ES2247115T3 - Diagnosis, prevencion y tratamiento de la enfermedad de crohn utilizando el antigeno ompc. - Google Patents
Diagnosis, prevencion y tratamiento de la enfermedad de crohn utilizando el antigeno ompc.Info
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- ES2247115T3 ES2247115T3 ES01935666T ES01935666T ES2247115T3 ES 2247115 T3 ES2247115 T3 ES 2247115T3 ES 01935666 T ES01935666 T ES 01935666T ES 01935666 T ES01935666 T ES 01935666T ES 2247115 T3 ES2247115 T3 ES 2247115T3
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Abstract
Un método para diagnosticar la enfermedad de Crohn en un sujeto, que comprende determinar la presencia o ausencia de anticuerpos IgA anti-OmpC en una muestra de dicho sujeto, en el que la presencia de dichos anticuerpos IgA anti-OmpC indica que dicho sujeto tiene la enfermedad de Crohn.
Description
Diagnosis, prevención y tratamiento de la
enfermera de Crohn utilizando el antígeno OmpC.
La invención se refiere en general a los campos
de la inmunología y de la enfermedad inflamatoria intestinal, y más
específicamente al diagnóstico y tratamiento de la enfermedad de
Crohn usando un antígeno bacteriano, la proteína de membrana externa
C (OmpC).
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es la
expresión colectiva usada para describir dos trastornos
gastrointestinales de etiología desconocida: la enfermedad de Crohn
(EC) y la colitis ulcerosa (CU). La evolución y pronóstico de la
EII, que se da en todo el mundo y se ha informado que afecta a no
menos de dos millones de personas, varía ampliamente. El comienzo de
la EII es predominantemente en la edad adulta temprana con diarrea,
dolor abdominal y fiebre como síntomas iniciales más comunes. La
diarrea puede oscilar de leve a intensa, y la anemia y pérdida de
peso son signos adicionales comunes de EII. Del diez al quince por
ciento de todos los pacientes con EII necesitarán cirugía a lo largo
de un periodo de diez años. Además, los pacientes con EII tienen un
riesgo incrementado de desarrollo de cáncer intestinal. Los informes
de una incidencia incrementada de problemas psicológicos, que
incluyen ansiedad y depresión,
quizás no son síntomas sorprendentes de lo que es a menudo una enfermedad debilitante en la plenitud de la vida.
quizás no son síntomas sorprendentes de lo que es a menudo una enfermedad debilitante en la plenitud de la vida.
Desafortunadamente, las terapias disponibles para
la enfermedad inflamatoria intestinal son escasas, y tanto el
diagnóstico como el tratamiento han sido obstaculizados por la falta
de conocimiento relativo a la etiología de la enfermedad. Lo que
está claro, sin embargo, es que una combinación de factores
genéticos, desencadenantes exógenos y microflora endógena puede
contribuir a la lesión mediada por el sistema inmune de la mucosa
intestinal observada en la enfermedad inflamatoria intestinal. En la
enfermedad de Crohn se ha implicado a las bacterias en el inicio y
la progresión de la enfermedad: la inflamación intestinal en la
enfermedad de Crohn es notable por su sensibilidad frecuente a los
antibióticos y su susceptibilidad al flujo fecal bacteriano. Se ha
implicado a la flora intestinal normal y a patógenos nuevos en la
enfermedad de Crohn por medio de detección directa o por medio de
respuestas inmunes antimicrobianas asociadas a la enfermedad.
Además, en muchos modelos animales genéticamente susceptibles de
colitis crónica, los microorganismos luminales son un cofactor
necesario para la enfermedad; los animales albergados en un entorno
sin gérmenes no desarrollan colitis. Sin embargo, a pesar de muchas
pruebas directas e indirectas del papel de los microorganismos
entéricos en la enfermedad de Crohn, no se han identificado los
organismos y antígenos patógenos que contribuyen a la desregulación
inmune observada en esta enfermedad.
Los análisis diagnósticos actuales para la
enfermedad de Crohn son incapaces de detectar todos los pacientes
con la enfermedad. Así, la identificación de antígenos microbianos
nuevos asociados con la enfermedad de Crohn proporcionaría reactivos
que pueden incrementar la sensibilidad de los análisis diagnósticos
actuales. Además, tales antígenos microbianos pueden albergar un
epítopo de células T relacionado con la enfermedad y, como
inductores originales o contribuyentes de la respuesta inmune
asociada a la enfermedad, pueden ser antígenos tolerógenos efectivos
para tratar la enfermedad de Crohn.
Así, existe la necesidad de identificar los
antígenos microbianos asociados con la enfermedad de Crohn, que se
pueden usar para mejorar la sensibilidad de los análisis
diagnósticos actuales para esta enfermedad. La presente invención
satisface esta necesidad y también proporciona ventajas
relacionadas.
La presente invención proporciona un método para
diagnosticar la enfermedad de Crohn en un sujeto determinando la
presencia o ausencia de anticuerpos IgA
anti-proteína de membrana externa C (OmpC) en una
muestra del sujeto, en el que la presencia de los anticuerpos IgA
anti-OmpC indica que el sujeto tiene la enfermedad
de Crohn. Un método de la invención se puede poner en práctica, por
ejemplo, poniendo en contacto una muestra de un sujeto con un
antígeno OmpC, o con su fragmento reactivo, en condiciones adecuadas
para formar un complejo del antígeno OmpC, o de su fragmento
reactivo, y el anticuerpo IgA para el antígeno OmpC; poniendo en
contacto el complejo con un anticuerpo anti-IgA; y
detectando la presencia o ausencia de anticuerpos IgA
anti-OmpC, en donde la presencia de los anticuerpos
IgA anti-OmpC en el sujeto indica que el sujeto
tiene la enfermedad de Crohn. En una realización, la invención se
pone en práctica usando un antígeno OmpC que tiene sustancialmente
la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 1. En otra realización,
los anticuerpos IgA anti-OmpC se detectan con un
análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas.
La invención proporciona además un método para
diagnosticar la enfermedad de Crohn determinando la presencia o
ausencia de anticuerpos IgA anti-OmpC en una muestra
del sujeto y la presencia o ausencia de anticuerpos IgA
anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA) en una muestra del
sujeto, en el que la presencia de anticuerpos IgA
anti-OmpC o la presencia de IgA ASCA en la muestra
del sujeto indican cada una de forma independiente que el sujeto
tiene la enfermedad de Crohn. La presencia de IgA ASCA se puede
determinar, por ejemplo, mediante reactividad con fosfopeptidomanano
(PPM) purificado de pared celular de levaduras, que se puede
preparar, por ejemplo, a partir de la cepa ATCC #38926.
La invención proporciona adicionalmente un método
para diagnosticar la enfermedad de Crohn determinando la presencia o
ausencia de anticuerpos IgA anti-OmpC en una muestra
del sujeto y la presencia o ausencia de anticuerpos IgA
anti-polipéptido I-2 en una muestra
del sujeto, en el que la presencia de anticuerpos IgA
anti-OmpC o la presencia de anticuerpos IgA
anti-polipéptido I-2 en la muestra
del sujeto indican cada una de forma independiente que el sujeto
tiene la enfermedad de Crohn. En una realización, la presencia de
anticuerpos IgA anti-polipéptido I-2
se determina mediante reactividad de IgA con un polipéptido
I-2 que tiene sustancialmente la secuencia de
aminoácidos de ID SEC Nº: 3.
La invención proporciona además un método para
diagnosticar la enfermedad de Crohn en un sujeto determinando la
presencia o ausencia de anticuerpos IgA anti-OmpC en
una muestra del sujeto; determinando la presencia o ausencia de
anticuerpos IgA ASCA en una muestra del sujeto; y determinando la
presencia o ausencia de anticuerpos IgA
anti-polipéptido I-2 en una muestra
del sujeto, en el que la presencia de los anticuerpos IgA
anti-OmpC, la presencia de IgA ASCA o la presencia
de anticuerpos IgA anti-polipéptido
I-2 indican cada una de forma independiente que el
sujeto tiene la enfermedad de Crohn. En una realización, este método
incluye además la etapa de determinar la presencia o ausencia de
anticuerpos antineutrófilo perinucleares (pANCA) en una muestra del
sujeto.
La invención proporciona además el uso de un
antígeno OmpC, o su fragmento tolerógeno, para preparar un
medicamento para inducir tolerancia en un paciente con enfermedad de
Crohn. Un antígeno OmpC útil para un medicamen-
to para inducir tolerancia puede tener sustancialmente, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 1.
to para inducir tolerancia puede tener sustancialmente, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 1.
La Figura 1 muestra la reactividad de IgA OmpC y
la reactividad de IgA I-2 de sueros de pacientes que
tienen la enfermedad de Crohn.
La Figura 2 muestra la reactividad de IgA OmpC y
la reactividad de IgA ASCA de sueros de pacientes que tienen la
enfermedad de Crohn.
La Figura 3 muestra la reactividad de IgA OmpC y
la reactividad de IgG OmpC de sueros de pacientes que tienen la
enfermedad de Crohn.
La Figura 4 muestra la reactividad de IgA e IgG
OmpC de sueros de individuos normales.
La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos
de OmpC de E. coli (ID SEC Nº: 1).
La Figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos
de I-2 (ID SEC Nº: 2) y la secuencia de aminoácidos
predicha (ID SEC Nº: 3).
