ES2247860T3

ES2247860T3 - Metodo para estimular el crecimiento en animales acuaticos usando hormonas de crecimiento.

Info

Publication number: ES2247860T3
Application number: ES99966582T
Authority: ES
Inventors: Leonard Sonnenschein
Original assignee: GroFish LLC
Current assignee: GroFish LLC
Priority date: 1999-05-06
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2019-12-22
Also published as: EP1178813B1; CA2373130C; CA2373130A1; WO2000067763A1; EP1178813A4; US6238706B1; AU2209300A; EP1178813A1; DE69926663D1; MXPA01011365A; ATE301464T1

Abstract

Un método para administrar hormonas de crecimiento a animales acuáticos comprendiendo las fases de: (a) choquear osmóticamente los animales acuáticos con una solución osmótica salina; (b) colocar los animales acuáticos choqueados en un depósito de tratamiento que contiene una solución de hormonas de crecimiento; y (c) colocar los animales acuáticos en un estado de animación suspendida durante un predeterminado periodo de tiempo mientras los animales acuáticos se hallen en el depósito de tratamiento, siendo los animales acuáticos tratados únicamente una vez.

Description

Método para estimular el crecimiento en animales acuáticos usando hormonas de crecimiento.

Este invento hace referencia a la acuicultura, y, de modo particular, al uso de hormonas de crecimiento, especialmente somatotropina bobina (bST) para mejorar la velocidad a que crecen los animales acuáticos.

Antecedentes de la técnica

Los peces son una fuente de alimentación reconocida. La demanda mundial de pescados obtenidos en ambiente natural nos ha llevado a un fenómeno de crecimiento en la acuicultura industrial. Hay peces por todo el mundo, y pueden resultar bastante económicos allá donde existen en cantidad. Si los peces pudieran crecer más rápidamente, los peces crecidos en piscicultoras podrían recolectarse más rápidamente que en la actualidad. Esto podría aumentar el suministro de peces y por tanto reducir el coste de los peces para los consumidores, así como reducir la amenaza de la pesca excesiva de poblaciones salvajes y los efectos sobre el medio ambiente de dicho exceso de pesca. Se ha llevado a cabo una considerable cantidad de investigación con animales acuáticos, y, en particular, con métodos o tratamientos para aumentar la tasa de crecimiento de animales acuáticos. Parte de dicha investigación ha sido dirigida al uso de hormonas de crecimiento (incluyendo bST) y a los métodos para administrar hormonas de crecimiento a los peces. Se han inyectado peces con hormonas de crecimiento y también se han sumergido en soluciones de hormonas de crecimiento. Dada la configuración de los músculos y piel de los peces, realmente no se cierra la piel en el lugar de la inyección, y las hormonas inyectadas subdérmicas e intramusculares simplemente pueden salir del pez. Por tanto, la inyección de bST dentro del pez no ha sido un método adecuado para administrar hormonas de
crecimiento.

Conozco dos estudios en que los peces eran tratados con hormonas de crecimiento: (1) Growth Stimulation of Juvenile Salmonids by Immersion in Recombinant Salmon Growth Hormone [Estimulación del crecimiento de salmónidos jóvenes mediante inmersión en hormona de crecimiento de salmón recombinante], Moriyama y otro, Nippon Suisan Gakaishi, 56 (1):31-34 (1990); y (2) Experimental Administration of Recombinant Bovine Growth Hormone To Juvenile Rainbow Trout (Salmo Gairdneri) By Inyection Or By Immersion [Administración experimental de hormona de crecimiento bobina recombinante a truchas arco iris jóvenes (Salmo Gairdneri) por inyección o por inmersión], Shulte y otro, Aquaculture, 76:145-156 (1989). Ambos estudios utilizan bajos niveles de hormonas de crecimiento. En el primer estudio, los peces fueron sumergidos en una solución que contenía 30 mg/l de BSA; en el último estudio, los peces fueron inyectados con 10 \mug de hormonas de crecimiento por gramo del peso corporal. El método descrito en el último estudio (Schulte y otro) no muestra una marcada diferencia entre los grupos tratado y de control. En el primer estudio, los autores llegan a la conclusión de que la inmersión en rsGH puede ser útil como método de administración GH (hormona de crecimiento) a fin de acelerar el crecimiento de los peces en acuicultura. Sin embargo, todavía se pueden conseguir avances en la administración de hormonas de crecimiento a los peces, particularmente en la manera de administrar la hormona de crecimiento para mejorar o acelerar el crecimiento de los peces.

Se describe otro estudio en DATABASE BIOSIS (Online) BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; 1995 XU BIN GE GUO, CHANG MAIO HONG-ZHI: "Los efectos de la hormona de crecimiento recombinante de anguila, metiltestosterona y L-tiroxina en el crecimiento de sargos del Mar Rojo, Pagrasomus major". Acceso a la base de datos núm. PREV199698789436 XP002228975. En este estudio se investigaron "Los efectos de hormona de crecimiento recombinante de anguila, metiltestosterona y L-tiroxina en el crecimiento de sargos del Mar Rojo, Pagrasomus major". La administración de reGH a las crías por inmersión en 2 mg/l durante 2 h cada 5 días dio como resultado un aumento significativo tanto del peso como de la longitud, pero el factor condicionante (CF) se reducía con respecto al de los peces de control de tratados de manera similar durante el periodo de tratamiento de 37 días.

Se describe otro estudio en "Experimental Administration of Recombinant Bovine Growth Hormone to Juvenili Rainbow Trout (Salmo Gairdneri) by Injection or by Immersion" (Administración experimental de hormona de crecimiento recombinante bobina a truchas arco iris (Salmo Gairdneri) por inyección o por inmersión), por Schulte y otro, Aquaculture, 76/100-00, págs. 145-156. La administración de rbGH-21K por inmersión a una dosis de 100 mg/l durante 4 h cada 5 días dio como resultado un significante aumento de la velocidad específica de crecimiento con relación a los peces de control tratados similarmente durante un periodo de tratamiento de 8 semanas.

Resumen del invento

Un método para la administración de hormonas de crecimiento a animales acuáticos comprende las fases que figuran en la reivindicación 1.

