reaccionan con el anticuerpo dirigido contra el polipéptido de HER-2/neu, como anticuerpos específicos para la inmunoglobulina. Alternativamente, se puede marcar directamente el antígeno. Cuando está marcado, el grupo indicador puede incluir radioisótopos, fluoróforos, enzimas, sustancias luminiscentes o partículas colorantes. Estas y otras marcas se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en las siguientes patentes de los EEUU: 3 766 162, 3 791 932, 3 817 837, 3 996 345 y 4 233 402.
Normalmente, en un ensayo de ELISA, el antígeno se absorbe a la superficie de un pocillo de microvaloración. Luego, se bloquean los sitios de unión a la proteína residuales en la superficie con un agente apropiado, como albúmina de suero bovino (BSA), suero de cabra normal (SCN) inactivado por calor o BLOTTO (una disolución tamponada de leche en polvo desnatada que también contiene un conservante, sales y un antiespumante). Luego, se incuba el pocillo con una muestra de la que se sospecha que contiene el anticuerpo específico. La muestra se puede aplicar tal cual o, más a menudo, se puede diluir, normalmente en una disolución tamponada que contiene una pequeña cantidad (de 0,1% al 5,0% en peso) de proteína, como BSA, SCN o BLOTTO. Después de incubar durante suficiente tiempo como para permitir que se produzca una unión específica, se lava el pocillo para retirar la proteína sin unir y, luego, se incuba con un anticuerpo de inmunoglobulina específico de especie marcado con un grupo indicador. El grupo indicador se puede escoger entre un conjunto de enzimas, incluidas la peroxidasa de rábano, la beta-galactosidasa, la fosfatasa alcalina y la glucosa oxidasa. Se deja tiempo suficiente para que se produzca la unión específica, luego se lava de nuevo el pocillo para retirar el conjugado sin unir, y se añade el sustrato de la enzima. Se deja aparecer el color y se determina, visual o instrumentalmente, la densidad óptica del contenido del pocillo.
En una realización preferida de este aspecto de la presente invención, se une un grupo indicador a la proteína HER-2/neu. La etapa de detectar inmunocomplejos implica retirar sustancialmente cualquier proteína HER-2/neu sin unir y, luego, detectar la presencia o ausencia del grupo indicador.
En otra realización preferida, se une un grupo indicador a un segundo anticuerpo capaz de unirse a los anticuerpos específicos para la proteína HER-2/neu. La etapa de detectar inmunocomplejos implica a) retirar considerablemente cualquier anticuerpo sin unir, b) añadir el segundo anticuerpo, c) retirar considerablemente cualquier segundo anticuerpo sin unir y luego, d) detectar la presencia o ausencia del grupo indicador. Cuando se obtiene el anticuerpo específico para la proteína HER-2/neu a partir de un humano, el segundo anticuerpo es un anticuerpo antihumano.
En una tercera realización preferida para detectar inmunocomplejos, se une un grupo indicador a una molécula capaz de unirse a los inmunocomplejos. La etapa de detección implica a) añadir la molécula, b) retirar considerablemente cualquier molécula sin unir y luego, c) detectar la presencia o ausencia del grupo indicador. Un ejemplo de una molécula capaz de unirse a los inmunocomplejos es la proteína A.
Al experto en la técnica le resultará evidente que se pueden emplear una variedad de métodos para detectar los inmunocomplejos dentro de la presente invención. Los grupos indicadores adecuados para usar en cualquiera de los métodos incluyen radioisótopos, fluoroforos, enzimas, sustancias luminiscentes y partículas colorantes.
En un aspecto relacionado de la presente invención, se puede utilizar, para controlar la eficacia del tratamiento contra el cáncer, la detección de los inmunocomplejos formados entre el polipéptido de HER-2/neu y los anticuerpos en el líquido corporal que son específicos para el polipéptido de HER-2/neu, que implica un polipéptido de HER-2/neu, en busca de una neoplasia maligna a la que esté asociado el oncogén HER-2/neu. Se pueden analizar, en busca de los inmunocomplejos, las muestras de líquido corporal tomadas de un individuo antes y después del inicio del tratamiento, por medio de las metodologías descritas anteriormente. Brevemente, se compara el número de inmunocomplejos detectados en ambas muestras. Un cambio significativo en el número de inmunocomplejos en la segunda muestra (inicio del postratamiento) respecto a la primera muestra (previa al tratamiento) indica un tratamiento
exitoso.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
Ejemplos Ejemplo 1 Expresión y purificación del polipéptido de HER-2/neu recombinante humano
Se recuperó el polipéptido de HER-2/neu humano con el método de la PCR (p. ej., las patentes de los EEUU nº. 4 683 195, 4 683 202, 4 800 159) de un plásmido preparado según Di Fiore et al. (King et al., Science 229: 974-976, 1985; Di Fiore et al., Science 237: 178-182, 1987), mediante el uso de cebadores oligonucleotídicos que, adicionalmente, introdujeron un sitio de restricción BssHII y un sitio para la proteasa enterocinasa en el extremo 5' y un sitio EcoRI en el extremo 3'. El cebador del extremo 5' fue 5'-TCTGGCGCGCTGGATGACGATGACAAGAAACGACGGCAGCAGAAGATC-3'(SEQ ID nº. 3) mientras que el cebador del extremo 3' fue 5'-TGAATTCTCGAGTCATTACACTGGCACGTCCAGACCCAG-3' (SEQ ID nº. 4). Se subclonó el fragmento de la PCR de 1,8 kb resultante en el vector T de Novagen (Madison, WI, EEUU) y se determinó la secuencia de los clones seleccionados en el secuenciador de ADN automático ABI 373 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, EEUU), usando cebadores de secuenciación solapantes. Luego, los fragmentos de la PCR con la secuencia que correspondía a la secuencia de ADN publicada para el ADNc de HER-2/neu humano (SEQ ID n. 1; Coussens et al., Science 230: 1132, 1985; Yamamoto et al., Nature 319: 230, 1986) se conectaron en el marco de lectura correcto mediante el sitio BssHII con una tiorredoxina reductasa de E. coli modificada. Una etiqueta de afinidad de 6 histidinas empleada para la purificación por afinidad con Ni-NTA de la proteína de fusión expresada se incorporó en el homólogo de fusión con la tiorredoxina reductasa. Este ADNc para la proteína de fusión TrxA-polipéptido de HER-2/neu humano se subclonó en un vector de expresión pET modificado para la expresión en E. coli.
Mientras que la tiorredoxina reductasa se ha descrito que estabiliza y solubiliza otras proteínas heterólogas expresadas en E. coli, no parece ofrecer ninguna ventaja significativa para la expresión del polipéptido del HER-2/neu humano en E. coli. Mientras que una proporción significativa de la proteína de fusión trxA-polipéptido de HER-2/neu era soluble, la mayoría se expresó en cuerpos de inclusión. La proteína de fusión también se sometió a degradación durante la expresión en E. coli. Sin embargo, la presencia del homólogo de fusión de la tiorredoxina reductasa puede estabilizar la proteína durante la purificación. La disponibilidad de los anticuerpos monoclonales contra la tiorredoxina reductasa proporciona un marcador de seguimiento conveniente durante la purificación.
Para purificar el polipéptido humano de HER-2/neu con el homólogo de fusión de la tiorredoxina reductasa, que contenía la etiqueta de afinidad 6XHis, se resuspendió el sedimento de E. coli con inhibidores de proteasas y lisozima, y se sonicó. Se aislaron los cuerpos de inclusión mediante centrifugación y se lavaron 3 veces con desoxicolato, y el último lavado fue durante una noche para retirar el LPS. Los cuerpos de inclusión lavados se solubilizaron en GuHCl para la purificación por Ni. Se eluyó la columna de Ni con imidazol en urea y se dializó contra Tris pH8 a 10 mM. La recuperación del polipéptido de HER-2/neu mediante el uso de este protocolo proporcionó una proteína completa y pura al 80%-95% cuyo principal contaminante era proteína degradada. De 500 ml de fermentación, se recuperaron 20 mg. Resultó que más del 98% era el polipéptido de HER-2/neu. Las técnicas usadas en la presente invención las conocen bien los expertos en la técnica y se han descrito, por ejemplo, en J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^{a} ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Cold Spring Harbor, Nueva York, EEUU.
Ejemplo 2 Las células dendríticas pueden sensibilizar para el polipéptido de HER-2/neu humano A. Generación de cultivos de CD de médula ósea
Se generaron cultivos de CD (células dendríticas) a partir de células CD34+ progenitoras hematopoyéticas (CPH). Se purificaron las células CD34+ a partir de médula ósea de donantes normales, usando el sistema de separación de células Ceprate LC Kit (CellPro, Bothell, WA, EEUU). Se determinó la pureza de las células recuperadas CD34+ con análisis de citometría de flujo, que fue del 80% al 95%. Se cultivaron las células CD34+ en un medio sin suero (X-VIVO 10, Biowhittaker, Inc., Walkersville, MD, EEUU) complementado con L-glutamina (584 \mug/l), penicilina (10 IU/ml), estreptomicina (100 \mug/ml), rGM-CSF humano a 100 ng/ml y rIL-6 humana a 50 ng/ml (Immunex, Seattle, WA, EEUU). Después de 0 a 17 días de cultivo, se recogieron las células y se usaron para fenotipado y ensayos de estimulación de los linfocitos T. Se ha descrito que el GM-CSF solo y en combinación con la IL-4 o el TNF\alpha inducen el desarrollo in vivo de las CD. En experimentos usando KLH y OVA como antígenos para sensibilizar los linfocitos T naturales, el GM-CSF más la IL-6 ofrecieron de manera concordante una estimulación total comparable, pero con un menor ruido de fondo y, así, un mayor índice de estimulación en comparación con el GM-CSF más la IL-4 o el
TNF\alpha.
