ES2247009T3 - Composiciones pesticidas y antiparasitos. - Google Patents
Composiciones pesticidas y antiparasitos.Info
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Abstract
Una composición para uso agrícola o veterinario que comprende al menos un agente quitinolítico o agente inductor de actividad quitinolítica, y sulfuro o un agente productor de sulfuro.
Description
Composiciones pesticidas y antiparásitos.
Esta invención comprende varias composiciones
sinérgicas, tipo pesticidas y antiparásitos, útiles para controlar
los fitonematodos y zoonematodos parásitos, algunas enfermedades
(fúngicas y bacterianas), y para controlar los trematodos parásitos
(Fasciola hepatica).
A los nematodos, se les consideran responsables
de causar los mayores daños a la agricultura en regiones tropicales,
subtropicales, y templadas en el mundo (Nickle W. R. (Editor) 1991,
Manual of Agricultural Nematology, Marcel Dekker, Inc., Nueva Cork,
N.Y. Pub. 1035 pp). Los ataques de los nematodos al llantén por si
solo representan aproximadamente el 20% de las pérdidas de
producción mundial, lo que corresponde a 178 millones de dólares
cada año (Sasser J. N. y Freckman D. W., 1987. A World perspective
on nematology: the role of the society. Vistas on nematology: a
commemoration of the twenty-fifth anniversary of
the Society of Nematologists /editores, Joseph A. Veech y Donald W.
Dickson, p7-14). Plantaciones de llantén y plátano
se ven afectadas de forma significativa por Radopholus
similis.
Meloidogyne spp es el nematodo parásito
más importante, debido a que es la causa de pérdidas de entre el 11%
y el 25% de la cosecha en casi todas las regiones tropicales
(Sasser J. N. 1979. Root-knot nematodos.
Editores. F. Lamberte y C. E. Taylor, Academia Press, Londres,
p359). Como consecuencia, existe una gran necesidad de controlar
estos parásitos que, en el pasado, se combatían con nematicidas
químicos. Estos compuestos pueden ser altamente eficaces; sin
embargo, muchos de ellos pueden suponer un peligro importante para
el medioambiente. En algunos casos, las autoridades reguladoras han
impuesto un límite en la cantidad aplicada y/o la frecuencia del
uso de estos compuestos, comprometiendo así su eficacia
nematicida.
El control de los nematodos todavía es
deficiente. El uso de nematicidas químicos está cada día sujeto a
más limitaciones, porque contienen compuestos altamente tóxicos y
de una amplia acción. Como consecuencia de ello, se ha hecho un
esfuerzo para descubrir una forma eficaz para eliminar el daño
provocado por los nematodos a la vez de reducir el uso de los
pesticidas químicos. Un posible abordaje es el uso de pesticidas
biológicos con mecanismos de acción específicos y unos perfiles
toxicológicos relativamente más seguros, en vez de nematicidas
químicos. Algunos de las nematicidas alternativos incluyen
ABG-9008, un metabolito del hongo Myrothecium
verrucaria y una combinación de avermectinas (o compuestos
relacionados, tales como milbecinas) con ácidos graso (Abercrombie
K. D. 1994. Synergistic pesticidal compositions. Patente US5346698.
Mycogen Corporation. Sept. 13). Asimismo, un método que incluye la
administración concurrente para eliminar los daños provocados por
nematodos en plantas, el sitio, la tierra, o semillas que necesitan
tratamiento con a) un metabolito del hongo Myrothecium
verrucaria y b) un pesticida químico, junto con las
composiciones sinérgicas de nematicidas útiles en este caso, se
reivindica en una patente (Warrior P., Heiman D. F. y Rehberger
Linda A. 1996 Synergistic nematocidal compositions. Abbott
Laboratorios. WO 9634529,
11-07-1996)
Otro planteamiento es combinar las esporas de
Pasteuria penetrans, un parásito bacteriano de los
nematodos, con nematicidas organofosforadas (Nordmeyer D. 1987.
Synergistic nematocidal compositions of Pasteuria penetrans
spores and an organophosphorus nematocide. 1987
CIBA-GEIGY AG Patente AU 06057386A1.
29/01/1987).
Sin embargo, la preparación de esporas de P.
penetrans a escala industrial se encuentra con el problema de
que el organismo es un parásito obligado, conque tiene que
cultivarse en nematodos in situ, aislado de las digestiones
de raíces infestadas con nematodos.
Los hongos y las bacterias quitinolíticas que
comparten el hábitat del nematodo pueden proporcionar cierto
equilibrio biológico y de alguna manera restringir la proliferación
de los nematodos. Se han reivindicado dos cepas de bacterias
quitinolíticas (Toda T. y Matsuda H. 1993. Antibacterial,
anti-nematode and/or plant-cell
activating composition, and chitinolytic microorganisms for
producing the same. Toda Biosystem Laboratory, Japan, Patent
US5208159, 05/04/1993) como una composición antibacteriana,
nematicida y/o activadora de células vegetales.
Existen unos ejemplos del efecto quitinolítico
sobre los nematodos. Algunos de los más significativos son las cepas
de nuevas bacterias (Suslow T. y Jones D. G. 1994. Novel
chitinase-producing bacteria and plants. DNA Plant
Technology Corporation, US04940840, 10/07/1990) que se crean
mediante la introducción de ADN que codifica la producción de
quitinasa, una enzima que puede degradar la quitina en hongos y
nematodos. Las cepas son útiles en la producción de quitinasa para
inhibir los patógenos de plantas. Se han descrito también nuevas
plantas resistentes a los patógenos como resultado de la
introducción de ADN que codifica la producción de quitinasa.
Herrera-Estrella y Chet ("Chitinases in
biological control", en Chitin and Chitinases, vol. 87,
p171-184, 1999) analizaron el papel fisiológico de
las quitinasas y su posible uso en la mejora de agentes de
biocontrol y plantas de explotación mediante la ingeniería
genética.
Otros ejemplos de microorganismos que reducen las
poblaciones de nematodos que atacan a las plantas en condiciones
naturales se han descrito.
Rodríguez-Kabana et al.
(Rodríguez-Kabana R., Jordan J. W., Hollis J. P.
1965. Nematodos: Biological control in rice fields- role of hydrogen
sulfide. Science. 148: 524-26); Hollis y
Rodríguez-Kabana (Hollis, J. P., y R.
Rodríguez-Kábana. 1966. Rapid kill of nematodos in
flooded soil. Phytopathology 56, p1015-19)
observaron una correspondencia entre la bacteria Desulfovibrio
desulfuricans, la producción de sulfuro de hidrógeno y los
nematodos parásitos de plantas, cuya población disminuyó en las
plantaciones de arroz de Louisiana. Los sulfuros son inhibidores
del transporte de electrones en el proceso de respiración del
organismo aeróbico, igual que otros metabolitos producidos por
ciertas bacterias del suelo (Rodríguez-Kábana, R.
1991 Control biológico de nematodos parásitos de plantas.
NEMATROPICA, 21(1), p111-22). Topp et
al. ("Effects of marigold (Tagetes sp.) roots on soil
microorganisms" en Biology and Fertility of Soils, Vol. 27, Núm.
2, p149-154, 1988) concluyeron que la supresión de
nematodos por caléndulas (del genio Tapetes) se debe a
tiofenos, moléculas heterocíclicas que contienen sulfuro, que son
abundantes en esta planta.
