ES2247628T3 - Prevencion de amplio espectro y supresion de la contaminacion microbiana de productos alimenticios mediante compuestos de amonio cuaternario. - Google Patents
Prevencion de amplio espectro y supresion de la contaminacion microbiana de productos alimenticios mediante compuestos de amonio cuaternario.Info
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Abstract
UN PROCEDIMIENTO DE USO DE COMPUESTOS DE AMONIO CUATERNARIO PARA INHIBIR EL ACOPLAMIENTO O RETIRADA DE UN AMPLIO ESPECTRO DE CONTAMINACION MICROBIANA PORTADA POR ALIMENTOS DE PRODUCTOS ALIMENTICIOS. EN EL PROCEDIMIENTO SE UTILIZAN COMPUESTOS DE AMONIO CUATERNARIO PARA INHIBIR EL ACOPLAMIENTO Y LA RETIRADA DE MICROORGANISMOS TALES COMO STAPHYLOCOCCUS, ARCOBACTER, LISTERIA, AEROMONAS, BACILLUS, SALMONELLA, ESCHERICHIA NO PRODUCTORA DE TOXINAS Y ESCHERICHIA PRODUCTORA DE TOXINAS PATOGENICAS TALES COMO LA O157:H7; HONGOS, TALES COMO EL ASPERGILLUS FLAVUS Y PENICILLIUM CHRYSOGENUM, Y PARASITOS, TALES COMO LA ENTAMEBA HISTOLYTICA DE UNA AMPLIA GAMA DE ALIMENTOS. LOS ALIMENTOS QUE SE PUEDEN TRATAR SEGUN ESTE PROCEDIMIENTO SON LA CARNE, PESCADO, VERDURAS Y FRUTAS. UNO DE LOS PROCEDIMIENTOS DE TRATAMIENTO CONSISTE EN PULVERIZAR COMPUESTOS DE AMONIO CUATERNARIO SOBRE LOS PRODUCTOS ALIMENTICIOS PARA IMPEDIR UN AMPLIO ESPECTRO DE CONTAMINACION MICROBIANA PORTADA POR LOS ALIMENTOS. NUEVAS FORMULACIONESDE COMPUESTOS DE AMONIO CUATERNARIO COMBINADOS CON GLICERINA Y/O ALCOHOL ETILICO CON LAS QUE SE OBTIENE UNA NUEVA FORMULACION DE USO INDUSTRIAL Y UNA FORMULACION DILUIDA A UTILIZAR EN PROCEDIMIENTOS DE PULVERIZACION.
Description
Prevención de amplio espectro y supresión de la
contaminación microbiana de productos alimenticios mediante
compuestos de amonio cuaternario.
Esta solicitud es una continuación en parte del
Documento de los Estados Unidos con Nº de Serie 08/631.578 en
tramitación presentado el 12 de Abril de 1996, que se incorpora por
referencia en el presente documento en su totalidad.
La presente invención se refiere de manera
general a un procedimiento para evitar el crecimiento de un amplio
espectro de microorganismos en productos alimenticios. De manera más
específica, la presente invención se refiere a un procedimiento para
usar compuestos de amonio cuaternario (QAC) para evitar el
crecimiento de un amplio espectro de microorganismos en productos
alimenticios; tales como, productos cárnicos, por ejemplo, aves de
corral, ternera, cerdo, cordero, carne de venado, y otros productos
cárnicos comestibles; animales marinos por ejemplo pescado y
marisco; frutas, vegetales, y cualquier otro producto alimenticio
que se pueda tratar utilizando los procedimientos de tratamiento
acuoso de la presente invención sin afectar de manera perjudicial la
apariencia, textura, y calidad del alimento. De manera más
específica, la presente invención se refiere a un procedimiento de
uso de QAC para inhibir la adhesión de, para eliminar, y para evitar
el crecimiento de microorganismos en los productos alimenticios. De
manera particular, el uso se refiere al efecto de los QAC sobre
microorganismos que pueden producir contaminación a través de
alimentos. De manera más particular, estos microorganismos incluyen
microorganismos de los géneros Staphylococcus,
Campylobacter, Arcobacter, Listeria,
Aeromonas, Bacillus, Salmonella,
Escherichia no productora de toxinas, y Escherichia
patógena productora de toxinas, tal como O157:H7. De manera más
particular, la presente invención se refiere a un procedimiento
mejorado de tratamiento de rociado de QAC sobre productos
alimenticios para evitar el crecimiento de un amplio espectro de
microbios sobre estos productos. La presente invención se refiere
también a una formulación de QAC que hace que el procedimiento de
tratamiento sea más sencillo para uso comercial en una planta de
procesamiento de alimentos.
La prevención de las enfermedades transmitidas
por los alimentos debido a la contaminación microbiana es del mayor
interés para la industria de procesamiento de alimentos, agencias
reguladoras, y consumidores. Un informe reciente del Food Safety
& Inspection Service (FSIS) del United States Department of
Agriculture (Registro Federal, 3 de febrero de 1995) estima que se
producen anualmente más de 2 millones de casos de enfermedades
transmitidas por alimentos debido a la contaminación microbiana en
los Estados Unidos, con un coste asociado de más de 1 millardo de
dólares. La contaminación microbiana transmitida por alimentos se
produce tanto antes de entrar en la instalación de procesamiento,
como debido a la contaminación cruzada en el entorno de
procesamiento. El FSIS ha instituido los requisitos del nuevo
Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control (HACCP) para
reducir la ocurrencia y número de los patógenos transmitidos por
alimentos. Estas regulaciones deben cumplirse por los procesadores
de alimentos. Aunque los medios de conseguir esta reducción
microbiana quedan a la discreción del procesador, el FSIS espera que
los tratamientos antimicrobianos serán un componente importante de
los planes HACCP. Los procedimientos de tratamiento de la presente
invención, que emplean una formulación acuosa de QAC, son útiles
para el cumplimiento de los requisitos del HACCP.
En sus esfuerzos para proporcionar un producto
completamente libre de contaminación microbiana, los procesadores de
aves de corral y carne han encontrado las mayores dificultades en la
eliminación de microorganismos que se adhieren o sujetan de manera
vigorosa a los tejidos del ave de corral y la carne que se pretende
usar como producto alimenticio. Si los microorganismos contaminantes
no se sujetan a la superficie del alimento, pueden eliminarse
fácilmente con el agua de lavado. Sin embargo, los microorganismos
que se mantienen fuertemente sujetos no se pueden eliminar mediante
el lavado y son bastante resistentes a la eliminación mediante
medios químicos o físicos.
Se han propuesto diversos procedimientos químicos
y físicos para reducir los microorganismos en los productos
alimenticios, tales como el uso de cloro o dióxido de cloro, ozono,
peróxido de hidrógeno, ácido láctico, carbonato de sodio, fosfato
trisódico, y la estimulación eléctrica. De manera general, estos
procedimientos han mostrado efectividad limitada en la reducción de
la contaminación microbiana y pueden afectar la apariencia física de
los productos cárnicos.
La contaminación por Salmonella
typhimurium ha sido de especial interés para la industria de
procesamiento de aves de corral debido a que el organismo está a
menudo presente en las aves vivas. Los procesadores de aves de
corral han tenido las mayores dificultades para eliminar los
microorganismos, tales como S. typhimurium, que se sujeta o
adhiere a los tejidos del ave de corral. Se han sugerido una
variedad de soluciones químicas y físicas para uso durante el
procesamiento de las aves de corral para eliminar la contaminación
por S. typhimurium de las carcasas y minimizar la
contaminación cruzada entre las carcasas. Se ha utilizado fosfato
trisódico (TSP) en el procesamiento de aves de corral para suprimir
S. typhimurium; sin embargo los estudios informan de
resultados conflictivos sobre la eficacia del TSP frente a la
Salmonella. Como resultado de su solubilidad en agua, el TSP
se puede eliminar por lavado del ave de corral y de esta manera, no
puede inhibir la unión de los microorganismos.
La Patente de los Estados Unidos nº5.366.983
describe un procedimiento para eliminar o evitar la contaminación
por Salmonella de los productos cárnicos por tratamiento con
una cantidad efectiva de una solución acuosa de un QAC. De manera
específica, los tensioactivos catiónicos de amonio cuaternario,
tales como aquilpiridinio, de manera particular cloruro de cetil
piridinio (CPC) y bromuro de cetil piridinio (CPB) fueron efectivos
eliminando S. typhimurium de las aves de corral. Esta
patente, sin embargo, no describe que los QAC tienen un espectro
antimicrobiano más amplio que la Salmonella frente a
cualquier otro género de microorganismos que contaminan los
alimentos. De manera adicional, no se sugiere que este procedimiento
de tratamiento sería efectivo sobre otros productos alimenticios
diferentes que la carne.
Las sustancias alimenticias difieren química y
físicamente en virtud de su contenido en proteínas, porosidad,
lipofilia, pH superficial, permeabilidad al agua, área superficial,
y carga eléctrica neta superficial. La porosidad del alimento podría
ser importante en el secuestro de bacterias mientras que un
tegumento tieso impermeable de una sustancia alimenticia podría
reducir la contaminación bacteriana del alimento. Todas estas
diferencias químicas y físicas entre productos alimenticios hacen
difícil predecir si el éxito de un agente antimicrobiano en
productos cárnicos pudiese sugerir el éxito en otros productos
alimenticios, tales como frutas, vegetales, y pescado.
