ES2246927T3

ES2246927T3 - Inhibidores biciclicos de glucogeno sintasa quinasa 3.

Info

Publication number: ES2246927T3
Application number: ES00989272T
Authority: ES
Inventors: John M. Nuss; Xiaohui A. Zhou
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1999-12-17
Filing date: 2000-12-14
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2020-12-14
Also published as: WO2001044246A1; KR20020061647A; KR100711817B1; DE60022388D1; AU784748B2; AU2580201A; HK1049338B; DE60022388T2; EP1240168A1; EP1240168B1; US20010044436A1; US20030008866A1; US6800632B2; WO2001044246A8; ATE303383T1; CN100335479C; JP2003516991A; CN1434824A; HK1049338A1

Abstract

Un compuesto de estructura (I), en la que X e Y son nitrógeno; A1 es arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido; A2 es arilo, ariloxi, arilamino o heteroarilo opcionalmente sustituidos; R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, hidroxilo, y alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alquilaminoalquilo, alcoxi inferior, amino, alquilamino, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, heteroaralquilcarbonilo, arilo y heteroarilo opcionalmente sustituidos; R¿1, R¿2, R¿3 y R¿4 se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, y alquilo inferior opcionalmente sustituido; y las sales farmacéuticas de los mismos.

Description

Inhibidores bicíclicos de glucógeno sintasa quinasa 3.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a nuevos compuestos bicíclicos que inhiben la actividad de glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3), a composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos y al uso de los compuestos y composiciones, solos o en combinación con otros agentes farmacéuticamente activos. Los compuestos y composiciones proporcionados por la presente invención tienen utilidad en el tratamiento de trastornos mediados por la actividad de GSK3 tal como diabetes, enfermedad de Alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos, obesidad, enfermedad cardiovascular ateroesclerótica, hipertensión esencial, síndrome del ovario poliquístico, síndrome X, isquemia, en especial isquemia cerebral, lesión cerebral traumática, trastorno bipolar, inmunodeficiencia y cáncer.

Antecedente de la invención

La glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3) es una serina/treonina quinasa para la que se han identificado dos isoformas, \alpha y \beta. Woodgett, Trends Biochem Sci., 16: 177-81 (1991). Ambas isoformas de GSK3 son constitutivamente activas en células en reposo. El GSK3 se identificó originalmente como una quinasa que inhibe el glucógeno quinasa mediante fosforilación directa. En la activación de insulina, la GSK3 está inactivada, con lo que se permite la activación de glucógeno sintasa y posiblemente otros fenómenos dependientes de la insulina, tales como transporte de glucosa. Posteriormente, se ha demostrado que la actividad de GSK3 está también inactivada por otros factores de crecimiento que, como la insulina, señalan mediante receptores tirosinquinasas (RTK). Ejemplos de tales moléculas de señalización incluyen IGF-1 y EGF. Saito y col., Biochem. J., 303: 27-31 (1994); Welsh y col., Biochem. J. 294: 625-29 (1993); y Cross y col., Biochem. J., 303: 21-26 (1994).

Los agentes que inhiben la actividad de GSK3 son útiles en el tratamiento de trastornos que son mediados por la actividad de GSK3. Además la inhibición de GSK3 simula la activación de rutas de señalización del factor de crecimiento y en consecuencia los inhibidores de GSK3 son útiles en el tratamiento de enfermedades en las que tales rutas son insuficientemente activas. Se describen a continuación ejemplos de enfermedades que se pueden tratar con inhibidores de GSK3.

Diabetes

La diabetes de tipo 2 es una enfermedad crecientemente prevalente del envejecimiento. Se caracteriza inicialmente por menor sensibilidad a insulina y una elevación compensatoria en las concentraciones de insulina en circulación, esto último se requiere para mantener los niveles de glucosa en sangre normales. Los mayores niveles de insulina son provocados por la mayor secreción de las células beta pancreáticas, y la hiperinsulinemia resultante está asociada con complicaciones cardiovasculares de la diabetes. Cuando la resistencia a la insulina empeora, la demanda en las células beta pancreáticas aumenta de forma estacionaria hasta que el páncreas ya no puede proporcionar niveles adecuados de insulina, resultando niveles elevados de glucosa en la sangre. Por último, tienen lugar la hiperglicemia e hiperlipidemia manifiestas, que lleva a las complicaciones de devastación a largo plazo asociadas con diabetes, incluyendo enfermedades cardiovasculares, insuficiencia renal y ceguera. El(los) mecanismo(s) exacto(s) que provocan la diabetes de tipo 2 son(es) desconocido(s), pero dan lugar al transporte deficiente de la glucosa al músculo esquelético y a la mayor producción de glucosa hepática, además de respuesta a la insulina inadecuada. Las modificaciones dietéticas son frecuentemente inefectivas, por lo que la mayoría de los pacientes requieren en última instancia intervención farmacéutica en un esfuerzo para prevenir y/o ralentizar la progresión de las complicaciones de la enfermedad. Muchos pacientes pueden ser tratados con uno o más de los muchos agentes antidiabéticos por vía oral disponibles, incluyendo sulfonilureas, para aumentar la secreción de insulina. Ejemplos de fármacos de sulfonilurea incluyen metformina para eliminación de la producción de glucosa hepática, y troglitazona, una medicación de sensibilización a la insulina. A pesar de la utilidad de estos agentes, de 30 a 40% de los diabéticos no están controlados de forma adecuada usando estas medicaciones y requieren inyecciones de insulina por vía subcutánea. De forma adicional, todas estas terapias tienen asociados efectos secundarios. Por ejemplo, las sulfonilureas pueden provocar hipoglicemia y la troglitazona puede provocar hepatoxicidad grave. En la actualidad hay una necesidad de fármacos nuevos y mejorados para el tratamiento de pacientes prediabéticos y diabéticos.

Como se ha descrito anteriormente, la inhibición de GSK3 estimula los procesos dependientes de la insulina y es en consecuencia útil en el tratamiento de la diabetes de tipo 2. Datos recientes obtenidos usando sales de litio proporcionan evidencia de esta percepción. Se ha descrito recientemente que el ion de litio inhibe la actividad de GSK3. Klein y col., PNAS 93: 8455-9 (1996). Desde 1924, se ha descrito que el litio tiene efectos antidiabéticos incluyendo la capacidad para reducir los niveles de glucosa en plasma, aumentar la captación de glucógeno, potenciar la insulina, sobrerregular la activad de la glucosa sintasa y estimular la síntesis de glucógeno en la piel, músculo y adipocitos. Sin embargo, el litio no se ha aceptado ampliamente para uso en la inhibición de la actividad de GSK3, posiblemente debido a sus efectos documentados en dianas moleculares distintas de GSK3. El análogo de la purina 5-yodotubercidina, también un inhibidor de GSK3, estimula igualmente la síntesis de glucógeno y antagoniza la inactivación del glucógeno sintasa mediante glucagón y vasopresina en células de hígado de rata. Fluckiger-Isler y col., Biochem J 292: 85-91 (1993); y Massillon y col., Biochem J 299: 123-8 (1994). Sin embargo se ha demostrado también que este compuesto inhibe otras serina/treonina y tirosina quinasas. Massillon y col., Biochem J 299: 123-8 (1994).

Enfermedad de Alzheimer

GSK3 está también involucrada en las rutas biológicas relativas a la enfermedad de Alzheimer (AD). Los rasgos patológicos característicos de la AD son placas extracelulares de una forma procesada anormalmente de la proteína precursora amiloide (APP), denominada péptido \beta-amiloide (\beta-AP) y el desarrollo de marañas neurofibrilares intracelulares que contienen filamentos pareados helicoidales (PHF) que se componen en gran medida de proteína tau hiperfosforilada. GSK3 es una de un número de quinasas que se ha encontrado que fosforilan la proteína tau in vitro en los sitios anormales característicos de PHF tau, y es la única quinasa que se ha demostrado hace esto en células vivas y en animales. Lovestone y col., Current Biology 4: 1077-86 (1994); y Brownless y col., Neuroreport 8: 3251-3255 (1997). Además, el inhibidor de la quinasa GSK3, LiCl, bloquea la hiperfosforilación de tau en las células. Stambolic y col., Current Biology 6: 1664-8 (1996). Así pues, la actividad de GSK3 puede contribuir a la generación de marañas neurofibrilares y en consecuencia a la progresión de la enfermedad. Recientemente se ha demostrado que GSK3\beta se asocia con otra proteína clave en la patogénesis de la AD, presenilina 1 (PS1). Takashima y col., PNAS 95: 9637-9641 (1998). Las mutaciones en el gen de PS1 llevan a mayor producción de \beta-AP, pero los autores también demuestran que las proteínas PS1 mutantes se unen más fuertemente a la GSK3\beta y potencian la fosforilación de tau, que está unida a la misma región de PS1.

De forma interesante se ha demostrado también que otro sustrato de GSK3, \beta-catenina, se une a PS1. Zhong y col., Nature 395: 698-702 (1998). La \beta-catenina citosólica está orientada a la degradación tras fosforilación mediante GSK3 y la actividad de \beta-catenina reducida está asociada con mayor sensibilidad de células neuronales respecto a apoptosis neuronal inducida por \beta-AP. En consecuencia, la mayor asociación de GSK3\beta con PS1 mutante puede contribuir a niveles reducidos de \beta-catenina, que se han observado en los cerebros de pacientes con AD de PS1 mutante y al aumento relacionado con la enfermedad en la muerte celular neuronal. En concordancia con estas observaciones se ha demostrado que la inyección de GSK3 antisentido pero no en sentido, bloquea los efectos patológicos de \beta-AP en neuronas in vitro, dando lugar a un retraso de 24 horas en el comienzo de la muerte celular y mayor supervivencia celular de 12 a 35% en 1 hora. Takashima y col., PNAS 90: 7789-93 (1993). En estos últimos estudios los efectos sobre la muerte celular están precedidos (dentro de 3 a 6 horas de la administración de \beta-AP) por el doblamiento de la actividad de GSK3 intracelular, sugiriendo que además del mecanismo genético que aumenta la proximidad de GSK3 a su sustrato, \beta-AP puede aumentar realmente la actividad de GSK3. Otra evidencia de un papel para la GSK3 en la AD la proporciona la observación de que el nivel de expresión de proteína (pero, en este caso, actividad no específica) de GSK3 se aumenta en el 50% en sobrenadantes postsinaptosomales de AD frente a tejido de cerebro normal. Pei y col., J. Neuropathol Exp 56: 70-78 (1997). Así pues, se cree que inhibidores específicos de GSK3 actuarán para ralentizar la progresión de la enfermedad de Alzheimer.

Otros trastornos del CNS (sistema nervioso central)

Además de los efectos del litio descritos anteriormente, hay un largo historial del uso de litio para tratar el trastorno bipolar (síndrome maníaco depresivo). Esta respuesta clínica al litio puede reflejar una involucración de la actividad de GSK3 en la etiología del trastorno bipolar, en cuyo caso los inhibidores de GSK3 podrían ser relevantes para esa indicación. Como corroboración de esta percepción se ha demostrado recientemente que el valproato, otro fármaco comúnmente usado en el tratamiento del trastorno bipolar, es también un inhibidor de GSK3. Chen y col., J. Neurochemistry 72: 1327-1330 (1999). Un mecanismo por el que el litio y otros inhibidores de GSK3 pueden actuar para tratar el trastorno bipolar es aumentar la supervivencia de las neuronas sometidas a niveles aberrantemente elevados de excitación inducidos por el neurotransmisor, glutamato. Nonaka y col., PNAS 95: 2642-2647 (1998). Se cree también que la excitotoxicidad neuronal inducida por glutamato es una causa principal de la neurodegeneración asociada con daño agudo, tal como en isquemia cerebral, lesión cerebral traumática e infección bacteriana. Además se cree que la señalización de glutamato excesiva es un factor en el daño neuronal crónico visto en enfermedades tales como demencia asociada con Alzheimer, Huntington, Parkinson, SIDA, esclerosis lateral amiotrófica (AML) y esclerosis múltiple (MS). Thomas, J. Am. Geriatr. Soc. 43: 1279-89 (1995). En consecuencia se cree que los inhibidores de GSK3 son un tratamiento útil en estas y otras enfermedades neurodegenerativas.

Potenciación inmunológica

GSK3 fosforila el factor de transcripción NF-AT y promueve su exportación desde el núcleo, en oposición al efecto de la calcineurina. Beals y col., Science 274: 1939-33 (1997). Así pues, GSK3 bloquea precozmente la activación génica de respuesta inmune mediante NF-AT, y los inhibidores de GSK3 pueden tender a permitir o prolongar la activación de respuestas inmunes. Así pues, se cree que los inhibidores de GSK3 prolongan y potencian los efectos inmunoestimulatorios de ciertas citoquinas, y tal efecto puede mejorar el potencial de aquellas citoquinas para la inmunoterapia tumoral o incluso para la inmunoterapia en general.

Otros trastornos

El litio también tiene otros efectos biológicos. Es un estimulador potente de la hematopoyesis, tanto in vitro como in vivo. Hammond y col., Blood 55: 26-28 (1980). En perros el carbonato de litio eliminó la neutropenia recurrente y normalizó otros parámetros celulares en sangre. Doukas y col. Exp Hematol 14: 215-221 (1986). Si estos efectos del litio son mediados por la inhibición de GSK3, entonces los inhibidores específicos de GSK3 pueden tener incluso aplicaciones terapéuticas más amplias.

Debido a que los inhibidores de GSK3 son útiles en el tratamiento de muchas enfermedades sería muy deseable la identificación de nuevos inhibidores de GSK3.

Resumen de la invención

Se ha descubierto ahora de forma sorprendente que se puede inhibir la actividad de glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3) in vitro o in vivo mediante ciertos derivados basados en pirimidina y piridina proporcionados por la presente invención. Además de esto, se ha encontrado que los compuestos de la presente invención tienen especificidad por GSK3. De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona nuevos compuestos, composiciones y procedimientos de inhibición de la actividad de GSK3 in vitro y de tratamiento de trastornos mediados por GSK3 in vivo. En un aspecto, la presente invención proporciona nuevos compuestos que presentan actividad de inhibición de GSK3 de la siguiente fórmula (I):

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1

en la que:

W y Z son carbono, nitrógeno o azufre opcionalmente sustituidos;

X e Y se seleccionan independientemente del grupo constituido por nitrógeno, oxígeno, y carbono opcionalmente sustituido;

n es 0, 1 ó 2;

A_{1} y A_{2} son arilo, ariloxi, arilamino o heteroarilo opcionalmente sustituidos;

R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, hidroxilo y alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alquilaminoalquilo, alcoxi inferior, amino, alquilamino, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, heteroaralquilcarbonilo, arilo y heteroarilo opcionalmente sustituidos;

R'_{1}, R'_{2}, R'_{3} y R'_{4} se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, y alquilo inferior opcionalmente sustituido;

R_{5}, R_{6} y R_{7} se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, hidroxi, halo, carboxilo, nitro, amino, amido, amidino, imido, ciano y alquilo inferior sustituido o no sustituido, alcoxi inferior, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, heteraralquilcarbonilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, aralquilcarboniloxi, alquilaminocarboniloxi, arilaminocarboniloxi, formilo, alquil inferior-carbonilo, alcoxi inferior-carbonilo, aminocarbonilo, aminoarilo, alquilsulfonilo, sulfonamido, aminoalcoxi, alquilamino, arilamino, aralquilamino, heteroarilamino, heteroaralquilamino, alquilcarbonilamino, alquilaminocarbonilamino, arilaminocarbonilamino, aralquilcarbonilamino, heteroaralquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, heteroarilcarbonilamino, amidino, cicloalquilo, cicloamido, ciclotioamido, cicloamidino, heterocicloamidino, cicloimido, heterocicloimido, guanidinilo, arilo, biarilo, heteroarilo, heterobiarilo, heterociclo, heterocicloalquilo, arilsulfonilo y arilsulfonamido;

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Los compuestos actuales particularmente preferidos y nuevos de la invención son proporcionados por los compuestos de fórmula:

2

en la que W, X, Y, A_{1}, A_{2} y R_{1}-R_{7} tienen los significados descritos anteriormente, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Los procedimientos, compuestos y composiciones de la invención se pueden usar solos, o en combinación con otros agentes farmacológicamente activos en el tratamiento de trastornos mediados por la actividad de GSK3, tal como en el tratamiento de diabetes, enfermedad de Alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos, obesidad, enfermedad cardiovascular ateroesclerótica, hipertensión esencial, síndrome del ovario poliquístico, síndrome X, isquemia, en especial isquemia cerebral, lesión cerebral traumática, trastorno bipolar, inmunodeficiencia o cáncer.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporcionan compuestos, composiciones y procedimientos para la inhibición de la actividad de glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3), bien in vitro o in vivo. En un aspecto, la presente invención proporciona nuevos compuestos que tienen actividad de inhibición del GSK3 de la siguiente fórmula (I):

3

en la que:

W y Z son carbono, nitrógeno o azufre opcionalmente sustituidos;

n es 0, 1 ó 2;

R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, hidroxilo, y alquilo inferior opcionalmente sustituido, cicloalquilo inferior, alquilaminoalquilo, alcoxi inferior, amino, alquilamino, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, heteroaralquilcarbonilo, arilo y heteroarilo;

R_{5}, R_{6}, R_{7} y se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, hidroxi, halo, carboxilo, nitro, amino, amido, amidino, imido, ciano y alquilo inferior sustituido o no sustituido, alcoxi inferior, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, heteroaralquilcarbonilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, aralquilcarboniloxi, alquilaminocarboniloxi, arilaminocarboniloxi, formilo, alquil inferior-carbonilo, alcoxi inferior-carbonilo, aminocarbonilo, aminoarilo, alquilsulfonilo, sulfonamido, aminoalcoxi, alquilamino, arilamino, aralquilamino, heteroarilamino, heteroaralquilamino, alquilcarbonilamino, alquilaminocarbonilamino, arilaminocarbonilamino, aralquilcarbonilamino, heteroaralquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, heteroarilcarbonilamino, amidino, cicloalquilo, cicloamido, ciclotioamido, cicloamidino, heterocicloamidino, cicloimido, heterocicloimido, guanidinilo, arilo, biarilo, heteroarilo, heterobiarilo, heterociclo, heterocicloalquilo, arilsulfonilo y arilsulfonamido;

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En una realización actualmente preferida de la invención, al menos uno de X e Y es nitrógeno. Compuestos representativos de este grupo incluyen aquellos compuestos en los que uno de X e Y es nitrógeno y el otro de X e Y es oxígeno o carbono opcionalmente sustituido. Preferiblemente, ambos X e Y son nitrógeno.

