ES2248096T3 - Metodo de amplificacion de polinucleotidos. - Google Patents
Metodo de amplificacion de polinucleotidos.Info
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Abstract
Un método para cuantificar los polinucleótidos analito presentes en una muestra de prueba, comprendiendo los pasos de: Combinar una cantidad predeterminada de una muestra de prueba con una cantidad predeterminada de pseudodiana, conteniendo dicha muestra de prueba una cantidad desconocida de polinucleótido analito; Co-amplificar en una reacción de amplificación de polinucleótidos la pseudodiana y cualquiera de los polinucleótidos analitos contenidos en dicha muestra de prueba para producir un conjunto de productos de amplificación, donde dicho conjunto incluye tanto un amplicón analito si dicha muestra de prueba contenía polinucleótido analito y un amplicón pseudodiana; Cuantificar el amplicón analito sin referencia a la cantidad de amplicón pseudodiana, donde la cantidad de amplicón analito está relacionada de una forma en la que es dependiente de dosis de la cantidad desconocida de polinucleótido analito contenido en dicha muestra de prueba.
Description
Método de amplificación de polinucleótidos.
La presente invención está relacionada con los
métodos y composiciones útiles para mejorar la precisión y la
capacidad cuantitativa de las reacciones de amplificación de
polinucleótidos comúnmente realizadas en laboratorios de genética
molecular.
Los procedimientos basados en enzimas para
amplificar los polinucleótidos son actualmente herramientas
establecidas para exámenes diagnósticos, de entorno y forénsicos. El
mercado para los diagnósticos de sondas de DNA en laboratorios
clínicos representa actualmente varios cientos de millones de
dólares cada año. Se espera que el negocio de sondas de diagnósticos
clínicos crezca con la exploración viral y la determinación de carga
viral, que representan las áreas mayores de expansión activa de
mercado. Dado el valor comercial de esta tecnología, se han
invertido grandes esfuerzos en la investigación y el desarrollo de
procedimientos de amplificación mejorados (ver Genetic
Engineering News 17:6 (1997)).
Las técnicas recientemente desarrolladas para
amplificar polinucleótidos analitos han proporcionado alternativas
útiles a los métodos basados en el protocolo original de la Reacción
en Cadena de la Polimerasa (PCR, del inglés Polymerase Chain
Reaction). De acuerdo con una técnica, las reacciones de
amplificación de DNA se llevan a cabo en substratos en fase sólida
formados alternativamente por cristal, plástico, un chip
semiconductor o un grupo de fibras ópticas. La diana de DNA marcada
se sintetiza como un puente molecular entre pares de
oligonucleótidos cebadores inmovilizados al sustrato sólido de forma
que los productos de la amplificación permanecen adheridos al
sustrato sólido. La patente estadounidense nº 5.399.491 muestra una
técnica diferente donde el polinucleótido diana es amplificado
autocatalíticamente bajo condiciones de temperatura, fuerza iónica y
pH sustancialmente constantes. Este método, llamado Amplificación
Mediada por Transcripción (TMA, del inglés Transcription Mediated
Amplification), permite la síntesis de múltiples copias de RNA
de las secuencias diana. Los nuevos métodos que puedan aparecer en
el futuro continuarán expandiendo el rango de aplicaciones que
pueden ir dirigidas a las técnicas de amplificación de
polinucleótidos.
Los ensayos de amplificación cuantitativa
representan un subgrupo de análisis que imponen requisitos estrictos
en todos los aspectos del procedimiento, incluyendo el aislamiento
de plantillas y la estandarización de la eficiencia de la
amplificación. El enfoque que emplea estándares internos que
participan en las reacciones de amplificación pretende normalizar la
eficiencia de las reacciones, pero no tienen éxito en justificar los
niveles variables de la entrada de polinucleótidos analitos a la
reacción. Los métodos relacionados que amplifican simultáneamente un
polinucleótido analito y controlan los polinucleótidos derivados de
los genes de mantenimiento expresados constitutivamente son también
imperfectos puesto que se necesitan múltiples grupos de cebadores
para llevar a cabo la reacción de
amplificación.
amplificación.
Un ejemplo de método basado en el uso de
estándares internos en amplificaciones PCR cuantitativas se muestra
en la Patente Estadounidense nº 5.219.727. De acuerdo con el método
expuesto en esta patente, el estándar interno se incluye en la
reacción de amplificación y está diseñado para amplificar con una
eficiencia similar a la del polinucleótido diana. Como los métodos
que co-amplifican productos de genes expresados
constitutivamente para el uso como estándares internos, el método
expuesto en la Patente Estadounidense nº 5.219.727 requiere la
detección y cuantificación de los amplicones derivados del estándar
interno para cuantificar el polinucleótido analito. De esta forma,
se necesitan varios pasos para cuantificar polinucleótidos analitos
cuando un estándar interno debe ser detectado y cuantificado.
Otro ejemplo es el método expuesto en
WO-A-9502067 (Akzo Nobel, 1995), que
permite la cuantificación de un polinucleótido analito mediante la
relación de una cantidad predeterminada de una pseudodiana con la
cantidad de dicho polinucleótido analito.
Aún otro ejemplo es el método descrito en
US-A-5710029 (Ryder et al.,
1998), que permite la reducción de un antecedente no específico en
una reacción de amplificación de ácido nucleico mediante la
co-amplificación de una cantidad predeterminada de
una pseudodiana y luego el análisis y la cuantificación del
polinucleótido analito en una muestra mediante la comparación de
ambas cantidades.
El hecho de que los polinucleótidos amplificados
("amplicones") en procedimientos PCR y TMA convenciones sean
sintetizados como moléculas libres en solución representa otra
fuente de inexactitud para la detección de analitos. Estos
amplicones pueden ser fácilmente transferidos entre muestras para
producir resultados falso-positivos en las
reacciones contaminadas. Las precauciones estándar para minimizar
los resultados falso-positivos debidos a la
contaminación cruzada de plantillas de DNA incluyen la radiación
ultravioleta de dispositivos para pipetear, el uso de útiles de
plástico y cristal desechables, el uso de laboratorios o áreas de
laboratorios separadas para llevar a cabo las reacciones de
amplificación, y evitar la formación de aerosoles. Un enfoque
elaborado para asegurar que los productos PCR no serán
reamplificados en las siguientes reacciones incluye una serie de
pasos utilizando reactivos especializados para degradar los
productos de amplificaciones PCR previas. Sin embargo, este
procedimiento es algo complicado e incluye primero la sustitución de
dUTP por dTTP en la mezcla PCR y luego pre-tratar
todas las siguientes mezclas PCR con un enzima uracil
N-glucosilato (UNG) antes de la amplificación PCR.
Los productos de las amplificaciones PCR anteriores son entonces
eliminados por supresión de los residuos de uracil usando UNG, y
degradación del polinucleótido abásico resultante (Longo, et
al., Gene 93:125 (1990)). Claramente, estos métodos no se
prestan a ensayos de alto rendimiento.
Por consiguiente, existe una necesidad constante
de técnicas que puedan ser usadas para mejorar la precisión de los
procedimientos de amplificación de polinucleótidos. Además, existe
una necesidad de técnicas que puedan usarse para disminuir la
incidencia de resultados falso-positivos resultantes
de contaminación cruzada. La presente invención está dirigida a
estas dos necesidades.
Un primer aspecto de la invención está
relacionado con un método para cuantificar los polinucleótidos
analitos que están presentes en una muestra de prueba. El método
incluye pasos para (1) combinar una cantidad predeterminada de una
muestra de prueba, que contiene una cantidad desconocida de un
polinucleótido analito, con una cantidad predeterminada de una
pseudodiana; (2) co-amplificar en una reacción de
amplificación de polinucleótido el polinucleótido analito y la
pseudodiana para producir un grupo de productos de amplificación que
incluye tanto el amplicón analito si la muestra contenía el
polinucleótido analito como un amplicón pseudodiana; y (3)
cuantificar el amplicón analito sin depender de la información
referente a la cantidad de amplicón pseudodiana producido en la
reacción, donde la cantidad de amplicón analito está relacionada de
una forma dependiente de dosis a una cantidad desconocida de
polinucleótido analito que estaba presente en la muestra de prueba
original. Opcionalmente puede haber un paso adicional para la
detección de amplicón de pseudodiana. Este paso opcional puede ser
útil, por ejemplo, como control positivo para la reacción de
amplificación. En ciertas realizaciones referidas de la invención,
el paso para cuantificar el amplicón analito comprende una
hibridación inicial del grupo de productos de amplificación a partir
del paso de co-amplificación con una sonda marcada
que es específica para el amplicón analito pero no el amplicón
pseudodiana. Obviamente, hay que entender que la sonda específica
para el amplicón analito puede ser una sonda que une el
polinucleótido analito o una cadena de ácido nucleico que le es
complementaria. En otras realizaciones, la reacción de amplificación
de polinucleótidos en el paso de co-amplificación
puede ser indistintamente una reacción de Amplificación Mediada por
Transcripción (TMA), una reacción NASBA o una Reacción en Cadena de
Polimerasa, donde la reacción TMA representa una realización
altamente preferida de la invención. Sin tener en cuenta el tipo de
reacción de amplificación que se use, el paso de obtención puede
incluir primero conseguir un grupo de especímenes biológicos y luego
liberar ácidos nucleicos contenidos en el espécimen para dar como
resultado la muestra que contiene la cantidad desconocida de
polinucleótido analito. Para todos los tipos de reacciones de
amplificación, la cantidad de pseudodiana en el paso de combinación
es preferiblemente entre 1 x 10^{3} y 2 x 10^{8} moléculas,
preferentemente entre 1 x 10^{4} y 2 x 10^{8} moléculas, e
idóneamente entre 1 x 10^{5} y 2 x 10^{8} moléculas.
Opcionalmente puede incluirse un paso adicional para capturar el
polinucleótido analito en un soporte sólido antes del paso de
amplificación. En realización del método inventado que utilizan el
paso de captura adicional, la cantidad de pseudodiana usada en el
paso de combinación oscila preferiblemente entre 1 x 10^{3} y 2 x
10^{8} moléculas, preferentemente entre 1 x 10^{4} y 2 x
10^{8} moléculas, e idóneamente entre 1 x 10^{5} y 2 x 10^{8}
moléculas. Un soporte sólido ejemplar es una cuenta que se fabrica
con un polinucleótido sintético. El espécimen biológico utilizado en
el procedimiento puede ser una muestra de sangre o plasma y los
ácidos nucleicos contenidos en el espécimen pueden incluir ácidos
nucleicos virales. En la realización de la invención, el
polinucleótido analito utilizado en el procedimiento es un ácido
nucleico liberado por los viriones VIH. Cuando la reacción de
amplificación de polinucleótido utilizada en el método inventado es
la reacción TMA, puede incluirse en el método un paso adicional para
aislar el polinucleótido analito y la pseudodiana tras el paso de
combinación y antes del paso de co-amplificación. En
realizaciones del método inventado donde se utiliza la reacción de
Amplificación Mediada por Transcripción, la cantidad de pseudodiana
usada en la reacción es preferiblemente entre 1 x 10^{3} y 2 x
10^{8} moléculas, preferentemente entre 1 x 10^{4} y 2 x
10^{8} moléculas, e idóneamente entre 1 x 10^{5} y 2 x 10^{8}
moléculas. Cuando el paso de detección cuantitativa incluye la
hibridación de una sonda marcada que es específica para el amplicón
analito, la sonda marcada puede ser marcada con éster de acridina,
en cuyo caso el paso para la detección cuantitativa puede incluir la
realización de una luminometría. En realización de la invención
donde el primer paso incluye la liberación de ácidos nucleicos
contenidos en un espécimen biológico, el polinucleótido analito
puede ser un polinucleótido viral. En general, el método inventado
puede comprender el paso adicional de consultar una curva estándar
que relaciona cantidades de pre-amplificación de los
polinucleótidos analitos y las cantidades de
post-amplificación de amplicones de analito. Este
paso de consulta de una curva estándar también puede ponerse en
práctica cuando la luminometría se usa para medir la hibridación de
sondas marcadas con éster de acridina, o cuando la reacción de
amplificación es concretamente una reacción de Amplificación Mediada
por Transcripción. En otras realizaciones preferidas que usan la
reacción de Amplificación Mediada por Transcripción, se puede usar
un conjunto apareado de oligonucleótidos cebadores con las
secuencias ID DE SEC Nº 1 y ID DE SEC Nº 2 para conducir la
reacción, y la pseudodiana puede tener una secuencia polinucleótida
seleccionada del grupo compuesto por ID DE SEC Nº 4 y ID DE SEC Nº
9.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
método para relacionar las cantidades de polinucleótido analito de
pre-amplificación y las cantidades de amplicón
analito de post-amplificación. Este método incluye
pasos para: (1) obtener una pluralidad de muestras de control que
incluyen diferentes cantidades predeterminadas de un polinucleótido
analito; (2) combinar cada una de las muestras de pluralidad con una
cantidad constante de una pseudodiana para obtener una pluralidad de
muestras mezcladas; (3) co-amplificar en una
pluralidad de reacciones de amplificación tanto la pseudodiana como
cualquiera de los polinucleótidos analitos presentes en cada muestra
de la pluralidad de muestras mezcladas para producir productos de
amplificación, los productos de amplificación incluyendo tanto el
amplicón pseudodiana para cada una de las muestras de la pluralidad
de muestras mezcladas como un amplicón analito para cualquiera de
las muestras de la pluralidad de muestras mezcladas que contenga el
polinucleótido analito; (4) cuantificar el amplicón analito para
cada reacción de la pluralidad de reacciones de amplificación sin
referirse a la cantidad de amplicón pseudodiana presente en el
conjunto de productos de amplificación; y (5) preparar una curva
estándar con las cantidades predeterminadas diferentes de
polinucleótido analito trazándola en función de las cantidades
cuantificadas de amplicón analito para cada una de las reacciones de
la pluralidad de reacciones de amplificación, relacionando así las
cantidades de pre-amplificación de polinucleótido
analito presentes en cada muestra de la pluralidad de muestras de
control y las cantidades de post-amplificación de
amplicón analito sintetizado en cada una de las reacciones de
amplificación. Opcionalmente puede existir un paso añadido para la
detección del amplicón pseudodiana. Este paso opcional puede ser
útil, por ejemplo, como control positivo para la reacción de
amplificación. En una realización preferida, el polinucleótido
analito es un polinucleótido viral, como un polinucleótido VIH.
Generalmente, la cantidad predeterminada constante de pseudodiana
puede variar entre 1 x 10^{3} y 2 x 10^{8} moléculas,
preferiblemente entre 1 x 10^{4} y 2 x 10^{8} moléculas,
preferentemente entre 1 x 10^{4} y 2 x 10^{8} moléculas, e
idóneamente entre 1 x 10^{5} y 2 x 10^{8} moléculas. De acuerdo
con otras realizaciones del método inventado, la pluralidad de las
reacciones de amplificación en el paso de
co-amplificación puede ser cualquiera de la
pluralidad de reacciones de Amplificación Mediada por Transcripción,
una pluralidad de reacciones NASBA y una pluralidad de reacciones
PCR. En un conjunto de realizaciones altamente preferidas, las
reacciones de amplificación en el paso de
co-amplificación son reacciones de Amplificación
Mediadas por Transcripción. Sin tener en cuenta el tipo de
reacciones de amplificación que se utilizan, el paso cuantificativo
puede incluir primero una hibridación de los productos de
amplificación del paso de co-amplificación con una
sonda específica marcada para el amplicón analito pero no el
amplicón pseudodiana y luego la detección cuantitativa de cualquier
sonda marcada que se hibridó específicamente. En ciertos ejemplos,
la sonda marcada es marcada con éster de acridina.
En todavía otras realizaciones preferidas donde
el paso de cuantificar incluye la hibridación con un sonda marcada
específica para un amplicón analito, puede haber un paso adicional
para capturar el polinucleótido analito en un soporte sólido antes
del paso de co-amplificación.
También se muestra kits que se pueden usar para
llevar a cabo las reacciones de amplificación de polinucleótidos, de
acuerdo con el método descrito, utilizando plantillas de
polinucleótidos analitos. Los kits de ejemplo pueden incluir: una
pseudodiana; por lo menos un par de oligonucleótidos cebadores para
co-amplificar la pseudodiana y el polinucleótido
analito; reactivos para realizar la reacción de amplificación de
polinucleótidos, incluyendo desoxinucleótidos trifosfato y un enzima
polimerizante de DNA; e instrucciones impresas con directrices para
llevar a cabo primero la reacción de amplificación y luego la
detección de únicamente amplicones analitos producidos en la
reacción de amplificación. En una realización, el kit inventado
también puede incluir una sonda marcada para la detección de
cualquier amplicón analito producido en la reacción de
amplificación. De acuerdo con otra realización, el kit inventado
también incluye nucleótidos trifosfato y un enzima polimerizante de
RNA. El enzima polimerizante de DNA que se incluye en los kits puede
ser una transcriptasa reversa. En una realización altamente
preferida, no se usa en el kit ninguna RNAsa H adicional a la
proporcionada por la transcriptasa reversa.
Otro aspecto de la invención está relacionado con
un método cualitativo para determinar si una muestra biológica
contiene un polinucleótido analito. Este método incluye pasos para:
(1) combinar una muestra biológica con una pseudodiana para dar como
resultado una muestra mezclada; (2) aislar ácidos nucleicos de la
muestra mezclada, mediante lo cual se obtiene un conjunto de
moléculas que incluyen la pseudodiana y cualquiera de los
polinucleótidos analitos presentes en la muestra biológica; (3)
llevar a cabo una reacción de amplificación polinucleótida para
co-amplificar la pseudodiana y cualquier
polinucleótido analito contenido en el conjunto de moléculas para
fabricar productos de amplificación, mediante lo cual se forman
amplicones pseudodianas, y mediante lo cual los amplicones analitos
se forman si el conjunto de moléculas incluye el polinucleótido
analito; (4) detectar entre los productos de amplificación cualquier
amplicón analito sin detectar los amplicones pseudodiana; y (5)
determinar que la muestra biológica contiene el polinucleótido
analito si los amplicones analitos se detectan entre los productos
de amplificación. En ciertas realizaciones, la reacción de
amplificación es cualquiera de las reacciones de Amplificación
Mediada por Transcripción, una reacción NASBA y una reacción PCR. En
ciertas realizaciones altamente preferidas, la reacción de
amplificación es una reacción de Amplificación Mediada por
Transcripción. Independientemente del tipo de reacción de
amplificación que se utiliza, el paso de detección puede incluir
primero la hibridación de una sonda polinucleótida marcada con
especificidad de unión con amplicones analitos y luego la medida de
la cantidad de uniones específicas de la sonda polinucleótida
marcada. Cuando el paso de detección incluye la hibridación de una
sonda específica de amplicón analito marcada, el paso de aislamiento
puede incluir la inmovilización de la pseudodiana y el
polinucleótido analito en un soporte sólido. De acuerdo con otra
realización preferida, el paso de detección incluye la detección por
luminometría. En todavía otra realización preferida, el
polinucleótido analito proviene de viriones VIH. Cuando este es el
caso, la pseudodiana puede tener una secuencia que es o bien ID DE
SEC Nº 4 o ID DE SEC Nº 9.
