ES2245805T3 - Polisacaridos que forman iminas, preparacion de los mismos y el uso de los mismos como adyuvantes de inmunoestimulantes. - Google Patents

Polisacaridos que forman iminas, preparacion de los mismos y el uso de los mismos como adyuvantes de inmunoestimulantes.

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ES2245805T3 ES98949701T ES98949701T ES2245805T3 ES 2245805 T3 ES2245805 T3 ES 2245805T3 ES 98949701 T ES98949701 T ES 98949701T ES 98949701 T ES98949701 T ES 98949701T ES 2245805 T3 ES2245805 T3 ES 2245805T3
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Abstract

Un conjugado de polisacárido para usar en la potenciación de la respuesta inmunitaria de un animal a un antígeno, en donde dicho conjugado de polisacárido comprende: (i) un polisacárido que se une a la superficie celular de células que presentan antígenos (APCs) en donde dicho polisacárido comprende un mínimo de siete sacáridos; y (ii) una o más moléculas que tienen un grupo carbonilo estable; en donde dichas una o más moléculas se seleccionan del grupo que consiste en aldehídos aromáticos, cetonas aromáticas, aldehídos cicloalquílicos, cetonas cicloalquílicas, aldehídos cicloalquenílicos, cetonas cicloalquenílicas, aldehídos heterocíclicos, cetonas heterocíclicas, cetonas heteroaromáticas, aldehídos heteroaromáticos, aldehídos alquílicos, cetonas alquílicas, aldehídos alquenílicos y cetonas alquenílicas, en donde el polisacárido (i) está ligado a las moléculas (ii) a través de (iii) un enlace covalente directo o covalentemente a través de un conector bifuncional de una manera que mantieneintacto el grupo carbonilo estable.

Description

Polisacáridos que forman iminas, preparación de los mismos y el uso de los mismos como adyuvantes de inmunoestimulantes.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a nuevos derivados de polisacáridos, a su preparación y a su uso en vacunas y composiciones inmunoestimulantes. Los adyuvantes son derivados de polisacáridos reconocidos por células que presentan antígenos (APCs).
Técnica relacionada
Los adyuvantes tienen utilidad para activar el sistema inmunitario para incrementar la eficacia de vacunas preventivas y terapéuticas. Los inmunoadyuvantes tienen aplicaciones en: (1) la estimulación no específica de la resistencia del huésped contra la infección y el cáncer, (2) la potenciación de inmunogenicidad de vacunas preventivas y (3) la potenciación de la inmunogenicidad de vacunas terapéuticas. Estos adyuvantes pueden mejorar preferentemente respuestas inmunitarias medidas por células (respuestas de células T, hipersensibilidad retardada), respuestas humorales (respuestas de células B, producción de anticuerpos) o ambas. La estimulación de la inmunidad humoral es importante para la prevención de infecciones bacterianas, algunas infecciones virales así como en la terapia de cánceres en circulación. La inmunidad celular es de principal importancia para la terapia de cánceres de tumores sólidos y algunas enfermedades virales.
Después de una estimulación inicial por un agente extraño o antígeno (tal como virus, bacterias o parásitos), el sistema inmunitario habitualmente reconoce y reacciona con el agente con una respuesta acelerada durante la reexposición. Esta respuesta mejorada forma la base del enorme éxito de la vacunación para la prevención de enfermedades. Sin embargo, la respuesta inmunitaria inicial a un antígeno extraño requiere varios días para la respuesta completa, lo que es insuficiente para una protección contra infecciones por organismos altamente virulentos. Un modo de alcanzar una respuesta inmunitaria protectora más rápida es mediante vacunación o inmunización con un patógeno, que habitualmente está atenuado o muerto. Sin embargo, en muchos casos, la inmunización con microorganismos destruidos o con antígenos puros provoca una respuesta inmunitaria a corto plazo pobre con inmunidad mediada por células débil o no producida en absoluto. En muchos casos, esta respuesta inmunitaria pobre puede modificarse mediante la adición de adyuvantes a la preparación de antígeno. Se ha observado que varios polisacáridos (polímeros de carbohidrato) de manosa (por ejemplo, mananos), \beta(1,3)-glucosa (por ejemplo, glucanos), \beta(1,4)-manosa acetilada (acemananos), \beta(1,4)-N-acetilglucosamina (quitinas) y heteropolisacáridos, tales como ramnogalacturonanos (pectinas), estimulan el sistema inmunitario. Las células que presentan antígenos (APCs) tienen receptores de la superficie celular específicos que reconocen y se unen a los restos de azúcar de estos y otros polisacáridos. Las células que presentan antígenos (APCs), tales como células dendríticas y algunos macrófagos, son responsables de recoger antígenos y procesarlos hasta péptidos pequeños en endolisosomas. Los antígenos procesados se expresan sobre la superficie de APCs junto con el MHC de clase II. Específicamente, las células T reactivas reconocen antígeno y MHC de clase II simultáneamente, dando respuestas inmunitarias que están restringidas al MHC de clase II. Las células B son estimuladas por antígenos procesados para producir anticuerpo. Estos receptores de la superficie de APC (tales como el receptor de manosa de macrófagos y su receptor homólogo DEC-205 procedente de células dendríticas) son proteínas de transmembrana que median en la endocitosis y aparentemente representan un papel en el procedimiento de la presentación de antígeno (Stahl, P.D., Current Opinion in Immunology 4:49 (1992); Jiang, W. y otros, Nature 375:151 (1995)). La unión de estos polsacáridos a tales receptores aparentemente induce la inmunoestimulación, según se muestra mediante el incremento en la fagocitosis, las respuestas proliferativas, la liberación de citoquinas y otras actividades del sistema inmunitario. Debido a esta actividad inmunoestimulante, estos polisacáridos se han propuesto como adyuvantes de vacunas.
Los adyuvantes de polisacárido ejercen un efecto inmunomodulador modificando la producción de citoquinas, tal como regulando al alza IL-1, y provocando una respuesta de Thl moderada. La respuesta inmunitaria producida por el subgrupo Thl de células T CD4^{+} induce anticuerpos que se fijan al complemento así como reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) fuertes asociadas con \gamma-IFN, IL-2 e IL-12. Los efectos de los polisacáridos sobre la conformación de proteínas naturales son moderados, conservando los epítopos de conformación necesarios para provocar una respuesta de anticuerpos neutralizadora. Sin embargo, debido a que estos adyuvantes no pueden permitir que antígenos exógenos se procesen a través de la ruta endógena, no inducen una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL). Debido a que las APCs tienen receptores de la superficie celular específicos para ciertos restos de carbohidrato, la orientación y el aporte a estas células de antígenos asociados con estos restos de azúcar puede mejorarse significativamente. Aparentemente, el papel de los restos de azúcar en la orientación del aporte de antígenos no está limitado a adyuvantes de polisacárido. Por ejemplo, la modificación de cadenas laterales de carbohidrato de quilajasaponina mediante oxidación con ácido peryódico da como resultado una pérdida de su capacidad adyuvante. Presumiblemente, esto resulta debido a la pérdida de su capacidad de orientación.
Aunque las propiedades adyuvantes de ciertos polisacáridos se conocen desde hace algún tiempo, su uso ha estado muy limitado a aplicaciones de investigación. Por ejemplo, se ha observado que los glucanos pueden inducir una respuesta antitumoral en ratones y tienen un efecto preventivo sobre la sepsis aguda. Estos efectos dependen del peso molecular de los glucanos y de su grado de ramificación. Los mananos son otros polisacáridos con actividad adyuvante que presumiblemente ejercen su efecto después de unirse al receptor de la superficie celular de manosa de macrófagos. Recientemente, se ha observado que la conjugación de un antígeno proteínico a manano bajo condiciones oxidantes daba como resultado una respuesta inmunitaria mediada por células (Apostolopoulos, V. y otros, Vaccine 14: 930 (1996)). Sin embargo, antígenos proteínicos conjugados a manano bajo condiciones no oxidativas, es decir, sin formación de aldehído, provocaban solo inmunidad humoral (Okawa, Y. y otros, J Immunol. Meth. 142:127 (1992)) y (Apostolopoulos, V. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:10128 (1995)). La estimulación de inmunidad de células T también se ha alcanzado mediante generando con galactosa oxidasa bajo condiciones experimentales aldehídos en los residuos de galactosilo de polisacáridos de la superficie celular (Zeng, B. y otros, Science 256:1560 (1992)). Sin embargo, esta inmunoestimulación no era reproducible (Rhodes, J. Immunol. Today 17:436 (1996)). Estos resultados subrayan los problemas asociados con la inestabilidad de los aldehídos y/o la producción ineficaz de aldehídos mediante oxidación enzimática.
Dellacherie E y Bonneaux F (Polymer Bulletin 31, 145-149 (1993)) describen dextranos aldehídicos para usar como un sistema portador de fármacos.
Chen H y Rhodes J (J. Mol. Med. (1996) 74:497-504) revisan fármacos formadores de bases de Schiff y sus mecanismos de potenciación inmunitaria y potencial terapéutico.
Es clínicamente y económicamente importante para la industria de las vacunas tener adyuvantes nuevos y eficaces. El desarrollo de nuevos adyuvantes que se orientan a células que presentan antígenos y proporcionan señales coestimulantes para estimular la inmunidad de células T es la materia de la presente descripción de patente.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a la materia que se indica en las reivindicaciones.
La presente invención se dirige a conjugados químicos (denominados aquí conjugados de polisacárido) para usar en la potenciación de la respuesta inmunitaria de un animal a un antígeno, que comprenden (i) un polisacárido capaz de unirse a la superficie celular de células que presentan antígenos (APCs) y (ii) una o más moléculas que tienen un grupo carbonilo estable (es decir, un grupo aldehído o cetona que es capaz de reaccionar con grupos amino para formar una imina o base de Schiff), en donde las moléculas (ii) están unidas al polisacárido (i) a través de (iii) un enlace covalente directo o covalentemente a través de un conector bifuncional de una manera que mantiene intacto el grupo carbonilo estable. Las moléculas que tienen un grupo carbonilo formador de imina pueden ser un compuesto cíclico aromático o no aromático, heterocíclico aromático o no aromático o no cíclico. Preferiblemente, se emplean como moléculas (ii) cetonas y aldehídos aromáticos o heteroaromáticos.
En la invención, una o más moléculas que tienen un grupo carbonilo estable (es decir, un grupo aldehído o cetona que es capaz de reaccionar con grupos amino para formar una imina o base de Schiff) están ligadas covalentemente, directamente o a través de una molécula conectora bifuncional, a antígenos de carbohidrato no adyuvantes para proporcionar una capacidad adyuvante intrínseca a los antígenos de carbohidrato no adyuvantes. La conjugación de una o más moléculas que tienen un grupo carbonilo estable a dichos antígenos de carbohidrato da como resultado un producto que tiene eficacia incrementada de vacunaciones preventivas en comparación con los antígenos de carbohidrato no conjugados.
La presente invención también se refiere al uso del conjugado de polisacárido, según se indica en las reivindicaciones, en la preparación de una vacuna o un medicamento, según se indica en las reivindicaciones.
Descripción detallada de las modalidades preferidas
La presente invención se dirige a conjugados de polisacárido que comprenden:
(i) un polisacárido capaz de unirse a la superficie de células que presentan antígenos (APCs); y
(ii) una o más moléculas que tienen un grupo carbonilo estable (es decir, un grupo aldehído o cetona que es capaz de reaccionar con grupos amino para formar una imina o base de Schiff, también denominado un "compuesto formador de imina");
en donde el polisacárido (i) está ligado (iii) a través de un enlace covalente directo o covalentemente a través del residuo de un conector bifuncional a dicha una o más moléculas (ii). Los compuestos que tienen el grupo carbonilo formador de imina pueden ser compuestos cíclicos aromáticos o no aromáticos, heterocíclicos aromáticos o no aromáticos o no cíclicos. Preferiblemente, se emplean como (ii) cetonas y aldehídos aromáticos o heteroaromáticos.
Para explicar más claramente este aspecto de la presente invención, conjugados de polisacárido pueden representarse mediante la fórmula I:
\newpage
IP-(L-I)_{x}
o sales farmacéuticamente aceptables de la misma, donde
P es un polisacárido que es capaz de unirse a la superficie celular de una célula que presenta antígeno;
cada L es independientemente un enlace covalente o el residuo de una molécula conectora bifuncional;
cada I es una molécula formadora de imina. Moléculas formadoras de imina preferidas son residuos de compuestos aromáticos o heteroaromáticos que tienen (a) una funcionalidad de acetona o aldehído; y (b) un segundo grupo funcional que es capaz de reaccionar con un grupo funcional complementario presente en dicho polisacárido o dicha molécula conectora bifuncional, si está presente; y
x es mayor que o igual a uno. El valor de x estará determinado por el número de grupos reactivos que están covalentemente modificados en el polisacárido. Un número de factores y estrategias influirán en el valor de x, como se detallará más a fondo aquí. Generalmente, x será una función del número de grupos reactivos hidroxilo, hemiacetal del extremo terminal, carboxilo y/o amino que están presentes en el polisacárido. Debido a la diversa distribución de pesos moleculares de polisacáridos (P) útiles, el grado de modificación que es expresado por x se expresa como el número de grupos formadores de imina introducidos por cien residuos de glicosilo. Usando esta convención, el valor de x puede variar de 1 a más de 100, con un intervalo preferido de 1 a aproximadamente 50 grupos formadores de imina por 100 residuos de glicosilo.