Los constituyentes A_{1} y A_{2} pueden ser independientemente un anillo aromático que tiene de 3 a 10 átomos de carbono en el anillo y opcionalmente 1 o más heteroátomos en el anillo. Así pues, en una realización, A_{1} y/o A_{2} pueden ser arilo carbocíclico opcionalmente sustituido. De forma alternativa, A_{1} y/o A_{2} son heteroarilo opcionalmente sustituido, tal como, por ejemplo, piridilo, pirimidinilo, tiazolilo, indolilo, imidazolilo, oxadiazolilo, tetrazolilo, pirazinilo, triazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, purinilo, naftilo, benzotiazolilo, benzopiridilo y bencimidazolilo sustituidos o no sustituidos, que pueden sustituirse con al menos uno y no más de 3 grupos de sustitución. Grupos de sustitución representativos se pueden seleccionar independientemente del grupo constituido, por ejemplo, por nitro, amino, ciano, halo, tioamido, amidino, oxamidino, alcoxiamidino, imidino, guanidino, sulfonamido, carboxilo, formilo, alquilo inferior, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, alquil inferior-aminoalcoxi inferior, alquil inferior-carbonilo, aralquil inferior-carbonilo, heteroaralquil inferior-carbonilo, alquiltio, aminoalquilo y cianoalquilo.

En una realización particularmente preferida actual de la invención, A_{1} y/o A_{2} tiene la fórmula:

4

en la que R_{8} y R_{9} se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, nitro, amino, ciano, halo, tioamido, amidino, oxamidino, alcoxiamidino, imidino, guanidinilo, sulfonamido, carboxilo, formilo, alquilo inferior, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, alquil inferior-aminoalcoxi inferior, alquil inferior-carbonilo, aralquil inferior-carbonilo, heteroaralquil inferior-carbonilo, alquiltio, arilo y aralquilo.

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en la que L es -NH- u -O-; y R_{8} y R_{9} se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, nitro, amino, ciano, halo, tioamido, amidino, oxamidino, alcoxiamidino, imidino, guanidinilo, sulfonamido, carboxilo, formilo, alquilo inferior, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, alquil inferior-aminoalcoxi inferior, alquil inferior-carbonilo, aralquil inferior-carbonilo, heteroaralquil inferior-carbonilo, alquiltio, arilo y aralquilo. Lo más preferiblemente, A_{1} y/o A_{2} [A] se selecciona del grupo constituido por nitropiridilo, aminonitropiridilo, cianopiridilo, cianotiazolilo, aminocianopiridilo, trifluorometilpiridilo, metoxipiridilo, metoxinitropiridilo, metoxicianopiridilo y nitrotiazolilo.

En otras realizaciones de la invención al menos uno de R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} pueden ser hidrógeno, o alquilo inferior no sustituido o sustituido seleccionado del grupo constituido por haloalquilo inferior, heterocicloaminoalquilo, y alquil inferior-aminoalquilo inferior; o alquil inferior-aminoalquilo inferior. Las realizaciones preferidas actuales de la invención incluyen compuestos en los que R_{1}, R_{2} y R_{3} son hidrógeno y R_{4} se selecciona del grupo constituido por hidrógeno, metilo, etilo, aminoetilo, dimetilaminoetilo, piridiletilo, piperidinilo, pirrolidiniletilo, piperaziniletilo y morfoliniletilo.

Otros compuestos preferidos actuales de la invención incluyen compuestos de fórmula (I) en la que al menos uno de R_{5} y R_{7} se selecciona del grupo constituido por arilo, heteroarilo y biarilo sustituido y no sustituido. En las realizaciones preferidas actuales, al menos uno de R_{5} y R_{7} es un resto sustituido o no sustituido de fórmula:

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en la que R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13} y R_{14} se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por hidrógeno, nitro, amino, ciano, halo, tioamido, carboxilo, hidroxi y alquilo inferior opcionalmente sustituido, alcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, haloalquilo inferior, haloalcoxi inferior, aminoalquilo, alquilamino, alquiltio, alquilcarbonilamino, aralquilcarbonilamino, heteroaralquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, heteroarilcarbonilamino, aminocarbonilo, alquil inferior-aminocarbonilo, aminoaralquilo, alquil inferior-aminoalquilo, arilo, heteroarilo, cicloheteroalquilo, aralquilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, aralquilcarboniloxi, arilcarboniloxialquilo, alquilcarboniloxialquilo, heteroarilcarboniloxialquilo, aralquilcarboniloxialquilo y heteroaralcarboniloxialquilo. Se obtienen compuestos particularmente preferidos actuales en los que R_{10}, R_{11}, R_{13} y R_{14} son hidrógeno y R_{12} se selecciona del grupo constituido por halo, alquilo inferior, hidroxi, alcoxi inferior, haloalquilo inferior, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo y ciano; R_{11}, R_{13} y R_{14} son hidrógeno y R_{10} y R_{12} se seleccionan independientemente del grupo constituido por halo, alquilo inferior, hidroxi, alcoxi inferior, haloalquilo inferior y ciano; R_{10}, R_{11}, R_{13} y R_{14} son hidrógeno y R_{12} es heteroarilo; R_{10}, R_{11}, R_{13} y R_{14} son hidrógeno y R_{12} es un heterocicloalquilo; y en los que al menos uno de R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13} y R_{14} son halo y los restantes R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13} y R_{14} son hidrógeno. Preferiblemente, al menos uno de R_{5} y R_{7} se seleccionan del grupo constituido por diclorofenilo, difluorofenilo, trifluorometilfenilo, clorofluorofenilo, bromoclorofenilo, etilfenilo, metilclorofenilo, imidazolilfenilo, cianofenilo, morfolinofenilo y cianoclorofenilo.

En realizaciones representativas de la invención, R_{6} puede ser alquilo sustituido tal como, por ejemplo, aralquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, aminoaralquilo, carbonilaminoalquilo, alquilcarbonilaminoalquilo, arilcarbonilaminoalquilo, aralquilcarbonilaminoalquilo, aminoalcoxialquilo y arilaminoalquilo; amino sustituido tal como alquilamino, alquilcarbonilamino, alcoxicarbonilamino, arilalquilamino, arilcarbonilamino, alquiltiocarbonilamino, arilsulfonilamino, heteroarilamino, alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, heteroarilcarbonilamino, aralquilcarbonilamino, y heteroaralquilcarbonilamino; o carbonilo sustituido tal como aminocarbonilo, alquiloxicarbonilo, ariloxicarbonilo, aralquiloxicarbonilo y alquilaminoalquiloxicarbonilo no sustituidos o sustituidos. En otras realizaciones, R_{6} se puede seleccionar del grupo constituido por amidino, guanidino, cicloimido, heterocicloimido, cicloamido, heterocicloamido, ciclotioamido y heterocicloalquilo inferior. Aún en otras realizaciones, R_{6} puede ser arilo o heteroarilo tal como, por ejemplo, piridilo, pirimidinilo, tiazolilo, indolilo, imidazolilo, oxadiazolilo, tetrazolilo, pirazinilo, triazolilo, tienilo, furanilo, quinolinilo, pirroliopiridilo, benzotiazolilo, benzopiridilo, benzotriazolilo, y bencimidazolilo sustituidos o no sustituidos. Tal como se usa en esta invención, grupos heterociclo representativos incluyen, por ejemplo, aquellos mostrado a continuación (donde el punto de unión del grupo sustituyente, y de los otros grupos sustituyentes mostrados a continuación, se encuentra por la parte izquierda superior). Estos grupos heterociclo pueden estar sustituidos adicionalmente y pueden estar unidos en varias posiciones tal como será evidente para los especialistas en las técnicas de la química orgánica y medicinal en conjunción con la descripción de esta
invención.

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Grupos heteroarilo representativos incluyen, por ejemplo, aquellos mostrados a continuación. Estos grupos heteroarilo pueden estar sustituidos adicionalmente y pueden estar unidos en varias posiciones como será evidente para los especialistas en las técnicas de la química orgánica y medicinal en conjunción con la descripción de esta
invención.

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Grupos cicloimido y heterocicloimido representativos incluyen, por ejemplo, aquellos mostrados a continuación. Estos cicloimido y heterocicloimido pueden estar sustituidos adicionalmente y pueden estar unidos en varias posiciones como será evidente para los especialistas en las técnicas de la química orgánica y medicinal en conjunción con la descripción de esta invención.

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Grupos amidino y heterocicloamidino sustituidos representativos incluyen, por ejemplo, aquellos mostrados a continuación. Estos amidino y heterocicloamidino pueden estar sustituidos adicionalmente como será evidente para los especialistas en las técnicas de la química orgánica y medicinal en conjunción con la descripción de esta invención.

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Grupos alquilcarbonilamino, alquiloxicarbonilamino, aminoalquiloxicarbonilamino y arilcarbonilamino sustituidos representativos incluyen, por ejemplo, aquellos mostrados a continuación. Estos grupos pueden estar sustituidos adicionalmente como será evidente para los especialistas en las técnicas de la química orgánica y medicinal en conjunción con la descripción de esta invención.

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Grupos aminocarbonilo sustituidos representativos incluyen, por ejemplo, aquellos mostrados a continuación. Estos grupos heterociclo pueden estar sustituidos adicionalmente como será evidente para los especialistas en las técnicas de la química orgánica y medicinal en conjunción con la descripción de esta invención.

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Grupos alcoxicarbonilo sustituidos representativos incluyen, por ejemplo, aquellos mostrados a continuación. Estos grupos alcoxicarbonilo pueden estar sustituidos adicionalmente como será evidente para los especialistas en las técnicas de la química orgánica y medicinal en conjunción con la descripción de esta invención.

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Compuestos particularmente preferidos actuales de la invención incluyen compuestos que tienen la estructura:

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en la que W, X, Y, A_{1}, A_{2} y R_{1}-R_{7} tienen los significados descritos anteriormente, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Compuestos representativos, preferidos actuales, de este grupo incluyen, por ejemplo, 4-cloro-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[3,4-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo, 4-(2,4-diclorofenil)-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo, 4-(2,4-diclorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo, clorhidato de [4-(2,4-diclorofenil)(5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-2-il)]{2-[(5-nitro(2-piridil))amino]etil}amina, clorhidrato de {2-[(6-amino-5-nitro(2-piridil))amino]etil}[4-(2,4-diclorofenil)-(5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-2-il)]amina, clorhidrato de 6-[(2-{[4-(2,4-diclorofenil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-2-il]amino}etil)-amino]piridin-3-carbonitrilo, 4-(2,4-diclorofenoxi)-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo, 4-(2,4-diclorofenoxi)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]-pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo, clorhidrato de {2-[(6-
amino-5-nitro(2-piridil))amino]etil}{4-[(2,4-diclorofenil)amino](5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-2-il)}
amina, 4-[(2,4-diclorofenil)amino]-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo, 4-[(2,4-diclorofenil)amino]-2-(metilsulfonilo)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo, clorhidrato de {2-[(6-amino-5-nitro(2-piridil))amino]etil}{4-[(2,4-diclorofenil)-amino](5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-2-il)}amina, 4-[(2,4-difluorofenil)-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo, 4-[(2,4-difluorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-
butilo, 4-(2,4-diclorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidina, 6-acetil-4-(2,4-diclorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]-pirimidina, 6-acetil-2-({2-[(6-amino-5-nitro(2-piridil))amino]etil}
amino)-4-(2,4-diclorofenil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidina, y 6-[(2-{[6-acetil-4-(2,4-diclorofenil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-2-il]amino}etil)-amino]piridin-3-carbonitrilo.

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden una cantidad de un compuesto de fórmula (I) efectiva para modular la actividad de GSK3 en un sujeto humano o animal cuando se administra a este, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Aún en otras realizaciones, la invención proporciona procedimientos de inhibición de GSK3 en un sujeto humano o animal, que comprende la administración al sujeto humano o animal de una cantidad inhibidora de GSK3 de un compuesto de estructura (I).

La presente invención proporciona además procedimientos de tratamiento de sujetos humanos o animales que sufren de trastornos mediados por GSK3 en un sujeto humano o animal, que comprende la administración a un sujeto humano o animal de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I) anterior, bien solos o en combinación con otros agentes terapéuticamente activos.

Aún en otras realizaciones la presente invención proporciona compuestos de fórmulas I, IV y V, como se ha descrito anteriormente, para uso como un compuesto farmacéutico, así como también procedimientos de uso de estos compuestos en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de diabetes, enfermedad de Alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos, obesidad, enfermedad cardiovascular ateroesclerótica, hipertensión esencial, síndrome del ovario poliquístico, síndrome X, isquemia, en especial isquemia cerebral, lesión cerebral traumática, trastorno bipolar, inmunodeficiencia o cáncer.

Como se usa anteriormente y en cualquier otra parte de esta invención, los siguientes términos presentan los significados definidos a continuación:

"Glucógeno sintasa quinasa 3" y "GSK3" se usan de forma intercambiable en esta invención para hacer referencia a cualquier proteína que tenga más del 60% de homología de secuencia en los aminoácidos entre las posiciones 56 y 340 de la secuencia de aminoácidos beta de GSK3 humana (Genbank Accession número L33801). Para determinar la homología en porcentaje de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, se alinean las secuencias para fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir hiatos en la secuencia de un polipéptido o ácido nucleico para la alineación óptima con el otro polipéptido o ácido nucleico). Se comparan luego los residuos de aminoácido o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en una secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la otra secuencia, entonces las moléculas son homólogas en esa posición (es decir, como se usa en esta invención "homología" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "identidad" de aminoácido o ácido nucleico). La homología en porcentaje entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas divido por las secuencias (es decir, % de homología = nº de posiciones idénticas / nº total de posiciones x 100). Se identificó inicialmente GSK3 mediante su fosforilación de glucógeno sintasa como describieron Woodgett y col., Trends Biochem. Sci., 16: 177-81 (1991), incorporado a esta invención como referencia. Mediante la modulación de la actividad de la quinasa GSK3, se puede inhibir, o de forma alternativa, estimular, las actividades aguas abajo de la actividad de GSK3. Por ejemplo, cuando se inhibe la actividad de GSK3, se puede activar el glucógeno sintasa, resultando mayor producción de glucógeno. Se sabe también que GSK3 actúa como una quinasa en una variedad de otros contextos incluyendo, por ejemplo, fosforilación de c-jun, \beta-catenina y proteína tau. Se entiende que la inhibición de la actividad de la quinasa GSK3 puede llevar a una variedad de efectos en una variedad de contextos biológicos. La invención, sin embargo, no se encuentra limitada por teoría alguna de mecanismo sobre cómo opera la
invención.

