ES2246572T3 - Procedimiento para la catalisis de reacciones complejas de grandes moleculas mediante enzimas ligadas a un soporte polimero. - Google Patents

Procedimiento para la catalisis de reacciones complejas de grandes moleculas mediante enzimas ligadas a un soporte polimero.

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Abstract

Procedimiento para la obtención de insulinas o de sus análogos a partir de los correspondientes precursores, mediante una enzima ligada a un soporte polímero, caracterizado porque el material de soporte polímero no presenta poros.

Description

Procedimiento para la catálisis de reacciones complejas de grandes moléculas mediante enzimas ligadas a un soporte polímero.
La presente invención se refiere a un procedimiento para la catálisis de reacciones complejas de grandes moléculas, a saber, reacciones con reacciones sucesivas o secundarias, no deseadas, mediante una enzima ligada a un soporte polímero, y se refiere en especial a un procedimiento para la obtención enzimática de biomoléculas, en especial de péptidos biológicamente activos, por ejemplo de insulinas o de sus análogos, de proteínas, oligosacáridos o de polisacáridos, a partir de sus etapas previas o precursores biológicamente no activos, por ejemplo preproinsulinas, mediante enzimas ligadas a un soporte polímero.
La producción de insulina humana y de sus derivados ha sido descrita en diversos enfoques en la bibliografía. Además de la síntesis química, que a causa de la complejidad de la molécula diana u objetivo no es rentable, existen también un procedimiento semisintético así como un procedimiento de tecnología genética.
En el caso del enfoque semisintético se produce un intercambio, catalizado por tripsina, del aminoácido C-terminal de la cadena B de la insulina porcina, que conduce a la formación de la insulina humana (H.-D. Jakubke et al., Angew. Chem., 97 (1985) 79).
El enfoque de tecnología genética para la producción de insulina humana transcurre por la etapa de la preproinsulina y de sus derivados, que en el marco de la elaboración también se someten a un desdoblamiento tríptico (B.H. Frank et al., Peptides: synthesis, structure, function, (1981) 729-738; Jonasson et al., Eur. J. Biochem., 236 2 (1996) 656-661; Kemmier et al., J. Biol. Chem., 246 (1971) 6786-6791).
Para la utilización más eficiente de la enzima se desarrolló, para el enfoque semisintético, un procedimiento que permite el empleo de tripsina inmovilizada (documento EP 0 294 851).
Para la obtención de insulinas o de sus análogos a partir de las preproinsulinas producidas mediante tecnología genética, no se conoce hasta ahora ningún procedimiento enzimático en el que la enzima tripsina se encuentre presente en forma inmovilizada, por lo que en procedimientos conocidos, debe añadirse, por una parte, tripsina nueva para cada nueva tanda de reacción y, por otra parte, en el marco de la purificación del producto es necesario un costoso enriquecimiento de la enzima por separación de las impurezas.
El desdoblamiento tríptico de preproinsulina (PPI) es una reacción compleja, catalizada por enzimas, con numerosas reacciones sucesivas y secundarias no deseables. Como se muestra en la Fig. 1, en el desdoblamiento tríptico de PPI y a causa de los numerosos sitios reactivos, se forma una pluralidad de productos de reacción de los cuales los compuestos Arg(B31), Arg(B32)-insulina ("di-Arg") y Arg(B31)-insulina ("mono-Arg") han de considerarse como las sustancias útiles propiamente dichas para la elaboración ulterior. Por lo tanto, es necesario un desdoblamiento tanto de la secuencia preliminar como también de la cadena C "media" (la cadena que en la preproinsulina está dispuesta entre la secuencia de la cadena A y la secuencia de la cadena B).Si en otros sitios de la PPI llegan a producirse reacciones de desdoblamiento, en tal caso se forman productos secundarios no deseados, como por ejemplo la Des(B30)-insulina ("des-Thr").
Mientras que el desdoblamiento con tripsina nativa conduce a la formación predominante de las dos sustancias útiles, Arg(B31), Arg(B32)-insulina ("di-Arg") y Arg(831)-insulina ("mono-Arg"), el empleo de inmovilizados de tripsina sobre la base de soportes convencionales como, por ejemplo, Eupergit® C250L, Eupergit® C, Deloxan®, proporciona un patrón de reacciones no satisfactorio. En este caso, ambas sustancias útiles, di- y mono-Arg, se forman sólo en cantidades pequeñas, mientras que en primer término se forman los productos consecutivos de reacción o secundarios no deseados (especialmente des-Thr).