PAECIL^{TM}, también conocido como BIOACT o
Nemachek, es una nematicida biológica que contiene una cepa
patentada de Paecilomyces lilacinus en un concentrado seco y
estable de esporas para el tratamiento del suelo y semillas. Esta
especie de hongo se encuentra a menudo en los suelos de todo el
mundo. La cepa patentada utilizada como el principio activo de
PAECIL^{TM} es especialmente eficaz contra los nematodos
parásitos de plantas. Se aisló por primera vez en la Universidad de
las Filipinas, y se desarrolló posteriormente en Australia,
Universidad de Macquarie. Además, se ha sometido a ensayos grandes
para el control de varios tipos de nematodos que atacan plantas de
explotación importantes en Australia, las Filipinas, África del
Sur, y otros países. La formulación PAECIL^{TM} está disponible
comercialmente como un pesticida registrado en las Filipinas, bajo
el nombre BIOACT^{R}, en África del Sur bajo el nombre PL PLUS, y
en Indonesia bajo el nombre PAECIL^{TM}. Actualmente, la
Australian Nacional Registration Authority está evaluando el
producto como un pesticida (Holland, R. PAECIL^{TM}. 1998.
http://www.ticorp.com.au/article1.htm). Los ejemplos arriba
mencionados fallan en su intento de solucionar todos los problemas
de los parásitos de helminto. Por lo tanto, aún queda la necesidad
de implementar mejores medios en el control de parásitos para
sustituir los pesticidas químicos y productos antiparásitos.
Los trematodos causan daños económicos
sustanciales en la producción de animales y en la salud humana. La
diversidad de las especies, la patogenicidad relativamente benigna y
el endemismo en algunas regiones aisladas parecen ser factores
esenciales que contribuyen a la falta de conocimiento sobre los
trematodos. En términos generales, los trematodos intestinales son
zoonóticos y tienen un gran número de huéspedes de reserva en cada
especie.
Desde el punto de vista económico, uno de los
trematodos más importantes es la Fasciola hepatica, el primer
trematodo parásito que se descubrió; afecta al hombre habitando los
conductos biliarios. Sus huevos están entre los más grandes,
ovoides y operculados de los helmintos, lo que provoca disfunción
digestiva que consiste en dispepsia gástrica, disfunción de la
movilidad del colón, dolor hepático y de la vesícula biliaria,
fiebre y cólico hepático. Otros signos pueden incluir formas
quísticas en los pulmones, ojos, cerebro, vena hepática, y otros
tejidos (Saleha A. 1991. Liver fluke disease (fasciolosis)
epidemiology, economic impact and public health significance.
Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 22 supl. 1 dic
p361-4).
Los zoohelmintos se han convertido en plagas
importantes que afectan a ovejas y ganado. Existe una amplia
resistencia a productos antihelmínticos, sobre todo en poblaciones
de nematodos parásitos de rumiantes pequeños.
Se han desarrollado nuevas técnicas
suplementarias, y se están investigando otras. El hongo
Duddingtonia flagrans es un depredador que forma redes,
produce esporas estáticas con paredes gruesas, las clamidoesporas,
capaces de sobrevivir en el paso por el tracto digestivo del
ganado, caballos, ovejas, y cerdos (Larsen M. 1999. Biological
control of helminths. Int J Parasitol. Jan; 29(1):
139-46, y Larsen, M. 2000. Prospects for controlling
animal parasitic nematodos by predacious micro fungi. Parasitology,
120, S120-S121).
Estudios sobre D. flagrans en Dinamarca,
Francia, Australia, los EE.UU. y México han confirmado la fuerte
potencial que tiene este hongo para el control biológico.
Como muchos otros países con una producción de
ovejas importante, África del Sur atraviesa una gran crisis en
cuanto a la resistencia antihelmíntica, sobre todo, en cuanto a
nematodos gastrointestinales en ovejas o cabras. Los parásitos
helmintos más importantes están involucrados en este fenómeno; sin
embargo, este provoca un problema particular con el parásito
hematófago del abomaso Haemonchus contortus. Los estudios
apuntan a que más del 90% de las cepas de este parásito en las
regiones de producción de ovejas más importantes de África del Sur
muestran un cierto grado de resistencia química ante tres de los
cuatro grupos antihelmínticos disponibles en el mercado en África
del Sur. Incluso en áreas de pasto común en la Provincia del Norte,
se detectó en cinco rebaños estudiados en el 1993 (van Wyk J. A.,
Bath G. G., y Malan F. S. 2000. The need for alternative methods to
control nematodo parasites of ruminant livestock in South Africa.
World Animal Review.
http://www.fao.org/ag/AGA/AGAP/FRG/FEEDback/War/contents.htm).
El aumento en la resistencia se ha convertido en
un problema serio, ya que ha aparecido también en otras áreas.
Recientemente, se han realizado una serie de estudios
antihelmínticos en cuatro países latinoamericanos: Argentina (Eddi,
C., Caracostantogolo, J., Peya, M., Schapiro, J., Marangunich, L.,
Waller, P. J. y Hansen, J. W. 1996. The prevalence of anthelmintic
resistance in nematode parasites of sheep in southern Latin
America: Brasil. Vet. Parasitol., 62:
199-206); Paraguay (Maciel S., Giminez A. M., Gaona,
C., Waller P. J. y Hansen J. W. 1996. The prevalence of
anthel-
mintic resistance in nematode parasites of sheep in southern Latin America: Uruguay. Vet. Parasitol., 62: 213-222).
mintic resistance in nematode parasites of sheep in southern Latin America: Uruguay. Vet. Parasitol., 62: 213-222).
Uno de los nematodos responsables del mayor daño
entre el ganado es Dictyocaulus viviparous, un parásito que
llega a la madurez sexual y de adulto, se alberga en los pulmones
del ganado, especialmente en el ganado joven. La enfermedad así
provocada se llama bronquitis verminosa, o dictiocaulosis bovino, y
la infestación se produce después de ingerir los 3 o larvas
infectantes, presentes en los pastos. El tratamiento requiere
antihelmínticos (Borgsteede F. H. M., de Leeuw W. A. y Buró W. P.
J. 1988. A comparison of the efficacy of four different
long-acting boluses to prevent infections with
Dictyocaulus viviparus in calves. Veterinary Quarterly, Vol.
10, Núm. 3), pero este éxito se consigue a expensas de nuevas cepas
resistentes a los fármacos, lo que dificulta tratamiento adicional
de animales infestados. El alto coste de estos productos es un
factor limitante en los países con un bajo nivel de recursos, y se
producen efectos ecológicos nocivos por el uso de estas
formulaciones.
El problema internacional de la resistencia
antihelmíntica se acentúa por el hecho de que, mientras que la
quimioterapia sigue siendo la piedra angular del control de
parásitos, existe poca esperanza de descubrir agentes
antihelmínticos nuevos y químicamente no relacionados durante por
lo menos una década (Soll, M. D. 1997. The future of antihelmintic
therapy from an industry perspectiva. En J. A. Van Wyk y P. C. Van
Schalkwyk, editores, Managing antihelmintic resistance in
endoparasites, p. 1-5. Proceedings of the 16th
Internacional Conference of the World Association for the
Advancement of Veterinary Parasitology, Sun City, South Africa,
10-15 August 1997).
En el caso de bacterias y hongos patógenos,
existen informes extensos sobre los productos biológicos, cuya
acción se basa principalmente en el antagonismo y muchos de éstos
están disponibles comercialmente. Algunos de ellos son Conquer
(Pseudomonas fluorescens que antagoniza Pseudomonas
tolassii), Galltrol-A (Agrobacterium
radiobacter, que controla los siguientes hongos:
Phytophthora, Rhizoctonia solani, Pythium spp, Fusarium,
Verticillium), Aspire (Candida oleophila
1-182 que controla Botrytis spp. y
Penicillium spp.), etc.