Por ejemplo, se sabe que el CPC se enlaza con las
proteínas; sin embargo, si la eficacia antimicrobiana del CPC en
productos alimenticios fuera debida en gran parte al enlace con las
proteínas, entonces no se esperaría que tuviera éxito el presente
procedimiento para tratar frutas y vegetales no proteináceos.
De manera creciente, las enfermedades
transmitidas por alimentos producidas por otras bacterias patógenas
y de deterioro diferentes a la Salmonella se han convertido
en un problema para los procesadores de alimentos. En la Tabla 1 se
presenta una relación de estas bacterias con los productos en los
que se han presentado
| Microorganismo | Ave de corral | Ternera | Cerdo | Patógeno | De deterioro |
| Aeromonas hydrophila | X | X | X | X | |
| Arcobacter butzleri | X | X | X | ||
| Bacillus cereus | X | X | X | X | |
| Campilobacter jejuni | X | X | X | X | |
| Escherichia coli O157:H7 | X | X | X | X | |
| Listeria monocytogenes | X | X | X | X | |
| Salmonella typhimurium | X | X | X | X | |
| Staphylococcus aureus | X | X | X | X |
Entre estos microorganismos contaminantes que se
relacionan en la tabla, Escherichia coli O157:H7 es de
especial interés debido a su virulencia, gravedad de la enfermedad
producida, y mortalidad asociada. E. coli O157:H7 produce
fuertes toxinas "shiga-like" que conducen a
anormalidades en la coagulación de la sangre, fallo hepático
(síndrome urémico hemolítico), y muerte. Incluso si la recuperación
de la enfermedad aguda es completa, el 15-30% de las
personas infectadas con síndrome urémico hemolítico tendrá síntomas
de enfermedad hepática crónica. Los riesgos asociados con la
contaminación por E. coli O157:H7 se componen por su
resistencia informada a los antibióticos. En 1993, se produjeron
entre 8.000 - 16.000 casos de enfermedades transmitidas por los
alimentos debido a E. coli O157:H7 con un coste estimado de
entre 0,2 y 0,5 millardos de dólares
Se ha encontrado en la carne, vegetales, y
diversos productos lácteos otro contaminante virulento de los
alimentos, Listeria monocytogenes; que puede producir sepsis,
meningitis, y abcesos diseminados. L. Monocytogenes es un
microorganismo que tolera el frío y capaz de crecer bajo
refrigeración. En 1993 se produjeron aproximadamente 1.700 casos de
enfermedad transmitida a través de alimentos por L.
Monocytogenes con un coste estimado de entre 0,1 y 0,2 millardos
de dólares.
Otro microorganismo de interés en la industria
alimentaria es Aeromonas hydrophila, que produce deterioro en
la industria de procesamiento de alimentos y carne, y reduce la vida
media de estos productos.
En la actualidad no se conocen compuestos
microbicidas que sean efectivos evitando y eliminando la
contaminación en un amplio intervalo de productos alimenticios
frente a un amplio espectro de microorganismos gram positivos, gram
negativos, aerobios, anaerobios facultativos y microaerófilos. Los
presentes inventores han determinado que los QAC son efectivos
frente a un amplio espectro de diferentes microorganismos que
producen enfermedades transmitidas a través de alimentos cuando se
adhieren a un amplio espectro de productos alimenticios. Esta
sensibilidad de un amplio espectro de microorganismos patógenos no
se podría haber predicho.
La sensibilidad de un microorganismo a un agente
antimicrobiano concreto no predice la sensibilidad de otros
microorganismos al mismo agente. Se cree que los antisépticos o
germicidas tienen un espectro continuo de actividad pero se deben
tener en cuenta las susceptibilidades relativas de los diferentes
microorganismos. Por ejemplo, el germicida hexaclorofeno es efectivo
principalmente frente a microorganismos Gram positivos, y los
antisépticos catiónicos no son efectivos frente a los organismos
esporuladores. Se ha demostrado que algunos microorganismos Gram
negativos, tales como Pseudomonas capacia, crecen en
soluciones del fármaco cloruro de benzalconio. Se ha demostrado que
tras bacterias son capaces de crecer en etanol al 70% (Harvey, S.
C.; Antimicrobial Drugs en Remington's Pharmaceutical
Sciences, 18ª Ed., Mack publishing Co., pp.
1163-1241, 1990).
Con vistas al tratamiento de los productos
alimenticios, se ha informado que Listeria es más resistente
a la acción del TSP que Salmonella o E. coli (Somers,
E. B. y col., Int. J. Food Microbiol.,
22:269-276, 1994). De manera adicional, (Breen y
col., J. Food Sciences, 60:1991-1996, 1995)
demostraron que el TSP es mucho menos efectivo inhibiendo el
crecimiento de Salmonella que lo que es despegando este
organismo. De manera similar, el TSP ha reducido los conteos de
E. coli O157:H7 sobre carcasas de pollo pero no es efectivo
inhibiendo la contaminación cruzada de este microorganismo en otros
pollos.
La presente invención muestra que los QAC son
efectivos frente E. coli O157:H7 en suspensión en líquidos,
reduciendo los conteos de esta bacteria cuando se une adhiere a los
productos alimenticios, así como inhibiendo la adhesión de esta
bacteria a los productos alimenticios. Se ha informado que E.
coli O157:H7 muestra resistencia hacia un amplio espectro de
agentes antimicrobianos, tales como tetraciclina, estreptomicina,
sulfisoxazol (Kim y col., J. Infect. Med. Dis.,
170:1606-1609, 1994) y oxitetraciclina (Ciosek y
col., Med. Weter. 40:335,338:1984), por cuanto estos mismos
agentes son muy activos frente a cepas regulares de E. coli
no productoras de toxinas.
Claramente, no se puede predecir la efectividad
de un agente antimicrobiano o biocida frente a un microorganismo
particular basándose en su efectividad frente a diferentes
microorganismos. Existen muchos factores a considerar, tales como
las características microbianas que pueden jugar un papel en la
efectividad de un agente antimicrobiano frente a un microorganismo
particular. Estas características incluyen, pero no se limitan a:
(1) el grado de formación de glicocalix por una especie dada de un
microorganismo adherido, (2) la presencia de una envuelta celular
que contiene un lipopolisacárido - y un fosfolípido en bacterias
gram negativas, (3) la presencia de lipoproteína en la mayor parte
de bacterias entéricas y Pseudomonas, y (4) la presencia de canales
de proteína de porina, por ejemplo en E. coli y Salmonella
(Fulton y col., Structure en Medical Microbiology, 3ª
Ed., pp. 37-54, 1991).
La industria de procesamiento de alimentos tiene
necesidad de un procedimiento más efectivo para la prevención del
crecimiento de un amplio espectro de microorganismos contaminantes
sobre muchos productos alimenticios diferentes. Esto es
especialmente verdadero para los microorganismos que se adhieren a
las superficies del alimento. Como resultado del aumento de los
números de enfermedades producidas por microorganismos patógenos que
se transmiten a través de alimentos, la industria de procesamiento
de alimentos requiere ahora procedimientos más efectivos para la
eliminación y prevención de un espectro más amplio de
microorganismos y de manera particular para microorganismos
patógenos, tales como Escherichia productora de toxina, es
decir, E. coli O157:H7, que se conoce por producir
enfermedades humanas graves como resultado de la contaminación de
alimentos. Los presentes inventores han proporcionado un
procedimiento para evitar el crecimiento de microorganismos en
líquidos asociados con productos alimenticios, un objetivo
importante para evitar la contaminación cruzada en el interior de la
planta de procesamiento; eliminando los microorganismos adherido de
los productos alimenticios, inhibiendo la adhesión de los
microorganismos a los productos alimenticios; y evitando el
crecimiento de los microorganismos que permanecen adheridos a los
productos alimenticios. De manera adicional, el procedimiento de la
presente invención se puede adaptar fácilmente para uso en una
planta de procesamiento de alimentos.
De manera adicional, la presente invención
proporciona una formulación de QAC concentrado para uso en dilución
en una solución de trabajo para uso en el presente
procedimiento.
La presente invención proporciona un
procedimiento para la prevención del crecimiento de un amplio
espectro de microorganismos en productos alimenticios. Se pretende
que la prevención del crecimiento de microorganismos en productos
alimenticios proporciona un producto alimenticio que está
desprovisto de, o produzca conteos mínimos de, microorganismos
viables que podrían producir enfermedad en seres humanos o animales
o deterioro del producto alimenticio antes de la ingestión. Se
pretende que la prevención del crecimiento de microorganismos en
productos alimenticios incluya pero no se limite a los siguientes
mecanismos: (1) eliminación de los microorganismos adheridos de los
productos alimenticios; (2) inhibición de la adhesión de
microorganismos a los productos alimenticios; (3) muerte o
inactivación de los microorganismos adheridos sobre los productos
alimenticios; y (4) muerte o inactivación de los microorganismos que
no se adhieren al producto alimenticio, pero que están presentes en
líquidos asociados con los productos alimenticios durante el
procesamiento; tales como en los tanques de refrigeración.
