ES2246893T3 - Procedimiento de cribado de preparaciones de farmacos. - Google Patents
Procedimiento de cribado de preparaciones de farmacos.Info
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Abstract
Un procedimiento de cribado de preparaciones de fármacos para un determinado paciente, que implica el cultivo de componentes de la sangre del paciente con fármacos de ensayo, el análisis de dichos componentes tras el cultivo, y la selección del fármaco óptimo y se caracteriza porque se cultiva una muestra de sangre completa heparinizada del paciente, se añade un fármaco de ensayo in vitro a una dosis correspondiente a 1:5000 de su dosis terapéutica, y el fármaco seleccionado es el asociado con el mayor valor de la proporción de grupos - SH y -SS en la fracción celular de la sangre de un determinado paciente.
Description
Procedimiento de cribado de preparaciones de
fármacos.
La presente invención se refiere a la medicina,
en particular, a procedimientos de cribado de preparaciones de
fármacos realizados para seleccionar un fármaco y su dosificación
óptima para el tratamiento de un determinado paciente.
En la técnica actual, el modo convencional de
seleccionar un fármaco para un determinado paciente comporta un
examen médico del paciente, la comparación de los resultados del
examen con las recomendaciones proporcionadas por la farmacopea, la
prescripción de un fármaco o combinación de fármacos y la corrección
de la prescripción basándose en la observación de la respuesta del
paciente (Methods of Experimental Chemotherapy: a Practical Guide.
Ed. por N, G. Pershin, Moscú, 1971, 234 pags., -En ruso).
Sin embargo, el coste de tiempo y la falta de
fiabilidad de la selección de una metodología de tratamiento para un
determinado paciente y un alto grado de subjetividad han hecho
oportuno buscar nuevos procedimientos más objetivos para la
selección de fármacos y sus dosis para un determinado paciente
afectado por una determinada enfermedad.
Un procedimiento de cribado de fármacos
terapéuticos se describe en la patente del Reino Unido nº 2007 117
(IPC A 61 B5/04,1992), que concierne a la situación de las manos del
investigador sobre un paciente y sustancias de ensayo y a la
selección del fármaco óptimo basándose en la respuesta a la
temperatura del investigador.
Este procedimiento es suficientemente universal,
sin embargo es también un tanto subjetivo e insuficientemente
fiable.
Las patentes del Reino Unido y los certificados
de autoría de Suecia nº 1806601 (IPC A 61 B 5/0476, 1990), nº
1540804 (IPC A 61 B 10/00, 1987), nº 2000739 (IPC A 61 B5/02, 1991),
y nº 2046341 (IPC G 01 N 33/48, 1994) describen procedimientos de
cribado de fármacos terapéuticos para el tratamiento de determinados
trastornos del SNC y enfermedades virales, cancerosas y otras. Los
procedimientos están basados en la administración de fármacos de
ensayo en el cuerpo del paciente o en la aplicación de los fármacos
a preparaciones tisulares o fluidos corporales, discriminando
parámetros significativos, midiendo estos parámetros en cada fármaco
de ensayo, y seleccionando el fármaco que causa los mayores efectos
en los parámetros seleccionados como el fármaco óptimo.
Sin embargo, estos procedimientos son de
aplicabilidad limitada y no proporcionan resultados lo bastante
fiables cuando es necesaria una terapia compleja.
Se ha descrito un procedimiento para la selección
de un medicamento para tratar la insuficiencia cardiovascular que
comporta un análisis de quimioluminiscencia de la sangre venosa tras
su incubación con las soluciones del fármaco a diferentes
concentraciones y la selección de la dosis del fármaco que produce
una quimioluminiscencia mínima como la dosis diana (documento del
Reino Unido nº 2072100 C1 de 20.01.97).
Este procedimiento también es de aplicabilidad
limitada.
El propósito de la presente invención es
proporcionar un procedimiento más rápido y universal de cribado de
preparaciones de fármacos.
Con este fin, se sugirió realizar un cribado
basándose en el cultivo de una muestra de sangre completa
heparinizada con soluciones acuosas de fármacos de ensayo a
diferentes dosis, para determinar la proporción de grupos -SH y -SS
en la fracción celular de la sangre del paciente tras el cultivo, y
para seleccionar el fármaco a la dosis a la que produce la mayor
proporción de grupos -SH y -SS como el fármaco óptimo a la dosis
óptima (en la selección del fármaco prescrito se debe proceder
teniendo en cuenta que el fármaco óptimo y su dosis óptima para el
tratamiento de un paciente hacen que dicha proporción sea de
alrededor de 3,0, como han demostrado los experimentos).