Uno de las biofungicidas con una actividad más
amplia es Trichoderma spp (Chet I, Invar. J. 1994 Biological
control of fungal pathogens. Appl Biochem Biotechnol;
48(1): 37-43), un hongo cuyo mecanismo de
acción se ha descrito extensamente, donde participan las quitinasas
que degradan la pared celular del hongo huésped. Además, existe
evidencia experimental de la acción quitinolítica de hongos y
bacterias que se utilizan como biorreguladores de enfermedades
fúngicas (Herrera-Estrella A., Chet I. 1999.
Chitinases in biological control. EXS; 87:
171-84). Sin embargo, éste no sólo es el único
mecanismo de acción de las bacterias sobre los hongos
fitopatogénicos, existen otras maneras basadas en la producción de
metabolitos secundarios, tales como cianuro de hidrógeno, que
pueden inhibir hongos patógenos de las raíces (Blumer C. y Haas D.
2000. Mechanism, regulation, and ecological role of bacterial
cyanide biosíntesis. Arch Microbiol Mar; 173(3):
170-7), en el caso particular de la cepa P.
fluorescens CHA0.
El análisis de la interacción entre bacterias ha
mostrado que existen tres tipos principales: antibiosis, competición
por sustrato y parasitismo. En el caso de antibiosis, se sabe que
algunas cepas liberan antibióticos con el fin de suprimir la
actividad bacteriana alrededor, lo que puede utilizarse para el
control bacteriológico de especies patógenas. Asimismo, la
competición por sustrato es un mecanismo que puede usarse también
para conseguir un control biológico adecuado, ya que el organismo
biorregulador es capaz de sintetizar sideroforos, agentes quelantes
de microelementos, lo que conduce a una deficiencia de
microelementos, sobre todo, hierro, en el medio, inhibiendo así el
crecimiento patógeno correspondiente (Ongena M. 1998. Conference on
biological controls. Training program in the area of biotechnology
applied to agriculture and bioindustry. Gembloux, Belgium).
La invención se relaciona con una composición que
contiene, al menos, un agente quitinolítico o un agente inductor de
actividad quitinolítica, y sulfuro o un agente productor de sulfuro
de microorganismos o compuestos químicos, en donde el agente
quitinolítico o un agente inductor de actividad quitinolítica, y
sulfuro o un agente productor de sulfuro de microorganismos o
compuestos químicos, se aplican de forma concomitante en una
cantidad sustancialmente menor que cuando cada componente se utiliza
de forma independiente para conseguir un control efectivo sobre
helmintos y agentes causantes de enfermedades bacterianas y
fúngicas.
La invención también se relaciona con el uso de
estas composiciones y/o la administración concomitante de dichos
compuestos de distintas fuentes, tales como agentes biológicos y
químicos para un control efectivo que abarca una amplia gama de
nematodos parásitos (Meloidogyne spp, Angina spp, Ditylenchus
spp, Partylenchus spp, Heterodera spp, Aphelenchus spp, Radopholus
spp, Xiphinema spp, Rotylenchulus spp), nematodos parásitos y
trematodos de animales (Haemonchus spp, Trichostrongylus spp,
Dictyocaulus spp. y Fasciola hepatica), agentes
bacterianos causantes de enfermedades (Erwinia chysranthemia,
Burkholderia glumae) y agentes fúngicos causantes de
enfermedades (Pestalotia palmarum, Alternaria tabacina,
Sarcocladium orizae).
Los efectos de un agente quitinolítico o un
agente inductor de actividad quitinolítica, o sulfuro o un agente
productor de sulfuro sobre helmintos, bacterias y hongos se han
descrito o demostrado previamente. En este estudio, sin embargo,
por primera vez, se demuestra un efecto sinérgico cuando ambos
componentes se aplican a la vez.
Cuando el agente quitinolítico, o un agente
inductor de actividad quitinolítica, y el sulfuro o un agente
productor de sulfuro se aplican por separado, los efectos son
siempre menos acusados que cuando los agentes se aplican a la
vez.
Cuando se aplica como una composición de la
presente invención, el agente quitinolítico, o un agente inductor de
actividad quitinolítica, y el sulfuro o un agente productor de
sulfuro pueden mezclarse apropiadamente en forma de una solución,
suspensión, emulsión, polvo o mezcla granulada, y se aplica a la
planta o el suelo como un fertilizante, suelo previamente envasado,
un dispositivo oculto de semillas, un polvo, un granulado, un
nebulizador, una suspensión, un líquido, o cualquier forma indicada
en cápsulas para el control de los helmintos parásitos, y las
enfermedades bacterianas y fúngicas.
Los intervalos óptimos para la aplicación del
agente quitinolítico, o un agente inductor de actividad
quitinolítica, y el sulfuro o un agente productor de sulfuro para
el caso particular de nematodos, trematodos, bacterias u hongos, y
en el caso de condiciones específicas, los intervalos se determinan
mediante estudios experimentales in vitro, en invernaderos,
o en condiciones de campo.
Según los resultados descritos en la presente
invención, un control significativo de los helmintos, bacterias y
hongos se consigue con una mezcla de 1) un organismo productor de
quitinasa a una concentración de entre 10^{7} unidades formadoras
de colonias (UFC) y 10^{12} UFC de un microorganismo específico
por gramo de composición o de quitina entre 1% y 50 de la
composición; y 2) un microorganismo productor de sulfuro a una
concentración de entre 10^{7} UFC y 10^{12} UFC de un
microorganismo específico por gramo de composición, o cualquier
agente químico productor de sulfuro, donde el sulfuro varía de 1.0
mg/minuto por gramo de composición.
Cualquier composición con un microorganismo a una
concentración de entre 10^{7} UFC y 10^{12} UFC por gramo de
composición que produce agentes quitinolíticos y el sulfuro
simultáneamente es apropiada para el control de helmintos,
bacterias y hongos. Las anteriores composiciones implican
combinaciones de los siguientes agentes en las proporciones
indicadas anteriormente:
1. Quitinasa y Na_{2}S
2. Quitinasa y FeS
3. Quitinasa y el microorganismo Desulfovibrio
desulfuricans
4. Quitinasa y Na_{2}S
5. Quitinasa y FeS
6. Quitinasa y el microorganismo Desulfovibrio
desulfuricans
7. Microorganismos que producen actividad
quitinolítica y H_{2}S simultáneamente.
Las composiciones anteriores son efectivas contra
una amplia gama de nematodos parásitos de plantas, que incluyen pero
no se limitan a especies de Meloidogyne, tales como M.
incognita; especies de Angina, tales como A.
tritici; especies de Ditylencus, tales como D.
dipsaci; especies de Pratylenchus, tales como P.
coffee; especies de Heterodera, tales como H.
glycines; especies de Aphelenchus, tales como A.
avenae; especies de Radopholus, tales como R.
similis; especies de Xiphinema, tales como X.
index; especies de Rotylenchulus, tales como R.
reniformis; zoonematodos tales como: Haemonchus spp,
Tricholstrongylus spp, Ostertagia spp, Nemadodirus spp, Coopreria
spp, Ascaris spp, Bunostomum spp, Oesophagostomum spp, Chabertia
spp, Trichuris spp, Strongylus spp, Trichonema spp, Dictyocaulus
spp, Capillaria spp, Heterakis spp, Toxocara spp, Ascaridia spp,
Oxyuris spp, Anclyostoma spp, Uncinaria spp, Toxascaris spp y
Parascaris spp; trematodos tales como Fasciola
hepatica; bacterias patógenas de plantas tales como Erwinia
chrysanthemi, Burkholderia glumae, y hongos patógenos de
plantas, tales como Pestalotia palmarum, Alternaria
tabacina y Sarocladium orizae.