Los microorganismos que son susceptibles a los
QAC incluyen microorganismos de los géneros Staphylococcus,
Campylobacter, Arcobacter, Listeria,
Aeromonas, Bacillus, Salmonellla,
Escherichia no productora de toxinas, Escherichia
patógena productora de toxinas y otros microorganismos que se
transmiten a través de los alimentos y que son capaces de producir
contaminación microbiana del alimento transmitida a través del
alimento para consumo de seres humanos o animales.
Los microorganismos adicionales que son también
susceptibles a los QAC son los hongos, tales como, Aspergillus
flavum y Penicillium chrysogenum, y los parásitos, tales
como Entamoeba histolytica.
La composición de la presente invención comprende
una cantidad efectiva de QAC que inhibe el crecimiento microbiano en
una solución acuosa. Los QAC de la presente invención son efectivos
en la prevención del crecimiento de un amplio espectro de
microorganismos patógenos y de deterioro. Los QAC, de manera
particular el cloruro de cetil piridinio (CPC), son especialmente
efectivos para evitar el crecimiento de un amplio espectro de
microorganismos de un amplio espectro de productos alimenticios.
La presente invención tiene una aplicación
importante en la industria de procesamiento de alimentos, así como
para el uso en el hogar. Se dispone fácilmente de QAC y el coste de
llevar a cabo el procedimiento de la presente invención no es caro
en comparación con los procedimientos antimicrobianos existentes. A
diferencia de los tratamientos existentes usados, por ejemplo, el
TSP, el uso de QAC no altera la apariencia, color, sabor, o textura
del producto alimenticio. Un intervalo de concentraciones de QAC es
efectivo para la prevención de un amplio espectro de crecimiento
microbiano en productos alimenticios. Los QAC son seguros, tal como
se muestra por la ausencia de mutagenicidad del CPC usado en el
ensayo de Ames. De manera adicional, el CPC está ya aprobado para
uso humano en productos para la ingestión oral en preparaciones,
tales como pastillas de Cepacol® que se ingieren por vía oral en
cantidades de hasta 20 mg por día.
La presente invención se dirige también a una
formulación de QAC para uso con el presente procedimiento para el
tratamiento de productos alimenticios, en los que por ejemplo, el
CPC se formula con agentes que mejoran la solubilidad, tales como el
alcohol etílico y/o glicerina.
La presente invención se dirige también a un
procedimiento mejorado de puesta en contacto de los productos
alimenticios con QAC durante un período de tiempo de menos de cinco
minutos, incluso tan corto como de 20 a 90 segundos, que da como
resultado la prevención significativa del crecimiento de los
microorganismos sobre los productos alimenticios.
La invención incluye también un procedimiento
mejorado de puesta en contacto de QAC con productos alimenticios,
pulverizando el compuesto sobre el producto alimenticio. El
procedimiento de pulverización se puede llevar a cabo usando QAC en
solución en agua o usando la nueva formulación con QAC formulado con
agentes mejorantes de la solubilidad.
De manera adicional, el procedimiento de la
presente invención puede incluir de manera opcional una etapa de
determinación anterior a la puesta en contacto del producto
alimenticio con el QAC para determinar la presencia de
microorganismos sobre el alimento antes del tratamiento. Se puede
utilizar cualquier procedimiento convencional para determinar
rápidamente la presencia de microorganismos como etapa de
determinación, que por ejemplo, incluye PRC e inmunoensayos.
De manera adicional, el procedimiento de la
presente invención puede incluir de manera opcional una etapa para
determinar la presencia de QAC sobre la superficie del producto
alimenticio tras el contacto con el QAC. Esta determinación se puede
realizar inmediatamente después de la etapa de puesta en contacto o
tras varias etapas de lavado. Por ejemplo, el QAC se puede extraer
de los tejidos del alimento en una forma adecuada para el análisis
por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). El
procedimiento comprende la extracción con etanol del tejido del
alimento seguido por la extracción en fase sólida usando una columna
de intercambio catiónico débil que separa de manera selectiva los
QAC de otros compuestos en la matriz que podrían interferir de otra
manera con el análisis HPLC. El ensayo HPLC para la cuantificación
de los residuos de QAC emplea una columna de ciano en fase reversa y
usa un QAC análogo tal como en un estándar interno.
La Fig. 1 es un diagrama de barras que muestra la
inhibición de la adhesión de E. coli O157:H7 al tejido de
falda de ternera tras el tratamiento con CPC.
La Fig. 2 es un diagrama de barras que muestra la
reducción de los microorganismos viables sobre la piel de siluro
tras el tratamiento con CPC en glicerina acuosa al 5% sobre un medio
no selectivo.
La Fig. 3 es un diagrama de barras que muestra la
reducción de S. typhimurium viable sobre la piel de siluro
tras el tratamiento con CPC en glicerina acuosa al 5% sobre medio
selectivo.
La Fig. 4 es un diagrama de barras que muestra la
reducción de S. typhimurium viable sobre uvas negras tras el
tratamiento con CPC en glicerina acuosa al 5%.
La Fig. 5 es un diagrama de barras que muestra la
reducción de S. typhimurium viable sobre brécol tras el
tratamiento con CPC en glicerina acuosa al 5%.
La presente invención se basa en la determinación
de que se pueden usar QAC para tratar un amplio espectro de
productos alimenticios para reducir un amplio espectro de
contaminación microbiana que se transmite a través de los alimentos
en estos productos. La presente invención se basa también en el
hallazgo que los QAC son efectivos para la eliminación, muerte,
inactivación e inhibición de la adhesión de un amplio espectro de
microorganismos patógenos que se transmiten a través de los
alimentos a los productos alimenticios. Estos microorganismos
incluyen, pero no se limitan a bacterias que pertenecen a los
géneros, Salmonella, Staphylococcus,
Campylobacter, Arcobacter, Listeria,
Aeromonas, Bacillus, Escherichia coli no
productora de toxinas, y las cepas virulentas de Escherichia
coli productoras de toxinas, tales como E. coli O157:H7;
hongos, tales como Aspergillus flavus y Penicillium
chrysogenum; y parásitos, tales como Entamoeba
histolytica.
Las composiciones de la presente invención
comprenden una cantidad efectiva de QAC en una solución acuosa. El
QAC se selecciona entre el grupo constituido por alquilpiridinio,
tetraalquilamonio y las sales alquialicíclicas de amonio.
El alquilpiridinio se representa mediante la
fórmula estructural (I)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que n es
9-21; y X es un
haluro
El tetra-alquilamonio se
representa mediante la fórmula estructural (II):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que n es
9-21; R se selecciona entre el grupo constituido por
CH_{3}, y C_{2}H_{5}; y X es un
haluro
Las sales alquilalicíclicas de amonio se
representan mediante la fórmula estructural (III)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que n es
9-21; Z es 4-5; R se selecciona
entre el grupo constituido por CH_{3} y C_{2}H_{5}; y X es un
haluro.
Se evaluó la efectividad de diferentes QAC, todos
ellos son agentes catiónicos de superficie activa; es decir,
tensioactivos, para la eliminación de microorganismos adheridos a
diversos alimentos así como para la inhibición de la adhesión de los
microorganismos. De los QACC estudiados, el más efectivo fue el
cloruro de cetil piridinio (CPC), que será el que se use en los
ejemplos que se muestran a continuación, pero no se pretende limitar
el uso de los QAC al CPC dentro del significado de la presente
invención, debido a que otros miembros de los QAC tienen propiedades
similares frente a los microorganismos patógenos que se transmiten a
través de los alimentos.
La presente invención se basa de manera adicional
en la determinación que se puede reducir el tiempo de contacto de
los QAC con los productos alimenticios en el procedimiento de
inmersión a 1 minuto, dando aún como resultado una inhibición
significativa de la adhesión de los microorganismos, para los
microorganismos que se transmiten a través de los alimentos entre
los que se incluye Salmonella, lo que resulta una mejora
significativa y una ventaja comercial en el uso industrial de este
procedimiento.
\newpage
La presente invención se basa también en la
determinación que un nuevo procedimiento de pulverización de QAC
bajo diversas presiones sobre los productos alimenticios durante 20
a 90 segundos reduce de manera significativa los microorganismos
viables que se transmiten a través de los alimentos de estos
productos.
La presente invención se basa también en la
determinación que una nueva formulación de QAC en soluciones que
contienen concentraciones variables de al menos un agente mejorador
de la solubilidad, tal como alcohol etílico o glicerina, es útil
para el tratamiento de los productos alimenticios. Esto es de manera
particular cuando las soluciones de QAC se van a usar en combinación
con una sal, están muy concentradas, o se someterán a temperaturas
frías, tales como en el interior de las plantas de procesamiento de
alimentos. Esta nueva formulación permite concentrar el QAC para su
almacenamiento, diluyéndose fácilmente a continuación para uso en el
procedimiento de tratamiento antimicrobiano en la planta de
procesamiento, en vez de requerir que el polvo de QAC se mezcle
antes de uso. Esta nueva formulación de QAC proporciona facilidades
para uso del concentrado, lo que resulta ventajoso para uso
industrial. Esta nueva formulación de QAC se puede usar en el
procedimiento de inmersión estándar o en el nuevo procedimiento de
pulverizado.
