ES2247585T3 - Procedidmiento de regulacion de la respuesta inmunitaria usando moleculas de union a il4 y a ctla4. - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende una molécula de unión a B7 y una molécula de unión a IL4 para usar en regular una respuesta inmune bloqueando una interacción de B7 con linfocitos.

Description

Procedimiento de regulación de la respuesta inmunitaria usando moléculas de unión a IL4 y a CTLA4.

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden una molécula de unión a B7 y una molécula de unión a IL-4 igual que el uso de una molécula de unión a B7 y una molécula de unión a IL-4 para preparar una composición para regular respuestas inmunes.

La presente invención también describe la expresión del gen del receptor CTLA 4, la identificación de la interacción entre el receptor y las células que expresan antígeno B7, y procedimientos para regular las interacciones celulares que implican al receptor CTLA4 y el antígeno B7.

Antecedentes de la invención

El distintivo de un sistema inmune de vertebrados es la capacidad para discriminar lo "propio" de lo "no propio" (extraño). Esta propiedad ha llevado a la evolución de un sistema que requiere señales múltiples para lograr activación inmune óptima (Janeway, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 54: 1-14 (1989)). Las interacciones células T-células B son esenciales para la respuesta inmune. Los niveles de muchas moléculas de cohesión encontradas en las células T y en las células B se incrementan durante una respuesta inmune (Springer y col., (1987), supra; Shaw y Shimuzu, Current Opinion in Immunology, eds. Kindt and Long, 1: 92-97 (1988)); y Hemler Immunology Today 9:109-113 (1988)). Los niveles incrementados de estas moléculas pueden ayudar a explicar porqué las células B activadas son más efectivas estimulando proliferación específica de antígeno de las células T de lo que lo hacen las células B que descansan (Kaiuchi y col., J Immunol. 131: 109-114 (1983); Kreiger y col, J. Immunol. 135: 2937-2945 (1985) McKenzie, J. Immunol. 141: 2907-2911 (1988); y Hawrylowicz y Unanue, J. Immunol. 141: 4083-4088
(1988)).

La generación de una respuesta inmune de linfocitos T (células T) es un proceso complejo que implica interacciones célula-célula (Springer y col., A. Rev. Immunol. 5: 223-252 (1987)), particularmente entre células T y células accesorias tales como células B, y producción de mediadores inmunes solubles (citoquinas o linfoquinas) (Dinarello y Mier, New Eng. Jour. Med. 317: 940-945 (1987)). Esta respuesta se regula mediante varios receptores de superficie de las células T, incluyendo el complejo receptor de las células T (Weiss y col., Ann. Rev. Immunol. 4: 593-619 (1986)) y otras moléculas de superficie "accesorias" (Springer y col., (1987) supra). Muchas de estas moléculas accesorias son antígenos de diferenciación celular (CD) que se dan de forma natural definidos mediante la reactividad sobre la superficie de las células (McMichael, Ed., Leukocyte Typing III, Oxford Univ. Press, Oxford, N.Y. (1987)).

Las interacciones intercelulares independientes de antígeno que implican moléculas ayudantes de linfocitos son esenciales para una respuesta inmune (Springer y col., supra). Por ejemplo, la unión de la proteína asociada con células T, CD2, a su ligando LFA-3, una glicoproteína ampliamente expresada (revisada en Shaw y Shimuzu, supra), es importante para optimizar la activación de las células T específica de antígeno (Moingeon y col., Nature 339: 314 (1988).

Un sistema de adhesión importante implica unión de la glicoproteína LFA-1 encontrada en los linfocitos, macrófagos, y granulocitos (Springer y col., (1987), supra; Shaw y Shimuzu (1988), supra) a sus ligandos ICAM-1 (Makgoba y col., Nature 331: 86-88 (1988)) e ICAM-2 (Staunton y col., 339: 61-64 (1989)). Las moléculas accesorias de la célula T CD8 y CD4 fortalecen la adhesión de las células T mediante interacción con las moléculas MHC de clase I (Norment y col., Nature 336: 79-81 (1988)) y las moléculas MHC de clase II (Doyle y Strominger, Nature 330: 256-259 (1987), respectivamente. Los "receptores de orientación" son importantes para el control de la migración de los linfocitos (Stoolman, Cell 56: 907-910 (1989)).

Las glicoproteínas VLA son integrinas las cuales parecen mediar las funciones linfocitarias que requieren adhesión a los componentes de la matriz extracelular (Hemler, supra). Los sistemas de adhesión CD2/LFA-3, LFA-1/ICAM-1 e ICAM-2, y los sistemas de adhesión VLA están distribuidos en una amplia diversidad de tipos celulares (Springer y col., (1987), supra; Shaw y Shimuzu, (1988), supra y Hemler, (1988), supra).

Numerosos estudios in vitro han demostrado que las citoquinas están implicadas en la generación de células efectoras alorreactivas. Por ejemplo, el receptor IL-4 unido a membrana y el receptor IL-4 soluble se administraron por separado a ratones y estuvieron mostrando aumentar la respuesta linfoproliferativa (William C. Fanslow y col., "Regulation of alloreactivity in vitro by IL-4 and the soluble IL-4 receptor" J. Immunol. 147: 535-540 (1991)). Específicamente, la administración de IL-4 a ratones BALB/c dio como resultado un ligero aumento de la respuesta linfoproliferativa. En contraste, el receptor IL-4 soluble suprimió esta respuesta a las células alogénicas en una forma dosodependiente. Además, un anticuerpo contra IL-4 neutralizante y otro frente a receptor IL-4 soluble fueron inhibidores efectivos de la respuesta linfoproliferativa.

Se propuso hace muchos años que la activación de linfocitos B requiere dos señales (Bretscher y Cohn, Science 169: 1042-1049 (1970), y ahora se sabe que todos los linfocitos requieren dos señales para su activación óptima, una señal específica de antígeno o señal clonal, como también una segunda señal no específica de antígeno (Janeway, supra). Freeman y col. (J. Immunol. 143(8): 2714-2722 (1989)) aislaron y secuenciaron un clon de ADNc que codificaba un antígeno de activación de células B conocido por mAB B7 (Freeman y col., J Immunol. 138: 3260 (1987)). Las células COS transfectadas con este ADNc han mostrado teñirse tanto mediante mAb B7 como mediante mAb BB-1 (Clark y col, Human Immunol. 16: 100-113 (1986); Yokochi y col., J. Immunol. 128: 823 (1981)); Freeman y col., (1988) supra; y Freeman y col., (1987), supra)). Además, la expresión de este antígeno se ha detectado en células de otros linajes, tales como monocitos (Freeman y col., supra).

Las señales requeridas para una respuesta frente a antígeno de una célula T ayudante (Th) se proporcionan mediante células presentadoras de antígeno (APC). La primera señal se inicia mediante interacción del complejo receptor de células T (Weiss, J. Clin. Invest. 86: 1015 (1990)) con antígeno presentado en el contexto de las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase II (MHC) en el APC (Allen, Immunol. Today 8: 270 (1987)). Esta señal específica de antígeno no es suficiente para generar una respuesta completa, y en ausencia de una segunda señal puede conducir actualmente a la inactivación clonal o anergia (Schwartz, Science 248: 1349 (1990)). El requerimiento para una segunda señal "coestimuladora" proporcionada por el MHC también se ha demostrado en un número de sistemas experimentales (Swartz, supra; Weaver y Unanue, Immunol. Today 11: 49 (1990)). La naturaleza molecular de esta segunda señal (o señales) no se comprende completamente, aunque está claro en algunos casos que tanto moléculas solubles como interleucina (IL)-1 (Weaver y Unanue, supra) como receptores de membrana implicados en adhesión intercelular (Springer, Nature 346: 425 (1990)) pueden proporcionar señales coestimuladoras.

El antígeno CD28, una proteína homodimérica de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Aruffo y Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 8573-8577 (1987)), es una molécula accesoria encontrada en la mayoría de las células T humanas maduras (Damle y col., J. Immunol. 131: 2296-2300 (1983)). La evidencia actual sugiere que estas moléculas funcionan en una ruta de activación de células T alternativa distinta de la iniciada por el complejo receptor de células T (June y col., Mol. Cell. Biol. 7: 4472-4481 (1987)). El reactivo de anticuerpos monoclonales (mAb) con el antígeno CD28 puede aumentar las respuestas de células T iniciadas mediante diversos estímulos policlonales (revisado por June y col., supra). Estos efectos estimuladores pueden resultar de la producción de citoquinas inducida por mAb (Thomson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 1333-1337 (1989); y Lindsten y col., Science 244: 339-343 (1989)) como una consecuencia de estabilización de ARNm incrementada (Lindsten y col., (1989), supra). Los mAb anti-CD28 pueden tener también efectos inhibidores, es decir, pueden bloquear reacciones linfocitarias mezcladas autólogas (Damle y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 5096-6001 (1981)) y activación de clones de células T específica de antígeno (Lesslauer y col., Eur. J. Immunol. 16: 1289-1296 (1986)).

Estudios han mostrado que CD28 es un contrarreceptor para el antígeno de activación de células B, B7/BB-1 (Linsley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5031-5035 (1990)). Por conveniencia el antígeno B7/BB-1 se refiere de ahora en adelante como el "antígeno B7".

Las interacciones entre antígeno CD28 y antígeno B7 se han caracterizado usando condensaciones genéticas de las partes extracelulares del antígeno B7 y el receptor CD28, y la C\gamma1 de Inmunoglobulina (Ig) (región constante de las cadenas pesadas) (Linsley y col., J. Exp. Med. 173: 721-730 (1991)). La proteína de condensación inmovilizada B7Ig, como también las células CHO positivas en B7, han mostrado coestimular la proliferación de las células T.

La estimulación de células T con células CHO positivas en B7 también estimula específicamente niveles incrementados de transcripciones para IL-2. Estudios adicionales han mostrado que el mAb anti-CD28 inhibió la producción de IL-2 inducida en ciertas líneas celulares de leucemia de células T mediante interacciones celulares con una línea de leucemia de células B (Kohno y col., Cell. Immunol. 131-1-10 (1990)).

CD28 tiene un dominio similar a región variable extracelular única (V) (Aruffo y Seed, supra). Una molécula CTLA4 homóloga, se ha identificado mediante rastreo diferencial de una biblioteca de ADNc de células T citolíticas murinas (Brunet y col., Nature 328: 267-270 (1987)).

Las transcripciones de la molécula CTLA4 se han encontrado en poblaciones de células T que tienen actividad citotóxica, sugiriendo que CTLA4 pudo funcionar en la respuesta citolítica (Brunet y col., supra; y Brunet y col., Immunol. Rev. 103-21-36 (1988)). Los investigadores han notificado la clonación y el mapeado de un gen para la contrapartida humana de CTLA4 (Dariavach, y col., Eur. J. Immunol 18: 1901-1905 (1988)) a la misma región cromosómica (2q33.34) como CD2 (Lafage-Pochitaloff y col., Immunogenetics 31: 198-201 (1990).

La comparación de secuencias entre este ADN de CTLA4 humano y el que codifica proteínas CD28 revela homología de secuencia significativa, con el mayor grado de homología en la las regiones yuxtamembrana y citoplásmica (Brunet y col., 1988, supra; Dariavach y col., 1988, supra).

El alto grado de homología entre CD28 y CTLA4, conjuntamente con la colocalización de sus genes, plantea preguntas como si estas moléculas están relacionadas también funcionalmente. Sin embargo, dado que el producto proteico de CTLA4 no se ha expresado exitosamente, estas cuestiones permanecen sin respuesta.

La expresión de derivados solubles de glicoproteínas de la superficie celular en la superfamilia de genes de inmunoglobulinas se ha logrado para CD4, el receptor para VIH-1, y los receptores CD28 y B7, usando moléculas de condensación híbridas que constan de secuencias de ADN que codifican aminoácidos que corresponden a partes del dominio extracelular del receptor CD4 condensado a dominios de anticuerpo (\gamma1 de inmunoglobulina (Capon y col., Nature 337: 525-531 (1989) (CD4) y Linsley y col., J. Exp. Med., supra (CD28 y B7).

Hay una necesidad de la presente invención. En el presente, las terapias principales para prevenir el rechazo de transplantes de órganos dependen de fármacos paninmunosupresores, tales como ciclosporina A o anticuerpos monoclonales (mAb) para CD3. Estos fármacos se deben tomar frecuentemente durante la vida del individuo, deprimiendo su sistema inmune completo, y a menudo da como resultado achaques de salud secundarios tales como frecuencia incrementada de infecciones y cáncer.

El documento WO-A-93/00431 proporciona la completa y correcta secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos correspondiente a la proteína receptora CTLA4, e identifica al antígeno B7 como un ligando natural para el receptor CTLA4. Se describe que la proteína del receptor humano CTLA4 se codifica mediante 187 aminoácidos e incluye un sitio de glicoxilación unido al N terminal recientemente identificado. Este documento describe también un procedimiento para expresar el ADN como un producto de proteína de condensación de inmunoglobulina (Ig) CTLA4. Las realizaciones incluyen proteína de condensación CTLA4Ig, y proteínas de condensación híbrida incluyendo proteínas de condensación CD28Ig/CTLA4Ig. También se proporcionan procedimientos para usar la proteína de condensación CTLA4, la proteína de condensación B7Ig, las proteínas de condensación híbrida, y fragmentos y/o derivados de las mismas, tales como anticuerpos monoclonales reactivos con CTLA 4 y el antígeno B7, para regular las interacciones celulares y las respuestas inmunes.

Se ha descrito una diversidad de moléculas capaces de interferir con las interacciones células B/células T que están mediadas mediante la ruta (o las rutas) B7/CD28/CTLA4. Entre ellas hay moléculas de unión a B7 tales como proteínas de condensación a CTLA4Ig (documento WO-A-93/00431; Tan y col., J. Exp. Med. 177: 165-173; Linsley y col., Science 257: 798-792 (1992); Swartz y col., Cell 71: 1065-1068 (1992)), CD28 soluble y derivados solubles y análogos de los mismos (documento WO-A-92/15671), híbridos de proteínas de condensación CD28Ig/CTLAIg (documento WO-A-93/00431) anticuerpos monoclonales anti-B7 (documento WO-A-93/00431) también como moléculas de unión a CTLA-4 tales como proteínas de condensación B7Ig y anticuerpos monoclonales reactivos con CTLA (WO-A-93/00341). Se dice que dichas moléculas de unión B7 o CTLA-4 son útiles para regular las respuestas inmunes in vivo e in vitro).

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden una molécula de unión B7 y una molécula de unión IL-4 para usar en regular una respuesta inmune bloqueando una interacción de B7 con linfocitos, especialmente con linfocitos positivos para B7. Específicamente, la respuesta inmune es una respuesta de células B que da como resultado la inhibición de la producción de anticuerpos, una respuesta de células T que da como resultado la inhibición de la inmunidad mediada por células, o la respuesta inmune es una inhibición de la proliferación de linfocitos.

De acuerdo con una realización particular, la composición es para usar en la inhibición de rechazo de transplante en un sujeto, siendo el sujeto un receptor del tejido transplantado.

De acuerdo con una realización particular, la composición se usa en la inhibición de la enfermedad injerto contra huésped.

De acuerdo con una realización, la molécula de unión B7 es una proteína de condensación CD28Ig/CTLA4Ig. Específicamente, la proteína de condensación CD28Ig/CTLA4Ig es una proteína de condensación que tiene una primera secuencia de aminoácidos que contiene residuos de aminoácido desde aproximadamente la posición 1 hasta aproximadamente la posición 125 de la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular de CTLA4 y una segunda secuencia de aminoácidos que contiene residuos de aminoácidos que corresponden a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de la C\gamma1 de inmunoglobulina humana.