Se utilizaron huevos de los zoonematodos
Haemonchus spp., Trichostrongylus colubriformis y
Dictyocaulus viviparus así como las larvas de fitonematodos
parásitos (juveniles 2) de Melodoigyne incognita.
Las colecciones de nematodos Haemonchus spp.
y Trichostrongylus colubriformis se extrajeron de
abomaso ovino (ovejas) y bovino (ganado), respectivamente. Los
nematodos hembras adultos se lavaron con una solución fisiológica y
se trataron con "Hibitane" (Acetato de clorhexidina) al 0,5%
durante un minuto, y el proceso se desarrolló a 37ºC.
Aproximadamente 100 individuos previamente desinfectados se
introdujeron en un matraz Erlenmeyer con 50 ml de solución del
medio LB, se diluyeron 10 veces con agua estéril destilada, y se
dejaron para que pusieran sus huevos durante la noche (8 a 10
horas).
Las colecciones del nematodo D. vivaparous
se extrajeron del pulmón bovino infectado (ganado), que se había
sacrificado previamente. Se siguió el mismo procedimiento para
Haemonchus spp. y T. colubriformis; sin embargo, se
permitió que las hembras pusieran sus huevos durante 2 a 3
horas.
A partir de este momento, la manipulación se
llevó a cabo bajo condiciones asépticas en un flujo vertical
laminar, con placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos. El
volumen total del medio que contenía las hembras y los huevos se
filtró con una malla de tamización de 60 \mum. Los huevos de los
nematodos quedaron atrapados en la malla de 30 \mum en una
segunda tamización. Se introdujo en una solución de Hibitane al
0,5% durante 3 minutos, y a continuación, se lavó 3 veces con el
medio LB diluido 10 veces en agua estéril destilada.
Una vez infectados, los huevos se eliminaron de
la malla de tamización y se resuspendieron cuidadosamente con una
solución del medio LB diluido 10 veces en agua estéril destilada. El
resultado final de la distribución se comprobó mediante un recuento
de los huevos en cada pocillo con un microscopio invertido Olympus;
al mismo tiempo, también se realizaron observaciones de la
uniformidad y el estado evolucionario en esta fase.
Los huevos de Haemonchus spp. y T.
colubriformis se eclosionan después de 24 a 48 horas de
incubación a 28ºC, mientras que los huevos de D. vivparus se
eclosionan antes de 24 horas. Se consigue una preparación buena de
la muestra cuando, en todos los controles no tratados, más del 60%
se eclosiona dentro de los periodos anticipados anteriormente para
cada especie.
La colección de masa de huevo de Meloidogyne
incognita se llevó a cabo con raíces de calabacín (Cucúrbita
pepo), previamente infectadas y cultivadas en invernaderos. Para
esta operación, se utilizaron un microscopio estereoscopio y
jeringuillas con puntas debidamente modificadas. Las masas se
colocaron en agua destilada estéril en placas de Petri a 28ºC, con
50 masas por cada placa. Se realizaron observaciones a diario para
comprobar la eclosión de los huevos. En aproximadamente 72 horas,
hubo suficientes larvas como para empezar la recolección y la
desinfección.
El volumen total de agua que contenía las masas
de los huevos y las larvas se filtró a través de una malla de
tamización de 60 \mum. A partir de este momento, toda
manipulación se realizó bajo condiciones asépticas en un flujo
vertical laminar, con placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos.
Los huevos que se despegaron de la masa no pudieron eclosionarse y
permanecieron en la malla de tamización de 30 \mum; las larvas se
recoleccionaron con otra malla de 5 \mum. Se introdujeron en la
solución de Hibitane al 0,5% durante 3 minutos y a continuación se
lavaron 3 veces con el medio LB diluido 10 veces en agua estéril
destilada. Una vez desinfectadas, las larvas de Meloidogyne
incognita se eliminaron de la malla de tamización y se
resuspendieron cuidadosamente con una solución del medio LB diluido
10 veces en agua estéril destilada. Los resultados finales de
recolección y desinfección se comprobaron mediante el recuento y el
registro de las larvas vivas con un microscopio invertido
Olympus.
Los huevos de las larvas del nematodo se
colocaron con 100 individuos en aproximadamente 2 ml del medio LB
diluido 10 veces. Este volumen se introdujo en válvulas de seguridad
que permiten que el aire atraviese el líquido y, por lo tanto, los
gases contacten con los huevos y las larvas. Cada válvula fue una
réplica para cada tratamiento.
El sulfuro de hidrógeno se obtuvo de la reacción
de ácido cloruro de dos sales sulfuros (Na_{2}S y FeS), y de la
fermentación anaeróbica de la bacteria Desulfovibrio
desulfuricans subesp. desulfuricans ATCC 27774 (aislada
del rumen ovino). El enzima quitinolítico utilizado fue la
quitinasa SIGMA 1650, de la bacteria Serratia
marcescens.
Los huevos y las larvas de los nematodos del
estudio se sometieron a los siguientes tratamientos durante 24
horas:
- 1.
- Tratamiento de control: quitinasa no aplicada, y aire que circulaba a través de la válvula
- 2.
- Tratamiento de quitinasa: quitinasa a una velocidad de 0,2 unidades por réplica
- 3.
- Tratamiento de sulfuro: sulfuro de hidrógeno de Na_{2}S con un flujo de 0,2 a 0,3 mg/minuto
- 4.
- Tratamiento de sulfuro: sulfuro de hidrógeno de Fe_{2}S con un flujo de 0,2 a 0,3 mg/minuto
- 5.
- Tratamiento de sulfuro: sulfuro de hidrógeno de Desulfovibrio desulfuricans con un flujo de 0,2 a 0,3 mg/minuto
- 6.
- Tratamiento combinado: aplicación simultánea de tratamientos 2 y 3
- 7.
- Tratamiento combinado: aplicación simultánea de tratamientos 2 y 4
- 8.
- Tratamiento combinado: aplicación simultánea de tratamientos 2 y 5
Todos los tratamientos arriba señalados tuvieron
4 réplicas.
Veinticuatro horas después de empezar el
experimento, se realizó un recuento de las larvas emergentes
(Haemonchus sp., T. colubriformis y D. viviparous) y
el número de larvas vivas (Melodogyne incognita) en todos los
tratamientos. Los resultados de eficacia (E) se presentan en la
tabla 1. Este valor es el promedio de las 4 réplicas en cada
tratamiento. El análisis de varianza (ANOVA) se aplicó a los
resultados obtenidos en cada especie de nematodos en el estudio por
separado; se utilizó la prueba de Duncan (Lerch G. 1977 La
experimentación en las ciencias biológicas y agrícolas. 1ª edición,
p.p. 203-308, Editorial
Científico-Técnica, La Habana), que también se
muestra en la tabla 1. Letras idénticas indican que no hubo
diferencias significativas (p<0,05) entre los
tratamientos.