B. Ensayo de sensibilización de los linfocitos T
Como APC, se usaron CPH CD34+ obtenidos a partir de médula ósea cultivados en un medio sin suero que contenía el GM-CSF y la IL-6 después de un periodo de cultivo de 0 a 17 días. Se determinó la capacidad sensibilizadora de las CD cultivándolas con linfocitos T autógenos sin sensibilizar en presencia o ausencia del polipéptido de HER-2/neu humano (PHNh) recombinante (10 \mug/ml) como antígeno proteico. Se aislaron linfocitos T CD4+ a partir de células mononucleares de la sangre periférica con selección positiva mediante columnas de inmunoafinidad (CellPro, Inc., Bothell, WA, EEUU). Se seleccionaron los linfocitos T (sin sensibilizar) CD4+ CD45RA+ a partir de los linfocitos T CD4+ con el uso del anticuerpo monoclonal anti-CD45RA que se conjugó directamente a FITC (Immunotech, Westbrook, ME, EEUU), con clasificación por citometría de flujo. Los linfocitos T CD4+ CD45RA+ obtenidos estaban puros al 99%. Se colocaron los cultivos de las CD en placas de 96 pocillos de fondo redondo (Corning, Corning, NY, EEUU) a varias concentraciones y se incubaron durante 16 a 18 horas con una concentración final de 10 \mug/ml del PHNh. Se irradiaron (10 Gy) las CD expuestas a un pulso con el antígeno y se les añadieron los linfocitos T CD4+ CD45RA+ (5 x 10^{4} linfocitos por pocillo). Se midió la respuesta proliferativa de los linfocitos T por medio de la captación de [^{3}H]-timidina (1 \muCi por pocillo) añadida en el día 6 durante 16 a 18 horas. Se realizaron ensayos de proliferación en un medio sin suero y sin citocina. Los resultados se muestran en la figura 1. La figura 2 muestra los resultados de las pruebas de los linfocitos T CD4+, de un donante normal, en relación a las respuestas al PHNh. Se obtuvieron unos datos similares con los linfocitos T de nueve de los diez individuos normales.
Ejemplo 3 Ensayo para detectar los precursores de linfocitos poco frecuentes
Se pueden usar tres ensayos para detectar las respuestas de los CD4+: un ensayo de proliferación estándar, un método de detección sistemática de acontecimientos de baja frecuencia y un ensayo de dilución limitante (EDL). Los ensayos de proliferación convencionales son capaces de detectar rápidamente las respuestas sensibilizadoras. El índice de estimulación de la respuesta proliferativa proporciona una correlación a grosso modo con la frecuencia de precursores de los linfocitos T reactivos del antígeno. Se considera que cualquier respuesta proliferativa específica detectada a partir de PBL es una respuesta sensibilizada.
Para proporcionar una interpretación más cuantitativa de las respuestas de los linfocitos T CD4+, se usa el sistema de ensayo desarrollado para detectar respuestas de baja frecuencia del precursor de linfocitos (descrito más adelante). Este ensayo es simple y rentable. En las situaciones en las que se necesita más precisión, se valida la frecuencia del precursor por medio de ensayos de dilución limitante (Bishop y Orosz, Transplantation 47: 671-677, 1989).
Las respuestas mayores que las detectadas en individuos normales se definen como una respuesta sensibilizada e implican una inmunidad existente. Se consideran que las respuestas bajas, detectables sólo mediante condiciones del EDL, son respuestas sin sensibilizar. Se considera que la ausencia de respuesta mediante el EDL o una respuesta menor que la definida por el análisis de poblaciones normales es tolerancia/anergia.
En general, las respuestas sensibilizadoras de los linfocitos T CD4+ se pueden detectar en ensayos proliferativos convencionales, mientras que las respuestas no sensibilizadoras son indetectables en los mismos ensayos. La detección de pequeñas cantidades de linfocitos T sin sensibilizar está limitada por una absorción de timidina de fondo entorpecedora, incluida la respuesta de los linfocitos mixtos autógenos (RLMA) al antígeno del propio CMH más las respuestas a las propias proteínas del suero procesadas y a las proteínas del suero añadido exógenamente.
Para inducir y detectar linfocitos T sin sensibilizar, se usó un sistema de ensayo para las respuestas de baja frecuencia basado en la estadística de muestras de Poisson (en Pinnacles, Chiron Corporation, 1:1-2, 1991). Este tipo de análisis se aplica específicamente a acontecimientos de baja frecuencia en los que, si la frecuencia del precursor es menor que el número de células en un cultivo de replicado, se necesitan muchos replicados para detectar un número estadísticamente significativo de positivos. Teóricamente, el análisis corregirá las respuestas autógenas instalando un control positivo conocido (como PHA o vacuna antitetánica) y un control negativo conocido (sin antígeno) y evaluando todos los puntos de datos desde el más bajo al más elevado independientemente del grupo experimental al que pertenecen. Se calcula un valor discriminatorio sobre la base de la ecuación "valor discriminatorio = M + (F + DE)", donde M = media aritmética, F = 3,29, un factor de las tablas de distribución normal estandarizadas elegido de manera que no más del 0,1% de los "negativos reales" de un fondo de distribución normal esté por encima del valor discriminatorio, y DE = desviación estándar. En este ensayo de detección, se considera que los pocillos por encima del valor discriminatorio son positivos reales que, posiblemente, contienen un linfocito que prolifera específicamente para el antígeno de interés. Aunque es posible estimar la frecuencia de los precursores de los linfocitos usando este método, la determinación precisa requiere un análisis formal por EDL.
Ejemplo 4 La vacuna a base del polipéptido de HER-2/neu induce la inmunidad a la proteína HER-2/neu A. Animales
En este estudio, se utilizaron ratas de la cepa 344 de Fischer (CDF (F-344)/CrIBR) (Charles River Laboratories, Portage MI, EEUU). Las ratas se mantuvieron en las instalaciones para animales de la Universidad de Washington en condiciones específicas sin patógenos y, para los estudios experimentales, se usaron sistemáticamente ratas con una edad entre 3 y 4 meses.
B. Inmunización
Se inmunizaron las ratas de Fischer con el polipéptido de HER-2/neu recombinante de rata (PHNr) en diversos adyuvantes (MPL, Vaccel; Ribi, Bozeman, MT, EEUU). Los animales recibieron 50 \mug de la PHNr mezclada con el adyuvante por vía subcutánea. Veinte días después, se reforzaron los animales con una segunda inmunización de 50 \mug de la PHNr, administrados del mismo modo. Veinte días después de la inmunización de refuerzo, se analizaron los animales en busca de la presencia de anticuerpos dirigidos contra la proteína HER-2/neu de rata (neu).
C. Estirpes celulares
Se utilizaron dos estirpes celulares como fuente de proteínas neu. La SKBR3, una estirpe celular del cáncer de mama humano que sobreexpresa notablemente HER-2/neu (American Type Culture Collection, Rockville, MD, EEUU) se mantuvo en un cultivo en suero bovino fetal (SBF) al 10% (Gemini Bioproducts, Inc., Calabasas, CA, EEUU) y RPMI. La DHFR-G8, una estirpe celular NIH/3T3 cotransfectada con cneu-p y pSV2-DHFR (American Type Culture Collection, Rockville, MD, EEUU), se usó como una fuente no transformante de la proteína de rata neu (Bernards et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 6854-6858, 1987). Esta estirpe celular se mantuvo en SBF al 10% y en un medio de Eagle modificado de Dulbecco con 4,5 g/l de glucosa. Las células DHFR-G8 se pasaron por el mismo medio complementado con 0,3 \muM de metotrexato en cada tercer pase para conservar el neu transfectante.
D. Preparación de lisados celulares
Se prepararon lisados de la SKBR3 y de la DHFR-G8 y se utilizaron como una fuente de la proteína neu. Brevemente, se preparó un tampón de lisis que consistió en una base de tris, cloruro de sodio y Triton-X al 1% a pH de 7,5. Se añadieron inhibidores de las proteasas: aprotinina (1 \mug/ml), benzamidina (1 mM) y PMSF (1 mM). Se usó 1 ml del tampón de lisis para suspender 10^{7} de células. Las células se agitaron con un vórtex durante 15 segundos cada 10 minutos durante una hora, hasta que se rompieron. Todos los procedimientos se llevaron a cabo en hielo en una cámara fría a 4ºC. Después de la lisis, las células se centrifugaron en una microcentrífuga a 4ºC durante 20 minutos. Se retiró el sobrenadante de los residuos celulares y se almacenó en pequeñas alícuotas a -70ºC, hasta que se usaran. Se documentó la presencia del neu de rata y de humanos en los lisados mediante el análisis por inmunotransferencia Western.
E. ELISA para las respuestas del anticuerpo contra el neu de rata
Se incubaron placas Immunlon 4 de 96 pocillos (Baxter SP, Redmon, WA: Dynatec Laboratories) durante una noche a 4ºC con un anticuerpo monoclonal específico del neu de rata (Oncongene Science), 7.16.4, a una concentración de 10 \mug/ml diluido en tampón carbonato (concentraciones equimolares de Na_{2}CO_{3} y NaHCO_{3}, con un pH de 9,6). Después de incubar, se bloquearon todos los pocillos con una BSA al 1% en PBS (Sigma Chemical, St. Louis, MO, EEUU), 100 \mul/pocillo durante 3 horas a temperatura ambiente. Se lavó la placa con un Tween al 0,5% en PBS y se añadieron lisados de DHFRG8, una estirpe celular murina transfectada con ADN de neu de rata (American Type Culture Collection, Rockville, MD, EEUU) a modo de una fuente de proteína neu de rata, en columnas alternas. Se incubó la placa durante una noche a 4ºC. Luego, se lavó la placa con un Tween al 0,5% en PBS y se añadieron los sueros experimentales en las siguientes diluciones: 1:25 a 1:200. Se diluyeron los sueros en un PBS con BSA al 1%, SBF al 1%, IgG de ratón a 25 \mug/ml y NaN_{3} al 0,01%, y luego, en serie, en PBS con BSA al 1%. Se añadieron 50 \mul de los sueros diluidos por pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió cada suero experimental a un pocillo con neu de rata y a un pocillo sin neu de rata. Se añadió Ig F(ac')_{2} antirrata de oveja con peroxidasa de rábano (PRP) a los pocillos, en una dilución 1:5000 en PBS con BSA al 1% y se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente (Amersham Co., Arlington Helgts, IL, EEUU). Tras el lavado final, se añadió el reactivo de revelado TMB (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, EEUU). Se leyó la reacción del color en una densidad óptica (DO) de 450 nm. Se calculó la DO de cada dilución de suero como la DO de los pocillos recubiertos con el neu de rata menos la DO de los pocillos recubiertos con BSA al 1% en PBS. También se evaluaron los sueros de animales inmunizados solo con los adyuvantes y un animal inmunizado con la PHNh (proteína foránea), de manera similar. Los resultados se muestran en la figura 3.