El cultivo de sangre se realiza típicamente
durante 1 hora a una temperatura cercana a un máximo de 37ºC,
añadiéndose los fármacos del ensayo en dosis que representan 1:5000
de sus dosis terapéuticas.
El procedimiento se basa en la hipótesis de que
los compuestos de la sangre que contienen azufre son los más
sensibles a factores de varias etiologías asociadas con
enfermedades, por lo que los fármacos capaces de normalizarlos son
los más eficaces en el tratamiento de estas enfermedades.
Las principales diferencias del procedimiento
proporcionado por esta invención son el uso de sangre completa para
el cultivo, la determinación de un nuevo parámetro, es decir, la
proporción de grupos -SH y grupos -SS en la fracción celular de la
sangre, y el supuesto del valor óptimo del parámetro. Forma de
realización más preferida de la invención
La práctica del procedimiento de cribado de
preparaciones farmacéuticas implica lo siguiente:
Cada fármaco de prueba a su dosificación in
vitro calculada para ser hasta 1:5000 de su dosificación
terapéutica se añade a un tubo de ensayo que contiene 1 ml de sangre
completa heparinizada obtenida de una vena periférica, siendo
añadidos vehículos respectivos a tubos de control, y las mezclas se
incuban durante 1 hora a 37ºC. El tiempo de incubación puede ser
prolongado opcionalmente hasta 2 horas, lo que permite cierto
aumento en la exactitud del procedimiento, sin embargo, esto es
razonable solamente cuando los resultados de ensayo para distintos
fármacos son cercanos unos a otros, o los fármacos dan lugar a
pequeños efectos en la proporción de los grupos -SH y
-SS.
-SS.
Las cantidades de los grupos -SH y grupos -SS y
sus proporciones en la fracción celular de la sangre se determinan
principalmente usando los procedimientos de titulación amperométrica
directa (-SH) e inversa (-SS).
Para la titulación amperométrica directa, se
añaden 10 ml de sangre venosa a un tubo de ensayo que contiene
1-2 gotas de heparina 5000 ILJ/ml como
anticoagulante. Entonces la muestra de sangre se distribuye en
alícuotas de 1 ml en la cantidad necesaria de tubos de ensayo
(normalmente 7-9), que depende del número de
fármacos que se van a ensayar y de sus dosis. Los fármacos de ensayo
se añaden a los tubos de ensayo a las dosis necesarias (cada dosis
in vitro se calcula en cantidades que representan 1:5000 de
las respectivas dosis terapéuticas), mientras que los respectivos
vehículos se añaden a los tubos de control. Luego las mezclas se
incuban en un termostato durante 1 hora a 37ºC. Tras la incubación,
los tubos de ensayo y de control se centrifugan durante
5-7 min. a 800 rpm. y se elimina el plasma. Entonces
cada fracción celular se hemolisa en una disolución 0,1% Trylon B
(Na-EDTA) (pH = 7,0), para cuyo propósito se mezcla
una parte de células sanguíneas con 19 partes de la disolución, la
mezcla se coloca en un refrigerador (+4ºC - +5ºC), y tras 30 minutos
la mezcla se centrifuga durante 15 minutos a 6000 rpm para
sedimentar las células lisadas. El sobrenadante (hemolisado) se usa
más adelante. Se añaden 25-30 ml de tampón amoniaco
en un vaso de titulación (un vaso de precipitados de
30-40 ml). El vaso de precipitados se coloca en un
agitador magnético, se sumergen un electrodo de platino y el extremo
libre de un puente salino en la disolución de ensayo y se conectan a
un amperímetro, y se coloca una cápsula con un imán en el fondo del
vaso de precipitados y se lleva a rotación a una velocidad tal que
se evite el que la disolución crepite, y se añaden 0,2 ml de
hemolisado a un vaso de titulación. Cuando el indicador del
amperímetro se ha estabilizado, comienza la titulación añadiendo
dosis de 0,05 ml o dosis de 0,1 ml de una disolución 1 x 10^{-3} M
AgNO_{3},.Tras cada dosis consecutiva, se deja que el indicador se
estabilice, se registra su posición, y después de eso se prosigue
con la titulación. Cuando se alcanza la variable principal de
valoración, cada siguiente dosis de la disolución de titulación
causa un incremento brusco en la corriente eléctrica y el
desplazamiento respectivo de la posición del indicador hacia valores
mayores. Después de 4-5 mediciones de comprobación,
se detiene el procedimiento de titulación y sus resultados se usan
para determinar gráficamente la cantidad de nitrato de plata
necesario para titular la disolución, lo que establece la base para
calcular el contenido de grupos
-SH.