\vskip1.000000\baselineskip
| Eficacia del tratamiento (E)* | ||||||||
| 1. Ec | 2 Eq | 3 Esn | 4 Esf | 5 Esd | 6 Eqsn | 7 Eqsf | 8 Eqsd | |
| control | (2+3) | (2+4) | (2+5) | |||||
| Haemonchus | 0.00 | 0.32 | 0.41 | 0.40 | 0.37 | 0.86 | 0.85 | 0.82 |
| (a) | (b) | (c) | (c) | (b, c) | (d) | (d) | (d) | |
| Trichostrongilus | 0.00 | 0.37 | 0.40 | 0.39 | 0.38 | 0.88 | 0.88 | 0.83 |
| (a_{1}) | (b_{1}) | (b_{1}, c_{1}) | (b_{1}, c_{1}) | (b_{1}, c_{1}) | (d_{1}) | (d_{1}) | (d_{1}) | |
| Dictyocaulus | 0.00 | 0.35 | 0.44 | 0.42 | 0.40 | 0.91 | 0.90 | 0.86 |
| (a_{2}) | (b_{2}) | (c_{2}) | (c_{2}) | (b_{2}, c_{2}) | (d_{2}) | (d_{2}) | (d_{2}) | |
| Maloidogyne | 0.00 | 0.39 | 0.51 | 0.52 | 0.47 | 0.95 | 0.93 | 0.90 |
| (a_{3}) | (b_{3}) | (c_{3}) | (c_{3}) | (c_{3}) | (d_{3}) | (d_{3}) | (d_{3}) | |
| * \begin{minipage}[t]{157mm} La eficacia (E) es el resultado de restar el valor de la frecuencia activa (F_{r}) para eclosión o de las larvas vivas de 1, según el caso. Fr es la relación entre el número de larvas emergentes o vivas en cada tratamiento (Ntto) y el número de larvas emergentes o vivas en el tratamiento 1 (Nc):\end{minipage} | ||||||||
E=1-Fr, donde Fr =
Ntto-Nc; \hskip0,3cm por lo tanto, \hskip0,3cm
E =
1-Ntto/Nc
Para determinar el efecto sinérgico de los
tratamientos 6, 7 y 8, se ha supuesto que los acontecimientos que se
producen durante los mismos no son mutuamente exclusivos.
Para este tipo de análisis, la eficacia esperada
(EE) tiene que igualar a la suma de los efectos individuales (EI),
dado por la eficacia debida a la acción de quitinasa (Eq) y la
eficacia debida a la acción del sulfuro de hidrógeno (Esn, Esf y
Esd), menos el efecto de intersección (ei) (Sigarroa, A. 1985.
Biometría y diseño experimental. 1ª Parte. Minist. Educación Sup.
Ed. Pueblo y Educación. Cap. 3. Pag 69-107).
EE = Eq + Es - ei, \hskip0,3cm
donde \hskip0,3cm ei = Eq x
Es
Si la eficacia experimental (E) en los
tratamientos que combinan dos agentes nematicidos (los tratamientos
6, 7, 8) es mayor que la eficacia esperada (EE) para dichos
tratamientos, puede suponerse que existe un sinergismo en cuanto a
la actividad nematicida del agente quitinolítico (quitinasa) y el
sulfuro de hidrógeno cuando ambos se aplican simultáneamente en el
mismo tratamiento. Los valores obtenidos se resumen en la tabla
2.
\vskip1.000000\baselineskip
| Eficacia experimental (E) y anticipada (EE) | ||||||
| Tratamiento 6 | Tratamiento 7 | Tratamiento 8 | ||||
| E | EE | E | EE | E | EE | |
| Haemonchus | 0.86 | 0.60 | 0.85 | 0.59 | 0.82 | 0.57 |
| Trichostrongilus | 0.88 | 0.62 | 0.88 | 0.62 | 0.83 | 0.61 |
| Dictyocaulus | 0.91 | 0.64 | 0.90 | 0.62 | 0.86 | 0.61 |
| Maloidogyne | 0.95 | 0.70 | 0.93 | 0.71 | 0.90 | 0.68 |
En los tres tratamientos en los que se combinan
simultáneamente la quitinasa y el sulfuro de hidrógeno, la eficacia
experimental (E) fue mayor que la eficacia esperada (EE) para los
cuatro nematodos estudiados, lo que demuestra estadísticamente la
existencia de un sinergismo entre ambos compuestos (cuando actúan
de forma concurrente), en cuanto a su actividad nematicida.
No se observaron diferencias estadísticamente
significativas en cuanto al origen de los sulfuros y sus efectos
nematicidos (tabla 1).
Se seleccionó suelo marrón con un pH neutral: se
secó y se tamizó con una malla de 0,5 cm para eliminar partículas no
deseadas. Se esterilizó en un autoclave vertical durante una hora a
120ºC y bajo 1 atmósfera (Sambrook J., Fritsch E. F. y Maniatis T.
1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª edición. Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., EE.UU.). Se secó
a temperatura ambiente durante 3 a 4 días para más adelante hacer
las mezclas planificadas para los tratamientos con arena del río,
humus de lombriz y quitina (Núm. de catálogo ICN
101334).
101334).
Se llenaron 20 tarros (diámetro 15 cm x 13 cm de
profundidad y una capacidad de 1 litro) con las proporciones fijadas
en los siguientes tratamientos:
- 1.
- Tratamiento de control: suelo 70%, arena del río 25%, y humus 5%.
- 2.
- Tratamiento de quitina: suelo 70%, arena del río 25%, humus 4%, y quitina 1%.
- 3.
- Tratamiento microorgánico: suelo 70%, arena del río 25%, humus 5% y D. desulfuricans, aplicado a una concentración de 10^{10} ufc por tarro
- 4.
- Tratamiento combinado: suelo 70%, arena del río 25%, humus 4%, quitina 1% y D. desulfuricans, aplicado a una concentración de 10^{10} ufc por tarro.
Cada tratamiento se llevó a cabo con 5 réplicas
(tarros).
En los tratamientos 2 y 4, se produjo una
pre-mezcla de humus con quitina a una proporción de
4:1, y a continuación, se produjo una mezcla final con el suelo y
la arena. En los tratamientos 3 y 4, se aplicó D.
desulfuricans con 100 ml de agua desionizada por cada tarro.
Estos volúmenes se aplicaron uniformemente durante el primer
riego.
riego.
Para todos los tratamientos, 500 nematodos de la
especie Radopholus similis, previamente recolectados de
raíces de plátano naturalmente infectadas se inocularon en los
tarros. Se utilizó la técnica de
centrifugación-flotación (Jenkins, W.R. 1964. A
rapad centrifugal-flotation technique for separation
of nematodos from soil. Plant Disease Reporter, 48: 692); los
especímenes se diluyeron en 5 ml de agua destilada y se aplicaron
uniformemente a una profundidad de 5 cm por debajo de la superficie
de la tierra.
Se colocaron los tarros en los invernaderos y,
después de aplicar los tratamientos y de inocular con los
nematodos, los tarros pasaron 3 días sin moverse. Se regó a diario
en esta fase, para mantener las buenas condiciones de humedad.
Antes del cuarto día de tratamientos, una variante de plátano
Cavendish conseguido de un cultivo in vitro se
transplantó en los tarros. A partir de este momento, se siguió un
régimen estricto de riego, que permitió que la tierra tuviera su
humedad habitual en el campo.
La valoración final se llevó a cabo tres meses
después del inicio del experimento, y las raíces de las plantas se
extrajeron cuidadosamente de la tierra. A continuación, se registró
el número de especímenes (larvas y adultos) y nematodos vivos
recogidos de las plantas utilizando la técnica de
centrifugación-flotación (Jenkins, W. R. 1964. A
rapid centrifugal-floatation technique for
separation nematodes from soil. Plant Disease Reporter, 48: 692), y
un microscopio invertido para los recuentos. Los resultados de
eficacia para los diferentes tratamientos se muestran en la tabla 3.
Los valores representan el valor medio de 5 réplicas por cada
tratamiento. El análisis de varianza se aplicó a los resultados
obtenidos (ANOVA), seguido de la prueba de Duncan (Lerch G. 1977.
La experimentación en las ciencias biológicas y agrícolas. 1ª
edición, p.p. 203-308, Editorial
Científico-Técnico, La Habana), indicados en la
tabla 3. Letras idénticas indican que no existieron diferencias
significativas (p<0.05) entre los
tratamientos.
tratamientos.