De acuerdo con una realización adicional, la molécula de unión B7 es un híbrido de proteína de condensación CTLA4Ig. Específicamente, el híbrido de proteína de condensación CTLA4Ig es un híbrido de proteína de condensación que tiene primera secuencia de aminoácidos correspondiente a una parte del dominio extracelular del receptor CD28 condensado con una segunda secuencia de aminoácidos que corresponde a una parte del dominio extracelular del receptor CTLA4 y una tercera secuencia de aminoácidos correspondiente a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de la C\gamma1 de inmunoglobulina humana.

De acuerdo con una realización particular de la invención, la molécula de unión a IL-4 es un anticuerpo monoclonal el cual reconoce y se une específicamente a IL4. Alternativamente, la molécula de unión a IL-4 es un receptor soluble de IL-4 el cual reconoce y se une a IL-4.

La presente invención se refiere también al uso de una molécula de unión a B7 y una molécula de unión a IL-4 para preparar una composición farmacéutica como se define anteriormente para regular una respuesta inmune bloqueando una interacción B7 con linfocitos, en particular linfocitos B7 positivos. Específicamente, la respuesta inmune es una respuesta de células B que da como resultado la inhibición de la producción de anticuerpos, una respuesta de célula T que da como resultado la inhibición de la inmunidad mediada por células, o la respuesta inmune es una inhibición de la proliferación de linfocitos.

La proteína de condensación CTLA4Ig de la invención se une al antígeno B7 expresado en células B activadas, y a células de otros linajes, un ligando del receptor de CD28 en células T. La CTLA4Ig se une al antígeno B7 con afinidad significativamente mayor que B7 uniendo al receptor CD28. La construcción CTLA4Ig tiene una primera secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular del receptor de CTLA4 condensado a una segunda secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio C\gamma1 de la Ig humana. La primera secuencia de aminoácidos contiene residuos de aminoácido desde aproximadamente la posición 1 hasta aproximadamente la posición 125 de la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular de CTLA4 unida a una segunda secuencia de aminoácidos que contiene residuos de aminoácido que corresponden a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de la C\gamma1 de Ig humana. La proteína de condensación se produce preferiblemente en forma dimérica. El CTLA4Ig soluble es un potente inhibidor in vitro de las respuestas de linfocitos B y T.

También se contemplan en la invención proteínas de condensación híbridas tales como CD28Ig/CTLA4Ig que tienen una primera secuencia de aminoácidos correspondiente a fragmentos del dominio extracelular de CD28 unido a una segunda secuencia de aminoácidos correspondiente a fragmentos del dominio extracelular de CTLA4Ig y una tercera secuencia de aminoácidos correspondiente a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de la C\gamma1 de Ig humana. Una realización de las proteínas de condensación híbridas es una condensación CD28Ig/CTLA4Ig que tiene una primera secuencia de aminoácidos que contiene residuos aminoácidos desde aproximadamente la posición 1 hasta aproximadamente la posición 94 de la secuencia de aminoácidos que corresponde al dominio extracelular de CD28, unido a una segunda secuencia de aminoácidos que contiene residuos aminoácidos de aproximadamente la posición 94 a aproximadamente la posición 125 de la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular de CTLA4, unido a una tercera secuencia de aminoácidos que contiene restos aminoácido correspondientes a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de la C\gamma1 de Ig humana.

La invención también proporciona un procedimiento para regular las interacciones de las células T con células B7 positivas, usando un ligando para el antígeno B7. Tal ligando es la proteína de condensación CTLA4Ig de la invención, sus fragmentos o derivados, el híbrido de proteínas de condensación CD28Ig/CTLA4Ig, o un reactivo del anticuerpo monoclonal con el antígeno B7.

La invención incluye adicionalmente un procedimiento para tratar enfermedades del sistema inmune mediadas por interacciones de las células T con células B positivas administrando un reactivo de ligando con antígeno B7 para regular las interacciones de células T con las células B7 positivas. Un ligando tal es la proteína de condensación CTLA4Ig de la invención, sus fragmentos o derivados, el híbrido de proteínas de condensación CD28/CTLA4Ig, o un reactivo anticuerpo monoclonal con el antígeno B7.

Se discute también una línea celular de ovario de hámster chino que expresa de forma estable la proteína de condensación CTLA4Ig.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una representación mediante diagramas de las construcciones de condensación de CTLA4Ig como se describe en el ejemplo 2, infra.

La figura 2 es una fotografía de un gel obtenida de purificación cromatográfica SDS-PAGE de CTLA4Ig como se describe en el ejemplo 2, infra.

La figura 3 representa la secuencia completa de aminoácidos humanos del receptor CTLA4 (SEQ ID N^{os}: 13 y 14) condensados al péptido señal de la oncoestatina M (posición -25 a -1) e incluyendo el recientemente identificado sitio de glicosilación unido al N terminal (posición 109-111), como se describe en el ejemplo 3, infra.

La figura 4 representa los resultados del análisis de FACS^{R} de unión de la proteína de condensación B7Ig a las células COS transfectadas con CD28- y CTLA4- como se describe en el ejemplo 4, infra.

La figura 5 representa los resultados del análisis de FACS^{R} de unión de CTLA4Ig purificado en células CHO antígeno B7 positivas (B7+) y en una línea celular linfoblastoide (PM LCL) como de describe en el ejemplo 4, infra.

La figura 6 es un gráfico que ilustra el análisis de unión de competición de B7Ig etiquetado con ^{125}I para inmovilizar CTLA4Ig como se describe en el ejemplo 4, infra.

La figura 7 es un gráfico que muestra los resultados de análisis de Scatchard de unión de B7Ig etiquetado con ^{125}I a CTLA4Ig inmovilizado como se describe en el ejemplo 4, infra.

La figura 8 es una fotografía de un gel de cromatografía SDS-PAGE de análisis de inmunoprecipitación de células CHO B7 positivas y células PM LCL etiquetadas en superficie con ^{125}I como se describe en el ejemplo 4, infra.

La figura 9 es un gráfico que describe los efectos en la proliferación de células T de CTLAIg como se mide por incorporación de [^{3}H]-timidina como se describe en el ejemplo 4, infra.

La figura 10 es un gráfico de barras que ilustra los efectos de CTLA4Ig en secreción de inmunoglobulinas, inducida por células T ayudantes, (Th)-inducida, por células B como se determina mediante inmunoensayos enzimáticos (ELISA) y de describe en el ejemplo 4, infra.

Las figuras 11A, 11B y 11C son líneas de gráfico que muestran la supervivencia de isletas humanas pancreáticas como xenoinjertos.

Las figuras 12A, 12B, 12C y 12B son fotografías de portaobjetos histopatológicos de isletas humanas transplantadas bajo la cápsula renal de ratones B10.

La figura 13 es una línea de gráfico que muestra la prolongación de un injerto de isleta que sobrevive con mAb a B7 humano.

La figura 14 es una línea de gráfico que muestra la inducción de la no capacidad de respuesta específica de donante a antígenos de injerto de isletas mediante CTLAIg.

La figura 15 es una línea de gráfico que muestra los niveles de titulación de suero de ratones inyectados con células rojas de la sangre de oveja (SRBC), mAb L6 y Ig de rata, mAb L6 y anti-IL-4, CTLA4Ig e Ig de rata, CTLA4Ig y anti-IL4. El eje de las X mide el título de anticuerpo-suero. El eje de las Y mide el tiempo en días. La caja cerrada representa ratones inyectados con SBRC en el día 0 y en el día 46. La caja abierta representa ratones inyectados con mAb L6 e inmunoglobulina de ratas. El círculo abierto representa ratones inyectados con mAb L6 y anticuerpo anti-IL4. El triángulo cerrado representa ratones inyectados con CTLAIg e inmunoglobulina de ratas. El triángulo cerrado representa ratones inyectados con CTLA4Ig e inmunoglobulina de rata. El triángulo abierto representa ratones inyectados con CTLA4Ig y anticuerpo anti-IL4.

La figura 16 es una línea de gráfico que muestra los niveles de titulación de suero de ratones inyectados con KlH, mAb L6 e inmunoglobulina de rata, mAb L6 y anti-IL4, CTLA4Ig e Ig de rata, CTLA4Ig y anti-IL4. El eje de las X mide la valoración de anticuerpo-suero. El eje de las Y mide el tiempo en días. La caja cerrada representa ratones inyectados con hemocianina de lapa de California (KHL) en el día 46. El círculo cerrado representa ratones inyectados con mAb L6 e inmunoglobulina de rata. El círculo abierto representa ratones inyectados con mAb L6 y anticuerpo anti-IL4. Los triángulos cerrados representan ratones inyectados con CTLAIg e inmunoglobulina de rata. El triángulo abierto representa ratones inyectados con CTLA4Ig e inmunoglobulina de rata. El triángulo abierto representa ratones inyectados con CTLA4Ig y anticuerpo anti-IL4.

Descripción detallada de la invención Definición

Como se usan en esta solicitud, las siguientes palabras o frases tienen los significados especificados.

Como se usa en el presente documento "interacción que bloquea B7" se refiere a interferir con la unión del antígeno B7 a sus ligandos tal como CD28 y CTLA4, obstruyendo de este modo la interacción entre célula T y célula B.

Como se usa en el presente documento una "molécula de unión a B7" significa cualquier molécula la cual se unirá al antígeno B7.

Como se usa en el presente documento una "molécula de unión a IL4" significa cualquier molécula la cual reconocerá y se unirá a IL4.

Con el fin de que la invención descrita en el presente documento pueda entenderse más completamente, se expone la siguiente descripción.

Se describen el aislamiento y expresión del receptor humano CTLA4 encontrado en las superficies de las células T, el cual se une al antígeno B7 expresado en células B activadas, y células de otros linajes, y la expresión de productos de proteína de condensación soluble del gen del receptor CTLA4. la invención se refiere al uso del receptor CTLA4 para regular interacciones celulares, incluyendo interacciones de células T con células B7 positivas.

En una realización preferida, la secuencia de ADN completa y correcta que codifica la secuencia de aminoácidos correspondiente a la proteína receptora de CTLA 4 humana de la invención se clona usando PCR. El ADNc que contiene la secuencia codificante completa predicha de CTLA4 se ensambló a partir de dos fragmentos de PCR amplificados a partir de ARN de H38, e insertados en el vector de expresión, CMD8 como se describe en detalle en los ejemplos, infra. Los aislados se transfectaron en células COS y se probaron en su unión a B7Ig, una proteína de condensación soluble que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde al dominio extracelular de B7 y una región C\gamma1 de inmunoglobulina (Ig) humana, como se describe por Linsley y col., J. Exp. Med. 173: 721-730 (1991).

La secuencia de ADN de un aislado, designada como OMCTLA4, se determinó después y se encontró que correspondía exactamente a la secuencia CTLA4 humana predicha, condensada en el extremo C-terminal al péptido señal de oncostatina M. El receptor CTLA 4 se codifica mediante 187 aminoácidos (exclusivos del péptido señal y codones de parada) e incluye un sitio de glicoxilación unido al N terminal recientemente identificado en las posiciones de aminoácidos 109-11 (véase figura 3, infra). El receptor de CTLA4 se expresa usando el péptido señal de oncostatina M.

En otra realización preferida, formas solubles del producto proteico del gen receptor CTLA4 (CTLAIg) se preparan usando proteínas de condensación que tienen una primera secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular de CTLA4 y una segunda secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio C\gamma1 de Ig humano. Los plásmidos de expresión y clonación (CDM8 y \piLN) se construyeron conteniendo ADNc que codifican partes de la secuencia de aminoácidos correspondientes al receptor CTLA4 humano basado en la secuencia de ADNc descrita en el presente documento, donde el ADN codifica una primera secuencia de aminoácidos que corresponde a una región IgC que permite la expresión del gen del receptor CTLA4 alterando la solubilidad de la proteína CTLA4 expresada. Así, la proteína de condensación CTLA4Ig soluble se codifica mediante una primera secuencia de aminoácidos que contiene residuos de aminoácido desde aproximadamente la posición 1 hasta aproximadamente la posición 125 de la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular de CTLA4 unido a una segunda secuencia de aminoácidos correspondiente a la bisagra, las regiones CH2 y CH3 de la C\gamma1 de Ig humana. La proteína de condensación se produce fundamentalmente en forma dimérica. La construcción se transfirió después en células COS o CHO, y CTLA4 se purificó e identificó como un dímero.

De acuerdo con la práctica de esta invención, CTLA4Ig y el híbrido de proteínas de condensación CTLA4Ig/CD28 pueden tener sustituciones aminoacídicas en la secuencia de aminoácidos correspondientes al dominio externo de CTLA4 tal como para producir moléculas las cuales retendrían la propiedad funcional de CTLA4, a saber, la molécula que tiene tales sustituciones unirá aún al antígeno B7. Estas sustituciones de aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, sustituciones de aminoácidos conocidas en la técnica como "conservadoras".

Por ejemplo, es un principio bien establecido de la química de proteínas que ciertas sustituciones de aminoácidos, llamadas "sustituciones de aminoácidos conservadoras", se pueden hacer frecuentemente en una proteína si alterar bien la conformación o bien la función de la proteína. Tales cambios incluyen sustituir cualquiera de isoleucina (I), valina (V), y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos hidrófobos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. Otras sustituciones se pueden considerar también conservadoras, dependiendo del ambiente del aminoácido particular y su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, glicina (G) y alanina (A) pueden frecuentemente ser intercambiables, como pueden alanina y valina (V).

La metionina (M), la cual es relativamente hidrófoba, puede intercambiarse frecuentemente con leucina e isoleucina, y algunas veces con valina. Lisina (K) y arginina (R) son frecuentemente intercambiables en localizaciones en las cuales la característica significativa del residuo aminoácido es su carga y las diferentes pK de estos dos residuos aminoácidos no son significativas. Aún otros cambios se pueden considerar "conservadores" en ambientes particulares.

De hecho, usando las metodologías descritas en el presente documento, se produjeron los mutantes de la molécula de unión a B7. Un mutante comprende (1) una secuencia que comienza con el aminoácido en la posición 1 y finaliza con el aminoácido en la posición 95 de la proteína receptora CD28 (Aruffo y Seed 1987); (2) una secuencia que comienza con el aminoácido en la posición 95 y finaliza con el aminoácido en la posición 125 del dominio extracelular de CTLA4 (Brunet y col, 1987); y (3) una secuencia correspondiente al dominio humano C\gamma1 de Ig.

La segunda mutación comprende (1) una secuencia que comienza con el aminoácido en posición 1 de la proteína receptora y finaliza con el aminoácido en la posición 95 de la proteína receptora CD28 (Aruffo y Seed, 1987); (2) una secuencia que comienza con el aminoácido en la posición 95 y finaliza con el aminoácido en la posición 120 del dominio extracelular de CTLA4 (Brunet y col., 1987); y (3) un secuencia correspondiente al dominio humano C\gamma1 de Ig.

La presente invención proporciona un procedimiento para bloquear la interacción B7 tal como para regular la respuesta inmune la cual comprende poner en contacto linfocitos con una molécula de unión a B7 y una molécula de unión a IL4. Los linfocitos pueden ser linfocitos positivos para B7.

Adicionalmente, la presente invención proporciona un procedimiento para regular una respuesta inmune la cual comprende poner en contacto linfocitos B7 positivos con una molécula de unión a B7 y una molécula de unión a IL4.

La respuesta inmune puede ser una respuesta de células B que da como resultado la inhibición de producción de anticuerpos. Adicionalmente, la respuesta inmune puede ser una respuesta de células T que da como resultado inhibición de la inmunidad mediada por células. Adicionalmente, la respuesta inmune puede ser una inhibición de la proliferación linfocitaria.

Además, la presente invención proporciona un procedimiento para inhibir el rechazo de transplante de tejidos por un sujeto, siendo el sujeto un receptor del tejido transplantado. Este procedimiento puede comprender administrar al sujeto una molécula de unión a B7 y una molécula de unión a IL-4.