La presente invención se dirige al descubrimiento
apasionante de que los anticuerpos IgA para la proteína de membrana
externa C (OmpC) están asociados a la enfermedad de Crohn. Como se
muestra en la Figura 4, solamente un único individuo sin la
enfermedad de Crohn ("normal") tuvo reactividad de IgA OmpC
mayor de 0,2_{405}, aunque muchos individuos normales mostraron
una reactividad de IgG OmpC significativa. En contraste con los
individuos normales, hubo presente una reactividad significativa de
IgA OmpC en los sueros de muchos pacientes que tenían la enfermedad
de Crohn (véase la Figura 1). Además, esta reactividad fue
aparentemente distinta, en gran parte, de la reactividad de IgA
I-2 e IgA ASCA observada en los sueros de los
pacientes con enfermedad de Crohn (figuras 1 y 2). Estos resultados
se resumen en la Tabla 1, que indica que la reactividad de IgA OmpC
junto con la reactividad de IgA ASCA, reactividad de pANCA y
reactividad de polipéptido I-2 es un sistema
diagnóstico sumamente sensible que puede detectar el 86% de los
pacientes con enfermedad de Crohn. Además, como se muestra la Tabla
2, la reactividad de IgA OmpC por sí misma detectó un 55% de
pacientes que tienen la enfermedad de Crohn. Estos resultados
indican que la reactividad de IgA OmpC puede ser valiosa para
aumentar el número de pacientes con enfermedad de Crohn a los que se
les diagnostica la enfermedad, facilitando por ello un tratamiento
precoz y más apropiado.
| Total | Panel | IgA | pANCA | I2 | % adicional | % acumulado | |
| ASCA+ | OmpC+ | detectado | detectado | ||||
| Cohorte de EC | 153 | 86 | 56% | 56% | |||
| Panel ASCA- | 67 | 31 | 20% | 76% | |||
| Panel ASCA-/OmpC- | 36 | 12 | 8% | 84% | |||
| Panel ASCA-/OmpC-/pANCA- | 24 | 2 | 1% | 86% | |||
| % total detectado: \hskip0.7cm 86% \hskip1.3cm 86% |
| Total | Panel ASCA+ | OmpC+ | pANCA | I2 | |
| \; \hskip1.4cm n: | 153 | 86 | 84 | 36 | 79 |
| % detectado: | 56% | 55% | 24% | 52% |
Basándose en lo anterior, la presente invención
proporciona un método para diagnosticar la enfermedad de Crohn en un
sujeto determinando la presencia o ausencia de anticuerpos IgA
anti-OmpC en una muestra del sujeto, en el que la
presencia de los anticuerpos IgA anti-OmpC indica
que el sujeto tiene la enfermedad de Crohn. Un método de la
invención se puede poner en práctica, por ejemplo, poniendo en
contacto una muestra de un sujeto con un antígeno OmpC, o con su
fragmento reactivo, en condiciones adecuadas para formar un complejo
del antígeno OmpC, o de su fragmento reactivo, y el anticuerpo IgA
para el antígeno OmpC; poner en contacto el complejo con un
anticuerpo anti-IgA; y detectar la presencia o
ausencia de anticuerpos IgA anti-OmpC, en el que la
presencia de los anticuerpos IgA anti-OmpC en el
sujeto indica que el sujeto tiene la enfermedad de Crohn. En una
realización, la invención se pone en práctica usando un antígeno
OmpC que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de ID SEC
Nº: 1. En otra realización, los anticuerpos IgA
anti-OmpC se detectan con un análisis de
inmunoabsorción ligado a
enzimas.
enzimas.
La proteína de membrana externa C ("OmpC")
útil en los métodos de la invención es una "porina", una clase
de proteínas transmembrana que se encuentran en las membranas
externas de las bacterias, que incluyen bacterias entéricas gram
negativas tales como E. coli. Las porinas de la membrana
externa de una célula de E. coli proporcionan canales para el
paso de disacáridos, fosfato y moléculas similares. Las porinas
pueden ser trímeros de subunidades idénticas ordenadas para formar
una estructura en forma de tonel con un poro en el centro (Lodish
et al., Molecular Cell Biology, capítulo 14
(1995)).
OmpC es una de las principales proteínas porinas
que se encuentran en las membranas externas de bacterias tales como
E. coli. OmpC es similar en estructura y función a la
proteína de membrana externa F ("OmpF"). Ambas se ensamblan en
forma de trímeros en la membrana externa para formar canales acuosos
que permiten la difusión pasiva de pequeñas moléculas hidrofílicas a
través de la barrera hidrofóbica. Sin embargo, los poros de OmpC
tienen un diámetro de 1,1 nm, mientras los poros de OmpF tienen un
diámetro de 1,2 nm. Esta diferencia da como resultado una velocidad
más lenta de difusión a través de los poros de OmpC que a través de
los poros de OmpF.
La expresión de porina puede estar influenciada
por las condiciones ambientales, que incluyen osmolaridad,
temperatura, fase de crecimiento y concentración de toxinas. Por
ejemplo, en el intestino, donde tanto las concentraciones de
moléculas de nutrientes como de toxinas son relativamente altas,
OmpC, con un diámetro de poro inferior, es la porina predominante
(Pratt et al., Mol. Micro., 20:911-917
(1996)).
Como se usa aquí, la expresión "antígeno
OmpC" u "OmpC" significa una proteína que tiene una
homología lineal o conformacional con OmpC. Un antígeno OmpC se
puede derivar de una bacteria gram negativa, tal como E.
coli, y puede ser un homólogo de especie de OmpC de E.
coli (ID SEC Nº: 1), que se muestra en la Figura 5. Una
secuencia similar para un antígeno OmpC ha sido publicada por Mizuno
et al. (JBC, 258:6932-6940 (1983)). En
la naturaleza, un antígeno OmpC es una proteína que forma una
estructura trimérica en la membrana externa de las bacterias que
permite el paso de moléculas pequeñas, o un precursor de tal
proteína.
Como se usa aquí, la expresión antígeno OmpC u
OmpC significa una proteína que tiene una identidad de aminoácidos
de al menos el 50% con OmpC de E. coli (ID SEC Nº: 1)
mostrada en la Figura 5. Un antígeno OmpC puede tener, por ejemplo,
una identidad de aminoácidos de al menos el 60%, 70%, 80%, 85%, 90%
ó 95% con ID SEC Nº: 1, determinada dicha identidad de aminoácidos
con CLUSTALW usando la matriz BLOSUM 62 con los parámetros por
defecto. Para el uso en los métodos de la invención, se puede
purificar parcialmente un antígeno OmpC, por ejemplo, mediante lisis
de esferoplastos procedentes de células deficientes en OmpA y OmpF
como se describe en el Ejemplo IV, o se puede preparar de forma
similar a partir de una diversidad de otras cepas de E. coli,
que pueden contener OmpA y OmpF además de OmpC. Un antígeno OmpC se
puede preparar también de forma recombinante expresando una
secuencia de ácido nucleico codificante tal como la disponible en
GenBank con número de acceso K00541 mediante métodos bien conocidos
en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.
Nueva York (1999)).
Los métodos de la invención se refieren a
determinar la presencia o ausencia de anticuerpos IgA
anti-OmpC en un sujeto. Como se usa aquí, la
"presencia de anticuerpos IgA anti-OmpC"
significa reactividad de IgA con un antígeno OmpC que es mayor de
dos desviaciones estándar por encima de la reactividad media de IgA
anti-OmpC de sueros de control (normales) analizados
en las mismas condiciones.
Los métodos de la invención se refieren al
diagnóstico y tratamiento de la enfermedad de Crohn (enteritis
regional), que es una enfermedad de inflamación crónica que puede
implicar cualquier parte del tracto gastrointestinal. Comúnmente,
están afectados la parte distal del intestino delgado (íleon) y
ciego. En otros casos, la enfermedad se limita al intestino delgado,
colon o región anorrectal. La enfermedad de Crohn implica
ocasionalmente el duodeno y estómago, y más raramente el esófago y
la cavidad oral.
Las manifestaciones clínicas variables de la
enfermedad de Crohn son, en parte, resultado de la localización
anatómica variable de la enfermedad. Los síntomas más frecuentes de
la enfermedad de Crohn son dolor abdominal, diarrea y fiebre
recurrente. La enfermedad de Crohn se asocia comúnmente a
obstrucción o fístula intestinal, que es un conducto anormal entre
asas intestinales afectadas, por ejemplo. La enfermedad de Crohn
también incluye complicaciones tales como inflamación de los ojos,
articulaciones y piel; hepatopatía; cálculos renales o amiloidosis.
Además, la EC se asocia con un riesgo aumentado de cáncer
intestinal.
Diversas propiedades son características de la
patología de la enfermedad de Crohn. La inflamación asociada con la
EC, conocida como inflamación transmural, implica todas las capas de
la pared intestinal. El engrosamiento y edema, por ejemplo, aparecen
también típicamente por toda la pared intestinal, con fibrosis
presente también en la enfermedad de larga duración. La inflamación
característica de la EC también es discontinua, ya que los segmentos
de tejido inflamado, conocidos como "lesiones segmentarias",
están separados por intestino aparentemente normal. Además, las
úlceras lineales, edema e inflamación del tejido intermedio conducen
a una apariencia de "empedrado" de la mucosa intestinal que es
distintiva de la EC.
Un sello de la enfermedad de Crohn es la
presencia de agregaciones discretas de células inflamatorias,
conocidas como granulomas, que se hallan generalmente en la
submucosa. Algunos casos de enfermedad de Crohn muestran los típicos
granulomas discretos, mientras otros muestran una reacción
granulomatosa difusa o inflamación transmural inespecífica. Como
resultado, la presencia de granulomas discretos es indicativa de EC,
aunque la ausencia de granulomas también es compatible con la
enfermedad. Así, la inflamación transmural o discontinua, más que la
presencia de granulomas, es un indicador diagnóstico preferido de la
enfermedad de Crohn (Rubín y Farber, Pathology (segunda
edición) Filadelfia: J.B. Lippincott Company (1994)).