"Inhibidor de GSK3" como se usa en esta invención se refiere a un compuesto que muestra una CI_{50} respecto a GSK3 de no más de aproximadamente 100 \muM y más típicamente no más de aproximadamente 50 \muM, medida en el ensayo sin células de actividad inhibidora de GSK3 descrito generalmente más adelante. "CI_{50}" es aquella concentración de inhibidor que reduce la actividad de un enzima (por ejemplo, GSK3) a la mitad del nivel máximo. Se ha descubierto que compuestos representativos de la presente invención muestran actividad inhibidora frente a GSK3. Los compuestos de la presente invención muestran preferiblemente una CI_{50} respecto a GSK3 de no más de aproximadamente 10 \muM, más preferiblemente, no más de aproximadamente 5 \muM, incluso más preferiblemente no más de aproximadamente 1 \muM, y lo más preferiblemente, no más de aproximadamente 200 nM, medida en el ensayo de quinasa GSK3 sin células.

"Opcionalmente sustituido" se refiere al reemplazo de hidrógeno con un radical monovalente o divalente. Grupos de sustitución adecuados incluyen, por ejemplo, hidroxilo, nitro, amino, imino, ciano, halo, tio, tioamido, amidino, imidino, oxo, oxamidino, metoxamidino, imidino, guanidino, sulfonamido, carboxilo, formilo, alquilo inferior, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, heteroaralquilcarbonilo, alquiltio, aminoalquilo, cianoalquilo y similares.

El grupo de sustitución puede estar él mismo sustituido. El grupo sustituido en el grupo de sustitución puede ser carboxilo, halo; nitro, amino, ciano, hidroxilo, alquilo inferior, alcoxi inferior, aminocarbonilo, -SR, tioamido, -SO_{3}H, -SO_{2}R o cicloalquilo, donde R es típicamente hidrógeno, hidroxilo o alquilo inferior.

Cuando el sustituyente sustituido incluye un grupo de cadena lineal, la sustitución puede tener lugar bien dentro de la cadena (por ejemplo, 2-hidroxipropilo, 2-aminobutilo, y similares) o bien en el extremo de la cadena (por ejemplo, 2-hidroxietilo, 3-cianopropilo, y similares). Los sustituyentes sustituidos pueden ser disposiciones de cadena lineal, ramificadas o cíclicas de átomos de carbono o heteroátomos unidos de forma covalente.

"Alquilo inferior" tal como se usa en esta invención se refiere a grupos alquilo de cadena ramificada o lineal que comprende de uno a diez átomos de carbono que están no sustituidos o sustituidos, por ejemplo, con uno o más halógenos, hidroxilos u otros grupos, incluyendo, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, neopentilo, trifluorometilo, pentafluoroetilo y similares.

"Alquilenilo" se refiere a un radical alifático saturado de cadena lineal o de cadena ramificada divalente que tiene de 1 a 20 átomos de carbono. Grupos alquilenilo típicos usados en compuestos de la presente invención son grupos alquilenilo inferior que tienen de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono en su esqueleto. "Alquenilo" se refiere en esta invención a radicales de cadena lineal, ramificada o cíclica que tienen uno o más dobles enlaces y de 2 a 20 átomos de carbono. "Alquinilo" se refiere en esta invención a radicales de cadena lineal, ramificados o cíclicos que tiene uno o más triples enlaces y de 2 a 20 átomos de carbono.

"Alcoxi inferior" como se usa en esta invención se refiere a RO- en la que R es alquilo inferior. Ejemplos representativos de grupos alcoxi inferior incluyen metoxi, etoxi, t-butoxi, trifluorometoxi y similares.

"Cicloalquilo" se refiere a un sustituyente alquilo, heterocíclico o carbocíclico, mono- o policíclico. Sustituyentes cicloalquilo típicos tienen de 3 a 8 átomos del esqueleto (es decir, del anillo) en los que cada átomo del esqueleto es carbono o un heteroátomo. El término "heterocicloalquilo" se refiere en esta invención a sustituyentes cicloalquilo que tienen de 1 a 5, y más típicamente, de 1 a 4 heteroátomos en la estructura del anillo. Heteroátomos adecuados usados en compuestos de la presente invención son nitrógeno, oxígeno y azufre. Restos heterocicloalquilo representativos incluyen, por ejemplo, morfolino, piperazinilo, piperadinilo y similares. Grupos carbocicloalquilo son grupos cicloalquilo en los que todos los átomos del anillo son carbono. Cuando se usa junto con sustituyentes cicloalquilo, el término "policíclico" se refiere en esta invención a estructuras cíclicas de alquilo condensadas y no
condensadas.

"Halo" se refiere en esta invención a un radical halógeno, tal como flúor, cloro, bromo o yodo. "Haloalquilo" se refiere a un radical alquilo sustituido con uno o más átomos de halógeno. El término "haloalquilo inferior" se refiere a un radical alquilo inferior sustituido con uno o más átomos de halógeno. El término "haloalcoxi" se refiere a un radical alcoxi sustituido con uno o más átomos de halógeno. El término "haloalcoxi inferior" se refiere a un radical alcoxi inferior sustituido con uno o más átomos de halógeno.

"Arilo" se refiere a grupos aromáticos monocíclicos y policíclicos que tienen de 3 a 14 carbonos o heteroátomos en el esqueleto, e incluye tanto grupos arilo carbocíclicos como arilo heterocíclicos. Son grupos arilo carbocíclicos grupos arilo en los que todos los átomos del anillo en el anillo aromático son carbono. El término "heteroarilo" se refiere en esta invención a grupos arilo que tienen de 1 a 4 heteroátomos como átomos del anillo en un anillo aromático siendo el resto de los átomos del anillo átomos de carbono. Cuando se usa junto con sustituyentes arilo, el término "policíclico" se refiere en esta invención a estructuras cíclicas condensadas y no condensadas en las que al menos una estructura cíclica es aromática, tal como, por ejemplo, benzodioxozol (que tiene una estructura heterocíclica condensada con un grupo fenilo, es decir 100, naftilo, y similares. Restos arilo ejemplo usados como sustituyentes en compuestos de la presente invención incluyen fenilo, piridilo, pirimidinilo, tiazolilo, indolilo, imidazolilo, oxadiazolilo, tetrazolilo, pirazinilo, triazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, purinilo, naftilo, benzotiazolilo, benzopiridilo y bencimidazolilo y similares.

"Aralquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo. De forma típica, grupos aralquilo usados en los compuestos de la presente invención tienen de 1 a 6 átomos de carbono incorporados dentro de la parte alquilo del grupo aralquilo. Grupos aralquilo adecuados usados en compuestos de la presente invención incluyen, por ejemplo, bencilo, picolilo y similares.

"Amino" se refiere en esta invención al grupo -NH_{2}. El término "alquilamino" se refiere en esta invención al grupo -NRR', donde R y R' se seleccionan cada uno independientemente entre hidrógeno o un alquilo inferior. El término "arilamino" se refiere en esta invención al grupo -NRR' donde R es arilo y R' es hidrógeno, un alquilo inferior, o un arilo. El término "aralquilamino" se refiere en esta invención al grupo -NRR' donde R es un aralquilo inferior y R' es hidrógeno, un alquilo inferior, un arilo o un aralquilo inferior.

El término "arilcicloalquilamino" se refiere en esta invención al grupo aril-cicloalquil-NH-, donde cicloalquilo es un grupo cicloalquilo divalente. De forma típica, cicloalquilo tiene de 3 a 6 átomos de esqueleto, de los que de forma opcional de 1 a aproximadamente 4 son heteroátomos. El término "aminoalquilo" se refiere a un grupo alquilo que está terminalmente sustituido con un grupo amino.

El término "alcoxialquilo" se refiere al grupo -alq_{1}-O-alq_{2}, donde alq_{1} es alquilenilo o alquenilo, y alq_{2} es alquilo o alquenilo. El término "alcoxialquilo inferior" se refiere a un alcoxialquilo donde alq_{1} es alquilenilo inferior o alquenilo inferior, y alq_{2} es alquilo inferior o alquenilo inferior. EL término "ariloxialquilo" se refiere al grupo -alquilenil-O-arilo. El término "aralcoxialquilo" se refiere al grupo -alquilenil-O-aralquilo, donde aralquilo es un aralquilo inferior.

El término "alcoxialquilamino" se refiere en esta invención al grupo -NR- (alcoxialquilo), donde R es típicamente hidrógeno, aralquilo inferior o alquilo inferior. El término "aminoalcoxialquilo inferior" se refiere en esta invención a un aminoalcoxialquilo en el que el alcoxialquilo es un alcoxialquilo inferior.

El término "aminocarbonilo" se refiere en esta invención al grupo -C(O)-NH_{2}. "Aminocarbonilo sustituido" se refiere en esta invención al grupo -C(O)NRR' donde R es alquilo inferior y R' es hidrógeno o un alquilo inferior. El término "arilaminocarbonilo" se refiere en esta invención al grupo -C(O)-NRR' donde R es un arilo y R' es hidrógeno, alquilo inferior o arilo. "Aralquilaminocarbonilo" se refiere en esta invención al grupo -C(O)-NRR' donde R es aralquilo inferior y R' es hidrógeno, alquilo inferior, arilo o aralquilo inferior.

"Aminosulfonilo" se refiere en esta invención al grupo -S(O)_{2}-NH_{2}. "Aminosulfonilo sustituido" se refiere en esta invención al grupo -S(O)_{2}-NRR' donde R es alquilo inferior y R' es hidrógeno o un alquilo inferior. El término "aralquilaminosulfonilarilo" se refiere en esta invención al grupo -aril-S(O)_{2}-NH-aralquilo, donde el aralquilo es aralquilo inferior.

"Carbonilo" se refiere al grupo divalente -C(O)-.

"Carboniloxi" se refiere por lo general al grupo -C(O)-O-. Tales grupos incluyen ésteres, -C(O)-O-R, donde R es alquilo inferior, cicloalquilo, arilo o aralquilo inferior. El término "carboniloxicicloalquilo" se refiere por lo general en esta invención a un "carboniloxicarbocicloalquilo" y a un "carboniloxiheterocicloalquilo", es decir, donde R es un carbocicloalquilo o heterocicloalquilo, respectivamente. El término "arilcarboniloxi" se refiere en esta invención al grupo -C(O)-O-arilo, donde arilo es un carbocicloarilo o heterocicloarilo mono- o policíclico. El término "aralquilcarboniloxi" se refiere en esta invención al grupo -C(O)-O-aralquilo, donde el aralquilo es aralquilo inferior.

El término "sulfonilo" se refiere en esta invención al grupo -SO_{2}-. "Alquilsulfonilo" se refiere a un sulfonilo sustituido de la estructura -SO_{2}R- en la que R es alquilo. Grupos alquilsulfonilo usados en compuestos de la presente invención son típicamente grupos alquil inferior-sulfonilo que tienen de 1 a 6 átomos de carbono en su estructura de esqueleto. Así pues, grupos alquilsulfonilo típicos usados en compuestos de la presente invención incluyen, por ejemplo, metilsulfonilo (es decir, donde R es metilo), etilsulfonilo (es decir, donde R es etilo), propilsulfonilo (es decir, donde R es propilo) y similares. El término "arilsulfonilo" se refiere en esta invención al grupo -SO_{2}-arilo. El término "aralquilsulfonilo" se refiere en esta invención al grupo -SO_{2}-aralquilo, en el que el aralquilo es aralquilo inferior. El término "sulfonamido" se refiere en esta invención a -SO_{2}NH_{2}.

Como se usa en esta invención, el término "carbonilamino" se refiere al grupo divalente -NH-C(O)- en el que el átomo de hidrógeno del nitrógeno de la amida del grupo carbonilamino puede ser reemplazado por un grupo alquilo inferior, arilo o aralquilo inferior. Tales grupos incluyen restos tales como ésteres de carbamato (-NH-C(O)-O-R) y amidas -NH-C(O)-NR'-R, donde R y R' son alquilo inferior de cadena lineal o ramificada, cicloalquilo, o arilo o aralquilo inferior. El término "alquil inferior-carbonilamino" se refiere a alquilcarbonilamino donde R es un alquilo inferior que tiene de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono en su estructura de esqueleto. El término "arilcarbonilamino" se refiere al grupo -NH-C(O)-R donde R es un arilo. De forma similar, el término "aralquilcarbonilamino" se refiere a carbonilamino donde R es un aralquilo inferior.

Como se usa en esta invención, el término "guanidino" o "guanidilo" se refiere a restos derivados de guanidina, H_{2}N-C(=NH)-NH_{2}. Tales restos incluyen aquellos unidos al átomo de nitrógeno que porta el doble enlace formal (la posición "2" de la guanidina, por ejemplo, diaminometilenamino, (H_{2}N)_{2}C=NH-) y aquellos unidos a cualquiera de los átomos de nitrógeno que portan un enlace simple formal (las posiciones "1" y/o "3" de la guanidina, por ejemplo, H_{2}N-C(=NH)-NH-). Los átomos de hidrógeno en cualquiera de los nitrógenos pueden ser reemplazados por un sustituyente adecuado, tal como alquilo inferior, arilo, o aralquilo inferior.

Como se usa en esta invención, el término "amidino" se refiere a los restos R-C(=N)-NR'- (estando el radical en el nitrógeno "N^{1}") y R(NR')C=N- (estando el radical en el nitrógeno "N^{2}"), donde R y R' puede ser hidrógeno, alquilo inferior, arilo o aralquilo inferior).

Los compuestos de la presente invención se pueden sintetizar fácilmente usando los procedimientos descritos en esta invención, u otros procedimientos, que son bien conocidos en la técnica.

Los compuestos inhibidores de GSK3 de la presente invención se pueden purificar usando procedimientos conocidos, tales como, por ejemplo, cromatografía, cristalización y similares.

Los compuestos de la presente invención muestran preferiblemente actividad inhibidora que es relativamente sustancialmente selectiva respecto a GSK3, en comparación con al menos otro tipo de quinasa. Como se usa en esta invención, el término "selectivo" se refiere a una potencia relativamente mayor para la inhibición frente a GSK3, en comparación con al menos otro tipo de quinasa. Preferiblemente, los inhibidores de GSK3 de la presente invención son selectivos respecto a GSK3, en comparación con al menos otros dos tipos de quinasas. Se conocen por lo general ensayos de actividad de quinasa para quinasas distintas de GSK3. Véase, por ejemplo, Havlicek y col., J. Med. Chem., 40: 408-12 (1997), incorporado a esta invención como referencia. La selectividad por GSK3 se puede cuantificar de acuerdo con lo siguiente: selectividad por GSK3 = CI_{50 \ (otra \ quinasa)}/ CI_{50 \ (GSK3)}, donde un inhibidor de GSK3 es selectivo para GSK3 cuando CI_{50 \ (otra \ quinasa)} > CI_{50 \ (GSK3)}. Así pues, un inhibidor que es selectivo para GSK3 muestra una selectividad por GSK3 superior a 1 vez respecto a la inhibición de una quinasa distinta a GSK3. Como se usa en esta invención, el término "otra quinasa" se refiere a una quinasa distinta de GSK3. Tales selectividades se miden por lo general en el ensayo sin células descrito en el ejemplo 20.

De forma típica, los inhibidores de GSK3 de la presente invención muestran una selectividad de al menos aproximadamente 2 veces (es decir, CI_{50 \ (otra \ quinasa)}/ CI_{50 \ (GSK3)}) para GSK3, en comparación con otra quinasa y más típicamente muestran una selectividad de al menos aproximadamente 5 veces. Normalmente, los inhibidores de GSK3 de la presente invención muestran una selectividad por GSK3, en comparación con al menos otra quinasa, de al menos aproximadamente 10 veces, de forma deseable al menos aproximadamente 100 veces y más preferiblemente, al menos aproximadamente 1000 veces.