De acuerdo con la práctica de esta invención, la molécula de unión a CTLA-4 puede ser una proteína de condensación a CTLA4Ig. Por ejemplo, la proteína de condensación a CTLA4Ig puede ser una proteína de condensación que tiene una primera secuencia de aminoácidos que contiene restos aminoácido de aproximadamente la posición 1 hasta aproximadamente la posición 125 de la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular de CTLA4 y a una segunda secuencia de aminoácidos que contienen residuos de aminoácidos correspondientes a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de la C\gamma1 de inmunoglobulina humana.

Alternativamente, la molécula de unión a CTLA4 puede ser un híbrido de proteínas de condensación CD28Ig/
CTLA4Ig. Por ejemplo, el híbrido de proteínas de condensación CD28Ig/CTLA4Ig puede ser un híbrido de proteínas de condensación que tiene una primera secuencia de aminoácidos correspondiente a una parte del dominio extracelular del receptor CD28 condensado a una segunda secuencia de aminoácidos correspondiente a una parte del dominio extracelular del receptor CTLA4 y a una tercera secuencia de aminoácidos correspondiente a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de la C\gamma1 de inmunoglobulina humana.

Adicionalmente, la molécula de unión a IL4 puede ser un anticuerpo monoclonal el cual específicamente reconoce y se une a IL4. Alternativamente, la molécula de unión a IL4 es un receptor IL4 soluble el cual reconoce y se une a IL4 (Fanslow y col. 1991).

El ADN que codifica la secuencia de aminoácidos correspondiente a la proteína de condensación CTLA4Ig se ha depositado con la American Type Culture Collection (ATCC) en Rockville, Maryland, bajo las precauciones del Tratado de Budapest en el 31 de mayo de 1991 y se le ha concedido el número de acceso: 68629.

De acuerdo con la presente invención se usa un producto proteico de transcripciones de CTLA4 en forma de una proteína de condensación soluble. La proteína CTLA4Ig forma un dímero unido por enlace disulfuro que tiene dos subunidades, cada una de las cuales tiene una Mr de aproximadamente 50.000 indicando que la CTLA4 nativa existe probablemente con un homodímero unido por enlaces disulfuro.

El antígeno B7 ha mostrado ser un ligando para el receptor CD28 en las células T (Linsley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, supra). La molécula receptora CTLA4 parece relacionada funcional y estructuralmente al receptor CD28; ambos son receptores para la activación del antígeno de las células B, B7, a pesar de que CTLA4 parece tener mayor afinidad por B7, entre las más altas comunicadas hasta ahora para los sistemas de adhesión linfoide. Sin embargo, CTLA4Ig mostró unirse más fuertemente a líneas celulares B7 positivas (B7+) que a CD28Ig. Otros experimentos demuestran que CTLA4 es un receptor de afinidad mayor por el antígeno B7 que el receptor CD28. Adicionalmente, CTLA4Ig mostró unirse a una proteína individual en células linfoblastoides la cual es similar en tamaño al antígeno B7. CTLA4Ig inhibió la proliferación de las células T e inhibió la producción de IgM inducida por Th.

En otra realización preferida, se construyeron las proteínas de condensación híbrida que tienen secuencias de aminoácidos correspondientes a fragmentos de diferentes proteínas de receptores. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos correspondientes a fragmentos seleccionados de los dominios extracelulares de CD28 y CTLA4 se unieron para formar proteínas de condensación híbridas CD28Ig/CTLA4Ig. Así, se obtuvo una proteína de condensación CD28Ig/CTLA4Ig que tiene una primera secuencia de aminoácidos que contiene residuos aminoácidos correspondientes a un fragmento del dominio extracelular de CD28 unido a una segunda secuencia de aminoácidos correspondiente a un fragmento del dominio extracelular de CTLA4Ig y una tercera secuencia de aminoácidos que corresponde a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de la C\gamma1 de inmunoglobulina humana. Un elemento de las proteínas de condensación híbrida es una construcción CD28Ig/CTLAIg que tiene una primera secuencia de aminoácidos que contiene residuos de aminoácido desde aproximadamente la posición 1 hasta aproximadamente la posición 94 de la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular de CD28, unida a una segunda secuencia de aminoácidos que contiene restos aminoácido de aproximadamente la posición 94 a aproximadamente la posición 125 de la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular de CTLA4, unido a una tercera secuencia de aminoácidos correspondiente a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de la C\gamma1 de Ig humana.

Las técnicas para clonar y expresar secuencias de ADN que codifican las secuencias de aminoácidos correspondientes a la proteína receptora CTLA4, proteínas de condensación soluble y proteínas de condensación híbrida, por ejemplo síntesis de oligonucleótidos, PCR, células transformantes, vectores de construcción, sistemas de expresión, y similares están bien establecidas en la técnica, y la mayoría de los practicantes están familiarizados con los materiales de recursos estándar para condiciones y procedimientos especiales. Sin embargo, los siguientes párrafos se mantienen por conveniencia y anotación de modificaciones donde sea necesario, y pueden servir como una pauta.

Clonación y Expresión de Secuencias Codificantes para Receptores y Proteínas de Condensación

Las construcciones de proteínas de condensación que corresponden a CD28C\gamma1 de Ig y B7C\gamma1 de Ig para caracterizar la CTLA4Ig de la presente invención, y para preparar híbridos de condensación CD28IgCTLAIg, se prepararon como se describe por Linsley y col., J. Exp. Med. 173: 721-730 (1991). Alternativamente, los clones de ADNc se pueden preparar a partir de ARN obtenido de células que expresan antígeno B7 y receptor CD8 en base al conocimiento de las secuencias publicadas de estas proteínas (Aruffo y Seed, y Freeman, supra) usando procedimientos estándar.

Las condensaciones CTLA4Ig constan de secuencias que codifican aminoácidos que corresponden al dominio extracelular de CTLA4 y a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de la C\gamma1 de inmunoglobulina humana, se construyeron mediante ligazón de fragmentos de PCR. El ADNc que codifica las secuencias de aminoácidos se amplifica usando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") (véanse patentes de los Estados Unidos n^{os}.: 4.683.195 y 4.683.202 cedidas a Mullis y col. y a Mullis y Faloona, Methods Enzymol. 154: 335-50 (1987)). Los polipéptidos de condensación CTLA4Ig se obtuvieron teniendo ADN que codifica secuencias de aminoácidos que contienen residuos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 1 hasta aproximadamente la posición 125 de la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular de CTLA4 y ADN que codifica secuencias de aminoácidos que corresponden a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de la C\gamma1 de inmunoglobulina humana.

Debido a que la expresión de la proteína del receptor CTLA4 en células linfoides humanas no se ha comunicado previamente, fue necesario localizar una fuente de ARNm de CTLA4. Se rastreó ADNc de PCR elaborado a partir del ARN celular total de varias líneas celulares de leucemia en humanos, usando como cebadores, oligonucleótidos de la secuencia publicada del gen de CTLA4 (Dariavach y col., supra). Del ADNc probado, las células H38 (una línea de leucemia asociada a HTLV II) proporcionaron el mejor rendimiento de productos de PCR que tuvieron el tamaño esperado. Dado que no se identificó un péptido señal para CTLA4 en el gen CTLA4, el extremo N terminal de la secuencia predicha de CTLA4 se condensó con el péptido señal de oncostatina M (Malik y col., Molec. and Cell. Biol. 9: 2847 (1989)) en dos pasos usando oligonucleótidos como se describen en los ejemplos, infra. El producto de la reacción de PCR se ligó con ADNc que codifica las secuencias de aminoácidos correspondientes a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de C\gamma1 de Ig dentro de un vector de expresión, tales como CDM8 o \piLN.

Para obtener ADN que codifica CTLA4 en su longitud completa, se obtuvo un ADNc que codifica los dominios transmembrana y citoplásmicos de CTLA4 mediante PCR a partir de células H38 y se unió con un fragmento de CTLA4Ig, obtenido como se describe anteriormente, que codifica el péptido señal oncoestatina M condensado al extremo N terminal de CTLA4, usando cebadores oligonucleotídicos como se describe en los ejemplos, infra. Los fragmentos de PVCR se ligaron dentro del plásmido CDM8, dando como resultado un plásmido de expresión que codifica el gen CTLA4 en su longitud total, y se nombra OMCTLA4.

Para la construcción de un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos correspondiente a proteínas de condensación híbridas, se une ADN que codifica aminoácidos correspondientes a partes del dominio extracelular de un gen receptor a ADN que codifica aminoácidos correspondientes a partes del dominio extracelular de otro gen receptor, y a ADN que codifica las secuencias de aminoácidos correspondientes a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de la C\gamma1 de Ig humana usando procedimientos como los que se describen anteriormente para las construcciones B71g, CD28Ig y CTLA4Ig. Así, por ejemplo, el ADN que codifica los residuos de aminoácidos de aproximadamente la posición 1 a aproximadamente la posición 94 de la secuencia de aminoácidos correspondientes al dominio extracelular del receptor CD28 se une al ADN que codifica los residuos de aminoácido de aproximadamente la posición 94 a aproximadamente la posición 125 de la secuencia de aminoácidos que corresponde al dominio extracelular del receptor CTLA4 y a ADN que codifica las secuencias de aminoácido correspondientes a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de la C\gamma1 de Ig humana.

Para producir grandes cantidades de ADN clonado, los vectores que contienen ADN que codifica las construcciones de condensación de la invención se transforman en células huésped adecuadas, tales como la línea celular bacteriana cepa MC1061/p3 de E. coli (Invitrogen Corp., San Diego, CA) usando procedimientos estándar, y se rastrearon las colonias en busca de los plásmidos apropiados.

Los clones que contienen las construcciones de condensación que codifican de ADN obtenidas como se describió anteriormente se transfectan después en células huésped adecuadas para expresión. Dependiendo de la célula huésped usada, la transfección se lleva a cabo usando técnicas estándar apropiadas para tales células. Por ejemplo, la transfección en células de mamífero se lleva a cabo usando transfección mediada por DEAE-dextrano, coprecipitación con CaPO_{4}, lipofección, electroporación, o condensación protoplásmica, y otros procedimientos conocidos en la técnica incluyen: condensación de lisozimas o condensación de eritrocitos, raspado, captación directa, choque osmótico o choque de sacarosa, microinyección directa, microinyección indirecta tal como por medio de técnicas mediadas por eritrocitos, y/o sometiendo a las células huésped a corrientes eléctricas. La lista anterior de técnicas de transfección no se considera que sea exhaustiva, ya que no hay duda que se desarrollarán otros procedimientos para introducir información genética dentro de células.

Se prefiere la expresión en cultivos de células huésped eucariotas derivadas de organismos pluricelulares (véase Tissue Cultures, Academic Press, Cruz y Patterson, eds. (1973)). Estos sistemas tienen la ventaja adicional de la capacidad de emplamar intrones y así se pueden usar directamente para expresar fragmentos genómicos. Las líneas celulares huésped útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón de mono (COS), células VERO y células HeLa. En la presente invención, se prefieren las líneas celulares que expresan de forma estable las construcciones de condensación.

Los vectores de expresión para tales células de ordinario incluyen promotores y secuencias control compatibles con células de mamífero tales como, por ejemplo, promotor CMV (vector CDM8) y virus del sarcoma aviar (ASV) (vector \piLN). Otros promotores tempranos y posteriores usados comúnmente incluyen aquellos del virus de los simios 40 (SV40) (Fiers, y col., Nature 273: 113 (1973)), u otros promotores virales tales como aquellos derivados de polioma, adenovirus 2, y papilomavirus bovino. El promotor que controla, hMTII (Karin, y col., Nature 299: 797-802 (1982)) se puede usar también. Los aspectos generales de los sistemas de transformación de células huésped de mamíferos se han descrito por Axel (patente de los Estados Unidos nº.: 4.399.126 publicada el 16 de agosto de 1983). Ahora parece que las regiones "potenciadoras" son importantes en optimizar la expresión; estas son, generalmente, secuencias encontradas cadena arriba o cadena debajo de la región promotora en regiones de ADN no codificantes. Los orígenes de replicación se pueden obtener, si es necesario, de fuentes virales. Sin embargo, la integración dentro del cromosoma es un mecanismo común para replicación del ADN en eucariotas.

Aunque las células huésped preferidas para expresión de construcciones de condensación incluyen células eucariotas tales como células COS o CHO, se pueden usar como huéspedes microbios eucariotas diferentes. Las cepas de laboratorio de Saccharomyces cerevisiae, la levadura de Baker, son más usadas aunque se pueden usar otras cepas tales como Schizosaccharomyces pombe. Se pueden usar los vectores que emplean, por ejemplo, el origen de replicación 2\mu de Broach, Meth Enz. 101: 307 (1983), u otros orígenes de replicación de levaduras compatibles (véase, por ejemplo, Stinchcomb y col., Nature 282: 39 (1979)); Tschempe y col., Gene 10: 157 (1980); y Clarke y col., Meth. Enz. 101: 300 (1983)). Las secuencias control de vectores de levaduras incluyen promotores para la síntesis de enzimas glicolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Holland y col., Biochemistry 17: 4900 (1978)). Los promotores adicionales conocidos en la técnica incluyen el promotor de CMV proporcionado en el vector CDM8 (Toyama y Okayama, FEBS 268: 217-221 (1990); el promotor para 3-fosfogliceratoquinasa (Hitzeman y col., J Biol. Chem. 255: 2073 (1980)), y aquellos para otras enzimas glucolíticas. Otros promotores, los cuales tienen la ventaja adicional de transcripción controlada mediante condiciones de crecimiento son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con metabolismo del nitrógeno, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. También se cree que las secuencias terminadoras son deseables en el extremo 3' de las regiones codificantes. Tales terminadores se encuentran en la región 3' no traducida que sigue a las secuencias codificantes en genes derivados de levaduras.

Alternativamente, las células procariotas se pueden usar como huésped para expresión. Los procariotas están representados más frecuentemente mediante diversas cepas de E. coli; sin embargo, otras cepas microbianas se pueden usar también. Las secuencias de control procariótico comúnmente usadas las cuales se definen en el presente documento para incluir promotores para iniciación de la trascripción, opcionalmente con un operador, junto con las secuencias del sitio de unión al ribosoma, incluyen tales promotores comúnmente usados como los sistemas promotores de la beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) (Chang y col., Nature 198: 1056 (1977)), el sistema de promotor de triptófano (Goeddel y col., Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980)) y el promotor PL derivado de lambda y el sitio de unión al ribosoma del gen N (Shimatake y col., Nature 292: 128 (1981)).

Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas CD28Ig y CTLA4Ig, y proteínas de condensación híbridas tales como CD28Ig/CTLA4Ig se pueden expresar en una diversidad de sistemas como se expone a continuación. El ADNc se puede escindir mediante enzimas de restricción adecuadas y ligar en vectores de expresión adecuados procariotas o eucariotas para tal expresión. Debido a que las proteínas receptoras CD28 y CTLA4 se dan en la naturaleza como dímeros, se cree que la expresión exitosa de estas proteínas requiere un sistema de expresión el cual permita a estas proteínas formarse como dímeros. Las versiones truncadas de estas proteínas (es decir, formadas mediante introducción de un codon de parada en la secuencia en una posición cadena arriba de la región transmembrana de la proteína) no parecen expresarse La expresión de los receptores CD28 y CTLA4 como proteínas de condensación permite la formación de dímeros de estas proteínas. Así, en la presente invención se prefiere la expresión de la proteína CTLA4 como un producto de condensación.

Una línea de CHO estable en la invención, designada Línea Celular del Ovario de Hámster Chino CTLA4-Ig-24, se prefiere para expresión de CTLA4Ig y se ha depositado con el ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest en mayo de 1991, y se acordó un número de acceso ATCC: 10762.