En contraste con la colitis ulcerosa, que se
caracteriza por una inflamación continua del colon que normalmente
es más grave de forma distal que proximal, la enfermedad de Crohn es
una enfermedad desigual, frecuentemente sin afectación del recto.
Además, la inflamación en la enfermedad de Crohn es distinta de la
inflamación superficial observada en la colitis ulcerosa, que
normalmente se limita a la capa mucosa y se caracteriza por un
infiltrado inflamatorio agudo con neutrófilos y abscesos de cripta.
En su lugar, la enfermedad de Crohn afecta a todo el grosor de la
pared intestinal con granulomas presentes a menudo, aunque no
siempre. Además, la implicación del íleon terminal, una apariencia
de empedrado, úlceras discretas o fístulas sugieren la enfermedad de
Crohn. Las características que sirven para distinguir la enfermedad
de Crohn de la colitis ulcerosa se resumen en la Tabla 3 (Rubín y
Farber, anteriormente mencionado, 1994).
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Propiedad \+ \hskip2cm \+ Enfermedad de
Crohn \+ \hskip2cm \+ Colitis ulcerosa \cr
Macroscópica \+\+\+\+\cr Pared intestinal engrosada \+ \+
Típica \+ \+ Poco común\cr Estrechamiento luminal \+ \+ Típica \+
\+ Poco común\cr Lesiones segmentarias \+ \+ Común \+ \+
Ausente\cr Predominio de colon derecho \+ \+ Típica \+ \+
Ausente\cr Fisuras y fístulas \+ \+ Común \+ \+ Ausente\cr Ulceras
circunscritas \+ \+ Común \+ \+ Ausente\cr Ulceras lineales
confluentes \+ \+ Común \+ \+ Ausente\cr Pseudopólipos \+ \+
Ausente \+ \+ Común\cr \+\+\+\+\cr Microscópica \+\+\+\+\cr
Inflamación transmural \+ \+ Típica \+ \+ Poco común\cr Fibrosis
submucosa \+ \+ Típica \+ \+ Ausente\cr Fisuras \+ \+ Típica \+ \+
Rara\cr Granulomas \+ \+ Común \+ \+ Ausente\cr Abscesos de cripta
\+ \+ Poco común \+ \+
Típica\cr}
Como se usa aquí, el término "sujeto"
significa cualquier animal capaz de tener enfermedad inflamatoria
intestinal, que incluye un humano, primate no humano, conejo, rata o
ratón, especialmente un humano. Un sujeto puede tener uno o más
síntomas de la enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, o estar
asintomático.
Una muestra útil en los métodos de la invención
se puede obtener a partir de cualquier líquido biológico que tiene
anticuerpos, tal como, por ejemplo, sangre entera, plasma, saliva u
otro líquido o tejido corporal, preferiblemente suero.
Como se usa aquí, el término "fragmento"
significa un péptido, polipéptido o compuesto que contiene
aminoácidos de origen natural, aminoácidos de origen no natural o
aminoácidos modificados químicamente. Un fragmento reactivo o
fragmento tolerógeno de un antígeno OmpC puede ser también una
molécula mimética peptídica, que es una estructura química no
aminoácida que imita la estructura de un péptido que tiene una
secuencia de aminoácidos, con tal que la molécula peptidomimética
mantenga una reactividad preferente con anticuerpos IgA de los
sueros de pacientes con enfermedad de Crohn o una actividad
tolerógena, como se define aquí. Tal molécula mimética se
caracteriza generalmente por exhibir características físicas
similares tales como tamaño, carga o hidrofobicidad en la misma
distribución espacial encontrada en su equivalente peptídico. Un
ejemplo específico de una molécula mimética peptídica es un
compuesto en el que el enlace amida entre uno o más de los
aminoácidos se sustituye, por ejemplo, por un enlace
carbono-carbono u otro enlace bien conocido en la
técnica (véase, por ejemplo, Sawyer, Peptide Based Drug
Design, ACS, Washington (1995)).
Como se usa aquí, el término "aminoácido" se
refiere a uno de los veinte aminoácidos de origen natural, que
incluyen, a menos que se indique de otra forma,
L-aminoácidos y D-aminoácidos. El
término aminoácido también se refiere a compuestos tales como
aminoácidos modificados químicamente, que incluyen análogos de
aminoácidos, aminoácidos de origen natural que no se incorporan
normalmente a proteínas, tales como norleucina, y compuestos
sintetizados químicamente que se sabe que tienen propiedades
conocidas en la técnica características de un aminoácido, siempre
que el compuesto se pueda sustituir dentro de un péptido de forma
que conserve la reactividad con los sueros de la enfermedad de Crohn
o la actividad tolerógena. Se enumeran ejemplos de aminoácidos y
análogos de aminoácidos en Gross y Meienhofer, The Peptides:
Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, Inc., Nueva York
(1983). Un aminoácido también puede ser una molécula mimética de
aminoácido, que es una estructura que exhibe sustancialmente la
misma disposición espacial de grupos funcionales que un aminoácido,
pero no tiene necesariamente los grupos
\alpha-amino y \alpha-carboxilo
característicos de un aminoácido.
Un fragmento reactivo o tolerógeno de un antígeno
OmpC útil en la invención se puede producir o sintetizar usando
métodos bien conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen métodos
de ADN recombinante y métodos de síntesis química para la producción
de un péptido. Los métodos recombinantes para producir un péptido
por medio de la expresión de una secuencia de ácido nucleico que
codifica el péptido en una célula hospedadora adecuada se conocen
bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Ausubel et
al., anteriormente mencionado, 1999.
Un fragmento reactivo o tolerógeno de un antígeno
OmpC útil en la invención también se puede producir mediante
síntesis química, por ejemplo, mediante el método de síntesis
peptídica en fase sólida de Merrifield et al., J. Am.
Chem. Soc. 85:2149 (1964). También se pueden usar métodos de
disolución estándar conocidos en la técnica para sintetizar un
fragmento reactivo o tolerógeno útil en la invención (véase, por
ejemplo, Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis,
Springer-Verlag, Berlín (1984) y Bodanszky,
Peptide Chemistry, Springer-Verlag, Berlín
(1993)). Un péptido recién sintetizado se puede purificar, por
ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), y
se puede caracterizar usando, por ejemplo, espectrometría de masas o
análisis de secuencia de aminoácidos.
Se entiende que se pueden hacer modificaciones
limitadas a un antígeno OmpC sin destruir su función biológica. De
forma similar, se pueden hacer modificaciones limitadas a un
fragmento reactivo de un antígeno OmpC o a un fragmento tolerógeno
de este antígeno sin destruir su reactividad o su actividad
tolerógena. Una modificación de un antígeno revelado aquí que no
destruye su reactividad preferente con los anticuerpos IgA en los
sueros de pacientes que tienen la enfermedad de Crohn, o una
modificación de un antígeno revelado aquí que no destruye la
actividad tolerógena, está dentro de la definición de un antígeno
OmpC. De forma similar, una modificación de un fragmento reactivo de
un antígeno revelado aquí que no destruye su capacidad para formar
un complejo con anticuerpos IgA en el suero de un paciente que tiene
la enfermedad de Crohn está dentro de la definición de un fragmento
reactivo. Además, una modificación de un fragmento tolerógeno de un
antígeno OmpC que no destruye su capacidad para producir una
respuesta inmunológica disminuida está dentro de la definición de un
fragmento tolerógeno de un antígeno OmpC. Una modificación puede
ser, por ejemplo, una adición, deleción o sustitución de residuos de
aminoácido; una sustitución de un compuesto que imita la estructura
o función de un aminoácido; o una adición de restos químicos tales
como grupos amino o acetilo. La actividad de un antígeno OmpC
modificado o un fragmento modificado de un antígeno OmpC se puede
analizar, por ejemplo, usando uno de los análisis de reactividad o
actividad tolerógena revelados aquí.
Una modificación particularmente útil confiere
una estabilidad incrementada. La incorporación de uno o más
D-aminoácidos es una modificación útil para
incrementar la estabilidad de un antígeno OmpC o de su fragmento. De
forma similar, la deleción o sustitución de lisina puede incrementar
la estabilidad protegiendo contra la degradación. Por ejemplo, una
sustitución tal puede incrementar la estabilidad y, así, la
biodisponibilidad de un antígeno OmpC o de su fragmento tolerógeno,
siempre que la sustitución no altere significativamente la
reactividad o la actividad tolerógena.
La invención proporciona además un método para
diagnosticar la enfermedad de Crohn determinando la presencia o
ausencia de anticuerpos IgA anti-OmpC en una muestra
del sujeto y la presencia o ausencia de anticuerpos IgA
anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA) en una muestra del
sujeto, en el que la presencia de anticuerpos IgA
anti-OmpC o la presencia de IgA ASCA en la muestra
del sujeto indican cada una de forma independiente que el sujeto
tiene la enfermedad de Crohn. La presencia de IgA ASCA se puede
determinar, por ejemplo, mediante reactividad con fosfopeptidomanano
(PPM) purificado de pared celular de levaduras, que se puede
preparar, por ejemplo, a partir de la cepa ATCC #38926. Los métodos
para determinar la presencia de IgA ASCA se ejemplifican aquí en el
Ejemplo III. Como se usa aquí, la "presencia de IgA ASCA"
significa reactividad de IgA con S. cerevisiae que es mayor
del 20% de la reactividad dada como referencia (positivo conocido)
en sueros de la enfermedad de
Crohn.
Crohn.
Los anticuerpos anti-Saccharomyces cerevisiae
(ASCA) están elevados de forma característica en pacientes que
tienen la enfermedad de Crohn, aunque la naturaleza del antígeno de
S. cerevisiae que mantiene la respuesta específica de
anticuerpo en la EC es desconocida (Sendid et al.,Clin.