-SH.
Para la titulación amperométrica inversa se
añaden 25 ml de tampón amoniaco a un vaso de titulación. El vaso se
coloca sobre un agitador magnético, el electrodo indicador y el
extremo del puente salino conectados al electrodo de referencia
quedan sumergidos en la disolución, el amperímetro y el agitador
magnético se conectan a la red eléctrica, se pone en marcha el
agitador, y los reactivos siguientes se añaden al tampón uno tras
otro: 0,5 ml de disolución 1 x 10^{-3} M AgNO_{3}, 0,2 ml de un
hemolisado, y 200 mg de sulfito sódico.
Se pone en marcha el amperímetro y cuando su
indicador se ha estabilizado (tras unos 3-5
minutos), comienza la titulación de una muestra de ensayo usando una
disolución 5x10^{4} M de unitiol añadida a la mezcla de reacción
en dosis de 0,05 ml o dosis de 0,1 ml hasta que se añade el volumen
final de 0,5 ml Cuando se ha completado la titulación, la cantidad
de unitiol necesaria para titular la muestra se determina
gráficamente, y la cantidad determinada se usa para calcular la
cantidad de grupos -SS. Finalmente, se calcula la proporción entre
las concentraciones de grupos -SH y grupos -SS.
Como norma general, los procedimientos anteriores
se combinan. Cuando la determinación de grupos -SH por el
procedimiento anterior de titulación directa se ha completado, se
añade sulfito sódico a la misma disolución sin interrumpir su
agitación, y el contenido en grupos -SS en la misma muestra se
determina usando la disolución equimolar de unitiol, añadiéndose el
exceso de disolución de nitrato de plata para la titulación inversa
a la mezcla de reacción no de una vez sino en varias dosis en el
transcurso de la titulación directa.
La posibilidad de usar el procedimiento de
cribado de preparaciones de fármacos proporcionado por la presente
invención en el tratamiento de las enfermedades de varias etiologías
se demuestra con los siguientes ejemplos.
Paciente B-ya E.V. Diagnóstico:
Cáncer de colon transversal (T_{3}N_{0}M_{0}). Se ha
realizado la resección del colon transverso.
Se han determinado los efectos de diferentes
dosis de un fármaco antitumoral immunomodulador Ukrain (Nowicky
Pharma; Austria) y un fármaco antihipoxante Oliphen (OOO Oliphen,
Rusia) en equilibrio de bisulfuro de tiol en sangre. Los resultados
se presentan en la Tabla 1 siguiente.
Según nuestras estimaciones, el fármaco óptimo es
Ukrain administrado en dosis de 5,0 mg unidad porque cuando se
añadía la respectiva dosis in vitro de Ukrain, la proporción
- SH/-SS aumentaba de 2,00 a 3,00.
El paciente recibió un ciclo de tratamiento con
Ukrain previo a la cirugía y dos ciclos después de la cirugía,
siendo administrado Ukrain a la dosis de 5,0 mg en días alternos
diez veces durante cada ciclo de tratamiento.
Los hallazgos de la investigación histológica en
el tumor eliminado son como sigue: adenocarcinoma con mucosidad en
el lumen glandular, focos necróticos, e infiltración inflamatoria
del estroma.
Durante tres años hasta ahora se observa su
remisión completa y el nivel del antígeno sérico carcinoembriónico
(CEA) permanece normal (1,2 ng/ml el 27/12/96 y 1,1 ng/ml el
10/04/97, siendo la norma menos de 5 ng/ml).
Paciente G-va N.V. Diagnóstico:
Cáncer de colon transversal (T_{4}N_{2}M_{1}). El tumor fue
cortado para aliviar una obstrucción intestinal. Se halló
carcinomatosis peritoneal durante la operación.