\vskip1.000000\baselineskip
| Eficacia de los tratamientos (E)* | ||||
| 1. Ec | 2. Eq | 3. Esd | 4. Eqsd | |
| Radopholus similis | 0,00 (a) | 0,21 (b) | 0,18 (c) | 0,48 (d) |
| * \begin{minipage}[t]{155mm} La eficacia (E) es el resultado de restar el valor de la frecuencia activa (F_{r}) de 1. Fr es la relación entre el número de especímenes vivos en cada tratamiento (Ntto) y el número de especímenes vivos en el tratamiento 1 (Nc):\end{minipage} | ||||
E=1-Fr, donde Fr =
Ntto-Nc; \hskip0,3cm por lo tanto, \hskip0,3cm
E =
1-Ntto/Nc
Para determinar el efecto sinérgico posible en el
tratamiento 4, se supuso que los acontecimientos (efecto
nematicido) no son mutuamente exclusivos.
Como en el ejemplo 1, la eficacia esperada (EE)
tiene que ser igual a la suma de los efectos individuales (EI),
indicada por la eficacia atribuida a la acción de quitina (Eq) como
inductor de la actividad quitinolítica de los microorganismos
presentes en la mezcla de tierra y humus, y la eficacia atribuida a
la acción de sulfuro de hidrógeno (Esd) de la bacteria D.
desulfuricans; menos el efecto de intersección (ei) entre los
dos tratamientos (Sigarroa, A. 1985. Biometría y diseño
experimental. 1ª Parte. Minist. Educación Sup. Ed. Pueblo y
Educación. Cap. 3. pág.
69-107).
69-107).
EE = Eq + Es -
ei, \hskip0,3cm donde \hskip0,3cm ei = Eq x
Es
Si la eficacia experimental (E) en el tratamiento
4, donde se combinan los dos agentes nematicidos, es mayor que la
eficacia esperada (EE), puede suponerse que existe un sinergismo
entre el agente inductor de actividad quitinolítica (quitina) y el
sulfuro de hidrógeno (de D. desulfuricans), cuando se aplican
simultáneamente en el mismo tratamiento. Los valores conseguidos se
presentan en la tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
| Eficacia experimental (E) y anticipada (EE) | ||
| Tratamiento 4 | ||
| E | EE | |
| Radopholus similis | 0,48 | 0,35 |
En el tratamiento 4, se combinan un inductor de
actividad quitinolítica (quitina) y una fuente biológica de sulfuro
de hidrógeno (D. sulfuricans). En este caso, la eficacia
experimental (E) fue mayor que la eficacia esperada (EE), así
demostrando la existencia de sinergismo (en cuanto a su actividad
nematicida) entre los dos compuestos cuando se aplican
simultáneamente en el suelo.
En tubos de 100 ml para la recogida de gases, se
recogieron muestras de la corriente de gas de la fermentación de
cepas C-924 y DSM 20162 en birreactores de 5L. El
tiempo total de cultivo fue de 24 h. La formación de sulfuro de
hidrógeno se detectó por primera vez a las 16 h.
Las muestras se procesaron de la misma forma que
para el patrón de H_{2}S generado. El análisis se llevó a cabo en
un cromatógrafo Varian de gases, bajo las siguientes
condiciones:
- \bullet
- Detector fotométrico de llama con filtro sensible a compuestos que contienen sulfuro.
- \bullet
- Patrón de sulfuro de hidrógeno: 43,2 ng/ml, en duplicado
- \bullet
- Muestras: en duplicado para cada tiempo de muestreo
- \bullet
- Inyección: 1 ml o \mul de espacio de cabecera
- \bullet
- Columna: DB-5 (15 m x 0,53 mm)
- \bullet
- Temperatura: 35ºC
- \bullet
- Vehículo de gas: Nitrógeno 1,5 ml/min
- \bullet
- Detector: FPD-S
- \bullet
- Gas de purga: Nitrógeno 30 ml/min
La tabla 5 muestra un resumen del análisis de los
gases de sulfuro emitidos por las dos cepas en los diferentes
tiempos.
\vskip1.000000\baselineskip
| Flujo de H_{s}S mg/min (flujo de sulfuro detectado) | ||||||
| Cepa | Muestra | 16 horas | 18 horas | 20 horas | 22 horas | 24 horas |
| C-924 | 1 | 0.0.673 | 0,2208 | 0,4779 | 0,3578 | 0,0672 |
| 2 | 0,0659 | 0,2160 | 0,4755 | 0,3552 | 0,0680 | |
| DSM 29162 | 1 | 0,0231 | 0,0416 | 0,1014 | 0,1863 | 0,0009 |
| 2 | 0,0240 | 0,0422 | 0,1040 | 0,1887 | 0,0097 |
Ambas cepas producen sulfuros, pero
C-294 produce un flujo mayor que la cepa DSM
20162.
Se utilizaron las cepas Corynebacterium
paurometabolum C-924, Tsukamurella
paurometabola DSM 20162, Serratia marcescen ATCC 13880 y
E. Coli ATCC 25922.
Los cultivos bacterianos de las cepas del estudio
se cultivaron en medio LB a 28ºC y 100 rpm durante 24 horas, seguido
de centrifugación a 3500 rpm. Los sobrenadantes se filtraron a
través de dos mallas de 0,2 \mum. El producto filtrado se ensayó
en placas preparadas con una suspensión coloidal de quitina (0,5%),
con la adición además de agarosa, hasta el 0,8%, para conseguir que
el medio formase un gel y para asegurar la porosidad para facilitar
la difusión de la proteína. Después de formar el gel, se abrieron
pocillos de 5 mm en donde se añadieron 100 \mul del sobrenadante
de cada cepa bacteriana. Se utilizaron tres réplicas para cada
placa, y se incubaron a 28ºC en la
oscuridad.
oscuridad.
A partir de la hora 48, se observó una reducción
en la turbiedad del medio que tenía la apariencia de un halo, lo que
demostró hidrólisis de quitina. En la siguiente tabla (tabla 6), se
muestran los resultados cualitativos de la aparición de un halo de
hidrólisis a diferentes tiempos de incubación con el sobrenadante
del cultivo de las diferentes cepas estudiadas.
| Cepas | 24 horas | 48 horas | 72 horas |
| S. marcescen | Negativo | Positivo | Positivo +++ |
| C. paurometabolum | Negativo | Negativo | Positivo ++ |
| T. paurometabola | Negativo | Negativo | Positivo + |
| E. coli | Negativo | Negativo | Negativo |
| +++ se refiere al halo de hidrólisis más grande, | |||
| ++ se refiere al halo de hidrólisis intermedio, y | |||
| + se refiere al halo de hidrólisis más pequeño |
Ambas cepas (C. Paurometabolum y T.
Paurometabola) mostraron el halo de hidrólisis de quitina, igual
que el control positivo utilizado (S. Marcescen); sin
embargo, la cepa de E. Coli (control negativo) no produjo
ningún halo de hidrólisis.
Se utilizaron los huevos del parásito Fasciola
hepatica. Las muestras de huevos se tomaron directamente de
bilis bovina infectada (de ganado), que se había sacrificado
anteriormente. El contenido de la bilis se resuspendió en tres
volúmenes de agua destilada y se dejó en reposo durante 2 a 3 horas
a 28ºC para conseguir la precipitación del huevo. A continuación,
se eliminó el mayor volumen posible de líquido sobrenadante. El
precipitado se filtró a través de una malla de tamización de 71
\mum, en donde se quedaron atrapados los huevos.