Diag. Lab. Immunol., 3:219-226 (1996)). Estos
anticuerpos pueden representar una respuesta contra levaduras
presentes en alimentos o bebidas comunes, o una respuesta contra
levaduras que colonizan el tracto gastrointestinal. Los estudios con
oxidación con peryodato han demostrado que los epítopos reconocidos
por ASCA en sueros de pacientes con EC contienen polisacáridos. Los
epítopos de oligomanósido son compartidos por una diversidad de
organismos que incluyen diferentes cepas y géneros de levaduras,
hongos filamentosos, virus, bacterias y glicoproteínas humanas. Así,
las respuestas de anticuerpos inducidas por manosa en la EC pueden
representar una respuesta contra un organismo patógeno de levadura o
pueden representar una respuesta contra un epítopo de oligomanósido
de reacción cruzada presente, por ejemplo, en un autoantígeno
glicoproteico humano. Independientemente de la naturaleza del
antígeno, las concentraciones elevadas de ASCA sérica son un
marcador diferencial de la enfermedad de Crohn, con concentraciones
bajas de ASCA informadas solamente en los pacientes de CU (Sendid
et al., anteriormente mencionado, 1996).
Se puede detectar IgA ASCA usando un antígeno
específico para ASCA, que es cualquier antígeno o mezcla de
antígenos al que se une específicamente ASCA. Aunque los anticuerpos
ASCA se caracterizaron inicialmente por su capacidad para unirse a
S. cerevisiae, los expertos en la técnica entenderán que se
puede obtener un antígeno específico para ASCA a partir de S.
cerevisiae, o que se puede obtener a partir de una diversidad de
otras fuentes con tal que el antígeno sea capaz de unirse
específicamente a los anticuerpos ASCA. Por lo tanto, las fuentes
ejemplares de un antígeno específico para ASCA contempladas para el
uso en los métodos de la invención incluyen células muertas enteras
de levadura, tales como las de los géneros Saccharomyces y
Candida, fosfopeptidomanano (PPM) de pared celular de
levaduras, oligomanósidos, neoglicolípidos, anticuerpos de idiotipo
anti-ASCA y similares. Como se describió
anteriormente, se pueden usar diferentes especies y cepas de
levaduras, que incluyen Saccharomyces, como antígeno
específico para ASCA en los métodos proporcionados aquí. Por
ejemplo, las cepas de S. cerevisiae Su1, Su2, CBS 1315 ó BM
156, o la cepa de Candida albicans VW32, se pueden usar como
antígeno específico para ASCA en los métodos de la invención.
Las preparaciones de mananos de pared celular de
levaduras, o fosfopeptidomananos (PPM), también se contemplan aquí
como antígenos específicos para ASCA. Estos antígenos de superficie
hidrosolubles se pueden preparar mediante técnicas de extracción
apropiadas, que incluyen autoclavar como se describe en el Ejemplo
III, o se pueden obtener comercialmente (véase Lindberg et
al., Gut 33:909-913 (1992)). La fracción
ácida estable de PPM de pared celular de levaduras también puede ser
útil en los métodos de la invención (Sendid et al.,
anteriormente mencionado, 1996). Un PPM ejemplar para uso para
diagnosticar subtipos clínicos de la enfermedad de Crohn se deriva
de la cepa de S. cerevisiae ATCC #38926.
Los antígenos oligosacáridos purificados, tales
como oligomanósidos específicos para ASCA, también se contemplan
para uso en los métodos de la invención. Para uso aquí, los
antígenos de oligomanósido purificados se convierten preferiblemente
en neoglicolípidos como se describe en Faille et al., Eur.
J. Microbiol. Infect. Dis. 11:438-446 (1992). Un
experto en la técnica entiende que la reactividad de tal antígeno de
oligomanósido con ASCA se puede optimizar variando la longitud de la
cadena de manosilo (Frosh et al., Proc. Natl. Cad. Sci.
USA, 82:1194-1198 (1985)); la configuración
anomérica (Fukazawa et al., In E. Kurstak (ed.),
Immunology of Fungal Disease, Marcel Dekker Inc., Nueva York,
págs. 37-62 (1989); Nishikawa et al.,
Microbiol. Immunol., 34:825-840 (1990);
Poulain et al., Eur. J. Clin. Microbiol.,
23:46-52 (1993); Shibata et al., Arch.
Biochem. Biophys., 243:338-348 (1985); y Trinel
et al., Infect. Immun., 60:3845-3851
(1992)); o la posición del enlace (Kikuchi et al.,
Planta, 190:525-535 (1993)).
Un antígeno de oligomanósido específico para ASCA
puede incluir la manotetraosa
Man(1-3)Man(1-2)Man(1-2)Man,
y se puede purificar a partir de PPM como se describe en Faille
et al., anteriormente mencionado, 1992. Se puede construir un
neoglicolípido ejemplar para uso en los métodos de la invención
liberando el oligomanósido de su PPM respectivo y uniendo
subsiguientemente el oligomanósido liberado a
4-hexadecilanilina o similar.
La invención proporciona adicionalmente un método
para diagnosticar la enfermedad de Crohn determinando la presencia o
ausencia de anticuerpos IgA anti-OmpC en una muestra
del sujeto y la presencia o ausencia de anticuerpos IgA
anti-polipéptido I-2 en una muestra
del sujeto, en el que la presencia de anticuerpos IgA
anti-OmpC o la presencia de anticuerpos IgA
anti-polipéptido I-2 en la muestra
del sujeto indican cada una de forma independiente que el sujeto
tiene la enfermedad de Crohn. En una realización, la presencia de
anticuerpos IgA anti-polipéptido I-2
se determina mediante reactividad de IgA contra un polipéptido
I-2 que tiene sustancialmente la secuencia de
aminoácidos de ID SEC Nº: 3.
Los métodos de la invención se refieren a
determinar la presencia o ausencia de anticuerpos IgA
anti-polipéptido I-2 en una muestra
de un sujeto. Como se usa aquí, la "presencia de anticuerpos IgA
anti-polipéptido I-2" o
"anticuerpos IgA anti-polipéptido
I-2" significa reactividad de IgA contra un
polipéptido I-2 que es mayor de dos desviaciones
estándar por encima de la reactividad media de IgA
anti-I-2 de los sueros de control
(normales) analizados en las mismas condiciones.
Como se usa aquí, la expresión "polipéptido
I-2" significa un polipéptido que tiene
sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido
I-2 microbiano (ID SEC Nº: 3) mostrado en la Figura
6. El polipéptido I-2 microbiano (ID SEC Nº: 3) es
un polipéptido de 100 aminoácidos que comparte cierta similitud con
reguladores transcripcionales bacterianos, con la máxima similitud
en los 30 aminoácidos aminoterminales. El ácido nucleico codificante
de I-2 (ID SEC Nº: 2) está presente de forma
diferencial en el tejido implicado en la enfermedad de Crohn,
comparado con la mucosa macroscópicamente libre de enfermedad. Se
puede preparar un polipéptido I-2, o su fragmento
reactivo, por ejemplo, usando métodos recombinantes como se expone
en el Ejemplo IV.
Un polipéptido I-2 que tiene
sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº: 3
puede ser el polipéptido I-2 de origen natural (ID
SEC Nº: 3) o un polipéptido relacionado que tiene una similitud
sustancial de secuencia de aminoácidos con esta secuencia. Tales
polipéptidos relacionados incluyen variantes u homólogos de isotipo
de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 6. Como se usa
aquí, el término polipéptido I-2 describe de forma
general los polipéptidos que tienen generalmente una secuencia de
aminoácidos con una identidad mayor del 50%, preferiblemente una
identidad mayor de alrededor del 60%, más preferiblemente una
identidad mayor de alrededor del 70%, y pueden ser un polipéptido
que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos mayor de
alrededor del 80%, 90%, 95%, 97% ó 99% con ID SEC Nº: 3, dicha
identidad de aminoácidos determinada con CLUSTALW usando la matriz
BLOSUM 62 con parámetros por defecto.
La invención proporciona además un método para
diagnosticar la enfermedad de Crohn en un sujeto determinando la
presencia o ausencia de anticuerpos IgA anti-OmpC en
una muestra del sujeto; determinando la presencia o ausencia de
anticuerpos IgA ASCA en una muestra del sujeto; y determinando la
presencia o ausencia de anticuerpos IgA
anti-polipéptido I-2 en una muestra
del sujeto, en el que la presencia de anticuerpos IgA
anti-OmpC, la presencia de IgA ASCA o la presencia
de anticuerpos IgA anti-polipéptido
I-2 indican cada una de forma independiente que el
sujeto tiene la enfermedad de Crohn.
Estudios previos han demostrado reactividad de
ANCA en una pequeña parte de pacientes con enfermedad de Crohn,
aunque estos anticuerpos están elevados más frecuentemente en
pacientes con colitis ulcerosa. Se reveló un análisis para colitis
ulcerosa basado en las concentraciones de pANCA o pANCA e IgG
anti-OmpC, respectivamente, en Cohavy el al.
(Infect. Immun. 68, 1542-1548) y el documento
US 6.033.864. La prevalencia informada en EC varía del 0 al 43%, con
la mayoría de estudios que informan que del 10 al 30% de los
pacientes de EC expresan ANCA (véase, por ejemplo, Saxon et
al., J. Allergy Clin. Immunol. 86:202-210
(1990); Cambridge et al., Gut
33:668-674 (1992); Pool et al., Gut
3446-50 (1993); y Brokroelofs et al., Dio.
Dis. Sci. 39:545-549 (1994).