F. Ensayos de proliferación de linfocitos T
Para el análisis de las respuestas específicas del polipéptido de HER-2/neu, se recogen células frescas del bazo o de ganglios linfáticos mediante rotura mecánica y se hacen pasar a través de una malla de alambre y se lavan. Se siembran 2 x 10^{5} células de bazo por pocillo y 1 x 10^{5} células de ganglio linfático por pocillo en placas de microvaloración de 96 pocillos de fondo redondo (Corning, Corning, NY, EEUU) con 6 replicaciones por grupo experimental. Los medios consisten en EHAA 120 (Biofluids) con L-glutamina, penicilina/estreptomicina, 2-mercaptoetanol y SBF al 5%. Se incuban las células con los polipéptidos. Después de 4 días, se pulsan los pocillos con 1 pCi de [^{3}H]-timidina durante 6 a 8 horas y se realiza el recuento. Los datos se expresan como el índice de estimulación (IE), que se define como la media de los pocillos experimentales dividida por la media de los pocillos de control (sin antígeno). Para el análisis de las respuestas específicas de la proteína HER-2/neu, se cultivan células de bazo o de ganglio linfático durante 3 estimulaciones in vitro. Durante el análisis, 1 x 10^{5} linfocitos T de bazo o de ganglio linfático en cultivo se siembran en placas de microvaloración de 96 pocillos, como se describió anteriormente. Se incuban las células con 1 \mug/ml de neu de rata purificada mediante columna de inmunoafinidad (a partir de células DHFR-G8 como la fuente del neu de rata). Después de 4 días, los pocillos recibieron un pulso con 1 \muCi de [^{3}H]-timidina durante 6 a 8 horas y se realizó el recuento. Los datos se expresan como un índice de estimulación que se define como la media de los pocillos experimentales dividida por la media de los pocillos de control (sin antígeno).
Ejemplo 5 Se pueden detectar las respuestas de sensibilización al polipéptido de HER-2/neu humano en pacientes con cáncer de mama
Se obtuvo sangre heparinizada de un paciente con un cáncer de mama de etapa II que sobreexpresaba HER-2/neu. Se separaron los linfocitos mononucleares de sangre periférica (LMSP) por medio de la centrifugación en densidad con Ficol Hypaque. Los LMSP se sembraron a una concentración de 2 x 10^{5} células/pocillo en unas placas de 96 pocillos de fondo redondo (Corning, Corning, NY, EEUU). Se realizaron replicaciones de 24 pocillos para cada grupo experimental. A cada replicación de 24 pocillos, se le añadieron antígenos que consistieron en 25 \mug/ml de péptidos derivados de HER-2/neu (de 15 a 20 aminoácidos de longitud con el número del primer aminoácido en la secuencia listada), 1 \mug/ml del polipéptido de HER-2/neu humano (PHNh), 1 \mug/ml de vacuna antitetánica y 25 \mug/ml de p30, un péptido derivado de la toxina tetánica. El ensayo se realizó en unos medios que contenían sueros humanos al 10%. Se midió la respuesta proliferativa de los linfocitos T mediante la captación de [^{3}H]-timidina (1 \muCi/pocillo) añadida en el día 4 durante 10 horas. Los pocillos positivos, los pocillos que reaccionaban al antígeno, se puntuaban como positivos si las cpm eran mayores que la media más 3 desviaciones estándares de los pocillos sin antígenos. Los resultados se muestran en la figura 4. Este paciente con cáncer de mama de etapa II tiene una respuesta significativa al PHNh recombinante.
A partir de lo anterior, será evidente que, aunque se han descrito en la presente invención realizaciones específicas de la invención para propósitos de ilustración, se pueden realizar varias modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(I)
SOLICITANTE: University of Washington 
\vskip0.800000\baselineskip
(II)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPUESTOS PARA INDUCIR O REFORZAR LA REACTIVIDAD INMUNITARIA A LA PROTEÍNA HER-2/NEU PARA PREVENIR O TRATAR LAS NEOPLASIAS MALIGNAS EN LAS QUE ESTÁ ASOCIADO EL ONCOGÉN HER-2/NEU 
\vskip0.800000\baselineskip
(III)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
(IV)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: SEED and BERRY LLP
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 6300 Columbia Center. 701 Fifth Avenue
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Seattle
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
ZIP: 98104-7092
\vskip0.800000\baselineskip
(V)
FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn distribución nº. 1.0 Versión nº. 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(VI)
DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE REGISTRO: 28-3-1996
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(VIII)
INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Sharkey. Richard G.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 32629
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/LISTA: 920010.448PC
\vskip0.800000\baselineskip
(IX)
INFORMACIÓN PARA LA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (206) 622-4900
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (206) 682-6031
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº. 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3768 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(IX)
RASGOS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
UBICACIÓN: 1..3765
\vskip0.800000\baselineskip
(XI)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº. 1:
\vskip1.000000\baselineskip
2
3
4
5
6
7
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº. 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(I)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1255 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(II)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº. 2:
\vskip1.000000\baselineskip
10
11
12
13
14
15 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº. 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(I)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(XI)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº. 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCTGGCGCGC TGGATGACGA TGACAAGAAA CGACGGCAGC AGAAGATC 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº. 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(I)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: mono
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(XI)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº. 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGAATTCTCG AGTCATTACA CTGGCACGTC CAGACCCAG 
\hfill
39

Claims (25)

1. Una composición que comprende un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable en combinación con un polipéptido codificado por una secuencia de ADN desde el nucleótido 2026 al 3765 de la SEQ ID nº. 1 para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una neoplasia maligna a la cual se asocia el oncogén HER-2/neu.
2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde lisina, el aminoácido 676, hasta valina, el aminoácido 1255, o una variante de la misma que produce, al menos, una respuesta inmunitaria equivalente.
3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2, desde el aminoácido 676 hasta el aminoácido 1255.
4. El uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un polipéptido de la composición, para la fabricación de un medicamento para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una neoplasia maligna a la cual se asocia el oncogén HER-2/neu.
5. Una molécula de ácido nucleico para la inmunización por transfección de las células de un animal de sangre caliente con la molécula de ácido nucleico, en la que dicha molécula de ácido nucleico dirige la expresión de un polipéptido codificado por una secuencia de ADN desde el nucleótido 2026 al 3765 de la SEQ ID nº. 1.
6. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, en la que las células se transfectan ex vivo para la posterior administración al animal.
7. El uso de una molécula de ácido nucleico para la fabricación de un medicamento para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una neoplasia maligna a la cual se asocia el oncogén HER-2/neu, en la que dicha molécula de ácido nucleico dirige la expresión de un polipéptido codificado por una secuencia de ADN desde el nucleótido 2026 al 3765 de la SEQ ID nº. 1.
8. Un vector vírico para la inmunización por infección de las células de un animal de sangre caliente con el vector, en la que dicho vector vírico dirige la expresión de un polipéptido codificado por una secuencia de ADN desde el nucleótido 2026 al 3765 de la SEQ ID nº. 1.
9. Un vector vírico de acuerdo con la reivindicación 8, en la que las células se infectan ex vivo para la posterior administración al animal.
10. El uso de un vector vírico para la fabricación de un medicamento para la inmunización de un animal de sangre caliente contra una neoplasia maligna a la cual se asocia el oncogén HER-2/neu, en la que dicho vector vírico dirige la expresión de un polipéptido codificado por una secuencia de ADN desde el nucleótido 2026 al 3765 de la SEQ ID n.º 1.
11. Una composición que comprende un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable en combinación con un polipéptido codificado por una secuencia de ADN desde el nucleótido 2026 al 3765 de la SEQ ID nº. 1 para inducir o reforzar una respuesta inmunitaria contra la proteína HER-2/neu.
12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde lisina, el aminoácido 676, hasta valina, el aminoácido 1255, o una variante de la misma que produce, al menos, una respuesta inmunitaria equivalente.
13. Una composición de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde el aminoácido 676 hasta el aminoácido 1255.
14. El uso de una composición de acuerdo con la reivindicación 11, 12 ó 13, para la fabricación de un medicamento para inducir o reforzar una respuesta inmunitaria contra la proteína HER-2/neu.
15. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, para inducir o reforzar una respuesta inmunitaria contra la proteína HER-2/neu.
16. El uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5, para la fabricación de un medicamento para inducir o reforzar una respuesta inmunitaria contra la proteína HER-2/neu.
17. Una molécula de ácido nucleico o el uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, 15 ó 16, en la que el polipéptido codificado tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde lisina, el aminoácido 676, hasta valina, el aminoácido 1255, o una variante de la misma que produce, al menos, una respuesta inmunitaria equivalente.
18. Una molécula de ácido nucleico o el uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, 15 ó 16, en la que el polipéptido codificado tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde el aminoácido 676 hasta el aminoácido 1255.
19. Un vector vírico de acuerdo con la reivindicación 8, para inducir o reforzar una respuesta inmunitaria contra la proteína HER-2/neu.
20. El uso de un vector vírico de acuerdo con la reivindicación 8, para la fabricación de un medicamento para inducir o reforzar una respuesta inmunitaria contra la proteína HER-2/neu.
21. Un vector vírico o el uso de un vector vírico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, 19 ó 20, en la que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde lisina, el aminoácido 676, hasta valina, el aminoácido 1255, o una variante de la misma que produce, al menos, una respuesta inmunitaria equivalente.