La relación de moléculas formadoras de imina varía ampliamente dependiendo de la estrategia de conjugación empleada. El control de esta relación se describe adicionalmente aquí.
Un grupo hidroxilo, hemiacetal del extremo terminal, ácido carboxílico o amino libre del polisacárido se emplea para conectar covalentemente el polisacárido (P) a (L) o (I). Uno o más de estos grupos reactivos que están presentes en el polisacárido pueden "activarse" (como se describe adicionalmente aquí) en primer lugar para incrementar la reactividad de estos grupos, o el polisacárido puede hacerse reaccionar con un compuesto formador de imina que tiene un grupo funcional "activado".
Un aspecto adicional de la invención se dirige a conjugados que comprenden uno o más compuestos que tienen un grupo carbonilo, en donde dichos compuestos están ligados covalentemente, directamente o a través del residuo de una molécula conectora bifuncional, a antígenos de carbohidrato no adyuvantes para proporcionar capacidad adyuvante intrínseca a los antígenos de carbohidrato no adyuvantes. La conjugación de una molécula formadora de imina a dicho antígeno de carbohidrato da como resultado un producto que tiene eficacia incrementada de vacunaciones preventivas en comparación con el antígeno de carbohidrato solo. Antígenos de carbohidrato incluyen polisacáridos, incluyendo lipopolisacáridos y peptidoglicanos de estreptococos, estafilococos y otras bacterias que se usan como antígenos de vacunas.
Polisacáridos
Polisacáridos que pueden emplearse para formar conjugados de la presente invención incluyen cualquier polisacárido, natural o químicamente modificado, que se una a receptoras de la superficie celular en APCs. Para los propósitos de la presente invención, polisacáridos útiles comprenden un mínimo de dos sacáridos, preferiblemente siete o más sacáridos, y no están ramificados o están ramificados, y pueden tener un peso molecular de aproximadamente 1.000 a varios millones de daltons. Polisacáridos preferidos tienen un peso molecular de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 500.000. Los polisacáridos pueden poseer modificaciones químicas como las descritas aquí.
El término "Células que Presentan Antígenos" o la abreviatura "APCs" para el propósito de la presente invención significan células dendríticas y macrófagos que son responsables de recoger antígenos, procesarlos hasta péptidos pequeños y expresarlos sobre su superficie junto con el MHC de clase II para la presentación a células T y
B.
Durante la evolución, los macrófagos y las células dendríticas han desarrollado receptores de la superficie celular que reconocen los restos de carbohidrato de diferentes microorganismos. Estos receptores representan un papel crítico en la fagocitosis así como en la pinocitosis, dos procesos que están implicados en la presentación de antígenos. Los polisacáridos reconocidos por estos receptores de la superficie celular serían adecuados para la construcción de estos adyuvantes debido a que tales polisacáridos proporcionan un mecanismo eficaz para la orientación a APC. En algunos casos, secuencias de carbohidratos de orígenes bacteriano, fúngico y animal son compartidas por polisacáridos de plantas. Así, los polisacáridos de plantas pueden proporcionar una fuente práctica de materiales de partida en algunos casos. Aunque estos adyuvantes pueden prepararse con polisacáridos solubles o insolubles, se prefieren las formas solubles.
Las aplicaciones de la presente descripción no están de ningún modo limitadas a polisacáridos de plantas. Pueden extenderse a otros compuestos que contienen carbohidratos procedentes de diferentes fuentes que son reconocidos por receptores superficiales de ACPs. Ejemplos de estos otros polisacáridos son quitinas y dextranos que son de origen animal o bacteriano, respectivamente. Ejemplos de compuestos que contienen carbohidrato adecuados son ácidos teicoicos bacterianos y sus derivados, lipopolisacáridos bacterianos, lípido A y sus derivados.
Finalmente, se contempla que la conjugación de compuestos que tienen grupos carbonilo formadores de imina a productos que contienen carbohidratos no adyuvantes es útil para proporcionar capacidad adyuvante intrínseca a estos productos y para incrementar la eficacia de inmunizaciones preventivas. Ejemplos de estos productos son polisacáridos de estreptococos, estafilococos y otras bacterias que se usan como antígenos de vacunas.
Entre los polisacáridos preferidos que son útiles en la presente invención están: \beta-glucanos; mananos; pectinas y 2-acetamidoglucanos. También son útiles derivados, incluyendo derivados solubles en agua, de estos polisacáridos. Véase la Solicitud Provisional Nº 60/083.106.
Polisacáridos preferidos se describen más a fondo a continuación.
\beta-Glucanos: Los \beta-glucanos tienen una cadena principal de unidades de \beta-D-glucopiranosilo conectadas (1\rightarrow3) que tiene unidades de \beta-D-glucopiranosilo ligadas por conexiones (1\rightarrow6). Se encuentran en varias fuentes, tales como levaduras, hongos, algas y cereales. Tienen un amplio intervalo de pesos moleculares, es decir entre 5.000 y >500.000, que influyen en sus propiedades inmunomoduladoras. En general, los \beta-glucanos de alto peso molecular que son relativamente insolubles en agua tienen una actividad biológica superior. Sin embargo, esta falta de solubilidad ha impedido la administración sistémica de glucanos. La modificación de estos polisacáridos mediante la introducción de grupos aniónicos, tales como fosfato, sulfato, carboxilo y otros, ha dado formas solubles que aparentemente retienen sus actividades biológicas. Glucanos solubles pueden prepararse mediante uno de los siguientes procedimientos: i) aislamiento de extractos de levadura (Hahn y Albersheim, 1978, Plant Physiol. 66:107), ii) sonicación de partículas de glucano (Januz y otros, 1986, J. Immune. 137:327, e iii) introducción de grupos aniónicos a glucanos insolubles mediante sulfonilación, fosforilación, carboximetilación o sulfatación (Bohn y BrMiller, 1995, Carbohydr. Polym. 28:3), (Di Luzio, Patente de EE.UU. 4.739.046, 4/1988)). En \beta-glucanos, el único residuo de glucosilo reductor (conectado en la posición 3) está situado en el extremo de la cadena principal de residuos de \beta-D-glucosilo conectados (1\rightarrow3). Los residuos de glucosilo ligados por conexiones (1\rightarrow6) a la cadena principal no tienen un grupo reductor libre. El fragmento más pequeño que se une al receptor de glucano de monocitos es un \beta-glucanoheptasacárido conectado (1\rightarrow3). Sin embargo, este oligosacárido no tiene actividad inmunoestimulante.
Mananos: Los mananos son polisacáridos lineales o ramificados formados exclusivamente por manosa. Los mananos se encuentran en plantas, mohos, bacterias y otros organismos. En ciertas plantas, los mananos lineales consisten en residuos de manosilo conectados \beta-(1\rightarrow4), mientras que en algunas levaduras los residuos de manosilo están conectados mediante conexiones \alpha-(1\rightarrow2) y \alpha-(1\rightarrow6). En los mananos ramificados de Saccharomyces cerevisiae (levadura del pan), el manano consiste en una estructura principal de manopiranosilo conectada \alpha-(1\rightarrow6) substituida en los átomos O-2 por cadenas laterales de \alpha-D-manopiranosilo, \alpha-D-manopiranosiol-\alpha-(1\rightarrow2)-\alpha-D-manopiranosilo y \alpha-D-manopiranosilo-\alpha-(1\rightarrow3)-\alpha-D-manopiranosilo-\alpha-(1\rightarrow2)-\alpha-D-manopiranosilo. Además, el manano de S. cerevisiae también puede estar fosforilado (Barreto-Bergter y P.A. Gorin, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 41:67 (1983), Vinogradov, E. y otros, Carbohydr. Res. 307:177 (1998)). Aunque la capacidad de los mananos de S. cerevisiae para estimular inmunidad mediada por células es cuestionable, mejoran la acción de los lipopolisacáridos al estimular respuestas de células T (Ohta, M. y otros, Immunology 60:503 (1987)). Parece que los mananos pueden ejercer sus efectos inmunoestimulantes uniéndose a los receptores de la superficie celular que se unen a manosa de macrófagos. Un derivado de \beta-mananos, la \beta-(1\rightarrow4)-polimanosa acetilada, parece estimular el sistema inmunitario de una manera similar a los mananos.
Polisacáridos pécticos: Varios polisacáridos pécticos son anticomplementarios y pueden tener diferentes grados de actividad inmunopotenciadora (Yamada, H. y otros, Planta Medica 56:182 (1990)). La oxidación de estos polisacáridos con ácido peryódico da como resultado una pérdida de actividad anticomplementaria en la ruta clásica, pero una actividad incrementada en la ruta alternativa (Yamada, H. y Kiyohara, H., Abstracts of Chinese Medicine 3(1): 104 (1989)). Los polisacáridos que muestran alguna actividad inmunopotenciadora y así que son reconocidos por receptores de la superficie celular pueden agruparse ampliamente en homogalacturonanos, ramnogalacturonanos, arabanos, galactanos y arabinogalactanos. Sin embargo, no todos estos compuestos tendrían actividad biológica. En muchos casos, la actividad dependería de la estructura, el peso molecular, el estado de agregación y otros parámetros. En general, los polisacáridos pécticos son un grupo de polímeros de azúcar asociados con residuos de ácido \alpha-D-galactosilurónico conectados 1,4. Estos polisacáridos pueden tener varios oligosacáridos ramificados conectados a los residuos de ácido galactosilurónico de la cadena principal. A partir de estudios previos con saponinas y otros polisacáridos, los oligosacáridos ramificados parecen ser relevantes para la capacidad adyuvante.
2-Acetamidoglucanos: quitina, mureína y sus derivados: La quitina es un polímero de N-acetil-D-glucosamina (NAG) lineal conectado mediante conexiones \beta-(1\rightarrow4) que tiene aproximadamente 16 por ciento de sus residuos de NAG desacetialdos. Esta ampliamente distribuida en la naturaleza: se ha encontrado en el exoesqueleto de artrópodos y en las paredes celulares de hongos. Este polisacárido tiene cadenas que forman enlaces de hidrógeno intermoleculares extensivos, lo que lo hace insoluble en agua y en diferentes disolventes orgánicos. La retirada de grupos N-acetilo de la quitina mediante tratamiento con álcali fuerte da quitosano, un policatión soluble en agua de poli-D-glucosamina \beta-(1\rightarrow4). El quitosano con 70% de sus grupos N-acetilo retirado (quitina desacetilada) muestra una actividad inmunoestimulante (Azuma, I., Vaccine 10:1000 (1992)). Para evitar las limitaciones impuestas por su solubilidad, se han desarrollado varios derivados de quitina que son más solubles en agua, tales como glicolquitina (Senzyu, K. y otros, J. Japan, Agri. Chem. Soc., 23:432 (1950)) y carboximetilquitina, que también pueden tener propiedades inmunoestimulantes. Se han preparado quitodextrinas insolubles en alcoholes solubles en agua compuestas por heptámeros de oligosacáridos de NAG mayores mediante hidrólisis ácida limitada (Berger, L. R., y otros, Biochim. Biophys. Acta 29:522 (1958)). La mureína, el principal componente de las paredes celulares bacterianas, es un polisacárido formado por NAG conectada \beta-(1\rightarrow4), con una de las unidades de NAG substituidas en C-3 con un grupo ácido O-láctico mediante una conexión éter para dar ácido N-acetil-D-murámico (NAM) que forma la secuencia repetitiva NAG-NAM. Debido a los residuos de ácido láctico, las mureínas aisladas son solubles en agua. En la pared celular bacteriana, la mureína está ligada a ciertos péptidos para formar un peptidoglicano reticulado. Debido a sus similitudes estructurales, la quitina y la mureína son reconocidas por la enzima lisozima y aparentemente también por receptores de la superficie celular de macrófagos. Estas similitudes estructurales, que también están presentes en la glicolquitina, pueden explicar las propiedades inmunoestimulantes de la quitina y algunos de sus derivados.
Moléculas que Tienen un Grupo Carbonilo Estable (Moléculas Formadoras de Imina)
El segundo elemento de los conjugados de la presente invención es una o más moléculas que tienen un grupo carbonilo estable (es decir, un grupo aldehído o cetona) que es capaz de reaccionar con grupos amino para formar una imina o base de Schiff. Las moléculas que tienen el grupo carbonilo formador de imina pueden ser un carbociclo aromático o no aromático (saturado o parcialmente insaturado), un heterociclo aromático o no aromático (saturado o parcialmente insaturado) o un compuesto alifático no cíclico que puede tener uno o más enlaces insaturados.