La expresión del receptor CTLA4 de la invención se lleva a cabo transfectando una línea celular tal como células COS, y detectando expresión mediante unión de las células CYLA4-transfectadas a un ligando para el receptor CTLA4, por ejemplo mediante prueba para unión de las células a la proteína de condensación B7Ig.

Las secuencias de las construcciones resultantes se confirman mediante secuenciación de ADN utilizando procedimientos conocidos, por ejemplo como se describe por Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 (1977) como se describe adicionalmente por Messing y col., Nucleic Acids Res. 9:309 (1981), o mediante el procedimiento de Maxam y col., Methods Enzymol. 65: 499 (1980)).

Recuperación de productos proteicos

Como se destacó anteriormente, los genes del receptor CD28 y CTLA4 no se expresan fácilmente como proteínas maduras usando expresión directa de ADN que codifica la proteína truncada. Para permitir la formación de homodímeros, el ADN que codifica la secuencia de aminoácidos que corresponde a los dominios extracelulares de CD28 y CTLA4, y que incluye los codones para una secuencia señal tal como aquella de oncoestatina M en células capaces de procesamiento adecuado, se condensa con ADN que codifica la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio Fc de una proteína naturalmente dimérica. La purificación de estos productos de proteína de condensación después de la secreción a partir de las células se facilita así usando anticuerpos reactivos con la parte anti-inmunoglobulina de las proteínas de condensación. Cuando se segrega al medio, el producto proteína de condensación se recupera usando técnicas de purificación de proteínas estándar, por ejemplo mediante aplicación a columnas de proteína A.

Uso

La proteína de condensación CTLA4Ig y/o fragmentos de la proteína de condensación se pueden usar para reaccionar con las células B7 positivas, tales como células B, para regular respuestas inmunes mediadas mediante interacciones de células T con las células B7 antígeno positivas.

La proteína de condensación CTLA4Ig y las proteínas híbridas CTLA4Ig/CD28Ig, y/o fragmentos y derivados de estas proteínas, pueden también usarse para reaccionar con las células B7 positivas, incluyendo células B, para regular respuestas inmunes mediadas por respuestas de células B dependientes de células T. El término "fragmento" como se usa en el presente documento significa una parte de la secuencia de aminoácidos que codifica la proteína referida como "CTLA4". Un fragmento de la proteína de condensación CTLA4Ig que se puede usar es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a alguna parte de la secuencia de aminoácidos correspondiente al receptor CTLA4 usado para obtener la proteína de condensación CTLA4Ig como se describe anteriormente.

El antígeno B7 expresado en células B activadas y células de otros linajes, y el receptor CD28 expresado en las células T, pueden unirse directamente entre sí, y esta interacción puede mediar la interacción célula-célula. Tales interacciones activan directamente la ruta de activación CD28 en las células T, conduciendo a la producción de citoquinas, proliferación de células T, y diferenciación de células B en células que producen inmunoglobulinas. La activación de las células B que tienen lugar, puede causar expresión incrementada de antígeno B7 y estimulación adicional de CD28, conduciendo a un estado de inflamación crónica tal como en enfermedades autoinmunes, rechazo de aloinjerto, enfermedad injerto contra huésped o reacciones alérgicas crónicas. Bloquear o inhibir esta reacción puede ser efectivo en prevenir producción de citoquinas de células T y así prevenir o revertir reacciones inflamatorias.

Se muestra en el presente documento que la CTLA4Ig es un potente inhibidor de las funciones de los linfocitos in vitro que requieren interacción de células T y células B. Esto indica la importancia de interacciones entre el antígeno B7 y sus contrarreceptores, CTLA4 y/o CD28. Los dominios citoplásmicos de CTLA4 murino y humano son similares (Dariavach y col., supra, 1988), sugiriendo que esta región tiene importantes propiedades funcionales. Los dominios citoplásmicos de CD28 y CTLA4 también comparten homología.

CTLA4 es un inhibidor más potente in vitro de respuestas de linfocitos que, bien anticuerpos anti-BB1, o bien anticuerpos anti-CD28. La CTLA4Ig no ha tenido efectos estimuladores directos sobre la proliferación de célula T para contrarrestar sus efectos inhibidores. Por lo tanto, la proteína de condensación CTLA4Ig puede funcionar como un mejor inhibidor in vivo que anticuerpos monoclonales anti-CD28. Los efectos inmunosupresores de CTLA4Ig in vitro sugieren su uso en terapia para tratamiento de enfermedades autoinmunes que implican activación de células T anormal o producción de Ig anormal.

Se espera que la proteína de condensación CTLA4Ig presente propiedades inhibidoras in vivo. Así, se espera que CTLA4Ig actuará para inhibir células T de una manera similar a los efectos observados para el anticuerpo anti-CD28, bajo condiciones similares in vivo. Bajo condiciones donde las interacciones células T/células B están ocurriendo como resultado del contacto entre células T y células B, la unión de CTLA4Ig introducido para reaccionar con las células positivas a antígeno B7, por ejemplo células B, puede interferir, es decir, inhibir las interacciones células T/células B dando como resultado regulación de respuestas inmunes. Debido a este efecto inhibidor exclusivo, se espera que CTLA4Ig sea útil in vivo como un inhibidor de actividad de células T, sobre inhibidores no específicos tales como ciclosporina y glucosteroides.

En una realización, la proteína de condensación CTLAIg o las proteínas híbridas CTLA4Ig/CD28Ig, se pueden introducir en un vehículo farmacéutico adecuado in vivo, es decir administrarse en un sujeto humano para el tratamiento de afecciones patológicas tales como enfermedades del sistema inmune o cáncer.

Se espera que la introducción de la proteína de condensación in vivo dé cómo resultado interferencia con las interacciones de las células T con otras células, tales como células B, como resultado de unión del ligando a las células B7 positivas. La prevención de las interacciones de las células T normales puede dar como resultado actividad de células T disminuida, por ejemplo, proliferación de células T disminuida. Además, se espera que la administración de la proteína de condensación in vivo dé cómo resultado regulación de niveles in vivo de citoquinas, incluyendo, pero no limitadas a, interleucinas, por ejemplo, interleucina ("IL")-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, factores de crecimiento incluyendo factor de crecimiento tumoral ("TGF"), factor estimulador de colonias ("CSF"), interferones ("IFN"), y factor de necrosis tumoral ("TNF") para promover efectos deseados en un sujeto. Por ejemplo, cuando la proteína de condensación se introduce in vivo, puede bloquear la producción de citoquinas, la cual contribuye al crecimiento maligno, por ejemplo de células tumorales. La proteína de condensación puede también bloquear la proliferación de virus dependientes de la activación de las células T, tales como el virus que causa SIDA, HTLV1.

Bajo algunas circunstancias, como se destaca anteriormente, el efecto de administración de la proteína de condensación CTLA4Ig o sus fragmentos in vivo es inhibidor, lo que resulta del bloqueo, mediante la proteína de condensación, de la activación de las CTLA4 y CD28 resultante del contacto células T/células B. Por ejemplo, la proteína CTLA4Ig puede bloquear la proliferación de células T. La introducción de la proteína de condensación CTLA4Ig in vivo producirá así efectos en las respuestas inmunes mediadas tanto por células T como por células B. La proteína de condensación se puede administrar también a un individuo en combinación con la introducción de citoquinas u otros agentes terapéuticos.

Los anticuerpos monoclonales se pueden producir mediante hibridomas preparados usando procedimientos conocidos, tales como aquellos introducidos por Kohler y Milstein (véase Kohler y Milstein, Nature, 256: 495-97 (1975), y modificaciones de los mismos, para regular interacciones celulares.

Estas técnicas implican el uso de un animal el cual se prepara para producir un anticuerpo en particular. El animal se puede preparar mediante inyección de un inmunógeno (por ejemplo la proteína de condensación B7Ig, la proteína de condensación CTLA4Ig o la proteína de condensación híbrida CD28Ig/CTLA4Ig) para facilitar la respuesta inmune deseada, es decir producción de anticuerpos a partir del animal preparado. Un animal preparado es también uno el cual está expresando una enfermedad. Los linfocitos derivados de los nódulos linfáticos, bazos o sangre periférica de animales preparados, enfermos, se pueden usar para buscar un anticuerpo en particular. Los cromosomas de linfocitos que codifican las inmunoglobulinas deseadas se inmortalizan condensando los linfocitos con células de mieloma, generalmente en presencia de una agente condensante tal como polietilenglicol (PEG). Cualquiera de un número de líneas celulares de mieloma se puede usar como un compañero de condensación de acuerdo con las técnicas estándar; por ejemplo, las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653, Sp2/0-Ag14, o HL1-653. Estas líneas de mieloma están disponibles a partir de ATCC, Rockville, Maryland.

Las células resultantes, las cuales incluyen los hibridomas deseados, se cultivan después en un medio selectivo tal como un medio HAT, en el cual las células de mieloma o linfocíticas parentales no condensadas eventualmente mueren. Sólo las células de hibridoma sobreviven y se pueden cultivar bajo condiciones de dilución limitantes para obtener clones aislados. Los sobrenadantes de los hibridomas se rastrean en busca de la presencia de la especificidad deseada, por ejemplo mediante técnicas de inmunoensayo que usan la proteína CTLA4Ig que se ha usado para inmunización. Los clones positivos se pueden subclonar bajo condiciones de dilución limitantes, y el anticuerpo monoclonal producido se puede aislar.

Diversos procedimientos convencionales se pueden usar para aislamiento y purificación de los anticuerpos monoclonales tal como para obtenerlos libres de otras proteínas y contaminantes. Los procedimientos usados comúnmente para purificar anticuerpos monoclonales incluyen precipitación de sulfato amónico, cromatografía de intercambio iónico, y cromatografía de afinidad (véase Zola y col., en Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, Hurell (ed.) páginas 51-52 (CRC Press, 1982)). Los hibridomas producidos de acuerdo a estos procedimientos se pueden propagar in vitro o in vivo (en fluido de ascitis) usando técnicas conocidas en la técnica (véase en general Fink y col., Prog. Clin. Pathol., 9: 121-33 (1984), fig. 6-1 en la pagina 123).

Generalmente, la línea celular individual se puede propagar in vitro, por ejemplo, en recipientes de cultivo de laboratorio, y el medio de cultivo que contiene altas concentraciones de un anticuerpo monoclonal específico individual se puede recoger mediante decantación, filtración, o centrifugación.

Además, se pueden producir fragmentos de estos anticuerpos que contienen la región de unión activa con el dominio extracelular del receptor CTLA4, tal como Fab, F(ab')2 y fragmentos Fv. Tales fragmentos se pueden producir usando técnicas bien establecidas en la técnica (véase por ejemplo Rousseaux y col., en Methods Enzymol., 121: 663-69, Academic Press (1986).

Los anticuerpos monoclonales anti-B7 preparados como se describe anteriormente se pueden usar para unir el antígeno B7 para inhibir interacciones de células T CD28 positivas o CTLA4 positivas con células B7 positivas.

En otra realización, la proteína de condensación CTLA4Ig se puede usar para identificar compuestos adicionales capaces de regular la interacción entre CTLA4 y el antígeno B7. Tales compuestos pueden incluir moléculas que se dan en la naturaleza pequeñas que se pueden usar para reaccionar con células B y/o células T. Por ejemplo, los caldos de fermentación se pueden probar en su capacidad para inhibir interacciones CTLA4/B7. Además, derivados de la proteína de condensación CTLA4Ig como se describen anteriormente se pueden usar para regular proliferación de células T. Por ejemplo, los fragmentos o derivados se pueden usar para bloquear proliferación de células T en enfermedad injerto contra huésped (GVH) la cual acompaña al transplante de médula ósea alogénico.

La proliferación celular de células T mediada por CD28 es resistente a ciclosporina, en contraste con proliferación dirigida por el complejo receptor celular CD3/Ti (June y col., 1987, supra). La ciclosporina es relativamente ineficaz como un tratamiento de enfermedad GVH (Storb, Blood 68: 119-125 (1986)). La enfermedad GVH está pensada para mediarse por linfocitos T los cuales expresan antígeno CD28 (Storb y Thomas, Immunol. Rev. 88: 215-238 (1985)). Así, la proteína de condensación CTLA4Ig puede ser útil sola, o en combinación con inmunosupresores tales como ciclosporina, para bloquear la proliferación de células T en enfermedades GVH.

La regulación de interacciones de células T CTLA4 positivas con células B7 positivas, incluyendo células B, mediante los procedimientos de la invención se pueden usar así para tratar afecciones patológicas tales como autoinmunidad, transplante, enfermedades infecciosas y neoplasia.

Las moléculas de unión a CTLA4 y las moléculas de unión a IL4 descritas en el presente documento pueden estar en una diversidad de formas de dosificación las cuales incluyen, pero no se limitan a, disoluciones o suspensiones líquidas, comprimidos, píldoras, polvos, supositorios, microcápsulas o microvesículas poliméricas, liposomas, y disoluciones inyectables o infundibles. La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica.

El modo más efectivo de administración y régimen de dosificación para las moléculas de la presente invención depende de la gravedad y tratamiento de la enfermedad, la salud del sujeto y la respuesta al tratamiento y el juicio del médico que trata. De acuerdo con ello, las dosificaciones de las moléculas deberían valorarse para el sujeto indivi-
dual.

La interrelación de dosificaciones para animales de varios tamaños y especies y humanos basada en mg/m^{2} de área de superficie se describe por Freireich, E.J., y col. (Quantitate Comparison of Toxicity of Anticancer Agents in Mouse, Rat, Hamster, Dog, Monkey and Man. Cancer Chemother., Rep., 50, nº. 4, 219-244, mayo 1966).

Los ajustes en el régimen de dosificación se pueden hacer para optimizar la respuesta de inhibición del crecimiento. Las dosificaciones se pueden dividir y administrar en una base diaria o la dosis se puede reducir proporcionalmente dependiendo de la situación. Por ejemplo, varias dosis divididas se pueden administrar diariamente o la dosis se puede reducir proporcionalmente como se indica por la situación terapéutica específica.

De acuerdo con la práctica de la invención una cantidad efectiva para tratar un sujeto puede estar entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del sujeto. Además, la cantidad efectiva puede ser una cantidad entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del sujeto.

Ventajas de la invención

La invención sujeto supera los problemas asociados con terapias actuales deseadas para prevenir el rechazo del tejido o trasplantes de órganos. En contraste con las terapias actuales, la presente invención lleva a cabo sólo respuestas inmunes mediadas por interacciones B7.

Por ejemplo, la presente invención afecta las células T específicas de antígeno del trasplante, induciendo así tolerancia específica de donante y específica de antígeno. La unión de CD28 mediante su ligando, B7/BB1 (B7), durante el compromiso del receptor de células T es crítica para la señalización de células T apropiada en algunos sistemas (M.K. Jenkins, P.S. Taylor, S.D. Norton, K.B. Urdahl, J. Immunol. 147: 2461 (1991); C.H. June, J.A. Ledbetter, P.S. Linsley, C.B. Thompson, Immunol. Today 11: 211 (1990); H. Reiser, G.J. Freeman, Z. Razi-Wolf, C.D. Gimmi, B. Benacerraf, L.M. Nadler, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 271 (1992); N.K. Damie, K. Klussman, P.S. Linsley, A. Aruffo, J. Immunol. 148: 1985 (1992)).

Cuando la interacción de CD28 con su ligando se bloquea, las células T específicas de antígeno se inducen inapropiadamente dentro de un estado de anergia de las células T específicas de antígeno (M.K. Jenkins, P.S. Taylor, S.D. Norton, K.B. Urdahl, J. Immunol. 147: 2461 (1991); F.A. Harding, J.G. McArthur, J.A. Gross, D.H. Raulet, J.P. Allison, Nature 356: 607 (1992)).