22. Un vector vírico o el uso de un vector vírico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, 19 ó 20, en la que el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº. 2 desde el aminoácido 676 hasta el aminoácido 1255.
23. La composición o el uso de la misma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u 11 a 14, en la que el polipéptido se une a un péptido o un polipéptido.
24. La composición o el uso de la misma de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u 11 a 14, en la que el polipéptido está truncado.
25. La composición de acuerdo con la reivindicación 24, en la que el polipéptido se une a un péptido o a un polipéptido.
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Families Citing this family (361)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7252829B1 (en) 1998-06-17 2007-08-07 Idm Pharma, Inc. HLA binding peptides and their uses
AU712441B2 (en) * 1994-12-14 1999-11-04 Scripps Research Institute, The In vivo activation of tumor-specific cytotoxic T cells
US6514942B1 (en) * 1995-03-14 2003-02-04 The Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for stimulating T-lymphocytes
US6685940B2 (en) * 1995-07-27 2004-02-03 Genentech, Inc. Protein formulation
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US20080220012A1 (en) * 1996-05-15 2008-09-11 Ragupathy Madiyalakan Therapeutic Compositions that alter the immune response
US8038994B2 (en) 1996-05-15 2011-10-18 Quest Pharmatech Inc. Combination therapy for treating disease
ATE233102T1 (de) * 1996-05-15 2003-03-15 Altarex Inc Verfahren und zusammensetzung zur umgestaltung multi-epitopischer antigene um die immunantwort einzuleiten
US7371376B1 (en) 1996-10-18 2008-05-13 Genentech, Inc. Anti-ErbB2 antibodies
JP2001512306A (ja) * 1997-01-08 2001-08-21 ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド タンパク質の産生方法
US6884435B1 (en) * 1997-01-30 2005-04-26 Chiron Corporation Microparticles with adsorbent surfaces, methods of making same, and uses thereof
US20040202680A1 (en) * 1997-01-30 2004-10-14 O'hagan Derek Microparticles with adsorbent surfaces, methods of making same, and uses thereof
PT991403E (pt) * 1997-01-30 2003-08-29 Chiron Corp Uso de microparticulas com antigenio adsorvido para estimular respostas imunes
ZA9811162B (en) * 1997-12-12 2000-06-07 Genentech Inc Treatment with anti-ERBB2 antibodies.
JP2002514573A (ja) * 1998-05-08 2002-05-21 スローン − ケッタリング インスティチュート フォー キャンサー リサーチ 能動的なワクチン接種のための組成物および方法
GB9810040D0 (en) * 1998-05-11 1998-07-08 Univ Nottingham Blood borne tumour markers
CA2340091C (en) 1998-08-11 2013-02-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Combination therapies for b-cell lymphomas comprising administration of anti-cd20 antibody
US6573043B1 (en) * 1998-10-07 2003-06-03 Genentech, Inc. Tissue analysis and kits therefor
KR20010099788A (ko) * 1998-11-09 2001-11-09 케네쓰 제이. 울코트 Ｂｍｔ 또는 ｐｂｓｃ 이식을 받은 환자의 키메라항-ｃｄ２０ 항체 치료법
EP1131093A4 (en) 1998-11-09 2002-05-02 Idec Pharma Corp TREATMENT OF HEMATOLOGICAL VILTIES ASSOCIATED WITH CIRCULATING TUMOR CELLS USING CHIMERIC ANTI-CD20 ANTIBODIES
US6541214B1 (en) * 1998-11-13 2003-04-01 Oregon Heath Science University N-terminally truncated HER-2/neu protein as a cancer prognostic indicator
GB9827228D0 (en) 1998-12-10 1999-02-03 Univ Nottingham Cancer detection method and reagents
US7396810B1 (en) * 2000-08-14 2008-07-08 Oregon Health Sciences University Compositions and methods for treating cancer by modulating HER-2 and EGF receptors
US7625859B1 (en) 2000-02-16 2009-12-01 Oregon Health & Science University HER-2 binding antagonists
US7393823B1 (en) 1999-01-20 2008-07-01 Oregon Health And Science University HER-2 binding antagonists
ATE425749T1 (de) 1999-01-27 2009-04-15 Cornell Res Foundation Inc Behandlung von mit her-2/neu-uberexprimierung einhergehendem krebs
HUP0105303A2 (en) * 1999-01-29 2002-05-29 Corixa Corp Her-2/neu fusion proteins
US7198920B1 (en) 1999-01-29 2007-04-03 Corika Corporation HER-2/neu fusion proteins
CA2367692A1 (en) * 1999-03-15 2000-09-21 Introgen Therapeutics, Inc. Dendritic cells transduced with a wild-type self gene elicit potent antitumor immune responses
EP1754488A1 (en) 1999-05-24 2007-02-21 Introgen Therapeutics, Inc. Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
WO2000071577A1 (en) * 1999-05-25 2000-11-30 Human Genome Sciences, Inc. Meth1 and meth2 polynucleotides and polypeptides
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
IL147017A0 (en) * 1999-06-25 2002-08-14 Genentech Inc TREATING PROSTATE CANCER WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
US20030086924A1 (en) * 1999-06-25 2003-05-08 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
US20040013667A1 (en) * 1999-06-25 2004-01-22 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
US7041292B1 (en) 1999-06-25 2006-05-09 Genentech, Inc. Treating prostate cancer with anti-ErbB2 antibodies
US7060284B1 (en) * 1999-08-03 2006-06-13 The Ohio State University Polypeptides and polynucleotides for enhancing immune reactivity to HER-2 protein
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
TR200200472T2 (tr) 1999-08-27 2002-06-21 Genentech, Inc. Anti-Erb B2 antikorları ile tedavi için dozajlar
CA2383615A1 (en) * 1999-09-22 2001-03-29 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
US20030157119A1 (en) * 1999-09-22 2003-08-21 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
US7378096B2 (en) 1999-09-30 2008-05-27 Health Research, Inc. Stress protein compositions and methods for prevention and treatment of cancer and infectious disease
WO2001023421A2 (en) * 1999-09-30 2001-04-05 Corixa Corporation Stress protein compositions and methods for prevention and treatment of cancer and infectious disease
FR2801106B1 (fr) * 1999-11-12 2007-10-05 Commissariat Energie Atomique Procede de diagnostic d'une esst provoquee par une souche d'atnc dans un echantillon biologique et son utilisation dans le diagnostic differentiel des differentes souches d'atnc
AU2087401A (en) * 1999-12-10 2001-06-18 Epimmune, Inc. Inducing cellular immune responses to her2/neu using peptide and nucleic acid compositions
WO2001048205A2 (en) * 1999-12-29 2001-07-05 Corixa Corporation Murine neu sequences and methods of use therefor
EP1252294A2 (en) * 2000-01-21 2002-10-30 Corixa Corporation Compounds and methods for prevention and treatment of her-2/neu associated malignancies
US6528060B1 (en) * 2000-03-16 2003-03-04 Genzyme Corporation Therapeutic compounds
WO2001074855A2 (en) * 2000-03-30 2001-10-11 Dendreon Corporation Compositions and methods for dendritic cell-based immunotherapy
IL152054A0 (en) * 2000-04-13 2003-05-29 Bio Life Science Forschungs & Entwicklungsgesellschaft Mbh Vaccine against cancerous diseases which is based on mimotopes of antigens expressed on tumor cells
WO2001083781A2 (en) * 2000-04-28 2001-11-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 14094, a novel human trypsin family member and uses thereof
KR20130056201A (ko) 2000-05-19 2013-05-29 제넨테크, 인크. ＥｒｂＢ 길항제에 의한 암 치료요법에 대한 효과적인 반응의 가능성을 개선시키기 위한 유전자 검출 분석
US10293056B1 (en) 2000-05-24 2019-05-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
US20030232399A1 (en) * 2000-06-14 2003-12-18 Robertson John Forsyth Russell Cancer detection methods and reagents
FR2812087B1 (fr) * 2000-07-21 2007-05-11 Inst Nat Sante Rech Med Procede de criblage de peptides utilisables en immunotherapie
US7229623B1 (en) 2000-08-03 2007-06-12 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins
MXPA03001389A (es) * 2000-08-14 2004-05-04 Corixa Corp Composiciones y metodos para la terapia y diagnostico de malignidades asociadas con her-2/neu.
AU2001283360A1 (en) * 2000-08-14 2002-02-25 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
PT1889630E (pt) 2000-10-18 2012-02-29 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacinas compreendendo o antigénio mage ligado a um fragmento da proteína d
US20020183271A1 (en) * 2000-12-07 2002-12-05 Sunil Chada Methods of treatment involving human MDA-7
US20040121946A9 (en) * 2000-12-11 2004-06-24 John Fikes Inducing cellular immune responses to her2/neu using peptide and nucleic acid compositions
US7906492B2 (en) * 2001-01-16 2011-03-15 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
US7507724B2 (en) 2001-01-16 2009-03-24 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
US20040071671A1 (en) * 2001-02-20 2004-04-15 Leturcq Didier J. Cell therapy method for the treatment of tumors
EP2848255B1 (en) * 2001-02-20 2017-08-23 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Artificial Drosophila antigen presenting cell for preparing CD8 cell suspension for use in the treatment of cancer
EP1236740B1 (de) * 2001-02-28 2012-07-18 Bio Life Science Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Vakzine gegen Krebserkrankungen, die mit dem HER-2/neu Onkogen assoziiert sind
SI2371854T1 (sl) * 2001-03-09 2014-09-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Office Of The General Counsel Induciranje imunosti tumorja z variantami beljakovine, ki se veĺ˝e na folat
GB0109297D0 (en) 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
AU2002303330B2 (en) 2001-05-31 2008-07-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Chimeric alphavirus replicon particles
ES2276732T3 (es) * 2001-09-03 2007-07-01 Bio Life Science Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. Mimotopos de antigenos y vacuna contra enfermedades cancerosas.