A partir de este momento, toda manipulación se
realizó bajo condiciones estériles en un flujo vertical laminar,
utilizando placas de 24 pocillos de cultivo de tejidos. El cribado
con los huevos de F. Hepatica se introdujo en una solución
de Hibitane a 0,5% durante 3 minutos, y a continuación, se lavó
tres veces con medio LB diluido 10 veces en agua estéril destilada.
Una vez desinfectada, se eliminaron los huevos del cribado y se
resuspendieron cuidadosamente con solución del medio LB diluido 10
veces en agua estéril destilada. Los resultados finales de la
recogida y la desinfección se comprobaron mediante el recuento y
registro de las larvas vivas con un microscopio invertido
Olympus.
También se registraron observaciones de la
uniformidad del estado evolucionario en esta fase.
Los huevos de este parásito se eclosionan bajo
las condiciones impuestas anteriormente en el experimento in
vitro en aproximadamente 15 días de incubación a 28ºC; se
considera una preparación buena de la muestra cuando más del 60% de
los huevos se eclosionan al término del periodo de incubación.
Para desarrollar el experimento, los huevos
desinfectados se colocaron en aproximadamente 100 individuos en 1 ml
de medio LB diluido 10 veces. El volumen se introdujo de forma
uniforme en las 20 válvulas de seguridad que permiten que el aire
atraviese el liquido; así, los gases hacen contacto con los huevos.
Cada válvula fue una réplica (4 por tratamiento) en cada uno de los
cinco tratamientos.
Los huevos de F. Hepatica se expusieron a
los siguientes tratamientos durante los últimos 4 días de
incubación:
- 1.
- Tratamiento control: adición de 1 ml de medio LB diluido 10 veces a cada válvula, sin quitinasa, y con el aire circulando.
- 2.
- Adición a cada válvula de 1 ml de sobrenadante quitinolítico sin células bacterianas de un cultivo de 10^{10} unidades formadoras de colonias por cada mililitro (UFC/ml) de Corynebacterium paurometabolum C-924.
- 3.
- Adición a cada válvula de 1 ml de sobrenadante quitinolítico sin células bacterianas de 10^{10} UFC/ml de Tsukamurella paurometabola DSM 20162.
- 4.
- Se permitió que el flujo de gases de un cultivo continuo de Corynebacterium paurometabolum C-924 a 10^{10} UFC/ml atravesara las válvulas.
- 5.
- Se permitió que el flujo de gases de un cultivo continuo de Tsukamurella paurometabola DSM 20162 a 10^{10} UFC/ml atravesara las válvulas.
- 6.
- Tratamiento combinado: aplicación simultánea de tratamientos 2 y 4.
- 7.
- Tratamiento combinado: aplicación simultánea de tratamientos 3 y 5.
Al cuarto día después del inicio del experimento,
se contaron los huevos eclosionados. En el caso de F.
Hepatica, no fue posible contar las larvas (miracidas) que
salieron debido a su gran movilidad; por lo tanto, las
observaciones a través del microscopio se han enfocado en los
huevos. Se muestran los resultados de eficacia de los diferentes
tratamientos en la tabla 7. Son valores medios para las 4 réplicas
en cada tratamiento. Letras iguales indican una falta de
diferencias significativas (p<0.05) entre los
tratamientos.
| Eficacia de tratamiento (E)* | |||||||
| 1. E | 2. Eq | 3. Eq | 4. Es | 5. Es | 6. E. | 7. E. | |
| Control | C-924 | DSM20162 | C-924 | DSM20162 | (2+4) | (3+5) | |
| Fasciola hepatica | 0,00 (a) | 0,18 (b) | 0.11(c) | 0.29 (d) | 0.16(b, c) | 0.52 (e) | 0.28(d) |
| \begin{minipage}[t]{155mm} La eficacia* se calcula restando el valor de la frecuencia relativa de eclosión (Fr) de 1. Fr es la relación entre el número de huevos eclosionados en cada tratamiento (Ntto) y el número de huevos eclosionados en el tratamiento 1 (Nc):\end{minipage} | |||||||
E = 1 - Fr, donde Fr = Ntto/Nc;
\hskip0,3cm por tanto, \hskip0,3cm E = 1 -
Ntto/Nc
Para determinar el posible efecto sinérgico en
los tratamientos 6 y 7, se supuso que los acontecimientos (efectos
antiparásitos) que se produjeron durante los tratamientos no son
exclusivos.
Para este tipo de análisis, la eficacia esperada
(EE) se calcula de la eficacia debida a la acción de quitinasa (Eq)
y la eficacia debida a la acción de sulfuro de hidrógeno (Esn, Esf
y Esd), menos el efecto de intersección (ei) (Sigarroa, A. 1985.
Biometría y diseño experimental. 1ra Parte. Minist. Educación Sup.
Ed. Pueblo y Educación. Cap. 3. pag 69-107).
EE = Eq + Es -
ei, \hskip0,3cm donde \hskip0,3cm ei = Eq x
Es
Si la eficacia experimental (E) en los
tratamientos en donde se combinan dos agentes antiparásitos
(tratamientos 6 y 7) es mayor que la eficacia esperada para dichos
tratamientos, se puede suponer que existe sinergismo en términos de
actividad antiparásita del agente quitinolítico (quitinasa) y
sulfuro de hidrógeno cuando los dos se aplican simultáneamente en
el mismo tratamiento. Los valores conseguidos se resumen en la
tabla 8.
| Eficacia experimental (E) y anticipada (EE) | ||||
| Tratamiento 6 | Tratamiento 7 | |||
| E | EE | E | EE | |
| Fasciola hepatica | 0,52 | 0,31 | 0,28 | 0,25 |
En los tratamientos en donde se combinan
quitinasa y sulfuro de hidrógeno, la eficacia experimental (E) fue
mayor que la eficacia esperada (EE), que demuestra el sinergismo de
los dos compuestos cuando actúan de forma concurrente en términos
de su actividad nematicida.
Se utilizaron las siguientes especies de hongo:
Pestalotia palmarum, Altemaria tabacina, Sarocladium ozirae,
Pitium debaryanum; y también se utilizaron las siguientes
especies de bacteria: Erwinia chyrsanthemi, Burkholderia glumae,
Serratia marcescen ATCC 13880, Bacillus subtilis F 1695 y
Escherichia coli ATCC 25922.
La interacción de Corynebacterium
paurometabolum C-924 sobre hongos se ensayó con
estos tres hongos: Pestalotia palmarum, Alternaria tabacina,
Sarocladium orizae y Pytium debayianum. La cepa de
Serratia marcescen ATCC 13880 se utilizó como el control
positivo para actividad fungicida y la cepa de E. Coli ATCC
25922 se utilizó como el control negativo para actividad fungicida.
Los cultivos de bacterias se cultivaron en las condiciones estándar
de agitación y temperatura para todas las especies durante 24 horas.
Las diluciones necesarias se llevaron a cabo con absorción a
\lambda 530 nm para asegurar una concentración de células de
10^{9} ufc/ml. Se colocaron en placas Petri que contenían medio
PDA (agar-patata-dextrosa); los
inóculos se recogieron de una línea central con la ayuda de un asa
microbiológica. Las placas se incubaron durante 48 horas a 28ºC, y a
continuación, se inocularon discos con un diámetro de 8 mm de las
diferentes cepas de hongo anteriormente cultivadas (placas que
contenían el medio PDA) y se colocaron en la superficie de la placa
en cada eje con respecto a la línea central de las bacterias
inoculadas. Se utilizaron tres réplicas para cada hongo en estudio
y se incubaron durante 10 días a 28ºC. Los resultados se leyeron en
el día cinco desde el comienzo del experimento.