La proteína de condensación CTLA4Ig se une tanto a B7 humano como a B7 murino (con una afinidad 20 veces mayor que CD28), bloquea la unión de CD28 a B7, inhibe la activación de células T, e induce la no capacidad de respuesta de las células T in vitro (F.A. Harding, J.G. McArthur, J.A. Gross, D.H. Raulet, J.P. Allison, Nature 356: 607 (1992); P.S. Linsley y col., J. Exp. Med. 174: 561 (1991).

Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la presente invención y para ayudar a alguien de habilidad normal en elaborar y usar la misma. Los ejemplos no se desean de ninguna manera para limitar aparte de eso la panorámica de la invención.

Ejemplo 1 Preparación de Proteínas de Condensación B7Ig y CD28Ig

Las proteínas de condensación con el receptor de gamma inmunoglobulina C (C\gamma de Ig) B7Ig y CD28Ig se prepararon como se describe por Linsley y col., en J. Exp. Med. 173: 721-730 (1991), en el presente documento. Brevemente, el ADN que codifica las secuencias de aminoácidos correspondiente a la proteína receptora respectiva (por ejemplo, B7) se unió al ADN que codifica secuencias de aminoácidos correspondientes a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de la C\gamma de Ig humana. Esto se llevó a cabo como sigue.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Para PCVR, los fragmentos de ADN se amplificaron usando pares de cebadores como se describe para cada proteína de condensación. Las reacciones de PCR (0,1 ml de volumen final) se ejecutaron en tampón de polimerasa Tag (Stratagene, La Jolla, CA), que contenía 20 \mumoles de cada dNTP; 50-100 pmoles de los cebadores indicados; plantilla (1 ng de plásmido o ADNc sintetizado a partir de \leq 1 \mug de ARN total usando cebador hexámero aleatorio, como se describe por Kawasaki en PCR Protocols, Academic Press, páginas 21-27 (1990); y polimerasa Tag (Stratagene). Las reacciones se hicieron funcionar en un termociclador (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT) durante 16-30 ciclos (un ciclo típico constó de etapas de 1 minuto a 94ºC, 1-2 minutos a 50ºC y 1-3 minutos a 72ºC).

Construcción de Plásmido. Los plásmidos de expresión que contienen ADNc que codifica CD28, como se describe por Aruffo y Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573 (1987)), se proporcionaron por los doctores Aruffo y Seed (Mass General Hospital, Boston, MA). Los plásmidos que contienen ADNc que codifica CD5, como se describe por Aruffo, Cell, 61: 1303 (1990)), se proporcionó por el doctor Aruffo. Los plásmidos que contienen ADNc que codifica B7, como se describe por Freeman y col., J. Immunol. 143: 2714 (1989), se proporcionaron por el doctor Freeman (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA). Para intentos iniciales en expresión de formas solubles de CD28 y B7, se elaboraron construcciones (OMCD28 y OMB7) como se describe por Linsley y col., J. Exp. Med., supra, en los cuales los codones de parada se introdujeron cadena arriba de los dominios transmembrana y los péptidos señal nativos se reemplazan con el péptido señal de oncoestatina M (Malik y col., Mol. Cell. Biol. 9: 2847 (1989)). Esto se hizo usando oligonucleótidos sintéticos para reconstrucción (OMCD28) o como cebadores (OMB7) para PCR. OMCD28, es un ADNc de CD28 modificado para expresión más eficiente reemplazando el péptido señal con la región análoga de oncoestatina M. Las construcciones CD28Ig y B7Ig se hicieron en dos partes. Las partes 5' se hicieron usando OMCD28 y OMB7 como plantillas y el oligonucleótido, CTAGCCACTGAAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCACAC (SEQ ID Nº.: 1), (que codifica la secuencia de aminoácidos correspondiente al péptido señal de oncoestatina M) como un cebador directo, y bien TGGCATGGGC TCCTGATCAGGCTTAGAAGGTCCGGGGAAA (SEQ ID Nº.: 2), o bien, TTTGGGCTCCTGATCAGGAAAATGCTCTTGCTTGGTTGT (SEQ ID Nº.: 3) como cebadores inversos, respectivamente. Los productos de las reacciones de PCR se escindieron con endonucleasas de restricción (Hind III y BclI) como sitios introducidos en los cebadores de PCR y purificados mediante gel.

La parte 3' de las construcciones de condensación correspondientes a las secuencias de C\gamma1 de Ig humana se hizo mediante una reacción de PCR acoplada a transcriptasa reversa (del virus de la mieloblastosis aviar; Life Sciences Associates, Bayport, Nueva York) que usa ARN de una línea celular de mieloma que produce mAb L6 quimérica de humano-ratón (proporcionada por el Dr. P. Fell y M. Gayle, Bristol-Myers Squibb Company, Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA) como plantilla. El oligonucleótido, AAGCAAGAGCATTTTCCTGATCAGGAGC
CCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTG (SEQ ID Nº.: 4), se usó como cebador directo, y CTTCGACCAGTCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC (SEQ ID Nº.: 5) como cebador inverso. Los productos de reacción se escindieron con BclI y XbaI y se purificaron en gel. Las construcciones finales se ensamblaron ligando fragmentos escindidos con HindIII/BclI que contenían secuencias CD28 o B7 conjuntamente con fragmento escindido con BclI/XbaI que contenía secuencias de C\gamma1 de Ig en CDM8 escindido con HindIII/XbaI. Los productos de ligazón se transformaron en células de E. coli MC1061/p3 y las colonias se rastrearon en busca de los plásmidos apropiados. Las secuencias de las construcciones resultantes se confirmaron mediante secuenciación de ADN.

La construcción que codifica B7 contuvo ADN que codificaba aminoácidos correspondientes a los residuos de aminoácidos de aproximadamente la posición 1 a aproximadamente la posición 215 del dominio extracelular de B7. La construcción que codifica CD28 contuvo ADN que codificaba aminoácidos correspondientes a los residuos de aminoácidos de aproximadamente la posición 1 a aproximadamente la posición 134 del dominio extracelular de CD28.

CD5Ig se construyó de modo idéntico, usando CATTGCACAGTCAAGCTTCCATGCCCATGGGTTCTCTGG
CCACCTTG (SEQ ID Nº.: 6) como cebador directo y ATCCACAGTGCAGTGATCATTTGGATCCTGGCATG
TGAC (SEQ ID Nº.: 7) como cebador inverso. El producto de PCR fue digerido por endonucleasas de restricción y ligado con el fragmento C\gamma1 de Ig como se describe anteriormente. La construcción resultante (CD5Ig) codificó una proteína madura que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene residuos de aminoácido desde la posición 1 hasta la posición 347 de la secuencia correspondiente a CD5, dos aminoácidos introducidos mediante el procedimiento de construcción (aminoácidos DQ), seguidos por ADN que codifica aminoácidos correspondientes a la región bisagra de C\gamma1 de Ig.

Cultivos Celulares y Transfecciones. Las COS (células de riñón de mono) se transfectaron con plásmidos de expresión que expresan CD28 y B7 usando una modificación del protocolo de Seed y Aruffo (Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 3365 (1987)). Las células se sembraron a 10^{6} por placa de cultivo de 10 cm de diámetro de 18 a 24 horas antes de la transfección. Se añadió ADN en plásmido (aproximadamente 15 \mul por pocillo) en un volumen de 5 ml de DMEM libre de suero que contiene cloroquina 0,1 mM y 600 \mug/ml de DEAE Dextrano, y las células se incubaron durante 3-3,5 horas a 37ºC. Las células transfectadas se trataron después brevemente (durante aproximadamente 2 minutos) con dimetilsulfóxido al 10% en PBS y se incubaron a 37ºC durante 16-24 horas en DMEM que contiene FCS al 10%. A 24 horas después de la transfección, el medio de cultivo se eliminó y reemplazó con DMEM libre de suero (6 ml/placa). La incubación se continuó durante 3 días a 37ºC, tiempo al cual el medio gastado se recogió y se añadió medio libre de suero sin usar. Después de 3 días adicionales a 37ºC, el medio gastado se recogió de nuevo y las células se descartaron.

Las células CHO que expresan CD28, CD5 o CD7 se aislaron como se describe por Linsley y col., (1991) supra, como sigue. Brevemente, los transfectantes estables CD28, CD5, o B7, se aislaron siguiendo cotransfección de células de ovario de hámster chino deficiente en dihidrofolato reductasa (CHO dhfr^{-}) con una mezcla del plásmido de expresión apropiado y el marcador seleccionado, pSV2dhfr (Linsley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5031 (1990)). Los transfectantes se cultivaron después en concentraciones crecientes de metotrexato a un nivel final de 1 \muM y se mantuvieron en DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS), prolina 0,2 mM y metotrexato 1 \muM. Las líneas CHO que expresaron altos niveles de CD28 (CHO CD28^{+}) o B7 (CHO B7^{+}) se aislaron mediante rondas múltiples de separación de células activada por fluorescencia (FACS^{R}) siguiendo inmunotinción indirecta con mAb 9,3 o BB-1. Las células CHO amplificadas negativas para expresión en superficie de CD28 o B7 (CHO dhfr^{-}) se aislaron también mediante FACS^{R} a partir de poblaciones transfectadas con CD28.

Inmunotinción y Análisis de FACS^{R}. Las células transfectadas CHO o COS o las células T activadas se analizaron mediante inmunotinción indirecta. Antes de teñir, las células CHO se eliminaron de los recipientes de cultivo mediante incubación en PBS que contenía 10 mM de EDTA. Las células se incubaron primero con mAb 9.3 murino (Hansen y col., Immunogenetics 10: 247 (1980) o BB-1 (Yokochi y col., J. Immunol. 128: 823 (1981)), o con proteínas de condensación con Ig (todas a 10 \mug/ml en DMEM que contiene FCS al 10%) durante 1-2 horas a 4ºC. Las células se lavaron, y se incubaron durante unas 0,5-2 horas adicionales a 4ºC con un agente de la segunda etapa conjugado con FITC (suero de cabra anti-Ig de ratón para mAb murinos, o suero de cabra anti-C\gamma de Ig humana para proteínas de condensación (Tago, Inc., Burlingame, CA)).

La fluorescencia se analizó en un aislador de células FACS IV^{R} (Becton Dickinson y CO., Mountain View, CA) equipado con un amplificador logarítmico de cuatro décadas.

Purificación de Proteínas de Condensación con Ig. Las colecciones primera, segunda y tercera de medios de cultivo libres de suero gastados de células COS transfectadas se usan como fuentes para la purificación de proteínas de condensación Ig. Después de la eliminación de restos celulares mediante centrifugación de baja velocidad, el medio se aplicó a una columna (aproximadamente 200-400 ml de medio/ml de volumen de lecho empaquetado) de proteína A inmovilizada (Repligen Corp., Cambridge, MA) equilibrado con citrato de sodio 0,05 M, pH 8,0. Después de la aplicación del medio, la columna se lavó con fosfato potásico 1 M, pH 8, y la proteína unida se eluyó con citrato de sodio 0,05 M, pH 3. Las fracciones se recogieron e inmediatamente se neutralizaron mediante adición de volumen 1/10 de Tris 2 M, pH 8. Las fracciones que contienen el material que absorbe al pico de A_{280} se almacenaron y dializaron frente a PBS antes de usar. Los coeficientes de extinción de 2,4 y 2,8 ml/mg para CD28Ig y BTIg, respectivamente, se determinaron mediante análisis de aminoácidos de disoluciones de absorbancia conocida. La recuperación de actividades de unión de CD28Ig y B7Ig purificadas fue casi cuantitativa a juzgar por análisis FACS^{R} después de tinción fluorescente indirecta de células CHO B7^{+} y CD28^{+}.

Ejemplo 2 Preparación de Proteína de Condensación CTNLA4Ig

Se construyó una condensación genética soluble que codifica CTLA4Ig entre el dominio extracelular de CTLA4 y el dominio C\gamma1 de Ig de una forma similar a aquella descrita anteriormente para la construcción CD28Ig. El dominio extracelular del gen CTLA4 se clonó mediante PCR usando oligonucleótidos sintéticos correspondientes a la secuencia publicada (Dariavach y col., Eur. Journ. Immunol. 18: 1901-1905 (1988)).

Debido a que un péptido señal de CTLA4 no se identificó en el gen CTLA4, el extremo N terminal de la secuencia predicha de CTLA4 se condensó con el péptido señal de oncoestatina M (Malik y col., Mol. and Cell. Biol. 9: 2847 (1989)) en dos etapas usando oligonucleótidos que se superponen. Para la primera etapa, el oligonucleótido,
CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC (SEQ ID Nº.: 8) (el cual codifica los 15 aminoácidos C terminales del péptido señal de oncoestatina M condensados a los 7 aminoácidos N terminales de CTLA4) se usó como cebador directo, y TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGG
GCACGGTTG (SEQ ID Nº.: 9) (el cual codifica residuos aminoácidos 119-125 de la secuencia de aminoácidos que codifica receptor CTLA4 y contiene un sitio de enzimas de restricción) como cebador inverso. La plantilla para esta etapa fue ADNc sintetizado a partir de 1 \mug de ARN total a partir de células H38 (una línea celular leucémica de células T infectadas con HTLV II proporcionada por los doctores Salahudin y Gallo, NCI, Bethesda, MD). Una parte del producto de PCR de la primera etapa se reamplificó, usando un cebador directo que se superpone, codificando la parte N terminal del péptido señal de la oncostatina M y conteniendo un sitio de endonucleasa de restricción Hind III, CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGC
TCAGTCTGGTCCTTGCACTC (SEQ ID Nº.: 10) y el mismo cebador inverso. El producto de la reacción PCR se digirió con Hind III y Bcl I y se ligó conjuntamente con un fragmento de ADNc escindido con Bcl 1/Xba I que codifica las secuencias de aminoácidos correspondientes a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de C\gamma1 de Ig dentro del vector de expresión CDM8 escindido con Hind III/Xba I, o del vector de expresión \piLN escindido con Hind III/Xba I (proporcionados por el Dr. Aruffo).

Un mapa de la construcción de condensación CTLA4Ig resultante se muestra en la figura 1. Las secuencias desplegadas en esta figura muestran los empalmes entre CTLA4 (letras mayúsculas, zonas no sombreadas) y el péptido señal, SP, de oncoestatina M (regiones sombreadas en negro), y la bisagra, H, de C\gamma1 de Ig (regiones punteadas). El aminoácido entre paréntesis se introdujo durante la construcción. Los asteriscos (*) indican mutaciones de cisteína a serina introducidas en la región bisagra de C\gamma1 de Ig. Se indica el dominio similar a V de la superfamilia de las inmunoglobulinas presente en CTLA4, como son los dominios CH2 y CH3 de C\gamma1 de Ig.

Los plásmidos de expresión, CDM8, que contienen CTLA4Ig se transfectaron después dentro de células COS usando transfección DEAE/dextrano mediante modificación (Linsley y col., 1991, supra) del protocolo descrito por Seed y Aruffo, 1987, supra.

Las construcciones de plásmidos de expresión (\piLN o CDM8) que contienen ADNc que codifica la secuencia de aminoácidos de CTLA4Ig, se transfectaron mediante lipofección usando procedimientos estándar en líneas celulares CHO dhfr^{-} para obtener nuevas líneas celulares que expresen de forma estable CTLA4Ig.

El ADN que codifica la secuencia de aminoácidos correspondiente a CTLA4Ig se ha depositado con la ATCC bajo el Tratado de Budapest en el 31 de mayo de 1991, y se ha acordado un número de acceso ATCC 68629.

Un transfectante estable preferido, que expresa CTLA4Ig, llamado línea celular de Ovario de Hámster Chino, CTLA4Ig-24, se elaboró mediante rastreo de líneas celulares CHO B7 positivas en busca de actividad de unión a B7 en el medio usando inmunotinción. Los transfectantes se mantuvieron en DMEM suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%, prolina 0,2 mM y metotrexato 1 \muM.

La línea celular CHO CTLA4Ig-24 se ha depositado con la ATCC bajo el Tratado de Budapest en el 31 de mayo de 1991, y se ha acordado un número de acceso ATCC 10762.