La actividad inhibidora de GSK3 se puede detectar fácilmente usando los ensayos descritos en esta invención, así como también ensayos conocidos en general por los especialistas en la técnica. Procedimientos ejemplo para la identificación de inhibidores específicos de GSK3 incluyen tanto ensayos de quinasa GSK3 sin células como basados en células. Un ensayo de quinasa GSK3 sin células detecta inhibidores que actúan mediante interacción directa con el polipéptido GSK3, mientras que un ensayo de quinasa GSK3 basado en células puede identificar inhibidores que funcionan bien mediante interacción directa con GSK3 propiamente, o mediante interferencia con expresión de GSK3 o con procesamiento post-translacional requerido para producir GSK3 activa madura.

En general, un ensayo de quinasa GSK3 sin células se puede llevar a cabo fácilmente mediante: (1) incubación de GSK3 con un sustrato péptido, ATP marcado radiactivamente (tal como, por ejemplo, \gamma^{33}P- o \gamma^{32}P-ATP, ambos disponibles por parte de Amersham, Arlington Heights, Illinois), iones de magnesio y de forma opcional, uno o más inhibidores candidatos; (2) incubación de la mezcla durante un periodo de tiempo para permitir la incorporación del fosfato marcado radiactivamente en el sustrato péptido mediante actividad de GSK3; (3) transferencia de toda o una parte de la mezcla de reacción enzimática a un recipiente a parte, de forma típica un pocillo de microtítulo que contiene una cantidad uniforme de un ligando de captura que es capaz de unir a un ligando de anclaje sobre el sustrato péptido; (4) lavado para eliminar el ATP marcado radiactivamente no reaccionado; luego (5) cuantificación de la cantidad de ^{33}P o ^{32}P que queda en cada pocillo. Esta cantidad representa la cantidad de fosfato marcado radiactivamente en el sustrato péptido. Se observa la inhibición como una reducción en la incorporación de fosfato marcado radiactivamente al sustrato péptido.

Sustratos peptídicos adecuados para uso en el ensayo sin células pueden ser cualquier derivado de péptido, polipéptido o péptido sintético que pueda ser fosforilado por GSK3 en presencia de una cantidad apropiada de ATP. Sustratos peptídicos adecuados pueden estar basados en porciones de las secuencias de varios sustratos proteicos naturales de GSK3, y también pueden contener modificaciones o extensiones N-terminales o C-terminales incluyendo secuencias espaciadoras y ligandos de anclaje. Así pues, el sustrato péptido puede residir dentro de un polipéptido más largo, o puede ser un péptido aislado diseñado para la fosforilación mediante GSK3.

Por ejemplo, un sustrato péptido puede estar diseñado en base a una subsecuencia de la proteína de unión al ADN CREB, tal como la secuencia peptídica CREB unida a SGSG dentro de la proteína de unión a ADN CREB descrita por Wang y col., Anal. Biochem., 220: 397-402 (1994), incorporado a esta invención como referencia. En el ensayo descrito por Wang y col., la serina C-terminal en el motivo SXXXS del péptido CREB se prefosforila enzimáticamente mediante proteinquinasa dependiente de AMPc (PKA), una etapa que se requiere para hacer la serina N-terminal en el motivo fosforilable por GSK3. Como alternativa se puede usar un sustrato péptido de CREB modificado que tenga el mismo motivo SXXXS y que también contenga un ligando de anclaje N-terminal, pero que esté sintetizado con su serina C-terminal pre-fosforilada (tal sustrato se encuentra disponible comercialmente por parte de Chiron Technologies PTY Ltd., Clayton, Australia). La fosforilación de la segunda serina en el motivo SXXXS durante la síntesis del péptido elimina la necesidad de fosforilar enzimáticamente ese residuo con PKA como una etapa a parte, y la incorporación de un ligando de anclaje facilita la captura del sustrato péptido tras su reacción con GSK3.

Por lo general, un sustrato péptido usado para un ensayo de actividad de la quinasa puede contener uno o más sitios que son fosforilables por GSK3, y uno o más de otros sitios que son fosforilables por otras quinasas, pero no por GSK3. Así pues, estos otros sitios se pueden prefosforilar con el fin de crear un motivo que es fosforilable por GSK3. El término "prefosforilado" se refiere en esta invención a la fosforilación de un péptido sustrato con fosfato no marcado radiactivamente antes de llevar a cabo un ensayo de quinasa usado ese péptido sustrato. Tal fosforilación se puede llevar a cabo de forma conveniente durante la síntesis del sustrato peptídico.

El péptido CREB unido a SGSG puede estar unido a un ligando de anclaje, tal como biotina, donde la serina se prefosforila cerca del término C entre P e Y. Como se usa en esta invención, el término "ligando de anclaje" se refiere a un ligando que puede estar unido a un sustrato péptido para facilitar la captura del sustrato péptido en un ligando de captura, y que actúa para mantener el sustrato péptido en el lugar durante las etapas de lavado, permitiendo además la eliminación del ATP marcado radiactivamente no reaccionado. Un ligando de anclaje ejemplo es la biotina. El término "ligando de captura" se refiere en esta invención a una molécula que puede unir un ligando de anclaje con alta afinidad, y que está unido a una estructura sólida. Ejemplos de ligandos de captura unidos incluyen, por ejemplo, pocillos de microtítulos recubiertos con avidina o estreptavidina o esferas de agarosa. Los ligados de captura que portan esferas se pueden combinar adicionalmente con un líquido de centelleos para proporcionar un medio para la detección del péptido sustrato marcado radiactivamente capturado, o se puede añadir el líquido de centelleo al péptido capturado en una última etapa.

El sustrato péptido marcado radiactivamente se puede cuantificar en un contador de centelleos usando procedimientos conocidos. La señal detectada en el contador de centelleos será proporcional a la actividad de GSK3 si la reacción enzimática ha tenido lugar en condiciones en la que sólo una parte limitada (por ejemplo, menos del 20%) del sustrato péptido se fosforila. Si un inhibidor está presente durante la reacción, la actividad de GSK3 será reducida, y una menor cantidad del fosfato marcado radiactivamente será incorporado por tanto en el sustrato péptido. De ahí que será detectada una señal de centelleo inferior. En consecuencia, la actividad inhibidora de GSK3 será detectada como una reducción en la señal de centelleo, en comparación con la observada en un control negativo, donde no está presente inhibidor durante la reacción. Este ensayo se describe con más detalle en el ejemplo 265 más adelante.

Un ensayo de actividad de la quinasa GSK3 basado en células usa de forma típica una célula que puede expresar tanto GSK3 como un sustrato de GSK3, tal como, por ejemplo, una célula transformada con genes que codifican GSK3 y su sustrato, incluyendo secuencias de control regulatorio para la expresión de los genes. En la realización del ensayo basado en células, la célula capaz de expresar los genes es incubada en presencia de un compuesto de la presente invención. Se lisa la célula, y se determina la proporción de sustrato en forma fosforilada, por ejemplo, mediante observación de su movilidad respecto a la forma no fosforilada en SDS PAGE o mediante determinación de la cantidad de sustrato que es reconocida por un anticuerpo específico para la forma fosforilada del sustrato. La cantidad de fosforilación del sustrato es una indicación de la actividad inhibidora del compuesto, es decir, se detecta la inhibición como una disminución en la fosforilación en comparación con el ensayo llevado a cabo sin inhibidor presente. La actividad inhibidora de GSK3 detectada en un ensayo basado en células puede ser debida, por ejemplo, a la inhibición de la expresión de GSK3 o por inhibición de la actividad de quinasa de GSK3.

Así pues, se pueden usar también ensayos basados en células para analizar de forma específica las actividades que están implicadas en la inhibición de GSK3, tal como, por ejemplo, inhibición de fosforilación de proteína tau, potenciación de la señalización de insulina, y similares. Por ejemplo, para comprobar la capacidad de un inhibidor de GSK3 para inhibir la fosforilación tipo Alzheimer de proteína tau asociada a microtúbulos, se pueden co-transfectar células con GSK3\beta humana y proteína tau humana, incubar luego con uno o más inhibidores candidatos. Se pueden usar distintas líneas celulares y vectores de expresión de mamíferos para este tipo de ensayo. Por ejemplo, se pueden transfectar células COS tanto con un plásmido de expresión de GSK3\beta humano de acuerdo con el protocolo descrito por Stambolic y col., 1996, Current Biology 6: 1664-68, que se incorpora a esta invención como referencia, como un plásmido de expresión tal como pSG5 que contiene secuencia de codificación de proteína tau humana en un promotor SV40 precoz. Véase también Goedert y col., EMBO J., 8: 393-399 (1989), que se incorpora a esta invención como referencia. La fosforilación tipo Alzheimer de tau se puede detectar fácilmente con un anticuerpo específico tal como, por ejemplo, AT8, que se encuentra disponible por parte de Polymedco Inc. (Cortlandt Manor, Nueva York) tras lisado de las células. Este ensayo se describe con mayor detalle en los ejemplos, más adelante.

Igualmente, la capacidad de los compuestos inhibidores de GSK3 para potenciar la señalización de insulina mediante activación de glucógeno sintasa se puede averiguar fácilmente usando un ensayo de actividad de glucógeno sintasa basado en células. Este ensayo usa células que responden a la estimulación con insulina mediante aumento de la actividad de glucógeno sintasa, tal como la línea celular CHO-HIRC, que sobreexpresa el receptor de insulina de tipo salvaje (aprox. 100.000 sitios de unión/célula). La línea celular CHO-HIRC se puede generar como describieron Moller y col., J. Biol.Chem., 265: 14979-14985 (1990) y Moller y col., Mol.Endocrinol., 4: 1183-1191 (1990), ambas se incorporan a esta invención como referencia. El ensayo se puede llevar a cabo mediante incubación de células CHO-HIRC con déficit de suero en presencia de distintas concentraciones de compuestos de la presente invención en el medio, seguido de lisis celular al final del periodo de incubación. La actividad del glucógeno sintasa se puede detectar en el lisado como describieron Thomas y col., Anal. Biochem., 25: 486-499 (1968). La actividad del glucógeno sintasa se computa para cada muestra como un porcentaje de la actividad del glucógeno sintasa máxima, como describieron Thomas y col., véase anteriormente, y se representa como una función de la concentración de inhibidor de GSK3 candidato. La concentración de inhibidor de GSK3 candidato que aumentó la actividad del glucógeno sintasa a la mitad de su nivel máximo (es decir, la CE_{50}) se puede calcular mediante ajuste de una curva sigmoidal de cuatro parámetros usado procedimientos de ajuste de curvas rutinarios que son bien conocidos por los especialistas en la técnica. Esto se describe con más detalles en el ejemplo 266, más adelante.

Los inhibidores de GSK3 se pueden clasificar fácilmente en cuanto a actividad in vivo tal como, por ejemplo, usando procedimientos que son bien conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, se pueden identificar fácilmente compuestos candidato que tienen actividad terapéutica potencial en el tratamiento de la diabetes de tipo 2 mediante detección de una capacidad para mejorar la tolerancia a la glucosa en modelos animales de diabetes de tipo 2. De forma específica, se puede dosificar el compuesto candidato usando cualquiera de varias rutas antes de la administración de un bolo de glucosa en ratón diabético (por ejemplo, KK, db/db, ob/ob) o ratas diabéticas (por ejemplo, Zucker Fa/Fa o GK). Tras administración del compuesto candidato y glucosa, se extraen muestras de sangre a intervalos de tiempo preseleccionados y se evalúan en cuanto a glucosa en suero y niveles de insulina. Se puede considerar mayor administración de glucosa en ausencia de niveles de secreción elevados de insulina endógena como sensibilización a insulina y puede ser indicativo de la eficacia del compuesto. Se proporciona más adelante una descripción detallada de este ensayo en los ejemplos.

Los compuestos de la presente invención se pueden usar en la forma de sales derivadas de ácidos inorgánicos u orgánicos. Estas sales incluyen, pero sin limitarse a estas, las siguientes: acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, canforato, canforsulfonato, digluconato, ciclopentanopropionato, dodecilsulfato, etanosulfonato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietnosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, nicotinato, 2-naftalensulfonato, oxalato, pamoato, pectinato, sulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato y undecanoato. También, se pueden cuaternizar los grupos que contienen nitrógeno básicos con agentes tales como haluros de alquilo inferior, tal como cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; sulfatos de dialquilo como sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo y diamilo, haluros de cadena larga tal como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo, haluros de aralquilo como bromuros de bencilo y fenetilo, y otros. Con esto se obtienen productos solubles o dispersables en agua o aceite.

Ejemplos de ácidos que se pueden usar para formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico y ácidos orgánicos tales como ácido oxálico, ácido maleico, ácido succínico y ácido cítrico. Se pueden preparar sales de adición básicas in situ durante el aislamiento y purificación final de los compuestos de fórmula (I), o por separado mediante reacción de restos de ácido carboxílico con una base adecuada tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico farmacéuticamente aceptable o con amoniaco, o una amina primaria, secundaria o terciaria. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitarse a estas, cationes basados en metales alcalinos y alcalinotérreos, tales como sales de sodio, litio, potasio, calcio, magnesio, aluminio y similares, así como también cationes de amonio, amonio cuaternario y amina no tóxicos, incluyendo, pero sin limitarse a amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares. Otras aminas orgánicas representativas útiles para la formación de las sales de adición de base incluyen dietilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina y similares.

Los compuestos de la presente invención se pueden administrar por una variedad de vías que incluyen rutas de administración entérica, parenteral y tópica. Por ejemplo, modos adecuados de administración incluyen por vía oral, subcutánea, transdérmica, transmucosal, iontoforética, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, subdural, rectal y similares.

De acuerdo con otras realizaciones de la presente invención, se proporciona una composición que comprende compuesto inhibidor de GSK3 de la presente invención, junto con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen agentes de procesamiento y modificadores y potenciadores de la liberación de fármaco, tales como, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, monosacáridos, disacáridos, almidón, gelatina, celulosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, dextrosa, hidroxipropil-\beta-ciclodextrina, polivinilpirrolidinona, ceras de bajo punto de fusión, resinas de intercambio de iones, y similares, así como también combinaciones de cualquiera de dos o más de los mismos. Se describen otros excipientes farmacéuticamente aceptables en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Pub. Co., Nueva Jersey (1991), incorporado a esta invención como referencia.

Composiciones farmacéuticas que contienen compuestos inhibidores de GSK3 de la presente invención pueden estar en cualquier forma adecuada para el procedimiento pretendido de administración, incluyendo, por ejemplo, una solución, una suspensión, o una emulsión. Se usan típicamente vehículos líquidos en la preparación de soluciones, suspensiones y emulsiones. Vehículos líquidos contemplados para uso en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, disolvente(s) orgánico(s) farmacéuticamente aceptable(s), aceites o grasas farmacéuticamente aceptables y similares, así como también mezclas de dos o más de los mismos. El vehículo líquido puede contener otros aditivos farmacéuticamente aceptables adecuados tales como solubilizantes, emulsionantes, nutrientes, tampones, conservantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, reguladores de la viscosidad, estabilizantes y similares. Disolventes orgánicos adecuados incluyen, por ejemplo, alcoholes monohídricos, tal como etanol y alcoholes polihídricos, tal como glucoles. Aceites adecuados incluyen, por ejemplo, aceite de soja, aceite de coco, aceite de oliva, aceite de alazor, aceite de semilla de algodón, y similares. Para administración por vía parenteral, el vehículo puede ser también un éster oleoso tal como oleato de etilo, miristato de isopropilo y similares. Las composiciones de la presente invención pueden estar también en la forma de micropartículas, microcápsulas, encapsulados microsomales y similares, así como también combinaciones de dos cualesquiera o más de los mismos.

Los compuestos de la presente invención se pueden administrar por vía oral, parenteral, sublingual, mediante aerosol para inhalación, rectal o tópica en formulaciones unitarias de dosificación que contienen vehículos, adyuvantes y potadores farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales como se desee. La administración por vía tópica puede involucrar también el uso de administración por vía transdérmica tal como parches transdérmicos o dispositivos de iontoforesis. El término parenteral como se usa en esta invención incluye inyecciones por vía subcutánea, inyección por vía intravenosa, intramuscular, intraesternal, o técnicas de infusión.