US7718387B2 (en) 2001-09-20 2010-05-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Measuring circulating therapeutic antibody, antigen and antigen/antibody complexes using ELISA assays
JP2005533000A (ja) * 2002-03-05 2005-11-04 ボード　オブ　リージェンツ，　ザ　ユニバーシティ　オブ　テキサス　システム Ｍｄａ−７に関与する免疫誘導を増強する方法
US8802618B2 (en) * 2002-03-08 2014-08-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Controlled modulation of amino acid side chain length of peptide antigens
JP2005522483A (ja) * 2002-04-11 2005-07-28 アルタレックス メディカル コーポレーション 結合剤及び腫瘍細胞をターゲティングする際のそれらの使用
AU2003251597A1 (en) * 2002-06-19 2004-01-06 Abgenix, Inc. Method for predicting response to epidermal growth factor receptor-directed therapy
US20090110702A1 (en) 2002-07-12 2009-04-30 The Johns Hopkins University Mesothelin Vaccines and Model Systems and Control of Tumors
EP1575500A4 (en) 2002-07-12 2007-01-03 Univ Johns Hopkins MESOTHELIN VACCINE AND MODEL SYSTEMS
US9200036B2 (en) 2002-07-12 2015-12-01 The Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems
EP2269619A1 (en) * 2002-08-12 2011-01-05 Jennerex Biotherapeutics ULC Methods and compositions concerning poxviruses and cancer
US20080019992A1 (en) * 2002-09-02 2008-01-24 Christoph Zielinski Antigen mimotopes and vaccine against cancerous diseases
CN1497255A (zh) * 2002-10-02 2004-05-19 ���µ�����ҵ��ʽ���� 被检测体用取样元件、被检测体处理装置及其处理方法
US20040089615A1 (en) * 2002-11-12 2004-05-13 Alan Weiss Evaporation control device for multiwell plates
GB2424273B (en) * 2002-11-14 2007-06-27 Univ Nottingham Method for preparing tumour marker protein
JP2006516117A (ja) * 2002-11-21 2006-06-22 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ＥｒｂＢ２抗体を用いた非悪性疾病または疾患の治療
AU2003294023B2 (en) 2003-01-03 2008-01-31 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti Spa Rhesus HER2/neu, nucleotides encoding same, and uses thereof
CA2514058C (en) * 2003-01-24 2014-05-13 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 254p1d6b useful in treatment and detection of cancer
EP1603943A2 (en) * 2003-03-03 2005-12-14 Board of Regents, The University of Texas System Methods and compositions involving mda-7
ES2456666T3 (es) 2003-04-18 2014-04-23 Biotech Synergy, Inc. Péptidos antígenos HLA-A2 asociados a un tumor y composiciones
US20050239088A1 (en) * 2003-05-16 2005-10-27 Shepard H M Intron fusion proteins, and methods of identifying and using same
US7178491B2 (en) * 2003-06-05 2007-02-20 Caterpillar Inc Control system and method for engine valve actuator
AU2004249254B2 (en) * 2003-06-17 2010-07-08 Mannkind Corporation Combinations of tumor-associated antigens for the treatment of various types of cancers
CA2532460C (en) * 2003-07-21 2012-04-24 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Synthetic gene encoding human epidermal growth factor 2/neu antigen and uses thereof
GB0321615D0 (en) 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
EP1684579A1 (en) 2003-10-22 2006-08-02 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods, compositions and devices for inducing stasis in cells, tissues, organs, and organisms
US7498298B2 (en) 2003-11-06 2009-03-03 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
CA2548220A1 (en) * 2003-12-01 2005-09-09 Introgen Therapeutics, Inc. Use of mda-7 to inhibit infection by pathogenic organisms
US20070281041A1 (en) * 2004-03-02 2007-12-06 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and Methods Involving MDA-7 for the Treatment of Cancer
JP2008506366A (ja) * 2004-05-14 2008-03-06 レセプター バイオロジックス インコーポレイテッド 細胞表面受容体アイソフォームならびにその同定および使用方法
EP2290071B1 (en) * 2004-05-28 2014-12-31 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving microRNA
KR20120064120A (ko) 2004-06-01 2012-06-18 제넨테크, 인크. 항체 약물 접합체 및 방법
JP2008504292A (ja) 2004-06-24 2008-02-14 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 免疫増強用の化合物
WO2006115509A2 (en) 2004-06-24 2006-11-02 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Small molecule immunopotentiators and assays for their detection
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
KR101270829B1 (ko) 2004-09-23 2013-06-07 제넨테크, 인크. 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체
WO2006042002A2 (en) * 2004-10-05 2006-04-20 Oregon Health And Science University Compositions and methods for treating disease
CA2582713A1 (en) * 2004-10-06 2006-04-20 Wellstat Biologics Corporation Detection of elevated levels of her-2/neu protein on circulating cancer cells and treatment
CA2857881A1 (en) 2004-11-12 2006-12-28 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving mirna and mirna inhibitor molecules
US20060115862A1 (en) * 2004-11-17 2006-06-01 Duke University Anti-tenascin monoclonal antibody immunoassays and diagnostic kits
CN100381460C (zh) * 2004-11-30 2008-04-16 北京市肿瘤防治研究所 Her-2模拟抗原表位及含有该表位的肽
US20060165711A1 (en) * 2004-12-29 2006-07-27 Bot Adrian I Methods to elicit, enhance and sustain immune responses against MHC class I-restricted epitopes, for prophylactic or therapeutic purposes
CN101166539B (zh) * 2005-02-08 2012-01-04 得克萨斯大学体系董事会 用于治疗癌症的涉及mda-7的组合物和方法
PT1879599E (pt) * 2005-04-20 2014-01-23 Hutchinson Fred Cancer Res Métodos, composições e artigos de fabrico para aumentar a capacidade de sobrevivência de células, tecidos, órgãos, e organismos
CN100398558C (zh) * 2005-05-10 2008-07-02 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 HER2/neu与Herstatin相互作用的活性片段及其编码基因与应用
AU2006249199A1 (en) * 2005-05-12 2006-11-23 Introgen Therapeutics, Inc. P53 vaccines for the treatment of cancers
US20090170769A1 (en) * 2005-05-13 2009-07-02 Pei Jin Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same
GB2426581A (en) * 2005-05-27 2006-11-29 Univ Nottingham Immunoassay methods
SI1889059T1 (sl) 2005-05-27 2009-12-31 Oncimmune Ltd Izboljšani imunotestni postopek
EP1912680B1 (en) * 2005-06-15 2014-11-26 The Ohio State University Research Foundation Her-2 peptides
MX2007015933A (es) 2005-06-17 2008-04-21 Mannkind Corp Metodos y composiciones para generar respuestas inmunes multivalentes contra espitopes dominantes y subdominantes, expresados en celulas cancerigenas y estromas tumorales.
GB0512751D0 (en) * 2005-06-22 2005-07-27 Glaxo Group Ltd New adjuvant
KR101772375B1 (ko) * 2005-09-07 2017-08-29 신라젠(주) Ｇｍ-ｃｓｆ를 발현하는 폭스바이러스를 사용한 전이성 및/또는 전신 파종성 암의 전신 치료법
WO2007030451A2 (en) * 2005-09-07 2007-03-15 Receptor Logic, Ltd. Antibodies as t cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
US8980246B2 (en) 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
CA2622036A1 (en) * 2005-09-08 2007-03-15 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, In C. Targeted identification of immunogenic peptides
US8945573B2 (en) * 2005-09-08 2015-02-03 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Targeted identification of immunogenic peptides
CA2626253A1 (en) 2005-10-18 2007-04-26 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Mucosal and systemic immunizations with alphavirus replicon particles
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
US20090053221A1 (en) * 2006-01-17 2009-02-26 Cheung Nai-Kong V Immune response enhancing glucan
EP1984004A4 (en) * 2006-01-17 2010-03-03 Sloan Kettering Inst Cancer THE THERAPY REINFORCING GLUCAN
US8323644B2 (en) * 2006-01-17 2012-12-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Therapy-enhancing glucan
WO2007092944A2 (en) * 2006-02-08 2007-08-16 Introgen Therapeutics, Inc. Compositions and methods involving gene therapy and proteasome modulation
WO2007109810A2 (en) * 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Methods for the preparation of imidazole-containing compounds
CA2646891A1 (en) * 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Immunopotentiating compounds
CA2646539A1 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Imidazoquinoxaline compounds as immunomodulators
US7517270B2 (en) * 2006-05-30 2009-04-14 Minds-I, Inc. Construction system
US20090087873A1 (en) 2006-07-21 2009-04-02 Invitrogen Corporation Sharply resolving labeled protein molecular weight standards
US7972602B2 (en) 2006-08-11 2011-07-05 Dendreon Corporation Promiscuous HER-2/Neu CD4 T cell epitopes
US8574848B2 (en) 2006-09-13 2013-11-05 Oncimmune Ltd. Immunoassay methods
CA2663034C (en) 2006-09-15 2016-05-03 Ottawa Health Research Institute Oncolytic rhabdovirus
JP2010510964A (ja) 2006-09-19 2010-04-08 アシュラジェン インコーポレイテッド 治療的介入の標的としての、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４７、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１６、ｍｉＲ−３３１、ｍｍｕ−ｍｉＲ−２９２−３ｐによって調節される遺伝子および経路
US20080075528A1 (en) * 2006-09-22 2008-03-27 Michael Marzetta Construction system
WO2008039874A2 (en) 2006-09-26 2008-04-03 Cedars-Sinai Medical Center Cancer stem cell antigen vaccines and methods
WO2008039974A2 (en) 2006-09-28 2008-04-03 Cedars-Sinai Medical Center Cancer vaccines and vaccination methods
US20080131878A1 (en) * 2006-12-05 2008-06-05 Asuragen, Inc. Compositions and Methods for the Detection of Small RNA