CTLA4Ig se purificó mediante cromatografía de la proteína A a partir de sobrenadantes acondicionados libres de suero (figura 2). Se determinaron concentraciones de CTLA Ig asumiendo un coeficiente de extinción a 280 nm de 1,6 (determinado experimentalmente mediante análisis de aminoácidos de una disolución de absorbancia conocida). Los estándares de peso molecular (caminos 1 y 2, figura 2) y muestras (1 \mug) de CTLA4Ig (caminos 2 y 4) se sometieron a SDS-PAGE (gradiente de acrilamida del 4-12%) bajo condiciones no reductoras (-\betaME, caminos 1 y 2) o condiciones reductoras (+\betaME, caminos 3 y 4). Las proteínas se visualizaron tiñendo con Azul Brillante de Coomassie.

Bajo condiciones no reductoras, CTLA4Ig migra como una especie de 100.000 aproximadamente de M_{r}, y bajo condiciones reductoras, como una especie de 50.000 aproximadamente de M_{r}(figura 2). Debido a que los enlaces disulfuro de la bisagra C\gamma de Ig se eliminaron durante la construcción, CTLA4Ig, como CD28Ig, es un dímero presumiblemente unido a través de un enlace disulfuro nativo.

Ejemplo 3 Receptor CTLA4

Para reconstruir ADN que codifica la secuencia de aminoácidos correspondiente al gen de CTLA humano en su longitud total, el ADNc que codifica aminoácidos correspondientes a un fragmento de los dominios transmembrana y citoplásmico de CTLA4 se clonó mediante PCR y después se unió con ADNc que codifica aminoácidos correspondientes a un fragmento de CTLA4Ig correspondiente al péptido señal de la oncoestatina M condensado con el extremo N terminal de CTLA4. Los procedimientos para PCR, y los cultivos celulares y transfecciones fueron como se describen anteriormente en el ejemplo 1 usando células COS y transfección DEAE-dextrano.

Debido a que la expresión de la proteína receptora CTLA4 en células linfoides humanas no se ha comunicado previamente, fue necesario localizar una fuente de ARNm de CTLA4. Se usó para clonación mediante PCR, ADNc de PCR reverso transcrito a partir del ARN celular total de células H38, como se destacó anteriormente. Para este propósito, el oligonucleótido, GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTAGTG (SEQ ID Nº.: 11), (codificando los 11 primeros aminoácidos en la secuencia codificante predicha) se usó como un cebador directo, y TGATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAAATAAGGCTG (SEQ ID Nº.: 12) (homóloga a los 8 últimos aminoácidos en CTLA4 y conteniendo un sitio Xba I) como cebador inverso. La plantilla fue de nuevo un ADNc sintetizado a partir de 1 \mug de ARN de células H38. Los productos de la reacción PCR se escindieron con las endonucleasas de restricción Nco I y Xba I y el producto de 316 pares de bases resultante se purificó mediante gel. Un fragmento de 340 pares de bases Hind III/Nco I de la condensación de CTLAIg anteriormente descrita se purificó también mediante gel, y ambos fragmentos de restricción se ligaron en CMD8 escindido con Hind III/Xba I para formar OMCTLA.

La construcción resultante correspondió a CTLA4 de longitud total (SEQ ID N^{os}.: 13 y 14) y el péptido señal de oncoestatina M. La construcción se muestra en la figura 3 y se llama OMCTLA4. La secuencia para CTLA4 mostrada en la figura 3 se diferencia de la secuencia de ADN de CTLA4 humana predicha (Dariavach y col., supra) mediante un cambio de base tal que la alanina previamente comunicada en la posición aminoacídica 111 de la secuencia de aminoácidos mostrada, codifica una treonina. Esta treonina es parte de un sitio de glicosilación unido en N identificado recientemente que puede ser importante para expresión exitosa de la proteína de condensación.

Los productos de ligazón se transformaron en células de E. coli MC1061/p3 y las colonias se rastrearon para los plásmidos apropiados. Las secuencias de las construcciones resultantes se confirmaron mediante análisis de secuencia de ADN.

Ejemplo 4 Caracterización de CTLA4Ig

Para caracterizar las construcciones de CTLA4Ig, varios aislados, CD28Ig, B7Ig, y CD5Ig, se prepararon como se describe anteriormente en los ejemplos 2 y 3, y se probaron mediante análisis de FACS^{R} para unión de B7Ig. Además de las construcciones anteriormente mencionadas, se usaron también los plásmidos CDM8 que contienen ADNc que codifican CD7 como se describe por Aruffo y Seed, (EMBO Jour. 6: 3313-3316 (1987)), en el presente documento.

mAb. Los anticuerpos monoclonales murinos (mAb) 9.3 (anti-CD28) y G19-4 (anti-CD3), G3-7 (anti-CD7), BB-1 (antígeno anti-B7) y mAb 187.1 de rata (anti-cadena K de ratón) se han descrito previamente (Ledbetter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 1384-1388 (1987); Ledbetter y col., Blood 75: 1531 (1990); Yokochi y col., supra) y se purificó a partir de fluido de ascitis antes de usar. El hibridoma que produce mAb OKT8 se obtuvo a partir de ATCC, Rockville, MD, y el mAb se purificó también a partir de fluido de ascitis antes de usar. Se proporcionó mAb 4G9 (anti-CD19) por el Dr. E. Engleman, (Universidad de Stanford, Palo Alto, CA). El mAB L6 quimérico ratón-humano purificado (que tiene parte de C\gamma1 de Fc humano) fue un regalo del Dr. P. Fell y M. Gayle (Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA).

Análisis de Inmunotinción y FACS^{R}. Antes de teñir, las células COS o CHO se eliminaron de sus recipientes de cultivo mediante incubación en PBS que contenía EDTA 10 mM. Las células se incubaron primero con mAb o proteínas de condensación con Ig a 10 \mug/ml en DMEM que contiene FSB al 10% durante 1-2 horas a 4ºC. Las células se lavaron después, y se incubaron durante unas 0,5-2 horas adicionales a 4ºC con inmunoglobulina de cabra antirratón conjugada con FITC o con suero anti C\gamma1 de Ig humana de cabra conjugado con FITC (ambos de Tago, Burlingame, CA). Cuando se mide la unión de ambos, mAb y proteínas de condensación con Ig, en el mismo experimento, los reactivos de segunda etapa antirratón y antihumano conjugados con FITC se mezclaron juntos antes de usar. Se analizó después mediante FACS^{R} la fluorescencia en un total de 10.000 células.

Separación y Estimulación de Linfocitos en Sangre Periférica. Se aislaron linfocitos de sangre periférica (PBL) mediante centrifugación a través de Medio de Separación de Linfocitos (Litton Bionetics, Kensington, MD). Las células T alorreactivas se aislaron mediante estimulación de PBL en una reacción primaria de linfocitos mezclados (MLR). PBL se cultivaron a 10^{6}/ml irradiados ((50 Gy) 5000 rad) LCL T51. Las líneas celulares linfoblastoides transformadas con EVB (LCL), PM (Bristol-Myers Squibb Co.) y T51 (Bristol-Myers Squibb Co.) se mantuvieron en RPMI suplementado con FBS al 10%. Después de 6 días, las células "blásticas" alorreactivas se criopreservaron. El MLR secundario se condujo cultivando blastos alorreactivos descongelados conjuntamente con LCL T51 irradiadas frescas en presencia y ausencia de mAb y proteínas de condensación con Ig. Las células se cultivaron en placas de fondo plano de 96 pocillos (4 x 10^{4} blastos alorreactivos y 1 x 10^{4} células LCL T51 irradiadas/pocillo, en un volumen de 0,2 ml) en RPMI que contenía FBs al 10%. La proliferación celular de cultivos cuadruplicados se midió mediante captación de [^{3}H]-timidina durante las últimas 6 horas de un cultivo de 2-3 días.

Las células T activadas por PHA se prepararon cultivando PBL con 1 \mug/ml de PHA (Wellcome, Charlotte, NC) durante cinco días, y un día en medio que carece de PHA. Las células viables se recogieron mediante sedimentación a través de Medio de Separación de Linfocitos antes de usar. Las células se estimularon con mAb o células CHO transfectadas durante 4-6 horas a 37ºC, se recogieron mediante centrifugación y se usaron para preparar
ARN.

Las células T CD4^{+} se aislaron a partir de PBL separando PBL de donantes sanos entre células T y células no T usando técnica de formación de escarapelas de eritrocitos de oveja y separando células T adicionalmente mediante cribado en células CD4^{+} como se describe por Damle y col., J. Immunol. 139: 1501 (1987). Las células B se purificaron también a partir de sangre periférica mediante cribado como se describe por Wysocki y Sato, Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 2844 (1978), usando mAb anti-CD19 4G9. Para medir producción de Ig inducida por T_{h}, 10^{4} células T CD4^{+} se mezclaron con 10^{6} células B CD19^{+} en 1 ml de RPMI que contiene FBS al 10%. Tras cultivar durante 6 días a 37ºC, la producción de IgM humana se midió en los sobrenadantes del cultivo usando ELISA en fase sólida como se describe por Volkman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2528 (1981). Brevemente, placas de ELISA de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos (Corning, Corning, NY) se revistieron con 200 \mul/pocillo de tampón de carbonato de sodio (pH 9,6) que contenía 10 \mug/ml de anticuerpo anti IgG humana o anti IgM humana de cabra purificado por afinidad (Tago, Burlingame, CA), incubado durante toda una noche a 4ºC, y después lavado con PBS y se bloquearon adicionalmente los pocillos con BSA al 2% en PBS (BSA-PBS). Las muestras a ensayarse se añadieron a una dilución apropiada a estos pocillos y se incubaron con 200 \mul/pocillo de fracción F(ab')_{2}de anticuerpo anti IgG o IgM humanas de cabra purificado por afinidad (Tago) conjugada con dilución 1:1000 de peroxidasa de rábano picante (HRP). Las placas, y 100 \mul/pocillo de disolución (0,6 mg/ml en tampón citrato-fosfato con pH 5,5 y peróxido de hidrógeno al 0,045%) de o-fenilenodiamina (Sigma Chemical Co., San Luís, MO), se lavaron después. La formación de color se detuvo con ácido sulfúrico 2 N. La absorbancia a 490 nm se midió con un lector de placa de ELISA automatizado. Las muestras prueba y control se corrieron por triplicado y los valores de absorbancia se compararon con aquellos obtenidos con estándares de IgG o IgM corridos simultáneamente con las muestras de sobrenadante para generar la cuerva estándar usando la cual se cuantificaron las concentraciones de Ig en el sobrenadante de cultivo. Los datos se expresaron como ng/ml de Ig \pm SEM de cultivos tanto por triplicado como por cuadruplicado.

Análisis de Inmunoprecipitación y SDS PAGE. Las células se etiquetaron en superficie con ^{125}I y se sometieron a análisis de inmunoprecipitación. Brevemente, las células T PHA-activadas se etiquetaron en superficie con ^{125}I usando lactoperoxidasa y H_{2}O_{2} como se describe por Vitetta y col., J. Exp. Med. 134: 242 (1971). La cromatografía SDS-PAGE se llevó a cabo en geles de gradientes de acrilamida lineales con geles apilados de acrilamida al 5%. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie, se destiñeron, y fotografiaron o secaron y expusieron a película de rayos X (Kodak XAR-5).

Ensayos de Unión. B7Ig se etiquetó con ^{125}I a una actividad específica de aproximadamente 2 x 10^{6} cpm/pmol. Placas de plástico de 96 pocillos se revistieron con una disolución que contiene CTLA4Ig (0,5 \mug en un volumen de 0,05 ml de Tris 10 mM, pH 8). Los pocillos se bloquearon con tampón de unión (DMEM que contiene 50 mM BES (Sigma Chemical Co.), pH 6,8, BAS 0,1%, y FCS 10%) antes de la adición de una disolución (0,09 ml) que contiene ^{125}I B7Ig (aproximadamente 5 x 10^{5} cpm) en presencia o ausencia de competidor. Tras la incubación durante 2-3 horas a 23ºC, los pocillos se lavaron una vez con tampón de unión, y cuatro veces con PBS. La radiactividad unida se solubilizó después mediante adición de NaOH 0,5 N, y se cuantificó con recuento gamma.

Unión a B7Ig. La actividad funcional de la construcción OMCTLA4 que codifica el gen de ADN CTLA4 humano completo, se muestra en el experimento mostrado en la figura 4. Las células COS se transfectaron con plásmidos de expresión CD7, OMCD28 y OMCTLA4 como se describe anteriormente. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se recogieron e incubaron sólo con medio (sin ninguna adición) o con mAb 9.3, B7Ig, CD5Ig o G3-7. Las células se lavaron después y se detectó unión mediante una mezcla de los reactivos de segunda etapa de cabra anti-Ig de ratón y anti-Ig de humano conjugados con FITC. Las células transfectadas se probaron en su expresión de los marcadores de superficie celular apropiados mediante inmunotinción indirecta y la fluorescencia se midió usando análisis de FACS^{R} como se describe anteriormente.

Como se muestra en la figura 4, mAb 9.3 se unió a células COS transfectadas con CD28, pero no a células transfectadas con CTLA 4. En contraste, la proteína de condensación B7Ig (pero no la proteína de condensación CD5Ig control) se unió tanto a células transfectadas con CD28 como a células transfectadas con CTLA4. Las células COS transfectadas con CD7 no se unieron ni a mAb 9.3 ni a cualquiera de las proteínas de condensación. Esto indica que tanto CD28 como CTLA4 se unen al antígeno de activación de células B, B7. Además, mAb 9.3 no se unió detectablemente a CTLA4.

Unión de CTLA4Ig en Células CHO B7 Positivas. Para caracterizar adicionalmente la unión de CTLA4Ig y B7, la actividad de unión de CTLA4Ig purificada en células CHO B7^{+} y en una línea celular linfoblastoide (PM LCL) se midió en el experimento mostrado en la figura 5. Las líneas celulares CHO amplificadas transfectadas y PM LCL se incubaron sólo con medio (sin adición) o con una concentración equivalente de proteínas que contienen C\gamma de Ig humana (10 \mug/ml) de CD5Ig, CD28Ig o CTLA4Ig. La unión se detectó mediante FACS^{R} tras la adición de reactivos de segunda etapa anti-Ig humana de cabra conjugada con FITC. Una total de 10.000 células teñidas se analizaron mediante FACS^{R}.

Como se muestra en la figura 5, la CD28Ig se unió a células CHO B7^{+} pero no a PM LCL, una línea celular que expresa niveles relativamente bajos del antígeno B7 (Linsley y col., supra, 1990). CTLA4Ig se unió más fuertemente a ambas líneas celulares de lo que lo hizo CD28Ig, sugiriendo que se unió con mayor afinidad. Ni CD28Ig no CTLA4Ig se unieron a células CHO CD28^{+}.

Afinidad de Unión de CTLA4Ig y B7Ig. La afinidad de interacción aparente entre CTLA4Ig y B7Ig se midió después usando un ensayo de unión competitivo de fase sólida. Se revistieron placas de plástico de noventa y seis pocillos con CTLA4Ig como se describe anteriormente. Se marcó radiactivamente B7Ig con ^{125}I (5 x 10^{5} cpm, 2 x 10^{6} cpm/pmol), y se añadió a una concentración de 4 nM en la presencia de las concentraciones indicadas (véase figura 6) de mAb L6, mAb 9.3, mAb BB-1 o B7Ig quiméricos no etiquetados. La radiactividad unida a placa se determinó y expresó como un porcentaje de radiactividad unida a pocillos tratados sin competidor (28.300 cpm). Cada punto representa la media de determinaciones por duplicado; las repeticiones variaron generalmente de la media en un \leq 20%. Las concentraciones se calcularon en base a una M_{r} de 75.000 por sitio de unión para mAb y 51.000 por sitio de unión para B7Ig.