Cuando se sumerge en la solución de hormonas de crecimiento, el material acuático traga la solución y la hormona de crecimiento es absorbida a través del intestino del animal en lugar de a través de su piel, músculos o agallas. La administración de hormonas de crecimiento a los animales acuáticos se cree que aumenta el metabolismo de los animales y por tanto estimula el crecimiento. La mayor velocidad de crecimiento se consigue usando productos naturales (o copias sintetizadas de productos naturales). El fenotipo genético o consistencia celular del animal acuático no se altera.

La solución de hormonas de crecimiento (o solución de tratamiento) contiene 3-3000 mg de hormonas de crecimiento por litro. Preferiblemente, la solución contiene 150.450 mg y más preferentemente 300 mg de solución de hormonas de crecimiento por litro. Las hormonas de crecimiento es bST, aun que también funcionarían igualmente otras hormonas de crecimiento citadas. Adicionalmente, la solución de tratamiento incluye por lo menos cierta sal para hacer la solución por lo menos algo salina. La solución de hormonas de crecimiento está supersaturada con oxígeno a fin de permitir tratar los animales acuáticos durante periodos de tiempo más largos. Esto coloca al animal acuático en un estado de animación suspendida. Antes de sumergir el animal acuático en la solución de hormonas de crecimiento, los animales acuáticos son choqueados osmóticamente en una solución salina hiperosmótica de más alta concentración. La salinidad de la solución de choque depende del animal acuático que debe choquearse. La salinidad de la solución de tratamiento es preferiblemente alrededor de la mitad de la solución de choque. La solución de hormonas de crecimiento, en función del animal acuático a tratar, puede ser refrigerada. Los animales acuáticos son sumergidos en la solución de tratamiento durante un periodo de dos minutos a seis horas. Preferiblemente, el tiempo de inmersión es de 30 minutos a 2 horas, y más preferiblemente alrededor de una a una hora y media. Una vez terminado el periodo de tratamiento, la temperatura del animal acuático aumenta lentamente hasta la temperatura ambiente, por ejemplo, graduando la solución de hormonas de crecimiento con agua caliente.

Preferiblemente los animales acuáticos son tratados en cualquier momento hasta unos seis meses de edad. Sin embargo, preferentemente los animales acuáticos son tratados cuando son jóvenes, es decir cuando tienen menos de nueve días de edad, y más preferiblemente cuando tienen menos de veinticuatro horas de vida.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico que muestra los resultados del tratamiento de lobina rayada híbrida;

La figura 2 es un gráfico que muestra los resultados del tratamiento de siluro del canal de acuerdo con el presente invento;

La figura 3 es un gráfico que muestra los resultados del tratamiento de camarones de acuerdo con el presente invento;

La figura 4 es un gráfico que muestra los resultados del tratamiento de lobina, cuando las lobinas son sonicadas durante la inmersión en la solución de hormonas de crecimiento;

Las figuras 5A y 5B son gráficos que muestran el peso y la longitud de carpas de hierba tratadas con una solución de 300 mg de hormonas de crecimiento por litro;

Las figuras 6A y 6B son gráficos que muestran el peso y la longitud de camarones tratados con una solución con 300 mg de hormonas de crecimiento por litro;

Las figuras 7A y 7B son gráficos que muestran el efecto del tratamiento de siluros embriónicos con soluciones de 30 mg y 300 mg de hormonas de crecimiento por litro de agua;

Las figuras 8A y 8B son gráficos que muestran el peso y la longitud de siluros, con peces tratados una vez, dos veces, como crías, y como peces más viejos; el gráfico también muestra el efecto de limitar la toma de alimentos del pez;

La figura 9 es un gráfico que muestra el peso de lobinas, en que las lobinas se somete a diferentes tiempos de inmersión y a diferentes dosis de solución de hormonas de crecimiento;

Las figuras 10A y 10B son gráficos que muestran el peso y longitud de siluros tratados con altos niveles de hormonas de crecimiento;

La figura 11 es un gráfico que muestra el aumento de peso de salmón coho tratado respecto al salmón coho sin tratar;

La figura 12 es una fotografía tomada en octubre de 1999 comparando el tamaño de los peces de control y de los peces tratados con 3 gm bST por litro, y mostrando que los peces tratados tenían un tamaño notablemente distinto de los peces de control, cuyo crecimiento aparece en los gráficos de las figuras 10A y 10B;

La figura 13 es una fotografía tomada en octubre de 1999 de la lobina rayada híbrida de control y tratada durante 1,5 hora en soluciones de 30 mg bST litro y 300 mg bST litro, cuyo crecimiento aparece en el gráfico de la figura 9;

La figura 14 es una fotografía tomada en octubre de 1999 de la lobina rayada híbrida de control y tratada durante 1 hora en soluciones de 30 mg bST litro y 300 mg bST litro, cuyo crecimiento aparece en el gráfico de la figura 9;

La figura 15 es una fotografía tomada en octubre de 1999 de la carpa de hierba, de control y tratada, cuyo crecimiento aparece en los gráficos de las figuras 5A y 5B;

La figura 16 es una fotografía tomada en octubre de 1999 del siluro, de control y tratado, cuyo crecimiento aparece en los gráficos de las figuras 7A y 7B; y

La figura 17 es una fotografía tomada en octubre de 1999 del pez de control, el pez tratado una vez, y el pez tratado dos veces, cuyo crecimiento aparece en los gráficos de las figuras 8A y 8B.

Mejor modo de llevar a cabo el invento

La siguiente descripción detallada explica el invento a modo de ejemplo. Dicha descripción permitirá conocer claramente, a alguien entendido en la materia, el uso del invento, y describe lo que actualmente creo es la mejor manera de la puesta en practica del invento.

El método de tratar animales acuáticos con hormonas de crecimiento, a saber bST, fue estudiado en relación con la lobina rayada híbrida, siluro del canal, langostinos de agua dulce, camarones, carpa y salmón, tal como se indicará más adelante. Creo que el tratamiento funcionará igual de bien con otros animales acuáticos. Por ejemplo, el tratamiento debe funcionar con Tilapia y otras especies de lobinas, otras especies de carpa, otros invertebrados, tales como langostas, cangrejos, orejas marinas, etc., y otras especies de vertebrados acuáticos, tales como anfibios. El tratamiento comprende la inmersión del animal acuático en una solución de bST durante un periodo de tiempo. La concentración de bST en la solución variaba desde 3 mg/l a 3000 mg/l, preferiblemente alrededor de 150 mg/l a unos 450 mg/l, y más preferiblemente entorno de 300 mg/l. El tiempo de inmersión del animal acuático en la solución variaba de aproximadamente 2 minutos a alrededor de 6 horas; preferiblemente de unos 30 minutos a alrededor de 180 minutos; y más preferentemente, de unos 60 minutos a 120 minutos. La solución bST estaba supersaturada con oxígeno para colocar el animal acuático en animación suspendida mientras se sumergían en la solución bST. La solución del tratamiento incluía cierto NaCl, de manera que la solución bST fuera por lo menos algo salina. Diferentes animales acuáticos responden de manera distinta a la temperatura y salinidad del agua. Por tanto, los protocolos para diferentes animales acuáticos debían variarse teniendo esto en cuenta. Estudios estadísticos realizados de los datos donde era evidente cambiar utilizando un test T de evaluación indicaban que los datos eran estadísticamente significativos para el cambio debido al tratamiento, con un p<0,05.