EP2104734A2 (en) * 2006-12-08 2009-09-30 Asuragen, INC. Mir-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US7935350B2 (en) * 2006-12-14 2011-05-03 Antigen Express, Inc. Ii-key/Her-2/neu hybrid cancer vaccine
US8889143B2 (en) 2006-12-14 2014-11-18 Antigen Express, Inc. Ii-key/HER-2/neu hybrid cancer vaccine
US7410225B1 (en) * 2007-03-14 2008-08-12 Minds-I, Inc. Multi-part links for endless track
KR20080084528A (ko) * 2007-03-15 2008-09-19 제네렉스 바이오테라퓨틱스 인크. 종양살상형 백시니아 바이러스 암 치료
CA2684265A1 (en) * 2007-04-19 2008-10-30 Wellstat Biologics Corporation Detection of elevated levels of her-2/neu protein from non-isolated circulating cancer cells and treatment
SI2162149T1 (sl) 2007-06-01 2014-04-30 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Cepivo za preprečevanje relapsa raka na dojki
US20090017716A1 (en) * 2007-07-11 2009-01-15 Michael Marzetta Construction system
US20090061456A1 (en) * 2007-08-30 2009-03-05 Allard William J Method for predicting progression free and overall survival at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients using circulating tumor cells
US8361714B2 (en) 2007-09-14 2013-01-29 Asuragen, Inc. Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
US20090117532A1 (en) * 2007-11-01 2009-05-07 Doyle Gerald V Pre-clinical method for monitoring serial changes in circulating breast cancer cells in mice
WO2009059450A1 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Shanghai Jiaotong University Peptide ligand directed drug delivery
US7841923B2 (en) * 2007-11-13 2010-11-30 Minds-I, Inc. Vehicle axle joint for a toy vehicle
CN101878429B (zh) * 2007-11-27 2015-05-20 维里德克斯有限责任公司 血液中循环黑素瘤细胞的自动化计数和表征
US8071562B2 (en) 2007-12-01 2011-12-06 Mirna Therapeutics, Inc. MiR-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20090191535A1 (en) * 2007-12-22 2009-07-30 Mark Carle Connelly Method of assessing metastatic carcinomas from circulating endothelial cells and disseminated tumor cells
GB0725239D0 (en) * 2007-12-24 2008-02-06 Oncimmune Ltd Calibrator for autoantibody assay
US8258111B2 (en) 2008-05-08 2012-09-04 The Johns Hopkins University Compositions and methods related to miRNA modulation of neovascularization or angiogenesis
JP2010006705A (ja) * 2008-06-13 2010-01-14 Atlas Antibodies Ab Ｈｅｒ２サブセット
PL2328923T3 (pl) 2008-09-02 2016-06-30 Cedars Sinai Medical Center Epitopy CD133
US9114099B2 (en) 2008-12-10 2015-08-25 The Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Miltary Medicine, Inc. Vaccine for the prevention of breast cancer recurrence
US20100234283A1 (en) 2009-02-04 2010-09-16 The Ohio State University Research Foundation Immunogenic epitopes, peptidomimetics, and anti-peptide antibodies, and methods of their use
US20110045080A1 (en) * 2009-03-24 2011-02-24 William Marsh Rice University Single-Walled Carbon Nanotube/Bioactive Substance Complexes and Methods Related Thereto
JP5718319B2 (ja) * 2009-05-14 2015-05-13 ネステク ソシエテ アノニム Ｈｅｒ２標的化療法に対する乳癌細胞の感受性を決定するためのバイオマーカー
WO2010144874A2 (en) 2009-06-12 2010-12-16 University Of Southern California Clusterin pharmaceuticals and treatment methods using the same
CA2809819A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 Centrose, Llc Extracellular targeted drug conjugates
BR112012005774B8 (pt) 2009-09-14 2023-02-14 Jennerex Inc uso de um inibidor de quinase antiangiogênico no tratamento de câncer
CA2836117C (en) 2009-12-10 2017-08-15 Ottawa Hospital Research Institute Oncolytic rhabdovirus
WO2011107100A1 (en) 2010-03-03 2011-09-09 Aarhus Universitet Methods and compositions for regulation of herv4
DK2528625T3 (da) 2010-04-15 2013-10-14 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepiner og konjugater deraf
KR20130121699A (ko) 2010-05-28 2013-11-06 테트리스 온라인, 인코포레이티드 상호작용 혼성 비동기 컴퓨터 게임 기반구조
EP2576613A1 (en) 2010-06-07 2013-04-10 Pfizer Inc. Her-2 peptides and vaccines
BR112012030311A2 (pt) 2010-06-08 2017-01-24 Genentech Inc anticorpo
JP5889912B2 (ja) 2010-11-17 2016-03-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド アラニニルメイタンシノール抗体コンジュゲート
KR101942237B1 (ko) 2011-01-04 2019-01-25 신라젠(주) 종양 항원에 대한 항체의 생산 및 종양용해 우두 바이러스의 투여에 의한 종양 특이적 보체 의존적 세포독성의 생산
JP2014506791A (ja) 2011-02-03 2014-03-20 マーナ セラピューティクス インコーポレイテッド ｍｉＲ−３４の合成模倣体
CN103459598B (zh) 2011-02-03 2016-08-10 米尔纳医疗股份有限公司 Mir-124的合成模拟物
KR101992502B1 (ko) 2011-05-12 2019-06-24 제넨테크, 인크. 프레임워크 시그너처 펩티드를 사용하여 동물 샘플에서 치료 항체를 검출하기 위한 다중 반응 모니터링 lc-ms/ms 방법
CA2872045A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Compositions and methods for glioblastoma treatment
AU2012294814A1 (en) 2011-08-05 2014-02-27 Research Development Foundation Improved methods and compositions for modulation of Olfml3 mediated angiogenesis
JP6153526B2 (ja) 2011-09-06 2017-06-28 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ ポリペプチドワクチン
WO2013040251A2 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Asurgen, Inc. Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
JP6104257B2 (ja) 2011-10-14 2017-03-29 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピンおよびそのコンジュゲート
WO2013123424A1 (en) * 2012-02-17 2013-08-22 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for generating cd8+ t cells having the ability to recognize cancer cells expressing a her2/neu polypeptide
WO2013130093A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Genentech, Inc. Biomarkers for treatment with anti-tubulin chemotherapeutic compounds
US20150283233A1 (en) 2012-06-15 2015-10-08 Gencia Corporation Compositions and Methods for Enhancing Immune Responses
UA114108C2 (uk) 2012-07-10 2017-04-25 Борд Оф Ріджентс, Дзе Юніверсіті Оф Техас Сістем Моноклональне антитіло для застосування в діагностиці і терапії злоякісних пухлин і аутоімунного захворювання
ES2649990T3 (es) 2012-10-12 2018-01-16 Medimmune Limited Conjugados de anticuerpos anti-CD22-pirrolobenzodiazepinas
AU2013328625B2 (en) 2012-10-12 2016-12-15 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US10751346B2 (en) 2012-10-12 2020-08-25 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine—anti-PSMA antibody conjugates
US10695433B2 (en) 2012-10-12 2020-06-30 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
DK2906298T3 (en) 2012-10-12 2018-12-17 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CN104837502B (zh) 2012-10-12 2018-08-10 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物
EP2906250B1 (en) 2012-10-12 2018-05-30 ADC Therapeutics SA Pyrrolobenzodiazepine-anti-psma antibody conjugates
AU2013334583B2 (en) 2012-10-24 2018-09-13 Research Development Foundation JAM-C antibodies and methods for treatment of cancer
CN105246894A (zh) 2012-12-21 2016-01-13 斯皮罗根有限公司 用于治疗增殖性和自身免疫疾病的非对称吡咯并苯并二氮杂卓二聚物
CN105189507A (zh) 2012-12-21 2015-12-23 斯皮罗根有限公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物
US10137182B2 (en) 2013-02-14 2018-11-27 Immunocellular Therapeutics, Ltd. Cancer vaccines and vaccination methods
CA2901501C (en) 2013-02-21 2023-03-07 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Vaccine composition
NZ710746A (en) 2013-03-13 2018-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CA2905181C (en) 2013-03-13 2020-06-02 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof for providing targeted therapy
SG11201507214SA (en) 2013-03-13 2015-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3033111B1 (en) 2013-08-12 2019-03-13 Genentech, Inc. 1-(chloromethyl)-2,3-dihydro-1h-benzo[e]indole dimer antibody-drug conjugate compounds, and methods of use and treatment
KR20160068738A (ko) 2013-08-14 2016-06-15 윌리엄 마쉬 라이스 유니버시티 운시알라마이신의 유도체, 합성 방법 및 항종양 제제로서 이들의 용도
CN114621346B (zh) 2013-08-21 2025-06-10 德克萨斯州大学系统董事会 用于靶向连接蛋白半通道的组合物和方法
KR102269209B1 (ko) 2013-08-29 2021-06-28 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 항신생물제로서 조작된 영장류 시스틴/시스테인 분해 효소
KR102271498B1 (ko) 2013-08-30 2021-07-05 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 종양 치료를 위한 키누레닌 고갈 효소의 투여
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3054986B1 (en) 2013-10-11 2019-03-20 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3054985B1 (en) 2013-10-11 2018-12-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US10010624B2 (en) 2013-10-11 2018-07-03 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
JP2017501694A (ja) 2013-12-04 2017-01-19 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 診断および療法のためのエキソソーム中のゲノムｄｎａ、ｒｎａおよびタンパク質の分析
KR20170042495A (ko) 2013-12-16 2017-04-19 제넨테크, 인크. 펩티드모방체 화합물 및 그의 항체-약물 접합체
BR112016013258A2 (pt) 2013-12-16 2018-01-16 Genentech Inc composto conjugado anticorpo-droga, composição farmacêutica, método para tratar câncer e kit
JP6671292B2 (ja) 2013-12-16 2020-03-25 ジェネンテック， インコーポレイテッド ペプチド模倣化合物及びその抗体−薬物コンジュゲート
WO2016033105A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Novel capsazepine analogs for the treatment of cancer and other proliferative diseases
JP7080053B2 (ja) 2014-08-29 2022-06-03 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 腫瘍の治療のための、キヌレニンを枯渇させる酵素の投与
JP6531166B2 (ja) 2014-09-10 2019-06-12 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びそのコンジュゲート
MX2017003123A (es) 2014-09-12 2017-05-12 Genentech Inc Anticuerpos y conjugados modificados geneticamente con cisteina.