Como se muestra en la figura 6, sólo mAb BB-1 y B7Ig no marcado compiten significativamente por unión a ^{125}I-B7Ig (la mitad de los efectos máximos a aproximadamente 22 nM y a aproximadamente 175 nM, respectivamente). Ni mAb L6 quimérico, ni mAb 9.3 compitieron de forma efectiva a las concentraciones probadas. En otros experimentos, las concentraciones de mAb 9.3 usadas fueron suficientes para inhibir la unión de ^{125}I-B7Ig a CD28Ig inmovilizado o CD28 expresado en superficie celular en \geq 90%.

Cuando los datos de competición de la figura 6 se trazaron en una representación de Scatchard, se calculó una constante de disociación, K_{d}, de aproximadamente 12 nM para unión de ^{125}I-B7 a CTLA4Ig inmobilizada (figura 7). Este valor es aproximadamente 20 veces menor que la K_{d} previamente determinada de unión entre ^{125}I-B7Ig y CD28 (aproximadamente 200 nM) (Linsley y col., (1991), supra) indicando que CTLA4 es un receptor de afinidad más alta para el antígeno B7 que el receptor CD28.

Para identificar la(s) molécula/s) en las células linfoblastoides la(s) cual(es) se une(n) a CTLA4Ig (figura 7), las células etiquetadas con ^{125}I en su superficie se sometieron a análisis de inmunoprecipitación (figura 8). Las células CHO B7^{+} y PM LCL se marcaron en superficie con ^{125}I, y se extrajeron con una disolución detergente no iónica como se describe anteriormente. Alícuotas de extracto que contienen aproximadamente 1,5 x 10^{7} cpm en un volumen de 0,1 ml se sometieron a análisis de inmunoprecipitación como se describe anteriormente sin ninguna adición de CD28Ig, CTLA4Ig o CD5Ig, o con adición de 2 \mug cada de una. Los inmunoprecipitados lavados se analizaron después mediante SDS-PAGE (gradiente de acrilamida 10-20%) bajo condiciones reductoras. El gel se secó después y se sometió a autorradiografía. El panel izquierdo de la figura 8 muestra un autorradiograma obtenido después de 1 día de exposición. El panel derecho de la figura 8 muestra un autorradiograma del mismo gel después de 10 días de exposición. El autorradiograma en el panel central de la figura 8 se expuso también durante 10 días. Las posiciones de peso molecular estándar se indican también en esta figura.

Como se muestra en la figura 8, una proteína etiquetada radiactivamente que migra de forma difusa (M_{r} aproximadamente 50.000-75.000; centrada a aproximadamente 60.000) se inmunoprecipitó mediante CTLA4Ig, pero no mediante CD28Ig o CD51g. Esta molécula comigró con B7 inmunoprecipitada a partir de células CHO B7^{+} mediante CTLA4Ig; y mucho más débilmente, mediante CD28Ig. Estos hallazgos indican que CTLA4Ig une una proteína individual en células linfoblastoides la cual es similar en tamaño al antígeno B7.

Inhibición de Respuestas Inmunes In Vitro mediante CTLA4Ig

Inhibición de Proliferación. Estudios previos han mostrado que el mAb anti-CD28, mAb 9.3, y el mAb anti-B7, mAb BB-1, inhibe proliferación de células T_{h} aloantigénicas específicas, como también secreción de inmunoglobulina mediante células B presentadoras de aloantígeno (Damle y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 5096 (1981); Lesslauer y col., Eur. J. Inmunol. 16: 1289 (1986)). Debido a que CTLA4 es un receptor de alta afinidad para el antígeno B7 como se demuestra en el presente documento, CTLA4Ig soluble se probó en su capacidad para inhibir estas respuestas. Los efectos de CTLA4Ig en proliferación de células T se examinaron en el experimento mostrado en la figura 9.

Los blastos de reacción primaria de linfocitos mezclados (MRL) se estimularon con células linfoblastoides (LC) T51 irradiadas en la ausencia o presencia de concentraciones de fragmentos Fab de mAb 9.3 murino, o proteínas de condensación de C\gamma de inmunoglobulina B7Ig, CD28Ig o CTLA4Ig.

La proliferación celular se midió con incorporación de [^{3}H]-timidina después de 4 días y se expresa como el porcentaje de incorporación por cultivos no tratados (21.000 cpm). La figura 9 muestra las medias de determinaciones por cuadruplicado (SEM \leq 10%).

Como se muestra en la figura 9, CTLA4Ig inhibió la reacción MLR en una manera dosodependiente mediante un máximo de > 90% con una respuesta de 1/2 de la máxima a aproximadamente 30 ng/ml (aproximadamente 0,8 nM). El fragmento Fab de mAb 9.3, el cual previamente estuvo mostrando ser un inhibidor de MLR más potente que mAb 9.3 completo (Damle y col., J. Immunol. 140: 1753-1761 (1988)), inhibió también el MRL, pero a concentraciones mayores (aproximadamente 800 ng/ml o aproximadamente 30 nM para una respuesta de 1/2 de la máxima). B7Ig y CD28Ig no inhiben significativamente el MRL incluso a concentraciones mayores. En otro experimento, la adición de B7Ig conjuntamente con CTLA4Ig superó parcialmente la inhibición de MLR mediante CTLA4Ig, indicando que la inhibición se debió específicamente a interacciones con antígeno B7.

Inhibición de Secreción de Inmunoglobulinas. También se examinaron los efectos de CTLA4Ig sobre la secreción de inmunoglobulina inducida por células T ayudantes (T_{h}) (figura 10). Las células T CD4^{+} se mezclaron con células B CD19^{+} alogénicas en presencia o ausencia de las moléculas de inmunoglobulina indicadas como se describieron anteriormente. Se añadieron mAb OKT8, 9.3 y BB-1 murinos a 20 \mug/ml, y proteínas de condensación con Ig a 10 \mug/ml. Después de 6 días de cultivo, las concentraciones de IgM humana (SEM < 5%) en sobrenadantes de cultivo se determinaron mediante inmunoensayo enzimático (ELISA) como se describe anteriormente. La producción de IgM por células B cultivadas en la ausencia de células T CD4^{+} fue 11 ng/ml.

Como se muestra en la figura 10, las células T CD4^{+} estimularon la producción de IgM por células B CD19^{+} alogénicas (en la ausencia de células T CD4^{+}, los niveles de IgM se redujeron en un 93%). mAb 9.3 y BB-1 inhibieron significativamente la producción de IgM inducida por T_{h} (inhibición del 63% y del 65%, respectivamente). CTLA4Ig fue incluso más efectivo como inhibidor (inhibición del 89%) de lo que lo fueron estos mAb. La inhibición mediante moléculas Ig de control, mAb OKT8 y CD5Ig, fue mucho menor (= 30% de inhibición). Ninguna de estas moléculas inhibió significativamente la producción de Ig en presencia de la enterotoxina B de Staphylococcus aureus. Se obtuvieron resultados similares con células T CD4^{+} y células B derivadas de otros donantes. Estos resultados indican que la inhibición de CTLA4Ig es específica.

Los datos anteriores demuestran también que los receptores CTLA4 y CD28 están relacionados funcionalmente como también estructuralmente. Como CD28, CTLA4 es también un receptor para el antígeno de activación de células B, B7. CTLA4Ig une ^{125}I-B7 con una constante de afinidad, K_{d}, de aproximadamente 12 nM, un valor algo superior a 20 veces la afinidad entre CD28 y B7Ig (aproximadamente 200 nM). Así, se puede pensar en CTLA4 y CD28 como receptores de alta y baja afinidad, respectivamente, para el mismo ligando, el antígeno B7.

La afinidad aparente entre CD28 y B7 es similar a la afinidad comunicada para unión de aloantígeno soluble al receptor de célula T de un hibridoma de células T murinas (aproximadamente 100 nM; Schnek y col., Cell 56: 47 (1989)), y es mayor que la de interacciones entre CD2 y LFA3 (Recny y col., J. Biol. Chem. 265: 8542 (1990)), o la de moléculas CD4 y moléculas de MHC de clase II (Clayton y col., Nature 339: 548 (1989)). La constante de afinidad aparente, K_{d}, entre CTLA4 y B7 es incluso mayor, y se compara favorablemente con mAb de mayor afinidad (K_{d} 2-10.000 nM; Alzari y col., Ann. Rev. Immuno. 6: 555 (1988)). La K_{d} entre CTLA4 y B7 es similar a o mayor que valores K_{d} de receptores de integrina y sus ligandos (10-2000 nM; Hautanen y col., J. Biol. Chem. 264: 1437-1442 (1989); Di Minno y col., Blood 61: 140-148 (1983); Thiagarajan y Kelley, J. Biol. Chem. 263: 035-3038 (1988)). La afinidad de interacción entre CTLA4 y B7 está así entre las mayores así comunicadas para sistemas de adhesión linfoi-
de.

Estos resultados demuestran la primera expresión de un producto proteico funcional de las trasncripciones de CTLA4. CTLA4Ig, una construcción de condensación que contiene el dominio extracelular de CTLA4 condensado con un dominio C\gamma1 de Ig, forma un dímero unido por enlace disulfuro de subunidades de aproximadamente 50.000 de Mr (figura 1). Debido a que no se debería predecir que se forme ningún enlace disulfuro intercatenario en la parte Ig de esta condensación, parece probable que las cisteínas de CTLA4 estén implicadas en la formación de enlace disulfuro. La proteína de condensación CD28Ig análoga (Linsley y col., supra, 1991) contienen también enlace(s) disulfuro intercatenario(s). Estos resultados sugieren que el receptor CTLA4, como CD28 (Hansen y col., Immunogenetics 10: 247-260 (1980)), existe en la superficie de la célula T como un homodímero unido por enlace disulfuro. Aunque CD28 y CTLA4 son proteínas altamente homólogas, son inmunológicamente distintas, debido a que el mAb anti-CD28, mAb 9.3, no reconoce CTLA4 (figuras 4 y 5).

No se sabe si CTLA4 puede activar células T mediante una ruta de señalización análoga a CD28. Los dominios citoplásmicos de CTLA4 murino y humano son idénticos (Dariavach y col., supra 1988), sugiriendo que esta región tiene importantes propiedades funcionales. Los dominios citoplásmicos de CD28 y CTLA4 también comparten homología, aunque no está claro si esta es suficiente para impartir propiedades de señalización similares a las dos moléculas.

CTLA4Ig es un potente inhibidor de funciones linfocíticas in vitro que requiere colaboración de células T y células B (figuras 9 y 10). Estos hallazgos, conjuntamente con estudios previos, indican la importancia funcional de interacciones entre antígeno B7 y sus contrarreceptores, CD28 y/o CTLA4, en regular tanto respuestas de linfocitos T como de linfocitos B. CTLA4Ig debería ser un reactivo útil para investigaciones futuras sobre el papel de estas interacciones durante las respuestas inmunes. CTLA4Ig es un inhibidor más potente de respuestas de linfocitos in vitro que bien mAb BB-1 o bien mAb 9.3 (figuras 9 y 10). La mayor potencia de CTLA4Ig sobre mAb BB-1 se debe más probablemente a la diferencia en afinidades para B7 entre estas moléculas (figura 6).

CTLA4Ig es también más potente que mAb 9.3, probablemente debido a que, a diferencia del mAb, no tiene también efectos estimulatorios directos sobre la proliferación de células T (June y col., Immunology Today 11: 211 (1989)) para contrarrestar sus efectos inhibidores. Los efectos inmunosupresores de CTLA4Ig in vitro sugieren que están justificadas futuras investigaciones sobre posibles efectos terapéuticos de esta molécula para tratamiento de trastornos autoinmunes que impliquen activación de células T o producción de Ig aberrantes.

El alcance de la presente invención es como se expone en las reivindicaciones adjuntas más bien que limitándose a los ejemplos contenidos en la descripción precedente.

Ejemplo 5

Se obtuvieron ratones BALB/c (H-2^{d}) y C57BL/6 (H-2^{d}) hembra, de 6 a 8 semanas de edad de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

Células de isletas pancreáticas humanas se purificaron después de digestión con colagenasa como se describe (C. Ricordi y col., Transplantation 52: 519 (1991); A.G. Tzakis y col. Lancet 336; 402 (1990); C. Ricordi, P.E. Lacy, E.H. Finke, B.J. Olack, D.W. Scharp, Diabetes 37: 413 (1988)).

Se usaron como receptores ratones B6 o B10, tratados con estreptozocina (175 mg por kilogramos de peso corporal) de 3 a 5 días antes del transplante y presentando niveles de glucosa en plasma no de ayuno de más de 280 mg/dl (con la mayoría por encima de 300 mg/ml).

Cada animal recibió aproximadamente 800 isletas humanas sin usar de 150 \mum de diámetro debajo de la cápsula renal izquierda (D. Faustman y C. Coe, Science 252: 1700 (1991); Y.J. Zeng y col., Transplantation 53: 277 (1992)). El tratamiento se empezó inmediatamente después del transplante.

Los animales de control se trataron con PBS (líneas sólidas) o L6 (líneas punteadas) a 50 \mug un día sí y otro no durante 14 días inmediatamente después del transplante (figura 11A). Los transplantes de isleta se consideran rechazados cuando los niveles de glucosa fueron mayores de 250 mg/dl durante tres días consecutivos. Los animales tratados con PBS (n = 14) y L6 (n = 8) tienen supervivencias al injerto medias de 5,6 y 6,4 días, respectivamente.

Los animales se trataron con 10 \mug de CTLA4Ig durante 14 días consecutivos inmediatamente después del transplante (n = 7) (figura 11B). Tres de cada siete animales mantuvieron sus transplantes durante >80 días. Los cuatro animales restantes tienen supervivencias al injerto medias de 12,75 días.

Los animales se trataron con 50 \mug de CTLA4Ig un día sí y otro no durante 14 días inmediatamente después del transplante de isletas humanas (figura 11C). Todos los animales (n = 12) tratados con esta dosis mantuvieron injertos durante todo el análisis (figura 11C). Los ratones seleccionados se nefrectomizaron en los días 21 y 29 después del transplante para valorar la función del injerto (figura 11C).

La histología se llevó a cabo en riñones transplantados con células de isletas humanas (figuras 12A, 12B, 12C, 12D). Los portaobjetos se analizaron a ciegas.

La tinción con hematotoxilina y eosina de un ratón injertado con isleta humana control 29 días después del transplante mostró una infiltración de linfocitos masiva (figura 12A). El mismo tejido, teñido por insulina, mostró producción de insulina no detectable (figura 12B).

El examen histológico de tejido a partir de un ratón tratado con CTLA4Ig 21 días después del transplante mostró isletas intactas bajo la cápsula renal con muy pocos linfocitos infiltrándose en el tejido transplantado (figura 12C). El tejido se tiñó con hematoxilina y eosina. El mismo tejido del ratón tratado con CTLA4Ig, teñido por insulina, mostró la producción de insulina mediante las isletas injertadas (figura 12D). Se observaron resultados similares en tejido injertado examinado en puntos temporales posteriores. Las puntas de flecha superiores, medias e inferiores identifican la cápsula del riñón, el transplante de isleta, y el parénquima del riñón, respectivamente.

En el ensayo de histopatología se fijaron todos los tejidos en formalina tamponada al 10% y se procesaron, y se tiñeron secciones de 5 \mum bien con hematoxilina y eosina o bien por insulina con el procedimiento de avidina-biotina-peroxidasa (S.M. Hsu, L. Raine, H. Fanger, J. Histochem, Cytochem, 29: 577 (1981). El aumento fue x 122.

En la figura 13 los animales tratados con estreptozotocina se transplantaron como se describe anteriormente para la figura 11. Los ratones se trataron bien con PBS (líneas punteadas) o con mAb para B7 humano (líneas sólidas) a una dosis de 50 \mug un día sí y otro no durante 14 días (figura 13). Los animales control (tratados con PBS) (n = 3) tienen una media de supervivencia de injerto de 3,5 días, mientras que los animales tratados con anti-B7 (n = 5) mantuvieron los injertos de 9 a >50 días (figura 13).