En un método de la invención, la presencia o
ausencia de pANCA se puede determinar opcionalmente en el sujeto,
por ejemplo, mediante reactividad con neutrófilos fijados. Como se
usa aquí, la expresión "anticuerpo citoplásmico antineutrófilo
perinuclear" es sinónimo de "pANCA", y se refiere a un
anticuerpo que reacciona específicamente con un neutrófilo para dar
una tinción de perinuclear a nuclear o una tinción citoplásmica con
un brillo perinuclear. Un método para determinar la presencia de
pANCA en un sujeto se ejemplifica aquí en el Ejemplo V.
La invención proporciona además el uso de un
antígeno OmpC, o su fragmento tolerógeno, para preparar un
medicamento para inducir tolerancia en un paciente con la enfermedad
de Crohn. Un antígeno OmpC útil para un medicamento para inducir
tolerancia puede incluir, por ejemplo, la secuencia ID SEC Nº:
1.
Como se usa aquí, la expresión "dosis
efectiva" significa la cantidad de un antígeno OmpC, o su
fragmento tolerógeno, útil para inducir tolerancia en un paciente
que tiene la enfermedad de Crohn. Para la inducción de tolerancia
oral, por ejemplo, se pueden administrar pequeñas dosis orales
múltiples, o se puede administrar una dosis grande. Tales dosis se
pueden extrapolar, por ejemplo, de la inducción de tolerancia en
modelos animales (véase, por ejemplo, Trentham et al.,
Science 261:1727-1730 (1993)).
Se conocen en la técnica diversas moléculas para
provocar, favorecer o aumentar la tolerancia, y un antígeno OmpC o
su fragmento tolerógeno se puede combinar, si se desea, con una
molécula tolerogenizadora. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU.
nº 5.268.454 y sus citas. Como se usa aquí, la expresión "molécula
tolerogenizadora" significa una molécula, compuesto o polímero
que provoca, favorece o aumenta la actividad tolerógena al
combinarla con un antígeno OmpC o con su fragmento. Una molécula
tolerogenizadora se puede conjugar opcionalmente con un antígeno
OmpC y puede ser, por ejemplo, polietilenglicol. Tales moléculas se
conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU.
nº 5.268.454, anteriormente mencionada).
Se puede administrar una dosis efectiva de un
antígeno OmpC, o su fragmento, para inducir tolerancia mediante
métodos bien conocidos en la técnica. La tolerancia oral se reconoce
en la técnica como método para tratar la enfermedad autoinmune
(véase, por ejemplo, Weiner, Hospital Practice, págs.
53-58 (15 de sept., 1995)). Por ejemplo, los
autoantígenos administrados oralmente reprimen varios modelos
autoinmunes experimentales de una forma específica de enfermedad y
antígeno; las enfermedades incluyen encefalomielitis, uveítis, y
miastenia autoinmunes experimentales, artritis inducida por colágeno
y adyuvantes, y diabetes en el ratón NOD (véase, por ejemplo, Weiner
et al., Ann. Rev. Immunol. 12:809-837
(1994)). Además, los ensayos clínicos de tolerancia oral han
producido resultados positivos al tratar la esclerosis múltiple,
artritis reumatoide y uveítis. Los modos de administración incluyen
administración parenteral e inyección subcutánea (Johnson, Ann.
Neurology 36 (supl.):S115-S117 (1994)).
La expresión "fragmento tolerógeno", como se
usa en relación a un antígeno OmpC, significa un péptido o porción
de polipéptido del antígeno que tiene actividad tolerógena, como se
define por su capacidad, ya sea solo o en combinación con otra
molécula, para producir una respuesta inmunológica disminuida. Así,
un fragmento tolerógeno de un antígeno OmpC es un péptido o
polipéptido que tiene sustancialmente la misma secuencia de
aminoácidos que una porción de ID SEC Nº: 1 y actividad tolerógena
como se define por su capacidad, ya sea solo o en combinación con
otra molécula, para producir una respuesta inmunológica disminuida.
Un fragmento tolerógeno de un antígeno OmpC puede tener de alrededor
de tres aminoácidos a alrededor de 90 aminoácidos. Un fragmento
tolerógeno de un antígeno OmpC puede tener, por ejemplo, al menos 5,
8, 10, 12, 15, 18, 20 ó 25 aminoácidos. Por ejemplo, un fragmento
tolerógeno de un antígeno OmpC puede tener de cinco a cincuenta
aminoácidos, de ocho a cincuenta aminoácidos, o de diez a cincuenta
aminoácidos. Más preferiblemente, un fragmento tolerógeno tiene de
ocho a veinte aminoácidos o de diez a veinte aminoácidos. Más
preferiblemente, un fragmento tolerógeno tiene de doce a veinte
aminoácidos o de quince a veinte aminoácidos.
Un fragmento tolerógeno de un antígeno OmpC se
puede identificar usando alguno de una diversidad de análisis, que
incluyen análisis in vitro tales como análisis de
proliferación de células T o de secreción de citocinas, y análisis
in vivo tales como la inducción de tolerancia en modelos
murinos de enfermedad inflamatoria intestinal. Los análisis de
proliferación de células T, por ejemplo, se reconocen en la técnica
como predictivos de actividad tolerógena (véase, por ejemplo,
Miyahara et al., Immunol. 86:110-115
(1995) o Lundin et al., J. Exp. Med.
178:187-196 (1993)). Se puede realizar un análisis
de proliferación de células T cultivando células T con células
presentadoras de antígenos irradiadas, tales como células normales
de bazo, en pocillos de microtitulación durante 3 días con
concentraciones variables del fragmento a analizar; añadiendo
^{3}H-timidina; y midiendo la incorporación de
^{3}H-timidina en el ADN. En tal análisis, se
puede analizar la actividad de un fragmento de un antígeno OmpC, por
ejemplo, a concentraciones de 20 \mug/ml y 40 \mug/ml.
Se puede identificar un fragmento tolerógeno de
un antígeno OmpC usando un análisis de secreción de citocinas en
células T conocido en la técnica. Por ejemplo, las células T se
pueden cultivar con células presentadoras de antígenos irradiadas en
pocillos de microtitulación con concentraciones variables del
fragmento de interés y, después de tres días, se puede analizar
IL-2, IL-4 ó
IFN-\gamma en los sobrenadantes de los cultivos
como se describe en Czerinsky et al., Immunol. Rev.
119:5-22 (1991).
Las células T primarias para uso en un análisis
de proliferación de células T o en un análisis de secreción de
citocinas, por ejemplo, se pueden aislar de lámina propia o de
sangre periférica. Además, una fuente conveniente de células T para
uso en un análisis in vitro de actividad tolerógena puede ser
una línea de células T establecida a partir de un paciente de EII,
tal como un paciente de enfermedad de Crohn, a partir de un modelo
murino de EII o a partir de un animal sano inmunizado con un
antígeno OmpC de la invención. Una fuente preferida de células T
para uso en la identificación de un fragmento tolerógeno de un
antígeno OmpC es un paciente con enfermedad de Crohn.
Se puede establecer una línea de células T a
partir de un paciente con EC o CU, por ejemplo, cultivando
linfocitos T con alrededor de 1 \mug/ml de antígeno OmpC
recombinante o proteína de fusión de OmpC, en presencia de
concentraciones bajas de IL-2 para apoyar el
crecimiento (alrededor de 10 \mug/ml). Se puede establecer una
línea de células T cultivando linfocitos T con células presentadoras
de antígenos y cultivando las células en un ciclo alternante de
cuatro a cinco días con IL-2 y un antígeno OmpC, o
solamente con IL-2, como se describe en Nanda et
al., J. Exp. Med. 176:297-302 (1992). Una
línea celular que se transforma en una línea celular proliferante
fiable dependiente de la presencia de un antígeno OmpC es
particularmente útil para identificar fragmentos tolerógenos. El
establecimiento de líneas de células T a partir de mucosa intestinal
se describe, por ejemplo, en Lundin et al., anteriormente
mencionado, 1993. Las líneas de células T dependientes de la
presencia de un antígeno OmpC y útiles para identificar fragmentos
tolerógenos de un antígeno OmpC se pueden preparar de forma
similar.
Un fragmento tolerógeno se puede identificar
también mediante su capacidad para inducir tolerancia in
vivo, como se indica por una respuesta inmunológica disminuida,
que puede ser una respuesta de células T disminuida, tal como una
respuesta proliferativa o respuesta de secreción de citocinas
disminuida como se describió anteriormente, o un título de
anticuerpos disminuido para el antígeno. Un ratón neonatal o adulto
se puede hacer tolerante con un fragmento de un antígeno OmpC, y se
puede analizar una respuesta de células T o un título de anticuerpo
anti-OmpC después de una prueba de provocación
mediante inmunización. Por ejemplo, un ratón neonatal se puede hacer
tolerante dentro de las 48 horas después del nacimiento mediante
administración intraperitoneal de alrededor de 100 \mug de un
fragmento de un antígeno OmpC emulsionado con adyuvante incompleto
de Freund, e inmunizado subsiguientemente con polipéptido
I-2 aproximadamente a las 8 semanas de edad (véase,
por ejemplo, Miyahara, anteriormente mencionado, 1995). Un ratón
adulto se puede hacer tolerante intravenosamente con alrededor de
0,33 mg de un fragmento de un antígeno OmpC, administrado
diariamente durante tres días (dosis total 1 mg), e inmunizado una
semana después con un antígeno OmpC. Se puede medir una respuesta de
células T disminuida, tal como proliferación o secreción de
citocinas disminuida, que indica actividad tolerógena, usando
células T recogidas 10 días después de la inmunización. Además, se
puede analizar un título de anticuerpos anti-OmpC
disminuido, que también indica actividad tolerógena, usando sangre
recogida 4-8 semanas después de la inmunización. Los
métodos para analizar una respuesta de células T o un título de
anticuerpos anti-antígeno OmpC se describieron
anteriormente y se conocen bien en la técnica.