Tal como se usa aquí, los siguientes términos
tienen los siguientes significados, a menos que se exprese
específicamente lo contrario.
Un "polinucleótido" puede ser tanto RNA como
DNA, a menos que se especifique lo contrario.
Un "oligonucleótido" es una molécula
polinucleótida cuya longitud oscila entre 10 y 100 nucleótidos, o
preferentemente entre 10 y 50 nucleótidos. Normalmente, los
oligonucleótidos son sintetizados por métodos químicos orgánicos y
son de una sola cadena, a menos que se especifique lo contrario. Los
oligonucleótidos pueden estar marcados con una marca detectable.
Un "amplicón" es un producto polinucleótido
generado en una reacción de amplificación.
Un "amplicón analito" es un producto
polinucleótido de una reacción de amplificación donde un
polinucleótido analito sirve como plantilla para la síntesis de
copias de polinucleótidos o productos de amplificación.
Un "polinucleótido analito" es un
polinucleótido diana que se va a replicar por un proceso de
amplificación de los ácidos nucleicos, como el protocolo TMA, pero
es estructuralmente distinguible de un polinucleótido pseudodiana.
Los dos polinucleótidos pueden distinguirse, por ejemplo, por la
presencia o ausencia de un sitio de corte para la enzima de
restricción o una diferencia en las secuencias internas que es
distinguible mediante una sonda de hibridación.
Un "polinucleótido diana" tiene una
secuencia diana que tiene que replicarse. Puede ser o bien de dos
cadenas o de sólo una, y puede incluir secuencias adicionales a la
secuencia diana, donde dichas secuencias adicionales no deben
amplificarse.
Una "secuencia diana" se refiere a la
secuencia de nucleótidos concreta del polinucleótido diana que hay
que amplificar. La secuencia diana incluye las secuencias de
acomplejamiento que los oligonucleótidos cebadores útiles en la
reacción de amplificación pueden hibridar antes de la extensión por
DNA polimerasa. Donde el polinucleótido diana es originariamente de
una cadena, el término "secuencia diana" se referirá también a
la secuencia complementaria al polinucleótido diana. Donde el
polinucleótido diana es originariamente de dos cadenas, el término
"secuencia diana" se refiere a tanto la cadena (+) como la (-)
que son complementarias entre sí.
Una "pseudodiana" es un polinucleótido que
puede ser co-amplificado con el polinucleótido
analito en una única reacción de amplificación. La pseudodiana y el
polinucleótido analito pueden ser amplificados usando el mismo grupo
de oligonucleótidos cebadores. La pseudodiana y el polinucleótido
analito serán moléculas no idénticas de forma que el polinucleótido
analito y la pseudodiana puedan distinguirse entre sí.
Un "amplicón pseudodiana" es un producto
polinucleótido de una reacción de amplificación donde una
pseudodiana sirve como plantilla para la síntesis de copias de
polinucleótidos o productos de amplificación.
Una reacción de "amplificación de
polinucleótidos" es una reacción catalizada por un enzima in
vitro dependiente de una plantilla que aumenta el número de
polinucleótidos diana.
En el contexto de la invención, "detectar
cuantitativamente" o "cuantificar" se refiere a un proceso
para determinar la cantidad de la producción de polinucleótidos o
amplicones.
Una "sonda marcada" es un polímero de
nucleótidos que contiene una fracción detectable que puede
combinarse con una secuencia de ácidos nucleicos diana de una sola
cadena complementaria para formar un híbrido de cadena doble. El
término también incluye análogos de nucleótidos que ocurren
naturalmente y incluye concretamente análogos con un grupo metoxi en
la posición 2' de la ribosa (Ome). La fracción detectable puede
unirse a la(s) punta(s) de la sonda o puede colocarse
internamente dentro de la secuencia de la sonda. En general, las
sondas marcadas son de entre 10 y 100 nucleótidos de longitud, pero
pueden ser de más de 100 ó menos de 10 nucleótidos.
Una "fracción detectable" es una molécula
unida a, o sintetizada como parte de, una sonda marcada. Esta
molécula debería ser detectable de forma individual y permitirá como
resultado la detección de la sonda. Estas fracciones detectables son
a menudo radioisótopos, moléculas quimioluminiscentes, enzimas,
haptenos, o incluso secuencias de oligonucleóticos únicas.
Una "sonda marcada específica para un amplicón
analito" es una sonda marcada con una secuencia polinucleótida
complementaria a un producto polinucleótido sintetizado en una
reacción de amplificación donde un polinucleótido analito sirve como
plantilla para la síntesis de productos de amplificación. Puedo que
el amplicón es un producto polinucleótido generado en una reacción
de amplificación, la sonda marcada específica para un amplicón
analito puede ser complementaria a cualquier cadena polinucleótida
generada en la reacción. De esta manera, si un polinucleótido
analito es una molécula de una sola cadena que contiene una
secuencia diana, y si se generan copias de la secuencia diana y su
complemento en la reacción de amplificación, entonces la sonda
marcada específica para el amplicón analito puede ser complementaria
a la secuencia diana o su complemento.
"Co-amplificar", tal como se
usa aquí, se refiere al proceso de amplificación en una reacción de
amplificación polinucleótida de más de un tipo de polinucleótido
diana. Por ejemplo, "co-amplificar un
polinucleótido analito y una pseudodiana" pretende indicar que el
proceso de amplificar simultáneamente los dos polinucleótidos para
dar como resultado la formación de amplicones analitos y amplicones
pseudodiana, respectivamente.
Tal como se usa aquí "obtener" una muestra
que incluye, o puede incluir, un polinucleótido analito, puede
significar o bien obtener a partir de un sujeto biológico, como un
humano, o bien obtener a partir de un depositario de reactivos, con
un vendedor comercial. Cuando una muestra se obtiene a partir de un
animal o un humano, se entenderá que aquéllos expertos en la materia
pueden utilizar varios medios apropiados. Por ejemplo, si se obtiene
una muestra de sangre, puede obtenerse consiguiendo la sangre
mediante venepunctura, pero también se puede obtener como una
muestra forense.
Tal como se usa aquí, la frase "sin referencia
a la cantidad de amplicón pseudodiana" significa que la
información cuantitativa referente a la cantidad de amplicón
pseudodiana sintetizado en una reacción de amplificación no debe
necesariamente hacer una determinación de acuerdo con otro parámetro
en un sistema de amplificación. Por ejemplo, la cantidad sintetizada
de amplicón analito en un sistema de amplificación o la cantidad de
polinucleótido analito que llevaría a la formación de dicha cantidad
de amplicón puede determinarse siguiendo los métodos expuestos aquí
sin información cuantitativa sobre la formación de los amplicones
pseudodiana en la misma reacción. De hecho, ni siquiera es necesario
detectar el amplicón pseudodiana para tener éxito con el método
cuantitativo aquí descrito. La presente invención proporciona un
enfoque para relacionar la cantidad de
pre-amplificación de polinucleótido analito y la
cantidad de post-amplificación de amplicón analito.
Esta relación puede establecerse sin depender de la cantidad de
amplicón pseudodiana, o sin ni siquiera tener conocimientos al
respecto, que se co-amplifica con el amplicón
analito en una reacción de amplificación. De esta manera, incluso si
el amplicón pseudodiana es detectado o cuantificado en un
procedimiento experimental, no es necesario usar esta información
para relacionar la cantidad de pre-amplificación de
un polinucleótido analito y la cantidad de
post-amplificación del amplicón analito
correspondiente.
Tal como se usa aquí, una "curva estándar"
es una representación que relaciona una cantidad de
pre-amplificación de un polinucleótido y una
cantidad de post-amplificación del amplicón
correspondiente. Por ejemplo, una curva estándar puede ser una
gráfica sabiendo los números de entrada de las moléculas de la
plantilla en el eje de las X, y o bien los valores RLU o los pmols
del producto de amplicón representado en el eje de las Y. Las curvas
estándar son típicamente producidas usando estándares de
polinucleótidos de control con un número conocido de plantillas de
polinucleótidos. Las curvas estándar pueden almacenarse de forma
electrónica o pueden representarse gráficamente.
Un "espécimen biológico" es una muestra de
material derivado de un organismo.
La figura I es una representación esquemática de
los productos de la reacción TMA separados electroforéticamente
sintetizados usando diferentes cantidades de plantilla de
polinucleótidos diana de entrada. La representación marcada como
"Neg" se refiere a una reacción que no incluía plantilla de
entrada. Las demás representaciones se refieren a reacciones
llevadas a cabo usando cantidades cada vez mayores de
polinucleótidos diana de entrada. La posición en el gel de un
producto de amplificación en concreto derivados del polinucleótido
diana se marca con una flecha.
Las figuras 2a-2c ilustran
esquemáticamente tres condiciones de reacción diferentes para una
reacción TMA. Cuando otras variables, como el enzima, el cebador, y
las concentraciones NTP, se mantienen constantes. Bajo las
condiciones de bajos niveles de entrada de polinucleótidos analitos
(Figura 2a), la mayoría del producto de reacción es un producto no
específico independiente de la plantilla (NP), mientras que el
amplicón analito o el producto específico (SP) representa sólo un
componente mínimo del producto de reacción total. Bajo condiciones
de elevados niveles de entrada de polinucleótidos analitos (Figura
2b), el amplicón analito (SP) representa una mayoría del producto de
reacción total, mientras que el producto no específico (NP) es un
componente minoritario. Bajo condiciones donde el nivel de entrada
de polinucleótido analito es bajo pero el nivel de pseudodiana es
elevado (Figura 2c), la formación del producto específico
pseudodiana (PTSP) es a expensas de la formación de producto no
específico.
Las figuras 3a-3b son
ilustraciones esquemáticas que muestran como la inclusión de
pseudodianas en las reacciones idealizadas que no proporcionan
productos de amplificación no específicos puede transformar los
ensayos cualitativos y hacerlos cuantitativos. La figura 3a muestra
como los niveles bajos o elevados de inicio de polinucleótido
analito (TA) sirven como plantillas para la conversión de reactantes
(R) en cantidades similares de productos específicos para analitos
(SP). La figura 3b muestra que la inclusión de pseudodianas (PsT) en
las reacciones de amplificación con niveles de partida bajos o
elevados de polinucleótidos analitos tiene como resultado una
relación cuantitativa entre los niveles de productos específicos
para analitos sintetizados en las reacciones y los niveles de
entrada de plantillas. El diagrama muestra que las pseudodianas
sirven como plantillas en la reacción para la síntesis de productos
específicos para pseudodianas (PTSP) mientras que los
polinucleótidos analitos sirven como plantillas para la síntesis de
productos específicos para analitos.
Las figuras 4a-4d son gráficas
ideales que ilustran cómo el rango dinámico y la precisión de las
reacciones de amplificación de polinucleótidos mejoran cuando las
reacciones incluyen pseudodianas. La figura 4a muestra los
resultados que se espera de una reacción de amplificación hipotética
que produce sólo amplicones específicos para analitos. La figura 4b
muestra los resultados esperados para reacciones de amplificación
que producen espontáneamente niveles bajos de productos de
amplificación no específica que no están relacionados con el
polinucleótido analito. La figura 4c muestra los resultados
esperados para las reacciones de amplificación que producen
espontáneamente niveles elevados de productos de amplificación no
específica que no están relacionados con el polinucleótido analito.
La figura 4d muestra los resultados ideales esperados de reacciones
que incluyen pseudodianas.
La figura 5 es un diagrama esquemático que
ilustra cómo la variabilidad en la eficiencia de la recuperación de
un grupo de polinucleótidos que incluye un polinucleótido analito y
una pseudodiana puede proporcionar cantidades similares de amplicón
siguiendo a una reacción de amplificación. El polinucleótido analito
y la pseudodiana se muestran en la parte de arriba del diagrama en
un radio de inicio fijado. Tanto el 100% como el 50% de la muestra
de polinucleótido sirve de inicio en la reacción de amplificación.
Las cantidades finales de productos de amplicón son similares.
La figura 6 es un gráfico linear que muestra cómo
una pseudodiana puede usarse para normalizar la síntesis de amplicón
en las reacciones de amplificación con diferentes cantidades de
polinucleótido analito. Las tres condiciones presentadas en el
gráfico son: sin pseudodiana (\blacklozenge); con cantidad
constante de pseudodiana(\blacksquare); relación constante
de pseudodiana y polinucleótido analito (\Box).
La figura 7 es un gráfico lineal que muestra cómo
una pseudodiana puede usarse para controlar la producción de
amplicones analitos. Las dos condiciones presentadas en el gráfico
son: sin pseudodiana (\bullet); y 2 x 10^{6} copias de
pseudodiana por reacción (\blacksquare).
Aquí se expone que las reacciones de
amplificación polinucleótidas que incluyen una pseudodiana mostraron
ventajosamente una precisión mejorada respecto a la cantidad de
amplicón analito sintetizada. Adicionalmente, las reacciones de
amplificación cualitativa pueden transformarse en ensayos
cuantitativos al incluir pseudodianas en las reacciones y luego
medir cuantitativamente la cantidad de amplicón analito que se haya
sintetizado. También se muestra un nuevo método de procesamiento del
espécimen que asegura ventajosamente la producción de una relación
preestablecida de pseudodiana y amplicones analitos en una siguiente
reacción de amplificación, independientemente de la eficiencia con
la que los ácidos nucleicos hayan sido aislados del espécimen. De
acuerdo con este método, las pseudodianas se añaden a un espécimen
biológico antes de que los ácidos nucleicos se aíslen del espécimen.
También se describen ensayos realizados en un formato cualitativo
usando amplificación de pseudodianas, y que proporcionan información
semi-cuantitativa sobre la cantidad de
polinucleótido analito en una muestra de prueba.
Una observación que llevó al desarrollo de la
invención relativa a una característica inherente de la reacción TMA
estándar. Más específicamente, se observó que la síntesis enzimática
de productos de amplificación no específicos representaba una
proporción sustancial de los productos de reacción donde la reacción
se inició usando sólo pequeñas cantidades de polinucleótido diana.
Cuando se mediante electroforesis, la amplificación no específica de
productos se mostró como una mancha que se extendía en un rango de
tamaño muy amplio. Este resultado se ilustra esquemáticamente en la
Figura 1.
Es importante destacar que se observó que las
reacciones TMA realizadas utilizando cantidades cada vez mayores de
plantillas de polinucleótidos diana tuvo como resultado
contribuciones relativas disminuidas de productos no específicos.
Este resultado también está ilustrado en la Figura 1. Las reacciones
que se iniciaron usando concentraciones más elevadas de
polinucleótidos diana tuvieron como resultado la formación de
cantidades mayores de productos específicos y sólo cantidades
pequeñas de productos no específicos. Esta relación inversa llevó a
especular que la formación de producto en reacciones no específicas
podía suprimirse al incluir una plantilla amplificable en la mezcla
de reacción en el momento en el que la reacción se iniciaba.
A la vez que no se pretendía estar ligado a
ninguna teoría en particular, esta relación inversa puede haber
destacado particularmente en reacciones autocatalíticas, como las
reacciones TMA, porque a menos que se interrumpan prematuramente, la
naturaleza de la reacción es la de proceder hasta un criterio de
valoración donde el suministro de reactantes disponibles se agote y
no pueda tener lugar más síntesis. Una reacción TMA que tiene lugar
indefinidamente en ausencia de un polinucleótido diana generará
productos no específicos hasta que los reactantes se hayan agotado y
no se produzca síntesis adicional. También se espera que una
reacción PCR que tenga lugar indefinidamente llegue a un punto donde
los reactantes se agoten y cese la producción de amplicones, y puede
también generar productos de amplificación no específica (por
ejemplo, ver D. Persing en Diagnostic Molecular Microbiology;
Cap. 3, p. 58 (1993)).
Como el método expuesto aquí se practica de forma
ordinaria, la detección del amplicón analito se usa para indicar la
presencia de polinucleótidos analito en una población de moléculas
de ácido nucleico. Por ejemplo, un procedimiento para monitorizar
los niveles en suero de viriones de virus de inmunodeficiencia
humana (VIH) podría implicar amplificar una porción del genoma VIH y
luego detectar y cuantificar ese producto de amplificación. Si el
procedimiento también incluyera amplificar una pseudodiana, entonces
la detección del amplicón pseudodiana sería un paso opcional que no
sería necesario para que el ensayo resultara exitoso. La detección
del amplicón pseudodiana podría usarse como un procedimiento de
control positivo para indicar que la reacción de amplificación ha
ocurrido (esto es, un control de amplificación interna). Sin
embargo, la caracterización cuantitativa de la cantidad de amplicón
analito sintetizado en una reacción de amplificación o la cantidad
de plantilla de analito polinucleótido que habría provocado la
formación de esa cantidad de amplicón analito, no depende del hecho
de conocer la cantidad de amplicón pseudodiana sintetizado en la
reacción de amplificación. Así, el amplicón analito puede
cuantificarse de acuerdo con los métodos expuestos aquí sin
referencia a la cantidad de amplicón pseudodiana sintetizado en una
reacción de amplificación. Una característica crítica del método
expuesto aquí es que el amplicón analito debe ser distinguible del
amplicón pseudodiana. Más concretamente, debe ser posible detectar
el amplicón analito sin detectar también el amplicón pseudodiana. En
una realización preferida, el amplicón analito y el amplicón
pseudodiana se unen de forma diferente a como mínimo una sonda de
hibridación de forma que los dos tipos de amplicón se pueden
detectar independientemente.