Existe una evidencia de que ciertos compuestos aromáticos con grupos carbonilo son muy eficaces para formar iminas o bases de Schiff durante la reacción con grupos amino en ciertos receptor o receptores de la superficie de células Th. Debido a que los grupos carbonilo ligados a compuestos aromáticos son más estables (mientras que los aldehídos alifáticos generalmente son inestables), sus derivados tienen típicamente una vida útil más prolongada. Por otra parte, el carácter hidrófobo de los compuestos cíclicos que soportan los grupos carbonilo reforzará las interacciones entre receptores de la superficie celular y los conjugados de polisacárido. Por consiguiente, los compuestos que han de usarse para modificar los polisacáridos son preferiblemente aldehídos o cetonas arílicos o heteroarílicos. Para facilitar el acceso de estos compuestos a los grupos amino en células T, se prefiere más que tengan también algunas características hidrófilas.
Compuestos que encarnan algún grado de la totalidad de las propiedades mencionadas previamente son agentes preferidos para modificar los polisacáridos. Compuestos preferidos incluyen aril(de 6 a 10 átomos de carbono)-aldehídos y aril-(de 6 a 10 átomos de carbono)-alquil(de 1 a 4 átomos de carbono)-aldehídos mono- y di-substituidos, compuestos que comprenden un grupo arilo, tales como fenilo o naftilo, e incluyen un substituyente formilo o formil-alquilo(de 1 a 4 átomos de carbono). Preferiblemente, estos compuestos incluyen además uno o dos substituyentes adicionales tales como halo, hidroxilo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, hidroxialquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, trifluorometilo o benciloxi. Valores adecuados incluyen benzaldehído y naftaldehído, substituidos por uno o dos de hidroxi y halo. Ejemplos incluyen 2,3-, 2,4-, 2,5- y 3,4-dihidroxibenzaldehído, 5-cloro-2-hidroxibenzaldehído, vainillina, etilvainillina, naringenina, 3- y 4-hidroxibenzaldehído y 4-hidroxifenilacetaldehído. Un segundo grupo preferido es alquil(de 1 a 4 átomos de carbono)-aril(de 6 a 10 átomos de carbono)-cetonas substituidas con hidroxilo, tales como 2-, 3- y 4-hidroxiacetofenona, y cetonas arílicas substituidas con hidroxilo, tales como 6-hidroxi-1,2-naftoquinona. Un tercer grupo preferido incluye aldehídos heteroarílicos y cetonas heteroarílicas. Grupos heteroarilo útiles son tiofeno, furano, benzotiofeno, benzofurano, piridina, quinolina, piridazina, pirimidina, pirazol, imidazol, 1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, isoxazol y oxazol, teniendo cada uno un substituyente ceto, formilo o formil-alquilo(de 1 a 4 átomos de carbono), e incluyendo preferiblemente un substituyente halo o hidroxilo adicional, si estos pueden ser alojados por átomos de carbono de anillo disponibles. Preferiblemente, furanil-, piridil- e indolil-aldehídos y -cetonas son núcleos heteroarílicos útiles. Ejemplos de aldehídos y cetonas heteroarílicos útiles incluyen piridoxal, 2-tiofenocarboxaldehído y 3-tiofenocarboxaldehído.
Otro grupo relativamente estable de compuestos cíclicos que contienen grupos carbonilo formadores de imina son tripertenoides y esteroides que tienen una substitución de ceto, formilo o formilalquilo. Ejemplos incluyen androsterona, formildienolona, progesterona, prednisolona y otros derivados.
Conectores Bifuncionales
Los conectores bifuncionales son bien conocidos en la técnica para diversas aplicaciones (Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press 1996). Un número de conectores bifuncionales puede emplearse para formar una ligazón entre un polisacárido adecuado y un compuesto formador de imina adecuado. "Residuo de un conector bifuncional" se refiere a la estructura que conecta un compuesto carbonílico estable al polisacárido después de que los extremos terminales del conector bifuncional se hayan unido covalentemente a dicho compuesto y dicho polisacárido.
Ejemplos no limitativos de grupos conectores que pueden usarse para conectar el compuesto que contiene carbonilo estable al polisacárido son alquilendiaminas (NH_{2}-(CH_{2})_{n}-NH_{2}), donde n es de 2 a 12; aminoalcoholes (HO-(CH_{2})_{r}-
NH_{2}), donde r es de 2 a 12; aminotioles (HS-(CH_{2})_{r}-NH_{2}), donde r es de 2 a 12; y aminoácidos que están opcionalmente protegidos por carboxi; etilen- y polietilen-glicoles (H-(O-CH_{2}-CH_{2})_{n}-OH, donde n es 1-4). Compuestos de diamina bifuncionales incluyen etilendiamina, 1,3-propanodiamina, 1,4-butanodiamina, espermidina, ácido 2,4-diaminobutírico, lisina, 3,3'-diaminodipropilamina, ácido diaminopropiónico, N-(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina, 2-(4-aminofenil)etilamina y compuestos similares.
Cuando se emplea un grupo carboxilo del polisacárido como el grupo de conjugación, pueden emplearse uno o más aminoácidos como la molécula conectora bifuncional. Así, un aminoácido, tal como \beta-alanina o ácido \gamma-aminobutírico, o un oligopéptido, tal como di- o tri-alanina, puede emplearse como una molécula conectora adecuada.
Grupos conectores bifuncionales preferidos incluyen:
-NH-(CH_{2})_{r}-NH-, donde r es de 2-5,
-O-(CH_{2})_{r}-NH-, donde r es de 2-5,
-NH-CH_{2}-C(O)-,
-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-,
-NH-NH-C(O)-CH_{2}-,
-NH-C(CH_{3})_{2}-C(O)-,
-S-(CH_{2})_{r}-C(O), donde r es de 1-5,
-S-(CH_{2})_{r}-NH-, donde r es de 2-5,
-S-(CH_{2})_{r}-O-, donde r es de 1-5,
-S-(CH_{2})-CH(NH_{2})-C(O)-,
-S(CH_{2})-CH(COOH)-NH-,
-O-CH_{2}-CH(OH)-CH_{2}-S-CH(CO_{2}H)-NH-,
-O-CH_{2}-CH(OH)-CH_{2}-S-CH(NH_{2})-C(O)-,
-O-CH_{2}-CH(OH)-CH_{2}-S-CH_{2}-CH_{2}-NH-,
-S-CH_{2}-C(O)NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-, y
-NH-O-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-O-P(O_{2}H)-.
Las combinaciones preferidas de polisacárido, compuesto formador de imina, conectores y las relaciones para cada uno pueden incluir, pero no se limitan a:
Polisacárido (P) Compuesto formador de imina (I) Conector (L) L/P* I/P*
Glucanos 4-hidroxibenzaldehído -NH-(CH_{2})_{n}-NH-C(O)- 5-30 5-20
Glucanos ácido 4,6-dioxoheptanoico -C(O)-NH-(CH_{2})_{n}-NH- 5-30 5-20
Glucanos 5-fosfato de piridoxal -NH-O-C(O)-(CH_{2})-C-O- 5-30 5-20
Glucanos 2,4-dihidroxibenzaldehído -NH-(CH_{2})_{n}-NH-C(O)- 5-30 5-20
Glucanos 5-fosfato de piridoxal -NH-(CH_{2})_{n}-NH-C(O)- 5-30 5-20
Glucanos 2-tiofenocarboxaldehído -C(O)-NH-(CH_{2})_{n}-NH- 5-30 5-20
Glucanos 3-tiofenocarboxaldehído -NH-O-C(O)-(CH_{2})-C-O- 5-30 5-20
Mananos 4-hidroxibenzaldehído -NH-(CH_{2})_{n}-NH-C(O)- 5-30 5-20
Mananos ácido 4,6-dioxoheptanoico -C(O)-NH-(CH_{2})_{n}-NH- 5-30 5-20
Mananos 5-fosfato de piridoxal -NH-O-C(O)-(CH_{2})-C-O- 5-30 5-20
Mananos 2,4-dihidroxibenzaldehído -NH-(CH_{2})_{n}-NH-C(O)- 5-30 5-20
Mananos 5-fosfato de piridoxal -NH-(CH_{2})_{n}-NH-C(O)- 5-30 5-20
(Continuación)
Polisacárido (P) Compuesto formador de imina (I) Conector (L) L/P* I/P*
Mananos 2-tiofenocarboxaldehído -C(O)-NH-(CH_{2})_{n}-NH- 5-30 5-20
Polisacáridos péticos 4-hidroxibenzaldehído -NH-(CH_{2})_{n}-NH-(O)-
Polisacáridos péticos 5-fosfato de piridoxal -NH-(CH_{2})_{n}-NH-C(O)- 5-30 5-20
Polisacáridos péticos 2-tiofenocarboxaldehído -C(O)-NH-(CH_{2})_{n}-NH- 5-30 5-20
Polisacáridos péticos 3-tiofenocarboxaldehído -NH-O-C(O)-(CH_{2})-C-O- 5-30 5-20
Mureína 4-hidroxibenzaldehído -CH_{2}-CHOH-(CH_{2})-O-(CH_{2})_{n}- 5-30 5-20
O-CH_{2}-CHOH-CH_{2}-
Mureína ácido 4,6-dioxoheptanoico -C(O)-(CH_{2})_{n}-NH- 5-30 5-20
Mureína 2,4-dihidroxibenzaldehído -CH_{2}-CHOH-CH_{2}- 5-30 5-20
Mureína 5-fosfato de piridoxal -NH-(CH_{2})_{n}-NH-C(O)- 5-30 5-20
Mureína 2-tiofenocarboxaldehído -C(O)-NH-(CH_{2})_{n}-NH- 5-30 5-20
Mureína 3-tiofenocarboxaldehído -NH-O-C(O)-(CH_{2})-C-O- 5-30 5-20
Glicolquitina 5-fosfato de piridoxal -O-C(O)-(CH_{2})_{n}-C-O- 5-30 5-20
Glicolquitina 5-fosfato de piridoxal -NH-(CH_{2})_{n}-NH-C(O)- 5-30 5-20
Glicolquitina 2-tiofenocarboxaldehído -C(O)-NH-(CH_{2})_{n}-NH- 5-30 5-20
Glicolquitina 3-tiofenocarboxaldehído -NH-O-C(O)-(CH_{2})-C-O- 5-30 5-20
(*) \begin{minipage}[t]{150mm} Las relaciones I/P y L/P se expresan como moléculas de I o L incorporadas por 100 residuos de carbohidrato, n = 1 a 8\end{minipage}
Preparación de Adyuvantes de Polisacárido Formadores de Imina
La presente invención también se dirige a procedimientos para la preparación de conjugados de polisacárido de la presente invención. Los estudios de estructura/función de polisacáridos y saponinas adyuvantes han mostrado que la integridad de las estructuras de las cadenas de carbohidrato es crítica para su capacidad adyuvante. Aparentemente, el reconocimiento de los restos de carbohidrato por receptores superficiales de APCs es esencial para la orientación de las células así como para ejercer sus efectos inmunoestimulantes. La actividad adyuvante de saponinas triterpénicas también requiere un grupo aldehído en el resto triterpenoide. También se ha mostrado recientemente que pequeñas moléculas orgánicas capaces de formar iminas o bases de Schiff pueden proporcionar una señal coestimulante a células T, obviando así la necesidad de su estimulación mediante el receptor de B7-1 presente en APCs (Rhodes, J. y otros, Nature 377:71 (1995)). La adición de (i) un compuesto aromático cíclico o heterocíclico o compuestos cíclicos que tienen grupos carbonilo formadores de imina a (ii) ciertos polisacáridos reconocidos y unidos por APCs dará como resultado productos con propiedades adyuvantes superiores. Estas moléculas adyuvantes poseerán propiedades inmunomoduladoras y orientativas.
A. Adición de compuestos formadores de imina a residuos de glicosilo reductores terminales
Un método para ligar covalentemente compuestos formadores de imina a residuos de glicosilo reductores terminales de \beta-glucanos y \beta-mananos se describe aquí con referencia al Esquema 1.
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Esquema I
Adición de compuestos formadores de imina a \beta-glucanos a través de hemiacetal del extremo terminal 
\vskip1.000000\baselineskip
1
Debido a que los \beta-glucanos y \beta-mananos están comprendidos por residuos de glucosilo o manosilo, los grupos funcionales disponibles para modificaciones químicas son principalmente grupos hidroxilo (-OH) con reactividad limitada. Además, hay un residuo de glucosilo reductor terminal por cadena de polímero. En general, los grupos hidroxilo primario de residuos de glicosilo son más reactivos que los grupos hidroxilo secundarios. Sin embargo, es posible que la estructura de un polisacárido particular pueda imponer ciertas restricciones (estéricas o electrónicas) a la reactividad de los grupos hidroxilo. Esto creará una jerarquía de grupos hidroxilo que podría favorecer la producción de ciertos productos dominantes bajo condiciones de reacción limitativas.