En la figura 14 los ratones glucémicos, tratados con CTLA4Ig, transplantados (líneas punteadas) se nefroctomizaron en el día 44 después del transplante e inmediatamente se retransplantaron bien con 1000 isletas de donantes del primer grupo (líneas punteadas, círculos sólidos) o bien con 1000 isletas de donantes del segundo grupo (líneas punteadas, círculos abiertos) debajo de la cápsula renal restante.

Estas isletas, congeladas al tiempo del primer transplante, se descongelaron y cultivaron durante 3 días antes del transplante para asegurar la función de la isleta. Los ratones B10 que se trataron con estreptozocina y presentaron niveles de glucosa no de ayuno de más de 280 mg/dl se usaron como controles (líneas sólidas) (figura 14). No se dio ningún tratamiento después del transplante.

Los animales control rechazaron tanto los injertos de isletas del primer grupo (líneas sólidas, círculos cerrados) como los del segundo grupo (líneas sólidas, círculos abiertos) en el día 4 después del transplante (figura 14). Los ratones tratados con CTLA4Ig retransplantados con el segundo grupo de isletas tienen una supervivencia de injerto media de 4,5 días, mientras que los animales retransplantados con el primer grupo de isletas del donante mantuvieron transplantes durante tanto tiempo como se analizaron (>80 días) (figura 14).

CTLA4Ig prolonga significativamente la supervivencia del injerto de isletas en ratones en una manera específica de donante proporcionando de este modo una aproximación a inmunosupresión

Los ratones C57BL/6 (B6) o C57BL/10 (B10) se trataron con estreptozocina para eliminar la función celular de la isleta B pancreática de ratón. Los animales diabéticos se injertaron bajo la cápsula renal, y el tratamiento se empezó inmediatamente después de la cirugía. La supervivencia de los injertos de isleta se controló mediante el análisis de concentraciones de glucosa en sangre.

Los animales control transplantados, tratados bien con disolución salina tamponada con fosfato (PBS) (n = 14) o bien con L6 (un mAB quimérico de IgG1 humano; n = 8), tienen una supervivencia de injerto media de 5,6 y 6,4 días, respectivamente (figura 11A).

En contraste, el rechazo de isleta se retrasó en animales tratados con CTLA4Ig (10 \mug por día durante 14 días), con cuatro de cada siete animales presentando supervivencia de injerto media moderadamente prolongada (12,75 días), mientras que los tres animales restantes mantuvieron niveles normales de glucosa durante >80 días (figura 11B). Este incremento eventual en concentración de glucosa puede ser un resultado de agotamiento de la isleta debido a que no se observó ninguna evidencia de rechazo celular activo.

En los tres ratones que mantenían injertos de isletas a largo plazo, el incremento transitorio en concentraciones de glucosa alrededor del día 21 después del transplante puede haber representado un episodio de rechazo autolimitado consistente con las farmacocinéticas de compensación de CTLA4Ig después de la terapia (P.S. Linsley y col., Science 257: 792 (1992)).

En los experimentos subsiguientes, la dosis de CTLA4Ig se incrementó a 50 \mug por animal uno de cada dos días durante 14 días. Este tratamiento resultó en que el 100% de los animales mantiene la función de la isleta normal a través del experimento sin ningún signo de una crisis de rechazo (figura 11C).

Con el fin de confirmar que la producción de insulina se originó a partir de las isletas transplantadas y no a partir del páncreas nativo de ratón, los inventores nefrectomizaron animales seleccionados en los días 21 y 29 para eliminar los injertos de isletas (figura 11C). En estos animales, las concentraciones de glucosa se incrementaron a más de 350 mg/dl en 24 horas, lo cual indicó que el xenoinjerto de isleta fue responsable de mantener niveles de glucosa normales. Parece que el bloqueo de la interacción CD28-B7 inhibe rechazo de injerto de isleta xenogénica.

Los efectos de tratamiento con el receptor soluble, a saber, proteína de condensación CTLAIg, no fueron un resultado de unión a Fc (L6 no llevó a cabo rechazo de injerto) o efectos generales sobre función de células T o células B in vivo.

Se hicieron análisis históricos de xenotransplante de isletas a partir de ratones control (tratados con PBS) y ratones tratados con CTLA4Ig (figuras 12A, 12B, 12C, 12D). El tejido de la isleta del animal control manifestó evidencia de rechazo inmune, con un infiltrado linfocítico marcado en el injerto y pocas isletas restantes (figura 12A).

La tinción inmunohistoquímica mostró que las células positivas para insulina estuvieron presentes sólo raramente, y no estuvo presente ninguna célula positiva para somatostatina en absoluto (figura 12B). En contraste, el tejido transplantado de los ratones tratados con CTLAIg estuvo desprovisto de cualquier infiltrado linfocítico (figura 12).

Los injertos estuvieron intactos, con muchas isletas visibles. Además, las células B observadas en el tejido de la isleta humana produjeron insulina humana (figura 12D) y somatostatina humana.

El CTLA4Ig humano usado en este estudio reaccionó tanto con B7 humano como murino. Una ventaja del modelo de transplante xenogénico es la disponibilidad de un mAB contra B7 humano que no reacciona con B7 de ratón (T. Yokochi, R.D. Holly, E.A. Clark, J. Immunol. 128: 823 (1982)). Así, el papel de las células presentadoras de antígeno (APC) que llevan B7 humanas se puede examinar directamente.

Los ratones se transplantaron como se describe y se trataron con 50 \mug de mAb contra B7 humano un día sí y otro no durante 40 días después del transplante. Este tratamiento prolongó la supervivencia del injerto en ratones tratados (9 a >50 días) en comparación con aquel para los ratones control (figura 13). El mAb anti-B7 es incapaz de bloquear el rechazo de forma tan efectiva como CTLA4Ig.

La terapia de CTLA4Ig dio como resultado aceptación de injerto en la mayoría de los ratones. Sin embargo, los animales no pueden ser tolerantes. La inmunosupresión transitoria puede conducir a aceptación del injerto de isletas permanente debido a la adaptación al injerto (la pérdida de inmunogenicidad como resultado de la pérdida de función APC) (L. Hao, Y. Wang, R.G. Gill, K.J. Lafferty, J. Immunol. 139: 4022 (1987); K.J. Lafferty, S.J. Prowse, M. Simeonovic, Annu. Rev. Immunol. 1: 143 (1983)).

Con el fin de diferenciar entre estas posibilidades, los inventores nefrectomizaron ratones xenotransplantados seleccionados, tratados con CTLA4Ig (día 40), y los retransplantaron bajo la cápsula renal restante bien con las isletas del donante original (grupo primero) o bien con las isletas humanas del segundo grupo (figura 14).

Los animales control tratados con estreptozocina, que nunca han recibido un transplante de isleta, se transplantaron también bien con las isletas del primer grupo o bien con las del segundo grupo. No se dio tratamiento después del transplante. Los animales control rechazaron las isletas del primer y el segundo grupos en el día 4. Los animales tratados con CTLA4Ig que habían recibido las isletas del segundo grupo rechazaron esas isletas en el día 5, mientras que
los animales que recibieron isletas de donante del primer grupo mantuvieron los injertos durante >80 días (figura 14).

Estos resultados sugieren que el tratamiento con CTLA4Ig dio como resultado la no capacidad de respuesta específica de donante a isletas xenogénicas. La capacidad de la respuesta inmune murina para distinguir diferencias entre los donantes humanos de isletas apoya también el reconocimiento directo de los productos polimórficos de MHC expresados en las células de isletas humanas.

Ejemplo 6

Se obtuvieron ratones BALB/c (H-2^{d}) y C57BL/6 (H-2^{d}) hembra, de 6 a 8 semanas de edad a partir de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

El anticuerpo monoclonal 11B11 es una IgG1 de rata anti IL4 murina (Ohara, J., y W.E. Paul, 1985, Production of a monoclonal antibody to and molecular characterization of B-cell stimulatory factor-1. Nature 315: 333) (Verax (Lebanon, NH)).

Se inmunizaron ratones BALB/c (cinco por grupo) intravenosamente solo con 10^{8} SRBC o conjuntamente con 200 \mug de mAb L6 quimérico o proteína de condensación humana CTLA4Ig. Los grupos indicados se trataron 2 horas antes de inyección de SRBC mediante inyección intraperitoneal de 2 ml de bien cada inmunoglobulina de rata o bien mAb 11B11 anti-IL4 murino de rata a 5 mg/ml. El tratamiento con mAb L6 quimérico o con CTLA4Ig se repitió diariamente durante 4 días adicionales.

A todos los animales se les dieron inyecciones intravenosas de SRBC (figura 15) o KLH (figura 16) en el día 46. Específicamente, en la figura 15, la caja cerrada representa ratones a quienes se administró sólo con SBRC en el día 0 y en el día 46. La caja abierta representa ratones administrados sólo con SRBC en el día 46. Los restantes ratones representados en la figura 15 se administraron adicionalmente con SRBC en el día 46. En contraste, en la figura 16, los ratones se administraron con un inmunógeno diferente, KLH, sólo en el día 46.

Las concentraciones de suero de ratones medidas de los anticuerpos que tienen dirigidos contra SRBC o KLH se determinaron mediante ELISA como se describe (Linsley y col., Science 1992).

Las valoraciones de anticuerpos en suero se calcularon como la dilución que da una A_{45}de cinco veces la del principio. Se determinaron los valores de valoración de anticuerpos en el suero a partir de la figura 15 a partir de sueros almacenados de 5 ratones por grupo, mientras los valores de valoración de anticuerpos en suero de la figura 16 representan valoraciones medias de cinco sueros individuales. Las flechas indican una inyección de SBRC o KLH en el día 46.

Las figuras 15 y 16 muestran que la respuesta inmunológica en ratones infectados concurrentemente tanto con CTLA4Ig como con anti-IL4 (triángulo abierto) se suprime en una forma antígeno-específica.

La figura 15 muestra que no hay ninguna subida en valoración de anticuerpos en suero (es decir no hay ninguna respuesta inmunológica primaria o secundaria) en ratones inyectados concurrentemente con CTLA4Ig y anti-IL4 e inyectados con SBRC en el día 0 y el día 46. La combinación CTLA4Ig y anti-IL-4 suprime una respuesta inmune primaria y secundaria e induce la no capacidad de respuesta inmunológica duradera a SBRC.

Adicionalmente, la figura 15 muestra que no hay respuesta inmunológica primaria en ratones inyectados concurrentemente con CTLA4Ig y la Ig de rata control (Cappel, Organotecknika, Palo Alto, CA). Sin embargo, estos ratones muestran una respuesta inmunológica secundaria después de inyección con SRBC en el día 46) triángulo cerrado, figura 15).

La figura 16 muestra que la administración de CTLA4Ig y anti-IL4, seguida por un inmunógeno diferente, KLH, en el día 46 en ratones no suprime una respuesta inmune primaria a KLH en ratones.

En cambio, estos ratones presentaron una respuesta inmune primaria a KLH (triángulo abierto, figura 16). Así, los ratones tratados con CTLA4Ig y anti-IL4 presentaron una respuesta inmune altamente específica dependiendo del antígeno administrado en ellos.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Park Avenue, 345

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Nueva York

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Nueva York

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 10154

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTOS PARA REGULAR LA RESPUESTA INMUNE USANDO MOLÉCULAS DE UNIÓN A CTLA4 Y MOLÉCULAS DE UNIÓN A IL4

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 14

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: Patente en publicación #1.0, Versión #1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 94 100 882.3

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE ARCHIVO: 21 de enero de 1994

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGCCACTG AAGCTTCACC ATGGGTGTAC TGCTCACAC

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGCATGGGC TCCTGATCAG GCTTAGAAGG TCCGGGGAAA

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGGCTCC TGATCAGGAA AATGCTCTTG CTTGGTTGT

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 84 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGCAAGAGC ATTTTCCTGA TCAGGAGCCC AAATCTTCTG ACAAAACTCA CACATCCCCA

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGTCCCCAG CACCTGAACT CCTG

\hfill

84

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTCGACCAG TCTAGAAGCA TCCTCGTGCG ACCGCGAGAG C

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTGCACAG TCAAGCTTCC ATGCCCATGG GTTCTCTGGC CACCTTG

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCCACAGTG CAGTGATCAT TTGGATCCTG GCATGTGAC

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 65 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCAGTCTGG TCCTTGCACT CCTGTTTCCA AGCATGGCGA GCATGGCAAT GCACGTGGCC

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGCC

\hfill

65

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGGCTCC TGATCAGAAT CTGGGCACGG TTG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGCCACTG AAGCTTCACC AATGGGTGTA CTGCTCACAC AGAGGACGCT GCTCAGTCTG

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCTTGCAC TC

\hfill

72

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAATGCACG TGGCCCAGCC TGCTGTGGTA GTG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGATGTAACA TGTCTAGATC AATTGATGGG AATAAAATAA GGCTG

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 561 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..561

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº.: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 187 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

Claims (14)

1. Una composición que comprende una molécula de unión a B7 y una molécula de unión a IL4 para usar en regular una respuesta inmune bloqueando una interacción de B7 con linfocitos.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que la molécula de unión a B7 es una proteína de condensación CTLA4Ig.

3. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la proteína de condensación CTLA4Ig es una proteína de condensación que tiene una primera secuencia de aminoácidos que contiene residuos de aminoácidos de aproximadamente la posición 1 a aproximadamente la posición 125 de la secuencia de aminoácidos correspondiente al dominio extracelular CTLA4 y una segunda secuencia de aminoácidos que contiene residuos correspondientes a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de la C\gamma1 de inmunoglobulina humana.

4. La composición de la reivindicación 1, en la que la molécula de unión es el híbrido de proteínas de condensación CD28Ig/CTLA4Ig.

5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 4, en la que el híbrido de proteínas de condensación CD28Ig/CTLA4Ig es un híbrido de proteínas de condensación que tiene una primera secuencia de aminoácidos correspondiente a una parte del dominio extracelular de CD28 condensada a una segunda secuencia de aminoácidos correspondiente a una parte del dominio extracelular del receptor CTLA4 y una tercera secuencia de aminoácidos que contiene residuos correspondientes a la bisagra, regiones CH2 y CH3 de la C\gamma1 de inmunoglobulina humana.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la molécula de unión a IL-4 es un anticuerpo monoclonal el cual reconoce y se une específicamente a IL-4.

7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la que la molécula de unión a IL-4 es un receptor de IL-4 soluble el cual reconoce y une a IL-4.

8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que los linfocitos son linfocitos B7 positivos.

9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la respuesta inmune es una respuesta de células B que da como resultado la inhibición de la producción de anticuerpos, una respuesta de células T que da como resultado la inhibición de la inmunidad mediada por células, o la respuesta inmune es una inhibición de la proliferación de linfocitos.

10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la composición es para usar en la inhibición del rechazo de transplante en un sujeto, siendo el sujeto un receptor del tejido transplantado.

11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la composición es para usar en la inhibición de la enfermedad injerto contra huésped.

12. Uso de una molécula de unión a B7 y una molécula de unión a IL4 para preparar una composición farmacéutica como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para regular una respuesta inmune bloqueando una interacción B7 con linfocitos.

13. Uso de una molécula de unión a B7 y una molécula de unión a IL4 para preparar una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, en la que los linfocitos son linfocitos B7 positivos.

14. Uso de una molécula de unión a B7 y una molécula de unión a IL4 para preparar una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la respuesta inmune es una respuesta de células B que da como resultado la inhibición de la producción de anticuerpos, una respuesta de células T que da como resultado la inhibición de inmunidad mediada por células, o la respuesta inmune es una inhibición de proliferación de linfocitos.