Se puede identificar también un fragmento
tolerógeno de un antígeno OmpC usando un modelo murino de enfermedad
inflamatoria intestinal. Se pueden hacer tolerantes ratones
neonatales o adultos que tienen una enfermedad similar a EII con un
fragmento de un antígeno OmpC como se describió anteriormente, y
analizar la respuesta de células T o el título de anticuerpos
anti-OmpC. Una respuesta de células T disminuida o
un título disminuido de anticuerpos para el antígeno indica una
respuesta inmunológica disminuida y, así, sirve para identificar un
fragmento tolerógeno de un antígeno OmpC. Además, se puede
identificar un fragmento tolerógeno de un antígeno OmpC mediante la
capacidad de reducir la frecuencia, momento de inicio o gravedad de
la colitis en un modelo murino de EII.
Pueden ser útiles diversos modelos murinos
aceptados de enfermedad inflamatoria intestinal para identificar un
fragmento tolerógeno de un antígeno OmpC. Por ejemplo, los ratones
con interrupción dirigida del gen que codifica la subunidad alfa de
la proteína-G Gi2, es un modelo bien conocido que
exhibe características de la enfermedad intestinal humana (Hornquist
et al., J. Immunol. 158:1068-1077
(1997); Rudolph et al., Nat. Genet.
10:143-150 (1995)). Los ratones deficientes en
IL-10 como se describe en Kühn et al.,
Cell 75:263-274 (1993), y los ratones
deficientes en IL-2 como se describe en Sadlack
et al., Cell 75:253-261 (1993),
también tienen enfermedad similar a colitis y son útiles para
identificar un fragmento tolerógeno de un antígeno OmpC. Además, los
ratones con mutaciones en el receptor \alpha de células T (TCR),
TCR \beta, TCR \beta x \delta, o el complejo principal de
histocompatibilidad (MHC) de clase II, como se describe en Mombaerts
et al., Cell 75:275-282 (1993), desarrollan
enfermedad inflamatoria intestinal y, así, son útiles para
identificar un fragmento tolerógeno de un antígeno OmpC. De forma
similar, se puede analizar la actividad tolerógena de un fragmento
en un ratón SCID reconstituido con células T CD45RB CD4+, que es un
modelo aceptado de enfermedad inflamatoria intestinal, como se
describe en Powrie et al., Immunity
1:553-562 (1994). Los modelos animales adicionales
de EII también se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo,
Podolsky, Acta Gastroenterol. Belg.
60:163-165 (1997); y Bregenholt et al.,
APMIS 105:655-662 (1997)). Así, un fragmento
tolerógeno de un antígeno OmpC se puede identificar fácilmente
mediante un análisis in vitro o in vivo revelado aquí,
o mediante otro análisis bien conocido en la técnica.
Se puede identificar un fragmento reactivo o
tolerógeno de un antígeno OmpC cribando una gran colección, o
biblioteca, de péptidos de interés o péptidos aleatorios en función
de su reactividad o actividad tolerógena. Por ejemplo, se puede
cribar un panel de péptidos que abarcan la secuencia entera de un
antígeno OmpC en función de su reactividad o actividad tolerógena
como se describió anteriormente. Tal panel puede ser un panel de
péptidos de 15 unidades monoméricas que abarcan la secuencia del
antígeno OmpC (ID SEC Nº: 1), que se solapan entre sí en tres o
cinco residuos usando el Mimotope Cleavable Pin Technology
(Cambridge Research Biochemicals, Wilmington, DE), como se describe
en Geysen et al., Science 235:1184 (1987). El panel se
criba subsiguientemente en función de su reactividad o actividad
tolerógena usando uno de los análisis descritos anteriormente
(véase, por ejemplo, Miyahara et al., anteriormente
mencionado, 1995). Una biblioteca de péptidos para cribar también
puede ser una población de péptidos relacionados en la secuencia de
aminoácidos con ID SEC Nº: 1, pero que tienen uno o más aminoácidos
que difieren de ID SEC Nº: 1.
Los péptidos adicionales para cribar incluyen,
por ejemplo, bibliotecas químicas marcadas de péptidos y moléculas
peptidomiméticas. Las bibliotecas de péptidos comprenden también las
generadas mediante tecnología de presentación de fagos. La
tecnología de presentación de fagos incluye la expresión de
moléculas peptídicas en la superficie del fago así como otras
metodologías mediante las cuales un ligando proteico se asocia o se
puede asociar con el ácido nucleico que lo codifica. Se conocen en
la técnica los métodos para la producción de bibliotecas de
presentación de fagos, que incluyen vectores y métodos para
diversificar la población de péptidos que se expresan (véase, por
ejemplo, Smith y Scott, Methods Enzymol.
217:228-257 (1993); Scott y Smith, Science
249:386-390 (1990); y Huse, documentos WO 91/07141 y
WO 91/07149. Se pueden usar éstos u otros métodos conocidos para
producir una biblioteca de presentación de fagos que se puede
cribar, por ejemplo, con uno de los análisis revelados en función de
la reactividad o actividad tolerógena. Si se desea, se puede
analizar en masa una población de péptidos. Por ejemplo, para
identificar un fragmento reactivo de un antígeno OmpC, se puede
analizar en una población de péptidos la capacidad para formar un
complejo con sueros de pacientes que contienen reactividad de IgA
anti-antígeno OmpC; la población activa se puede
subdividir, y se puede repetir el análisis para aislar el fragmento
reactivo de la población.
Se puede identificar un fragmento reactivo o
tolerógeno de un antígeno OmpC cribando, por ejemplo, fragmentos del
polipéptido producidos mediante escisión química o proteolítica. Se
conocen en la técnica métodos para la escisión química y
proteolítica y para la purificación de los fragmentos proteicos
resultantes (véase, por ejemplo, Deutscher, Methods in
Enzymology, vol. 182, "Guide to Protein Purification", San
Diego: Academic Press, Inc. (1990)). Por ejemplo, se puede usar un
producto químico tal como bromuro de cianógeno o una proteasa tal
como tripsina, quimotripsina, proteasa V8, endoproteinasa
Lys-C, endoproteinasa Arg-C o
endoproteinasa Asp-N para producir fragmentos
convenientes de un antígeno OmpC que se pueden cribar en función de
su reactividad o actividad tolerógena usando uno de los análisis
revelados aquí.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, pero
no limitar, la presente invención.
Ejemplo
I
Este ejemplo describe la purificación de OmpC
usando lisis de esferoplastos.
Se inocularon E. coli mutantes
OmpF-'-/OmpA-'- de una reserva de glicerol en 10-20
ml de caldo Luria Bertani suplementado con 100 \mug/ml de
estreptomicina (LB-Strep), y se cultivó
vigorosamente a 37ºC durante \sim8 horas hasta la fase
exponencial. Este cultivo iniciador se usó para inocular un litro de
medio LB-Strep, y el cultivo de 1 L se dejó crecer
durante menos de 15 horas.
Las células se recogieron mediante centrifugación
(JS-4.2, 4K/15 min/4ºC). Si fue necesario, las
células se lavaron dos veces con 100 ml de Tris-Cl
20 mM de pH 7,5 helado. Las células se resuspendieron
subsiguientemente en tampón helado de formación de esferoplastos
(Tris-Cl 20 mM de pH 7,5, 20% de sacarosa, EDTA 0,1
M de pH 8,0, 1 mg/ml de lisozima), tras lo cual las células
resuspendidas se incubaron en hielo durante 20 minutos a 2 horas
mezclando ocasionalmente mediante inversión.
Si fue necesario, los esferoplastos se
centrifugaron (JA-17, 5,5K/10 min/4ºC) y se
resuspendieron en un volumen menor de tampón de formación de
esferoplastos (SFB). El sedimento de esferoplastos se congeló
opcionalmente antes de la resuspensión para mejorar la eficacia de
la lisis. Se evitó el tampón hipotónico para evitar la ruptura de
los esferoplastos y la liberación del ADN cromosómico, que disminuye
significativamente la eficacia de la lisis.
La preparación de esferoplastos se diluyó 14
veces en Tris-Cl 10 mM de pH 7,5 helado, 1 mg/ml de
DNasa-I, y se agitó en vórtex vigorosamente. La
preparación se sometió a ultrasonidos en hielo 4 x 30 segundos a un
50% de potencia en el programa 4, con un pulso "puntual" de 1
segundo, sin formación de espuma o sobrecalentamiento de la
muestra.
Los restos celulares se sedimentaron mediante
centrifugación (JA-17, 5-10K/10
min/4ºC), y el sobrenadante se extrajo y se aclaró mediante
centrifugación una segunda vez (10K/10 min/4ºC). El sobrenadante se
extrajo sin recoger ninguna parte del sedimento, y se colocó en
tubos de ultracentrífuga. Los tubos se llenaron hasta 1,5 milímetros
del extremo superior con Tris-Cl 20 mM de pH
7,5.
La preparación de membranas se sedimentó mediante
ultracentrifugación a 100.000 g (35K/1 hora/ 4ºC en el rotor de
tambor flotante SW 60 de Beckman). El sedimento se resuspendió
homogeneizando en Tris-Cl 20 mM de pH 7,5 usando una
punta de pipeta azul de 1 ml y aplicando de cerca un chorro de
tampón al sedimento antes de aspirar y dispensar durante
aproximadamente \sim10 min por tubo.