El número restringido de azúcares reductores terminales en glucanos y mananos proporciona un sitio altamente específico para la introducción de nuevos grupos químicos. Esta especificidad hace a los hemiacetales glicosílicos del extremo terminal un grupo preferido para la producción comercial de adyuvantes de polisacáridos modificados de la presente invención.
Las modificaciones químicas descritas aquí pueden usarse con glucanos solubles o insolubles de diferentes organismos. Sin embargo, se proporcionan solo como ejemplos, no como limitaciones de los procedimientos sintéticos disponibles. Debido a que el papel de los restos de carbohidrato en estos nuevos adyuvantes es la orientación de APCs, el intervalo de pesos moleculares útiles puede variar ampliamente, es decir, de aproximadamente 1.000 a varios millones. En la presente invención, se prefieren oligo- y poli-sacáridos solubles de pesos moleculares que varían de aproximadamente 1.000 a varios cientos de miles.
El extremo reductor de los oligosacáridos proporciona un sitio selectivo y conveniente para la ligazón covalente directa de moléculas con grupos amino, tal como compuestos diamínicos bifuncionales. El procedimiento de aminación reductiva implica hacer reaccionar el residuo o los residuos de glicosilo reductores terminales en el oligosacárido (o polisacárido) con un compuesto que tiene uno o más grupos amino primarios en presencia de cianoborohidruro sódico (NaCNBH_{3}). El anión cianoborohidruro reduce selectivamente la imina o base de Schiff formada mediante un aldehído o cetona y una amina. Puesto que solo un pequeño porcentaje del tiempo los hemiacetales glucosílicos terminales están en su forma formílica o abierta, la reacción puede avanzar a una velocidad muy baja. Debido a que la presencia tanto de carbonilos formadores de imina como de aminas primarias en una molécula daría como resultado principalmente la producción de productos no deseables, las adiciones se llevan a cabo en un procedimiento en dos etapas, resumido como sigue:
Etapa 1
Oligosacáridos o polisacáridos de glucano/manano (1) se suspenden en un disolvente apropiado, tal como acetonitrilo acuoso, dimetilformamida (DMF), piridina o tampones acuosos que contienen un tampón de amina terciaria, pH 9,0, y un compuesto diamínico adecuado (2), donde n es de aproximadamente 2 a aproximadamente 12, preferiblemente de 2 a 4, se añade en el mismo disolvente con el pH ajustado hasta 9,0. [Compuestos diamínicos bifuncionales adecuados son etilendiamina, 1,4-butanodiamina, espermidina, ácido 2,4-diaminobutírico, lisina, 3,3'-diaminodipropilamina, ácido diaminopropiónico, N-(2-aminoetil)-1,3-propanodiamina, 2-(4-aminofenil)etilamina y compuestos similares]. El compuesto de diamina que se añade debe estar en un exceso de aproximadamente 5 a 10 veces en comparación con el equivalente molar de grupos aldehído libres en el carbohidrato (es decir, un aldehído libre por cadena de polímero de carbohidrato). Cianoborohidruro sódico disuelto en acetonitrilo al 50% se añade a la mezcla de reacción y la reacción se deja avanzar a 25ºC con agitación suave durante varios días. La cantidad de compuesto amínico incorporado en el polisacárido depende de las condiciones de reacción así como de la preparación de glucano. Por lo tanto, la cantidad de compuesto diamínico incorporado se determina diariamente para establecer el tiempo de reacción necesario para alcanzar el nivel requerido de incorporación de diamina. El glucano/manano aminado modificado (3), que contiene 1 mol de espaciador de diamina por cadena de polisacárido, se recupera mediante precipitación con 6 volúmenes de etanol, u otro disolvente adecuado, durante 8 horas a 4ºC. El precipitado se redisuelve en agua, se filtra y se precipita de nuevo con 5 volúmenes de etanol durante 24 horas a 4ºC. El material se disuelve en agua y se liofiliza.
Etapa 2
Compuestos cíclicos o heterocíclicos aromáticos con un grupo carbonilo formador de imina (4) y uno o más grupos hidroxilo, tales como 4-hidroxibenzaldehído, 2,4-dihidroxibenzaldehído, vainillina, etilvainillina, naringenina y otros compuestos similares se prefieren para la adición a los polisacáridos aminados. Sin embargo, también pueden usarse otros compuestos que tienen grupos carbonilo, tales como derivados de esteroides y terpenoides. Partes alícuotas pequeñas de 10 milimoles de 4-hidroxibencilaldehído (1,2 g), vainillina (1,5 g) o 5-cloro-2-hidroxibenzaldehído (1,6 g) disueltos en 10 ml de dioxano o acetona se añaden a 10 milimoles (1,6 g) de 1,1'-carbonildiimidazol (carbodiimidazol o CDI) o N,N'-carbonildiimidazol disueltos en 10 ml de dioxano o acetona anhidros. La mezcla se hace reaccionar durante 6-8 horas a temperatura ambiente con mezcladura mientras se protege de la humedad atmosférica. Los productos de reacción son un carbamato de imidazol intermedio altamente reactivo (5) que se forma con el hidroxilo de los derivados de aldehído aromáticos, más imidazol.
Etapa 3
Esta mezcla de reacción puede añadirse a los polisacáridos aminados sin aislamiento previo del carbamato de imidazol intermedio. El carbamato se acopla con los grupos amino de los polisacáridos modificados para dar conexiones de carbamato estables. (Los derivados de carbamato de imidazol pueden aislarse mediante cromatografía, extracciones diferenciales u otros procedimientos). Para minimizar las reacciones de los grupos hidroxilo de los polisacáridos con el producto intermedio de carbamato de imidazol, la reacción de acoplamiento debe tener lugar en presencia de cantidades equimolares de grupos amino y carbamato de imidazol. La cantidad de grupos amino en el polisacárido aminado se determina con ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) o se estima a partir de su contenido de C, N, H y O según se determina mediante análisis elemental. El glucano o manano aminado se suspende en un disolvente orgánico anhidro adecuado, tal como DMF, dioxano o piridina, y el pH se ajusta hasta aproximadamente 9,5-10 con trietilamina. Se añade una parte alícuota del producto intermedio de carbamato que contiene una cantidad equivalente a los grupos amino de la preparación de polisacárido y la reacción se deja avanzar durante de 12 a 18 horas a temperatura ambiente protegida de la humedad. Aproximadamente 6-8 volúmenes de etanol frío se añaden a la reacción para precipitar el conjugado de polisacárido-aldehído aromático (6), que se recoge mediante filtración. El polisacárido conjugado se redisuelve en agua y se reprecipita de nuevo con 6-8 volúmenes de etanol u otro disolvente adecuado. La eficacia de acoplamiento se determina mediante uno de los siguientes métodos: i) medir los grupos amino residuales en la preparación con TNBS, ii) determinar espectrofotométricamente la cantidad de compuesto aromático presente en la preparación, o iii) mediante estimación directa de los grupos aldehído con reactivo de Schiff o espectrofotométricamente con N-metilbenzotiazolonhidrazona (MBTH) (Paz, M.A. y otros, Archiv. Biochem. Biophys. 109:548 (1965)). El conjugado de polisacárido-aldehído aromático se disuelve en agua y se liofiliza.
También es posible crear nuevos grupos aldehído en la cadena de polisacárido mediante oxidación suave con ácido peryódico. Después de la oxidación, el polisacárido con los grupos aldehído adicionales se precipita con alcohol y se somete a aminación reductiva según se describe previamente.
B. Adición de compuestos formadores de imina a través de los grupos hidroxilo del polisacárido
Otro método para preparar glucano o manano conjugado a compuestos que soportan carbonilo es usar los grupos hidroxilo de los polisacáridos para la formación del conjugado. Este método se ilustra mediante referencia al Esquema 2. Debido al número de grupos hidroxilo por residuo de glicosilo, este método permite la preparación de conjugados con densidades superiores de grupos carbonilo. Se pueden activar los grupos hidroxilo del polisacárido y dejarlos reaccionar con la molécula que soporta carbonilo.
Esquema 2
Adición de compuestos formadores de imina a \beta-glucanos a través de grupos -OH
2
La conjugación de compuestos que soportan grupos carbonilo a los grupos hidroxilo de polisacáridos puede realizarse con carbonato de N,N'-disuccinimidilo (DSC). Los grupos hidroxilo que se activan con DSC reaccionan casi exclusivamente con aminas primarias, evitando la reticulación de las cadenas de polisacárido a través de sus grupos -OH. Los grupos hidroxilo de los \beta-1,3-glucanos se activan con DSC y subsiguientemente se hacen reaccionar con etilendiamina para introducir grupos amino en el glucano. Estos grupos amino pueden reaccionar a continuación con uno de los siguientes ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS): ácido 3- o 5-formilsalicílico, ácido 4-formilcinámico y 3- o 4-carboxibenzaldehído, para formar un conjugado de aldehído aromático-glucano. El escleroglucano (7), un \beta-1,3-glucano con ramificaciones de D-glucosa conectadas \beta-1,6 simples en cada tercera unidad de glucosa y con un peso molecular de aproximadamente 130.000, se disuelve en agua (solución al 2-5%) y se liofiliza para dar un producto pulverulento fácilmente suspendido en disolventes orgánicos. Dos g del escleroglucano liofilizado (12 milimoles de residuos de glucosilo) se suspenden en 40 ml de DMF que contienen 0,8 g de DSC (3 milimoles). A esta suspensión se añadieron en una hora 20 ml de piridina seca que contenían 0,75 ml de trietilamina anhidra (5,5 milimoles) y se dejaron reaccionar durante 4 horas adicionales a temperatura ambiente. Se añade un volumen de acetona a esta reacción y el succinimidilcarbonato de escleroglucano activado (8) se recoge y se enjuaga mediante filtración. El escleroglucano activado, disuelto o suspendido en 20 ml de agua, se añade lentamente con agitación a 100 ml de bicarbonato potásico 0,2 M que contiene 2 ml de etilendiamina (30 milimoles o un exceso de 10 veces sobre los grupos -OH activados de los polisacáridos máximos) y se ajusta hasta pH 8,5. Después de 4 horas a temperatura ambiente, la reacción se concentra y se dializa frente a agua para retirar el exceso de reaccionantes del derivado de escleroglucano aminado (9) y se liofiliza. El polisacárido aminado se hace reaccionar a continuación con éster de ácido succinimidil-3-
formilsalicílico.
El éster de ácido succinimidil-3-formilsalicílico se prepara como sigue: a 0,49 g de ácido 3-formilsalicílico (3 milimoles) y 0,42 g de NHS (3,5 milimoles) disueltos en 10-15 ml de DMF, se añaden 1,28 g de CMC o p-toluenosulfonato de 1-ciclohexil-3-(2-morfolinoetil)carbodiimida (3 milimoles) y se dejan reaccionar durante 5 horas a temperatura ambiente protegidos de la humedad. A esta mezcla de reacción se añaden 2,1 ml de 2-mercaptoetanol (30 milimoles) para extinguir la CMC sin reaccionar, se mezclan y se hacen reaccionar durante 10 minutos a temperatura ambiente y se usa inmediatamente el éster de ácido succinimidil-3-formilsalicílico (10). (El ácido 3-formilsalicílico puede reemplazarse por una cantidad equimolar de ácido 5-formilsalicílico, ácido 4-formilfenoxiacético o 3-carboxibenzalde-
hído).
Al escleroglucano aminado (aproximadamente 2 g) disuelto en 25 ml de 0,1 M de tampón de MOBS (ácido 4-[N-morfolino]butanosulfóncio), pH 7,6, se añadió con agitación la DMF que contenía el éster de ácido succinimidil-3-formilsalicílico y el mercaptoetanol y se dejaron reaccionar con agitación a temperatura ambiente durante 4-6 horas. El derivado de ácido 3-formilsalicílico-escleroglucano (11) se precipita con 6-8 volúmenes de etanol y se recoge y se lava con etanol para retirar el exceso de reaccionantes. El derivado de escleroglucano precipitado se disuelve en 50 ml de agua, se dializa frente a agua y se liofiliza. El contenido de ácido 3-formilsalicílico del derivado de escleroglucano puede determinarse a partir de su composición elemental de H, C, N y O. El contenido de residuos de aldehído aromático en el derivado de escleroglucano también puede determinarse espectrofotométricamente como sigue: disuélvanse 5-8 mg del derivado de escleroglucano en 4 ml de KOH 0,05 M y léanse los espectros UV entre 220 y 320 nm usando como un blanco una solución de igual concentración de escleroglucano no modificado en KOH 0,05 M. Calcúlese el ácido 3-formilsalicílico incorporado usando el coeficiente de extinción de este compuesto determinado en KOH 0,05 M. El contenido de aldehído también puede determinarse colorimétricamente con reactivo de Schiff o espectrofotométricamente con MBTH.