Un punto especialmente relevante para
procedimientos clínicos que utiliza protocolos de amplificación está
relacionado con la variabilidad de la recuperación de plantillas de
polinucleótidos de diferentes especímenes biológicos. Por ejemplo,
es común experimentar variabilidad en el número de moléculas de un
polinucleótido concreto recuperado de diferentes muestras de tejido
como el resultado de muestras de tamaños variados y la complejidad
de diferentes procedimientos de trabajo con muestras. Los ácidos
nucleicos pueden unirse de forma no específica a cristal, plástico y
medios de cromatografía, como las poliacrilamidas entrecruzadas y
los dextranos, reduciendo así la eficiencia de la recuperación de la
muestra durante el procesado extensivo. Adicionalmente, el RNA
recuperado a partir de un espécimen biológico puede haberse
degradado en un grado variable como resultado de la hidrólisis
química o enzimática. La hidrólisis enzimática es particularmente
evidente en muestras biológicas que contienen altas concentraciones
de ribonucleasa.
La incorporación de una pseudodiana a una
reacción de amplificación polinucleótida no sólo puede reducir la
variabilidad de amplificación de una muestra a otra, sino que
también puede transformar incluso un ensayo cualitativo
completamente optimizado en un ensayo cuantitativo. En el caso de un
sistema de amplificación polinucleótida donde sólo los productos de
amplificación específica son sintetizados (entendiendo que los
productos no de dianas no específicas no se fabrican) la cantidad
del producto final amplificado por un polinucleótido diana inicial
sería constante independientemente de la cantidad inicial de
polinucleótido diana incluida en la reacción. Esto es cierto cuando
las reacciones de amplificación autocatalítica, como la reacción
TMA, llegan hasta el punto en el que los reactantes se agotan en
cantidad suficiente como para terminar la reacción. La cantidad
total de producto final sintetizado en esta situación se determina
en gran forma por las concentraciones iniciales de reactantes
incluidos en la reacción. Tal sistema de amplificación
polinucleótida optimizado es cualitativo pero no cuantitativo cuando
la reacción tiene lugar hasta el punto en el que la concentración de
uno de los reactantes se vuelve limitante. Esto es porque la
cantidad de producto final fabricado en la reacción depende de las
concentraciones iniciales de reactantes y no de la cantidad inicial
de polinucleótido diana.
Cuando una pseudodiana se incluye en una reacción
de amplificación, como la reacción TMA, la pseudodiana estará
presente preferiblemente en un número de copia mayor con relación al
polinucleótido diana. La reacción de amplificación para cuando la
cantidad de producto amplificado de polinucleótido diana y de
pseudodiana es suficientemente grande que uno de los reactantes se
ha agotado. Puesto que la pseudodiana normalmente representa la
especie de amplificación dominante, la cantidad de amplificación del
polinucleótido diana se determina por la cantidad de inicio de la
pseudodiana y no por la cantidad de inicio de polinucleótido diana.
Por lo tanto, al controlar la cantidad de pseudodiana en la reacción
de amplificación, la extensión de la amplificación de polinucleótido
diana puede controlarse independientemente de la cantidad de inicio
de polinucleótido diana en la reacción. Mientras la cantidad
combinada de productos de amplificación será constante cuando las
concentraciones de reactante se mantengan fijas, la cantidad de
amplicón analito producido en la reacción reflejará sustancialmente
la proporción inicial de polinucleótido analito con relación al
nivel inicial de pseudodiana. De esta forma, un ensayo de
amplificación puede convertirse en un ensayo cuantitativo porque el
polinucleótido diana se amplificará hasta una extensión
predeterminada. Esto está ilustrado esquemáticamente en las Figuras
2-4.
En general, los métodos para convertir reacciones
de amplificación de polinucleótidos cualitativas en reacciones
cuantitativas mediante la inclusión de polinucleótidos pseudodiana
en las reacciones son aplicables a todos los sistemas de
amplificación de polinucleótidos conocidos, incluyendo PCR, NASBA
(amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico), SDA
(amplificación por desplazamiento de la cadena), y métodos de
amplificación que utilizan moléculas polinucleótidas
autoreplicativas y enzimas de replicación como MDV-1
RNA y enzima Q-beta. Los métodos para realizar estas
técnicas de amplificación varias pueden encontrarse respectivamente
en la patente estadounidense nº 4.965.188; la solicitud de patente
europea publicada EP 0 525 882, las patentes estadounidenses nº
5.455.166; 5.472.840 y Lizardi et al., BioTechnology
6:1197 (1998).
Se observa en el campo de los ensayos con ácido
nucleico que la amplificación de polinucleótido es un proceso
exponencial y que las pequeñas diferencias en cualquiera de las
variables que afectan a los índices de la reacción pueden llevar a
diferencias dramáticas en la obtención de amplicones específicos
para analitos. Se expone aquí el descubrimiento reciente de que los
productos de amplificación no específica generados en reacciones de
amplificación pueden contribuir significativamente a la producción
de amplicones totales y pueden consumir reactantes que de otra forma
se usarían para sintetizar productos de amplificación específica
para analitos. La contribución de los productos no específicos al
grupo de productos de amplificación es significativamente suficiente
como para que pequeños cambios en las cantidades de productos de
amplificación no específicos puedan influir profundamente en la
magnitud de la producción de amplicón analitos. Así, se descubrió
durante el desarrollo de la presente invención que la reducción de
la cantidad de productos no específicos formados en una reacción de
amplificación mejoraban de forma ventajosa la precisión de la
producción de amplicón analito y transformaban los ensayos de
amplificación cualitativos en ensayos cuantitativos.
El enfoque preferido para reducir la formación de
productos no específicos requiere la inclusión de una pseudodiana en
la reacción de amplificación y luego detectar cuantitativamente los
amplicones analitos que se sintetizan en la reacción. De esta
manera, la producción de amplicones analitos puede estar relacionada
de una forma dependiente de la dosis con la cantidad de
polinucleótido analito presente en el momento en el que se inicia la
reacción de amplificación. Adicionalmente, de acuerdo con los
métodos inventados, no es necesario detectar amplicones pseudodiana
para cuantificar el número de polinucleótidos analitos presentes en
una muestra de prueba.
Así, se expone aquí un método para cuantificar
polinucleótidos analitos que no se basa en la detección de los
productos de amplificación surgidos a partir de algún estándar
interno. El desarrollo de este enfoque fue posible por el
reconocimiento de la fuente del problema que subyace la variabilidad
en la producción de amplicones analitos, y que puede controlarse al
incluir una pseudodiana en la reacción de amplificación. Aunque la
pseudodiana sirve como plantilla en la reacción de amplificación, la
detección de amplicones pseudodiana no es necesaria para cuantificar
polinucleótidos analitos. A pesar de que pueda parecer contrario a
lo esperado, la precisión de una reacción de amplificación se mejora
al añadir a la reacción una plantilla que compite con el
polinucleótido analito por los reactivos necesario para sintetizar
amplicones. Los resultados mostrados en adelante demuestran el valor
de este procedimiento. Dicho en otras palabras, los métodos
expuestos aquí representan un procedimiento para controlar la
producción, que de otra forma sería altamente variable, de productos
de amplificación no específicos al introducir en el sistema
polinucleótidos plantilla que están amplificados, pero que no son
necesariamente detectados o cuantificados.
Las Figuras 3a-3b ilustran cómo
las pseudodianas pueden transformar una reacción de amplificación de
polinucleótidos cualitativa en un ensayo cuantitativo. La Figura 3a
muestra cómo una reacción optimizada convierte un grupo de
reactantes (representados en el diagrama por un octágono) en
productos de amplificación específicos (SP) utilizando
polinucleótidos analitos diana (TA) como plantilla. En ausencia de
una pseudodiana, el ensayo es cualitativo porque la cantidad de
amplicón analito producido en la reacción no está cuantitativamente
relacionado con el nivel de partida de polinucleótido analito diana.
Tanto si el nivel de partida de polinucleótido analito es bajo o
elevado, eso no altera la cantidad de amplicón analito sintetizado
en la reacción. En cambio, la cantidad de amplicón analito que puede
producirse en la reacción es definido por el grupo de reactantes de
partida y no por el nivel inicial de polinucleótido analito. De esta
forma, se produce una cantidad constante de amplicón cuando la
reacción de amplificación se lleva a cabo hasta el punto de
agotamiento de reactantes. En cambio, la Figura 3b muestra cómo las
reacciones de amplificación realizadas en presencia de productos
específicos para analitos sintetizadores de pseudodiana en
proporción a la cantidad de polinucleótido analito inicial cuando
las reacciones paralelas incluyen una pseudodiana. Más
concretamente, cuando las reacciones de amplificación de
polinucleótidos incluyen una pseudodiana, la cantidad final de
amplicón analito está relacionada de una forma dependiente de las
dosis con el nivel de partida de polinucleótido analito que se usó
como plantilla en la reacción. De acuerdo con esto, sólo es
necesario cuantificar el amplicón analito (y no el amplicón
pseudodiana) para obtener información sobre el nivel de inicio del
polinucleótido analito en la reacción. Este método de cuantificación
de polinucleótidos sortea la necesidad para detectar amplicones que
no sean el amplicón analito, o para usar diferentes sondas para
distinguir diferentes especies de amplicones. Adicionalmente, el
mismo grupo pareado de oligonucleótidos cebadores puede usarse para
amplificar tanto el polinucleótido analito como la pseudodiana,
puesto que los dos productos de la reacción de amplificación serán
distinguibles utilizando una sonda de hibridación específica para
analitos.
Las figuras 4a-4d ilustran como
la síntesis de amplicones analito refleja cuantitativamente el nivel
de partida de polinucleótido analito en un rango extenso cuando dos
reacciones de amplificación por competición tienen lugar
simultáneamente. La figura 4a muestra los resultados que se
esperaría para una reacción de amplificación ideal que tiene lugar
en ausencia de formación de productos no específicos. Se espera un
nivel constante de formación de amplicón analito a todos los niveles
de polinucleótido analito de entrada. Este caso refleja la reacción
ilustrada en la Figura 3a. La Figura 4b muestra los resultados que
se esperaría para reacciones de amplificación que espontáneamente
generan productos no específicos a bajos niveles. Un estrecho rango
en función de la dosis existe sólo a bajos niveles de entrada de
polinucleótido analito. La Figura 4c muestra los resultados que se
esperaría para reacciones de amplificación que generan
espontáneamente niveles elevados de productos de amplificación no
específicos. En este ejemplo, las reacciones de amplificación
llevadas a cabo a cualquier nivel de entrada de polinucleótido
analito producen cantidades de amplicón comprendidas en un rango,
como se indica en el eje de las Y de la gráfica. La contribución más
significativa de la formación de productos no específicos distingue
los resultados que se muestran en las figuras 4b y 4c. La amplitud
de las líneas relacionadas con los niveles de entrada de la síntesis
de polinucleótido analito y amplicón analito refleja la baja
precisión de la formación de amplicón analito y es atribuible al
hecho de que la formación espontánea de productos de amplificación
no específicos pueden ser altamente variables. La Figura 4d muestra
los resultados que se esperaría obtener en una reacción de
amplificación ideal que incluye una pseudodiana. LA cantidad de
amplicón analito producida en la reacción muestra tanto la precisión
mejorada y una relación dependiente de la dosis en un amplio rango
de niveles de polinucleótido analito de entrada. Este caso refleja
la reacción ideal ilustrada en la
Figura 3b.
Figura 3b.
Así, los aspectos cuantitativos y la precisión de
la reacción de amplificación conducida de acuerdo con el método
inventado están interrelacionados por la existencia y
controlabilidad de las reacciones de competencia donde los
polinucleótidos analitos y no analitos co-amplifican
y compiten por los reactantes. El rango dinámico mejorado surge
cuando una segunda reacción de amplificación compite con la reacción
específica para analitos por los reactantes. La precisión mejorada
en la cantidad de síntesis de amplicón analito surge cuando la
segunda reacción se hace altamente controlable al incluir
pseudodianas en la reacción de amplificación a un nivel de 1 x
10^{3} - 2 x 10^{8} moléculas por reacción, donde una reacción
típica tiene un volumen de 100 \mul.
Puesto que las reacciones de amplificación que
incluyen pseudodianas ponen de relieve ventajosamente las relaciones
cuantitativas entre el número de entrada de polinucleótidos analitos
en la reacción y el número de amplicones analitos sintetizados, el
número de polinucleótidos analitos presente en una muestra de prueba
puede determinarse usando una curva estándar. Más concretamente, una
pluralidad de reacciones de amplificación que contenga cantidades
constante de pseudodiana y cantidades conocidas de polinucleótido
analito estándar puede realizarse en paralelo con una reacción de
amplificación preparada usando una muestra de prueba que contenga un
número desconocido de polinucleótidos analitos. Por otro lado, la
curva estándar puede prepararse por adelantado, de forma que es
innecesario preparar una curva cada vez que se lleve a cabo un
procedimiento analítico. LA curva preparada por anticipado puede
incluso guardarse de forma electrónica en un dispositivo de memoria
de un instrumento de la prueba. Los métodos de amplificación
preferidos incluyen las reacciones de Amplificación Mediada por
Transcripción, las reacciones NASBA y las reacciones de cadenas de
polimerasa. La Amplificación Mediada por Transcripción es claramente
preferida. Las cantidades de pseudodiana usadas deberían ser las
mismas para cada reacción y preferiblemente estar en el rango de 10
a 2 x 10^{8}, de 2 x 10^{8}, de 10^{4} a 2 x 10^{8}, de
10^{5} a 2 x 10^{8}, o de 10^{7} y 2 x 10^{8} moléculas
pseudodiana por reacción. Las reacciones que incluyen pseudodianas
pueden realizarse según los métodos descritos aquí siendo
cuantificado con el número de amplicones analito sintetizado en cada
reacción mediante procedimientos de detección e hibridación
estándar. Aunque la detección de amplicones pseudodiana no es
necesaria para cuantificar cantidades de
pre-amplificación de polinucleótido analito en la
muestra de prueba, la detección de amplicones pseudodiana puede
usarse opcionalmente para confirmar el éxito de las reacciones de
amplificación. De esta forma, la detección de amplicones pseudodiana
sirve como un control de amplificación interno. Se prepara entonces
una curva estándar con cantidades de
pre-amplificación de polinucleótido analito estándar
en un primer eje y las cantidades de
post-amplificación correspondientes de amplicón
analito en un segundo eje. La cantidad de
post-amplificación de amplicón analito medida para
la reacción de prueba se coloca en el eje de
post-amplificación de la curva estándar. El valor
correspondiente en el otro eje de la curva representa la cantidad de
pre-amplificación de polinucleótido analito que
estaba presente en la reacción de prueba. Así, la determinación del
número de moléculas de polinucleótido analito presente en la muestra
de prueba se consigue consultando la curva estándar, o más
concretamente comprando los resultados cuantitativos obtenidos para
la muestra de prueba con la curva estándar, un procedimiento que
será familiar para aquéllos con cierto nivel de pericia en la
materia.
Los procedimientos descritos aquí pueden usarse
fácilmente para cuantificar los polinucleótidos analito presentes en
una muestra de prueba. De hecho, si una pluralidad de reacciones de
amplificación de control conteniendo pseudodianas, se inician usando
números conocidos de moléculas de un polinucleótido analito
estándar, y si una reacción de prueba que incluye la pseudodiana se
inicia usando un número desconocido de moléculas de polinucleótido
analito, entonces resulta posible, tras cuantificar el número de
amplicones analito en cada reacción, determinar el número de
moléculas de polinucleótido analito que deben haber estado presentes
en la muestra de prueba. Por ejemplo, si reacciones estándar que
incluyen respectivamente 500, 1000 y 1500 moléculas de
polinucleótido analito estándar producen señales de amplicón analito
de 1s, 22x y 3x siguiendo un procedimiento de hibridación basado en
sonda específica para analitos, y si la muestra de prueba produce
una señal de amplicón analito correspondiente a 1,5x, entonces la
muestra de prueba debe haber contenido 750 moléculas de
polinucleótido analito. En este caso de ejemplo, existe una relación
lineal entre la señal generada por los amplicones surgida del
polinucleótido analito estándar en el rango de 500 a 1500 moléculas.
La relación entre el número de moléculas de polinucleótido analito
de entrada en las reacciones de amplificación estándar y la fuerza
de las señales específicas de amplicones es más conveniente
establecerla utilizando una gráfica. Determinar el número de
moléculas de polinucleótido analito presente en una muestra de
prueba es simplemente una cuestión de determinación del número de
moléculas de polinucleótido analito, a partir de la gráfica
estándar, que corresponde a una fuerza de señal de amplicón analito
medida. Esto ilustra cómo los estándares de polinucleótido analito
pueden usarse conectados con pseudodianas en reacciones de
amplificación de polinucleótidos para cuantificar cantidades de
pre-amplificación de polinucleótidos analitos
contenidos en las muestras
de prueba.
de prueba.
La siguiente información puede usarse para
diseñar polinucleótidos pseudodiana para su uso conjuntamente con
los métodos expuestos aquí. Dada esta información, pueden fabricarse
pseudodianas útiles que corresponden a cualquier número de
polinucleótidos analitos que haya que detectar y cuantificar. Las
aplicaciones ejemplares donde las pseudodianas pueden usarse junto
con procedimientos de amplificación de polinucleótidos incluyen,
pero no exclusivamente: (1) detección de un patógeno viral o
bacteriano; (2) cuantificación de polinucleótidos, donde dicha
cuantificación es útil como indicador de procesos de enfermedad,
como la progresión de la enfermedad del VIH; y (3) otras
aplicaciones numerosas incluyendo pruebas para análisis forenses,
ambientales y alimenticios.
En una realización preferida de la invención, la
pseudodiana y el polinucleótido analito son amplificables usando el
mismo grupo de dos oligonucleótidos cebadores. En este ejemplo, un
único oligonucleótido cebador que tenga un sitio de unión
complementario en la pseudodiana tendrá también un sitio de unión
complementario en el polinucleótido analito.
En otra realización preferida, la pseudodiana y
el polinucleótido analito, que sirven como plantillas en la reacción
de amplificación, amplifican con eficiencia sustancialmente similar.
Así, tanto si la amplificación se lleva a cabo usando TMA, PCR o
cualquier otro procedimiento como SDA (amplificación por
desplazamiento de la cadena) o métodos que usen moléculas
polinucleótidas autoreplicativas y enzimas de replicación como
MDV-1 RNA y enzimas Q-beta, la
pseudodiana y los polinucleótidos analito tendrán preferiblemente
amplificaciones similares.