Los aspectos anteriormente descritos de la
presente invención se describen con detalle a continuación con
referencia a las Figs. 1-5.
Los ejemplos utilizan aves de corral, ternera,
siluros, brécol, y uvas como los productos alimenticios tratados en
el procedimiento, pero se pretende que el alcance de la presente
invención abarque el tratamiento de otros productos alimenticios que
pudieran no verse adversamente afectados por el procedimiento de
tratamiento.
Los microorganismos utilizados en los siguiente
ejemplos son como sigue Staphylococcus aureus ATCC 29213,
Campylobacter jejuni ATTC 29428, Escherichia coli
(cepa no productora de toxina) ATCC 25922; Escherichia coli
O157:H7 (cepa productora de toxina) ATCC 43895, Arcobacter
butzleri ATCC 49616, Listeria monocytogenes ATCC 49594,
Aeromonas hydrophila ATCC 49140, Bacillus cereus ATCC
49063, Salmonella typhimurium ATCC 14028 y NCTC 12023, y los
cultivos comercialmente disponibles de Aspergillus flavus y
Penicillium chrysogenum.
Se determinaron las concentraciones inhibitorias
mínimas (MIC) para el QAC en caldo de Mueller Hinton (BBL
Microbiology System) usando el procedimiento de macrodilución
establecido por el 1987 National Comittee for Clinical Laboratory
Standards. Los experimentos se llevaron a cabo durante 16 horas de
incubación a 37º C para Staphylococcus aureus, Escherichia
coli O157:H7, Listeria monocytogenes, y Salmonella
typhimurium. Se llevaron a cabo incubaciones a 30ºC para
Aeromonas hydrophila, y Bacillus cereus. Se determinó
la MIC mediante dilución inferior sin turbidez visible. La Tabla 2
muestra los datos de los experimentos anteriores
| Cloruro de | CPC frente | CPC frente | CPC frente | CPC frente | CPC frente | CPC frente L. |
| cetil piridinio | E. coli 0157:H7 | B.cereus | S. aureus | S. typhimurium | A. hydrophila | monocytogenes |
| (CPC) \mug/mL | ||||||
| 125 | - | - | - | - | - | - |
| 62,5 | - | - | - | - | - | - |
| 31,25 | - | - | - | + | + | - |
| 15,63 | - | - | - | * | * | - |
| 7,81 | + | - | - | + | + | - |
| 3,91 | + | + | - | + | + | - |
| 1,96 | + | + | - | + | + | - |
| Cloruro de | CPC frente | CPC frente | CPC frente | CPC frente | CPC frente | CPC frente L. |
| cetil piridinio | E. coli 0157:H7 | B.cereus | S. aureus | S. typhimurium | A. hydrophila | monocytogenes |
| (CPC) \mug/mL | ||||||
| 0,98 | + | + | - | + | + | - |
| 0,50 | + | + | - | + | + | + |
| 0,25 | + | + | - | + | + | + |
| 0.00 | + | + | + | + | + | + |
| (-) sin crecimiento (+) crecimiento | ||||||
| Las MIC se obtuvieron mediante el procedimiento de macrodilución del caldo (National Committee for Clinical | ||||||
| Laboratory Standards). |
Se determinaron las concentraciones bactericidas
mínimas (MBC) para el QAC frente a Campylobacter jejuni y
Arcobacter butzleri en caldo de Mueller Hinton (BBL
Microbiology System) usando el procedimiento de macrodilución
establecido por el 1987 National Committee for Clinical Laboratory
Standards. Los experimentos se llevaron a cabo mediante incubación
microaerófila a 37ºC durante 48 h. Los experimentos se llevaron a
cabo en incubación microaerófila a 37ºC durante 48 h. Se vertió una
alícuota de cada dilución en placa con agar y se incubó en
condiciones microaerófilas a 37ºC durante 48 horas. Se determinaron
las MBC con la dilución menor sin crecimiento. La Tabla 3 muestra
los datos del experimento anterior:
| Cloruro de cetil piridinio, \mug/mL | CPCC frente Campylobacter jejuni | CCPC frente Arcobacter butzleri |
| 125 | - | - |
| 62,5 | - | - |
| 31,25 | - | - |
| 15,63 | - | + |
| 7,81 | - | + |
| 3,91 | + | + |
| 1,96 | + | + |
| 0,98 | + | + |
| 0,50 | + | + |
| 0,25 | + | + |
| 0,00 | + | + |
| (-) Sin crecimiento (+)Crecimiento | ||
| Se obtuvieron las MCB mediante el procedimiento de macrodilución del caldo (National committee for Clinical | ||
| Laboratory Standards |
Los datos de MIC y MBC muestran que el CPC es
efectivo frente a un amplio espectro de microorganismos.
Se centrifugó un cultivo de
16-horas de cada E. coli O157:H7 en caldo de
soja tripticasa (15.000 rpm, 10 min, 4ºC). Tras eliminar del
sobrenadante, la torta se lavó con 10 ml de tampón de fosfato de
potasio 0,04 M (PPB, pH 7,0), y se suspendió en PPB hasta una
suspensión final de 1-2 x 10^{9} células/ml. Se
centrifugaron (14.000 rpm, 3 min) alícuotas (1,0 ml), y se
eliminaron los sobrenadantes. Cada torta se suspendió en 1 ml de una
solución acuosa de diversas concentraciones
(100-1.000 \mug/ml) de la composición de ensayo
(CPC) o 1,0 ml de PPB, se mezcló en vórtex (30 s), se incubó durante
1 min a 25ºC, y se centrifugó (14.000 rpm, 3 min).Tras eliminar del
sobrenadante, cada torta se suspendió en 0,5 ml de PPB, Se contaron
las células de cada muestra usando alícuotas duplicadas de 0,05 ml y
técnicas estándar de dilución en serie sobre agar de soja
tripticasa, y los datos se registraron como promedio de unidades
formadoras de colonias (CFU / ml.
Los resultados del experimento anterior muestran
que se alcanzó la reducción completa de E. coli O157:H7
viable en suspensión a todas las concentraciones del CPC ensayado
(100, 250, 500, y 1000 \mug/ml). Los resultados de este
experimento son particularmente significativos para la prevención de
la contaminación cruzada con E. coli O157:H7 en el
procesamiento industrial de la carne. Tal como se ha descrito
anteriormente, esta cepa de E. coli productora de toxina
muestra resistencia a muchos agentes antimicrobianos de amplio
espectro. Estos resultados proporcionan la evidencia que el
tratamiento de productos cárnicos con QAC evitará que una pieza de
carne contaminada contamine otras piezas no contaminadas debido a
que el QAC matará el organismo en el líquido que es el agente de
transferencia responsable para la contaminación cruzada.
Se retiraron las pieles de pollo (2,5 x 2,5 cm)
con una baqueta, esterilizada mediante una dosis de 45 KGy de
irradiación de una fuente de electrones, se colocaron con la parte
de la epidermis hacia arriba en cada pocillo de una placa de cultivo
de tejido de 6 pocillos. Cada pieza de piel se inoculó con 5 ml de
solución salina tamponada con fosfato 0,008 M (PBS, pH 7,2) que
contenía 6-8 x 10^{3} CFU / ml de bacterias con la
excepción del grupo de control del fondo que se trató sólo con 5 ml
de PBS. Las placas se incubaron (30 min, 35ºC), y cada pieza de piel
se lavó (2X, 5 ml PBS) para eliminar los microorganismos enlazados
débilmente (sin adherir). Cada piel inoculada se trató con 5 ml de
PBS que contenía CPC. Se usaron tres piezas de piel por cada
concentración de CPC, incluyendo una en la que las pieles se
trataron sólo con 5 ml de PBS (concentración 0). Las placas se
incubaron (30 min, 35ºC), y cada pieza de piel se lavó (2X, 5 ml
PBS) para eliminar los microorganismos débilmente enlazados (sin
adherir). Cada piel inoculada se trató con 5 ml de PBS que contenía
CPC. Se usaron tres piezas de piel por cada concentración de CPC,
incluyendo una en la que las pieles se trataron sólo con 5 ml de PBS
(concentración 0). Las placas se incubaron con agitación (100 rpm)
durante 30 min a 25ºC. Tras la incubación, cada pieza de piel se
lavó (5 ml PBS), se colocó en una bolsa de plástico estéril que
contenía 80 ml de solución salina o peptona al 1% y se
homogeneizaron durante 2 minutos usando un mezclador de laboratorio
(Stomacher® 400, Seward Medical, Londres, Inglaterra). Se vertieron
en placas tres alícuotas del homogenado (1 ml) y se incubaron (37ºC,
18-24 h). Las colonias bacterianas se contaron, se
corrigieron para dilución, y se informaron como CFU / piel.
Estos estudios muestran la reducción en bacterias
viables (Salmonella typhimurium, Staphylococcus
aureus, Cam- pylobacter jejuni, Escherichia
coli (cepa no productora de toxina) y Escherichia coli
O157:H7) tras el tratamiento con concentraciones de 50 a 1000 ppm de
CPC. Se ensayaron concentraciones más altas de CPC de hasta 8.000
ppm frente Escherichia coli O157:H7 y se encontró que reduce
el número de bacterias adheridas por debajo del 0,1%. Estos estudios
muestran una inhibición significativa del crecimiento de estas cinco
bacterias sobre la piel de
pollo.
pollo.