Adicionalmente, antes de colocar los animales acuáticos (salvo para camarones y langostinos) en la solución de tratamiento, los animales acuáticos fueran choqueados osmóticamente colocándolos en una solución salina hiperosmóptica. La solución salina utilizada para choquear osmóticamente el animal acuático tiene normalmente una salinidad de aproximadamente doble de la salinidad que tiene la solución del tratamiento. Tal como se ha dicho antes, los camarones y langostinos se recibían en soluciones salinas, y por tanto ya estaban choqueados osmóticamente.

Procedimiento básico de tratamiento para lobinas, carpas y langostinos

El tratamiento para la lobina rayada híbrida comprendía choquear osmóticamente los peces por inmersión en una solución salina hiperosmótica fría (aproximadamente 7,2ºC)(45ºF)) durante unos 120 segundos. La solución salina tenía aproximadamente 0,375-1,5 M NaCl, y preferiblemente alrededor de 1,5 M NaCl. Se sumergían en la solución bST (aproximadamente 300 mg bST/l) durante alrededor de una hora. La solución bST se enfriaba (aproximadamente 7,2ºC)(45ºF)). También era ligeramente salina, siendo dicha solución de aproximadamente 0,15-0,75 M NaCl (y preferiblemente entorno a 0,75 M NaCl). Para la lobina rayada híbrida, la salinidad de la solución bST era menor que la salinidad de la solución de choque. El deposito de tratamiento estaba cerrado, y mientras los peces se encontraban dentro del depósito de tratamiento se producían burbujas de oxígeno en el depósito, de manera que el agua estaba supersaturada con oxígeno. Algunos peces únicamente se trataban una vez y otros eran tratados dos veces. Mientras otros peces eran tratados cada dos semanas. Después de cada sesión de tratamiento, los peces eran colocados en depósitos de tratamiento, cuyas temperaturas eran aproximadamente iguales a la temperatura ambiente del entorno del depósito.

Los siluros eran sumamente susceptibles a la temperatura y salinidad de la solución en la que se mantenían. Si la solución era demasiado fría y/o excesivamente salada, los peces morían. Por tanto, el protocolo para el siluro tenía que modificarse con respecto al protocolo para la lobina rayada, teniendo en cuenta la susceptibilidad del siluro a la salinidad y temperatura. El tratamiento del siluro comprendía choquear osmóticamente los siluros sumergiéndolos en una solución salina a temperatura ambiente, durante 2 minutos. La solución de choqueo tenía aproximadamente 0,75 M NaCl. Luego, se trasladaban los peces a depósitos de tratamiento, en los cuales se sumergían los peces en la solución bST a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora. La solución bST contenía aproximadamente 300 mg bST/l, tenía alrededor de 0,374 M NaCl, y estaba supersaturada con oxígeno.

Los langostinos fueron recibidos en una solución salina fría que tenía una densidad de 1,002 y una temperatura de 7,2-12,8ºC (45-55ºF). Por tanto, una vez recibidos los langostinos se colocaron directamente en la solución bST, en un simple tratamiento para un periodo de una hora. La solución bST era más salada que la solución en la que se recibieron los langostinos. En este caso, la solución de tratamiento contenía alrededor de 300 mg/l bST, tenía una densidad de 1,010, una temperatura de aproximadamente 7,21C (45ºF) y estaba supersaturada con oxígeno.

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Ejemplo 1

(No forma parte del invento)

Tratamiento de la lobina rayada híbrida

El protocolo para tratar la lobina rayada híbrida comprendía choquear osmóticamente los peces con una solución salina osmótica refrigerada, durante unos 120 segundos. La solución salina tenía alrededor de 1,5M NaCl. La temperatura de la solución salina era de aproximadamente 7,2ºC (45ºF). Los peces choqueados fueron luego transferidos a un depósito que contenía una solución refrigerada de hormonas de crecimiento. Preferiblemente, se empleó somatrotropina bovina (bST) y se hallaba en un contenedor salino normal (aproximadamente 0,75 M NaCl). La solución contenía alrededor de 300 mg bST/l. El depósito de bST estaba cerrado, y la solución de bST en el depósito, con los peces en su interior, estaba supersaturada con oxígeno, haciendo burbujear el oxígeno en la solución. Se cree que la supersaturación del agua con oxígeno coloca los peces en un estado de animación suspendida, y permite tratar los peces durante más largos periodos de tiempo. Los peces permanecen en la solución de bST refrigerada y oxigenada durante aproximadamente una hora. Una vez concluido el periodo de tratamiento (es decir, al cabo de aproximadamente una hora), la temperatura de la solución bST se aumentó lentamente hasta alcanzar la temperatura ambiente. Preferiblemente, esto se hizo durante un periodo de quince minutos, tratando la solución bST con agua más caliente (temperatura ambiente). No puede incrementarse la temperatura del agua con excesiva rapidez, y se hizo que el agua alcanzara la temperatura ambiente normal (20ºC)(68ºF) a una velocidad de aproximadamente 0,85ºC minuto (1,5ºF por minuto). Este procedimiento de tratamiento fue llevado a cabo aproximadamente cada dos semanas durante 10,5 semanas. Tal como puede verse en la figura 1 y la Tabla 1 a continuación, el tratamiento dio como resultado un notable incremento de la velocidad de crecimiento de los peces, en comparación con un grupo de peces de
control.