La conjugación de compuestos que soportan tanto grupos carbonilo como hidroxilo a polisacáridos, tales como mananos, puede llevarse a cabo activando los grupos hidroxilo del polisacárido con cloruro de p-toluenosulfonilo (tosilo) (Nilsson, K. y otros, Acta Chem. Scan. 35:19 (1981); Nilsson, K. y otros, Methods Enzymol. 104:56-69 (1984)). Véase el Esquema 3-a.
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Esquema 3-a
Adición de compuestos formadores de imina a manano
3
Debido a que varios de los grupos hidroxilo primarios en el manano de S. cerevisiae están fosforilados o conectados a fosfoésteres, y no están disponibles para la tosilación, es necesario retirar el fosfato mediante hidrólisis alcalina bajo condiciones reductoras. Manano de levadura del pan, 4-5 g, se disuelve en 200 ml de KOH 1,5 M que contiene hidróxido sódico al 1% y se somete a reflujo a 100ºC durante 2 horas con agitación constante. Después de 2 horas a 100ºC, enfríese la solución hasta aproximadamente 50ºC y neutralícese con aproximadamente 18 ml de ácido acético. La solución de manano neutralizada se añade con agitación a 1,5 litros de etanol refrigerado y la mezcla se deja reposar durante 4 horas para precipitar el manano. El manano precipitado se recoge mediante filtración, se disuelve en agua, se dializa frente a agua para retirar las sales y se liofiliza.
Un g de manano (12) (\sim6 milimoles de manosa) liofilizado, secado mediante suspensión en piridina y el azeótropo retirado, se resuspende en 15 ml de DMF y se mezcla con 2,5 g de cloruro de tosilo (2,15 milimoles) disueltos en 5 ml de DMF. A esta mezcla se añaden 5 ml de piridina y se hacen reaccionar con agitación durante 18 horas a temperatura ambiente, para dar un manano tosilado (13) que tiene un grupo tosilo para cada 20-25 residuos de manosilo. El grado de tosilación se determina en una muestra del manano activado que se ha precipitado y lavado con alcohol como sigue. Disuélvanse 8 mg del manano precipitado en 4 ml de KOH 0,1 N y mídanse sus espectros de absorción UV (de 220 a 360 nm) frente a un blanco de manano no modificado (8 mg en 4 ml de KOH 0,1 N). Determínese el contenido de grupos tosilo usando un coeficiente de extinción para el tosilo de 480 M^{-1}cm^{-1} a 261 nm. A la preparación de manano tosilado (13) (\sim0,9 g) resuspendida en 20 ml de bicarbonato K 0,5 M añádanse 2 g de HCl de 2-cisteamina (18 milimoles) y ajústese el pH con KOH 1 N hasta 9,5-10. Déjese la reacción durante 24 horas a 40ºC con agitación y bajo una atmósfera de nitrógeno para introducir aproximadamente un residuo de cisteamina por -OH tosilado. Dialícense las reacciones frente a agua para retirar el exceso de reaccionantes y sales y liofilícese el derivado de manano-cisteamina (14). La cantidad de cisteamina unida al manano tosilado puede determinarse a partir de la composición elemental de H, C, S, O y N del derivado. La incorporación de cisteamina también puede estimarse mezclando 10 ml de tampón de carbonato K 0,05 M, pH 9,5, que contiene 2 mg del manano aminado con 1 ml de un TNBS acuoso (7,2 mg/ml) y haciendo reaccionar durante 2 horas a 40ºC. Mídase la absorbancia a 363 nm frente a un blanco de tampón más TNBS y determínese el -NH_{2} incorporado usando un coeficiente de extinción molar de 11.000 M^{-1}cm^{-1}.
Esquema 3-b
Adición de compuestos formadores de imina a manano
4
El Esquema 3-b ilustra la ligazón de un compuesto formador de imina a mananocisteamina. Suspéndase la mananocisteamina liofilizada (0,8-0,9 g) en 20 ml de piridina, retírese el azeótropo bajo presión reducida para eliminar agua y resuspéndase el residuo de mananocisteamina (14) en 40 ml de piridina:tetrahidrofurano (10:1). Añádanse a esta suspensión 0,37 g de DCC (diciclohexilcarbodiimida) (1,8 milimoles), 0,3 g de p-carboxibenzaldehído y 0,21 g de NHS (1,8 milimoles) para formar in situ el producto intermedio de éster p-carboxibenzaldehídico de NHS (10). Déjese avanzar la reacción durante 24 horas con agitación a temperatura ambiente. Deténgase la reacción añadiendo 100 ml de agua a la mezcla para acelerar la formación de DCU. Después de 30 minutos, añádanse 400 ml adicionales de agua para disolver el derivado de p-carboxibenzaldehído-manano (15). Después de 6 horas de agitación a temperatura ambiente, déjese que la diciclohexilurea (DCU) se sedimente durante la noche y retírese mediante decantación. Fíltrese el sobrenadante, concéntrese bajo presión reducida, dialícese frente a agua y liofilícese el derivado de p-carboxibenzaldehído-manano (15). El aldehído aromático incorporado al manano puede determinarse espectrofotométricamente como sigue. Disuélvanse 5-8 mg del derivado de manano en 4 ml de KOH 0,05 M y léanse los espectros UV entre 220 y 320 nm usando como un blanco una solución de igual concentración de manano no modificado en KOH 0,05 M. Para calcular la concentración de p-carboxibenzaldehído, úsese su coeficiente de extinción determinado en KOH 0,05 M. El contenido de aldehído también puede determinarse colorimétricamente con un reactivo de Schiff o espectrofotométricamente con MBTH.
C. Adición de compuestos formadores de imina a grupos carboxi de polisacáridos pécticos
Grupos carboxílicos de poliscáridos pécticos (homogalacturonanos, ramnogalacturonanos, arabinogalactanos, arabanos o galactanos), tales como ácido galacturónico, glucurónico, acético, Kdo o 3-desoxi-D-mano-octulosónico y otros ácidos, son grupos reactivos que pueden usarse para acoplar las pectinas a compuestos que soportan carbonilo (formadores de imina). Los grupos carboxílicos pueden acoplarse específicamente a aminas usando diciclohexilcarbodiimida (DC) y N-hidroxisuccinimida (NHS). Véase el Esquema 4.
Esquema 4
Adición de compuestos formadores de imina a polisacáridos pécticos
5
Esta reacción puede llevarse a cabo en disolventes orgánicos tales como dioxano, DMF, piridina, acetonitrilo o mezclas de los mismos. La reacción de acoplamiento también puede llevarse a cabo en medios acuosos o semiacuosos usando una de las carbodiimidas solubles en agua tales como 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) o CMC, junto con N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS) o NHS. El número de grupos amino por residuo de glicosilo puede seleccionarse mediante el uso de una cantidad limitativa de CMC en presencia de un exceso de ligando diamínico. Este sistema se ilustra en el Esquema 4. En un ejemplo, a 2,0-2,2 g de pectinato Na^{+} con bajo contenido de metoxilo (< 11 milimoles de ácido galacturónico) disuelto en 50 ml de agua caliente se añaden 15 ml de resina de ácido poliestirenosulfónico intercambiadora catiónica fuerte sedimentada en forma H^{+} (Dowex, 50-X8) y se agitan durante 2 horas. La suspensión se filtra para retirar la resina y la resina se lava con 20 ml de agua templada. La solución de pectina (forma H^{+}) (16) se reduce en volumen mediante liofilización parcial, evaporación giratoria a baja presión u ósmosis inversa, hasta aproximadamente 40 ml. A la solución de pectina (forma H^{+}) se añade piridina para llevar el pH hasta \sim7,6. A esta solución se añaden con agitación 1 g de CMC (2,35 milimoles) y 0,41 g de NHS (3,4 milimoles) disueltos en 10 ml de piridina y 2 ml de etilendiamina (30 milimoles) y la mezcla se deja reaccionar durante la noche a temperatura ambiente con agitación constante. La separación del polisacárido aminado (17) de los otros reaccionantes se efectúa precipitándolo con 6-8 volúmenes de etanol. La pectina aminada precipitada lavada con etanol se disuelve en agua, se dializa y se liofiliza para dar un producto pulverulento fácilmente disuelto en agua, y su contenido de grupos amino se determina con TNBS. La pectina aminada se hace reaccionar a continuación con éster de ácido succinimidil-3-formilsalicílico preparado como sigue. A 0,49 g de ácido 3-formilsalicílico (3 milimoles) y 0,42 g de NHS (3,5 milimoles) disueltos en 10-15 ml de DMF se añaden 1,28 g de CMC (3 milimoles) y se dejan reaccionar durante 5 horas a temperatura ambiente protegidos de la humedad. A esta mezcla de reacción se añaden 2,1 ml de 2-mercaptoetanol (30 milimoles) para extinguir la CMC sin reaccionar, y, después de 10 minutos a temperatura ambiente, el éster de ácido succinimidil-3-formilsalicílico (10) formado se usa inmediatamente. (El ácido 3-formilsalicílico puede reemplazarse por una cantidad equimolar de 3-carboxibenzaldehído, ácido 4-formilfenoxiacético o ácido 4,5-dioxoheptanoico).
A 2 g de la pectina aminada, disueltos en 30 ml de tampón de MOBS (ácido 4-[N-morfolino]butanosulfónico) 0,1 M, pH 7,6, se añade la mezcla de reacción en DMF que contiene el éster de ácido succinimidil-3-formilsalicílico y el mercaptoetanol y se dejan reaccionar con agitación a temperatura ambiente durante 6 horas. El derivado de ácido 3-formilsalicílico-pectina (18) se precipita con 6-8 volúmenes de etanol y a continuación se recoge y se lava con etanol para retirar el exceso de reaccionante. El derivado de pectina precipitado se disuelve en un volumen mínimo de agua, se dializa frente a agua y se liofiliza. La pectina aminada también puede hacerse reaccionar con un producto intermedio de carbonato de succinimidilo de compuesto hidroxilado que contiene carbonilo, tal como 4-hidroxifenilacetaldehído, 6-hidroxi-2-naftoquinona, 4-hidroxibenzaldehído, 2,4-dihidroxibenzaldehído, formildienolona, progesterona, androsterona, prednisolona o piridoxal. Después de mezclar la reacción con 6 volúmenes de etanol, el derivado de polisacárido péctico que contiene aldehído se retira a continuación mediante filtración, se disuelve en agua, se dializa frente a agua y se liofiliza.
Alternativamente, la pectina aminada (17) puede hacerse reaccionar con un compuesto que contiene un grupo aldehído tanto libre como uno protegido, como monodietilacetal de tereftaldehído. La pectina aminada se hace reaccionar en primer lugar con el grupo aldehído libre para formar un enlace estable, y subsiguientemente el aldehído protegido se retira mediante hidrólisis ácida suave, según se describe aquí. A 2 g de pectina aminada suspendida en 30 ml de tetrahidrofurano acuoso u otro disolvente adecuado se añaden 0,43 g de monodietilacetal de tereftaldehído (2 milimoles), 0,18 g de cianoborohidruro sódico (3 milimoles) y se dejan reaccionar durante la noche con agitación a 40ºC para dar el derivado de monodietilacetal de tereftaldehído de pectina (19). El derivado de pectina se precipita con 6 volúmenes de etanol, se recoge y se lava mediante filtración con más etanol. El derivado de pectina de monodietilacetal de tereftaldehído se disuelve en un volumen mínimo de HCl 0,05 M y se calienta a 100ºC durante 15-20 minutos para convertir el acetal en la forma aldehídica. Después de la hidrólisis la solución de derivado de pectina fenilacetaldehídico (20) se lleva hasta la neutralidad con NaOH dializado frente a agua y se liofiliza. El contenido de aldehído aromático de los derivados de pectina se determina espectrofotométricamente como sigue: disuélvanse 5-8 mg de la pectina conjugada y 3 ml de NaOH 0,05 N y explórense los espectros UV entre 220 y 320 nm frente a una solución de blanco que contiene la misma cantidad de pectina no modificada. La concentración de aldehído aromático del derivado de pectina se calcula usando el coeficiente de extinción del aldehído aromático libre según se determina en NaOH 0,05 M. El contenido de aldehído también puede determinarse espectrofométricamente con MBTH o colorimétricamente con reactivo de Schiff.