Se pueden formular preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles de acuerdo con la técnica conocida usando agentes de dispersión o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1,3-propanodiol. Entre los portadores y disolventes aceptables que se pueden usar están agua, solución de Ringer, y solución de cloruro de sodio isotónica. Además se usan convencionalmente aceites fijos estériles como un disolvente o medio de suspensión. Para este fin se puede usar cualquier aceite fijo suave incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Además, son de uso ácidos grasos, tales como el ácido oleico, en la preparación de inyectables.

Se pueden preparar supositorios para administración por vía rectal del fármaco mediante mezcla del fármaco con un excipiente no irritante adecuado tal como manteca cacao y polietilenglucoles que son sólidos a temperaturas ordinarias pero líquidos a la temperatura del recto y por tanto se fundirán en el recto y liberarán el fármaco.

Las formas de dosificación sólidas para administración por vía oral pueden incluir cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólidas, el compuesto activo se puede administrar con al menos un diluyente inerte como sacarosa lactosa o almidón. Tales formas de dosificación pueden comprender también, como es práctica normal, sustancias adicionales distintas de diluyentes inertes, por ejemplo, agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de dosificación pueden comprender también agentes tampón. Se pueden preparar adicionalmente comprimidos y píldoras con recubrimientos
entéricos.

Formas de dosificación líquidas para administración por vía oral pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables que contienen diluyentes inertes usados comúnmente en la técnica, tales como agua. Tales composiciones pueden comprender también adyuvantes, tales como agentes humectantes, emulsionantes y agentes de suspensión, ciclodextrinas, y edulcorantes, aromatizantes y agentes perfumantes.

De acuerdo con otras realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos para inhibición de la actividad de GSK3 en un sujeto humano o animal, dicho procedimiento comprende la administración a un sujeto de una cantidad de un compuesto inhibidor de GSK3 que tiene la estructura (I), (IV) o (V) (o composición que comprende tal compuesto) efectiva para inhibir la actividad de GSK3 en el sujeto. Otras realizaciones proporcionaron procedimientos para el tratamiento de una célula o un trastorno mediado por GSK3 en un sujeto humano o animal, que comprende la administración a la célula o al sujeto humano o animal de una cantidad de un compuesto o composición de la invención efectiva para inhibir la actividad de GSK3 en la célula o sujeto. Preferiblemente, el sujeto será un sujeto animal humano o animal no humano. La inhibición de la actividad de GSK3 incluye eliminación detectable de la actividad de GSK3 bien en comparación con un control o bien en comparación con la actividad de GSK3 esperada.

Cantidades efectivas de los compuestos de la invención incluyen por lo general cualquier cantidad suficiente para inhibir de forma detectable la actividad de GSK3 mediante cualquiera de los ensayos descritos en esta invención, mediante otros ensayos de actividad de la quinasa GSK3 conocidos por los especialistas en la técnica o mediante detección de un alivio de los síntomas en un sujeto afligido con un trastorno mediado por GSK3.

Los trastornos mediados por GSK3 que se pueden tratar de acuerdo con la invención incluyen cualquier trastorno biológico o médico en el que esté implicada la actividad de GSK3 o en el que la inhibición de GSK3 potencie la señalización mediante una ruta que sea característicamente defectiva en la enfermedad que se va a tratar. La afección o trastorno puede estar provocado o caracterizado por actividad de GSK3 anormal. Trastornos mediados por GSK3 representativos incluyen, por ejemplo, diabetes de tipo 2, enfermedad de Alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos, obesidad, enfermedad cardiovascular ateroesclerótica, hipertensión esencial, síndrome del ovario poliquístico, síndrome X, isquemia, en especial isquemia cerebral, lesión cerebral traumática, trastorno bipolar, inmunodeficiencia, cáncer y similares.

El tratamiento exitoso de un sujeto de acuerdo con la invención puede dar lugar a la inducción de una reducción o alivio de los síntomas en un sujeto afligido con un trastorno médico o biológico, por ejemplo, para detener la progresión adicional del trastorno, o la prevención de la enfermedad. Así pues, por ejemplo, el tratamiento de la diabetes puede dar lugar a una reducción en los niveles de glucosa o de HbA1c en el paciente. Igualmente, el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer puede dar lugar a una reducción en la velocidad de la progresión de la enfermedad, detectado, por ejemplo, mediante medida de una reducción en la velocidad de aumento de la demencia.

La cantidad de principio activo que se puede combinar con los materiales vehículo para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del huésped tratado y el modo determinado de administración. Se entenderá, sin embargo, que la cantidad de dosis específica para cualquier paciente determinado dependerá de una variedad de factores incluyendo la actividad del compuesto específico usado, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, momento de administración, vía de administración, velocidad de excreción, combinación de fármaco, y la gravedad de la enfermedad determinada que se somete a terapia. La cantidad terapéuticamente efectiva para una situación dada se puede determinar fácilmente mediante experimentación rutinaria y está dentro de la experiencia y juicio del facultativo ordinario.

Para los fines de la presente invención, una dosis terapéuticamente efectiva será por lo general de aproximadamente 0,1 mg/kg/día a aproximadamente 100 mg/kg/día, preferiblemente de aproximadamente 1 mg/kg/día a aproximadamente 20 mg/kg/día, y lo más preferiblemente de aproximadamente 2 mg/kg/día a aproximadamente 10 mg/kg/día de un compuesto inhibidor de GSK3 de la presente invención, que se puede administrar en una o múltiples dosis.

Los compuestos de la presente invención se pueden administrar también en la forma de liposomas. Como se conoce en la técnica, los liposomas se derivan en general de fosfolípidos u otras sustancias líquidas. Los liposomas están formados por cristales líquidos hidratados mono- o multilamelares que están dispersados en un medio acuoso. Se puede usar cualquier lípido fisiológicamente aceptable y metabolizable, no tóxico capaz de formar liposomas. Las composiciones presentes en forma de liposoma pueden contener, además de un compuesto de la presente invención, estabilizantes, conservantes, excipientes y similares. Los lípidos preferidos son los fosfolípidos y fosfatidilcolinas (lecitinas), tanto naturales como sintéticos. Se conocen en la técnica procedimientos para formar liposomas. Véase, por ejemplo, Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, volumen XIV, Academic Press, Nueva York, N.W., página 33 y siguientes (1976).

Aunque los compuestos de la invención se pueden administrar como el agente farmacéutico activo en solitario, estos también se pueden usar en combinación con otro y otros agentes usados en el tratamiento de trastornos. Agentes representativos útiles en combinación con los compuestos de la invención para el tratamiento de la diabetes de tipo 2 incluyen, por ejemplo, insulina, troglitazona, rosiglitazona, pioglitazona, glipicida, metformina, acarbosa y similares. Agentes representativos útiles en combinación con los compuestos de la invención para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer incluyen, por ejemplo, donepezilo, tacrina y similares. Agentes representativos útiles en combinación con los compuestos de la invención para el tratamiento de trastorno bipolar incluyen, por ejemplo, sales de litio, valproato, carbamazepina y similares. Un agente representativo útil en combinación con los compuestos de la invención para el tratamiento de apoplejía es, por ejemplo, activador del plasminógeno en tejido.

Cuando se usan agentes activos adicionales en combinación con los compuestos de la presente invención, los agentes activos adicionales se pueden usar por lo general en cantidades terapéuticas como se indican en PHYSICIANS' DESK REFERENCE (PDR) 53ª edición (1999), que se incorpora a esta invención como referencia, o tales cantidades terapéuticamente útiles como serían conocidas por un especialista en la técnica.

Los compuestos de la invención y los otros agentes terapéuticamente activos se pueden administrar en la dosificación clínica máxima recomendada o a dosis inferiores. Las cantidades de dosificación de los compuestos activos en las composiciones de la invención se pueden variar de modo que se obtenga una respuesta terapéutica deseada dependiendo de la vía de administración, gravedad de la enfermedad y de la respuesta del paciente. La combinación se puede administrar como composiciones por separado o como una forma de dosificación única que contiene ambos agentes. Cuando se administran como una combinación, los agentes terapéuticos se pueden formular como composiciones por separado que se administran al mismo tiempo o tiempos diferentes, o los agentes terapéuticos se pueden administrar como una composición única.

Los anteriores y otros aspectos de la invención se pueden entender mejor en relación con los siguientes ejemplos representativos.

Ejemplos Ejemplo 1 Procedimientos de caracterización y purificación

Los compuestos de la presente invención se caracterizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) usando un sistema de cromatografía Waters Millenium con un módulo de separación 2690 (Mildford, Massachussets). Las columnas analíticas fueron de fase inversa Alltima C-18, 4,6 x 250 mm de Alltech (Deerfield, Illinois). Se usó un gradiente de elución, de forma típica partiendo con acetonitrilo al 5%/agua al 95% y progresando hasta acetonitrilo al 100% durante un periodo de 40 minutos. Todos los disolventes contenían ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%. Se detectaron los compuestos mediante absorción con luz ultravioleta (UV) a 220 o 254 nm. Los disolventes para HPLC eran de Burdick y Jackson (Muskegan, Michigan) o de Fisher Scientific (Pittsburg, Pennsilvania). En algunos casos, se analizó la pureza mediante cromatografía en capa fina (TLC) usando placas de gel de sílice revestidas de vidrio o plástico, tal como, por ejemplo, láminas flexibles Baker-Flex Silica Gel 1B2-F. Los resultados de TLC se detec-
taron fácilmente de forma visual en luz ultravioleta, o usando vapor de yodo y otras técnicas de tintado bien conocidas.

Se llevó a cabo el análisis por espectrometría de masas en un espectrómetro de masas por electropulverización Fisons VG. Todas las masas que se dan son las de iones de origen protonados.

Se llevó a cabo el análisis por resonancia magnética nuclear (RMN) con un equipo de RMN a 300 MHz Varian (Palo Alto, California). La referencia espectral fue TMS o el desplazamiento químico conocido del disolvente. Se experimentaron algunas muestras de compuesto a temperaturas elevadas (es decir, 75ºC) para promover una mayor solubilidad de la muestra).

La pureza de algunos de los compuestos de la invención se analizó por análisis elemental (Desert Analytics, Tucson, Arizona).

Se determinaron los puntos de fusión en un aparato Mel-Temp de Laboratory Devices (Holliston, Massachusets).

Se llevaron a cabo separaciones preparativas usando un sistema cromatográfico Flash 40 y KP-Sil, 60A (Biotage, Charlottesville, Virginia), un dispositivo cromatográfico radial Chromatotron (Harrison Research, Palo Alto, California) o por HPLC usando una columna de fase inversa C-18. Los disolventes típicos usados fueron diclorometano, metanol, acetato de etilo y trietilamina.

Ejemplo 2 Síntesis de 1-[(terc-butil)oxicarbonil]-4-oxopiperidin-3-carboxilato de metilo

Se llevaron a cabo HPLC en un módulo de separación Waters 2690, usando una columna ReliaSil C-18 de 5 \mu de Column Engineering (50 x 4,6 mm) con un gradiente que asciende de acetonitrilo al 5% a 80% en agua en 18 minutos.

Se añadió dicarbonato de di-terc-butilo (6,76 g, 3,10 mmol) en porciones a una solución de 4-oxopiperidin-3-carboxilato de metilo (5,0 g, 25,8 mmol), hidróxido de sodio (1,24 g, 31,0 mmol) en 1,4-dioxano y agua (60 ml:30 ml). Se agitó la solución resultante a temperatura ambiente durante la noche. Se repartió la mezcla de reacción entre acetato de etilo y agua. Se separó la fase orgánica y se lavó con salmuera, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró a vacío para dar rendimiento cuantitativo de 1-[(terc-butil)oxicarbonil]-4-oxopiperidin-3-carboxilato de metilo como un aceite amarillo viscoso. El producto bruto dio RMN satisfactorio y se usó en la siguiente etapa sin puri-
ficación.

Ejemplo 3 Síntesis de 2-metiltio-4-oxo-3,5,6,7,8-pentahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo

Se calentó a 80ºC durante la noche en nitrógeno la suspensión que contiene 1-[(terc-butil)oxicarbonil]-4-oxopiperidin-3-carboxilato de metilo (6,64 g, 25,8 mmol), sulfatode 2-metil-2-tiopseudourea (7,19 g, 25,8 mmol) y carbonato de cesio (16,8 g, 51,6 mmol) en 1-metil-2-pirrolidinona (100 ml). Se añadió agua a la mezcla de reacción para dar una solución homogénea, que se ajustó a pH 4 ó 5 usando ácido acético glacial. Se formó precipitado blanco durante este proceso. Se filtró la mezcla. Se lavó el sólido recogido con agua y acetato de etilo para dar 2-metiltio-4-oxo-3,5,6,7,8-pentahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo (3,0 g) como un polvo blanco. Se repartió el producto filtrado entre acetato de etilo y agua. Se separó la fase orgánica y se lavó con salmuera, se secó (MgSO_{4}) y se filtró. La concentración del producto filtrado a vacío dio un sólido amarillo, que se trituró con éter para dar más 2-metiltio-4-oxo-3,5,6,7,8-pentahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo (1,0 g, rendimiento total 52%) como un polvo esponjoso blanco.

HPLC [procedimiento AZ-S], 6,78 min (100%)

EM (M+H/Z), 298.

Ejemplo 4 Síntesis de 4-cloro-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo

Se añadió gota a gota a 0ºC a una solución de 2-metiltio-4-oxo-3,5,6,7,8-pentahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo (820 mg, 2,76 mmol) en diclorometano (50 ml) cloruro de oxalilo (261 ml, 3,03 mmol). A esto se añadió dos gotas de N,N-dimetilformamida y se calentó lentamente la solución resultante hasta temperatura ambiente durante 1 hora. La concentración de la mezcla de reacción dio una mezcla sólido/aceite amarilla, que se filtró a través de un lecho de gel de sílice y se lavó con éter. La concentración del producto filtrado y aguas de lavado dio 4-cloro-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de tec-butilo (850 mg, rendimiento del 97%) como una espuma pegajosa amarilla.

HPLC [procedimiento AZ-S], 12,04 min (100%)

EM (M+H/Z), 316.

Ejemplo 5 Síntesis de 4-(2,4-diclorofenil)-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo

Se calentó a reflujo durante 19 horas en nitrógeno una mezcla de 4-cloro-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de tec-butilo (334 mg, 1,06 mmol), ácido 2,4-diclorobencenoborónico (222 mg, 1,16 mmol), bis(dibencilidenacetona)paladio(0) (48 mg, 0,053 mmol) y 1,4-bis(difenilfosfino)butano (45 mg, 0,11 mmol) en tolueno (2 ml), solución de carbonato de sodio 1M acuosa (1 ml) y etanol (0,5 ml). Se enfrió luego la mezcla de reacción, se añadió agua, y se separó la fase de tolueno. Se extrajo la fase acuosa con acetato de etilo y se secaron los extractos orgánicos reunidos (MgSO_{4}), se filtraron, y se concentró el producto filtrado a vacío. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía en columna usando acetona al 15% en hexanos como eluyente, dando 4-(2,4-diclorofenil)-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo (471 mg, rendimiento > 100%) como una espuma pegajosa ligeramente amarilla.

HPLC [procedimiento AZ-S], 14,09 min (75%); EM (M+H/Z), 426.

Ejemplo 6 Síntesis de 4-(2,4-diclorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo

Se añadió a una solución de 4-(2,4-diclorofenil)-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo (383 mg, 0,898 mmol) en diclorometano (10 ml) ácido 3-cloroperbenzoico (680 mg, 57-86%, 2,25 mmol) en porciones. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 4 horas, se vertió en un embudo de separación que contiene solución de carbonato de sodio al 10% acuosa y diclorometano. Se separa la fase orgánica, se lava con sulfito de sodio al 10%, salmuera, se secó (MgSO_{4}) y se filtró. La concentración del producto filtrado dio 4-(2,4-diclorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo (430 mg, rendimiento bruto > 100%) como una espuma/sólido ligeramente amarillo.

HPLC [procedimiento AZ-S], 11,93 min (83%);

EM (M+H/Z), 458.