La aparición de interacción de Corynebacterium
paurometobolum C-924, E. Coli ATCC 25922
y Bacillus subtilis F 1695 se estudió en las siguientes
bacterias: Erwinia chrysanthanem y Burkholderia
glumae. La cepa de Bacillus subtilis F 1695 se utilizó
como control positivo para el antagonismo con otras bacterias, para
el control negativo, se utilizó la cepa de E. Coli ATCC
25922. Las cepas bacterianas se cultivaron en el medio LB bajo las
condiciones habituales de temperatura y de agitación durante 24
horas. De estos cultivos, se llevaron a cabo las diluciones
necesarias, con lectura previa de absorción a \lambda 530 nm para
asegurar una concentración de células de 10^{9} ufc/ml. En el
caso de C-924, gotitas de 5 \mul se aplicaron a
tres sitios distintos en placas con medio LB, a dos sitios distintos
para el control positivo y a dos otros sitios distintos para el
control negativo. Las placas se incubaron a 28ºC durante 48 horas.
Al cabo de este periodo, se trataron con vapor de cloroformo a 28ºC
durante 3 minutos (para desactivar y evitar la dispersión en los
siguientes pasos), y a continuación, las placas de dejaron en el
flujo laminar, medio abiertas, para eliminar el exceso de gas. La
inoculación de las cepas de exposición Erinia chrysanthemi y
Burkholderia glumae se realizó, partiendo de cultivos puros
de cada microorganismo del que se extrajeron las cantidades
necesarias para proporcionar una concentración celular de 10^{9}
ufc/ml, después de añadir hasta tres mililitros de medio LB
parcialmente sólido (0,1% agar técnico núm. 3). La mezcla se
dispersó sobre las placas que contenían las cepas de exposición, y
a continuación, se incubaron a 28ºC durante 48 horas para evaluar
los resultados.
La tabla 9 muestra la descripción de los
resultados conseguidos durante los ensayos de interacción descritos
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
| Especie | Descripción | Efecto antagonista |
| de la cepa C-924 | ||
| Pestalotia palmarum | \begin{minipage}[t]{80mm}Hongo, Deuteromiceto, fitopatogénico para hojas y frutas\end{minipage} | + + + |
| Alternaria tabacina | \begin{minipage}[t]{80mm}Hongo, Deuteromiceto, fitopatogénico para las hojas de tabaco\end{minipage} | + + + |
| Sarocladium orizae | \begin{minipage}[t]{80mm}Hongo, Deuteromiceto, fitopatogénico para el arroz, está involucrado en el complejo de acurus-hongo, que afecta a las semillas, la vaina y el cuello\end{minipage} | + + |
| Pytium debaryanum | \begin{minipage}[t]{80mm}Hongo, Oomiceto, vive en la tierra y forma parte del complejo nocivo de amortización\end{minipage} | + |
| Especie | Descripción | Efecto antagonista |
| de la cepa C-924 | ||
| Erwinia chrysantemi | \begin{minipage}[t]{80mm}Bacteria, aislada de los tallos de Dahlia con síntomas de podrido blando\end{minipage} | + + + |
| Burkholderia glumae | \begin{minipage}[t]{80mm}Bacteria, aislada de las plantas de arroz con necrosis atípica y marginal\end{minipage} | + + |
| Bacillus subtilis Cepa F1695 | \begin{minipage}[t]{80mm}Bacteria, aislada de la rizosfera de la patata en un campo afectado libre de podrido. Bioregulador\end{minipage} | - |
| \begin{minipage}[t]{155mm} + + +: Se observa antagonismo fuerte si el crecimiento se termina y aparece un halo por el efecto de C-924. En el caso de los hongos, se inhibe el crecimiento radial típico.\end{minipage} | ||
| + +: Efecto de antagonismo medio de C-924 sobre el microorganismo. | ||
| +: Efecto de antagonismo leve de C-924 sobre el microorganismo. |
Tal como se indica en la tabla 9, existe un
efecto antagonista acusado de la cepa Corynebacterium
paurometabolum C-924 sobre el hongo
Pestlotioa palmarum, Altemaria tabacina y
Sacrocladium orizae, que se caracterizan por tener un
contenido alto de quitina en sus estructuras. Sólo se observó un
antagonismo leve debido a la acción de sulfuro de hidrógeno. En el
caso de interacción con las bacterias estudias, el antagonismo se
observó en las dos cepas patógenas (Erwinia chrysanthemi y
Burkholderia glumae), mientras que no se observó antagonismo
en el caso de Bacillus subtilis, ya que se aisló de una
tierra antagonista con otros microorganismos y, por lo tanto, era
más resistente a los factores medioambientales adversos.
Claims (22)
1. Una composición para uso agrícola o
veterinario que comprende al menos un agente quitinolítico o agente
inductor de actividad quitinolítica, y sulfuro o un agente
productor de sulfuro.
2. Una composición según la reivindicación 1, en
donde dicho agente quitinolítico es una quitinasa.
3. Una composición según la reivindicación 1, en
donde dicho agente quitinolítico es un agente productor de
quitinasa.
4. Una composición según la reivindicación 3, en
donde el agente productor de quitinasa es un microorganismo que
contiene entre 10^{7} unidades formadoras de colonias (UFC) y
10^{12} UFC de dicho microorganismo por gramo de composición.
5. Una composición según la reivindicación 1, en
donde dicho agente productor de actividad quitinolítica es
quitina.
6. Una composición según la reivindicación 5, en
donde el intervalo de quitina es del 1% al 50%.
7. Una composición según la reivindicación 1, en
donde dicho agente productor de sulfuro es un microorganismo.
8. Una composición según la reivindicación 7, que
contiene entre 10^{7} UFC y 10^{12} UFC de dicho microorganismo
por gramo de composición.
9. Una composición según la reivindicación 1, en
donde dichos agentes productores de sulfuro son agentes
químicos.
10. Una composición según la reivindicación 1, en
donde la producción de sulfuro está entre 0,1 mg/minuto y 1,0
mg/minuto por gramo de composición.
11. Una composición según la reivindicación 1, en
donde el agente quitinolítico y el agente productor de sulfuro son
un microorganismo.
12. Una composición según las reivindicaciones 1
a 11, para el control de zoonematodos parásitos.
13. Una composición según la reivindicación 12,
en donde los zoonematodos parásitos son Heamonchus spp,
Tricholstrongylus spp y Dictiocalus spp.
14. Una composición según las reivindicaciones 1
a 11, para el control de nematodos parásitos de plantas.
15. Una composición según la reivindicación 14,
en donde los nematodos parásitos de plantas son Meloidogyne
spp y Radopholus similis.
16. Una composición según las reivindicaciones 1
a 11, para el control de bacterias patógenas de plantas y
animales.
17. Una composición según la reivindicación 16,
en donde las bacterias patógenas son Erwinia spp. y
Burkholderia spp.
18. Una composición según las reivindicaciones 1
a 11, para el control de hongos patógenos de plantas y animales.
19. Una composición según la reivindicación 18,
en donde los hongos patógenos son Pestalotia palmarum, Alternaria
tabacina y Sarcocladium orizae.
20. Una composición según las reivindicaciones 1
a 11, para el control de trematodos parásitos.
21. Una composición según la reivindicación 20,
en donde el trematodo parásito es Fasciola hepatica.
22. Una composición para el uso agrícola y/o
veterinario según las reivindicaciones anteriores, en donde dicho
vehículo puede ser un fertilizante, una tierra precintada, un
dispositivo para el encubrimiento de semillas, un polvo, un
granulado, un nebulizador, una suspensión, un líquido, o cualquiera
de las formas indicadas, en una formulación encapsulada para el
control de helmintos, bacterias y hongos parásitos.
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