Se retiraron las pieles de pollo (2,5 x 2,5 cm)
con una baqueta, esterilizada mediante una dosis de 45 KGy de
irradiación de una fuente de electrones, se colocaron con la parte
de la epidermis hacia arriba en cada pocillo de una placa de cultivo
de tejido de 6 pocillos. Cada pieza de piel se inoculó con 5 ml de
solución salina tamponada con fosfato 0,008 M (PBS, pH 7,2) que
contenía CPC. Se usaron tres piezas de piel por cada concentración
de compuesto de ensayo, incluyendo una en la que las pieles se
trataron sólo con 5 ml de PBS (concentración 0). Las placas se
incubaron con agitación (100 rpm) varias veces (1 min o 10 min) a
25ºC. La solución incubada se eliminó mediante aspiración, y las
pieles se lavaron (5 ml PBS), y se incubaron a continuación 30 min,
35ºC con 5 ml de PBS que contenía 6-8 x 10^{3} CFU
/ ml de bacterias. Tras la incubación, cada pieza de piel se lavó
(2X, 5 ml PBS), para eliminar los microorganismos débilmente
enlazados (sin adherir), se colocó en una bolsa de plástico estéril
que contenía 80 ml de solución salina o peptona al 1% y se
homogeneizó durante 2 minutos usando un mezclador de laboratorio
(Stomacher® 400, Seward Medical, Londres, Inglaterra). Se vertieron
en placas tres alícuotas del homogenado (1 ml) y se incubaron (37ºC,
18-24 h). Las colonias bacterianas se contaron, se
corrigieron para dilución, y se informaron como CFU / piel.
Estos estudios muestran la inhibición de la
adhesión de las bacterias (Salmonella typhimurium,
Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni,
Escherichia coli (cepa no productora de toxina) y
Escherichia coli O157:H7) a la piel de pollo tras el
tratamiento con concentraciones de 50 a 1000 ppm de CPC. Los datos
de estos estudios muestran que la piel de pollo pretratada con CPC
inhibe de manera significativa la adhesión de estos microorganismos
a la piel de pollo.
El tratamiento de la piel de pollo con CPC
durante sólo 1 minuto da como resultado una inhibición significativa
de la adhesión de S. typhimurium a 500 ppm y 1000 ppm. Este
tiempo de contacto más corto del QAC con los productos cárnicos
apoya que sigue siendo efectivo el uso de tiempos de contacto más
cortos que los que se han informado anteriormente. De manera
general, las inmersiones en tanques de frío pueden ser de hasta 60
minutos, pero los datos presentados en el presente documento apoyan
que se puede usar un tiempo de contacto o inmersión más corto que
sigue dando como resultado una reducción significativa en el número
de microorganismos viables. La etapa de puesta en contacto de la
presente invención se puede llevar a cabo durante aproximadamente 20
segundos a aproximadamente 60 minutos; sin embargo, la presente
invención describe también un procedimiento de un tiempo de contacto
más corto de menos de 10 minutos, de manera más preferible
aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 5 minutos, y de manera
más preferible aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 90
segundos.
Se colocó en cada pocillo de una placa de cultivo
de tejido de seis pocillos un cuadrado de tejido de falda de ternera
(2,5 x 2,5 cm) de aproximadamente 0,5 cm de espesor, esterilizados
mediante una dosis de irradiación de 45 KGy a partir de una fuente
de electrones. Se inoculó cada pieza de tejido con 5 ml de solución
salina tamponada con fosfato 0,008 M (PBS, pH 7,2) que contenía
6-8 x 10^{3} CFU/ml de bacterias, con la excepción
que el grupo de control del fondo se trató sólo con 5 ml de PBS. Se
incubaron las placas (30 min, 35ºC), y se lavó cada cuadrado (2X, 5
ml PBS) para eliminar los microorganismos débilmente enlazados (sin
adherir). Los cuadrados inoculados se trataron con 5 ml de PBS que
contenía el CPC. Se usaron tres piezas de tejido por cada
concentración del compuesto de ensayo, incluyendo una en la que los
cuadrados se trataron sólo con 5 ml de PBS (concentración 0). Se
incubaron las placas con agitación (100 rpm) durante 30 min a 25ºC.
Tras la incubación, se lavó cada cuadrado (5 ml PBS), se colocó en
una bolsa de plástico estéril que contenía 50 ml de peptona 1%, y se
homogeneizó durante 2 minutos usando un mezclador de laboratorio
(Stomacher® 400, Seward Medical, Londres, Inglaterra). Se vertieron
en placa tres alícuotas del homogenado (1 ml) y se incubaron (37ºC,
18-24 h). Se contaron las colonias bacterianas, se
corrigieron para dilución, y se informaron como CFU / cuadrado.
Los resultados de este estudio muestran una
reducción en el Escherichia coli O157:H7 viable tras
tratamiento con concentraciones de 50 a 1000 ppm de CPC sobre tejido
de falda de ternera con una reducción del 62-64% de
las bacterias adheridas a 500 y 1000 ppm de CPC.
Se colocó en cada pocillo de una placa de cultivo
de tejido de seis pocillos un cuadrado de tejido de falda de ternera
(2,5 x 2,5 cm), de aproximadamente 0,5 cm de espesor, esterilizados
mediante una dosis de irradiación de 45 KGy a partir de una fuente
de electrones. Se trató cada pieza con 5 ml de solución salina
tamponada con fosfato 0,008 M (PBS, pH 7,2) que contenía CPC. Se
usaron tres piezas de tejido de ternera por cada concentración del
compuesto de ensayo, incluyendo una en la que los cuadrados se
trataron sólo con 5 ml de PBS (concentración 0). Las placas de
cultivo se incubaron con agitación (100 rpm) durante 10 minutos a
25ºC. La solución de incubación se eliminó mediante aspiración, y
los cuadrados se lavaron (5 ml PBS), y a continuación se incubaron
(30 min, 35ºC) con 5 ml de PBS que contenía 6-8 x
10^{3} CFU/ml de bacterias. Tras la incubación, se lavó cada pieza
de tejido (2X, 5 ml PBS), para eliminar los microorganismos
débilmente enlazados (sin adherir), se colocaron en una bolsa de
plástico estéril que contenía 50 ml de peptona al 1%, y se
homogeneizaron durante 2 minutos usando un mezclador de laboratorio
(Stomacher® 400, Seward medical, Londres, Inglaterra). Se vertieron
en placa tres alícuotas del homogenado (1 ml) y se incubaron (37ºC,
18-24 h). Se contaron las colonias bacterianas, se
corrigieron para dilución y se informaron como CFU / cuadrado.
Los resultados de este estudio muestran la
inhibición de la adhesión de Escherichia coli O157:H7 tras el
tratamiento con 50 a 1000 ppm de CPC con una reducción del 76% en
el número en el número de bacterias adheridas en la ternera a
concentraciones de 1000 ppm de CPC. La Fig. 1 muestra los resultados
de un ensayo separado usando concentraciones más altas de CPC y el
mismo procedimiento experimental. A 20.000 ppm de CPC, las bacterias
se inhibieron de manera completa de la adhesión a la ternera.
Se diseñó una cámara de ensayo y se construyó
para uso en una planta piloto de procesamiento de aves de corral. El
sistema de ensayo de pulverización está constituido por una cámara
de ensayo, un tanque de almacenamiento de agua de pulverización, una
bomba de presión, un filtro, reguladores de presión, una cámara de
pulverización de plástico con ocho boquillas localizadas en cuatro
lados, y un colector de agua usada. Había tres boquillas sobre cada
una de las tuberías para pulverización por delante y por detrás. Se
usó una boquilla para la pulverización por la parte de arriba y una
boquilla para la pulverización por la parte de abajo. Las
dimensiones de la cámara son de manera preferible 91,4 x 91,4 x 91,4
cm (3 x 3 x 3 pies). Con una bomba impulsora de alta presión, la
presión se debería ajustar entre 0-140 psi (0 - 9,65
x 10^{5} N/m^{2}). La distancia entre las boquillas de
pulverización y la carcasa del pollo fue de 12-15
pulgadas (30,48-38,1 cm). La boquilla superior se
usó para rociar el interior de la carcasa de pollo. Se usaron
boquillas pulverizadoras de cono plano (1/8tK-SS1,
Spraying Systems Co).
La solución de pulverización en el tanque de
almacenamiento se bombeó al regulador de presión, y se pulverizó a
continuación mediante las boquillas en la cámara. En la cámara de
pulverización se instalaron diversas capas de pulverización
constituidas por boquillas de acero inoxidable y tuberías, y la
cámara se recubrió con láminas de plástico para evitar el impulso de
productos químicos. Se usó una cadena para suspender la carcasa de
pollo en la cámara.