Se dividieron los lobinos rayados híbridos en cinco categorías: (1) un grupo de control en que el agua estaba caliente (30-33,3ºC) (86-92ºF); (2) un grupo tratado con bST, como se ha indicado antes, en que el agua estaba caliente (30-33,3ºC) (86-92ºF); (3) un grupo tratado con bST y NovAqua® y en que el agua estaba caliente; (4) un grupo de control en que el agua se mantuvo a temperatura ambiente (es decir, aproximadamente a 22,2ºC (72ºF); y (5) un grupo tratado con bST en que el agua se mantuvo a temperatura ambiente (es decir, aproximadamente a 22,2ºC (72ºF). El NovAqua® es un acondicionador de agua suministrado por la división Kordon de Novalek de Hayward, California, el cual contiene un sistema tampón, polímeros sintéticos, agentes de reducción (declorizadores), electrolitos y estabilizadores. Proporciona un revestimiento coloidal sobre el cuerpo de los peces. Se sabe que el NovAqua® combate, e interfiere, la unión de bST a los peces. Por tanto, el NovAqua® debe evitar que bST afecte el crecimiento de los peces. El tercer grupo media el efecto del choque osmótico y la inmersión en agua supersaturada con oxígeno sobre el crecimiento de los peces. Tal como puede verse en la siguiente Tabla 1, los peces tratados tanto con bST como con NovAqua crecieron sustancialmente a la misma velocidad que los peces de control. Esto pone de manifiesto que el crecimiento de los peces tratados con bST era debido al bST, y que el choque osmótico y el agua supersaturada con oxígeno no debe atribuirse, en si mismos, a la mejor velocidad de crecimiento de los peces. Adicionalmente, puede verse, de los datos y el gráfico de la figura 1, que los peces mantenidos en agua más caliente crecen más rápidamente que los peces en el agua más fría. El grupo de control tenía 40 peces y los grupos de bST y bST+ NovAqua tenían 5 peces cada uno. Los pesos de los peces fueron controlados durante 10,5 semanas. Los peces fueron tratados cada dos semanas, y entre los tratamientos, se mantuvieron los peces en depósitos de mantenimiento.

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TABLA 1 Peso medio de la lobina rayada híbrida en gramos

	Baño de agua caliente	Agua a temp.ambiente
	(30-33,3ºC)(86-92ºF)	(\sim22,2ºC)(\sim72ºF)
Semana	Control	bSt	bSt+NovAqua	Control	bST tratado
0	1,96	1,96	1,96	0	0
2	3,9	4,5	4,1	0	0
4	6,9	7,9	6,8	1,9	2,3
6	8,1	10,3	8	1,9	2,7
9	21,2	29,8	21,2	4,9	8,5
10,5	28,2	38,2		6,7	10,9

Los peces en el grupo de control crecen aproximadamente 1339%, mientras que los peces tratados con bST crecen entorno del 1849%. Al final de las 10,5 semanas, los peces tratados con bST eran 355% más pesados que los peces del grupo de control. Los análisis de resultados utilizando los datos tenían un significado estadístico de p<0,05.

Durante las 6 primeras semanas del experimento, los peces estaban alojados en depósitos de mantenimiento interiores. A la semana 6 (que fue a principios de agosto en St. Louis, Missouri, EE.UU), se trasladaron los peces a depósitos de mantenimiento exteriores. Tal como puede verse en la figura 1 (que muestra el gráfico de los datos de la Tabla 1), a la semana 6, los peces empezaron a crecer a mucha mayor velocidad que en las semanas anteriores. Se cree que ello es debido al hecho de que el agua de los depósitos de mantenimiento exteriores era más caliente que el agua de los depósitos de mantenimiento interiores. La temperatura ambiente de verano en el exterior (26,7-28,9ºC) (80-84ºF) se cree ha sido una temperatura idónea para el crecimiento de los peces, y tal como puede verse, la velocidad de crecimiento tanto de los peces de control como de los peces tratados con bST fue mucho más rápida que en las seis primeras semanas, cuando los peces estaban en los depósitos de mantenimiento interiores.

Ejemplo 2 Tratamiento de siluros del canal

Los siluros del canal fueron tratados de manera algo similar a los lobinos rayados híbridos. Se retiraron los peces de sus depósitos de mantenimiento y choquearon osmóticamente con una solución de 0,75M de NaCl durante aproximadamente dos minutos. La solución de choque estaba a temperatura ambiente, normalmente alrededor de 21,2-26,7ºC (70-80ºF). Los siluros fueron luego trasladados a la solución de tratamiento de bST. La solución tenía 300 mg de bST/l y era de 0,375 M de NaCl. La solución de bST también se encontraba a temperatura ambiente. Los siluros fueron sumergidos en la solución de bST durante aproximadamente una hora. Igual como con la lobina rayada, el depósito de bST estaba cerrado, y la solución de bST en el depósito, conteniendo los peces, se supersaturó con oxígeno para poner los peces en un estado de animación suspendida.

Los peces fueron pesados y tratados en la semana 0. Se mantuvieron los peces en depósito de mantenimiento externos dentro de agua que tenía aproximadamente 26,7-28,9ºC (80-84ºF). Se pesaron los peces a las dos y tres semanas, pero sin embargo no volvieron a tratarse. Tal como puede verse en la figura 2 y en la Tabla 2 a continuación, el grupo tratado con bST creció a una velocidad notablemente mayor que el grupo de control.

TABLA 2 Peso medio del siluro del canal en gramos

Semana	Grupo de control	bST tratado
0	4,9	5,1
2	6,8	9,6
3	8,8	11,0

Durante el periodo de tres semanas, el grupo de control creció una media de aproximadamente el 80%, mientras que durante el mismo periodo, el grupo tratado con bST creció a una media de aproximadamente 116%. Al cabo de tres semanas, los peces en el grupo tratado con bST eran, de media, alrededor del 45% más pesados que los peces del grupo de control. Los análisis de los resultados empleado un test-T mostraron que los datos tenían un significado estadístico de p<0,05.