Huwig et al. (Chemical Abstracts, vol. 120, nº. 25, 20 de Junio de1994) describen un procedimiento de laboratorio para la producción de 2-ceto-D-glucosa y de otros azúcares con piranosaoxidasa inmovilizada de Peniophora gigantea. Lorenzen y Schlumme (Chemical Abstracts, vol. 123, nº. 19, 6 de Noviembre de 1995) describen la caracterización de tripsina inmovilizada sobre perlas de oxiranacrilo para la obtención de fosfopéptidos a partir de caseína. Eckstein y Renner (Chemical Abstracts, vol. 122, nº. 7, 13 de Febrero de 1995) describen la inmovilización de papaína y tripsina sobre polímeros epoxi para síntesis catalizadas con enzimas. En la Patente de los EE.UU. nº 4.994.388 se describen micropartículas de soporte de poliestireno recubiertas de colágeno. Könnecke et al. (Monatshefte für Chemie,,vol. 114, 1983, páginas 433-444) describen síntesis de péptidos con enzimas inmovilizadas.Jakubke et al. (Analytical Chemistry Symposia Series, vol. 9, 1982, páginas 529-536) describen la utilización de proteasas inmovilizadas para la síntesis de péptidos. Könnecke et al. (Monatshefte für Chemie, vol. 112, 1981, páginas 469-481) describen la síntesis de péptidos mediante enzimas inmovilizadas.
La misión de la presente invención es poner a disposición un procedimiento para la obtención de insulinas o de sus análogos a partir de los correspondientes precursores, mediante enzimas ligadas a un soporte polímero, en el que se eviten de la manera más amplia posible las reacciones sucesivas o secundarias no deseadas.
\newpage
La misión se resuelve mediante procedimientos para la obtención de insulinas o de sus análogos a partir de los correspondientes precursores, mediante enzimas ligadas a un soporte polímero, que se distingue porque el material de soporte polímero no muestra poros.
El procedimiento conforme a la invención es preferentemente adecuado para la obtención de insulinas o de sus análogos a partir de los correspondientes precursores, en especial a partir de las preproinsulinas, mediante una o varias enzimas ligadas a un soporte polímero.
Los análogos de insulina se derivan de insulinas que se presentan en la naturaleza, a saber de insulina humana o de insulinas animales, por ejemplo insulina porcina o vacuna, por sustitución o falta de al menos un radical aminoácido que se presenta en la naturaleza y/o por adición de al menos un radical aminoácido en la cadena A y/o B de la insulina que se presenta en la naturaleza.
Es preferible que el material de soporte polímero sea un copolímero a base de de los monómeros metacrilamida y N,N'-bis(metacrilamida), siendo especialmente preferible que el material de soporte polímero disponga de monómeros que contienen grupos oxirano.
En el caso del procedimiento conforme a la invención, es preferible que la enzima se haya ligado covalentemente al material de soporte con ayuda de grupos oxirano.
En el caso del procedimiento preferido para la obtención de insulinas o de sus análogos a partir de los correspondientes precursores, en especial a partir de las preproinsulinas, como enzima se utiliza preferentemente tripsina.
En este caso la enzima inmovilizada en el soporte presenta preferentemente una actividad de 0,05 a 0,5 U/ml, el valor del pH de la solución de reacción es preferentemente de 6 a 10, de manera especialmente preferida, de 7 a 9.
A continuación se ilustra la presente invención con mayor detalle, en especial mediante la ayuda de los ejemplos.
En una serie de inmovilizaciones se ligó tripsina covalentemente a diversos materiales de soporte (Eupergit® C, Eupergit® 250L, Deloxan®).
Sin embargo, el empleo de estos inmovilizados en el desdoblamiento de preproinsulina (PPI) proporcionó las sustancias útiles, di- o mono-Arg, solamente en pequeñas cantidades, a pesar de la variación de diversos parámetros de reacción tales como por ejemplo, el valor del pH, la temperatura o concentración de la enzima. En cambio, se formaron predominantemente productos secundarios no deseados como, por ejemplo, des-Thr.
En el empleo de tripsina, que había sido inmovilizada sobre el soporte Eupergit® C1Z, un soporte libre de poros, se logró sorprendentemente el desdoblamiento de PPI según el modelo deseado en el empleo nativo.
La elección de un soporte libre de poros, en especial Eupergit® C1Z, en la inmovilización de tripsina, permite por lo tanto, por primera vez, el empleo repetido de la enzima con al mismo tiempo una muy buena selectividad en el desdoblamiento de PPI, a favor de las dos sustancias útiles, di- y mono-Arg. Por lo tanto, para el procedimiento de tecnología genética de la producción de insulina humana, es posible una utilización, análoga al procedimiento semisintético, de la tripsina inmovilizada, con la consecuencia de una fácil separabilidad del catalizador de la solución de la reacción, así como un empleo múltiple.