Las carcasas de pollo preenfriado se obtuvieron
de una planta de procesamiento local de aves de corral. Se tomaron
al final de la línea de procesamiento de evisceración, se
transportaron al laboratorio de investigación y se usaron de manera
inmediata para los ensayos. El tiempo transcurrido entre la planta
de procesamiento y el laboratorio de investigación fue inferior a
una hora y media. La temperatura de las carcasas de pollo estuvo en
el intervalo de 32-37ºC.
Las carcasas de pollo se inocularon pulverizando
1 ml de S. typhimurium a 1 x 10^{6} CFU/ml y a continuación
se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. Las carcasas de
pollo inoculadas se lavaron pulverizando agua corriente a 30 psi
(2,06 x 10^{5} N/m^{2}) y 22ºC durante 5 s para hacer
desaparecer mediante el lavado las células de Salmonella
débilmente adheridas. Cada carcasa se colgó a continuación en la
cámara de pulverización y se pulverizó con uno de los compuestos de
ensayo. Tras la pulverización, cada carcasa de pollo se lavó con
agua corriente durante 20 s. Las carcasas de pollo se lavaron a
continuación con agua con peptona tamponada en una bolsa de plástico
sobre un agitador automático para obtener muestras para análisis
microbiano. El color de la piel de pollo se examinó visualmente
comparando las aves tratadas con los compuestos de ensayo, tales
como los QAC, con aves sin tratar.
Se usó CPC a una concentración de 1000 rpm a
diferentes presiones y duraciones de pulverización. La temperatura
del agua de pulverización se situó a una temperatura ambiente de
22ºC. las presiones se situaron a 30, 50, y 120 psi (2,06 x
10^{5}; 3,44 x 10^{5} y 8,27 x 10^{5} N/m^{2}), y la
duración a 30 y 90 s. Se llevaron a cabo tres réplicas por cada
ensayo. Se comparó la reducción de S. typhimurium sobre
carcasas de pollo entre los de los compuestos de ensayo
pulverizados, el agua pulverizada, y los grupos sin rociar.
Tras los tratamientos de pulverización, se agitó
mecánicamente cada carcasa con 100 ml de agua con peptona tamponada
(BPW) durante 1 min, y a continuación se recogió el agua de lavado.
Las muestras se diluyeron, enriquecieron, y se pasaron a placa sobre
agar XLT o Petrifilm (3M, Inc.; St. Paul, MN para placas de conteo
de aerobios totales) y se incubaron durante 18-24
horas a 37ºC. A continuación se contaron las unidades formadoras de
colonias. Se calculó el número de bacterias adheridas usando la
técnica del número más probable. Para cada carcasa se llevaron a
cabo los recuentos de números más probables de Salmonella y
de placas de aerobios totales usando la muestras de agua de lavado.
Se usó un análisis de la varianza para analizar los datos
experimentales para determinar cualquier diferencia significativa
entre los grupos de tratamiento y los controles (SAS / STAT Guía de
Usuarios, SAS Institute, Inc., Cary, NC 1993).
Los resultados de este experimento muestran que
la segunda pulverización de 30 y 90 segundos de la solución de 1000
ppm de CPC a presiones de 30, 50, y 120 psi (2,06 x 10^{5}; 3,44 x
10^{5} y 8,27 x 10^{5} N/m^{2}), producen una reducción
significativa en el número de Salmonella sobre carcasas de
pollo. Estos datos muestran que el procedimiento de pulverización es
un procedimiento alternativo viable al procedimiento estándar de
inmersión o baño de pollos cuando se pulveriza durante 30 segundos a
90 segundos con una presión en el intervalo de 30 a 120 psi (2,06 x
10^{5} a 8,27 x 10^{5} N/m^{2}), a una concentración de CPC
del 0,1%. Puede ser posible usar concentraciones más bajas de CPC
con presiones de pulverización variables dentro del intervalo
descrito de 30 a 120 psi (2,06 x 10^{5} a 8,27 x 10^{5}
N/m^{2}), o mayores y tiempos de pulverización variables para
obtener un procedimiento más eficiente con una reducción
significativa de los microorganismos transmitidos a través de los
alimentos. El procedimiento de pulverización sería ventajoso para
uso en procedimientos industriales debido a que se podrían rociar
muchas carcasas de pollo durante cortos períodos de tiempo, dando
sin embargo como resultado una reducción significativa de las
bacterias patógenas.
Se estudiaron los efectos del CPC sobre la
inhibición y reducción de S. typhimurium viable sobre piel de
pollo. Las soluciones de ensayo comprendían diversas concentraciones
de CPC (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) en glicerina al 5% (v/v)
en solución salina tamponada con fosfato 0,008 M, pH 7,2 (PBS). Las
soluciones salinas se prepararon disolviendo las cantidades
apropiadas de CPC en la mezcla de glicerina-PBS.
Los cuadrados de piel (2,5 x 2,5 cm) de pollos sin procesar, a
partir de baquetas recientemente congeladas, se esterilizaron
mediante una dosis de irradiación de 45 KGy (haz de electrones de un
acelerador lineal, Iowa State University). La fuente de S.
typhimurium fue la cepa ATCC # 14028 o la cepa NCTC # 12023).
Todos los recuentos de colonias se llevaron a cabo sobre placas de
agar de soja tripticasa (TSA; DIFCO, Detroit, MI) El almacenamiento
de Salmonella fue sobre TSA. La preparación del inóculo se
llevó a cabo como sigue. Un matraz que contenía 50 ml de caldo de
soja tripticasa se inoculó con S. typhimurium de una colonia
única y se incubó a continuación (37ºC) con agitación (150 rpm)
durante la noche. Una alícuota de 1 ml del cultivo se lavó con 9 ml
de PBS (4800 rpm, 10 min) dos veces. La torta se resuspendió en PBS
para obtener una concentración celular final
(espectrofotométricamente, 420 nm) de 1 a 2 x 10^{6} unidades
formadoras de colonias (CFU) por ml.
Se retiró la piel de pollo a partir de una
baqueta y se colocó con la parte de la epidermis hacia arriba en
cada pocillo de las placas de cultivo de tejido de seis pocillos.
Las piezas de piel se inocularon con 5 ml de PBS que contenía 1 a 2
x 10^{6} CFU de S. typhimurium por ml, con la excepción del
grupo de control del fondo que se trató sólo con 5 ml de PBS. Las
placas de cultivo con las piezas de piel se incubaron (30 min.,
35ºC), y a continuación, la solución de incubación se eliminó
mediante aspiración. Las pieles inoculadas se trataron con 5 ml de
la solución de ensayo. Se usaron lotes de tres piezas de piel por
cada concentración de la solución de ensayo, incluyendo un lote en
el que las pieles se trataron sólo con 5 ml de glicerina en PBS al
5% (v/v) (concentración 0). Las placas se incubaron a 25ºC con
agitación (100 rpm) durante 1, 3, o 30 min. Tras la incubación, cada
pieza de piel se lavó con aspiración (5 ml de PBS), se colocó en una
bolsa de plástico estéril que contenía 50 ml de peptona al 0,1%
(p/v), y se homogeneizó durante 2 minutos usando un mezclador de
laboratorio Stomacher® 400 (Seward Medical Co, Londres, Inglaterra).
Se cortó una esquina de la bolsa de manera aséptica y se
transfirieron los contenidos a un tubo de centrífuga estéril que se
hizo girar a continuación durante 10 min (12.000 rpm, 20ºC). La
torta se resuspendió en 5 ml de peptona / agua al 0,1% (p/v). Un ml
de la dilución apropiada se vertió en placa sobre agar TSA por
triplicado y se incubó a continuación a 37ºC durante 24 horas,
después de lo cual las se contaron las colonias, se corrigieron para
dilución, y se informaron como CFU / piel. Los resultados muestran
que la reducción de Salmonella fue dependiente sobre la
concentración de CPC y el tiempo de exposición. Se alcanzó una
descontaminación de casi 5 unidades logarítmicas tratando con
soluciones de CPC de 4000 y 8000 ppm para tiempos de contacto tan
bajos como 3 min.
Se colocaron los cuadrados de piel con la parte
de la epidermis hacia arriba en cada pocillo de las placas de
cultivo de tejido de seis pocillos. Las piezas de piel se trataron
con 5 ml de la solución de ensayo. Se usaron lotes de tres piezas de
piel por cada concentración de solución de ensayo, incluyendo un
lote en el que las pieles se trataron sólo con 5 ml de glicerina en
PBS al 5% (v/v) (concentración 0). Las placas de cultivo con las
piezas de piel se incubaron a 25ºC con agitación (100 rpm) durante
1, 3, o 10 min. La solución de incubación se eliminó mediante
aspiración, y las pieles se lavaron (5 ml PBS) y se incubaron a
continuación (30 min., 35ºC) con 5 ml de PBS que contenía 1 a 2 x
10^{6} CFU de S. typhimurium por ml. Tras la incubación,
cada pieza de piel se lavó con aspiración (5 ml de PBS), se colocó
en una bolsa de plástico estéril que contenía 50 ml de peptona al
0,1% (p/v), y se homogeneizó durante 2 minutos usando un mezclador
de laboratorio Stomacher® 400. Se vertieron en placa tres alícuotas
del homogenado (1 ml) y se incubaron a 37ºC durante 24 h y a
continuación se contaron las colonias, se corrigieron para dilución,
y se informaron como log_{10} CFU / piel. Los resultados indican
que la prevención de la contaminación por Salmonella mediante
pretratamiento con CPC mostraron también la concentración y el
tiempo de dependencia. Los efectos más marcados se observaron
durante tiempos de pretratamiento de 10 minutos cuando se mostró una
inhibición de la adhesión de Salmonella de 4,9 unidades
logarítmicas a una concentración de 8000 ppm. Este resultado es
importante debido a que la prevención de la contaminación cruzada es
de la mayor importancia en el procesamiento del alimento.