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2016040825A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anthracycline disulfide intermediates, antibody-drug conjugates and methods
US20160074527A1 (en) 2014-09-17 2016-03-17 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and antibody disulfide conjugates thereof
AU2015352545B2 (en) 2014-11-25 2020-10-15 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
MX2017007169A (es) 2014-12-03 2018-05-02 Genentech Inc Compuestos de amina cuaternaria y conjugados de anticuerpofármaco de los mismos.
JP6724023B2 (ja) 2015-02-09 2020-07-15 リサーチ ディベロップメント ファウンデーション 改善された補体活性化を示す操作された免疫グロブリンｆｃポリペプチド
HRP20201791T1 (hr) 2015-03-04 2021-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Postupci za liječenje raka sa hemizigotnim gubitkom gena tp53
CN107533065A (zh) * 2015-03-13 2018-01-02 布莱恩·J·赫尔尼奇 在癌症和免疫恢复中监测cd4+1型t辅助细胞应答的方法
US20180171294A1 (en) * 2015-03-26 2018-06-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania In vitro artificial lymph node method for sensitization and expansion of t cells for therapy and epitope mapping
GB201506402D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
EP3302539A4 (en) * 2015-05-22 2018-12-19 Brian J. Czerniecki Manufacturing multi-dose injection ready dendritic cell vaccines
US9993538B2 (en) 2015-05-29 2018-06-12 Galena Biopharma, Inc. Peptide vaccine therapy for treatment of FRα-expressing tumors
US20180177727A1 (en) 2015-06-10 2018-06-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Use of exosomes for the treatment of disease
RU2612015C2 (ru) * 2015-06-29 2017-03-01 Общество с ограниченной ответственностью "Сибинтех" Пептид-иммуноген, используемый в терапевтической вакцине для лечения метастатического рака молочной железы у кошек и собак
AU2016298210B2 (en) 2015-07-28 2021-12-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Implant compositions for the unidirectional delivery of therapeutic compounds to the brain
US10526408B2 (en) 2015-08-28 2020-01-07 Research Development Foundation Engineered antibody FC variants
CA2996902C (en) 2015-10-02 2020-06-02 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine antibody drug conjugates and methods of use
CN108291227A (zh) 2015-10-14 2018-07-17 拜奥-帕斯控股股份有限公司 用于脂质体制剂的对乙氧基核酸
EP3362100B1 (en) 2015-10-16 2022-06-22 Genentech, Inc. Hindered disulfide drug conjugates
RU2624862C2 (ru) * 2015-10-20 2017-07-07 Общество с ограниченной ответственностью "Эпитек" Пептид-иммуноген, используемый в терапевтической вакцине для лечения метастатического рака молочной железы
EP3365025B1 (en) 2015-10-20 2020-07-15 Genentech, Inc. Calicheamicin-antibody-drug conjugates and methods of use
US20190038713A1 (en) 2015-11-07 2019-02-07 Multivir Inc. Compositions comprising tumor suppressor gene therapy and immune checkpoint blockade for the treatment of cancer
JP6987068B2 (ja) 2015-11-09 2021-12-22 ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィアThe Children’S Hospital Of Philadelphia 癌マーカーおよび治療標的としてのグリピカン２
CN114470194A (zh) 2015-12-02 2022-05-13 斯特库伯株式会社 与btn1a1免疫特异性结合的抗体和分子及其治疗用途
KR102815803B1 (ko) 2015-12-02 2025-06-05 주식회사 에스티사이언스 당화된 btla(b- 및 t-림프구 약화인자)에 특이적인 항체
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
WO2017147561A1 (en) 2016-02-26 2017-08-31 The Board Of Regents Of The University Of Texas System CONNEXIN (Cx) 43 HEMICHANNEL-BINDING ANTIBODIES AND USES THEREOF
MX2018010586A (es) 2016-03-02 2019-03-28 Univ Texas Nanovacuna de activacion de "sting" para inmunoterapia.
US20170315132A1 (en) 2016-03-25 2017-11-02 Genentech, Inc. Multiplexed total antibody and antibody-conjugated drug quantification assay
KR102418372B1 (ko) 2016-03-29 2022-07-08 주식회사 에스티큐브 글리코실화된 pd-l1에 특이적인 이중 기능 항체 및 이의 사용 방법
KR20180130541A (ko) 2016-03-29 2018-12-07 주식회사 에스티큐브앤컴퍼니 글리코실화된 면역체크포인트 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하는 방법
WO2017176076A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Ewha University - Industry Collaboration Foundation A peptide with ability to penetrate cell membrane
DK3449017T3 (da) 2016-04-29 2022-03-14 Univ Texas Målrettet måling af transkriptionel aktivitet vedrørende hormonreceptorer
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
CN109414451B (zh) 2016-05-16 2022-08-12 德克萨斯大学系统董事会 用于作为纳米粒递送tRNA的组合物及其使用方法
EP3458101B1 (en) 2016-05-20 2020-12-30 H. Hoffnabb-La Roche Ag Protac antibody conjugates and methods of use
EP3465221B1 (en) 2016-05-27 2020-07-22 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bioanalytical method for the characterization of site-specific antibody-drug conjugates
MA45169A (fr) 2016-05-31 2019-04-10 Sellas Life Sciences Group Inc Thérapie vaccinale pour le traitement du cancer de l'endomètre et de l'ovaire
JP2019521099A (ja) * 2016-06-03 2019-07-25 エトゥビクス コーポレーション Ｈｅｒ２／ｎｅｕを含む、腫瘍ワクチン接種及び免疫療法のための組成物及び方法
US10639378B2 (en) 2016-06-06 2020-05-05 Genentech, Inc. Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
CA3028771A1 (en) 2016-07-06 2018-01-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Human-enzyme mediated depletion of cystine for treating patients with cystinuria
EP3487883B1 (en) 2016-07-20 2023-01-04 Stcube, Inc. Methods of cancer treatment and therapy using a combination of antibodies that bind glycosylated pd-l1
WO2018031662A1 (en) 2016-08-11 2018-02-15 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepine prodrugs and antibody conjugates thereof
US9963498B2 (en) 2016-08-18 2018-05-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Peptides that inhibit syndecan-1 activation of VLA-4 and IGF-1R
AU2017325971A1 (en) 2016-09-16 2019-04-11 Bio-Path Holdings, Inc. Combination therapy with liposomal antisense oligonucleotides
EP3522933B1 (en) 2016-10-05 2021-12-15 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for preparing antibody drug conjugates
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
EP3538112B1 (en) 2016-11-09 2026-02-25 Musc Foundation for Research Development Cd38-nad+ regulated metabolic axis in anti-tumor immunotherapy
MA46852A (fr) 2016-11-17 2019-09-25 Univ Texas Composés à activité antitumorale contre des cellules cancéreuses porteuses de mutations egfr ou her2 exon 20
US11654112B2 (en) 2016-11-22 2023-05-23 Elektrofi, Inc. Particles comprising a therapeutic or diagnostic agent and suspensions and methods of use thereof
WO2018111902A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Multivir Inc. Methods and compositions comprising viral gene therapy and an immune checkpoint inhibitor for treatment and prevention of cancer and infectious diseases
MX375569B (es) 2017-02-08 2025-03-04 Adc Therapeutics Sa Conjugados de pirrolobenzodiazepinas y anticuerpos
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2018156973A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Assay for detection of early stage pancreatic cancer
PT3612537T (pt) 2017-04-18 2022-08-29 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina
ES2977788T3 (es) 2017-04-20 2024-08-30 Adc Therapeutics Sa Terapia combinada con un conjugado de anticuerpo anti-AXL y fármaco
KR102680776B1 (ko) 2017-05-12 2024-07-04 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 고호모시스테인혈증 및 호모시스틴뇨증 환자를 치료하기 위한 인간-효소 매개된 호모시스테인의 고갈
US10865403B2 (en) 2017-05-12 2020-12-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Engineered primate cystine/cysteine degrading enzymes for therapeutic uses
KR20200015602A (ko) 2017-05-31 2020-02-12 주식회사 에스티큐브앤컴퍼니 Btn1a1에 면역특이적으로 결합하는 항체 및 분자 및 이의 치료적 용도
US12215151B2 (en) 2017-05-31 2025-02-04 Stcube & Co., Inc. Methods of treating cancer using antibodies and molecules that immunospecifically bind to BTN1A1
CN110997724A (zh) 2017-06-06 2020-04-10 斯特库伯株式会社 使用结合btn1a1或btn1a1-配体的抗体和分子治疗癌症的方法
MX2019015042A (es) 2017-06-14 2020-08-06 Adc Therapeutics Sa Regimen de dosificacion.
AU2018314257B2 (en) 2017-08-11 2025-03-27 Research Development Foundation Engineered antibody Fc variants for enhanced serum half life
DK3668874T3 (da) 2017-08-18 2022-02-14 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepin-konjugater
IL273387B2 (en) 2017-09-20 2023-10-01 Ph Pharma Co Ltd Thylanstatin analogs
WO2019075097A1 (en) 2017-10-11 2019-04-18 Board Of Regents, The University Of Texas System PD-L1 HUMAN ANTIBODIES AND METHODS OF USE
CN119930795A (zh) 2017-10-12 2025-05-06 得克萨斯大学体系董事会 用于免疫疗法的t细胞受体
KR20200085780A (ko) 2017-11-07 2020-07-15 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 암의 치료에서 car-t 또는 car-nk 세포를 사용한 lilrb4 표적화
CA3084821A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treating cancer using exosomes-associated gene editing
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
EP3768698B1 (en) 2018-03-19 2025-02-12 MultiVir Inc. Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and cd122/cd132 agonists for the treatment of cancer
EP3768726B1 (en) 2018-03-23 2024-10-30 Board of Regents, The University of Texas System Dual specificity antibodies to pd-l1 and pd-l2 and methods of use therefor
WO2019182867A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Dual specificity antibodies to human pd-l1 and pd-l2 and methods of use therefor
SG11202009498RA (en) 2018-03-27 2020-10-29 Univ Texas Compounds with anti-tumor activity against cancer cells bearing her2 exon 19 mutations
EP3775258A4 (en) 2018-03-28 2022-01-26 Board of Regents, The University of Texas System IDENTIFICATION OF EPIGENETIC ALTERATIONS IN DNA ISOLATED FROM EXOSOMES
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN108624589B (zh) * 2018-04-17 2021-12-17 广州永诺生物科技有限公司 环状RNA circ-ERBB2及其检测试剂与应用
MX2020011023A (es) 2018-04-19 2021-01-29 Baylor College Medicine Reprogramación de células t cd4 en células cd8 citotóxicas por expresión forzada de cd8ab y receptores de células t restringidos de clase 1.