Una forma de asegurar que la pseudodiana y las
plantillas de polinucleótidos analito tendrán eficiencias de
amplificación similares consiste en requerir que las dos plantillas
muestren secuencias de polinucleótidos estrechamente relacionadas,
pero no idénticas, en el lapso de la secuencia que se amplifica en
el procedimiento. Por ejemplo, un polinucleótido pseudodiana puede
ser creado aleatorizando una porción interna de la secuencia de un
polinucleótido analito, donde la secuencia aleatorizada se
corresponde con la porción del polinucleótido analito que sirve como
la parte de la molécula que se híbrida con una sonda específica
mediante el polinucleótido analito. La longitud del polinucleótido
pseudodiana no es crítica para su operación en la práctica de los
métodos descritos aquí.
Es esencial que la pseudodiana y el
polinucleótido analito sean co-amplificables en una
única reacción, y que las dos especies de amplicón resultantes
puedan ser detectadas de forma independiente. Más concretamente, es
esencial que los productos de la amplificación de la pseudodiana y
el polinucleótido analito tenga secuencias polinucleótidas que
difieran entre ellas de forma que se puedan distinguir dos productos
por su longitud, su capacidad para hibridar a una sonda de
detección, o por otros métodos. Puesto que las plantillas de
polinucleótidos amplificadas en las reacciones de amplificación
contendrán normalmente un número sustancial de bases nucleótidas
interpuestas entre las regiones homólogas o complementarias a los
sitios de unión del cebador usados para realizar la reacción de
amplificación, estas secuencias interpuestas pueden servir como
regiones a las que se pueden unir sondas de hibridación
seleccionadas. Los criterios útiles para seleccionar las sondas de
hibridación y detección serán conocidos para aquéllos con un nivel
ordinario en la materia. Las sondas útiles, de acuerdo con la
invención, incluyen polinucleótidos marcados, así como
oligonucleótidos útiles como cebadores en las siguientes reacciones
de amplificación.
Cuando se añade la pseudodiana a un espécimen
biológico antes de que se aísle el polinucleótido analito del
espécimen, por ejemplo como ayuda al procesamiento de una muestra,
es importante que la pseudodiana y el polinucleótido analito sean
recuperables del espécimen por el mismo procedimiento de
procesamiento de la muestra. Por ejemplo, si el polinucleótido
analito es recuperable bajo condiciones fuertemente alcalinas que
desnaturalizan el DAN e hidrolizan el RNA, entonces también debería
ser cierto que la pseudodiana es recuperable como una molécula
estructuralmente intacta bajo las mismas condiciones. Así, si las
condiciones de tampón alcalino se usan para aislar polinucleótidos
analitos en presencia de polinucleótidos pseudodiana añadidos,
entonces ni el analito ni la pseudodiana deberían ser una molécula
de RNA que se degradaría durante el procedimiento de aislamiento. De
forma similar, si la pseudodiana y el polinucleótido analito deben
precipitar, por ejemplo por adición de un alcohol como el etanol,
entonces la pseudodiana y el polinucleótido analito deberían
precipitar con eficiencias sustancialmente
similares.
similares.
Resulta significativo el hecho de que se
prefiere, pero no es esencial, que la pseudodiana y el
polinucleótido analito sean co-amplificables usando
el mismo grupo de oligonucleótidos cebadores. Más concretamente, los
ensayos cualitativos de amplificación de polinucleótidos para la
detección de un polinucleótido analito usando un grupo pareado de
cebadores específicos para analitos pueden transformarse en ensayos
cuantitativos al incluir en la reacción una pseudodiana y un grupo
de cebadores para amplificar la pseudodiana. En una realización del
método inventado, el polinucleótido analito y la pseudodiana son
co-amplificables usando los mismos dos
cebadores.
También es posible usar una "pseudodiana
universal" y un grupo de cebadores específicos para pseudodianas
para producir reacciones de amplificación cuantitativas. En una
realización de la invención, los cebadores usados para amplificar la
pseudodiana universal pueden ser los mismos que los cebadores usados
para amplificar el polinucleótido analito. La pseudodiana universal
no tiene por qué estar necesariamente relacionada con la estructura
del polinucleótido analito, y no tiene por qué
co-amplificar con el polinucleótido analito con una
eficiencia de amplificación similar. Las reacciones de amplificación
llevadas a cabo usando niveles de partida elevados o bajos de
polinucleótidos analito sintetizarán amplicones analitos de una
forma que es dependiente de la dosis de las cantidades de partida de
polinucleótidos analitos presentes cuando las reacciones de
amplificación se iniciaron. Usando este procedimiento, se puede
evaluar dos o más reacciones de amplificación para la producción de
amplicones analitos, siendo los niveles de amplicones analito
relacionados con los niveles de partida de polinucleótidos analitos
en cada muestra de una forma dependiente de la dosis.
Mientras que los buenos resultados pueden
conseguirse usando pseudodianas y cebadores asociados que no estén
relacionados con el polinucleótido analito, es preferible usar
pseudodianas que co-amplifiquen con el
polinucleótido analito usando el mismo grupo de cebadores. Este
enfoque preferido reduce de forma ventajosa la variabilidad en la
composición del conjunto de reactivos usado como fuente para la
síntesis de amplicones en la reacción de amplificación. Sin embargo,
los ilustrativos ejemplos presentados aquí para describir la
invención usan pseudodianas y polinucleótidos analitos ejemplares
que co-amplifican usando grupos comunes de
oligonucleótidos cebadores.
En general, los beneficios positivos conseguidos
al incluir pseudodianas en las reacciones de amplificación
polinucleótida se pueden conseguir en un rango muy amplio de
concentraciones de pseudodiana. Más concretamente, incluir
pseudodianas en reacciones de amplificación, como las reacciones
TMA, en cantidades que oscilan entre 1 x 10^{3} y 2 x 10^{8}
moléculas, tendrá como resultado: (1) mayor precisión de
amplificación, (2) posibilidades reducidas de contaminación positiva
y (3) normalización de la variabilidad de la recuperación de dianas,
como se muestra aquí. Dentro de los límites prácticos, los niveles
de partida más elevados de pseudodianas en una reacción de
amplificación tendrán como resultado una mejora mayor de los tres
parámetros antes mencionados.
Puesto que los amplicones pseudodiana se
sintetizan usando reactantes nucleótidos trifosfato que, de otra
forma, se usarían para sintetizar amplicones analitos, la presencia
de una pseudodiana en una reacción de amplificación tiene como
resultado la reducción de la síntesis de amplicones analitos. Esto
sucede porque tanto los amplicones analito como los amplicones
pseudodiana se sintetizan a partir de un grupo de reactantes
limitado. De acuerdo con esto, los niveles de partida cada ves más
elevados de pseudodiana tendrán como resultado cantidades cada vez
menores de amplicón analito producido en la reacción de
amplificación. Así, el límite superior de la concentración de
pseudodiana inicial en una reacción de amplificación será una
cuestión práctica en función de la sensibilidad del procedimiento
usado para detectar el amplicón analito.
La cantidad o concentración superior límite de
una pseudodiana que puede incluirse en una reacción de
amplificación, y que proporcionará niveles de amplicón analito
adecuados para la detección es más fácilmente determinada mediante
experimentos rutinarios. De nuevo, será obvio para aquéllos expertos
en la materia, que los niveles elevados de pseudodiana en una
reacción de amplificación realizada hasta el punto en el que se
agota el reactivo, tendrán como resultado cantidades menores de
amplicón analito producido en la reacción. Esto es porque los
amplicones pseudodiana se sintetizan a expensas de los amplicones
analitos en la reacción de amplificación. Así, las reacciones de
amplificación que incluyen niveles muy elevados de pseudodiana
tendrán como resultado la producción de bajos niveles de amplicón
analito. Los ensayos altamente sensibles para la detección de
amplicones analitos serán particularmente útiles para la detección
de estos niveles bajos de amplicón analito. Por otro lado, los
ensayos menos sensibles que requieren menos cantidades de amplicón
analito para una señal de detección positiva, serán útiles para
detectar grandes cantidades de amplicón analito que pueden surgir de
las reacciones de amplificación que incluyen sólo niveles de entrada
de pseudodianas bajos, y eso da como resultado niveles más elevados
de amplicón analito. De esta forma, el límite superior de la
cantidad de pseudodiana que puede usarse para realizar una reacción
de amplificación dependerá de la sensibilidad del ensayo que será
usado en última instancia para la detección de amplicones analitos,
y no en la misma reacción de amplificación.
Puesto que es generalmente cierto que los niveles
elevados de pseudodiana de entrada provocan reducciones en los
productos de amplificación no específicos en reacciones como la
reacción TMA, se entiende que la cantidad de pseudodiana incluida en
una reacción de amplificación debería ser preferiblemente tan
elevada como fuera posible. El nivel de pseudodiana más elevado
expuesto en los Ejemplos que siguen era de 2 x 10^{8} moléculas en
una reacción de 100 \mul. Obviamente, el sistema de detección
usado para encontrar los amplicones analitos debe ser
suficientemente sensible para dar señales positivas cuando los
polinucleótidos analitos están presentes en la muestra inicial, de
forma que los amplicones analitos sean sintetizados en la reacción
de amplificación. En la práctica, un rango de concentraciones de
pseudodiana puede evaluarse para identificar una cantidad óptima que
proporciona buenos resultados en la reacción de amplificación, tal
como se mide mediante la detectabilidad de amplicones analitos
usando un sistema de detección con una sensibilidad concreta para la
detección de amplicones analitos. Normalmente, los controles
positivos y negativos se incluyen en este procedimiento para indicar
los resultados que se esperaría para reacciones de amplificación que
no incluyen polinucleótidos analitos, respectivamente.
La cantidad de pseudodiana seleccionada para
realizar una reacción de amplificación puede verse influenciada por
la magnitud de la amplificación, el número de partida de
polinucleótidos analitos en la reacción y en la sensibilidad del
sistema de detección usando para detectar amplicones analitos. Las
reacciones TMA estándares amplifican típicamente niveles de
polinucleótidos iniciales por 10^{12} y 10^{13} veces. Un
sistema de detección de polinucleótidos ejemplar puede detectar
aproximadamente 6 x 10^{7} moléculas en un ensayo de hibridación.
Para detectar 100 moléculas de un polinucleótido analito en una
muestra que sirve como fuente para plantillas en una reacción de
amplificación, sería necesario conseguir una amplificación de
aproximadamente 6 x 10^{5} veces (6 x 10^{7} dividido entre
100). Para conseguir por lo menos una amplificación de 6 x 10^{5}
veces de las 100 moléculas de polinucleótidos analitos, la reacción
de amplificación no debería incluir más de 1 x 10^{7} moléculas
pseudodiana. Esto es porque 6 x 10^{12} (como un valor de ejemplo
en el rango de entre 10^{12}-10^{13} veces, como
se ha indicado anteriormente) dividido entre 1 x 10^{7} es un
incremento de 6 x 10^{5} veces. La inclusión de un número mayor de
moléculas pseudodiana reduciría el exponente de la amplificación a
menos del valor aceptable 6 x 10^{5}. Si, en cambio se usara un
protocolo PCR que lleve a una amplificación 1 x 10^{9}, la
cantidad máxima aceptable de pseudodiana en la reacción de
amplificación sería de 1 x 10^{9} dividido entre 6 x 10^{5}, ó
1,7 x 10^{3} moléculas. Así, debería quedar claro que: (1) un
rango amplio de concentraciones pseudodiana será útil en la práctica
del método expuesto aquí, y (2) una cantidad óptima de pseudodiana
puede determinarse empíricamente cuando se conoce el número de
polinucleótidos analitos está en una muestra que se estudia en un
protocolo
de amplificación.
de amplificación.
Las cantidades preferidas de pseudodiana útiles
para realizar reacciones de amplificación se encuentran típicamente
en el rango entre 10^{3} y 10^{9} moléculas por reacción, donde
la reacción típica se lleva a cabo en un volumen de 100 \mul. Por
ejemplo, un ensayo para detectar polinucleótidos VIH en una muestra
de suero aislado de un humano infectado por VIH puede realizarse
usando entre 10^{3} y 2 x 10^{8}, entre 10^{4} y 2 x 10^{8}
ó entre 10^{5} y 2 x 10^{8} moléculas de pseudodiana por
reacción. En una realización altamente preferida, la reacción de
amplificación es una reacción TMA y el método HPA (ensayo de
protección homogénea) se usa para detectar los amplicones analitos
producidos en las reacciones de amplificación llevadas a cabo usando
estas cantidades de pseudodiana. Como se indica en los siguientes
Ejemplos, los rangos amplios de concentraciones de pseudodiana se
han evaluado y han demostrado dar buenos resultados.
Los kits útiles para poner en práctica los
métodos de amplificación de polinucleótidos descritos aquí
incluirán: (1) una pseudodiana, (2) oligonucleótidos cebadores para
co-amplificar la pseudodiana y el polinucleótido
analito, (3) reactivos para llevar a cabo la reacción de
amplificación de polinucleótidos, y (4) instrucciones impresas para
realizar una reacción de amplificación y para detectar
específicamente sólo los amplicones analitos producidos en la
reacción. Opcionalmente, el kit puede incluir una sonda marcada para
detectar los amplicones analitos. Los reactivos incluidos con el kit
comprenderán trifosfatos desoxirribonucleótidos y un enzima
polimerizante de DNA, que puede ser una transcriptasa reversa. Los
trifosfatos nucleótidos y una RNA polimerasa son reactivos
opcionales que pueden incluirse en el kit.
Con estos antecedentes, se describe con más
detalle tres aspectos de la invención concretos.
Las técnicas de amplificación, tanto
cuantitativas como cualitativas, representan herramientas poderosas
para detectar y medir incluso las cantidades de trazas de
polinucleótidos diana específicos. Sin embargo, la dificultad para
obtener una eficiencia de amplificación uniforme entre diferentes
reacciones implica que la variabilidad en la medida de la
amplificación compromete la precisión de la cuantificación y la
capacidad para detectar pequeñas cantidades de diana. Se buscó
desarrollar métodos que pudieran minimizar la formación de productos
no específicos, mejorar la precisión en la medida de la síntesis de
amplicones analitos y maximizar la facilidad con la que se pueda
llevar a cabo reacciones de amplificación cuantitativas.
La variabilidad en la medida de amplificación
parece ser parcialmente debido a la síntesis enzimática de productos
de reacción no específicos. La formación de estos productos no
específicos se hacía más notable cuando las reacciones contenían
únicamente niveles de partida muy bajos de polinucleótidos diana que
servían como plantillas de amplificación. A niveles más elevados de
polinucleótidos diana, la formación de productos de reacción no
específicos era menos importante y representaba sólo una pequeña
proporción del producto total de la reacción. Así, un objetivo de la
presente invención era el de simular las condiciones de reacción
características de concentraciones de polinucleótidos diana elevadas
incluso cuando los niveles de partida de polinucleótidos analito en
as mezclas de reacción eran muy bajos. Más concretamente, era
deseable simular condiciones de reacción favorables que minimizarían
la formación de productos no específicos, tal como se representa en
la Figura 2.
Las reacciones de amplificación con el suplemento
de polinucleótidos pseudodiana que co-amplificaban
con el polinucleótido analito proporcionaron las condiciones de
reacción necesarias para alcanzar los objetivos. Esto permitió que
la reacción de amplificación se comportara como si hubiera presentes
niveles elevados de analito, incluso cuando el nivel de analitos
real en la reacción de amplificación era bajo. Tal como se indica en
los resultados experimentales indicados más adelante, la adición de
más de 10^{5} copias del polinucleótido pseudodiana mejoraron la
precisión de la amplificación, tal como se midió con un coeficiente
de variabilidad (CV%) mejorado de unidades de luz relativa (ULR),
donde las ULR representan un indicador medible de la cantidad de
sonda hibridada. En el presente contexto, CV% es un valor
estadístico que se calcula dividiendo la desviación estándar (SD)
para un conjunto de datos entre la media neta para ese conjunto y
luego se multiplica el resultado por 100. Los valores más bajos de
CV% reflejan una dispersión menor entre los puntos de datos y se
entienden como indicadores de una precisión experimental más
elevada. Así, el método descrito aquí proporciona una forma de
mejorar la precisión con la que los polinucleótidos analitos son
amplificados a la par que se reduce la formación de productos de
reacción no específicos de distintos tamaños.
Los métodos expuestos aquí proporcionan además un
mecanismo para estandarizar los resultados de las reacciones de
amplificación de polinucleótidos independientemente del nivel de
partida de polinucleótido analito, siempre y cuando el
polinucleótido analito estuviera presente en un número de copias
menor que el número de copias de la pseudodiana. En un procedimiento
ejemplar descrito en adelante, el polinucleótido analito estaba
presente en un grupo de mezclas de reacción de amplificación a
niveles de partida de 10^{1}-10^{5} moléculas,
mientras que la pseudodiana estaba presente en todas las mezclas en
una cantidad de 10^{6} moléculas. Esto significa que las
reacciones de amplificación se iniciaron sustancialmente a partir de
10^{6} plantillas de polinucleótidos porque la contribución de los
polnucleótidos analitos al número total de plantillas en cualquiera
de las mezclas era mínimo. Así, todas las reacciones de
amplificación se comportaron como si contuvieran aproximadamente
10^{6} plantillas, aunque el número de polinucleótidos analitos
varió ampliamente. Esto estandarizó de forma efectiva las reacciones
de amplificación a 10^{6} polinucleótidos de plantillas
independientemente del nivel real de analito.
Se ha descubierto además que las pseudodianas
pueden utilizarse para superar obstáculos asociados con la
"sobreproducción" de amplicones analito que puede llevar a una
cuantificación poco precisa de niveles elevados de polinucleótido
diana de entrada. Si se producen cantidades excesivas de amplicón en
una reacción de amplificación, y si estos amplicones deben
cuantificarse por hibridación de una sonda de detección hasta
saturación, entonces se consumirán necesariamente grandes cantidades
de sonda de detección en el paso de detección del ensayo. Por otro
lado, si se producen niveles reducidos de amplicón, entonces se
necesitará menos sonda de detección para realizar el paso de
detección. Aún otra ventaja de la reducción de la cantidad de
amplicón producido en una reacción de amplificación está relacionada
con el otro aspecto del aparato de detección utilizado para detectar
el amplicón. Puesto que la detección implica el uso de aparatos como
luminómetros, a menudo se obtendrán rangos de respuesta lineal que
pueden saturarse a niveles de señal elevados, supone una ventaja el
poder llevar a cabo reacciones de amplificación de forma que la
señal producida en el paso de detección esté comprendida dentro de
los rangos de respuesta lineal para el aparato de detección. Así, la
capacidad de controlar la síntesis de amplicón es claramente
beneficiosa con respecto a los siguientes pasos de detección.