Los valores del log_{10} CFU / piel para los
controles estuvieron dentro del intervalo 4,61 a 5,03. Las
diferencias entre las muestras tratadas y los controles se
analizaron usando ANOVA seguido por el análisis de intervalo
múltiple de Newman - Keuls y fueron estadísticamente significativos
(p < 0,01).
En otro experimento de pulverización, se obtuvo
una reducción de la Salmonella de 3,3 unidades logarítmicas
tras 90 segundos de pulverización de las carcasas de pollo con una
solución de 5.000 ppm de CPC.
Se siguieron las etapas del Ejemplo 2 excepto en
que se usó L. Monocytogenes para inocular la piel de pollo y
el medio usado en la bolsa de plástico en el Stomacher 4000 contenía
peptona al 0,1% a concentraciones de CPCC de 2000 ppm o más altas,
hubo una reducción de más de 4 unidades logarítmicas en L.
monocytogenes.
Se siguieron las etapas del Ejemplo 3 excepto en
que se usó L. Monocytogenes para inocular la piel de pollo y
el medio usado en la bolsa de plástico en el Stomacher 400 contenía
peptona al 0,1%.Los resultados de este estudio muestran una
reducción del 82% de las bacterias adheridas a 50 ppm, una
reducción del 92% a 100 ppm, y una reducción del 100% a 5000 y 1000
ppm.
Se estudiaron los efectos del CPC sobre la
reducción de S. typhimurium viable sobre siluros, uvas
negras, y brécol. Las soluciones de ensayo comprendían diversas
concentraciones de CPC (Signa Chemical Co, St Louis, MO) en
glicerina al 5% (v/v) en solución salina tamponada con fosfato 0,008
M, pH 7,2 (PBS). Las soluciones se prepararon disolviendo las
cantidades apropiadas de CPC en la mezcla de glicerina - PBS. Las
muestras de alimento eran champiñones intactos pequeños, uvas negras
intactas pequeñas, florecillas de brécol, y cuadrados de piel de
siluro (2,5 x 2,5 cm) recortados de siluro descongelado de nuevo sin
procesar, las frutas y vegetales se consiguieron de una frutería
local, mientras que el pescado se envió congelado por un
suministrador de siluros local. La fuente de S. typhimurium
fue la cepa ATCC # 14028 o la cepa NCTC # 12023).
Todos los recuentos de colonias se llevaron a
cabo usando placas de agar XLD selectivo para la Salmonella
(DIFCO, Detroit, MI). De manera adicional, en los experimentos
con siluros, los recuentos de colonias aerobias se llevaron a cabo
usando un medio no selectivo, agar de soja tripticasa (TSA:DIFCO,
Detroit, MI). El almacenamiento de Salmonella fue sobre
TSA.
La preparación del inóculo para S.
typhimurium se llevó a cabo tal como se ha descrito en el
Ejemplo 7 anterior. Las muestras de alimento se colocaron en cada
pocillo de las placas de cultivo con seis pocillos. Las muestras se
inocularon a continuación con 5 ml de PBS que contenía 1 a 2 x
10^{6} CFU de S. typhimurium por ml, con la excepción del
grupo de control del fondo que se trató sólo con 5 ml de PBS. Las
placas de cultivo con las muestras de alimento se incubaron (30
min., 35ºC), y a continuación se eliminó la solución de incubación
mediante aspiración. Las muestras inoculadas se trataron con 5 ml de
solución de ensayo. Se usaron lotes de tres muestras de alimento por
cada concentración de solución de ensayo, incluyendo un lote en el
que las muestras de alimento se trataron sólo con 5 ml de glicerina
en PBS al 5% (v/v) (concentración 0). Las placas se incubaron a 25ºC
con agitación (100 rpm) durante 3 min. Tras la incubación, se
preparó cada muestra de alimento y se colocó en una bolsa de
plástico para uso con el mezclador de laboratorio Stomacher 400® tal
como se ha descrito en el Ejemplo 7 anterior. Se cortó de manera
aséptica una esquina de la bolsa y el contenido completo se
transfirió a un tubo de centrífuga estéril, que se hizo girar a
continuación a 12.000 rpm, 20ºC). La torta se resuspendió en 5 ml de
peptona / agua al 0,1% (p/v). Se vertió en placa un ml de la
dilución apropiada sobre agar XLD y agar TSA para el siluro por
triplicado. Tras la incubación a 37ºC durante 24 horas, se contaron
las colonias, se corrigieron para dilución, y se informaron como CFU
/ piel para el siluro y como CFU / gramo para las otras muestras de
alimento. En las Figs. 2-5 se muestran los
resultados de estos experimentos. Como el siluro no se había
irradiado, la Fig 2 muestra el recuento de bacterias aerobias
totales sobre medio no selectivo mientras que la Fig 3. muestra sólo
los recuentos de Salmonella.
Estos experimentos ensayaron el efecto que la
pulverización de QAC sobre carcasas de pollos enteros usando un
pulverizador comercial podría tener sobre la reducción de las
bacterias viables. Las soluciones de inoculación bacteriana fueron
hechas como sigue: Se hizo crecer E. coli (ATTC # 25922) en
caldo infusión corazón cerebro (BHI) durante 20-24 h
y a continuación se diluyó a una concentración 1:1000 añadiendo 0,5
ml de cultivo de E. coli en 500 ml de solución salina
fisiológica (PSS). La solución de tratamiento con CPC se preparó a
una concentración de 5.000 ppm. Las carcasas de pollo preenfriado se
obtuvieron de una planta de procesamiento de aves de corral local
para cada ensayo. Las carcasas se colocaron sobre una línea de
cadena y se pulverizó 1 ml de la solución de inoculación bacteriana
sobre la pechuga de la carcasa, y se pulverizó 1 ml sobre el
trasero. Se dejó adherirse a las bacterias durante 30 min a
temperatura ambiente. Tras la adhesión se lavaron las carcasas sobre
la línea de cadena con agua corriente durante 30 segundos. Las
carcasas se dividieron en dos grupos de diez. Para cada prueba hubo
un grupo de diez pollos que se rociaron sólo con agua corriente pero
para S. typhimurium, hubo también un grupo que no se
pulverizó tras la inoculación para evaluar el efecto del
pulverizado.
Para todas las bacterias, un grupo de carcasas se
trató con el lavador de Johnson^{TM} durante 20 segundos a 60 psi
(4,12 x 10^{5} N/m^{2}), con 35 vasos de agua corriente. Tras el
lavado las carcasas se dejaron reposar durante 90 segundos, y a
continuación se lavaron con 20 vasos de agua corriente durante 20
segundos a 80 psi (5,51 x 10^{5} N/m^{2}). Este ciclo de lavado
se repitió dos o tres veces. El intervalo de cada lavado fue también
de 90 segundos. Otro grupo de carcasas se trató con 5.000 ppm de CPC
durante 20 segundos a 60 psi (4,12 x 10^{5} N/m^{2}) en el
lavador de Johnson^{TM}, a continuación se dejó reposar durante 90
segundos, y a continuación se lavó con 20 vasos de agua corriente
durante 20 segundos a 80 psi (5,51 x 10^{5} N/m^{2}). Este ciclo
de lavados se repitió dos o tres veces.
Tras el tratamiento las carcasas se colocaron en
bolsas de plástico y se añadieron a cada bolsa 100 ml de agua de
peptona tamponada al 0,1% (BPW). Las bolsas se agitaron
mecánicamente y el lavado se recogió para la técnica del número más
probable (MPN). Se empleó también Petrifilm^{TM} para la
evaluación de los recuentos de placas de aerobios totales (TPC). Se
enumeró el C. jejuni preexistente (no inoculado) mediante la
técnica del MPN y el E. coli mediante el
Petrifilm^{TM}.