El material se extrajo en un tubo con tapón de
rosca de 15 ml lleno con 4 ml durante 1 hora en
Tris-Cl 20 mM de pH 7,5 con 1% de SDS, con rotación
a 37ºC. La preparación se transfirió a tubos de ultracentrifugación,
y la membrana se sedimentó a 100.000 g (35K/1 hora/4ºC en Beckman SW
60). El sedimento se resuspendió homogeneizando en
Tris-Cl 20 mM de pH 7,5 como antes. La preparación
de membranas se dejó opcionalmente a 4ºC durante la noche.
Se extrajo OmpC durante 1 hora con rotación a
37ºC en Tris-Cl 20 mM de pH 7,5, 3% de SDS, y NaCl
0,5 M (SDS precipita si se almacena por debajo de 37ºC). El material
se transfirió a tubos de ultracentrifugación, y las membranas se
sedimentaron mediante centrifugación a 100.000 g (35K/1
hora/30ºC en Beckman SW 60). Se evitaron las temperaturas más
bajas, ya que un enfriamiento adicional da como resultado que la
proteína extraída precipite de la disolución.
El sobrenadante que contenía OmpC extraído se
dializó después con más de 10.000 volúmenes para eliminar el alto
contenido en sales. SDS se eliminó mediante intercambio de
detergente con 0,2% de Tritón. Tritón se eliminó mediante diálisis
adicional con Tris-Cl 50 mM.
OmpC purificado, que funciona como una porina en
su forma trimérica, se caracteriza como sigue cuando se analiza
mediante SDS-PAGE. La electroforesis a temperatura
ambiente dio como resultado una escalera de bandas de \sim100 kDa,
\sim70 kDa y \sim30 kDa. El calentamiento durante
10-15 minutos a 65-70ºC disoció
parcialmente el complejo y dio como resultado solamente dímeros y
monómeros (bandas de \sim70 kDa y \sim30 kDa). La ebullición
durante 5 minutos dio como resultado monómeros de 38 kDa.
Ejemplo
II
Este ejemplo describe un análisis de ELISA para
la detección directa de anticuerpos IgA anti-OmpC en
sueros de pacientes.
El análisis ELISA directo de OmpC se realizó como
sigue. Se revistieron placas (Immulon 3, DYNEX Technologies,
Chantilly, VA) durante la noche a 4ºC con 100 \mul/pocillo de OmpC
preparado como se describió anteriormente a 0,25 \mug/ml en suero
salino tamponado con borato, pH 8,5. Después de tres lavados en
0,05% de Tween 20 en solución salina tamponada con fosfato (PBS),
las placas se bloquearon con 150 \mul/pocillo de 0,5% de albúmina
de suero bovino en PBS, pH 7,4 (BSA-PBS) durante 30
minutos a temperatura ambiente (TA). La disolución de bloqueo se
desechó después, y se añadieron 100 \mul/pocillo de suero de
pacientes de enfermedad de Crohn, pacientes de colitis ulcerosa y
controles normales diluidos al 1:100, y se incubaron durante 2 horas
a temperatura ambiente. Después de lavar las placas como antes, se
añadió anticuerpo indicador conjugado a fosfatasa alcalina
(anti-IgA humana de cabra (específica de cadena
\alpha) de Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a las placas a
una dilución de 1:1000 en
BSA-PBS, y se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas se lavaron subsiguientemente tres veces con 0,05% de Tween 20 en suero salino tamponado con fosfato, seguido de otros tres lavados con suero salino normal tamponado con Tris, pH 7,5. Se añadió la disolución de sustrato (1,5 mg/ml de fosfato de p-nitrofenol disódico (Amresco; Solon, OH), MgCl_{2} 2,5 mM, Tris 0,01 M, pH 8,6) a 100 \mul/pocillo, y se dejó desarrollar color durante una hora antes de leer las placas a 405 nm.
BSA-PBS, y se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas se lavaron subsiguientemente tres veces con 0,05% de Tween 20 en suero salino tamponado con fosfato, seguido de otros tres lavados con suero salino normal tamponado con Tris, pH 7,5. Se añadió la disolución de sustrato (1,5 mg/ml de fosfato de p-nitrofenol disódico (Amresco; Solon, OH), MgCl_{2} 2,5 mM, Tris 0,01 M, pH 8,6) a 100 \mul/pocillo, y se dejó desarrollar color durante una hora antes de leer las placas a 405 nm.
La reactividad positiva de IgA OmpC se definió
como la reactividad mayor de dos desviaciones estándar por encima de
la reactividad media obtenida con sueros de control (normales)
analizados a la vez que las muestras de prueba.
Ejemplo
III
Este ejemplo demuestra que se puede determinar la
presencia de anticuerpos IgA anti-Saccharomyces cerevisiae en
sueros de pacientes usando un análisis ELISA en microplacas.
Se preparó manano de pared celular de levadura
como sigue, y como se describe en Faille et al. Eur. J.
Clin. Microbiol. Infect. Dis. 11:438-446 (1992)
y en Kocourek y Ballou et al., J. Bacteriol.
100:1175-1181 (1969). Se obtuvo un sedimento
liofilizado de levadura Saccharomyces uvarum de la American
Type Culture Collection (#38926). Se reconstituyeron las levaduras
en 10 ml de medio 2X YT, preparado según Sambrook et al.,
Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989). Se cultivó S. uvarum durante dos a tres días a 30ºC.
El cultivo terminal de S. uvarum se inoculó en una placa de
agar 2X YT y se cultivó subsiguientemente durante dos a tres días a
30ºC. Se usó una única colonia para inocular 500 ml de medio 2X YT,
y se cultivó durante dos a tres días a 30ºC. Se preparó medio de
fermentación (pH 4,5) añadiendo 20 g de glucosa, 2 g de extracto
Bacto-yeast, 0,25 g de MgSO_{4} y 2,0 ml de
H_{3}PO_{4} del 28%, por litro de agua destilada. El cultivo de
500 ml se usó para inocular 50 litros de medio de fermentación, y se
fermentó el cultivo durante tres a cuatro días a 37ºC.
Se preparó extracto de manano de S. uvarum
añadiendo 50 ml de tampón citrato 0,02 M (5,88 g/l de citrato
sódico; pH 7,0 +/- 0,1) a cada 100 gramos de pasta celular. La
mezcla células/citrato se autoclavó a 125ºC durante noventa minutos
y se dejó enfriar. Después de centrifugar a 5000 rpm durante 10
minutos, se extrajo el sobrenadante y se conservó. Después se
lavaron las células con 75 ml de tampón citrato 0,02 M y la mezcla
células/citrato se autoclavó otra vez a 125ºC durante noventa
minutos. La mezcla células/citrato se centrifugó a 5000 rpm durante
10 minutos, y se conservó el sobrenadante.
Para precipitar complejos cobre/manano, se añadió
un volumen igual de disolución de Fehling a los sobrenadantes
combinados con agitación. La disolución completa de Fehling se
preparó mezclando disolución de Fehling A con disolución de Fehling
B en una proporción 1:1 justo antes de usarla. Los complejos de
cobre se dejaron posar, y se decantó el líquido suavemente del
precipitado. Los complejos cobre/manano del precipitado se
disolvieron después en 6-8 ml de HCl 3 N por 100
gramos de pasta de levadura.
La disolución resultante se vertió con agitación
vigorosa en 100 ml de metanol:ácido acético 8:1, y el precipitado se
dejó posar durante varias horas. Se decantó el sobrenadante y se
desechó; después se repitió el procedimiento de lavado hasta que el
sobrenadante fue incoloro, aproximadamente dos o tres veces. El
precipitado se recogió en un embudo de vidrio sinterizado, se lavó
con metanol y se secó al aire durante la noche. En algunas
ocasiones, el precipitado se recogió mediante centrifugación a 5000
rpm durante 10 minutos antes de lavar con metanol y secar al aire
durante la noche. El polvo de manano seco se disolvió en agua
destilada, usando aproximadamente 5 ml de agua por gramo de polvo de
manano seco. La concentración final de manano de pared celular de
S. uvarum fue aproximadamente 30 \mug/ml.
Las placas de ELISA con manano de células de
S. uvarum se saturaron con antígeno como sigue. Se diluyó
manano de S. uvarum purificado preparado como se describió
anteriormente hasta una concentración de 100 \mug/ml con solución
salina tamponada con fosfato/azida sódica del 0,2%
(PBS-N3). Usando una pipeta multicanal, se añadieron
100 \mul de manano de S. uvarum de 100 \mug/ml por
pocillo de una placa Hi-binding de 96 pocillos de
Costar (número de catálogo 3590; Costar Corp., Cambridge, MA). Se
dejó que el antígeno revistiera la placa a 4ºC durante un mínimo de
12 horas. Cada lote de placas se comparó con un lote previo antes de
su uso. Las placas se almacenaron a 2-8ºC durante
hasta un mes.
Se analizó la reactividad
anti-IgG o anti-IgA en sueros de
pacientes por duplicado. Se incubaron placas de microtitulación
saturadas con antígeno como se describió anteriormente con suero
salino tamponado con fosfato/0,05% de Tween 20 durante 45 minutos a
temperatura ambiente para inhibir la unión inespecífica de
anticuerpo. Los sueros de pacientes se añadieron subsiguientemente a
una dilución de 1:80 de IgA y se incubaron durante 1 hora a
temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con
PBS/0,05% de Tween 20. Después se añadió una dilución la 1:1000 de
anti-IgA humana de cabra conjugada con fosfatasa
alcalina (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), y las placas de
microtitulación se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente.
Se añadió una disolución de fosfato de p-nitrofenol en tampón
sustrato de dietanolamina, y se dejó desarrollar color durante 10
minutos. Se analizó la absorbancia a 405 nm usando un lector de
placas EMAX automático (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Se usó la unión estándar de sueros mezclados
procedentes de pacientes con un diagnóstico establecido de
enfermedad de Crohn como referencia estándar de unión, y se fijó
para que fueran 100 unidades de ELISA. Los resultados con los sueros
de pacientes de prueba se expresaron como un porcentaje de la unión
estándar de los sueros de EC de referencia. La positividad de ASCA
se definió como la reactividad de IgA ASCA que es mayor del 20% de
los sueros de EC de referencia.