Alternativamente, la introducción de grupos que contienen carbonilo en polisacáridos pécticos puede llevarse a cabo en disolventes orgánicos. En un ejemplo, CMC, NHS y un exceso de 10 veces de una diamina con respecto a la CMC se añaden a pectina liofilizada anhidra (forma H^{+}) suspendida en DMF-piridina (6:4, v/v) y la mezcla se deja reaccionar con agitación a temperatura ambiente durante la noche. El número de grupos amina por residuo de glicosilo puede seleccionarse usando una cantidad limitativa de CMC en presencia de un exceso de ligando diamínico. La separación del polisacárido aminado de los otros reaccionantes se efectúa precipitándolo con 6-8 volúmenes de etanol. La pectina aminada precipitada lavada con etanol se disuelve en agua y se liofiliza para dar un producto pulverulento fácil de resuspender en DMF-piridina. La pectina aminada se hace reaccionar en DMF-piridina con (i) un éster succinimidílico de un compuesto que contiene carbonilo carboxilado, tal como ácido 4,5-dioxoheptanoico, ácido 3- o 5-formilsalicílico, ácido 4-formilcinámico o 3- o 4-carboxibenzaldehído, o (ii) los productos intermedios de carbonato de succinimidilo de un compuesto hidroxilado que contiene carbonilo, tal como 2,4-dihidroxibenzaldehído, 4-hidroxibenzaldehído, 4-hidroxifenilacetaldehído, 4'-hidroxiacetofenona, 6-hidroxi-2-naftoquinona, formildienolona, progesterona, androsterona, prednisolona, piridoxal. El derivado de polisacárido péctico que contiene aldehído se recupera a continuación mediante filtración después de mezclar la reacción con 6 volúmenes de etanol, se disuelve en agua, se dializa frente a agua y se liofiliza.
D. Adición de compuestos formadores de imina a grupos amino de derivados de quitina
La insolubilidad de la quitina en la mayoría de los disolventes impide la adición de compuestos formadores de imina a ella. Sin embargo, la introducción de grupos que soportan carbonilo en el quitosano soluble en agua da geles insolubles en agua, que presumiblemente son el resultado de reticulación mediante bases de Schiff entre los grupos amino de la glucosamina y los grupos carbonilo de diferentes cadenas de polisacárido. Estos obstáculos se evitan mediante el uso de derivados de quitina solubles en agua en los que aproximadamente 85% de los grupos amina están acetilados en N, tales como glicolquitina (6-o-hidroxipropilquitina o 6-o-hidroxietilquitina) en la que los hidroxilos primarios de la glucosamina están hidroxietilados. El Esquema 5 ilustra este procedimiento.
Esquema 5
Adición de compuestos formadores de imina a glicolquitina
6
En una modalidad, se prepara glicolquitina como sigue. A 5 g de quitina (22) finamente triturada (iguales a 21,25 milimoles de N-acetilglucosamina y 3,75 milimoles de glucosamina) suspendidos en 30 ml de NaOH al 42% durante 2 horas a temperatura ambiente se añaden con agitación 70 ml de una mezcla de hielo-agua para dar una dispersión altamente viscosa de quitina alcalina. A esta dispersión, se añaden 5 g de óxido de butileno (114 milimoles) burbujeando en la solución mientras se agita durante 1-2 horas a 30-35ºC. La glicolquitina (23) se precipita a continuación con 6 volúmenes de etanol al 80%, se lava sobre papel de filtro de vidrio con etanol al 80%, se disuelve en agua, se dializa frente a agua, se liofiliza y a continuación el contenido de grupos amina libre se determina colorimétricamente con TNBS. A 1,7-2 g de glicolquitina liofilizada (aproximadamente 1,5 milimoles de glucosamina) disueltos/suspendidos en 40 ml de agua se añaden 40 ml de piridina que contienen 1,60 g de monodietilacetal de tereftaldehído (7,5 milimoles), 0,4 g de cianoborohidruro sódico (6 milimoles) y se deja reaccionar durante 4 horas a temperatura ambiente. Precipítese el derivado de monodietilacetal de tereftaldehído de glicolquitina (24) con 4-6 volúmenes de etanol, resuspéndase el precipitado y lávese con etanol al 80% para retirar cualquier exceso de reaccionantes. Disuélvase el derivado de glicolquitina (24) en 40-50 ml de HCl 0,05 M y caliéntese a 100ºC durante 20-30 minutos para liberar los grupos aldehído para dar el derivado benzaldehídico de glicolquitina (25). El contenido de benzaldehído del derivado de glicolquitina se determina espectrofotométricamente como sigue: Disuélvanse 5-8 mg del derivado de glicolquitina en 4 ml de KOH 0,05 M y léanse los espectros UV entre 220 y 320 nm usando como blanco una solución de igual concentración de glicolquitina en KOH 0,05 M. Calcúlese el benzaldehído incorporado usando el coeficiente de extinción para este compuesto determinado en KOH 0,05 M. El contenido de aldehído también puede determinarse espectrofotométricamente con MBTH o colorimétricamente con reactivo de Schiff.
En otra modalidad descrita en el Esquema 6, glicolquitina (23), formada como se describe previamente, se hace reaccionar con éster de ácido succinimidil-5-formilsalicílico (10), que se prepara como sigue. A 0,5 g de ácido 3-formilsalicílico (3 milimoles) y 0,42 g de NHS (3,5 milimoles) disueltos en 10-15 ml de DMF añádanse 1,28 g de CMC (3 milimoles) y déjense reaccionar a temperatura ambiente durante 5-6 horas protegidos de la humedad. A esta mezcla de reacción añádanse 2,1 ml de p-mercaptoetanol (30 milimoles) para extinguir la CMC sin reaccionar, mézclense y déjense reaccionar durante 10 minutos a temperatura ambiente y úsese el éster de ácido succinimidil-5-formilsalicílico inmediatamente. El ácido 5-formilsalicílico puede reemplazarse por una cantidad equimolar de otro compuesto carboxilado que contiene carbonilo, tal como ácido 4,5-dioxoheptanoico, ácido 4-formilcinámico, 3-carboxibenzaldehído o ácido 4-formilfenoxiacético). A la glicolquitina (1,7-2 g) disuelta en 40 ml de tampón de MOBS 0,1M, pH 7,6, añádanse con agitación la DMF que contiene el éster de ácido succinimidil-5-formilsalicílico y el mercatpoetanol y déjense reaccionar con agitación a temperatura ambiente durante 4-6 horas. El derivado de ácido 3-formilsalicílico de glicolquitina (26) se precipita con 6 volúmenes de etanol y se lava con etanol al 80% para retirar reaccionantes en exceso. El derivado de glicolquitina precipitado se disuelve en 50-60 ml de agua, se dializa frente a agua y se liofiliza. El contenido de ácido 3-formilsalicílico del derivado de glicolquitina se determina espectrofotométricamente como sigue: disuélvanse 5-8 mg del derivado de glicolquitina y 4 ml de KOH 0,05 M y léanse los espectros UV entre 220 y 320 nm usando como un blanco una solución de igual concentración de glicolquitina no modificada en KOH 0,05 M. Calcúlese el 3-formilsalicilato incorporado usando el coeficiente de extinción para este compuesto según se determina en KOH 0,05 M. El contenido de aldehído también puede determinarse colorimétricamente con reactivo de Schiff o espectrofotométricamente con MBTH.
Esquema 6
Adición de compuestos formadores de imina a glicolquitina
7 
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Además de los procedimientos descritos aquí, otros métodos, tales como el uso de éteres glicidílicos, halógenos activados y otros, pueden usarse para conjugar compuestos que contienen carbonilo a los residuos de glicosilo de polisacáridos. Véanse, por ejemplo, Maron y otros, Biochim. Biophys. Acta 278:243 (1972) y Erlanger y otros, J. Biol. Chem. 228:713 (1957).
Otros compuestos que contienen carbohidrato útiles que son reconocidos por receptores superficiales de APCs incluyen quitinas y dextranos que son de origen animal y bacteriano, respectivamente. Ejemplos de compuestos que contienen carbohidrato adecuados son ácidos teicoicos bacterianos y sus derivados, lipopolisacáridos bacterianos, lípido A, y sus derivados.
Se contempla que la conjugación de compuestos que soportan grupos carbonilo formadores de imina a productos que contienen carbohidrato no adyuvantes es útil para proporcionar capacidad adyuvante intrínseca a estos productos y para incrementar la eficacia de inmunizaciones preventivas. Ejemplos de estos productos son polisacáridos de estreptococos, estafilococos y otras bacterias que se usan como antígenos vacunales.
Composiciones Farmacéuticas y Veterinarias y Métodos de Uso
En un aspecto adicional, un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de Fórmula I o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, puede usarse para el tratamiento de enfermedades en las que existe un defecto en el sistema inmunitario y/o un mecanismo de defensa del huésped ineficaz, o para mejorar la actividad del sistema inmunitario por encima de niveles normales.
Un compuesto de la invención o una sal fisiológicamente aceptable del mismo puede administrarse para el tratamiento o la profilaxis de mamíferos inmunodeficientes solo o en combinación con otros agentes terapéuticos, por ejemplo, con otros agentes antivirales o con otros agentes anticancerígenos.
Un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de Fórmula I y sales fisiológicamente aceptables del mismo, puede administrarse para el tratamiento o la profilaxis de mamíferos inmunodeficientes solo o en combinación con otros agentes terapéuticos, por ejemplo con otros agentes antivirales o con otros agentes anticancerígenos.
Adyuvantes inmunitarios son compuestos que, cuando se administran a un individuo o se prueban in vitro, incrementan la respuesta inmunitaria a un antígeno en un sujeto o en un sistema de prueba al que se administra el antígeno.
Por una "cantidad eficaz" se entiende una cantidad de un conjugado de la presente invención que restaurará la función inmunitaria hasta niveles substancialmente normales o incrementará la función inmunitaria por encima de niveles normales para eliminar una infección.
Por potenciación de una respuesta inmunitaria se entiende la restauración de una función inmunitaria deprimida, la mejora de una mejora inmunitaria normal, o ambas. La función inmunitaria se define como el desarrollo y la expresión de inmunidad humoral (mediada por anticuerpos), inmunidad celular (mediada por células T) o resistencia mediada por macrófagos y granulocitos.
En esta memoria descriptiva, el término "paciente inmunodeficiente" se emplea para describir pacientes con un sistema inmunitario deficiente o defectuoso. Un paciente inmunodeficiente puede caracterizarse por medio de un ensayo de proliferación de linfocitos T. Usando este ensayo, los pacientes inmunodeficientes se caracterizan por una capacidad reducida de las células T para responder a la estimulación por mitógenos. Un ejemplo de un mitógeno usado comúnmente en este ensayo es la fitohemaglutinina (PHA).
Se cree que la inmunodeficiencia y la inmunosupresión se producen en muchas situaciones clínicas en las que existen lesiones en la señalización a linfocitos, particularmente células T que organizan la respuesta inmunitaria. Las células T requieren dos señales para iniciar una respuesta inmunitaria eficaz:
(i) ocupación del receptor de células T específico para el antígeno, y
(ii) estimulación a través de receptores coestimulantes.
En ausencia de la señal (ii), las células T no responden y muchas pueden paralizarse crónicamente o volverse anérgicas. Las infecciones virales y bacterianas persistentes y la enfermedad neoplástica pueden producir hiposensibilidad de células T interfiriendo de diversos modos con el aporte de señales secundarias y de este modo evadir la respuesta inmunitaria. Los conjugados de la presente invención parecen funcionar substituyendo o compensando de otro modo las señales coestimulantes deficientes para células T.
Estudios recientes (Rhodes, J., Immunology Today 17:436 (1996)) han mostrado que los compuestos formadores de bases de Schiff exógenos pueden substituir a los donantes naturales de grupos carbonilo y proporcionar una señal coestimulante para células cooperadoras T CD4 (Th). En un estudio relacionado (Zheng, B. y otros, Science, 256:1560 (1992)), el tratamiento de APCs con galactosa oxidasa para formar nuevos grupos aldehído daba como resultado un efecto adyuvante cuando se administraba con un antígeno a ratones.
Estos hallazgos subrayan el papel de compuestos formadores de bases de Schiff como estimulantes del sistema inmunitario. Durante la interacción entre una APC y una célula Th, existe una formación transitoria de una base de Schiff entre grupos carbonilo de APC especializadas y los grupos amino de células Th situados en receptores de la superficie celular todavía no definidos. Consecuencias de la formación de bases de Schiff son: el desvío del sistema inmunitario hacia una respuesta tipo Thl con un incremento en la producción de IL-2 e IFN-\gamma en células Th, y la mejora de la respuesta de CTL. Los compuestos formadores de bases de Schiff parecen funcionar desviando la ruta coestimulante que implica el receptor de CD-28 sobre células Th y el receptor de B7-1 presente sobre APCs.
Existe una variedad de circunstancias en las que el sistema inmunitario puede ser defectuoso o deficiente. Por ejemplo, la deficiencia del sistema inmunitario es común en niños inmaduros o prematuros (neonatos). También puede resultar de la suspensión por ciertos fármacos que pueden aportarse, por ejemplo, como un efecto secundario de la quimioterapia para el cáncer. El crecimiento desordenado de una o más partes constituyentes del sistema inmunitario, por ejemplo como en ciertas formas de cáncer, también puede dar como resultado inmunodeficiencia. La inmunodeficiencia también puede estar provocada por infecciones virales, incluyendo el virus de inmunodeficiencia humana (HIV).
Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un método para tratar pacientes inmunodeficientes, que comprende administrar a un mamífero una cantidad eficaz de un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de Fórmula I, o una sal fisiológicamente aceptable del mismo.
Un aspecto adicional de la presente invención proporciona el uso de un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de Fórmula I o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones virales agudas y crónicas.
Ejemplos de virus agudos contra los que puede usarse terapia inmunopotenciadora con un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de Fórmula I o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, preferiblemente junto con un agente antiviral, son:
herpesvirus, influenzavirus, parainfluenzavirus, adenovirus, coxsakievirus, picornavirus, rotavirus, virus de la hepatitis A, virus de la parotitis, virus de la rubéola, virus del sarampión, poxvirus, virus sincitiales respiratorios, papilomavirus y enterovirus, arenavirus, rinovirus, poliovirus, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la rabia y arbovirus.
Ejemplos de infecciones virales crónicas contra las que puede usarse terapia inmunopotenciadora con conjugados de la presente invención son infecciones por herpesvirus persistentes, infección por virus de Epstein Barr, infecciones por rubéola persistentes, infecciones por papilomavirus, infecciones por virus de la hepatitis e infecciones por virus de inmunodeficiencia humana.
Los conjugados de la invención pueden emplearse solos o en combinación con otros agentes terapéuticos para el tratamiento de las infecciones o condiciones previas. Terapias de combinación de acuerdo con la presente invención comprenden la administración de al menos un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de la Fórmula I o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, y al menos otro ingrediente farmacéuticamente activo. El ingrediente o los ingredientes farmacéuticamente activos y los compuestos de la presente invención pueden administrarse juntos o separadamente y, cuando se administran separadamente, esto puede producirse simultáneamente o secuencialmente en cualquier orden. Las cantidades del ingrediente o los ingredientes farmacéuticamente activos y los compuestos de la presente invención y las cronologías de administración relativas se seleccionarán para alcanzar el efecto terapéutico combinado deseado. Preferiblemente, la terapia de combinación implica la administración de un compuesto de la presente invención y uno de los agentes mencionados aquí más adelante.
Ejemplos de tales agentes terapéuticos adicionales incluyen agentes que son eficaces para el tratamiento de infecciones por HIV o condiciones asociadas tales como 3'-azido-3'-desoxitimidina (zidovudina), otros 2',3'-didesoxinucleósidos tales como 2',3'-didesoxicitidina, 2',3'-didesoxiadenosina y 2',3'-didesoxiinosina, carbovir, nucleósidos acíclicos (por ejemplo, aciclovir), 2',3'-dideshidrotimidina, inhibidores de proteasas tales como N-terc-butil-decahidro-2-[-2(R)-hidroxi-4-fenil-3(S)-[[N-2-quinolilcarbonil)-L-asparginil]butil]-(4aS,8aS)-isoquinolin-3(S)-carboxami-
da (Ro31-8959), análogos nucleosídicos de oxatiolano tales como cis-1-(2-hidroximetil)-1,3-oxatiolan-5-il)-citosina o cis-1-(2-hidroximetil)-1,3-oxatiolan-5-il)-5-fluorocitosina, 3'-desoxi-3'-fluorotimidina, 2',3'-didesoxi-5-etinil-3'-fluorouridina, 5-cloro-2',3'-didesoxi-3'-fluorouridina, Ribavirin, 9-[4-hidroxi-2-(hidroximetil)but-1-il]guanina (H2G), inhibidores de TAT, tales como 7-cloro-5-(2-pirril)-3H-1,4-benzodiazepin-2(H)-ona (Ro5-3335) o 7-cloro-1,3-dihidro-5-(1H-pirrol-2-il)-3H-1,4-benzodiazepin-2-amina (Ro24-7429), interferones tales como \alpha-interferón, inhibidores de la excreción renal tales como probenecid, inhibidores del transporte de nucleósidos tales como dipiridamol; pentoxifilina, N-acetilcisteína, Precession, \alpha-tricosantina, ácido fosfonofórmico, así como inmunomoduladores tales como interleuquina II, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, eritropoyetina, CD4 soluble y derivados manipulados por ingeniería genética del mismo. Ejemplos de tales agentes terapéuticos adicionales que son eficaces para el tratamiento de infecciones por HBV incluyen carbovir, análogos nucleotídicos de oxatiolano tales como cis-1-(2-hidroximetil)-1,3-oxatiolan-5-il)citosina o cis-1-(2-(hidroximetil)-1,3-oxatiolan-5-il)-5-fluorocitosina, 2',3'-didesoxi-5-etinil-3'-fluorouridina, 5-cloro-2',3'-didesoxi-3'-fluorouridina, 1-(\beta-D-arabinofuranosil)-5-propiniluracilo, aciclovir e interferones, tales como \alpha-inteferón.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de Fórmula I o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones por Pneumocystis carinii en mamíferos.
En un aspecto adicional más la presente invención proporciona el uso de un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de Fórmula I o una sal fisiológicamente aceptable del mismos, para tratar condiciones resultantes de deficiencias relativas de células T, tales como síndrome de DiGeorge, infecciones fúngicas, infecciones por micoplasmas, tuberculosis, lepra y lupus eritematoso sistémico.
En otro aspecto de la presente invención se proporciona el uso de un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de Fórmula I o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis del cáncer en mamíferos.
Ejemplos de formas de cánceres particularmente adecuadas para el tratamiento con compuestos de la presente invención son: melanoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de la cabeza y el cuello, cáncer gástrico, cáncer renal, cáncer laríngeo, cáncer rectal y linfoma no de Hodgkins. Los cánceres que expresan antígenos específicos de tumores o antígenos raramente expresados o expresados en densidad muy baja sobre células normales son asimismo objetivos terapéuticos. Los cánceres que contienen células T citotóxicas específicas de tumores que son anérgicas o de otro modo ineficaces son asimismo objetivos para la terapia. Los tumores quirúrgicamente extirpados en los que existe un alto riesgo de recurrencia también son adecuados para la terapia con compuestos de la presente invención.
Un aspecto adicional de la presente invención proporciona el uso, como un adyuvante de vacuna, de un conjugado de la presente invención, por ejemplo un compuesto de Fórmula I o una sal fisiológicamente aceptable del mismo. Por lo tanto, puede prepararse una vacuna formulando un componente antigénico con un conjugado de la presente invención.
Los compuestos de la presente invención pueden administrarse a un receptor humano mediante una ruta seleccionada de oral, parenteral (incluyendo subcutánea), intradérmica, intramuscular e intravenosa), rectal e inhalación. El tamaño de una dosis eficaz de un compuesto dependerá de un número de factores incluyendo la identidad del receptor, el tipo de inmunopotenciación implicado, la gravedad de la condición que ha de tratarse y la ruta de administración, y finalmente estará a discreción del médico asistente.
La dosis eficaz estará generalmente en el intervalo de 0,03 a 250 mg por individuo, y lo más preferiblemente entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 100 mg por dosis. Los estimulantes inmunitarios se administran preferiblemente solo una vez o dos veces a la semana y, en algunos casos, menos frecuentemente. La frecuencia y la duración del tratamiento varían entre especies e individuos.
Aunque es posible que los compuestos de la presente invención se administren como el compuesto químico en bruto, es preferible presentarlos como una preparación de formulación farmacéutica. Las formulaciones de la presente invención comprenden un compuesto de la presente invención junto con uno o más portadores aceptables para el mismo y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. El portador o los portadores deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor de la misma.
Adyuvantes inmunitarios con compuestos que, cuando se administran a un individuo o se prueban in vitro, incrementan la respuesta inmunitaria a un antígeno en un sujeto o en un sistema de prueba al que se administra el antígeno. Algunos antígenos son débilmente inmunogénicos cuando se administran solos o son tóxicos para un sujeto a concentraciones que provocan respuestas inmunitarias útiles en un sujeto. Un adyuvante inmunitario puede mejorar la respuesta inmunitaria del sujeto al antígeno haciendo al antígeno más fuertemente inmunogénico. El efecto adyuvante también puede dar como resultado la capacidad para administrar una dosis inferior de antígeno para alcanzar una respuesta inmunitaria útil en un sujeto.
La actividad inductora de inmunógenos de los compuestos y las composiciones de la presente invención puede determinarse mediante un número de métodos conocidos. El incremento en la concentración de anticuerpo contra un antígeno particular al administrar una composición de la presente invención puede usarse para medir la actividad inmunogénica. (Dalsgaard, K. Acta Veterinia Scandinavica 69:1-40 (1978)). Un método requiere inyectar ratones CD-1 intradérmicamente con una composición de prueba que incluye uno o más antígenos exógenos. Los sueros se recogen de los ratones dos semanas más tarde y se prueban mediante ELISA con respecto al anticuerpo antiinmunogénico.
Las composiciones de la invención son útiles como vacunas para inducir inmunidad activa hacia antígenos en sujetos. Cualquier animal que pueda experimentar los efectos beneficiosos de las composiciones de la presente invención entra dentro del alcance de sujetos que pueden tratarse. Los sujetos son preferiblemente mamíferos y más preferiblemente seres humanos.
Los conjugados de la presente invención pueden emplearse como un solo adyuvante o, alternativamente, pueden administrarse junto con otros adyuvantes. Tales adyuvantes útiles con la presente invención incluyen adyuvantes oleosos (por ejemplo, completo e incompleto de Freund), saponinas, saponinas modificadas, liposomas, sales minerales (por ejemplo, AlK(SO_{4})_{2}, AlNa(SO_{4})_{2}, AlNH_{4}(SO_{4}), sílice, alumbre, Al(OH)_{3}, Ca_{3}(PO_{4})_{2}, caolín y carbono), polinucleótidos (por ejemplo ácidos poli IC y poli AU) y ciertas substancias naturales (por ejemplo, cera D de Mycobacterium tuberculosis, así como substancias encontradas en Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis y miembros del género Brucella), albúmina de suero bovino, toxoide de la difteria, toxoide del tétanos, edestina, hemocianina de lapa de ojo de cerradura, toxina A de pseudomonas, coleragenoide, toxina del cólera, toxina pertussis, proteínas virales y proteínas eucarióticas tales como interferones, interleuquinas o factor de necrosis tumoral. Tales proteínas pueden obtenerse de fuentes naturales o recombinantes de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica. Cuando se obtiene de fuentes recombinantes, el adyuvante no saponínico puede comprender un fragmento proteínico que comprende al menos la porción inmunogénica de la molécula. Otras macromoléculas inmunogénicas conocidas que pueden usarse en la práctica de la invención incluyen, pero no se limitan a, polisacáridos, tRNA, polímeros sintéticos no metabolizables tales como polivinilamina, poli(ácido metacrílico), polivinilpirrolidona, policondensados mixtos (con peso molecular relativamente alto) de ácido 4',4-diaminofenilmetano-3,3'-dicarboxílico y ácido 4-nitro-2-aminobenzoico (véase Sela, M., Science 166:1365-1374(1969)) o glicolípidos, lípidos o carbohidratos.
Los conjugados de la presente invención exhiben efectos adyuvantes cuando se administran a lo largo de un amplio intervalo de dosificaciones y un amplio intervalo de relaciones para uno o más antígenos particulares que se administran.
Los conjugados pueden administrarse individualmente o mezclados con otros adyuvantes substancialmente puros para alcanzar una mejora de la respuesta inmunitaria a un antígeno.
Los conjugados de la presente invención pueden utilizarse para mejorar la respuesta inmunitaria a uno o más antígenos. Antígenos típicos adecuados para las composiciones que provocan respuestas inmunitarias de la presente invención incluyen antígenos derivados de cualquiera de los siguientes: virus, tales como influenza, virus de leucemia felina, virus de inmunodeficiencia felina, HIV-1, HIV-2, rabia, sarampión, hepatitis B o enfermedad de la pezuña y la boca; bacterias, tales como ántrax, difteria, enfermedad de Lyme o tuberculosis; o protozoos, tales como Babeosis bovis o Plasmodium. El antígeno puede ser proteínas, péptidos, polisacáridos o mezclas de los mismos. Las proteínas y los péptidos pueden purificarse de una fuente natural, sintetizarse por medio de síntesis en fase sólida o pueden obtenerse por medio de genética recombinante.
Los conjugados de la presente invención también pueden administrarse solos para potenciar el sistema inmunitario para el tratamiento de enfermedades infecciosas crónicas, especialmente en pacientes comprometidos inmunitariamente. Ejemplos de enfermedades infecciosas para las que pueden emplearse conjugados de la presente invención para tratamiento terapéutico o profiláctico se describen en la Patente de EE.UU. Nº 5.508.310. La potenciación del sistema inmunitario por conjugados de saponina también puede ser útil como una medida preventiva para limitar los tiempos de infecciones nosocomiales y/o postquirúrgicas.