Los resultados presentados a continuación
muestran que el tratamiento con CPC es efectivo reduciendo el número
de C. jejuni, E. coli, y S. typhimurium. Se
ensayó el agua de lavado para la S. typhimurium y se encontró
que el CPC en el agua de lavado redujo la Salmonella en una
unidad logarítmica.
| Bacterias presentes | ||||
| Agua | 5.000 ppm de CPC | Reducción en Log_{10} | ||
| Control | ||||
| C. jejuni | Ensayo 1 | 2,613 | 0 | 2,613 |
| Ensayo 2 | 2,643 | 0,629 | 2,014 | |
| E. coli | Ensayo 1 | 1,974 | 0,386 | 1,588 |
| Ensayo 2 | 1,380 | 0,460 | 0,920 |
\vskip1.000000\baselineskip
| S. typhimurium | Sin control de | Control de | 5.000 ppm | Reducción en Log_{10} de CFU | |
| pulverización | pulverización | de CPC | |||
| Sin pulverización | Pulverización frente | ||||
| frente a tratamiento | a tratamiento con | ||||
| con CPC | CPC | ||||
| 1 (02/12/96) | 5,342 | 5,039 | 4,295 | 1,047 | 0,744 |
| 2 (09/12/96) | 5,304 | 4,932 | 1,977 | 3,327 | 2,955 |
| 3 (16/12/96) | 5,001 | 5,154 | 2,606 | 2,395 | 2,548 |
| 4 (27/01/67) | 4,72 | 4,48 | 1,03 | 3,69 | 3,45 |
| 5 (03/02/97) | 4,185 | 4,212 | 1,426 | 2,76 | 2,79 |
Este estudio ensayó el efecto del CPC sobre los
hongos transmitidos a través de los alimentos. Los cultivos
inclinados de Aspergillus flavus y Penicillium
chrysogenum se sembraron en superficie sobre placas de agar
dextrosa patata (PDA). Treinta minutos después de la inoculación 0
24 h después de la inoculación (e incubación a temperatura
ambiente), se colocaron dos filtros redondos (7 mm de diámetro)
sobre la superficie de cada placa. Se añadieron soluciones con CPC
de 200 ppm, 1000 ppm, 5000 ppm, y 25.000 ppm o agua destilada y
desionizada a los filtros, 10 \mul por filtro. Todas las placas se
incubaron con la tapa levantada a temperatura ambiente durante 48
horas. Se midieron los diámetros de los anillos de inhibición. Los
resultados presentados a continuación muestran que el CCPC es
efectivo frente a los hongos transmitidos a través de los
alimentos.
\newpage
| Efecto del CPC sobre Aspergillus flavus | ||
| Concentración de CPC | Anillo de inhibición (mm) | |
| Tratamiento inmediato | Tratamiento retardado | |
| 25.000 | 1,63 | 1,00 |
| 5.000 | 2,00 | 0,92 |
| 1.000 | 0,38 | 1,00 |
| 200 | 0,25 | 0,33 |
| 0 | 0 | 0 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Efecto del CPC sobre Penicillium chrysogenum | ||
| Concentración de CPC (ppm) | Anillo de inhibición (mm) | |
| Tratamiento inmediato | Tratamiento retardado | |
| 25.000 | 4,13 | 1,83 |
| 5.000 | 3,38 | 1,92 |
| 1.000 | 1,00 | 1,67 |
| 200 | 0 | 1,17 |
| 0 | 0 | 0 |
El CPC es efectivo frente a los hongos
transmitidos a través de los alimentos ensayados.
Cuando se usa una composición en un procedimiento
industrial, es preferible trabajar solo con pequeños volúmenes de
líquidos concentrados en lugar de con grandes volúmenes de
soluciones líquidas. Se ha desarrollado una formulación de QAC que
permite concentraciones de QAC hasta 1000 veces que las que están
disponibles en la actualidad en formulaciones realizadas únicamente
con agua. Esta formulación que contiene al menos un agente mejorador
de la solubilidad proporciona un concentrado soluble de fácil
dilución en la concentración final para uso a gran escala en
procesamiento industrial. El agente mejorador de la solubilidad
funciona para mantener la solubilidad del QAC de manera que no
precipite fuera de la solución. Se puede usar cualquier agente de
solubilidad compatible pero se prefieren el alcohol etílico o la
glicerina. La formulación puede contener alcohol etílico, glicerina
o ambos. Esta formulación contiene aproximadamente 100.000 ppm a
aproximadamente 300.000 ppm de QAC, aproximadamente 0% a
aproximadamente 49% de alcohol etílico y aproximadamente 0 a
aproximadamente 20% de glicerina en agua. Una formulación preferida
contiene aproximadamente 150.000 ppm a aproximadamente 250.000 ppm
de QAC, aproximadamente 10% a aproximadamente 40% de alcohol etílico
y aproximadamente 0,5% a aproximadamente 10% de glicerina en agua.
De manera más preferible, la concentración de alcohol etílico puede
oscilar entre aproximadamente 15% a aproximadamente 30% y la
concentración de glicerina puede oscilar entre aproximadamente 0,5 a
aproximadamente 5%. De manera preferible, esta formulación contiene
aproximadamente 200.000 ppm de QAC, aproximadamente 20% de alcohol
etílico, y aproximadamente 1% de glicerina. Esta formulación es
particularmente útil como un concentrado que se va a añadir en los
tanques de almacenamiento para uso en un tratamiento de inmersión de
productos alimenticios con QAC pero es también útil en un
procedimiento de pulverización a una concentración final de
aproximadamente 5.000 ppm de QAC.
Se desarrolló una segunda formulación para
aumentar el tiempo de contacto de una solución de QAC sobre
productos alimenticios durante el procesamiento, de manera
particular cuando se liberó mediante un procedimiento de
pulverización. Esta formulación permite potencialmente un tiempo de
contacto más largo del QAC con el producto sin cualquier etapa
adicional que pudiera incrementar el tiempo de procesamiento. La
formulación, en virtud de sus propiedades aumenta potencialmente la
efectividad antimicrobiana del procedimiento. Esta formulación
contiene de manera preferible aproximadamente 50 ppm a
aproximadamente 20.000 ppm de QAC, y al menos una de un agente
mejorador de la solubilidad seleccionado entre aproximadamente 0 a
aproximadamente 10% de alcohol etílico, y aproximadamente 0 a
aproximadamente 20% de glicerina o ambos. De manera más preferible,
esta formulación contiene aproximadamente 50 ppm a aproximadamente
50 ppm a aproximadamente 5.000 ppm, aproximadamente 0 a
aproximadamente 10% de alcohol etílico, y aproximadamente 1,0% a
aproximadamente 10% de glicerina en agua. De manera más preferible
esta formulación contiene aproximadamente 500 ppm a aproximadamente
5.000 ppm de QAC, 0 a 10% de alcohol etílico y aproximadamente 1,0 a
aproximadamente 5% de glicerina en agua y de manera más preferible
aproximadamente 1,0 a aproximadamente 3% de glicerina.
La descripción anterior de las formas de
realización preferidas de la presente invención se presentó con
objetivos ilustrativos y no se pretende que limite la invención a
las composiciones específicas usadas en los ejemplos debido a que
son posibles diversas modificaciones en la invención descrita a la
luz de las anteriores enseñanzas. La presente invención se basa en
el descubrimiento que el QAC evita y reduce significativamente la
contaminación bacteriana por un amplio espectro de contaminación
microbiana transmitida a través de los alimentos que se conocía
anteriormente.
Claims (14)
1. Un procedimiento para evitar el crecimiento de
microorganismos en un producto alimenticio que comprende:
poner en contacto el mencionado producto
alimenticio con una cantidad efectiva de un compuesto de amonio
cuaternario que inhibe el crecimiento microbiano durante menos de 5
minutos para evitar el crecimiento de los microorganismos sobre el
producto alimenticio, en el que el mencionado compuesto de amonio
cuaternario se selecciona entre el grupo constituido por una sal de
alquilpiridinio representada mediante la fórmula estructural
(I):
en la que n es
9-21; y X es un
haluro,
una sal de tetra-alquilamonio
representada mediante la fórmula estructural (II):
en la que n es
9-21; R se selecciona entre el grupo constituido por
CH_{3} y C_{2}H_{5}; y X es un haluro,
y
una sal alquialicíclica de amonio representada
mediante la fórmula estructural (III):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que n es
9-21; Z es 4-5; R se selecciona
entre el grupo constituido por CH_{3} y C_{2}H_{5}; y X es un
haluro.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que la puesta en contacto se produce durante 1 minuto.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que la puesta en contacto se produce entre 20 segundos y 90
segundos.
4. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el producto alimenticio se
selecciona entre el grupo constituido por carne de vacuno, aves de
corral, alimentos marinos, vegetales y fruta.
5. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el mencionado compuesto de amonio
cuaternario es una sal de alquilpiridinio.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el
que la mencionada sal de alquilpiridinio es cloruro de cetil
piridinio.
7. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la mencionada cantidad efectiva de
compuesto de amonio cuaternario oscila entre 50 y 20.000 partes por
millón.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el
que la mencionada cantidad efectiva de compuesto de amonio
cuaternario oscila entre 500 y 5.000 partes por millón.
9. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la mencionada puesta en contacto
comprende la inmersión del mencionado producto alimenticio en el
mencionado compuesto de amonio cuaternario.
10. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la mencionada puesta en contacto
comprende rociar el mencionado producto alimenticio con el
mencionado compuesto de amonio cuaternario.
11. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que el mencionado microorganismo es
una bacteria, hongo o parásito.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que la mencionada bacteria se selecciona entre el grupo
constituido por Salmonella, Staphylococcus, Campylobacter,
Arcobacter, Listeria, Aeromonas, Bacillus, Escherichia no productora
de toxinas, y Escherichia productora de toxinas patógenas.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que la mencionada Escherichia productora de toxinas patógenas es
Escherichia coli O157:H7.
14. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la puesta en contacto se produce durante aproximadamente 3
minutos, el producto alimenticio es un ave de corral y el compuesto
de amonio cuaternario es cloruro de cetil piridinio.
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