Ejemplo
IV
Este ejemplo demuestra que el polipéptido
I-2 se puede determinar usando análisis de
ELISA.
Se clonó la totalidad de la secuencia de ácido
nucleico codificante de I-2 (ID SEC Nº: 3) en el
vector de expresión GST pGEX. Después de su expresión en E.
coli, la proteína se purificó en una columna GST. Se demostró
que la proteína purificada era del peso molecular esperado mediante
tinción de plata, y tenía reactividad anti-GST en el
análisis de Western.
Se detectaron anticuerpos IgA humanos que se unen
al polipéptido I-2 (ID SEC Nº: 3) mediante análisis
ELISA directos esencialmente como sigue. Se revistieron placas
(Immulon 3; DYNEX Technologies; Chantilly, VA) durante la noche a
4ºC con 100 \mul/pocillo de polipéptido de fusión
GST-I-2 (5 \mug/ml en suero salino
tamponado con borato, pH 8,5). Después de tres lavados en 0,05% de
Tween 20 en suero salino tamponado con fosfato (PBS), las placas se
bloquearon con 150 \mul/pocillo de albúmina de suero bovino del
0,5% en PBS, pH 7,4 (BSA-PBS) durante 30 minutos a
temperatura ambiente. La disolución de bloqueo se sustituyó después
con 100 \mul/pocillo de suero de enfermedad de Crohn o de control
normal, diluidos al 1:100. Después se incubaron las placas durante 2
horas a temperatura ambiente y se lavaron como antes. Se añadió
anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina
(anti-IgA humana de cabra (específica de cadena á),
Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a las placas de IgA a una
dilución de 1:1000 en BSA-PBS. Las placas se
incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente antes de lavar tres
veces con 0,05% de Tween 20/PBS, seguido de otros tres lavados con
suero salino normal tamponado con Tris, pH 7,5. Se añadió la
disolución de sustrato (1,5 mg/ml de fosfato de p-nitrofenol
disódico (Aresco; Solon, OH) en MgCl_{2} 2,5 mM, Tris 0,01 M, pH
8,6) a 100 \mul/pocillo, y se dejó desarrollar color durante una
hora. Las placas se analizaron después a 405 nm.
La reactividad positiva de IgA
I-2 se definió como una reactividad mayor de dos
desviaciones estándar por encima de la reactividad media obtenida
con sueros de control (normales) analizados al mismo tiempo que las
muestras de prueba.
Ejemplo
V
Este ejemplo describe métodos para determinar el
estado de pANCA de un sujeto.
Se usó un análisis inmunoabsorbente ligado a
enzimas con neutrófilos fijados para detectar ANCA como se describe
en Saxon et al., J. Allergy Clin. Immunol.
86:202-210 (1990), y todas las muestras se
analizaron de forma enmascarada. Las placas de microtitulación se
revistieron con 2,5 x 10^{5} neutrófilos por pocillo y se trataron
con metanol del 100% para fijar las células. Las células se
incubaron con albúmina de suero bovino del 0,25% (BSA) en solución
salina tamponada con fosfato para bloquear la unión inespecífica de
anticuerpos. A continuación, se añadieron sueros de control y
codificados a una dilución 1:100 al tampón de bloqueo de suero
bovino/solución salina tamponada con fosfato. Se añadió anticuerpo
F(ab')_{2} anti-inmunoglobulina G humana
(específico de cadena \gamma) de cabra conjugado con fosfatasa
alcalina (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc., West Grove, PA) a una
dilución 1:1000 para marcar el anticuerpo unido a neutrófilos. Se
añadió una disolución de sustrato de fosfato de p-nitrofenol
y se dejó desarrollar color hasta que la absorbancia a 405 nm en los
pocillos de control positivo fue 0,8-1,0 unidades de
densidad óptica mayor que la absorbancia en los pocillos de
blanco.
La tinción inmunofluorescente indirecta se
realizó en muestras que eran positivas para ANCA mediante ELISA para
determinar si el patrón de tinción predominante era perinuclear
(pANCA) o citoplásmico (cANCA). Se prepararon portaobjetos de vidrio
que contenían aproximadamente 100.000 neutrófilos por portaobjetos
mediante citocentrifugación (Shandon Cytospin, Cheshire, Inglaterra)
y se fijaron en metanol del 100%, se secaron al aire, y se
almacenaron a -20ºC. Los neutrófilos fijados se incubaron con sueros
humanos diluidos (1:20), y se visualizó la reacción con anticuerpo
F(ab')_{2} específico de cadena \gamma marcado con
fluoresceína como se describe en Saxon et al., anteriormente
mencionado, 1990. Los portaobjetos se examinaron usando un
microscopio Olympus BH-2 equipado con
epifluorescencia (Olympus, Lake Success, NY).
La positividad para pANCA se definió como un
patrón de tinción perinuclear combinado con una reactividad de ELISA
superior a dos desviaciones estándar por encima de la reactividad
media obtenida con sueros de control (normales) analizados al mismo
tiempo que las muestras de prueba.
<110> Centro médico
Cedars-Sinai
\hskip1cmLos regentes de la Universidad de California
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Diagnóstico, prevención y tratamiento
de la enfermedad de Crohn usando el antígeno OmpC
\vskip0.400000\baselineskip
<130> FP-PM 4713
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento US 09/575.061
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
19-05-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows, versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 367
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> E. coli
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 302
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Organismo microbiano del intestino
humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)...(302)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Organismo microbiano del intestino
humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Un método para diagnosticar la enfermedad de
Crohn en un sujeto, que comprende determinar la presencia o ausencia
de anticuerpos IgA anti-OmpC en una muestra de dicho
sujeto, en el que la presencia de dichos anticuerpos IgA
anti-OmpC indica que dicho sujeto tiene la
enfermedad de Crohn.
2. Un método in vitro para diagnosticar la
enfermedad de Crohn en un sujeto, que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto una muestra de un sujeto
del que se sospecha que tiene enfermedad inflamatoria intestinal con
un antígeno OmpC, o con su fragmento reactivo, en condiciones
adecuadas para formar un complejo del antígeno OmpC, o de su
fragmento reactivo, y el anticuerpo IgA para el antígeno OmpC;
(b) poner en contacto dicho complejo con un
anticuerpo anti-IgA; y
(c) detectar la presencia o ausencia de
anticuerpos IgA anti-OmpC, en el que la presencia de
dichos anticuerpos IgA anti-OmpC en dicho sujeto
indica que dicho sujeto tiene la enfermedad de Crohn.
3. El método de la reivindicación 2, en el que
dicho antígeno OmpC es un polipéptido que tiene al menos una
identidad de aminoácidos del 80% con la secuencia de aminoácidos de
ID SEC Nº: 1.
4. El método de la reivindicación 2, en el que
los anticuerpos IgA anti-OmpC se detectan con un
análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas.
5. El método de la reivindicación 2, que
comprende además determinar la presencia o ausencia de anticuerpos
IgA anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA) en dicho sujeto, en
el que la presencia de anticuerpos IgA anti-OmpC o
la presencia de IgA ASCA en dicho sujeto indican cada una de forma
independiente que dicho sujeto tiene la enfermedad de Crohn.
6. El método de la reivindicación 5, en el que la
presencia de IgA ASCA se determina mediante reactividad con
fosfopeptidomanano (PPM) purificado de pared celular de
levaduras.
7. El método de la reivindicación 6, en el que
dicho PPM de pared celular de levaduras se prepara a partir de la
cepa ATCC #38926.
8. El método de la reivindicación 2, que
comprende además determinar la presencia o ausencia de anticuerpos
IgA anti-polipéptido I-2 en dicho
sujeto, en el que la presencia de anticuerpos IgA
anti-OmpC o la presencia de anticuerpos IgA
anti-polipéptido I-2 en dicho sujeto
indican cada una de forma independiente que dicho sujeto tiene la
enfermedad de Crohn.
9. El método de la reivindicación 8, en el que la
presencia de anticuerpos IgA anti-polipéptido
I-2 se determina mediante reactividad de IgA con un
polipéptido I-2 que tiene una identidad de secuencia
de aminoácidos mayor que alrededor del 80% con la secuencia de
aminoácidos de ID SEC Nº: 3.
10. Un método para diagnosticar la enfermedad de
Crohn en un sujeto, que comprende las etapas de:
(a) determinar la presencia o ausencia de
anticuerpos IgA anti-OmpC en una muestra de dicho
sujeto;
(b) determinar la presencia o ausencia de IgA
ASCA en una muestra de dicho sujeto;
(c) determinar la presencia o ausencia de
anticuerpos IgA anti-polipéptido I-2
en una muestra de dicho sujeto,
en el que la presencia de dichos anticuerpos IgA
anti-OmpC, la presencia de IgA ASCA o la presencia
de anticuerpos IgA anti-polipéptido
I-2 indican cada una de forma independiente que
dicho sujeto tiene la enfermedad de Crohn.
11. El método de la reivindicación 10, que
comprende además determinar la presencia o ausencia de anticuerpos
anti-neutrófilo perinucleares (pANCA) en dicho
sujeto.
12. El uso de un antígeno OmpC, o su fragmento
tolerógeno, para preparar un medicamento para inducir tolerancia en
un paciente con enfermedad de Crohn.
13. El método de la reivindicación 12, en el que
dicho antígeno OmpC es un polipéptido que tiene al menos una
identidad de aminoácidos del 80% con la secuencia de aminoácidos de
ID SEC Nº: 1.
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