Ejemplo 3 Tratamiento de langostinos de agua dulce

Los langostinos fueron recibidos en una solución salina fría que tenia una densidad de 1,002 y una temperatura de 7,2-12,8ºC (45-55ºF). Los langostinos ya fueron choqueados osmóticamente. Luego se sacaron de su solución salina fría y colocados directamente en una solución de tratamiento refrigerada (alrededor de 7,2-12,8ºC (45-55ºF)) de 300 mg bST/l. La solución de tratamiento tenía una densidad de 1,010, una temperatura de aproximadamente 7,2ºC (45ºF) y era aproximadamente cinco veces más salada que la solución de transporte. Luego se dejaron los langostinos en la solución de tratamiento durante aproximadamente una hora. Igual como en el caso de las lobinas rayadas, el depósito de bST estaba cerrado, y la solución de bST se supersaturó con oxígeno a fin de poner los peces en un estado de animación suspendida. Una vez terminado el periodo de tratamiento, se dejó que la solución de tratamiento se calentara hasta alcanzar la temperatura ambiente, y luego se colocaron los langostinos en un depósito de mantenimiento externo con agua fría (alrededor de 26,7-28,9ºC (80-84ºF). Se observó el crecimiento de los langostinos durante cinco semanas. Los langostinos solo fueron tratados una vez.

Tal como puede verse en la figura 3 y en la Tabla 3 que sigue a continuación, los langostinos tratados crecieron a mayor velocidad que los langostinos de control no tratados. En el periodo de cinco semanas, los langostinos de control crecieron aproximadamente el 539%, mientras que los langostinos tratados con bST lo hicieron aproximadamente el 664%. Al cabo de cinco semanas, los langostinos tratados con bST tenían un peso medio que era alrededor del 20% superior a los langostinos del grupo de control. Los análisis de los resultados empleado un test-T mostraron que los datos tenían un significado estadístico de p<0,01.

TABLA 3 Peso medio de langostinos en gramos

Semana	Control	bST tratado
0	0,36	0,36
5	2,30	2,75

Ejemplo 4 Efecto de los peces sonicados durante el tratamiento

En este ejemplo, se trataron lobinos con una solución de 300 mg/l bST, sustancialmente igual como en el ejemplo 1. Sin embargo, los peces fueron sonicados al ser sumergidos en la solución bST. Los peces fueron sumergidos y sonicados aproximadamente durante dos minutos. Por tanto, en vez de una hora de inmersión, los peces tan solo fueron sumergidos en la solución bST durante dos minutos. Se descubrió que la sonicación de los peces durante más tiempo de dos minutos era perjudicial para la salud de los peces. La sonicación de los peces estaba destinada a producir el choque del bST dentro de las células dérmicas y agallas de los peces a fin de facilitar la absorción del bST al nivel de piel y agallas. Los resultados se presentan abajo, en la Tabla 4, y se representan en la figura 4.

TABLA 4 Peso de los peces sonicados respecto a los peces de control

Fecha	Peso del pez de	Peso del pez
	control (gms)	tratado (gms)
25/6/99	0,62	0,62
9/7/99	1,97	1,54
23/7/99	4,76	3,54
6/8/99	8,62	6,06

Tal como puede verse en los resultados, los peces de control (que no fueron tratados con bST) crecieron más deprisa que los peces tratados. Estos resultados parecen demostrar que el bST no es absorbido en el ámbito cutáneo (piel) o de agallas. Por tanto, se cree que los peces tragan la solución bST mientras están sumergidos en la solución del tratamiento, y que el mismo bST es absorbido en el intestino del pez (o del animal acuático).

Ejemplo 5 Tratamiento de carpas de hierba

Se trataron carpas de hierba sustancialmente de acuerdo con el Ejemplo 1, salvo en lo que se indica a continuación. Inicialmente las carpas fueron choqueadas osmóticamente en una solución salina molar de 0,375. Los peces choqueados fueron luego sumergidos en una solución salina molar de 0,154, incluyendo 300 mg de bST/l, durante 37 minutos. La solución de tratamiento se hallaba a temperatura ambiente. Las carpas fueron tratadas únicamente una vez y luego se siguieron la longitud y el peso de las carpas durante varias semanas. El peso y longitud de las carpas aparecen en la Tabla 5 de abajo y en el gráfico de las figuras 5A y 5B.

TABLA 5 Longitud y peso de la carpa de hierba

	Pez de control	Pez tratado
Fecha	Peso (gm)	Longitud	Peso (gm)	Longitud
		(pulgadas)		(pulgadas)
29/6/99	0	1,1	0	1,25
13/7/99	0,19	1,99	0,17	2,14
27/7/99	1,15	3,61	1,32	4,06
11/8/99	3,21	4,17	3,9	4,74
26/8/99	4,79	6	5,99	7,1
9/9/99	5,29	6,6	7,04	7,4
14/10/99	10,85	7,44	17,68	9,13

Tal como puede verse, transcurridos escasamente algo más de dos meses, la carpas de hierba tratadas pesaban aproximadamente 1,75 gm o alrededor del 33% más que los peces de control y eran aproximadamente 0,8'' o alrededor del 12% mayores que los peces de control. Al cabo de aproximadamente 3,5 meses, la carpa de hierba tratada pesaba unos 6,8 gms (o alrededor del 63%) más que la carpa de hierba de control. La fotografía de la figura 15 muestra las diferencias entre peces de control y tratados. Los análisis de los resultados empleado un test-T mostraron que los datos eran altamente significantes estadísticamente de p<0,001.

Ejemplo 6 Tratamiento de camarones

Se recibieron los camarones en una solución de salmuera con una densidad de 1,002. La densidad de la solución se aumentó hasta 1,010 añadiendo sal en la solución. Se añadió a la solución hormona de crecimiento (bST) en una cantidad de 300 mg/l, de modo que los camarones fueron choqueados osmóticamente y tratados al mismo tiempo. Los camarones se sumergieron en la solución de tratamiento durante una hora, transcurrida la cual se sacaron y devolvieron a un baño que tenía una densidad de 1,002. Los camarones solo fueron tratados una vez, y su crecimiento se registró durante varias semanas. El peso y longitud de los camarones aparece en la siguiente Tabla 6 y han sido representado en las figuras 6A y 6B.

TABLA 6 Simple tratamiento de camarones

	Camarón de control	Camarón tratado
Fecha	Peso (gm)	Longitud	Peso (gm)	Longitud
		(pulgadas)		(pulgadas)
1/7/99	0,09	0,26	0,09	2,37
13/7/99	0,17	2,53	0,16	2,67
27/7/99	1,06	5,52	0,98	5,28
11/8/99	1,72	6,5	2,02	6,6
26/8/99	2,41	7,1	2,93	7,4
9/9/99	2,72	7,4	3,75	8,2

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Tal como puede verse, al cabo de dos meses, los camarones tratados pesaban aproximadamente 1,03 gms o alrededor del 38% más que los camarones de control, y eran aproximadamente 0,8'' o alrededor del 11% más largos que los camarones de control. Los análisis de los resultados empleado un test-T mostraron que los datos tenían un significado estadístico de p<0,05.