WO2019226969A1 (en) 2018-05-24 2019-11-28 Elektrofi, Inc. Particles comprising a therapeutic or diagnostic agent and suspensions and methods of use thereof
CN108484732A (zh) * 2018-06-08 2018-09-04 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种治疗肿瘤的抗原肽链组及其在药物中的应用
CN108715603A (zh) * 2018-06-08 2018-10-30 天津亨佳生物科技发展有限公司 一种治疗肿瘤的抗原肽链组及其在药物中的应用
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
JP7708662B2 (ja) 2018-10-24 2025-07-15 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト コンジュゲート化された化学的分解誘導物質および使用方法
EP3883955A1 (en) 2018-11-19 2021-09-29 Board of Regents, The University of Texas System A modular, polycistronic vector for car and tcr transduction
WO2020113029A2 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Multiplex genome editing of immune cells to enhance functionality and resistance to suppressive environment
MX2021006393A (es) 2018-11-29 2021-10-13 Univ Texas Metodos para expansion ex vivo de celulas exterminadoras naturales y uso de las mismas.
EP3894427A1 (en) 2018-12-10 2021-10-20 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
WO2020123388A1 (en) 2018-12-11 2020-06-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Radiotherapies and uses thereof
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
EP3917500A2 (en) 2019-01-31 2021-12-08 Elektrofi, Inc. Particle formation and morphology
JP2022519718A (ja) 2019-02-08 2022-03-24 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 加齢および加齢性臓器不全に関連する疾患の処置のためのテロメラーゼ含有エキソソーム
KR102890251B1 (ko) 2019-03-15 2025-11-25 메드임뮨 리미티드 암의 치료에 사용하기 위한 아제티도벤조디아제핀 이량체 및 이를 포함하는 컨쥬게이트
US12492380B2 (en) 2019-05-09 2025-12-09 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Methods for the production of hepatocytes
JP2022532766A (ja) 2019-05-17 2022-07-19 キャンサー プリベンション ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 家族性腺腫性ポリポーシスを処置するための方法
CN120484131A (zh) 2019-07-19 2025-08-15 费城儿童医院 包含磷脂酰肌醇蛋白聚糖2结合结构域的嵌合抗原受体
WO2021050953A1 (en) 2019-09-13 2021-03-18 Elektrofi, Inc. Compositions and methods for the delivery of therapeutic biologics for treatment of disease
CN114729045B (zh) 2019-09-26 2025-09-09 斯特库比公司 对糖基化的ctla-4特异性的抗体及其使用方法
US12595304B2 (en) 2019-10-09 2026-04-07 Stcube & Co., Inc. Antibodies specific to glycosylated LAG3 and methods of use thereof
US20220380765A1 (en) 2019-11-02 2022-12-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting nonsense-mediated decay to activate p53 pathway for the treatment of cancer
WO2021113644A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Multivir Inc. Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer
WO2021141977A1 (en) 2020-01-07 2021-07-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Improved human methyl thioadenosine/adenosine depleting enzyme variants for cancer therapy
KR20220133238A (ko) 2020-01-29 2022-10-04 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 Nrg1 융합체가 있는 암의 치료를 위한 포지오티닙의 용도
US20230112470A1 (en) 2020-01-29 2023-04-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Use of egfr/her2 tyrosine kinase inhibitors and/or her2/her3 antibodies for the treatment of cancers with nrg1 fusions
WO2021167908A1 (en) 2020-02-17 2021-08-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for expansion of tumor infiltrating lymphocytes and use thereof
JP2023522627A (ja) 2020-04-17 2023-05-31 エレクトロフィ，インコーポレイテッド 連続的な液滴形成及び脱水によって粒子を形成する方法
AU2021275239A1 (en) 2020-05-21 2022-12-15 Board Of Regents, The University Of Texas System T cell receptors with VGLL1 specificity and uses thereof
WO2021247836A1 (en) 2020-06-03 2021-12-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting shp-2 to overcome resistance
US20230266325A1 (en) 2020-06-30 2023-08-24 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting lung cancer
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
CA3201499A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Catamaran Bio, Inc. Genetically modified natural killer cells and methods of use thereof
WO2022115611A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Catamaran Bio, Inc. Cellular therapeutics engineered with signal modulators and methods of use thereof
JP2024503480A (ja) 2021-01-19 2024-01-25 ウィリアム マーシュ ライス ユニバーシティ ポリペプチドの骨特異的送達法
GB2603166A (en) 2021-01-29 2022-08-03 Thelper As Therapeutic and Diagnostic Agents and Uses Thereof
US20250114452A1 (en) 2021-08-04 2025-04-10 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Lat activating chimeric antigen receptor t cells and methods of use thereof
CN115925875A (zh) * 2021-08-20 2023-04-07 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Her2基因人源化非人动物及其构建方法和应用
JP2024536133A (ja) 2021-09-29 2024-10-04 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 抗ｈｓｐ７０抗体およびその治療的使用
CN118369419A (zh) 2021-10-05 2024-07-19 赛托维亚治疗有限责任公司 自然杀伤细胞及其使用方法
CN113699221B (zh) * 2021-10-19 2023-10-10 广州吉赛医疗科技有限公司 HER2 mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR检测引物探针及其应用
KR20240099161A (ko) 2021-10-20 2024-06-28 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 Bcma를 표적화하는 조성물 및 이의 사용 방법
US20240409934A1 (en) 2021-10-25 2024-12-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Foxo1-targeted therapy for the treatment of cancer
CN117980327A (zh) 2021-11-03 2024-05-03 杭州多禧生物科技有限公司 抗体的特异性偶联
CN114262689A (zh) * 2021-12-17 2022-04-01 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种快速检测cd19/cd20-car-t细胞活性的方法
GB202201137D0 (en) 2022-01-28 2022-03-16 Thelper As Therapeutic and diagnostic agents and uses thereof
WO2023172514A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Catamaran Bio, Inc. Engineered immune cell therapeutics targeted to her2 and methods of use thereof
TW202405011A (zh) 2022-04-01 2024-02-01 美國德州系統大學評議委員會 針對人類pd-l1及pd-l2之雙重特異性抗體及其使用方法
EP4514382A1 (en) 2022-04-28 2025-03-05 Musc Foundation for Research Development Chimeric antigen receptor modified regulatory t cells for treating cancer
US20250295687A1 (en) 2022-05-09 2025-09-25 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders
WO2023230531A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Lunglife Ai, Inc. Methods for detecting circulating genetically abnormal cells
WO2023239940A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Research Development Foundation Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof
EP4637833A2 (en) 2022-12-23 2025-10-29 Genentech, Inc. Cereblon degrader conjugates, and uses thereof
CN116042657A (zh) * 2023-01-16 2023-05-02 上海复诺健生物科技有限公司 自复制信使核糖核酸疫苗
EP4698230A2 (en) 2023-04-17 2026-02-25 Peak Bio, Inc. Antibodies and antibody-drug conjugates and methods of use and synthetic processes and intermediates
WO2025217275A2 (en) 2024-04-10 2025-10-16 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immune cell targeted compositions and related methods
WO2026006688A2 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Firefly Bio, Inc. Degrader antibody conjugates and uses thereof
WO2026006689A2 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Firefly Bio, Inc. Bcl-xl degrader antibody conjugates and uses thereof

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) * 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) * 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) * 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3901654A (en) * 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3766162A (en) * 1971-08-24 1973-10-16 Hoffmann La Roche Barbituric acid antigens and antibodies specific therefor
US3935074A (en) * 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) * 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) * 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) * 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) * 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4233402A (en) * 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
US4452901A (en) * 1980-03-20 1984-06-05 Ciba-Geigy Corporation Electrophoretically transferring electropherograms to nitrocellulose sheets for immuno-assays
US7838216B1 (en) * 1986-03-05 2010-11-23 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Human gene related to but distinct from EGF receptor gene
US5401638A (en) * 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
DE69031120T2 (de) * 1989-05-19 1998-01-15 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Her2 extrazellulare domäne
CA2042064C (en) * 1989-08-04 2008-10-21 Susan G. Stuart C-erbb-2 external domain:gp75
DE69108716T2 (de) * 1990-01-26 1995-08-17 Washington Research Foundation, Seattle, Wash. Immunreaktivität gegenüber exprimierten aktivierten oncogenen zur diagnose und behandlung von bösartigen geschwülsten.
US5958784A (en) * 1992-03-25 1999-09-28 Benner; Steven Albert Predicting folded structures of proteins
CN1118572A (zh) * 1993-03-05 1996-03-13 萨依特尔有限公司 Hla-a2.1组合肽及其用途
US5550214A (en) * 1994-02-10 1996-08-27 Brigham And Women's Hospital Isolated antigenic oncogene peptide fragments and uses
AU712441B2 (en) * 1994-12-14 1999-11-04 Scripps Research Institute, The In vivo activation of tumor-specific cytotoxic T cells
US6514942B1 (en) * 1995-03-14 2003-02-04 The Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for stimulating T-lymphocytes
US5840839A (en) * 1996-02-09 1998-11-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Alternative open reading frame DNA of a normal gene and a novel human cancer antigen encoded therein
FR2812087B1 (fr) * 2000-07-21 2007-05-11 Inst Nat Sante Rech Med Procede de criblage de peptides utilisables en immunotherapie

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Publication number Publication date
US5846538A (en) 1998-12-08
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US5876712A (en) 1999-03-02
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