La administración de los compuestos útiles en el método de la presente invención puede ser mediante medios parenterales, intravenosos, intramusculares, subcutáneos, intranasales o cualesquiera otros adecuados. La dosificación administrada puede depender de la edad, el peso, el tipo de tratamiento simultáneo, si existe, y la naturaleza del antígeno administrado. En general, los conjugados de saponina/antígeno pueden administrarse a lo largo de un amplio intervalo de dosificaciones y un amplio intervalo de relaciones con el antígeno que se administra. La dosis inicial puede estar seguida por una dosificación de refuerzo después de un período de aproximadamente cuatro semanas para mejorar la respuesta inmunogénica. También pueden administrarse dosificaciones de refuerzo adicionales.
Los conjugados de la presente invención pueden emplearse en formas tales como cápsulas, soluciones líquidas, emulsiones, suspensiones o elixires para administración oral, o formas líquidas estériles tales como soluciones, emulsiones o suspensiones. Se usa preferiblemente cualquier portador inerte, tal como solución salina o solución salina tamponada con fosfato o cualquiera de tales portadores en el que los compuestos usados en el método de la presente invención tengan propiedades de solubilidad adecuadas para usar en los métodos de la presente invención.

Claims (23)

1. Un conjugado de polisacárido para usar en la potenciación de la respuesta inmunitaria de un animal a un antígeno, en donde dicho conjugado de polisacárido comprende:
(i) un polisacárido que se une a la superficie celular de células que presentan antígenos (APCs) en donde dicho polisacárido comprende un mínimo de siete sacáridos; y
(ii) una o más moléculas que tienen un grupo carbonilo estable; en donde dichas una o más moléculas se seleccionan del grupo que consiste en aldehídos aromáticos, cetonas aromáticas, aldehídos cicloalquílicos, cetonas cicloalquílicas, aldehídos cicloalquenílicos, cetonas cicloalquenílicas, aldehídos heterocíclicos, cetonas heterocíclicas, cetonas heteroaromáticas, aldehídos heteroaromáticos, aldehídos alquílicos, cetonas alquílicas, aldehídos alquenílicos y cetonas alquenílicas,
en donde el polisacárido (i) está ligado a las moléculas (ii) a través de (iii) un enlace covalente directo o covalentemente a través de un conector bifuncional de una manera que mantiene intacto el grupo carbonilo estable.
2. Un conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que potenciar la respuesta inmunitaria de un animal a un antígeno comprende mejorar la respuesta inmunitaria de dicho animal.
3. El conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polisacárido se selecciona del grupo que consiste en \beta-glucanos, mananos, polisacáridos pécticos y 2-acetamidoglucanopolisacáridos.
4. El conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dichas moléculas que tienen un grupo carbonilo estable se seleccionan del grupo que consiste en aril(de 6 a 10 átomos de carbono)-aldehídos mono- y di-substituidos, aril(de 6 a 10 átomos de carbono)-alquil(de 1 a 4 átomos de carbono)-aldehídos, y mezclas de los mismos; fenilo o naftilo substituido por un substituyente formilo o formil-alquilo(de 1 a 4 átomos de carbono), y que incluyen opcionalmente uno o dos substituyentes adicionales seleccionados independientemente del grupo que consiste en halo, hidroxi, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, trifluorometilo y benciloxi; benzaldehído y naftaldehído, substituidos por uno o dos de hidroxi y halo; 2,3-, 2,4-, 2,5- y 3,4-dihidroxibenzaldehído, 5-cloro-2-hidroxibenzaldehído, vainillina, etilvainillina, naringenina, 3- y 4-hidroxibenzaldehído o 4-hidroxifenilacetaldehído; alquil(de 1 a 4 átomos de carbono)-aril(de 6 a 10 átomos de carbono)-cetonas substituidas con hidroxi y arilcetonas substituidas con hidroxi; 2-hidroxiacetofenona, 3-hidroxiacetofenona, 4-hidroxiacetofenona y 6-hidroxi-1,2-naftoquinona; aldehídos heteroarílicos y cetonas heteroarílicas; tiofeno, furano, benzotiofeno, benzofurano, piridina, quinolina, piridazina, pirimidina, pirazol, imidazol, 1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, isoxazol u oxazol, teniendo cada uno un substituyente ceto, formilo o formil-alquilo(de 1 a 4 átomos de carbono), e incluyendo preferiblemente un substituyente halo o hidroxi adicional, si estos pueden ser alojados por átomos de carbono de anillo disponibles; piridoxal, 2-tiofenocarboxaldehído y 3-tiofenocarboxaldehído.
5. El conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho residuo de una molécula conectora bifuncional se selecciona del grupo que consiste en:
H_{2}N-(CH_{2})_{r}-NH_{2}, en donde r es de 2 a 12;
HO-(CH_{2})_{r}-NH_{2}, en donde r es de 2 a 12;
HS-(CH_{2})_{r}-NH_{2}, en donde r es de 2 a 12;
aminoácidos que están opcionalmente protegidos con carboxi; y
H-(O-CH_{2}-CH_{2})_{n}-OH, donde n es 1-4; etilendiamina, 1,4-butanodiamina, espermidina, ácido 2,4-diaminobutírico, lisina, \beta-alanina, ácido \gamma-aminobutírico, dialanina, trialanina, 3,3'-diaminodipropilamina, ácido diaminopropiónico, N-(2-aminoetl)-1,3-propanodiamina y 2-(4-aminofenil)etilamina;
-NH-(CH_{2})_{r}-NH-, donde r es de 2-5,
-O-(CH_{2})_{r}-NH-, donde r es de 2-5,
-NH-CH_{2}-C(O)-,
-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-,
-NH-NH-C(O)-CH_{2}-,
-NH-C(CH_{3})_{2}-C(O)-,
-S-(CH_{2})_{r}-C(O)-, donde r es de 1-5,
-S-(CH_{2})_{r}-NH-, donde r es de 2-5,
-S-(CH_{2})_{r}-O-, donde r es de 1-5,
-S-(CH_{2})-CH(NH_{2})-C(O)-,
-S-(CH_{2})-CH(COOH)-NH-,
-O-CH_{2}-CH(OH)-CH_{2}-S-CH(CO_{2}H)-NH-,
-O-CH_{2}-CH(OH)-CH_{2}-S-CH(NH_{2})-C(O)-,
-O-CH_{2}-CH(OH)-CH_{2}-S-CH_{2}-CH_{2}-NH-,
-S-CH_{2}-C(O)NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-, y
-NH-O-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-O-P(O_{2}H)-.
6. El conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polisacárido se selecciona del grupo que consiste en: \beta-glucanos, mananos, polisacáridos pécticos, quitina y sus derivados, mureína, fructanos bacterianos, xantanos, heteropolisacáridos bacterianos, pululano fúngico y ésteres, sulfonatos, sulfatos, fosfatos, éteres y derivados reticulados de los mismos.
7. El conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polisacárido es un \beta-glucano que tiene una cadena principal de unidades de \beta-D-glucopiranosilo conectadas (1\rightarrow3) y que tiene unidades de \beta-D-glucopiranosilo ligadas mediante conexiones (1\rightarrow6), y un peso molecular de entre 5.000 y 500.000, y en donde dicho \beta-glucano está opcionalmente modificado mediante la adición de uno o más grupos aniónicos, catiónicos o no iónicos.
8. El conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polisacárido es un \beta-manano que comprende polimanosa (1\rightarrow4) que tiene un residuo de manosilo reductor extremo o el producto de acetilación del mismo.
9. El conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polisacárido es un polisacárido péctico seleccionado del grupo que consiste en homogalacturonanos, ramnogalacturonanos, arabanos, galactanos y arabinogalactanos, y en donde dicho polisacárido péctico posee actividad inmunopotenciadora.
10. Uso de un conjugado de polisacárido en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad, en el que dicho conjugado de polisacárido comprende:
(i) un polisacárido que se une a la superficie de células que presentan antígenos (APCs) en donde dicho polisacárido comprende un mínimo de siete sacáridos; y
(ii) una o más moléculas que tienen un grupo carbonilo estable; en donde dichas una o más moléculas se seleccionan del grupo que consiste en aldehídos aromáticos, cetonas aromáticas, aldehídos cicloalquílicos, cetonas cicloalquílicas, aldehídos cicloalquenílicos, cetonas cicloalquenílicas, aldehídos heterocíclicos, cetonas heterocíclicas, cetonas heteroaromáticas, aldehídos heteroaromáticos, aldehídos alquílicos, cetonas alquílicas, aldehídos alquenílicos y cetonas alquenílicas,
en donde el polisacárido (i) está ligado a las moléculas (ii) a través de (iii) un enlace covalente directo o covalentemente a través de un conector bifuncional de una manera que mantiene intacto el grupo carbonilo estable y en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en un cáncer o una infección bacteriana o viral o es el resultado de cáncer o una infección bacteriana o viral o síndrome de DiGeorge, infecciones fúngicas, infecciones por micoplasmas, tuberculosis, lepra y lupus eritematoso sistémico.
11. Uso de un conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el medicamento es una vacuna.
12. Uso de un conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, que comprende además al menos un agente terapéutico o adyuvante.
13. El uso de un conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicha infección viral es el resultado de un virus seleccionado del grupo que consiste en: herpesvirus, virus de Epstein Barr, virus de rubéola, papilovirus y virus de inmunodeficiencia humana.
14. El uso de un conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicha enfermedad es la hepatitis.
15. El uso de un conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en: linfoma no de Hodgkins, melanoma, cánceres de mama, colon, cabeza y cuello, gástrico, renal, laríngeo y rectal, cánceres que expresan antígenos, cánceres que contienen células T citotóxicas específicas de tumores que son anérgicas, y cánceres que se han extirpado quirúrgicamente en los que existe un riego de recurrencia.
16. El uso de un conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicha enfermedad es una infección por Pneumocystis carinii.
17. El uso de un conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende además un antígeno.
18. El uso de un conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho antígeno se deriva de un virus, una bacteria o un protozoo.
19. El uso de un conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 18, en el que dicho antígeno se deriva de uno de los siguientes: influenza, leucemia felina, virus de inmunodeficiencia felina, HIV-1, HIV-2, rabia, sarampión, hepatitis B, enfermedad de la pezuña y la boca, ántrax, difteria, enfermedad de Lyme, tuberculosis, Babeosis bovis o Plasmodium.
20. El uso de un conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicho agente terapéutico es un agente antiviral o anticancerígeno.
21. El uso de un conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicho agente antiviral es un agente para el tratamiento de virus seleccionados del grupo que consiste en: herpesvirus, influenza, parainfluenza, adenovirus, coxsakievirus, picornavirus, rotavirus, hepatitis A, parotitis, rubéola, sarampión, poxvirus, virus sincitial respiratorio, papilomavirus, enterovirus, arenavirus, rinovirus, poliovirus, enfermedad de Newcastle, rabia y arbovirus.
22. El uso de un conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 20, en el que dicho agente antiviral se selecciona del grupo que consiste en: 3'-azido-3'-desoxitimidina, 2',3'-didesoxicitidina, 2',3'-didesoxiadenosina, 2',3'-didesoxiinosina, carbovir, 2',3'-dideshidrotimidina, N-terc-butil-decahidro-2-[-2(R)-hidroxi-4-fenil-3(S)-[[N-2-quinolilcarbonil)-L-asparginil]butil]-(4aS,8aS)-isoquinolin-3(S)-carboxamida, cis-1-(2-hidroximetil)-1,3-oxatiolan-5-il)-citosina o cis-1-(2-hidroximetil)-1,3-oxatiolan-5-il)-5-fluorocitosina, 3'-desoxi-3'-fluorotimidina, 2',3'-didesoxi-5-etinil-3'-fluorouridina, 5-cloro-2',3'-didesoxi-3'-fluorouridina, Ribavirin, 9-[4-hidroxi-2-(hidroximetil)
but-1-il]guanina, 7-cloro-5-(2-pirril)-3H-1,4-benzodiazepin-2(H)-ona, 7-cloro-1,3-dihidro-5-(1H-pirrol-2-il)-3H-1,4-benzodiazepin-2-amina, \alpha-interferón, probenecid, dipiridamol; pentoxifilina, N-acetilcisteína, Precession, \alpha-tricosantina, ácido fosfonofórmico, interleuquina II, eritropoyetina y 1-(\beta-D-arabinofuranosil)-5-propiniluracilo.
23. El uso de un conjugado de polisacárido de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicho adyuvante se selecciona del grupo que consiste en: adyuvantes oleosos, saponinas, saponinas modificadas, liposomas, sales minerales, polinucleótidos, ciertas substancias naturales aisladas de Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis o miembros del género Brucella, suero bovino, albúmina, toxoide de la difteria, toxoide del tétanos, edestina, hemocianina de lapa de ojo de cerradura, toxina A de pseudomonas, coleragenoide, toxina del cólera, toxina pertussis, proteínas virales, proteínas eucarióticas, polisacárido, RNA, polivinilamina, poli(ácido metacrílico), polivinilpirrolidona, policondensados, glicolípidos, lípidos y carbohidratos.
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