La cantidad de amplicón analito generado en la
reacción de amplificación puede controlarse incluyendo una
pseudodiana en la reacción de amplificación para competir con el
polinucleótido diana por la síntesis de amplicón. Cuando la
pseudodiana está presente, los reactantes en la mezcla de reacción
de amplificación se usarán para sintetizar tanto los amplicones
analitos como los amplicones pseudodiana. Si la reacción de
amplificación lleva al agotamiento de reactivos, y si se producen
cantidades más elevadas de amplicones pseudodiana a expensas de
amplicones analito, entonces la proporción relativa de amplicones
analito puede reducirse por el aumento de la cantidad inicial de
pseudodiana en la reacción de amplificación. La determinación del
nivel apropiado de pseudodiana que hay que incluir en la reacción de
amplificación puede realizarse usando sólo una experimentación
rutinaria.
Un enfoque alternativo a la reducción de la
producción de amplicón analito en una reacción de amplificación de
polinucleótido, como la reacción TMA, sería la de llevar a cabo la
reacción bajo condiciones sub-óptimas, como las descritas en las
patentes estadounidenses nº 5.705.365 y 5.710.029. Esta alternativa
puede algunas veces resultar deseable que los enfoques antes
descritos porque se puede necesitar diferentes condiciones para
"des-optimizar" la reacción para detectar
diferentes analitos. En contraste, la reducción de la cantidad de
amplicón analito producido en una reacción por la inclusión de una
pseudodiana permite que todas las reacciones se realicen bajo
condiciones óptimas.
De esta forma, la inclusión de una pseudodiana en
una reacción de amplificación proporciona una manera de
"sintonizar" una reacción de amplificación cuantitativa por la
competencia de niveles elevados de diana con niveles aún más
elevados de pseudodiana.
La recuperación uniforme de polinucleótidos diana
a partir de diferentes muestras biológicas es muy importante para
muchos ensayos cuantitativos. Por ejemplo, los ensayos para
determinar los niveles de plasma de viriones VIH podrían fácilmente
llevar a una estimación imprecisa de los niveles de viriones en el
plasma si la precisión de la recuperación del polinucleótido diana
es baja. Aquí se describe un enfoque alternativo que es
relativamente tolerante a la variabilidad en el nivel de entrada de
polinucleótidos analitos.
Más que esforzarse para conseguir una
recuperación cuantitativa de polinucleótidos que sirva como
plantilla en la reacción de amplificación, un aspecto de la
invención va dirigido a la obtención de un método para normalizar la
variabilidad de la recuperación de polinucleótido diana en el paso
de procesamiento del espécimen. De acuerdo con este enfoque, la
cantidad final de producto de amplificación de polinucleótido diana
se controla fácilmente cuando el nivel de una pseudodiana es
suficientemente elevado como para que la amplificación de la
pseudodiana compita con la amplificación de la diana real y cuando
la pseudodiana y el polinucleótido analito son
co-amplificables con similares eficiencias de
amplificación. En este rango, la cantidad de amplicón analito es
inversamente proporcional al nivel de entrada de la pseudodiana. Por
ejemplo, si el nivel de entrada de una pseudodiana se aumenta X
veces, entonces el amplicón analito se reducirá a 1/X. Cuando la
pseudodiana está presente en los pasos de procesamiento del
espécimen, la pseudodiana y la diana real se recuperan con
eficiencias similares. Por lo tanto, si la eficiencia de la
recuperación para el polinucleótido analito es K%, entonces la
pseudodiana también mostrará una recuperación con una eficiencia de
K%.
Bajo condiciones que de otra forma son idénticas,
las reacciones producirán una cantidad relativamente constante de
amplicón. Así, la adición de pseudodiana evita que los componentes
de la reacción produzcan amplicón no específico y asegura que todo
el amplicón producido en la reacción sea efectivamente o bien
amplicón pseudodiana o amplicón analito, representando el producto
de amplificación de un polinucleótido analito. El amplicón
pseudodiana y el amplicón analito serán producidos en la misma
proporción que la proporción de la pseudodiana y el polinucleótido
analito en el momento en el que la reacción de amplificación se
inicia.
Cuando los polinucleótidos analitos y las
pseudodianas son co-aislados y luego se añaden a una
reacción de amplificación que provoca un agotamiento de los
reactantes, la proporción relativa del analito resultante y los
amplicones pseudodiana será la misa que la proporción relativa de
analito y polinucleótidos pseudodiana en la muestra aislada a partir
del espécimen biológico. Esto significa que, independientemente de
la eficiencia de la recuperación de polinucleótido en el
procesamiento del espécimen, la cantidad de amplicón analito
sintetizada en una reacción de amplificación será la misma que la
cantidad que ser habría sintetizado si el 100% del polinucleótido
analito y la pseudodiana se hubieran recuperado en el paso de
procesamiento del espécimen. De esta forma, mediante la adición de
pseudodiana a un espécimen biológico en el momento del procesado
para aislar polinucleótidos para la subsiguiente amplificación, la
eficiencia de la recuperación de la diana se normaliza en el
subsiguiente paso de amplificación.
Se puede utilizar dos formatos convenientes para
llevar a cabo las reacciones TMA que se utilizaron en los ejemplos
que se describe más adelante. En el primer formato, todos los
materiales se encuentran en un estado líquido en todo momento. Por
ejemplo, las soluciones de reactivos, plantillas y enzimas, se
combinan en un recipiente de reacción y se permite que la
amplificación tenga lugar. Esto es especialmente conveniente cuando
el polinucleótido diana está disponible es un estado purificado o
semi-purificado. En el segundo formato, la plantilla
polinucleótida que hay que amplificar en la reacción TMA es primero
acumulada en fase sólida (como en una cuenta), y el complejo que
incluye la fase sólida y la plantilla combinada con otros reactivos
en la reacción de amplificación. Las soportes en fase sólida que son
útiles incluyen, pero no exclusivamente, nitrocelulosa, nailon,
cristal, partículas magnéticas recubiertas, poliacrilamida,
poliestireno y polímeros derivados como epoxis. El segundo formato
es especialmente conveniente cuando la plantilla de polinucleótido
está disponible en cantidades limitantes. Aquéllos que cuenten con
un nivel ordinario de pericia en la materia, observarán que la
manipulación de pequeñas muestras de polinucleótidos puede
sustituirse por la manipulación de suspensiones de las cuentas, que
son más grandes y más manejables. Además, las cuentas pueden
representar un componente en un esquema para la purificación de la
plantilla. Por ejemplo, las cuentas que tienen un
oligo(dT)polinucleótido dispuesto sobre ellas pueden
mezclarse con un lisado celular de forma que el
poli(A)^{+} mRNA se quede inmovilizado en las
cuentas. Así, el complejo que incluye las cuentas y mRNA
inmovilizado puede combinarse con reactivos y enzimas de forma que
la reacción TMA pueda llevarse a cabo usando el RNA unido a las
cuentas como plantillas para la amplificación. Bajo estas
circunstancias, las cuentas pueden añadirse directamente al
recipiente de la reacción. Si en lugar de un oligo(dT)
polinucleótido se inmoviliza en las cuentas un polinucleótido con
una secuencia diferente, esta secuencia puede usarse para capturar
un polinucleótido analito complementario o una pseudodiana a partir
de un conjunto de polinucleótidos. Este método de inmovilización de
un polinucleótido concreto en un soporte sólido puede proporcionar
maneras para aislar polinucleótidos concretos a partir de mezclas
complejas de polinucleótidos. Otros métodos para aislar
polinucleótidos pueden incluir procedimientos estándar como la
extracción con reactivos orgánicos, o las mezclas de fenol y
cloroformo, incluyendo opcionalmente pasos de precipitación de
alcohol.
Los siguientes ejemplos demostraron que la
presencia de pseudodianas reducía ventajosamente la variabilidad de
la producción de amplicón en las reacciones TMA que incluían cuentas
magnéticas derivatizadas con oligo(dT). Este descenso en la
variabilidad puede expresarse alternativamente como un aumento en la
"precisión" de la amplificación. Más concretamente, los
resultados que se presentan más adelante, demuestran que las
diferentes reacciones llevadas a cabo usando cantidades
sustancialmente idénticas de plantillas iniciales de polinucleótidos
produjeron de forma ventajosa más resultados reproducibles cuando la
variabilidad entre las muestras se redujo.
Aunque se puede usar muchos métodos diferentes de
detección de polinucleótidos amplificados en relación con la
presente invención, el "Ensayo de Protección Homogénea" (HPA)
expuesto en la patente estadounidense nº 5.639.604 representa un
método particularmente útil. En una realización el método de
detección HPA incluye la hibridación de polinucleótidos amplificados
con una sonda de polinucleótidos complementaria que está marcada con
un éster de acridina quimioluminiscente. Cuando está hibridado en
una estructura dúplex, el éster de acridina está protegido contra la
degradación bajo condiciones de hidrólisis moderada. El éster de
acridina en moléculas de sonda no hibridada es susceptible a dicha
degradación y se destruye selectivamente mediante los tratamientos
químicos adecuados. LA determinación de la cantidad de éster de
acridina sin degradar indica la cantidad de sonda que se híbrido a
polinucleótidos complementarios. Este paso determinante incluye la
adición de peróxido de hidrógeno a la mezcla y la medición de la
cantidad de luz emitida durante las siguientes reacciones
quimioluminiscentes base-catalizadas. El método HPA
de cuantificación de la síntesis de amplicón es preferido porque no
requiere pasos tediosos y que requieran mucho tiempo para eliminar
el exceso de sonda no hibridada que de otra forma supondría niveles
más elevados de hibridación de fondo. Sin embargo, se puede usar
otros métodos par ala detección y cuantificación de amplicones, como
los procedimientos que utilizan sondas marcadas radiactivamente, con
fluorescencia o con enzimas u otros métodos de detección que
utilicen métodos de separación incluyendo, pero no exclusivamente,
los formatos con soportes en fase sólida, HPLC y electroforesis,
para la práctica del método de la invención con métodos igual de
buenos. De hecho, no se espera que el método usado para detectar
amplicones influencie la calidad de los resultados que se obtendrían
en los siguientes procedimientos.
Tal como se describe aquí, los métodos
cuantitativos que utilizan pseudodianas pueden usarse para llevar a
cabo reacciones de amplificación independientemente del origen del
polinucleótido analito. Los polinucleótidos analitos preferidos
incluyen los ácidos nucleicos de organismos causantes de
enfermedades, incluyendo virus, bacterias, hongos y protozoos. Entre
los ejemplos de polinucleótidos analitos altamente preferidos de
virus se encuentran los ácidos nucleicos para los virus de
inmunodeficiencia humana (VIH-1 y
VIH-2), el virus de la hepatitis B (VHB), y el virus
de la hepatitis C (VHC). Los polinucleótidos analitos de bacterias,
hongos y protozoos que pueden cuantificarse de acuerdo con los
métodos expuestos aquí incluyen los RNA ribosómicos (rRNA). Entre
los ejemplos de bacterias que son altamente preferidas como fuentes
de polinucleótidos analitos se incluye Chlamydia trachomatis
(células gram-negativas que son organismos
intracelulares obligados), miembros del género Campylobacter (C.
jejuni, C. coli, C. laridis), miembros del género
Enterococcus (E. avium, E. casseliflavus, E.
durans, E. faecalis, E. faecium, E.
gallinarum, E. hirae, E. mundtii, E.
pseudoavium, E. malodoratus, y E. raffinosus),
Haemophilus influenzae, Listeria momocytogenes,
Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus, los
Estreptococos del grupo B, stroptococcus pneumonieae,
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium,
Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium gordonae,
Mycobacterium kansasii. Los ejemplos de hongos que son
altamtnete preferidos como fuentes de polinucleótidos analito
incluyen: Blastomyces dermatitidis, miembros del género
Candida (C. albicans, C. glabrata, C.
parapsilosis, C. diversus, C. tropicalis, C.
guilliermondii, C. dubliniensis), Histoplastama
capsulatum, Coccidioides immitis. Los ejemplos de
protozoos que son altamente preferidos como fuentes de
polinucleótidos analitos incluyen protozoos de la sangre y los
tejidos, como los miembros del género Plasmodium (P.
malariae, P. falciparum, P. vivax), así como los
protozoos que infectan el tracto gastrointestinal, como la
Giardia lamblia y el Cryptosporidium parvum.
El método inventado también puede usarse para
cuantificar los ácidos nucleicos que son de origen humano, como los
mRNA que están sobreexpresados o subexpresados en estados de
enfermedad, incluyendo el cáncer. Un ejemplo de gen que está
presente en un número de copia aumentado en adenocarcinomas de mama
y ovarios es el oncogén HER-2/neu, que codifica una
tirosin quinasa con ciertas características en común con el receptor
del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). La patente
estadounidense de número 4.968.603 describe el valor de medir el
número de opia aumentado del gen HER-2/neu, o del
HER-2/neu mRNA como herramienta para la
determinación de estados de enfermedad neoplástica. Así, por
ejemplo, el método descrito aquí puede usarse en protocolos de
amplificación de ácido nucleico donde se determina el contenido
celular de los polinucleótidos HER-2/neu.
De hecho, el método de amplificación de
polinucleótidos descrito aquí es totalmente ampliamente aplicable a
varias dianas de ácidos nucleicos y es fácilmente extensible a
procedimientos para cuantificar cualquier polinucleótido analito en
una muestra de prueba.
Aunque se puede usar otros materiales y métodos
similares o equivalentes a los descritos aquí en la práctica o
pruebas de la presente invención, los métodos preferidos y sus
materiales se describen ahora. Las referencias generales a métodos
que pueden usarse para realizar las diversas manipulaciones de
ácidos nucleicos y los procedimientos descritos aquí pueden
encontrarse en Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(Sambrook, et al., eds. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989) y
Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, et
al., eds., Greene Publishing Associates y
Wiley-Interscience 1987). Los métodos para llevar a
cabo la reacción TMA se exponen en la patente estadounidense nº
5.399.491. Las mejoras en el protocolo de reacción TMA, como las
descritas en la patente estadounidense nº 5.786.183, están inscritas
dentro del enfoque de la Amplificación Medida por Transcripción con
el propósito de la presente explicación. Los métodos para preparar y
utilizar sondas marcadas con éster de acridina se encuentran en
Arnold et al., en la patente estadounidense nº 5.639.604.
Seguidamente se incluye una descripción de los experimentos y
resultados que llevaron a la creación de la presente invención.
El ejemplo 1 describe los métodos que demostraron
que las reacciones de amplificación de polinucleótidos que incluían
una pseudodiana mostraron una variabilidad reducida de la producción
de amplicón.
Se preparó una serie de reacciones TMA usando
cebadores específicos para un segmento del transcrito VIH
pol. Todas las reacciones se realizaron en replicados de
ocho. Cada reacción recibió: 510 \mul que contenían 60 copias de
transcritos RNA del genoma de VIH completo diluido en tampón de
espécimen compuesto por HEPES 10 mM (pH 7,5) y EDTA 1 mM. El
transcrito RNA se sintetizó usando el plásmido BH10 como plantilla.
En este procedimiento, el RNA BH10 se usó como polinucleótido
analito de ejemplo. La secuencia polinucleótida del RNA BH10 viene
dada por la secuencia de ID DE SEC Nº 3. Las reacciones también
incluían o bien 0, ó 10^{5}, 10^{6} ó 10^{7} copias del RNA
pseudodiana IAC-Ascr con la secuencia de ID DE SEC
Nº 4. Se añadió 25 230l de reactivo de amplificación compuesto por
10 pmols de un cebador T7A(-)4190 con la secuencia:
AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTTTGTA
TGTCTGTTGCTATTATGTCTA (ID DE SEC Nº 1); 10 pmols del cebador (+)4108 con la secuencia ACAGCAGTA
CAAATGGCAG (ID DE SEC Nº 2); tampón Tris 160 mM (pH 7,5): 16 mM de cada ATP, CTP, GTP y UTP; 4 mM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP; MgCl_{2} 100 mM; KCl 70 mM; glicerol 20%; acetato de zinc 0,6 mM y polivinilpirrolidona 20%. Se recubrió las muestras con 200 \mul de aceite mineral, se incubó primero a 65ºC durante 10 minutos para permitir la hibridación cebador-diana, y luego se incubó a 42ºC durante 5 minutos. Después, cada reacción recibió una alícuota de 25 \mul de mezcla de enzimas que contenía 2000 unidades GP de transcriptasa reversa MMLV; 2000 unidades GP de polimerasa T7RNA; tampón Tris 140 mM (pH 8,0); N-acetilcisteína 100 mM como agente reductor; glicerol 20%; KCl 70 mM; trehalosa 80 mM; HEPES 8 mM; EDTA 1,04 mM; TRITON X-102 10% y fenol rojo 0,01%. Una unidad GP de transcriptasa reversa se corresponde con la cantidad de enzima que sintetiza 5,75 fmols de cDNA de una plantilla de RNA en 15 minutos a 37ºC. Una unidad GP de RNA polimerasa se define como la cantidad de enzima que sintetiza 5 fmols de RNA transcrito a partir de un molde de DNA de doble cadena que contenta una secuencia cebadora en un periodo de 20 minutos a 37ºC. Las reacciones se incubaron a 42ºC durante 60 minutos adicionales. Después se combinó muestras de 100 \mul de las mezclas de reacción con un volumen igual de sonda VIH-específica AE(+)4134 con una fracción de éster de acridina como marcador y con la secuencia
CCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGG (ID DE SEC Nº 5). Esta sonda polinucleótida marcada se preparó y usó esencialmente de acuerdo con el método expuesto en la patente estadounidense nº 5.639.604 y se dispersó en una solución que incluía tampón de succinato de litio 100 mM (pH 4,7), sulfato láurico de litio 2% (p/v), cloruro de litio 1,2M, ardritiol-2 15 mM, EDTA 20 mM, EGTA 20 mM y etanol 3%. Sustancialmente, toda la fuerza iónica para fomentar la reacción de hibridación fue proporcionada por el cloruro de litio 600 mM y los componentes de sulfato láurico de litio al 1% de la solución de hibridación final. Es importante el hecho de que la secuencia de la sonda AE(+)4134 permitía la hibridación a través del aparejamiento de bases complementarias sólo con el amplicón analito y no con el amplicón pseudodiana. Tras hibridar la mezcla a 60ºC durante 15 minutos, se añadió 300 \mul de una selección de reactivo que contenía borato de sodio 600 mM (pH 8,5) y TRITON X-100 al 1%, y se incubó la mezcla a 60ºC para inactivar la sonda no hibridada. Finalmente, las mezclas se dejaron enfriar a temperatura ambiente, colocadas en un luminómetro y la cantidad de amplicón analito se cuantificó midiendo la luz emitida con la reacción quimioluminiscente (en ULR). El reactivo de detección I incluía solución de peróxido de hidrógeno en ácido nítrico 0,001N. El reactivo de detección II incluía solución de NaOH 1N. Cada tubo de reacción se inyectó primero con reactivo de detección I y luego con reactivo de detección II para estimular la emisión de luz. Cabe destacar que las sondas utilizadas para detectar y cuantificar el amplicón analito fueron de la siguiente manera: las reacciones que no recibieron pseudodiana se sondaron con 100 fmols de sonda AE(+)4134 marcada (ID DE SEC Nº 5) y 3,9 pmols de 2'metoxiribonucleótido (2'OMe)(+)4134 no marcado; las reacciones que incluían 10^{5} copias de la pseudodiana fueron sondadas utilizando 100 fmols de sonda marcada y 3,9 pmols de 2'OMe (+)4134; las reacciones que incluían 10^{6} copias de la pseudodiana fueron sondadas usando 100 fmols de sonda marcada y 0,2 pmols de 2'OMe(+)4134; las reacciones que incluían 10^{7} copias de la pseudodiana fueron sondadas usando únicamente 100 fmols de la sonda marcada. Era notable que el 2'OMe substituía una fracción metoxi por la fracción hidroxil en la posición 2' de la ribosa del RNA. Cabe destacar que el polinucleótido (+)4134 tenía la misma secuencia de bases que el polinucleótido AE(+)4134, pero no incluía la marca del éster N-acridina. Las diferentes actividades específicas de cada sonda se usaron para facilitar las lecturas de luminometría en un rango de
detección lineal.