Los efectos de Ukrain y Reaferon (Vector NPO,
Rusia) en equilibrio de bisulfuro de tiol en sangre han sido
definidos (ver Tabla 1).
Según nuestras estimaciones, el fármaco óptimo es
Ukrain administrado como dosis de 10,0 mg unidad porque cuando se
añadía la dosis respectiva in vitro de Ukrain, la proporción
-SH/-SS aumentó de 1,17 a 1,75.
Se administró un ciclo de tratamiento con Ukrain
administrado intravenoso en días alternos a la dosis de 10,0 mg
(diez inyecciones). Tras la primera inyección, se evidenció una
respuesta característica a la administración del fármaco (incremento
de la temperatura corporal hasta 37,9ºC y sudoración) indicando la
eficacia del tratamiento. La respuesta disminuyó gradualmente en el
transcurso de las siguientes inyecciones y se volvió mínima hacia el
final del tratamiento. El sentimiento subjetivo del paciente mejoró
significativamente, y ensayos de laboratorio revelaron la
normalización del CEA sérico (1,7 ng/ml el 09/12/96 y 1,3 ng/ml el
27/12/96). Posteriormente, el paciente recibió dos ciclos más de
tratamiento con Ukrain, y la estabilización del estado del paciente
durante ocho meses fue evidente.
Paciente L-n B. A. Diagnóstico:
Cáncer de mama izquierda (T3N2M-1) con metástasis de
columna (Th_{12}, L_{1}-_{2}) después de la
mastectomía. La paciente recibió tratamiento de radiación de su
columna y cuatro ciclos de quimioterapia, Bonephos.
Cuando se estudiaron los efectos de Ukrain y
Oliphen en equilibrio de bisulfuro de tiol en sangre (ver Tabla 1),
se advirtió que con este paciente los valores del coeficiente
-SH/-SS eran bajos con todas las dosis de los fármacos, siendo el
óptimo Ukrain a la dosis de 5,0 mg por inyección (la dosis
respectiva in vitro aumentó el coeficiente -SH/-SS de 1,00 a
1,67). Sin embargo, de acuerdo con el protocolo aceptado, en este
caso, el tratamiento con Ukrain implicó dosis de 10 mg administradas
por vía intravenosa en días alternos (diez inyecciones). Después del
ciclo de tratamiento, el estado del paciente no mejoró, el dolor
persistió, el nivel del oncomarcador CA15-3 aumentó
algo (38,3 U/ml el 14/01/97 y 42,6 U/ml el 04/02/97, siendo los
valores normales menores de 26,9 U/ml). Mas tarde, la enfermedad
progresó rápidamente.
Paciente A-va Sh.O., edad 59,
Diagnóstico: Cáncer de esófago (T_{2}N_{X}M_{O}). Se ha
administrado radioterapia.
Estudios de los efectos de Ukrain y Cycloferon
(un inductor de interferon, NTFF Polysan) en equilibrio de bisulfuro
de tiol reveló que el efecto óptimo fue el ofrecido por Ukrain a la
dosis de 5,0 mg (la respectiva dosis de Ukrain añadida in vitro
aumentó el coeficiente -SH/-SS de 0,93 hasta 2,50).
Se aplicaron dos ciclos de tratamiento con Ukrain
administrado a la dosis de 5,0 mg en días alternos (diez
inyecciones). Antes del primer y el segundo ciclo los niveles de
marcador oncológico eran normales, y después del segundo ciclo se
advirtió que el nivel de CA19-9 disminuyó (el
24/01/97 el nivel de CEA era 0,53 ng/ml y el nivel de
CA19-9 era 5,0 U/ml: El 30/12/98 el nivel de CEA era
0,80 ng/ml y el nivel de CA19-9 era 23,9 U/ml; el
27/01/99 el nivel de CA19-9 era 18,1 U/ml; siendo su
nivel normal menor de 37 U/ml). Durante tres años hasta ahora la
estabilización del estado del paciente ha sido evidente. Una
gastroduodenoscopía realizada el 22/12/98 reveló la ulceración del
tercio inferior del esófago (una ulcera de 0,3x0,5 cm bajo fibrina)
y esofaguitis erosiva. La investigación ultrasónica del abdomen no
proporcionó datos que indicaran la generalización de los procesos
patológicos.