Ejemplo 7 Tratamiento de peces cuando tienen menos de 24 horas de edad

En este ejemplo, se trataron siluros recién nacidos o crías. Los siluros tratados tenían menos de 24 horas de vida, y aún tenían unidas sus bolsas de huevo. Los peces fueron tratados una vez siguiendo sustancialmente el mismo protocolo expuesto en el Ejemplo 1 (es decir, choque osmótico, inmersión durante una hora en una solución salida con bST), y se siguió su crecimiento durante varias semanas. El peso y la longitud de los peces figuran en la siguiente Tabla 7 y en el gráfico de las figuras 7A y 7B. Se dividieron los peces en cuatro grupos. El primer grupo era un grupo de control. Este grupo estuvo sometido tan solo a la solución de choque osmótica. El segundo grupo de choque se sometió a la solución de choque osmótica y luego se sumergió durante una hora en una solución salina que tenía la misma salinidad que la solución de tratamiento. En el tercer grupo, los peces fueron sumergidos durante una hora en una solución salina que tenia 30 mg de bSTG/l; y en el cuarto grupo, los peces se sumergieron durante una hora en una solución salina de 300 mg bST/l. Los análisis de los resultados empleado un test-T mostraron que los datos tenían un significado estadístico de
p<0,05.

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TABLA 7

Peso en gramos
Fecha	Peces de	Peces	Tratados con	Tratados con
	control	choqueados	30 mg bST	300 mg bST
17/6/99	0,01	0,01	0,01	0,01
16/7/99	0,2	0,3	0,41	0,27
30/7/99	1,19	1,57	1,91	1,56
13/8/99	3,37	3,96	4,87	4,21
26/8/99	5,29	5,58	6,51	7,09
9/9/99	7,65	7,19	7,41	8,95
7/10/99		11,18	12,09	21,02
Longitud en pulgadas
Fecha	Peces de	Peces	Tratados con	Tratados con
	control	choqueados	30 mg bST	300 mg bST
17/6/99	1,8	1,85	1,97	1,87
16/7/99	2,78	3,05	3,37	3,04
30/7/99	4,99	5,45	5,88	5,45
13/8/99	7,14	7,94	8,13	7,42
26/8/99	8,4	8,5	9,18	8,7
9/9/99	9,3	9,5	9,5	9,7
7/10/99		10,9	11,6	13,2

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Tal como se ha indicado antes, estos peces fueron tratados únicamente una vez, y cuando eran muy jóvenes (menos de 24 horas de vida). Esto permitió tratar muchos más peces de una vez, que, por ejemplo, si los peces hubieran sido tratados al ser más viejos, pero ejemplo, seis meses de edad. Este ejemplo pone de manifiesto el efecto incrementado de usar una solución de 300 mg/l de bST respecto a una solución de 30 mg/l de bST. Los peces tratados con 30 mg/l pesaban menos que los peces de control (pero más que los peces choqueados) al cabo de casi tres meses. Comparado con los peces choqueados, al cabo de casi cuatro meses, los peces tratados con 30 mg/l de bST/l pesaban 0,91 gm o aproximadamente un 86% más que los peces choqueados y tenían la misma longitud que los peces choqueados. Por otra parte, los peces tratados con 300 mg/l de bST crecieron en general mucho más deprisa que los peces tratados con 30 mg de bST. Tal como pude verse en la figura 7A, resulta interesante que, inicialmente, los peces tratados con 30 mg de bST crecieran más rápido que los peces tratados con 300 mg de bST. Sin embargo, al cabo de 9 semanas, la velocidad de crecimiento de los peces tratados con 300 mg de bST sobrepasó en mucho los peces tratados con 30 mg de bST, y el cuarto grupo de peces capturados, y superaron a los peces el tercer grupo de peces. A final de casi cuatro meses, los peces tratados con 300 mg de bST pesaban 9,84 gm o casi un 90% más que los peces choqueados, y pesaban 8,91 gm o casi el 75% más que los peces tratados con 30 mg de bST. Con respecto a la longitud, los peces de todos los cuatro grupos tenían longitudes que eran bastante iguales al final de los tres meses. Sin embargo, a los cuatro meses, empezaron a verse grandes diferencias. Los peces tratados con 30 mg de bST/l eran aproximadamente 0,5'' más largos que los peces choqueados y los peces tratados con 300 mg de bST eran alrededor de 2,3'' y 1,6'' más largos que los peces choqueados y los peces tratados con 30 mg de bST, respectivamente. La fotografía de la figura 16 muestra claramente las diferencias entre los diferentes grupos de
peces.

Tal como se ha dicho antes, ciertos artículos iniciales discutían del tratamiento de peces con pequeñas dosis de hormonas de crecimiento. Este ejemplo pone de manifiesto que el tratamiento con mayores dosis de hormonas de crecimiento aumenta dramáticamente la velocidad de crecimiento de los peces. Los análisis de los resultados empleado un test-T mostraron que los datos tenían un significado estadístico con un p<0,05 para los peces tratados con la solución de 300 mg de bST/l y un p<0,10 para los peces tratados con la solución de 30 mg de bST/l. Por tanto, a pesar de la pequeña diferencia en peso medio y longitud entre los peces de control y los peces tratados con la solución de 30 mg de bST/l, la menor dosis tuvo cierto efecto.

Ejemplo 8 Efecto de la restricción de alimento al tratar peces

En este ejemplo, los peces se dividieron en cuatro grupos. En cada grupo, se limitó el alimento dado a los peces. Los peces recibieron el 10% de su peso corporal como alimento diario. Los peces se alimentaron tres veces al día. Así pues, en cada comida los peces recibían un alimento equivalente al 3,33% de su peso corporal. El primer grupo es un grupo de control en que los peces no fueron tratados con bST. El segundo grupo fue tratado dos veces; la primera vez como crías (es decir, con menos de 24 horas de vida) y la segunda vez con un mes de edad; el tercer grupo fue tratado una sola vez al mes de edad; y el cuarto grupo fue tratado únicamente una vez como crías. Los peces tratados lo fueron sustancialmente de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1. El peso y longitud de los peces aparecen abajo, y en el gráfico de las figuras 8A y 8B.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 8

1

Aún cuando la tendencia de los datos parece mostrar diferencias entre los grupos de peces, el peso de cada grupo de cada grupo varía ampliamente. Así, el análisis de los resultados no presenta significados estadísticos entre los grupos. A partir de mis observaciones, se cree que los peces tratados tienen más apetito que los peces sin tratar. Por tanto, dado que los peces consumen más alimento, con una tasa metabólica aumentada, crecerán a mayor tamaño.