TGTCTGTTGCTATTATGTCTA (ID DE SEC Nº 1); 10 pmols del cebador (+)4108 con la secuencia ACAGCAGTA
CAAATGGCAG (ID DE SEC Nº 2); tampón Tris 160 mM (pH 7,5): 16 mM de cada ATP, CTP, GTP y UTP; 4 mM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP; MgCl_{2} 100 mM; KCl 70 mM; glicerol 20%; acetato de zinc 0,6 mM y polivinilpirrolidona 20%. Se recubrió las muestras con 200 \mul de aceite mineral, se incubó primero a 65ºC durante 10 minutos para permitir la hibridación cebador-diana, y luego se incubó a 42ºC durante 5 minutos. Después, cada reacción recibió una alícuota de 25 \mul de mezcla de enzimas que contenía 2000 unidades GP de transcriptasa reversa MMLV; 2000 unidades GP de polimerasa T7RNA; tampón Tris 140 mM (pH 8,0); N-acetilcisteína 100 mM como agente reductor; glicerol 20%; KCl 70 mM; trehalosa 80 mM; HEPES 8 mM; EDTA 1,04 mM; TRITON X-102 10% y fenol rojo 0,01%. Una unidad GP de transcriptasa reversa se corresponde con la cantidad de enzima que sintetiza 5,75 fmols de cDNA de una plantilla de RNA en 15 minutos a 37ºC. Una unidad GP de RNA polimerasa se define como la cantidad de enzima que sintetiza 5 fmols de RNA transcrito a partir de un molde de DNA de doble cadena que contenta una secuencia cebadora en un periodo de 20 minutos a 37ºC. Las reacciones se incubaron a 42ºC durante 60 minutos adicionales. Después se combinó muestras de 100 \mul de las mezclas de reacción con un volumen igual de sonda VIH-específica AE(+)4134 con una fracción de éster de acridina como marcador y con la secuencia
CCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGG (ID DE SEC Nº 5). Esta sonda polinucleótida marcada se preparó y usó esencialmente de acuerdo con el método expuesto en la patente estadounidense nº 5.639.604 y se dispersó en una solución que incluía tampón de succinato de litio 100 mM (pH 4,7), sulfato láurico de litio 2% (p/v), cloruro de litio 1,2M, ardritiol-2 15 mM, EDTA 20 mM, EGTA 20 mM y etanol 3%. Sustancialmente, toda la fuerza iónica para fomentar la reacción de hibridación fue proporcionada por el cloruro de litio 600 mM y los componentes de sulfato láurico de litio al 1% de la solución de hibridación final. Es importante el hecho de que la secuencia de la sonda AE(+)4134 permitía la hibridación a través del aparejamiento de bases complementarias sólo con el amplicón analito y no con el amplicón pseudodiana. Tras hibridar la mezcla a 60ºC durante 15 minutos, se añadió 300 \mul de una selección de reactivo que contenía borato de sodio 600 mM (pH 8,5) y TRITON X-100 al 1%, y se incubó la mezcla a 60ºC para inactivar la sonda no hibridada. Finalmente, las mezclas se dejaron enfriar a temperatura ambiente, colocadas en un luminómetro y la cantidad de amplicón analito se cuantificó midiendo la luz emitida con la reacción quimioluminiscente (en ULR). El reactivo de detección I incluía solución de peróxido de hidrógeno en ácido nítrico 0,001N. El reactivo de detección II incluía solución de NaOH 1N. Cada tubo de reacción se inyectó primero con reactivo de detección I y luego con reactivo de detección II para estimular la emisión de luz. Cabe destacar que las sondas utilizadas para detectar y cuantificar el amplicón analito fueron de la siguiente manera: las reacciones que no recibieron pseudodiana se sondaron con 100 fmols de sonda AE(+)4134 marcada (ID DE SEC Nº 5) y 3,9 pmols de 2'metoxiribonucleótido (2'OMe)(+)4134 no marcado; las reacciones que incluían 10^{5} copias de la pseudodiana fueron sondadas utilizando 100 fmols de sonda marcada y 3,9 pmols de 2'OMe (+)4134; las reacciones que incluían 10^{6} copias de la pseudodiana fueron sondadas usando 100 fmols de sonda marcada y 0,2 pmols de 2'OMe(+)4134; las reacciones que incluían 10^{7} copias de la pseudodiana fueron sondadas usando únicamente 100 fmols de la sonda marcada. Era notable que el 2'OMe substituía una fracción metoxi por la fracción hidroxil en la posición 2' de la ribosa del RNA. Cabe destacar que el polinucleótido (+)4134 tenía la misma secuencia de bases que el polinucleótido AE(+)4134, pero no incluía la marca del éster N-acridina. Las diferentes actividades específicas de cada sonda se usaron para facilitar las lecturas de luminometría en un rango de
detección lineal.
Los resultados presentados en la Tabla 1 indican
que las reacciones de amplificación que incluían una pseudodiana
contaban con la ventaja de dar resultados más uniformes con menos
variabilidad entre el grupo de muestras. La Tabla 1 muestra el
número de copias de pseudodiana IAC-Ascr y
polinucleótido analito BH10 RNA incluido en cada reacción. También
se muestran los datos brutos que representan la emisión de luz de
las reacciones (en ULR) y la emisión neta que se ha corregido para
restar la emisión de fondo medida en las reacciones de control
negativo. La columna marcada como "Corregido para Sp. Act.
Uniforme" indica el valor de las ULR netas que se obtendría si
todos los ensayos HPA se realizaran usando la misma sonda de elevada
actividad específica. Este valor se incluye en el análisis para que
las diferentes reacciones puedan compararse de forma directa. Las
medias netas de todas las determinaciones para unas condiciones de
reacción concretas se presentan también junto con los valores
calculados para la desviación estándar (SD) y el coeficiente de
variabilidad (CV%). La última columna de la tabla muestra que los
valores CV% descendieron a la vez que el número de copias de
pseudodiana en las reacciones aumentó. Este resultado indicó
cuantitativamente que la variabilidad en la cantidad de amplicón
producido en diferentes reacciones descendía mientras que la
cantidad de pseudodiana se aumentaba.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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El ejemplo 2 describe los métodos usados para
demostrar que la precisión mejorada de la producción de amplicón fue
una característica general de las reacciones que incluían una
pseudodiana. Más concretamente, los siguientes procedimientos
muestran que una segunda pseudodiana a modo de ejemplo, llamada
IAC-Bscr, también redujo la variabilidad de la
producción de amplicón en una reacción TMA ejemplo.
Se añadió 30 \mul que contenían 60 moléculas de
BH10 RNA diluido en un tampón de espécimen (EDTA 1 mM, HEPES 10 mM)
a un grupo de tubos de reacción. Se añadió 20 \mul que contenían
0, 10^{5},10^{6}, 10^{7}, ó 10^{8} moléculas de RNA
pseudodiana IAC-Bscr (ID DE SEC Nº 9) en tampón de
espécimen a los tubos apropiados. Tras pasar por el vórtex, cada
tubo recibió una alícuota de 25 \mul de reactivo de amplificación
descrito en el Ejemplo 1, con la excepción de que las
concentraciones de los cebadores T7A(-)4190 y (+)4108 se usaron a 5
pmols cada una, en lugar de 10 pmols. El contenido líquido de cada
tubo fue recubierto después con 200 \mul de aceite para evitar la
evaporación. Se incubó los tubos a 65ºC durante 10 minutos y luego a
42ºC durante 5 minutos. Posteriormente se añadió una alícuota de 25
\mul de reactivo enzimático como se ha descrito en el Ejemplo 1 en
cada tubo. Los contenidos de todos los tubos se mezclaron y se
incubó las reacciones a 42ºC durante 1 hora. Al final del periodo de
reacción, todas las muestras fueron sujetas a análisis por HPA
estándar. De acuerdo con esto, 100 \mul de la solución de la sonda
2'metoxi AE(+)4134 marcada con acridina se añadió a cada tubo. Se
usó las diferentes actividades específicas de la sonda para detectar
amplicones analitos en las muestras producidas utilizando distintas
cantidades de la pseudodiana IAC-Bscr. Esto aseguró
que la lectura de la emisión de luz en el procedimiento de detección
estuviera dentro del rango lineal del luminómetro que se usó para
cuantificar los amplicones analito. Las sondas que se usaron para
detectar y cuantificar el amplicón analito fueron las siguientes:
las reacciones que no recibieron pseudodiana fueron sondadas con 100
fmols de 2'Ome(+)4134 marcada y 20,0 pmols de sonda sin marcar; las
reacciones que incluían 10^{5} copias de pseudodiana fueron
sondadas usando 100 fmols de sonda marcada y 3,0 pmols de sonda sin
marcar; las reacciones que incluían 10^{6} copias de la
pseudodiana fueron sondadas usando 100 fmols de sonda marcada y 0,4
pmols de sonda sin marcar; las reacciones que incluían 10^{7} ó
10^{8} copias de la pseudodiana fueron sondadas usando 100 fmols
de únicamente sonda marcada. Las mezclas de los productos de
amplificación y la sonda se incubaron a 60ºC durante 15 minutos, se
mezclaron 300 \mul de reactivo de selección y luego se incubaron a
60ºC durante 10 minutos adicionales. Las mezclas se enfriaron a
temperatura ambiente y se midió la quimioluminiscencia tras añadir
los reactivos de detección I y II.
Los resultados que se muestra en la Tabla 2
confirman que las reacciones de amplificación que incluían una
pseudodiana produjeron de forma ventajosa cantidades más uniformes
de amplicón analito con menos variabilidad dentro del grupo de
lecturas de las muestras. La Tabla 2 muestra el número de copias de
pseudodiana IAC-Bscr y polinucleótido analito BH10
RNA que se incluyeron en cada una de las 8 reacciones de
amplificación replicadas que se llevaron a cabo para cada nivel de
pseudodiana de entrada. También se muestran los resultados que
representan la media neta de las lecturas de emisión de luz a partir
de todas las reacciones HPA. Los valores de emisión de fondo medidos
para las reacciones que incluían la pseudodiana sin incluir el
polinucleótido analito modelo se restaron para obtener los
resultados netos. Las cantidades medias de amplicón analito
producido para cada condición de reacción ("Amplicón") se
muestran de forma que los productos de las diferentes reacciones HPA
hibridados con sondas con actividades específicas diferentes
pudieran compararse directamente. También se muestran los valores de
la desviación estándar (SD) y el coeficiente de variabilidad (CV%)
que se calculó para todas las determinaciones de luminometría para
unas condiciones de reacción concretas. Los resultados confirmaban
que las cantidades de amplicón analito sintetizado en las reacciones
que incluían una pseudodiana se producían con mayor precisión que en
las reacciones que no se incluía ninguna pseudodiana. Más
concretamente, las reacciones que se llevaron a cabo usando más de 1
x 10^{5} moléculas pseudodiana proporcionaron valores CV% que eran
menores que el valor CV% obtenido del conjunto de datos producido
por las reacciones llevadas a cabo en ausencia de pseudodiana. De
hecho, el valor "p" estadístico era menor de 0,05 para las
reacciones en los conjuntos de datos que se realizaron usando por lo
menos 10^{6} moléculas de pseudodiana. Esto confirmó
cuantitativamente que la variabilidad en la cantidad de amplicón
producido en diferentes reacciones disminuía cuando la pseudodiana
estaba presente.
| IAC-Bscr | BH10 RNA | Media | Amplicón | Desviación | Coeficiente de |
| (copias) | (copias) | neta (ULR) | (pmols) | Estándar (SD) | Variabilidad (CV%) |
| Ninguna | 60 | 165085 | 1,84 | 103009 | 62,4 |
| 1 x 10^{5} | 60 | 193642 | 0,29 | 134671 | 69,5 |
| 1 x 10^{6} | 60 | 164908 | 0,039 | 46096 | 28,0 |
| 1 x 10^{7} | 60 | 96749 | 0,0029 | 30116 | 31,1 |
| 1 x 10^{8} | 60 | 10199 | 0,0003 | 2475 | 24,3 |
El ejemplo 3 describe métodos que se usaron para
investigar si la precisión de la amplificación se vería también
potenciada por las reacciones realizadas en presencia de cuentas
magnéticas derivatizadas. En este procedimiento, las cuentas se
procesaron de acuerdo con el procedimiento de procesamiento del
espécimen estándar que incluye un "polinucleótido de captura de
dianas" sintético.
Se combinó 100 \mul de un reactivo de captura
de diana con un volumen igual de plasma seronegativo VIH. El
reactivo de captura de diana incluía sulfato láurico de litio 17%;
ácido succínico 190 mM; hidróxido de litio 250 mM; EDTA 3 mM; EGTA 3
mM; sonda de captura desoxi (-)3737 3,5nM que contiene la secuencia
CCCTGTTTCTGCTGGAA
TAACTTCTGCTTCTATATTTAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (ID DE SEC Nº 6) y sonda de captura 2'metoxi (-)4258 3,5nM que contiene la secuencia TCTGCTGTCCCTGTAATAAACCCGTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (ID DE SEC Nº 7). Se incubó la mezcla a 60ºC durante 20 minutos y luego se combinó con 20 \mul de suspensión de cuentas que incluía 120 \mug de cuentas magnéticas derivatizadas con oligo(dT) (Novagen; Madison WI). Se dejó enfriar las reacciones a temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir la hibridación de la sonda de captura y del oligo(dT) inmovilizado. Se reunió las cuentas a un lado de la pared del recipiente durante 15 minutos tras posicionarlo en un soporte magnético, y se aspiró el sobrenadante. Las cuentas se lavaron tres veces usando alícuotas de 1ml de reactivo de lavado y se usaron en una reacción TMA tal y como se describe en el Ejemplo 1, excepto por el hecho de que se usó 100 copias del BH10 RNA, y 0, 10^{3}, 10^{4} ó 10^{5} copias de la pseudodiana IAC-Ascr. El HPA se llevó a cabo usando 100 fmols de sonda AE(+)4134 marcada y 200 fmols de (+)4134 no marcada, de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente.
TAACTTCTGCTTCTATATTTAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (ID DE SEC Nº 6) y sonda de captura 2'metoxi (-)4258 3,5nM que contiene la secuencia TCTGCTGTCCCTGTAATAAACCCGTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (ID DE SEC Nº 7). Se incubó la mezcla a 60ºC durante 20 minutos y luego se combinó con 20 \mul de suspensión de cuentas que incluía 120 \mug de cuentas magnéticas derivatizadas con oligo(dT) (Novagen; Madison WI). Se dejó enfriar las reacciones a temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir la hibridación de la sonda de captura y del oligo(dT) inmovilizado. Se reunió las cuentas a un lado de la pared del recipiente durante 15 minutos tras posicionarlo en un soporte magnético, y se aspiró el sobrenadante. Las cuentas se lavaron tres veces usando alícuotas de 1ml de reactivo de lavado y se usaron en una reacción TMA tal y como se describe en el Ejemplo 1, excepto por el hecho de que se usó 100 copias del BH10 RNA, y 0, 10^{3}, 10^{4} ó 10^{5} copias de la pseudodiana IAC-Ascr. El HPA se llevó a cabo usando 100 fmols de sonda AE(+)4134 marcada y 200 fmols de (+)4134 no marcada, de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente.
Los resultados que se presentan en la Tabla 3
confirman que las reacciones de amplificación que incluían una
pseudodiana proporcionaron de forma ventajosa una producción más
uniforme del amplicón analito. Más concretamente, estos resultados,
que se basan en replicados de 8 reacciones de amplificación
realizadas para cada nivel de entrada de pseudodiana, indican de
nuevo que los valores de CV% disminuyeron para los ensayos que se
realizaron en presencia de cantidades crecientes de pseudodiana.