Ejemplo 7 Procedimiento general para desplazamiento de la amina de la sulfona, eliminación del grupo Boc y preparación de la sal del ácido clorhídrico del producto final

Se calentó a 80ºC durante la noche una solución de sulfona (1 mmol) y amina (2 mmol) en acetonitrilo (1 ml). La concentración de la mezcla de reacción dio producto bruto, que se purificó mediante cromatografía ultrarrápida usando metanol al 3% en diclorometano como eluyente. El producto resultante así obtenido se disolvió luego en acetonitrilo (4 ml) y ácido clorhídrico acuoso (0,5 ml, 37%). Se agitó la solución homogénea a temperatura ambiente durante la noche y se liofilizó para proporcionar el producto final como una sal del ácido clorhídrico.

Los siguientes compuestos se prepararon usando el anterior procedimiento:

Clorhidrato de [4-(2,4-diclorofenil)(5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-2-il)]{2-[(5-nitro(2-piridil)amino]etil}amina

La reacción de 4-(2,4-diclorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo y 2-(2-aminoetilamino)-5-nitropiridina dio 4-(2,4-diclorofenil)-2-({2-[(5-nitro(2-piridil))-amino]etil}ami-
no)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo.

HPLC [procedimiento AZ-S], 11,83 min (91%);

EM (M+H/Z), 560.

El tratamiento con HCl y liofilización dio clorhidrato de [4-(2,4-diclorofenil)(5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-2-il)]{2-[(5-nitro(2-piridil)amino]etil}amina.

HPLC [procedimiento AZ-S], 6,52 min (80%);

EM (M+H/Z), 460.

Clorhidrato de {2-[(6-amino-5-nitro(2-piridil))amino]etil}[4-(2,4-diclorofenil)(5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-2-il)]amina

La reacción de 4-(2,4-diclorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo y 2-amino-3-nitro-6-(2-amino-etilamino)piridina dio 2-({2-[(6-amino-5-nitro(2-piridil))amino]etil}amino)-4-(2,4-diclorofenil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo.

HPLC [procedimiento AZ-S], 10,98 min (100%);

EM (M+H/Z), 575.

El tratamiento con HCl y liofilización dio clorhidrato de {2-[(6-amino-5-nitro(2-piridil))amino]etil}[4-(2,4-diclorofenil)(5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-2-il)]amina.

HPLC [procedimiento AZ-S], 5,79 min (95%);

EM (M+H/Z), 475.

Clorhidrato de 6-[(2-{[4-(2,4-diclorofenil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-2-il]amino}etil)amino]piridin-3-carbonitrilo

La reacción de 4-(2,4-diclorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo y 2-(2-aminoetilamino)-5-cianopiridina dio 4-(2,4-diclorofenil)-2-({2-[(5-ciano(2-piridil))-amino]etil}
amino)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo.

HPLC [procedimiento AZ-S], 10,66 min (100%);

EM (M+H/Z), 540.

El tratamiento con HCl y liofilización dio clorhidrato de 6-[(2-{[4-(2,4-diclorofenil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-2-il]amino}etil)amino]piridin-3-carbonitrilo.

HPLC [procedimiento AZ-S], 5,18 min (80%);

EM (M+H/Z), 440.

Ejemplo 8 Síntesis de 4-(2,4-diclorofenoxi)-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo

Se calentó a reflujo durante la noche una mezcla de 4-cloro-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo (100 mg, 0,317 mmol), 2,4-diclorofenol (57 mg, 0,348 mmol) y bis(trimetilsilil)amida de sodio (solución 1,0 M en THF, 412 \mul, 0,412 mmol) en tetrahidrofurano (2 ml). Se repartió la mezcla entre acetato de etilo y agua. Se separó la fase orgánica y se lavó con salmuera, se secó (MgSO_{4}) y se filtró. La concentración del producto filtrado dio producto bruto (180 mg), que se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (metanol al 0,5% en diclorometano como eluyente) para dar 4-(2,4-diclorofenoxi)-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo como una espuma blanca (52 mg, rendimiento del 37%).

HPLC [procedimiento AZ-S], 15,93 min (100%);

EM (M+H/Z), 442.

Ejemplo 9 Síntesis de 4-(2,4-diclorofenoxi)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo

Siguiendo el ejemplo 6, la oxidación de 4-(2,4-diclorofenoxi)-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo (52 mg, 0,118 mmol) con ácido 3-cloroperbenzoico dio 4-(2,4-diclorofenoxi)-
2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo en rendimiento cuantita-
tivo.

HPLC [procedimiento AZ-S], 12,85 min (95%);

EM (M+H/Z), 474.

Ejemplo 10 Síntesis de clorhidrato de {2-[(6-amino-5-nitro(2-piridil))amino]etil}{4-[(2,4-diclorofenil)-oxi](5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-2-il)}amina

Siguiendo el ejemplo 7, el tratamiento de 4-(2,4-diclorofenoxi)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo con 2-amino-3-nitro-6-(2-aminoetilamino)piridina dio 2-({2-[(6-amino-5-nitro(2-iridil))amino]etil}amino)-4-(2,4-diclorofenoxi)-5,6,7,8-tetrahidropirido[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo.

HPLC [procedimiento AZ-S], 10,76 min (95%);

EM (M+H/Z), 591.

El tratamiento con HCl y liofilización dio el clorhidrato de {2-[(6-amino-5-nitro(2-piridil))amino]etil}{4-[(2,4-diclorofenil)oxi](5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-2-il)}amina

HPLC [procedimiento AZ-S], 5,18 min (99%);

EM (M+H/Z), 491.

Ejemplo 11 Síntesis de 4-[(2,4-diclorofenil)amino]-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo

Se calentó a reflujo durante la noche una mezcla de 4-cloro-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo (100 mg, 0,317 mmol), 2,4-dicloroanilina (56 mg, 0,348 mmol) y bis(trimetilsilil)amida de sodio (solución 1,0 M en THF, 412 \mul, 0,412 mmol) en tetrahidrofurano (2 ml). Se repartió la mezcla entre acetato de etilo y agua. Se separó la fase orgánica y se lavó con salmuera, se secó (MgSO_{4}) y se filtró. La concentración del producto filtrado dio el producto bruto, que se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (metanol al 0,5% en diclorometano como eluyente) para dar 4-[(2,4-diclorofenil)amino]-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo como un aceite amarillo claro (85 mg, rendimiento del 61%).

HPLC [procedimiento AZ-S], 9,88 min (100%);

EM (M+H/Z), 441.

Ejemplo 12 Síntesis de 4-[(2,4-diclorofenil)amino]-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo

Siguiendo el ejemplo 6, la oxidación de 4-[(2,4-diclorofenil)amino]-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo (84,7 mg, 0,192 mmol) con ácido 3-cloroperbenzoico dio 4-[(2,4-diclorofenil)amino]-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo en rendimiento cuantitativo.

HPLC [procedimiento AZ-S], 11,40 min (95%);

EM (M+H/Z), 473.

Ejemplo 13 Síntesis de clorhidrato de {2-[(6-amino-5-nitro(2-piridil))amino]etil}{4-[(2,4-diclorofenil)amino](5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-2-il)]amina

Siguiendo el ejemplo 7, el tratamiento de 4-[(2,4-diclorofenil)amino]-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo con 2-amino-3-nitro-6-(2-aminoetilamino)piridina dio 2-({2-[(6-amino-5-nitro(2-piridil))amino]etil}amino)-4-[(2,4-diclorofenil)amino](5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo.

HPLC [procedimiento AZ-S], 9,47 min (95%); EM (M+H/Z), 590.

El tratamiento con HCl y liofilización dio clorhidrato de {2-[(6-amino-5-nitro(2-piridil))amino]etil}{4-[(2,4-diclorofenil)amino](5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-2-il)]amina.

HPLC [procedimiento AZ-S], 4,81 min (99%);

EM (M+H/Z), 490.

Ejemplo 14 Síntesis de 4-(2,4-difluorofenil)-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo

Siguiendo el ejemplo 5, el acoplamiento de 4-cloro-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo (1,94 mg, 6,14 mmol) con ácido 2,4-diclorobencenoborónico (1,07 g, 6,76 mmol) dio 4-[(2,4-difluorofenil)-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo como una espuma blanca (1,54 g, rendimiento del 64%).

HPLC [procedimiento AZ-S], 13,21 min (95%);

EM (M+H/Z), 394.

Ejemplo 15 Síntesis de 4-(2,4-difluorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo

Siguiendo el ejemplo 6, la oxidación de 4-(2,4-difluorofenil)-2-metiltio-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo (1,54 g, 3,91 mmol) con ácido 3-cloroperbenzoico (2,48 g, 8,61 mmol) dio 4-(2,4-difluorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo como una espuma blanca en rendimiento cuantitativo.

HPLC [procedimiento AZ-S], 10,34 (95%);

EM (M+H/Z), 426.

Ejemplo 16 Síntesis de 4-(2,4-diclorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidina

Se añadió a una solución de 4-(2,4-diclorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-6-carboxilato de terc-butilo (100 mg, 0,218 mmol) en diclorometano (2 ml) ácido trifluoroacético (1 ml) con cuidado. Se agitó la solución resultante a temperatura ambiente durante 2 horas, se concentró y se secó a alto vacío para dar 4-(2,4-diclorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidina en cuantitativo.

HPLC [procedimiento AZ-S], 4,74 (86%);

EM (M+H/Z), 358.

Ejemplo 17 Síntesis de 6-acetil-4-(2,4-diclorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidina

Se añadió gota a gota a una solución de 4-(2,4-diclorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidina (100 mg, 0,279 mmol), trietilamina (78 \mul, 0,558 mmol) en diclorometano (2 ml) anhídrido acético (53 \mul, 0,558 mmol). Se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante la noche. Se repartió la mezcla entre acetato de etilo y agua. Se separó la fase orgánica y se lavó con salmuera, se secó (MgSO_{4}) y se filtró. La concentración del producto filtrado dio el producto bruto 6-acetil-4-(2,4-diclorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidina en rendimiento cuantitativo.

HPLC [procedimiento AZ-S], 7,09 (81%);

EM (M+H/Z), 400.

Ejemplo 18 Síntesis de 6-acetil-2-({2-[6-amino-5-nitro(2-piridil))amino]etil}amino)-4-(2,4-diclorofenil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidina

Siguiendo el ejemplo 7, la reacción de 6-acetil-4-(2,4-diclorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidina y con 2-amino-3-nitro-6-(2-aminoetilamino)piridina dio 6-acetil-2-({2-[6-amino-5-nitro(2-piridil))
amino]etil}amino)-4-(2,4-diclorofenil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidina.

HPLC [procedimiento AZ-S], 7,23 (96%);

EM (M+H/Z), 517.

Ejemplo 19 Síntesis de 6-[(2-{[6-acetil-4-(2,4-diclorofenil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-2-il]amino}etil)amino]piridin-3-carbonitrilo

Siguiendo el ejemplo 7, la reacción de 6-acetil-4-(2,4-diclorofenil)-2-(metilsulfonil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidina y 2-(2-aminoetilamino)-5-cianopiridina dio 6-[(2-{[6-acetil-4-(2,4-diclorofenil)-5,6,7,8-tetrahidropiridino[4,3-d]pirimidin-2-il]amino}etil)amino]piridin-3-carbonitrilo.

HPLC [procedimiento AZ-S], 6,87 (90%);

EM (M+H/Z), 482.

Ejemplo 20 Seguimiento de la actividad inhibidora de GSK3 usando un ensayo sin células

Se disolvieron los compuestos de pirimidina y piridina de la presente invención en DMSO, luego se ensayaron en cuanto a la inhibición de GSK3\beta humana (la secuencia de nucleótidos para la GSK3\beta humana aparece en GenBank con el número de acceso L33801). La expresión de GSK3\beta se describe, por ejemplo, en Hughes y col., Eur J. Biochem., 203: 305-11 (1992), que se incorpora a esta invención como referencia.

Se dispensó una alícuota de 300 \mul de tampón sustrato (tris-HCl 30 mM, MgCl_{2} 10 mM, DTT 2 mM, 3 \mug/ml de GSK3\beta y péptido CREB unido a SGSG prefosforilado biotinilado 0,5 \muM (Chiron Technologies PTY Ltd., Clayton, Australia) a pocillos de una placa de microtitulación de polipropileno de 96 pocillos. Se añadió 3,5 \mul/pocillo de DMSO que contiene concentraciones variables de cada compuesto que se ha de ensayar o estaurosporina (un conocido inhibidor de quinasa usado como un control positivo, o un control negativo (es decir, DMSO sólo), y se mezcló completamente. Se iniciaron luego las reacciones mediante adición de 50 \mul/pocillo de ATP no marcado 1 \muM y de 1 a 2 x 10^{7} cpm de ATP marcado con \gamma^{33}P, y se dejó que la reacción progresase durante aproximadamente tres horas a temperatura ambiente.

Mientras tenía lugar la reacción se bloquearon las placas de captura "Combiplate 8" de Labsystems recubiertas de estreptavidina (Labsystems, Helsinki, Finlandia) mediante incubación de estas con 300 \mul/pocillo de PBS que contiene albúmina de suero bovino al 1% durante al menos una hora a temperatura ambiente. Se eliminó luego la solución de bloqueo mediante aspiración, y se rellenaron las placas de captura con 100 \mul/pocillo de reactivo de detención (ATP 50 \muM/EDTA 20 mM).

Cuando hubo finalizado la reacción enzimática de tres horas, se transfirieron por triplicado alícuotas de 100 \mul de cada mezcla de reacción a tres pocillos que contienen solución de detención, un pocillo en cada una de las tres placas de captura, y se mezclaron bien los contenidos del pocillo. Después de una hora a temperatura ambiente se vaciaron los pocillos de las placas de captura mediante aspiración y lavado cinco veces usando PBS y un lavador de placa ELISA Corning 430474 de 12 canales. Finalmente, se añadió 200 \mul de fluido de centelleo Microscint-20 a cada pocillo de la placa. Se recubrieron las placas con sellantes de placa, luego se dejaron en un agitador durante 30 minutos. Se sometió a recuento cada placa de captura en un contador de centelleo Packard TopCount (Meridian, Connecticut) y se representaron los resultados como una función de la concentración de compuesto.

Se clasificaron luego los compuestos de la presente invención en cuanto a la actividad inhibidora frente a GSK3 de acuerdo con este ensayo. Los compuestos de los ejemplos 3 a 19 mostraron CI_{50} de 1 \muM o inferior respecto a GSK3 en este ensayo sin células.

De acuerdo con lo anterior, estos resultados demuestran que los compuestos de la presente invención muestran actividad inhibidora frente a GSK3.

Ejemplo 21 Clasificación de la actividad inhibidora de GSK3 usando un ensayo de glucógeno sintasa basado en células

Se mantienen células CHO-HIRC en placas de cultivo de tejido de 10 cm en medio F12 de Ham/suero bovino fetal dializado al 10%. Se cosechan las células de una placa de 10 cm confluente y se dividen en los 6 pocillos de una placa de cultivo de tejido de 6 pocillos hasta un volumen final de 2 ml de medio. Se dejan las células crecer a 37ºC durante 24 horas. Se lavan luego las células tres veces en medio F12 de Ham que no contiene suero bovino fetal y finalmente se dejan las células durante unas 24 horas más a 37ºC en 2 ml del medio sin suero.

Al final de este tiempo se añade 20 \mul de compuesto disuelto en DMSO a cada pocillo y se incuba a 37ºC. Después de 20 minutos se elimina el medio y se lavan las células una vez en PBS a temperatura ambiente y luego se congelan rápidamente en las placas en nitrógeno líquido. Se descongelan luego las células sobre hielo en presencia de 140 \mul de tampón de lisis (tris 50 mM pH 7; EDTA 1 mM, NaF 100 mM, leupeptina 25 \mug/ml, DTT 1 mM, PMSF 1 mM) por pocillo. Se raspan las células de las placas y se congelan en tubos Eppendorf sobre hielo seco. Se descongelan luego los lisados y se recongelan sobre hielo seco.

Tras re-descongelación se agitan los lisados a 14.000 g durante 15 minutos. Se toman luego los sobrenadantes y se almacenan en hielo. Cada sobrenadante (45 \mul) se añade a 45 \mul de tampón de reacción (Tris 65 mM pH 7,8; EDTA 26 mM, KF 32,5 mM, UDP-glucosa 9,3 mM; glucógeno 11 mg/ml; ^{14}C-UDP-glucosa 500 nCi/ml) y se añade 45 \mul más a 45 \mul de tampón de reacción/glucosa-6-fosfato 20 mM. Se incuban las reacciones a 30ºC durante 30 minutos y luego se salpica sobre un papel cromatográfico 31ET cuadrado de 2 cm (Whatman). Se lavan los papeles de filtro dos veces durante 20 minutos en etanol al 66%, se lavan brevemente en acetona y se secan durante 1 hora a temperatura ambiente.