Con respecto a las tendencias de los datos en los gráficos (es decir, las medias que aparecen en los gráficos) tratando los peces únicamente los peces cuando son crías (o sea, menos de 24 horas de vida), una vez cuando tienen aproximadamente un mes de edad, o dos veces -como crías y de nuevo al cabo de un mes- puede observarse que los peces tratados como crías son más grandes al cabo de cuatro meses que los peces que se han tratado únicamente a un mes de edad. Por tanto, vale la pena tratar los peces cuando son pequeños. Adicionalmente, los peces tratados únicamente una vez cuando son crías son más grandes al final de la prueba que los peces tratados dos veces. Por consiguiente, el tratamiento adicional no hace que los peces crezcan más deprisa. De hecho, por algún motivo, el tratamiento adicional de los peces parece que retrasa su velocidad de crecimiento, de modo que los peces en el grupo de control serían capaces de competir en peso a los peces tratados dos veces. Adicionalmente, tal como puede verse en la figura 8A, el tratamiento de los peces solo una vez cuando tienen un mes de edad no afecta de manera significativa la velocidad de crecimiento de los peces, en comparación con el grupo de control.

A partir de lo anterior, puede verse que el bST influyen mejor en la velocidad de crecimiento de los peces jóvenes. Aparentemente tiene poco o ningún efecto sobre los peces de más edad (es decir, de un mes de edad), salvo que sea administrado en más altas soluciones de choqueo y tratamiento. Por tanto, el mejor momento para tratar los peces es cuando son crías. Dado que las crías son mucho más pequeñas que cuando tiene un mes de edad, es posible tratar al mismo tiempo muchas más crías que peces más viejos en un volumen de solución determinado. Debido al gasto de bST también es preferible poder aumentar al máximo el número de peces a tratar simultáneamente. La fotografía de la figura 17 muestra las similitudes y diferencias entre los grupos de tratamiento.

Ejemplo 9 Variación del tiempo de inmersión en la solución de tratamiento y la dosis de bST

En esta prueba, se comprobó el efecto del tiempo de inmersión de las lobinas rayadas híbridas en la solución de tratamiento, así como variando las concentraciones de bST. Las lobinas fueron colocadas en soluciones de tratamietno de 30 mg de bST/l y 300 mg de bST/l durante diversos periodos de tiempo. Se determinó que la inmersión de los peces según el presente protocolo (es decir, choqueo osmótico e inmersión en una solución salina/bST oxigenada) durante más de aproximadamente dos horas resultó perjudicial para la salud de los peces. Se cree que el bST de adhiere a las agallas de los peces e impide la transferencia de oxígeno a través de las agallas del pez. Por tanto, es preferible que el tiempo de inmersión en la solución de tratamiento sea inferior a dos horas. Los resultados para 1,5 y 1 hora de inmersión (o tratamiento) aparecen en la Tabla 9 y en el gráfico de la figura 9. Los peces se dividieron en siete grupos. Hubo un grupo de control, tres grupos para 1,5 horas de tratamiento y tres grupos para 1 hora de tratamiento. Los tres grupos para 1,5 hora de tratamiento y para 1 hora de tratamiento incluían respetivamente un grupo de choqueo de control (un grupo de peces que fueron sumergidos en una solución salina que tenía una salinidad equivalente a la salinidad de la solución de tratamiento), un grupo de peces que se colocaron en una solución de 30 mg de bST/l, y un grupo de peces que se colocaron en una solución de 300 mg de bST/l.

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TABLA 9 Peso peces al variar los tiempos de inmersión y dosis de BsT

Tratamiento 1,5 hora
Fecha	Control	Control	30 mg bST	300 mg bST
		choqueados
25/6/99	0,62	0,62	0,62	0,62
9/7/99	1,63	2,19	1,94	1,85
23/7/99	3,86	5,67	6,02	6,12
6/8/99	7,64	11,05	10,72	11,28
19/8/99		18,71	19,37	22,94
2/9/99		25,29	25,21	29,11
16/9/9		29,06	29,41	40,12
14/10/99		37,57	42,96	43,14
Tratamiento 1 hora
Fecha	Control	Control	30 mg bST	300 mg bST
		choqueados
25/6/99	0,62	0,62	0,62	0,62
9/7/99	1,63	1,95	1,94	1,95
23/7/99	3,86	6,15	5,15	5,88
6/8/99	7,64	10,93	9,68	10,89
19/8/99		20,52	18,85	19,98
2/9/99		26,37	23,14	24,96
16/9/99		31,19	29,45	29,85
14/10/99		38,82	38,78	41,78

Tal como se desprende de los resultados de la Tabla 9 y del gráfico de la figura 9, no existió ningún aumento significativo del peso de los peces tratados con 30 mg de bST cuando se sumergieron 1,5 hora, comparados con los peces choqueados al final de tres meses. Sin embargo, al cabo de cuatro meses, los peces tratados con la solución de 30 mg/l de bST pesaban 5,39 gm, o aproximadamente un 14% más que los peces choqueados. Para el tratamiento de 1 hora puede verse que no existe una marcada diferencia entre el grupo choqueado de control y el grupo tratado con la solución de 30 mg bST/l. De hecho, al cabo de cerca de cuatro meses, los peces tratados con la solución de 30 mg de bST/l durante una hora pesaban casi tanto como la media de sus peces choqueados de control. Por tanto, la media hora extra en la solución de 30 mg de bST/l parece que permitió a los peces absorber más bST, de modo que los peces tratados 1,5 hora mostraron una mayor velocidad de crecimiento que los peces de control. No obstante, cuando se trataron los peces tanto de 1,5 hora como de 1 hora, existía un notable aumento de ganancia de peso entre los peces tratados con 30 mg de bST y los peces tratados con 300 mg de bST. Había un marcado aumento en la ganancia de peso de los peces tratados con 300 mg de bST respecto a los peces tratados con 30 mg de bST. Al fin de tres meses, los peces tratados con 300 mg de bST durante 1,5 hora pesaban alrededor de un 36% más que los peces tratados con 30 mg de bST. Y, al final de cuatro meses, los peces tratados con 300 mg de bST solo pesaban aproximadamente un 0,4% más que los peces tratados con 30 mg de bST. Al mes de intervención, los peces tratados con 30 mg de bST/l crecieron a mayor velocidad, y sustancialmente atraparon a los peces tratados con la solución de 300 mg de bST/l. Para los peces tratados durante 1 hora, al final de los tres meses, no existía mucha diferencia entre el peso de los peces tratados con 300 mg de bST/l y los peces tratados con 30 mg de bST/l. Sin embargo, durante el cuarto mes, los peces tratados con 300 mg de bST/l crecieron mucho más deprisa y pesaban 3 gm (o alrededor de un 7%) más que los peces tratados con 30 mg de bST/l. Por tanto, parece ser que con mayores concentraciones (hasta cierto punto, tal como se indicará más abajo) es posible alcanzar antes mayores velocidades de crecimiento. Las diferencias entre los grupos pueden verse en las fotografías de las figuras 13 y 14. Los análisis de los resultados empleado un test-T mostraron que los datos tenían un significado estadístico de p<0,05.