Resultó notable el hecho de que los niveles mayores que 10^{4}
copias de pseudodiana por reacción dieran las mejoras
estadísticamente más significativas en la precisión de la síntesis
de amplicón analito.
| IAC-Bscr | BH10 RNA | Media neta | Desviación | Coeficiente de |
| (copias) | (copias) | (ULR) | Estándar (SD) | Variabilidad (CV%) |
| Ninguna | 100 | 97105 | 37798 | 39,0 |
| 1,0 x 10^{3} | 100 | 152313 | 38630 | 25,4 |
| 1,0 x 10^{4} | 100 | 155062 | 67377 | 43,5 |
| 1,0 x 10^{5} | 100 | 12385 | 19655 | 15,9 |
El resultado que se presenta en el siguiente
Ejemplo confirmó que las reacciones TMA que incluían una
pseudodiana, y que usaron polinucleótidos analitos capturados en un
soporte inmovilizado, mostraron una precisión mejorada respecto a la
cantidad de amplicón analito sintetizado en la reacción de
amplificación. Mientras que los procedimientos descritos bajo el
Ejemplo 3 demostraron que la presencia de un sustrato de captura en
fase sólida no afectaba adversamente a la reacción TMA, los
procedimientos que se establecen más abajo son más cercanos
paralelamente a la manera en la que se realiza los procedimientos de
prueba diagnósticos, de acuerdo con la invención. Más concretamente,
los procedimientos usados en el siguiente Ejemplo usaron RNA VIH
capturado como plantillas de amplificación. La variabilidad que
surge de la recuperación inconstante de dianas en estos
procedimientos fue normalizada para permitir que la precisión de
amplificación se pudiera examinar de forma independiente. Más
concretamente, el RNA VIH se recogió primeramente con cuentas
magnéticas de acuerdo con el protocolo de procesamiento de
especímenes estándar, y luego se juntó y redistribuyó en tubos
individuales, de forma que las reacciones de amplificación pudieran
iniciarse con cantidades iguales de RNA VIH, pero con diferentes
cantidades de pseudodiana.
El ejemplo 4 describe los métodos usados para
demostrar que las reacciones TMA realizadas usando pseudodianas y
plantillas de polinucleótido analito capturadas en sustratos sólidos
proporcionaron una precisión mejorada de la producción de amplicón
en las reacciones de amplificación.
En tubos de reacción individuales, se combinaron
alícuotas de 100 \mul de reactivo de captura de dianas y una
suspensión de viriones VIH diluida en plasma seronegativo que
contenía o bien 0 ó 200 copias equivalentes de RNA VIH/100 \mul de
plasma. El reactivo de captura de diana incluía los siguientes
reactivos en las concentraciones especificadas: EDA disodio 3 mM;
EGTA 3 mM, sulfato láurico de litio 17%; ácido succínico 190 mM
(ajustado a un pH final de 5,1); hidróxido de litio 250 mM; desoxi
VIH (-)3837 A30 3,5 mM (ID DE SEC Nº 6); y 2'metoxi VIH(-)4258 A30
(ID DE SEC Nº 7) 3,5 mM. Las muestras se incubaron a 60ºC durante 20
minutos para liberar el RNA VIH de los viriones, para desnaturalizar
todos los polinucleótidos y para permitir la hibridación de las
sondas de captura a las secuencias pol de las dianas. Se
añadió entonces a cada tubo de reacción alícuotas de 20 \mul de
cuentas de oligo(dT)en suspensión que contenían 120
\mug de cuentas derivatizadas con oligo(dT). Tras mezclar
exhaustivamente, se enfrió las muestras a temperatura ambiente
durante 15 minutos para permitir la hibridación de la cola
oligo(dA) de la sonda de captura y el oligo(dT)
inmovilizado en las cuentas, conectando así el polinucleótido
analito a la cuenta magnética mediante un puente polinucleótido. Las
cuentas y los polinucleótidos inmovilizados allí se aislaron del
plasma y los polinucleótidos libres al colocar los tubos en un
soporte magnético durante un periodo de 5 minutos, durante el cual
las cuentas se aglomeraron en una de las superficies internas de
cada tubo. Se aspiró el sobrenadante y las cuentas aisladas se
lavaron tres veces usando alícuotas de 1ml de reactivo de lavado
(0,1% SDS, HEPES 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM) con aislamiento
magnético de las cuentas entre cada paso. Las cuentas se combinaron
con 40 \mul de tampón espécimen (EDTA 1 mM, HEPES 10 mM), mezclado
y reunido. Se distribuyó alícuotas de 40 \mul de la suspensión de
cuentas reunidas a tubos de reacción frescos, de forma que las
muestras contenían cantidades sustancialmente idénticas de
polinucleótidos analitos capturados en las cuentas. Se distribuyó
alícuotas de 10 \mul de pseudodiana diluido en tampón espécimen
(EDTA 1 mM, HEPES 10 mM) en tubos adecuados. Cada alícuota contenía
o bien 0, ó 2 x 10^{6}, 2 x 10^{7} ó 2 x 10^{8} moléculas de
la pseudodiana RNA IAC-Ascr ó IAC Bscr. Las
reacciones de amplificación TMA se llevaron a cabo como se ha
descrito anteriormente en el Ejemplo. Se detectó los amplicones
analito usando una versión modificada del procedimiento HPA llamada
"Hidrólisis Promovida por un Aducto" (APH, del inglés Adduct
Promoted Hydrolysis). Siguiendo las reacciones de amplificación,
cada tubo recibió una alícuota de 100 \mul de sonda 2'Ome (+)4134
marcada con acridina. Las pruebas con diferentes actividades
específicas de pseudodiana, ya sean IAC-Ascr ó
IAC-Bscr, darían lecturas de emisión de luz que se
incluirían dentro del rango de respuesta lineal para luminometría.
Estas actividades específicas diferentes se consiguieron al mezclar
sondas marcadas y no marcadas. Las sondas usadas para detectar y
cuantificar el amplicón analito fueron las siguientes: reacciones
que no recibieron la pseudodiana se sondaron con 1,0 pmols de sonda
2'Ome (+)4134 marcada y 100,0 pmols de sonda sin marcar; las
reacciones que incluían 10^{6}, 10^{7} ó 10^{8} copias de la
pseudodiana fueron sondadas usando 1,0 pmols de sonda marcada y 1,0
pmols de sonda sin marcar. Las reacciones se incubaron a 60ºC
durante 15 minutos, se mezclaron con 300 \mul de reactivo de
selección que contenía metaarsenito de sodio, y se incubaron a 60ºC
durante 20 minutos. Se dejó enfriar las mezclas a temperatura
ambiente y se midió la quimioluminiscencia tras añadir reactivos de
detección I y II.
Los resultados de las Tablas 4 y 5 confirmaron
que las reacciones de amplificación que incluían una pseudodiana
produjeron de forma ventajosa amplicones analito en cantidades más
uniformes y con menos variabilidad entre el grupo de lecturas de la
muestra. Las tablas muestran que cada reacción se cebó usando o bien
0 ó 200 equivalentes de RNA del virión VIH (cepa VIH IIIb) como
polinucleótido analito, y una de seis condiciones pseudodiana. La
primera condición era un control negativo donde las reacciones se
llevaban a cabo en ausencia de la pseudodiana. Las demás condiciones
usaban o la pseudodiana IAC-Ascr (Tabla 4) o la
IAC-Bscr (Tabla 5) en una de las tres cantidades.
Los datos resumidos en ambas tablas representan el resultado de 8
ensayos de replicación llevados a cabo para cada nivel de entrada de
pseudodiana. Los valores de emisión de fondo producida en las
reacciones que incluían la pseudodiana sin incluir la plantilla de
polinucleótido analito modelo se restaron para obtener los
resultados netos. Los resultados indicaron claramente que la
cantidad de amplicón producido en las reacciones descendió mientras
el número de moléculas de pseudodiana en la reacción aumentó, tal y
como se esperaba. Todas las reacciones de amplificación que incluían
una pseudodiana dieron como resultado la producción de cantidades
más uniformes de amplicón analito. Más concretamente, los valores
CV% eran menores entre todos los grupos de datos derivados de las
reacciones que incluían pseudodianas cuando se comparaba con el
control negativo que se realizó en ausencia de pseudodiana. Estos
resultados respaldan la conclusión de que la precisión en la
cantidad de amplicón analito producido en una reacción de
amplificación puede mejorarse incluyendo una pseudodiana en la
reacción. El hecho de que dos pseudodianas diferentes produjeran
resultados igualmente buenos demostró que la precisión mejorada no
dependía de la secuencia concreta de la pseudodiana. Estos
resultados además mostraron cómo la precisión en la cantidad de
amplicón analito producida en una reacción de amplificación podía
mejorarse al incluir pseudodianas en reacciones que utilizaban
polinucleótidos analitos capturados por un soporte sólido, como las
cuentas magnéticas, como plantillas para la reacción de
amplificación.
| Pseudodiana IAC-Ascr | Virión VIH | Media neta | Amplicón | Desviación | Coeficiente de variabilidad |
| (copias) | (copias) | (ULR) | (pmol) | estándar (SD) | (CV%) |
| Ninguna | 200 | 69858 | 0,95 | 57195 | 81,9 |
| 2 x 10^{6} | 200 | 166824 | 0,03 | 62799 | 37,6 |
| 2 x 10^{7} | 200 | 26733 | 0,0041 | 13616 | 50,9 |
| 2 x 10^{8} | 200 | 3043 | 0,0005 | 585 | 19,2 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Pseudodiana IAC-Ascr | Virión VIH | Media neta | Amplicón | Desviación | Coeficiente de variabilidad |
| (copias) | (copias) | (ULR) | (pmol) | estándar (SD) | (CV%) |
| Ninguna | 200 | 69858 | 0,95 | 57195 | 81,9 |
| 2 x 10^{6} | 200 | 109125 | 0,0166 | 37519 | 34,4 |
| 2 x 10^{7} | 200 | 14904 | 0,0023 | 10669 | 71,6 |
| 2 x 10^{8} | 200 | 1492 | 0,0002 | 697 | 46,8 |
Otra ventaja de realizar reacciones de
amplificación en presencia de una pseudodiana tiene relación con la
normalización de la cantidad de amplicón producido cuando el
polinucleótido analito de entrada se recupera a partir de una
muestra biológica a un rendimiento menor que cuantitativo. La base
de esta ventaja, que se ilustra en la Figura 5, se ha comentado con
anterioridad. El siguiente ejemplo se usó para modelar situaciones
donde la recuperación de polinucleótidos analitos a partir de una
muestra biológica difirió sustancialmente. Más concretamente, las
condiciones examinadas oscilaban entre el equivalente a una
recuperación entre 100% y 25%. Tales diferencias en la eficiencia de
la recuperación de polinucleótido analito pueden surgir por razones
que incluye la recuperación variable de los procedimientos de
extracción de fenol, los procedimientos de precipitación de etanol,
la dificultad de unir el espécimen, o las condiciones de extracción,
o incluso una pérdida de muestra en el laboratorio debida a algún
derrame. En cada caso, la cantidad de polinucleótido analito
recuperado podría ser menor que la recuperación cuantitativa.
Tal como se describe en adelante, la eficiencia
variable de la recuperación de polinucleótido analito se modeló al
llevar a cabo reacciones de amplificación bajo tres condiciones
diferentes. Bajo la primera condición, las reacciones se llevaron a
cabo usando tres cantidades diferentes de polinucleótido analito de
entra sin pseudodiana. La segunda condición implicaba reacciones
realizadas usando las mismas tres cantidades de polinucleótido
analito de entrada y una cantidad constante de pseudodiana.
Finalmente, una tercera condición de reacción usaba las mismas tres
cantidades de polinucleótido analito de entrada, donde la proporción
de las cantidades de polinucleótido analito y pseudodiana eran
constante. Se aprecia claramente que esta tercera condición
representa un caso que podría resultar cuando la pseudodiana se
añadiera a una muestra biológica que contenga polinucleótido analito
en un tiempo anterior al momento en el que los ácidos nucleicos sean
aislados de la muestra. Bajo esta circunstancia, la pérdida de una
porción de la muestra durante los pasos de procesado tendría como
resultado pérdidas porcentuales idénticas de tanto el polinucleótido
analito como la pseudodiana, aunque la proporción de las dos
especies se mantenga fija. Como se observará a partir de los
siguientes resultados, las reacciones de amplificación que incluían
una proporción constante de pseudodiana y polinucleótido analito
proporcionaron de forma ventajosa síntesis de amplicones analitos
mejoradas. De esta manera, incluso las reacciones que tenían un
número limitado de polinucleótidos analitos de entrada se
comportaron como si el número inicial de plantillas fuera mayor.
Los resultados obtenidos en el Ejemplo que sigue
proporcionaron la base para el método mejorado de procesamiento del
espécimen biológico que incluye la adición de pseudodianas al
espécimen antes de que se aísle los ácidos nucleicos. Un método de
normalización del nivel de amplicón analito producido en una
reacción de amplificación incluye primero la adición de pseudodiana
a un espécimen biológico, luego el aislamiento de polinucleótidos a
partir del espécimen y posteriormente el uso de polinucleótidos
aislados de esta manera para llevar a cabo las reacciones de
amplificación.
El Ejemplo 5 describe los métodos que se usó para
representar las reacciones de amplificación que se iniciaron usando
cantidades variables de polinucleótido analito. Más concretamente,
las reacciones se llevaron a cabo de forma que las cantidades de
polinucleótido analito representaran valores "100%", "50%"
y "25%".
Las reacciones de amplificación se prepararon de
acuerdo al método del Ejemplo 1 con los siguientes cambios. Primero,
los replicados de 10 reacciones para cada condición se prepararon en
lugar de replicados de ocho. Segundo, las cantidades de cebador
usadas en las reacciones se redujeron a 5 pmols cada una, en lugar
de 10 pmols cada una. Tercero, el 20% de polivinilpirrolidona se
sustituyó por un 10% de trehalosa. Cuarto, las cantidades de
polinucleótido analito y pseudodiana fueron como se presenta en la
tabla 6. En nuestros procedimientos, las mezclas de polinucleótidos
presentadas en esta tabla se combinaron primero, después se
mezclaron con otros reactivos en la mezcla de reacción, y finalmente
se mezclaron con los dos enzimas polimerasa para iniciar la reacción
TMA.
Mezclas de polinucleótido
analito y
pseudodiana
| Condición | BH10 RNA (copias) | IAC-Ascr (copias) |
| Sin pseudodiana | 500 | 0 |
| 1000 | 0 | |
| 2000 | 0 | |
| Pseudodiana constante | 500 | 6 x 10^{6} |
| 1000 | 6 x 10^{6} | |
| 2000 | 6 x 10^{6} | |
| Proporción constante | 500 | 1,5 x 10^{6} |
| de pseudodiana y | 1000 | 3,0 x 10^{6} |
| polinucleótido analito | 2000 | 6,0 x 10^{6} |
En la conclusión de las reacciones de
amplificación, todas las mezclas de reacción se probaron de acuerdo
con el protocolo APH descrito anteriormente en el Ejemplo 4 para
detectar y cuantificar los amplicones analito. La sonda AE marcada
VIH (+)4134b con la secuencia CCACAATTTTAAAAGAAAAGGG (ID DE SEC Nº
8)de diferentes actividades específicas se usó en este
procedimiento de forma que las reacciones de amplificación llevadas
a cabo usando distintas cantidades de pseudodiana darían lecturas de
emisión de luz dentro de un rango de respuesta lineal para la
luminometría. De nuevo, estas actividades específicas diferentes se
consiguieron mezclando distintas cantidades de sondas marcadas y no
marcarlas. Las sondas usadas para detectar y cuantificar el amplicón
analito fueron las siguientes: las reacciones que no recibieron la
pseudodiana fueron sondadas usando 1,3 pmols de sonda marcada y 400
pmoles de sonda sin marcar; las reacciones que incluían 1,5 x
10^{6}, 3 x 10^{6} ó 6 x 10^{6} copias de pseudodiana se
sondaron usando 1,3 pmols de sonda marcada y 8,7 pmols de sonda sin
marcar.
Los resultados cuantitativos presentados en las
Tablas 7-9 y en la Figura 6 indican claramente que
las reacciones en las que la proporción de pseudodiana y
polinucleótido analito se mantuvo constante proporcionaron
diferencias sustancialmente menores en las cantidades de amplicón
analito sintetizado a partir de cantidades variables de
polinucleótido analito de entrada. Todos los resultados se basaron
en replicados de 10 ensayos llevados a cabo para cada nivel de
plantilla de polinucleótido analito de entrada. En la Figura 6, el
100% de polinucleótido analito de entrada estaba representado por
2000 copias de RNA BH10. En ausencia de la pseudodiana, la pendiente
de la línea que representa la cantidad de amplicón analito producida
a niveles decrecientes de polinucleótido analito de entrada
disminuía bruscamente a medida que el número de estas plantillas
descendía de 2000 a 500. Se obtuvo un resultado similar en los
ensayos que contenían un nivel constante de pseudodiana. De esta
manera, los procedimientos que comprendían la mera adición de
pseudodiana a una muestra y tenían un nivel bajo de polinucleótidos
analito de entrada no tuvo sustancialmente ningún efecto sobre el
incremento de la cantidad de amplicón analito que se sintetizó. Sin
embargo, las reacciones de amplificación que se llevaron a cabo
usando proporciones molares constantes de pseudodiana para
polinucleótido analito produjeron diferencias menores en las
cantidades de amplicón analito sintetizadas a partir de cantidades
variables de polinucleótido analito de entrada. Por ejemplo, los
resultados que se muestran en la Figura indican que a 500 copias de
RNA BH10 de entrada, la producción de amplicón analito (medida en
ULR) era de aproximadamente 68% del valor obtenido usando 2000
copias de la plantilla, mientras que el resultado correspondiente
obtenido en ausencia de pseudodiana o cuando la pseudodiana se
mantenía constante era de aproximadamente sólo un 22%. La
realización de reacciones de amplificación usando proporciones
constante de pseudodiana y polinucleótido analito tendían a
normalizar la cantidad de amplicón analito sintetizado en la
reacción de amplificación. También la proporción puede variar de
algunas maneras en función del nivel de entrada y de la precisión de
cuantificación deseada. Significativamente, los resultados similares
sustancialmente se obtuvieron cuando las reacciones se llevaron a
cabo en presencia de cuentas magnéticas y un reactivo de captura,
como se describe en los Ejemplos 3 y 4. Además, los datos
presentados en las Tablas 7-9 muestran que la
precisión de las reacciones de amplificación fue mejorada al incluir
una pseudodiana en la reacción de amplificación.
| RNA BH10 | Media neta | % de 2000 | Desviación Estándar | Coeficiente de Variabilidad |
| (copias) | (ULR) | (SD) | (CV%) | |
| Ninguna | 0 | 0 | No aplicable | No aplicable |
| 500 | 35279 | 22,4 | 10033 | 28,4 |
| 1000 | 70202 | 44,7 | 36070 | 51,4 |
| 2000 | 157176 | 100 | 26792 | 17,0 |
| RNA BH10 | Media neta | % de 2000 | Desviación Estándar | Coeficiente de Variabilidad |
| (copias) | (ULR) | (SD) | (CV%) | |
| Ninguna | 0 | 0 | No aplicable | No aplicable |
| 500 | 96434 | 22,2 | 23442 | 24,3 |
| 1000 | 224493 | 51,6 | 49903 | 22,2 |
| 2000 | 434899 | 100 | 30382 | 7,0 |
| RNA BH10 | Media neta | % de 2000 | Desviación Estándar | Coeficiente de Variabilidad |
| (copias) | (ULR) | (SD) | (CV%) | |
| Ninguna | 0 | 0 | No aplicable | No aplicable |
| 500 | 294660 | 67,8 | 43197 | 14,7 |
| 1000 | 340594 | 78,38 | 72128 | 21,2 |
| 2000 | 434899 | 100 | 30383 | 7,0 |
El siguiente ejemplo describe los experimentos
que se realizaron para demostrar cómo la incorporación de una
pseudodiana en una reacción de amplificación puede usarse para
controlar la cantidad de amplicón producido en la reacción. Tal como
se ha indicado anteriormente, la reducción de la cantidad de
amplicón producido en una reacción conlleva las siguientes ventajas:
(1) reduce la posibilidad de contaminación cruzada positiva; (2)
permite un uso más eficiente de sondas marcadas; y (3) puede usarse
para "sintonizar" la fuerza de la señal para que se incluya en
el rango lineal para los aparatos de detección como el luminómetro.