Ejemplos Ejemplo 1 Inmovilización de proteínas sobre soportes polímeros Ejemplo 1.1 Deloxan®
La inmovilización de proteínas sobre Deloxan® requiere una activación previa del soporte con glutardialdehido. En la fijación propiamente dicha de la enzima se varió, en una serie de mediciones, la actividad nativa indicada de la tripsina.
\newpage
Activación: pH = 9 [KPP: 100 mM]
\hskip0.9cm T = 25^{o}C
\hskip0.9cm t = 1 h
\hskip0.9cm Deloxan® = 10 g [VR = 150 ml]
\hskip0.9cm GD = 0,2 g/gTM
Condiciones de fijación: pH = 9 [KPP: 100 mM]
\hskip0.9cm T = 25^{o}C
\hskip0.9cm  t = 3 h 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1.2 Eupergit® C250L y Eupergit® C
En la inmovilización de tripsina sobre soportes de Eupergit® se mezcla en una reacción de un solo paso la suspensión del soporte con la solución de la enzima.
Condiciones de fijación para Eupergit® C250L:
\hskip0.9cm pH = 8 [KPP: 1 M]
\hskip0.9cm  T = 25ºC
\hskip0.9cm t = 3 d 
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones de fijación para Eupergit® C:
\hskip0.9cm  pH = 8,5 [tampón borato 100 mM]
\hskip0.9cm T = 25ºC
\hskip0.9cm t = 3 d
\hskip0.9cm Benzamidina = 24 mM 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1.3 Eupergit® C1Z
En contraste con los soportes usuales, el soporte Eupergit® C1Z se distingue por estar libre de poros.
Condiciones de fijación:
\hskip0.9cm  pH = 8 [KPP: 1 M]
\hskip0.9cm T = 25ºC
\hskip0.9cm  t = 3 d
\hskip0.9cm Tripsina nativa = 7.400 U/gTM [\Sigma =37.000 U sobre 5 g] 
\vskip1.000000\baselineskip
Bajo las condiciones indicadas se logró una actividad específica de 405 U/gTM. Si bien el rendimiento de fijación es comparable con los resultados de los dos otros soportes de Eupergit®, el coeficiente de detección, con un 46%, tiene un valor manifiestamente superior.
Ejemplo 2 Este ejemplo sirve para fines de comparación con el procedimiento reivindicado
En un vaso de filtración se dispone un volumen de 1 l de la solución de preproinsulina con una concentración de 0,83 mg/ml. Después del ajuste de un pH de 8,3 se inicia la reacción de desdoblamiento mediante adición de la tripsina fijada sobre Deloxan® con una concentración de 0,81 U/ml. La temperatura de la solución a lo largo del tiempo de reacción es de 6ºC. El valor del pH se mantiene constante durante la reacción mediante adición de una solución de NaOH 1M. En intervalos regulares a lo largo de un espacio de tiempo de 23 h se extraen muestras de la solución de la reacción, y se determina el contenido de los componentes de reacción individuales mediante HPLC.
Tal como cabe ver en la Fig. 2, a lo largo del espacio de tiempo observado se origina des-Thr como producto principal, mientras que la cantidad de las dos sustancias útiles di- y mono-Arg es claramente menor.
Ejemplo 3
Este ejemplo sirve para fines de comparación con el procedimiento reivindicado.
En un vaso de filtración se dispone un volumen de 1 l de la solución de preproinsulina con una concentración de 0,83 mg/ml. Después del ajuste de un pH de 8,3, se inicia la reacción de desdoblamiento mediante adición de la tripsina fijada sobre Eupergit® C250 L con una concentración de 1,62 U/ml. La temperatura de la solución a lo largo del tiempo de reacción es de 6ºC. El valor del pH se mantiene constante durante la reacción mediante adición de solución 1 M de NaOH. En intervalos regulares a lo largo de un espacio de tiempo de 23 h se extraen muestras de la solución de la reacción, y se determina el contenido de los componentes de reacción individuales mediante HPLC.
Tal como cabe ver en la Fig. 3, también en este caso a lo largo del espacio de tiempo observado se origina des-Thr como producto principal, mientras que la cantidad de las dos sustancias útiles di- y mono-Arg, que además se descomponen nuevamente en una reacción sucesiva, es significativamente menor.
Ejemplo 4
En un vaso de filtración se dispone un volumen de 1 l de la solución de preproinsulina con una concentración de 0,83 mg/ml. Después del ajuste de un pH de 8,3, se inicia la reacción de desdoblamiento mediante adición de la tripsina fijada sobre Eupergit® C1Z con una concentración de 0,081 U/ml. La temperatura de la solución a lo largo del tiempo de reacción es de 6ºC. El valor del pH se mantiene constante durante la reacción mediante adición de solución de NaOH 1M. En intervalos regulares a lo largo de un espacio de tiempo de 23 h se extraen muestras de la solución de la reacción, y se determina el contenido de los componentes de reacción individuales mediante HPLC.