Se añaden los filtros a 5 ml de material de centelleo líquido y se cuenta en un contador de centelleos. Se expresa el porcentaje de glucógeno sintasa total que es activo en cualquier lisado como 100X (cpm menos glucosa-6-fosfato)/(cpm más glucosa-6-fosfato). Tales valores se determinan por duplicado para 5 concentraciones diferentes del compuesto y para el DMSO sólo, y se representan luego los valores frente al logaritmo de la concentración. La concentración del compuesto que estimula la actividad de glucógeno sintasa hasta el 50% del nivel máximo se determina mediante ajuste de una curva sigmoidal a los datos representados. El nivel máximo se define como aquel nivel al que tiende la actividad de glucógeno sintasa asimtóticamente cuando la concentración del compuesto de ensayo aumenta sustancialmente más allá de la CE_{50}.

Ejemplo 22 Seguimiento de inhibición de la fosforilación de la proteína tau A. Trasnfección transitoria de células COS con plásmido de expresión de GSK3 y expresión de tau Construcción del plásmido

Se mantienen células COS en frascos de cultivo de tejido T25 en medio MEM con gran cantidad de glucosa/suero bovino fetal al 5%. Se cosechan células de un matraz T25 confluente y se siembren 80.000 células/pocillo en placas de cultivo de tejido de 6 pocillos Corning en un volumen final de 2 ml/pocillo de medio. Se dejan crecer las células a 37ºC durante 48 horas. Se lavan luego las células dos veces en Opti-MEM que no contiene suero bovino fetal, y finalmente se dejan las células en 1 ml de Opti-MEM.

Se subclona el polinucleótido que codifica la proteína tau en plásmido pSG5 bajo un promotor SV40 precoz para generar un plásmido de expresión de tau. La clonación del ADNc que codifica la proteína tau se describe en general por parte de Goedert y col., EMBO Journal, 8(2): 393-399 (1989), que se incorpora a esta invención como referencia. Se prepara un plásmido de expresión de GSK3 mediante subclonación de polinucleótido que codifica GSK3\beta en pCG, que es un derivado de ApEVRF descrito por Giese y col., Genes & Development, 9: 995-1008 (1995) y Matthias y col., Nucleic Acid Research, 17: 6418 (1989), ambos se incorporan a esta invención como referencia.

Se preparan las siguientes soluciones en tubos Eppendorf de 1,5 ml: solución A: para cada transfección, se diluyen 2 \mug de ADN (plásmido de expresión de tau) y 0,7 \mug de ADN (plásmido de expresión de GSK3) en 100 \mul de Opti-MEM (Gibco BRL); solución B: para cada transfección, se diluyen 8 \mul de reactivo de lipofectamina en 100 \mul de Opti-MEM. Se combinan las dos soluciones, se mezclan vigorosamente, y se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos para dejar que se formen los complejos de ADN-liposoma. Para cada transfección se añade 0,8 ml de Opti-MEM al tubo que contiene los complejos. Se mezcla vigorosamente la solución diluida y se extiende sobre las células lavadas. Se incuban las células con el ADN/lipofectamina complejado durante 6 horas a 37ºC en un incubador de CO_{2}. Tras la incubación se añade 1 ml de medio de crecimiento (MEM con alto contenido en glucosa) con FBS al 20% a cada pocillo y se incuba a 37ºC durante la noche. Se sustituye el medio con medio fresco completo a las 18 horas tras el comienzo de la transfección, y se dejan las células crecer a 37ºC durante otras 48 horas.

B. Ensayo de inhibición de fosforilación de tau

Dos horas antes de la cosecha, se añaden 2 \mul de compuesto de ensayo (inhibidor de GSK3) disuelto en DMSO a cada pocillo y se incuba a 37ºC. Después de 2 horas se elimina el medio y se congelan rápidamente las células en las placas sobre hielo seco y se almacenan a -70ºC. Se descongelan las células sobre hielo en presencia de 200 \mul de tampón de lisis (Triton® X-100 al 1%, Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 137 mM, glicerol al 15%, 25 \mug/ml de leupeptina, 1 \mug ml de pepstatina-A, PMSF 1 \muM, 21 \mug/ml de aproptinina, NaF 50 mM, \beta-glicerofosfato 50 mM, pirofosfato de sodio 15 mM, ortovanadato de sodio 1 mM). Se centrifugan los contenidos de cada pocillo a 14.000 g, a 4ºC durante 5 minutos y se transfieren los sobrenadantes a tubos limpios. En este momento se pueden almacenar los lisados a -20ºC.

C. ELISA para detectar tau fosforilada en lisados de células

Se recubren 4 tiras Immulon (Dynatech) con tau antifosforilada monoclonal (AT8, Polymedco, Inc.) a 5 \mug/ml en PBS que contiene Ca++ y Mg++, 100 \mug/pocillo. Después de incubación durante la noche a 4ºC, se lavan las tiras dos veces con tampón de lavado (PBS que contiene Tween® 20 al 0,05%) y se bloquea con PBS que contiene BSA al 1%, suero de ratón normal al 5% y Tween® 20 al 0,05% a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavan las tiras 5 veces con tampón de lavado. Se añade lisado (100 \mul) diluido a 1:10 en PBS que contiene BSA al 1%, NaN_{3} al 0,1% a cada pocillo y se incuba a temperatura ambiente durante una hora. Después del lavado, se añade a cada pocillo 100 \mul de tau anti(no-fosforilado) monoclonal biotinilado 0,5 \mug/ml (HT7, Polymedco, Inc.) en PBS-BSA. Se lavan las tiras 5 veces y se añade estreptavidina conjugada con HRP, incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos y se lava de forma extensiva con tampón de lavado. Se usa sustrato TMB (Pierce) para el desarrollo del color y se detiene la reacción mediante adición de un volumen igual de ácido sulfúrico 0,8 M. Se leen las tiras en un lector de placa ELISA usando un filtro de 450 nm. Se determina la concentración del compuesto que inhibe la fosforilación de tau en el 50% del nivel máximo (es decir, CI_{50}) mediante ajuste de una curva sigmoidal a los datos representados.

Ejemplo 23 Ensayo del potencial de los inhibidores de GSK3 para proteger las células del hipocampo primario de la excitotoxicidad del glutamato

Se diseccionaron hipocampos de ratas embriónicas de 18 a 19 días. Se recogió el tejido en medio Hibernate TM (Gibco BRL) y se desmenuza en piezas de aproximadamente 1 mm. Se disocia el tejido usando el sistema de disociación Papain (Worthington Biochemical Corporation). Tras el aislamiento se resuspendieron las células en medio libre de suero compuesto por Neurobasal TM (Gibco BRL), suplemento B27 al 2% (Gibco BRL), L-glutamina y antibióticos. Se dispusieron las células en discos de cultivo de tejido de 35 mm recubiertos con poli-L-lisina a una concentración de 7,5 x 10^{4} células por disco. Después de 10 a 14 días a 37ºC en CO_{2} al 5% se lavaron las células y se alimentaron con medio fresco. El siguiente día se añadieron compuestos representativos de la invención al medio de cultivo hasta una concentración final de entre 1 nM y 100 \muM. Cuatro a ocho horas tras la adición del compuesto se eliminó el medio acondicionado de las células y se almacenaron a 27ºC. Se lavaron los cultivos dos veces con solución salina equilibrada tamponada con HEPES (HBSS) que contiene glicina 10 \muM. Grabb y Choi, J.Neuroscience 19: 1657-62 (1999). Se expusieron luego los cultivos durante 5 minutos a temperatura ambiente a ácido glutámico 200 \muM en el mismo HBSS. Tras la exposición se lavaron los cultivos tres veces con el tampón y luego se devolvieron a su medio acondicionado original que contiene los compuestos. De veinte a veinticuatro horas tras la exposición a ácido glutámico se lavaron los cultivos en HBSS y se expusieron durante 10 minutos a azul de tripano. Este tinte es captado por las células muertas. Se lavaron los cultivos y luego se fijaron durante 30 minutos en paraformaldehído al 4%. Se recuenta el número de neuronas grandes vivas y muertas (núcleos azules) (al menos 200 células de cada cultivo) mediante microscopía por contraste de fase y se fotografían. Usando este procedimiento los compuestos de esta invención han demostrado ser capaces de reducir de forma significativa el potencial del glutamato para inducir la muerte celular neuronal.

Ejemplo 24 Evaluación de la eficacia en roedores diabéticos (El ensayo de tolerancia a la glucosa) Formulación de compuesto para dosificación por vía oral

De forma típica se formularon compuestos de ensayo para toma por vía oral como soluciones en agua o suspensiones en carboximetilcelulosa al 1%/tween-80 al 0,1% (ambos de Sigma Chem., MO) el día anterior a la administración. Algunos compuestos precoces se formularon como soluciones en Captisol al 15% (una ciclodexitrina modificada por CyDex Co., IL) siguiendo procedimientos comunes a los siguientes. Para soluciones en agua, se solubiliza el polvo de compuesto de ensayo seco y liofilizado en agua destilada y se mezcla bien mediante agitación y ultrasonidos. En caso necesario, se ajusta el pH de la solución de ensayo con NaOH 1 N o HCl 1 N y se filtra finalmente en condiciones de esterilidad a través de una jeringuilla equipada con una membrana de acetato de celulosa de 0,2 micrómetros (Millipore Co., MA). Para administración por vía oral se mezcla el polvo del compuesto de ensayo con una suspensión fresca de carboximetilcelulosa al 1%/tween-80 al 0,1% y se somete a ultrasonidos de forma extensiva, se ajusta el pH en caso de necesidad como se ha descrito anteriormente, y se agita hasta que el tamaño de partícula sea homogéneo y < 10 micrómetros de tamaño.

Ensayo de tolerancia a la glucosa en ratón diabético:

Se adquirieron ratones obesos db/db (C57BlKs/J hembras) a Jackson Labs (Bar Harbor, ME) de 8 semanas de edad y se usaron para el ensayo de eficacia 1 a 2 semanas después. En la mañana de un ensayo se retiró pronto la alimentación por la mañana (7 a 8 horas antes del bolo de glucosa). Se aplicó anestesia local (EMLA cr\thetame, Astra Pharm, MA) en el extremo de la cola y se tomaron muestras de sangre de 50 a 100 \mul de cortes en la punta de la cola y se recogió en tubos Eppendorf que contienen 5 \mul de heparina sódica 500 U/ml (Elkins-Sinn, NJ) con el posterior aislamiento de plasma. Se tomaron muestras a distintos intervalos a lo largo del día para un total de 6 a 8 momentos temporales. Se agruparon aleatoriamente los ratones en grupos de tratamiento y se les administró la primera dosis por vía oral del compuesto de ensayo (volumen de 0,2 ml) 4,5 horas antes que la glucosa y de nuevo 0,5 horas antes de la administración de 0,2 ml de dextrosa al 50% (Abbott Lab., IL) mediante toma por vía oral (oGTT) o inyección por vía intraperitoneal. Después de la muestra de sangre final aproximadamente 2 horas tras la administración de glucosa, se devolvió el alimento a los animales.

Regulación de la glicemia e insulinemia basales:

Se administraron de forma típica por vía oral compuestos de ensayo a ratones db/db (véase anteriormente) o a ratas ZDF (Genetic Models, Inc.; Indianápolis, IN) en el contexto de un régimen multi-día, multi-dosis o como un bolo único. Las ratas ZDF se recibieron a las 8 semanas de edad y se usaron para el ensayo de eficacia 1 a 2 semanas después. Se retiró el alimento aproximadamente 30 minutos antes de la dosificación y se administró un bolo único del compuesto de ensayo (volumen de dosificación que varía de 1 a 8 mg/ml). Se toma muestras de sangre como se ha descrito anteriormente en 1 a 6 momentos temporales durante las siguientes 2 a 3 horas. Se devolvió el alimento a las jaulas de los animales tras el muestreo de sangre.

Puntos finales primarios

Se miden niveles de glucosa e insulina de muestras de plasma y/o sangre. Los niveles de glucosa son medidos en sangre completa mediante el glucómetro One-Touch (Lifescan Co., CA) y en plasma mediante el analizador de glucosa Beckman. Los resultados de la glucosa reflejan típicamente valores en sangre para ratón y valores en plasma para estudios en rata. La medida de los niveles de insulina ha sido mediante ELISA (Cristal Chem. Co., IL) siguiendo el protocolo del suministrador.

Cuantificación de los resultados

Se puede expresar la eficacia como mg/dL de glucosa o ng/ml de insulina o representar como el área bajo la curva (AUC) para la glucosa en plasma (tomada por encima del basal normoglicémico de 100 mg/dL) e insulina (tomada por encima del basal normoinsulinémico de 1 ng/ml). De forma típica, cuando se expresa como AUC, los resultados se representan exactamente como AUC reducida ([AUC del control vehículo - AUC del grupo de ensayo) / AUC del control vehículo x 100]). Tal expresión proporciona una expresión cuantitativa única de la mayor eliminación de glucosa y/o hiperglicemia basal reducida o conservación de insulina respecto al grupo de control con placebo.

Resultados

Los compuestos representativos de la invención mostraron buena potencia in vitro, y cuando se formularon en captisol y administraron por vía subcutánea a ratones (30 mg/kg), mostraron alta biodisponibilidad y penetración en tejido in vivo. Se observaron una reducción significativa en hiperglicemia basal justo antes del ensayo de tolerancia a la glucosa, y eliminación de glucosa mejorada significativamente tras exposición a glucosa. Se observó una reducción del 45-50% en la AUC respecto al grupo de control si la respuesta a la glucosa se cuantifica mediante la determinación del área bajo la curva de glucosa en sangre (AUC) desde -60 minutos a +120 minutos. Esto es comparable a la eficacia obtenida con troglitazona (cuando se dosificaba por vía oral durante al menos varios días bien a 60 o 100 mg/kg/día). También era significativa la observación de que los niveles de insulina en animales tratados permanecían por debajo a los de los ratones de control.

Claims

1. Un compuesto de estructura (I):

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25

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en la que:

X e Y son nitrógeno;

A_{1} es arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido;

A_{2} es arilo, ariloxi, arilamino o heteroarilo opcionalmente sustituidos;

R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, hidroxilo, y alquilo inferior, cicloalquilo inferior, alquilaminoalquilo, alcoxi inferior, amino, alquilamino, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, heteroaralquilcarbonilo, arilo y heteroarilo opcionalmente sustituidos;

R_{5}, R_{6} y R_{7} se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, hidroxi, halo, carboxilo, nitro, amino, amido, amidino, imido, ciano y alquilo inferior sustituido o no sustituido, alcoxi inferior, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, heteroaralquilcarbonilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, aralquilcarboniloxi, alquilaminocarboniloxi, arilaminocarboniloxi, formilo, alquil inferior-carbonilo, alcoxi inferior-carbonilo, aminocarbonilo, aminoarilo, alquilsulfonilo, sulfonamido, aminoalcoxi, alquilamino, arilamino, aralquilamino, heteroarilamino, heteroaralquilamino, alquilcarbonilamino, alquilaminocarbonilamino, arilaminocarbonilamino, aralquilcarbonilamino, heteroaralquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, heteroarilcarbonilamino, amidino, cicloalquilo, cicloamido, ciclotioamido, cicloamidino, heterocicloamidino, cicloimido, heterocicloimido, guanidinilo, arilo, biarilo, heteroarilo, heterobiarilo, heterociclo, heterocicloalquilo, arilsulfonilo y arilsulfonamido;

y las sales farmacéuticas de los mismos.

2. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que al menos uno de A_{1} y A_{2} es un anillo aromático que tiene de 3 a 10 átomos de carbono en el anillo y opcionalmente 1 o más heteroátomos en el anillo.

3. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que A_{2} es arilo, arilamino o ariloxi carbocíclico opcionalmente sustituidos.