Paciente D-va S.V. Diagnóstico:
linfoma prolinfocítico no-Hodgkin del estómago
(T_{3}N_{2}M_{0}). Se ha realizado una resección subtotal del
estómago (tipo Billroth-2). La investigación
histológica del tumor extraído reveló linfoma prolinfocítico, y se
halló una imagen histológica similar en nódulos linfáticos de las
curvaturas gástricas mayor y menor.
Cuando se estudiaron los efectos de Ukrain y
Oliphen en equilibrio de bisulfuro de tiol en sangre (ver Tabla 1),
se advirtió que con este paciente, el fármaco óptimo era Oliphen a
la dosis unidad de 0,5g (cuando se añadió la respectiva dosis in
vitro aumentó el coeficiente -SH/-SS de 2,00 hasta 3,12).
Se administraron tres ciclos de tratamiento con
Oliphen administrado como una tableta de 0,5 g tres veces al día,
siendo la duración del ciclo 1,5 meses, y siendo los intervalos
entre los ciclos de 2-3 meses. Durante cinco años,
se ha observado una remisión completa
clínico-hematológica.
Paciente K-n A. V. Diagnóstico:
hepatitis B viral crónica B sin agente-delta
(virus).
Los estudios de los efectos de Reaferon y
Cycloferon en equilibrio de bisulfuro de tiol en sangre (ver Tabla
1) mostraron que el fármaco óptimo para este paciente fue Reaferon a
la dosis unidad de 1 x 106 U (la dosis respectiva añadida in vitro
aumentó la proporción -SH/-SS de 1,52 a 3,07). Se administró un
ciclo de tratamiento con Reaferon administrado intramuscularmente a
la dosis de 1 x106 U cada tres días durante seis meses. El
tratamiento se asoció con la normalización de actividades ALT y AST,
inversión de ADN de VHB, HBeAg, y HBsAg, y una remisión estable duró
ocho meses.
Paciente P-va G.A. Diagnóstico:
Poli artritis reumatoide de Estadio II seronegativa de progresión
rápida con afectación de las articulaciones humeral, ulnar,
radiocarpal, metacarpal, falangiano, coxofemoral y talocrural. El
cribado de la actividad funcional del paciente fue 3. El ensayo de
los efectos de Oliphen y Cycloferon en equilibrio de bisulfuro de
tiol en sangre (ver Tabla 1) reveló que el fármaco óptimo para este
paciente fue Cycloferon a la dosis unidad de 0,25 g (la dosis
respectiva añadida in vitro aumentó la proporción -SH/-SS de
1,24 a 2,56).
Se administró un ciclo de tratamiento con
Cycloferon implicando administración intramuscular de 2 ml de
disolución al 2% los días 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20. El
tratamiento permitió la reducción de la dosis diaria requerida de
ibuprofeno desde tres comprimidos (0,6 g) hasta dos comprimidos (0,4
g) después del día 5 desde el comienzo del tratamiento y hasta una
comprimido (0,2 g) después del día 10 y hasta suspender
completamente a toma de fármacos analgésicos después del día 16 por
la mejora del dolor. La actividad motora del paciente aumentó
significativamente. Ensayos de laboratorio mostraron disminución de
BSR desde 39 hasta 24 mm/h y disminución de proteína
C-reactiva desde cribado "++" hasta cribado
"+".
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(Tabla pasa a página
siguiente)
El experimento anterior demuestra que el
procedimiento de la presente invención es razonablemente universal
facilitando el ensayo de fármacos en el tratamiento de enfermedades
cancerosas, virales, autoinmunes, y otras. El tiempo necesario para
la selección de un fármaco óptimo mediante el cribado in vitro
es de 2-3 horas.
Claims (2)
1. Un procedimiento de cribado de preparaciones
de fármacos para un determinado paciente, que implica el cultivo de
componentes de la sangre del paciente con fármacos de ensayo, el
análisis de dichos componentes tras el cultivo, y la selección del
fármaco óptimo y se caracteriza porque se cultiva una muestra
de sangre completa heparinizada del paciente, se añade un fármaco de
ensayo in vitro a una dosis correspondiente a 1:5000 de su
dosis terapéutica, y el fármaco seleccionado es el asociado con el
mayor valor de la proporción de grupos -SH y -SS en la fracción
celular de la sangre de un determinado paciente.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el cultivo se realiza durante 1 hora a
37ºC.
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