Tal como cabe ver en la Fig. 4, en contraste con los ensayos de reacción anteriores con tripsina inmovilizada sobre la base de este soporte, las dos sustancias útiles deseadas, di- y mono-Arg, se forman en exceso, mientras que la proporción de los productos secundarios (en especial de des-Thr) se reduce drásticamente.
Ejemplo 5
En un vaso de filtración se dispone un volumen de 1 l de la solución de preproinsulina con una concentración de 0,83 mg/ml. Después del ajuste de un pH de 8,3, se inicia la reacción de desdoblamiento mediante adición de la tripsina fijada sobre Eupergit® C1Z con una concentración de 0,405 U/ml. La temperatura de la solución a lo largo del tiempo de reacción es de 6ºC. El valor del pH se mantiene constante durante la reacción mediante adición de solución 1 M de NaOH. En intervalos regulares a lo largo de un espacio de tiempo de 12 h se extraen muestras de la solución de la reacción, y se determina el contenido de los componentes de reacción individuales mediante HPLC. También en este ejemplo, en el empleo de la tripsina inmovilizada sobre Eupergit® C1Z, se forma el espectro deseado de productos y de productos secundarios.
Como cabe ver en la Fig.5, mediante la quintuplicación de la concentración del catalizador es posible elevar la velocidad de la reacción y. por lo tanto, acortar el tiempo de reacción necesario, sin que por ello se desplace la selectividad de la reacción en desmedro de las dos sustancias útiles.
Posible significado de los resultados de los Ejemplos 2 a 5
Por ejemplo, en el caso de preproinsulinas (PPI), y a diferencia de los productos consecutivos de la reacción, en el caso del substrato de partida se trata de una molécula más grande (\approx 10 kDa) que está sometida a una limitación más fuerte de su difusión por los poros. Por esta razón la velocidad de reacción de todas las reacciones sucesivas es mayor que la reacción directa de PPI en diversos fragmentos. Por este motivo, en el caso de soportes con muchos poros no debería ser posible una acumulación del producto intermedio deseado P (véase la Fig. 6; en este ejemplo: di-Arg). Por ello, como tanda de solución para el control de la selectividad se ofrece el empleo de soportes libres de poros (o aproximadamente libres de poros).
Leyendas de las figuras
Fig. 1: Sitios reactivos en el desdoblamiento tríptico de preproinsulina (INS = insulina; AO-Arg-INS = Arg(AO)-insulina; INS-di-Arg = Arg(B31), Arg(B32)-insulina; INS-mono-Arg = Arg(B31)-insulina; des-Thr = Des(B30)-insulina).
Fig. 2: Desarrollo de las concentraciones de los componentes de reacción como función del tiempo en el desdoblamiento de preproinsulina con tripsina inmovilizada sobre Deloxan®.
Fig. 3: Desarrollo de las concentraciones de los componentes de reacción como función del tiempo en el desdoblamiento de preproinsulina con tripsina inmovilizada sobre Eupergit®. C250 L.
Fig. 4: Desarrollo de las concentraciones de los componentes de reacción como función del tiempo en el desdoblamiento de preproinsulina con tripsina inmovilizada sobre Eupergit® C1Z.
Fig. 5: Desarrollo de las concentraciones de los componentes de reacción como función del tiempo en el desdoblamiento de preproinsulina con tripsina inmovilizada sobre Eupergit® C1Z.
Fig. 6: Significado de la morfología del soporte para la selectividad de la reacción (S = substrato, por ejemplo, PPI; P = producto intermedio deseado, por ejemplo, Di-Arg; Q = producto consecutivo de la reacción no deseado, por ejemplo, des-Thr).

Claims (8)

1. Procedimiento para la obtención de insulinas o de sus análogos a partir de los correspondientes precursores, mediante una enzima ligada a un soporte polímero, caracterizado porque el material de soporte polímero no presenta poros.
2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, caracterizado porque el material de soporte polímero es un copolímero a base de los monómeros metacrilamida y N,N'-bis(metacrilamida).
3. Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el material de soporte polímero dispone de monómeros que contienen grupos oxirano.
4. Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la enzima ha sido ligada covalentemente al material de soporte con ayuda de grupos oxirano.
5. Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la enzima es tripsina.
6. Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la enzima inmovilizada en el soporte muestra una actividad de 0,05 a 0,5 U/ml.
7. Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el pH de la solución de la reacción tiene un valor de 6 a 10.
8. Procedimiento conforme a la reivindicación 7, caracterizado porque el valor del pH es 7 a 9.
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