4. Un compuesto de la reivindicación 2, en el que al menos uno de A_{1} y A_{2} es heteroarilo opcionalmente sustituido.

5. Un compuesto de la reivindicación 2, en el que A_{2} se selecciona del grupo constituido por fenilamino y feniloxi sustituidos o no sustituidos.

6. Un compuesto de la reivindicación 2, en el que al menos uno de A_{1} y A_{2} se selecciona del grupo constituido por piridilo, pirimidinilo, tiazolilo, indolilo, imidazolilo, oxadiazolilo, tetrazolilo, pirazinilo, triazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, purinilo, naftilo, benzotiazolilo, benzopiridilo y bencimidazolilo sustituidos o no sustituidos.

7. Un compuesto de la reivindicación 2, en el que al menos uno de A_{1} y A_{2} está sustituido con al menos uno y no más de 3 grupos de sustitución.

8. Un compuesto de la reivindicación 7, en el que dichos grupos de sustitución se seleccionan independientemente del grupo constituido por nitro, amino, ciano, halo, tioamido, amidino, oxamidino, alcoxiamidino, imidino, guanidino, sulfonamido, carboxilo, formilo, alquilo inferior, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, alquil inferior-aminoalcoxi inferior, alquil inferior-carbonilo, aralquil inferior-carbonilo, heteroaralquil inferior-carbonilo, alquiltio, aminoalquilo y cianoalquilo.

9. Un compuesto de la reivindicación 2, en el que A_{2} tiene la fórmula:

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26

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en la que L es -NH- u -O-, y

R_{8} y R_{9} se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, nitro, amino, ciano, halo, tioamido, amidino, oxamidino, alcoxiamidino, imidino, guanidinilo, sulfonamido, carboxilo, formilo, alquilo inferior, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, alquil inferior-aminoalcoxi inferior, alquil inferior-carbonilo, aralquil inferior-carbonilo, heteroaralquil inferior-carbonilo, alquiltio, arilo y aralquilo.

10. Un compuesto de la reivindicación 9, en el que R_{8} y R_{9} se seleccionan del grupo constituido por halo y haloalquilo inferior.

11. Un compuesto de la reivindicación 10, en el que R_{8} y R_{9} son halo.

12. Un compuesto de la reivindicación 9, en el que A_{2} se selecciona del grupo constituido por 2,5-diclorofenilamino y 2,5-diclorofeniloxi.

13. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que al menos uno de R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} es alquilo inferior sustituido seleccionado del grupo constituido por haloalquilo inferior, heterocicloaminoalquilo y alquil inferior-aminoalquilo inferior.

14. Un compuesto de la reivindicación 13, en el que al menos uno de R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} es alquil inferior-aminoalquilo inferior.

15. Un compuesto de la reivindicación 13, en el que R_{1}, R_{2} y R_{3} son hidrógeno y R_{4} se selecciona del grupo constituido por hidrógeno, metilo, etilo, aminoetilo, dimetilaminoetilo, piridiletilo, piperidinilo, pirrolidiniletilo, piperaziniletilo y morfoliniletilo.

16. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que al menos uno de R_{5} y R_{7} se selecciona del grupo constituido por arilo, heteroarilo y biarilo sustituidos y no sustituidos.

17. Un compuesto de la reivindicación 16, en el que al menos uno de R_{5} y R_{7} es un resto sustituido o no sustituido de fórmula:

27

en la que R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13} y R_{14} se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por hidrógeno, nitro, amino, ciano, halo, tioamido, carboxilo, hidroxi y alquilo inferior opcionalmente sustituido, alcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, haloalquilo inferior, haloalcoxi inferior, aminoalquilo, alquilamino, alquiltio, alquilcarbonilamino, aralquilcarbonilamino, heteroaralquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, heteroarilcarbonilamino, aminocarbonilo, alquil inferior-aminocarbonilo, aminoaralquilo, alquil inferior-aminoalquilo, arilo, heteroarilo, cicloheteroalquilo, aralquilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, aralquilcarboniloxi, arilcarboniloxialquilo, alquilcarboniloxialquilo, heteroarilcarboniloxialquilo, aralquilcarboniloxialquilo y heteroaralquilcarboniloxialquilo.

18. Un compuesto de la reivindicación 17, en el que R_{10}, R_{11}, R_{13} y R_{14} son hidrógeno y R_{12} se selecciona del grupo constituido por halo, alquilo inferior, hidroxi, alcoxi inferior, haloalquilo inferior, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo y ciano.

19. Un compuesto de la reivindicación 17, en el que R_{11}, R_{13} y R_{14} son hidrógeno y R_{10} y R_{12} se seleccionan independientemente del grupo constituido por halo, alquilo inferior, hidroxi, alcoxi inferior, haloalquilo inferior y ciano.

20. Un compuesto de la reivindicación 17, en el que R_{10}, R_{11}, R_{13} y R_{14} son hidrógeno y R_{12} es heteroarilo.

21. Un compuesto de la reivindicación 17, en el que R_{10}, R_{11}, R_{13} y R_{14} son hidrógeno y R_{12} es heterocicloalquilo.

22. Un compuesto de la reivindicación 17, en el que al menos uno de R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13} y R_{14} son halo y el resto de R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13} y R_{14} son hidrógeno.

23. Un compuesto de la reivindicación 17, en el que al menos uno de R_{5} y R_{7} se selecciona del grupo constituido por diclorofenilo, difluorofenilo, trifluorometilfenilo, clorofluorofenilo, bromoclorofenilo, etilfenilo, metilclorofenilo, imidazolilfenilo, cianofenilo, morfolinofenilo y cianoclorofenilo.

24. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R_{6} es alquilo sustituido seleccionado del grupo constituido por aralquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, aminoaralquilo, carbonilaminoalquilo, alquilcarbonilaminoalquilo, arilcarbonilaminoalquilo, aralquilcarbonilaminoalquilo, aminoalcoxialquilo y arilaminoalquilo.

25. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R_{6} es amino sustituido seleccionado del grupo constituido por alquilamino, alquilcarbonilamino, alcoxicarbonilamino, arilalquilamino, arilcarbonilamino, alquiltiocarbonilamino, arilsulfonilamino, heteroarilamino, alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, heteroarilcarbonilamino, aralquilcarbonilamino, y heteroaralquilcarbonilamino.

26. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R_{6} se selecciona del grupo constituido por aminocarbonilo, alquiloxicarbonilo, ariloxicarbonilo, aralquiloxicarbonilo y alquilaminoalquiloxicarbonilo no sustituidos o sustituidos.

27. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R_{6} se selecciona del grupo constituido por amidino, guanidino, cicloimido, heterocicloimido, cicloamido, heterocicloamido, ciclotioamido y heterocicloalquilo inferior.

28. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R_{6} es arilo.

29. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que R_{6} es heteroarilo.

30. Un compuesto de la reivindicación 29, en el que R_{6} se selecciona del grupo constituido por piridilo, pirimidinilo, tiazolilo, indolilo, imidazolilo, oxadiazolilo, tetrazolilo, pirazinilo, triazolilo, tienilo, furanilo, quinolinilo, pirrolilpiridilo, benzotiazolilo, benzopiridilo, benzotriazolilo y bencimidazolilo sustituidos o no sustituidos.

31. Un compuesto de estructura (I):

28

en la que:

X e Y son nitrógeno;

A_{1} es arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido;

A_{2} es arilo, ariloxi, acilamino o heteroarilo opcionalmente sustituidos;

R_{5} y R_{7} se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, hidroxi, halo, carboxilo, nitro, amino, amido, amidino, imido, ciano y alquilo inferior sustituido o no sustituido, alcoxi inferior, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, heteroaralquilcarbonilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, aralquilcarboniloxi, alquilaminocarboniloxi, arilaminocarboniloxi, formilo, alquil inferior-carbonilo, alcoxi inferior-carbonilo, aminocarbonilo, aminoarilo, alquilsulfonilo, sulfonamido, aminoalcoxi, alquilamino, arilamino, aralquilamino, heteroarilamino, heteroaralquilamino, alquilcarbonilamino, alquilaminocarbonilamino, arilaminocarbonilamino, aralquilcarbonilamino, heteroaralquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, heteroarilcarbonilamino, amidino, cicloalquilo, cicloamido, ciclotioamido, cicloamidino, heterocicloamidino, cicloimido, heterocicloimido, guanidinilo, arilo, biarilo, heteroarilo, heterobiarilo, heterociclo, heterocicloalquilo, arilsulfonilo y arilsulfonamido;

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

32. Un compuesto de la reivindicación 31, en el que al menos uno de A_{1} y A_{2} es un anillo aromático que tiene de 3 a 10 átomos de carbono en el anillo y opcionalmente 1 o más heteroátomos en el anillo.

33. Un compuesto de la reivindicación 32, en el que A_{2} es arilo, arilamino o ariloxi carbocíclico opcionalmente sustituidos.

34. Un compuesto de la reivindicación 32, en el que al menos uno de A_{1} y A_{2} es heteroarilo opcionalmente sustituido.

35. Un compuesto de la reivindicación 32, en el que A_{2} se selecciona del grupo constituido por fenilamino y feniloxi sustituidos o no sustituidos.

36. Un compuesto de la reivindicación 32, en el que al menos uno de A_{1} y A_{2} se selecciona del grupo constituido por piridilo, pirimidinilo, tiazolilo, indolilo, imidazolilo, oxadiazolilo, tetrazolilo, pirazinilo, triazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, purinilo, naftilo, benzotiazolilo, benzopiridilo y bencimidazolilo sustituidos o no sustituidos.

37. Un compuesto de la reivindicación 32, en el que al menos uno de A_{1} y A_{2} está sustituido con al menos uno y no más de 3 grupos de sustitución.

38. Un compuesto de la reivindicación 37, en el que dichos grupos de sustitución se seleccionan independientemente del grupo constituido por nitro, amino, ciano, halo, tioamido, amidino, oxamidino, alcoxiamidino, imidino, guanidino, sulfonamido, carboxilo, formilo, alquilo inferior, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, alquil inferior-aminoalquil inferior- carbonilo, alquiltio, aminoalquilo y cianoalquilo.

39. Un compuesto de la reivindicación 32, en el que al menos uno de A_{1} y A_{2} tiene la fórmula:

29

en la que L es -NH- u -O-, y

40. Un compuesto de la reivindicación 39, en el que R_{8} y R_{9} se seleccionan del grupo constituido por halo y haloalquilo inferior.

41. Un compuesto de la reivindicación 40, en el que R_{8} y R_{9} son halo.

42. Un compuesto de la reivindicación 39, en el que A_{2} se selecciona del grupo constituido por 2,5-diclorofenilamino y 2,5-diclorofeniloxi.

43. Un compuesto de la reivindicación 39, en el que al menos uno de R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} es alquilo inferior sustituido seleccionado del grupo constituido por haloalquilo inferior, heterocicloaminoalquilo y alquil inferior-aminoalquilo inferior.

44. Un compuesto de la reivindicación 43, en el que al menos uno de R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} es alquil inferior-aminoalquilo inferior.

45. Un compuesto de la reivindicación 43, en el que R_{1}, R_{2} y R_{3} son hidrógeno y R_{4} se selecciona del grupo constituido por hidrógeno, metilo, etilo, aminoetilo, dimetilaminoetilo, piridiletilo, piperidinilo, pirrolidiniletilo, piperaziniletilo y morfoliniletilo.

46. Un compuesto de la reivindicación 31, en el que al menos uno de R_{5} y R_{7} se selecciona del grupo constituido por arilo, heteroarilo y biarilo sustituidos y no sustituidos.

47. Un compuesto de la reivindicación 46, en el que al menos uno de R_{5} y R_{7} es un resto sustituido o no sustituido de fórmula:

30

en la que R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13} y R_{14} se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, nitro, amino, ciano, halo, tioamido, carboxilo, hidroxi y alquilo inferior, alcoxi inferior, alcoxialquilo inferior, haloalquilo inferior, haloalcoxi inferior, aminoalquilo, alquilamino, alquiltio, alquilcarbonilamino, aralquilcarbonilamino, heteroaralquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, heteroarilcarbonilamino, aminocarbonilo, alquil inferior-aminocarbonilo, aminoaralquilo, alquil inferior-aminoalquilo, arilo, heteroarilo, cicloheteroalquilo, aralquilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, aralquilcarboniloxi, arilcarboniloxialquilo, alquilcarboniloxialquilo, heteroarilcarboniloxialquilo, aralquilcarboniloxialquilo y heteroaralquilcarboniloxialquilo.

48. Un compuesto de la reivindicación 47, en el que R_{10}, R_{11}, R_{13} y R_{14} son hidrógeno y R_{12} se selecciona del grupo constituido por halo, alquilo inferior, hidroxi, alcoxi inferior, haloalquilo inferior, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo y ciano.

49. Un compuesto de la reivindicación 47, en el que R_{11}, R_{13} y R_{14} son hidrógeno y R_{10} y R_{12} se seleccionan independientemente del grupo constituido por halo, alquilo inferior, hidroxi, alcoxi inferior, haloalquilo inferior y ciano.

50. Un compuesto de la reivindicación 47, en el que R_{10}, R_{11}, R_{13} y R_{14} son hidrógeno y R_{12} es heteroarilo.

51. Un compuesto de la reivindicación 47, en el que R_{10}, R_{11}, R_{13} y R_{14} son hidrógeno y R_{12} es heterocicloalquilo.

52. Un compuesto de la reivindicación 47, en el que al menos uno de R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13} y R_{14} son halo y los restantes de R_{10}, R_{11}, R_{12}, R_{13} y R_{14} son hidrógeno.

53. Un compuesto de la reivindicación 47, en el que al menos uno de R_{5} y R_{7} se selecciona del grupo constituido por diclorofenilo, difluorofenilo, trifluorometilfenilo, clorofluorofenilo, bromoclorofenilo, etilfenilo, metilclorofenilo, imidazolilfenilo, cianofenilo, morfolinofenilo y cianoclorofenilo.

54. Un compuesto de la reivindicación 31, en el que R_{6} es alquilo sustituido seleccionado del grupo constituido por aralquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, aminoaralquilo, carbonilaminoalquilo, alquilcarbonilaminoalquilo, arilcarbonilaminoalquilo, aralquilcarbonilaminoalquilo, aminoalcoxialquilo y arilaminoalquilo.

55. Un compuesto de la reivindicación 31, en el que R_{6} es amino sustituido seleccionado del grupo constituido por alquilamino, alquilcarbonilamino, alcoxicarbonilamino, arilalquilamino, arilcarbonilamino, alquiltiocarbonilamino, arilsulfonilamino, heteroarilamino, alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, heteroarilcarbonilamino, aralquilcarbonilamino, y heteroaralquilcarbonilamino.

56. Un compuesto de la reivindicación 31, en el que R_{6} se selecciona del grupo constituido por aminocarbonilo, alquiloxicarbonilo, ariloxicarbonilo, aralquiloxicarbonilo y alquilaminoalquiloxicarbonilo no sustituidos o sustituidos.

57. Un compuesto de la reivindicación 31, en el que R_{6} se selecciona del grupo constituido por amidino, guanidino, cicloimido, heterocicloimido, cicloamido, heterocicloamido, ciclotioamido y heterocicloalquilo inferior.

58. Un compuesto de la reivindicación 31, en el que R_{6} es arilo.

59. Un compuesto de la reivindicación 31, en el que R_{6} es heteroarilo.

60. Un compuesto de la reivindicación 59, en el que R_{6} se selecciona del grupo constituido por piridilo, pirimidinilo, tiazolilo, indolilo, imidazolilo, oxadiazolilo, tetrazolilo, pirazinilo, triazolilo, tienilo, furanilo, quinolinilo, pirrolilpiridilo, benzotiazolilo, benzopiridilo, benzotriazolilo y bencimidazolilo sustituidos o no sustituidos.

61. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad de un compuesto de la reivindicación 1 efectiva para inhibir la actividad de GSK3 en un sujeto humano o animal cuando se administra al mismo, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

62. Un compuesto de la reivindicación 1 o reivindicación 31, para uso como un compuesto farmacéutico.

63. Uso de un compuesto de la reivindicación 1 o reivindicación 31 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de diabetes, enfermedad de Alzheimer y otros trastornos neurodegenerativos, obesidad, enfermedad cardiovascular ateroesclerótica, hipertensión arterial, síndrome de ovario poliquístico, síndrome X, isquemia, lesión cerebral traumática, trastorno bipolar o cáncer.