Ejemplo 10 Alta dosificación de bST

En esta prueba, los peces se sometieron a una solución de tratamiento conteniendo 3000 mg bST/l de solución. Los peces tratados tenían menos de 24 horas de vida, y fueron sumergidos en la solución de tratamiento durante una hora. Tal como puede verse en la siguiente Tabla 10 y en los gráficos de las figuras 10A y 10B, los peces inmersos en la solución de tratamiento de 3000 mg/l bST no crecieron más rápidamente o se hicieron más grandes que los peces del grupo de control al final del tercer mes. No obstante, a finales del cuarto mes, los peces tratados resultaron algo mayores que los peces de control. Tal como puede verse en la Tabla 10, los peces tratados pesaban aproximadamente 2,3 gm, o 15% más que los peces de control. Los análisis de los resultados empleado un test-T mostraron que los datos tenían un significado estadístico de p<0,05. Los efectos de las altas dosis del tratamiento pueden verse visualmente en la fotografía de la figura 12.

TABLA 10

	Control	Tratado
Fecha	Peso (gm)	Longitud	Peso (gm)	Longitud
		(pulgadas)		(pulgadas)
13/8/99	3,54	7,31	3,43	7,23
31/8/99	6,83	9,4	6,85	9,1
9/9/99	7,64	9,6	7,26	9,4
7/10/99	15,31	12,45	17,61	12,7

Ejemplo 11 Tratamiento de salmón coho

En esta prueba se trataron salmones coho de acuerdo con el Ejemplo 1 (choque osmótico, solución de tratamiento conteniendo 300 mg de bST/l de solución durante una hora). Tal como puede verse en la Tabla 11 a continuación y los gráficos de la figura 11, los salmones coho tratados con bST no crecieron a mayor velocidad que los salmones coho del grupo de control. Tal como se indicó anteriormente, estudios preliminares pusieron de manifiesto que el tratamiento del salmón coho fue eficaz. Por consiguiente, existe la hipótesis de que las técnicas que designo son completamente distintas de la investigación antes realizada.

TABLA 11

Semana	Control	Tratado con bST
0	2,37	2,3
1	5,51	5,47
3	8,43	8,37

Conclusión

Tal como puede verse, sumergiendo animales acuáticos en soluciones que tengan una alta concentración de bST, la velocidad de crecimiento de dichos animales acuáticos puede aumentarse de manera dramática. Esto permitirá a los acuicultivadores conseguir el crecimiento, y por tanto la cosecha, más rápidamente de animales acuáticos, incrementado eficazmente la cantidad de alimentos cultivados disponibles para alimentar la gente y reducir la subsistencia a partir de fuentes de alimentación salvajes.

Por ejemplo, la solución de tratamiento puede ser supersaturada con oxígeno antes de colocar los peces en el depósito de tratamiento. Aun cuando se utilizó el bST con hormona de crecimiento, también funcionarán igualmente otras hormonas de crecimiento que tengan una estructura molecular similar a la del bST. Este ejemplo es puramente ilustrativo.

Claims

1. Un método para administrar hormonas de crecimiento a animales acuáticos comprendiendo las fases de:

(a): choquear osmóticamente los animales acuáticos con una solución osmótica salina;

(b): colocar los animales acuáticos choqueados en un depósito de tratamiento que contiene una solución de hormonas de crecimiento; y

(c): colocar los animales acuáticos en un estado de animación suspendida durante un predeterminado periodo de tiempo mientras los animales acuáticos se hallen en el depósito de tratamiento, siendo los animales acuáticos tratados únicamente una vez.

2. El método de la reivindicación 1, en que los animales acuáticos son choqueados osmóticamente durante aproximadamente 120 segundos.

3. El método de la reivindicación 1, en que la solución de hormona de crecimiento contiene aproximadamente 3-3000 mg de hormona de crecimiento por litro, preferiblemente 150-3000 mg de hormona de crecimiento por litro, y más preferentemente de 150-450 mg de hormona de crecimiento por litro.

4. El método de la reivindicación 1, en que la fase de colocar los animales acuáticos en un estado de animación suspendida incluye la supersaturación de la solución de hormona de crecimiento con oxígeno.

5. El método de la reivindicación 1, en que los animales acuáticos permanecen en la solución de hormona de crecimiento durante de 2 minutos a 2 horas, aproximadamente.

6. El método de la reivindicación 5, en que los animales acuáticos permanecen en la solución de hormona de crecimiento durante de sesenta a 90 minutos, aproximadamente.

7. El método de la reivindicación 1, en que la solución de hormona de crecimiento está refrigerada, comprendiendo además el método de aumentar la temperatura de los animales acuáticos hasta una temperatura ambiente una vez transcurrido un predeterminado periodo de tiempo.

8. El método de la reivindicación 7, en que la temperatura de la solución salina es aproximadamente de 7,2ºC (45ºF).

9. El método de la reivindicación 1, en que en que los animales acuáticos son tratados antes de los 6 meses de vida.

10. El método de la reivindicación 9, en que en que los animales acuáticos son tratados antes de los 9 días de vida.

11. El método de la reivindicación 10, en que los animales acuáticos son tratados cuando tienen menos de 24 horas de vida.

12. El método de la reivindicación 1, en que la hormona de crecimiento es bST.