Respecto a este segundo punto, los números reducidos de producto
amplicón producido en una reacción, es posible utilizar sondas de
actividad altamente específica en cantidades suficientes para
producir exceso de sonda. Aquéllos que cuenten con un nivel
ordinario de conocimientos sobre la materia apreciarán que la
actividad específica de una sonda de hibridación se refiere a la
cantidad de marca detectable por molécula de sonda. Las sondas de
actividad altamente específica son útiles para la detección de
cantidades minutas de polinucleótidos complementarios. Sin embargo,
si la preparación de la sonda es cara, o la sonda está marcada con
una marca radiactiva que necesita una manipulación y precauciones de
eliminación especiales, es posible que no sea deseable el uso de
sondas de actividad altamente específica en grandes cantidades que
necesitarían realizar hibridaciones cuantitativas usando condiciones
de exceso de sonda. Así, al reducir la cantidad de amplicón analito
producido en una reacción de amplificación de forma ventajosa puede
facilitar el uso eficiente de sondas que se utilizan para detectar
los amplicones.
El ejemplo 6 describe los métodos que se usó para
demostrar cómo las pseudodianas pueden usarse para controlar la
cantidad de amplicón analito producida en una reacción de
amplificación.
Se combinó 100 \mul de reactivo de captura de
diana (17% de sulfato láurico de litio; ácido succínico 190 mM;
hidróxido de litio 250 mM; EDTA 3 mM; EGTA 3 mM; sonda de captura
2'metoxi (-)3837 (ID DE SEC Nº 6) A30 3,5 mM y sonda de captura
2'metoxi (-)4258 A30 (ID DE SEC Nº 7) 3,5 mM, con 100 \mul de
virión VIH diluido en plasma VIH seronegativo. Las muestras o bien
no contenían RNA VIH, o contenían 200; 2000; 20000; 200000; ó
2000000 equivalentes RNA/ml de plasma. Las mezclas se incubaron a
60ºC durante 20 minutos para permitir la hibridación de la sonda de
captura con las secuencias del gen pol presentes en los
polinucleótidos diana, y luego se combinaron con 20 \mul de
suspensión de cuentas oligo(dT) (120 \mug de cuentas
oligo(dT)/20 \mul). Tras mezclar exhaustivamente, se enfrió
las muestras a temperatura ambiente durante un periodo de 15 minutos
para permitir la hibridación del oligo(dA) de la sonda de
captura y el olido(dT) inmovilizado en las cuentas, uniendo
así la secuencia del gen pol y la cuenta magnética. Se reunió
las cuentas contra las paredes de los tubos usando un soporte
magnético y se aspiró el sobrenadante. Se lavó las cuentas tres
veces usando volúmenes de 1ml de reactivo de lavado (SDS 0,1%; HEPES
10 mM (pH 7,5); NaCl 150 mM). Se añadió alícuotas de 50 \mul de
tampón de espécimen (HEPES 10 mM; EDTA 1 mM) a los tubos que no
recibieron pseudodiana. Se añadieron alícuotas de 50 \mul de
pseudodiana diluida en tampón espécimen a los tubos que recibieron
la pseudodiana. Tras mezclar, cada muestra recibió una alícuota de
25 \mul de reactivo de amplificación que contenía: 5 pmols del
cebador T7A(-)4190; 5 pmols del cebador (+)4108; tampón Tris (pH
7,5) 160 mM; 16 mM de cada uno de ATP, CTP, GTP y UTP; 4 mM de cada
uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP; MgCl_{2}100 mM; KCl 70 mM;
glicerol 20%; acetato de zinc 0,6 mM y trehalosa 10%. Se cubrió las
muestras con 200 \mul de aceite mineral y luego se incubó a 42ºC
durante 10 minutos. Las reacciones de amplificación se iniciaron al
añadir alícuotas de 25 \mul del reactivo de enzima que contiene
2000 unidades GP de transcriptasa reversa MMLV; 2000 unidades GP de
RNA polimerasa T7; tampón Tris (pH 8,0) 140 mM;
N-acetilcisteína 100 mM como agente reductor;
glicerol 20%; KCl 70 mM; trehalosa 80 mM; HEPES 8 mM; EDTA 1,04 mM;
TRITON X-102 10% y fenol rojo 0,01%. Todos los
reactivos se mezclaron y se dejaron incubar a 42ºC durante 1
hora.
En la conclusión del periodo de reacción, los
amplicones analito se cuantificaron usando el procedimiento PAH
antes descrito. Se añadió a cada muestra una alícuota de 100 \mul
de la solución de sonda AE(+)4134b marcada con acridina. Las
muestras correspondientes a las reacciones que incluían la
pseudodiana recibieron 1,3 pmols de sonda marcada y 38,7 pmols de
sonda sin marcar, mientras que las muestras correspondientes a las
reacciones que no incluían la pseudodiana recibieron 1,3 pmols de
sonda marcada y 400 pmols de sonda sin marcar. Se incubó las mezclas
a 60ºC durante 15 minutos y luego se combinaron y mezclaron con 300
\mul de reactivo de selección APH que contenía metaarsenito de
sodio Las mezclas de reacción fueron incubadas a 60ºC durante 20
minutos y luego se enfriaron a temperatura ambiente. Se leyó la
quimioluminiscencia siguiendo la adición de reactivos de detección
I y II.
Notablemente, los experimentos preliminares se
llevaron a cabo siguiendo los procedimientos APH rutinarios
utilizando un rango de actividades específicas para identificar las
condiciones que darían los resultados incluidos dentro del rango de
detección lineal del luminómetro usado en nuestros experimentos.
Aquéllos con conocimientos ordinarios sobre la materia apreciarán
fácilmente que los diferentes tipos de aparatos de detección, tanto
luminómetros como película de rayos X, tienen un rango dentro del
cual la intensidad de una señal y la cantidad de material que
produce la señal están linealmente o exponencialmente relacionadas.
Por encima del rango, la correspondencia no se mantiene. Así, la
determinación de tales rangos lineales es una cuestión de
experimentación de rutina para aquéllos expertos en la materia.
Las mezclas de sonda usadas para detectar
amplicones analito en nuestro procedimiento fueron: 401,3 pmols de
sonda compuesta por 1,3 pmols de sonda marcada y 400 pmols de sonda
sin marcar para la reacción llevada a cabo en ausencia de una
pseudodiana; y 40 pmols de sonda compuesta por 1,3 pmols de sonda
marcada y 38,7 pmols de sonda sin marcar para la reacción que
incluía pseudodiana. Para normalizar los resultados del ensayo, las
lecturas de intensidad de luz (medida en ULR) fueron convertidas a
pmols de amplicón en el paso de hibridación al multiplicar la media
de valores ULR netos mediante un factor de conversión. Este factor
de conversión se estableció al hibridar, en reacciones paralelas,
cantidades conocidas de polinucleótido diana y las cantidades de
exceso de sonda marcada y luego determinando la producción de luz
generada por la cantidad conocida de diana. Esto permitió establecer
una correlación entre la producción de luz y la cantidad de amplicón
hibridado a la sonda.
Los resultados presentados en las Tablas 10 y 11
y en la Figura 7 indican que la presencia de una pseudodiana en una
reacción de amplificación no comprometía la correlación entre la
cantidad de polinucleótido analito de entrada y la cantidad de
amplicón analito producida en reacciones de amplificación. Todos los
resultados basados en replicados de 5 ensayos realizados para cada
nivel de entrada de RNA VIH IIIb utilizado en este procedimiento. El
diagrama de registro que se muestra en la Figura 7 indica claramente
una fuerte relación entre la cantidad de equivalentes de RNA VIH
IIIb de entrada en una reacción y la cantidad de amplicón analito
producida. Claramente, esta misma relación lineal fuerte permaneció
cuando las reacciones de amplificación incluían adicionalmente la
pseudodiana. El cambio a la baja observado para la línea que
representa el amplicón analito producido en las reacciones que
incluían pseudodiana indica que se produjeron menos moléculas en
comparación con las reacciones que no incluían pseudodiana. Por
ejemplo, los resultados que se muestran en la Tabla 10 indican que
aproximadamente 520 pmols de amplicón analito se produjeron en la
reacción que incluía 200000 equivalentes RNA VIH, y que este número
se redujo alrededor de diez veces cuando se incluyó la pseudodiana
en la reacción. De esta manera, el número de amplicones analitos
producidos en la reacción de amplificación se redujo al incluir
pseudodiana en la
reacción.
reacción.
\vskip1.000000\baselineskip
| Equivalentes RNA VIH | Sin pseudodiana | ||
| IIIb por reacción | Media neta (ULR) | Amplicón (pmols) | Desviación Estándar (SD) |
| Ninguno | 0 | 0 | No aplicable |
| 20 | 47878 | 2,5 | 55529 |
| 200 | 137756 | 7,2 | 143360 |
| 2000 | 794621 | 41,7 | 174616 |
| 20000 | 4762815 | 250 | 609171 |
| 200000 | 9908427 | 520 | 639895 |
| Equivalentes RNA VIH | 2 x 10^{6} moléculas pseudodiana (IAC-Ascr) | ||
| IIIb por reacción | Media neta (URK) | Amplicón (pmols) | Desviación Estándar (SD) |
| Ninguno | 0 | 0 | No aplicable |
| 20 | 1623 | 0,01 | 2224 |
| 200 | 10473 | 0,067 | 8000 |
| 2000 | 84435 | 0,54 | 8449 |
| 20000 | 802975 | 5,1 | 189079 |
| 200000 | 8083585 | 51,5 | 1567615 |
Aunque la descripción anterior está relacionada
con ensayos cuantitativos, hay otros procedimientos útiles que
utilizan pseudodianas en reacciones de amplificación en relación con
ensayos cualitativos que proporcionan información sobre la presencia
o ausencia de un polinucleótido analito en una muestra de prueba.
Los ensayos cualitativos también pueden usarse para indicar si un
polinucleótido analito de una muestra de prueba está presente o no a
un nivel incluido dentro de un rango especificado. Estos ensayos
podrían, por ejemplo, usarse para monitorizar la respuesta de un
paciente a una terapia de medicamentos. Por ejemplo, un paciente
infectado con un virus transportado en la sangre puede experimentar
un cambio en la titulación del plasma después de un tratamiento
terapéutico con medicamentos. Un médico puede monitorizar si la
titulación del virus del paciente aumenta o desciende respecto a un
valor umbral concreto utilizando un ensayo cualitativo que incorpora
amplificación de pseudodiana. Hay que comprender que un ensayo en
formato cualitativo implica sólo la detección de una señal y por lo
tanto no requiere necesariamente medidas cuantitativas de la señal o
la producción o el uso de una curva estándar por un usuario final de
un ensayo diagnóstico.
En ciertas realizaciones preferidas de la
invención, se realizan ensayos cualitativos para indicar si la
muestra biológica contiene un polinucleótido analito o no. En otras
realizaciones preferidas de la invención, los ensayos que producen
sólo resultados cualitativos (un resultado es o bien negativo o bien
positivo) pero puede proporcionar información
semi-cuantitativa sobre un polinucleótido analito en
una muestra.
Los ensayos cualitativos que
co-amplifican polinucleótidos analitos y
pseudodianas son especialmente versátiles cuando se combinan con
protocolos de detección con umbrales específicos de detección. Estos
umbrales pueden manipularse ajustando la actividad específica de una
sonda de hibridación, o calibrando los dispositivos de detección
para especificar un resultado negativo por debajo de un valor
numérico concreto o un resultado positivo para valores ULR mayores
que cierto nivel umbral. De forma alternativa, la cantidad de
pseudodiana incluida en la reacción de amplificación puede
aumentarse o disminuirse de forma que ciertos niveles de amplicón
analito produzcan señales detectables que o bien estén por encima o
por debajo del límite de detección para un dispositivo concreto.
Así, la cantidad de pseudodiana de entrada en una reacción de
amplificación para un ensayo diagnóstico puede ajustarse a
"sintonizado" mediante experimentación rutinaria, de forma que
se produzca una señal de detección dentro del rango deseado.
Cuando se co-amplifica un
polinucleótido analito y una pseudodiana de acuerdo con los
procedimientos antes descritos, la cantidad de amplicón analito
sintetizada en la reacción estará naturalmente relacionada con la
cantidad de polinucleótido analito que se usó de entrada en la
reacción. Puesto que la magnitud de la señal de hibridación puede
"sintonizarse" por uno de los procedimientos ya descritos,
puesto que las reacciones de amplificación que incorporan
pseudodianas se caracterizan por una precisión mejorada de forma
ventajosa, y puesto que es posible "sintonizar" una reacción
diagnóstica de forma que cierto nivel de polinucleótido analito de
entrada produzca una señal de hibridación que esté por encima o por
debajo de un umbral de detección en un instrumento de prueba, es
posible producir ensayos cualitativos que también proporcionen
información cuantitativa.
El siguiente ejemplo ilustra cómo la información
semi-cuantitativa sobre la cantidad de
polinucleótido analito en una muestra de prueba puede obtenerse
usando un ensayo cualitativo que proporcione sólo resultados
positivos o negativos. Con propósitos ilustrativos, el
polinucleótido VIH sirve como polinucleótido analito y el rango
titulado indicado se basa en resultados presentados en el ejemplo
previo. Obviamente, puede utilizarse también otros polinucleótidos
analitos y diferentes rangos de umbrales distintos en este formato
de prueba cualitativa. También la detección por luminometría puede
sustituirse por fluorescencia u otro método de detección óptica o
electro-química. La pseudodiana puede combinarse
con una muestra biológica y los ácidos nucleicos pueden aislarse
después, o simplemente combinarse con polinucleótido analito
pre-aislado antes del paso de
co-amplificación. En este ejemplo, el sistema de
detección incluye un dispositivo de detección (luminómetro), una
sonda de hibridación marcada que puede detectarse por el dispositivo
de detección. De acuerdo con la descripción precedente, debería
estar claro que la actividad específica de la sonda marcada y la
cantidad de pseudodiana incluida en el paso de
co-amplificación son ambas variables que pueden
manipularse para controlar el umbral de detección en el sistema de
detección.
El ejemplo 7 describe cómo las reacciones de
amplificación que incluyen pseudodianas pueden usarse en formatos de
ensayo cualitativos para derivar información
semi-cuantitativa sobre cantidades de
pre-amplificación de polinucleótido analito.
Un médico que trate a un paciente infectado con
VIH desea monitorizar la efectividad de un protocolo de tratamiento
con fármacos. El médico especialmente desea saber cuándo la
titulación del plasma del paciente se reduce a partir de un nivel de
partida hasta un nivel menor que se corresponde con menos de
aproximadamente 200 equivalentes RNA en 100 \mul de plasma.
La primera y la segunda muestra de plasma se
obtienen a partir del paciente en los tiempos anterior y posterior
al inicio de la terapia con fármacos. Las muestras se preparan y se
usan para reacciones de amplificación esencialmente como se describe
en el Ejemplo 6. Se mezcla alícuotas de 100 \mul de las muestras
de plasma con alícuotas de 100 \mul de reactivo de captura de
diana y se incuba las muestras, combinadas con suspensión de cuentas
oligo(dT), se mezclan de nuevo y luego se dejan enfriar a
temperatura ambiente. Las cuentas se recogen, se lavan y luego se
combinan con alícuotas de 50 \mul que contienen 2 x 10^{6}
copias de pseudodiana diluidas en tampón espécimen. Tras mezclarlas,
cada muestra recibe una alícuota de 25 \mul de reactivo de
amplificación que contienen cebadores y reactantes nucleótidos. Se
cubre las muestras con 200 \mul de aceite mineral y luego se
incuban a 42ºC durante 10 minutos. Las reacciones de amplificación
se inician al añadir alícuotas de 25 \mul de reactivo de enzima
que contiene 2000 unidades GP de transcriptasa reversa MMLV y 2000
unidades GP de RNA polimerasa T7 en una solución tamponada. Todos
los reactantes son mezclados y se dejan incubar a 42ºC durante 1
hora. Las muestras amplificadas están luego sujetas a un
procedimiento de detección APH. Se añade a cada muestra una solución
de sonda AE(+)4134b marcada con acridina. Cada muestra recibe 1,3
pmols de sonda marcada y 38,7 pmols de sonda sin marcar, donde cada
sonda es específica para amplicones VIH auténticos pero no para
amplicones pseudodiana. Estas cantidades de sonda representan
cantidades de hibridación saturantes, de forma que los amplicones
analito se detectarán cuantitativamente. Se incuba las mezclas a
60ºC durante 15 minutos y luego se combinan y mezclan con 300 \mul
de reactivo de selección APH que contiene metaarsenito de sodio. Las
mezclas de reacción se incuban a 60ºC durante 20 minutos y luego se
enfrían a temperatura ambiente. Se lee la quimioluminiscencia tras
la adición de reactivos de detección I y II utilizando un
luminómetro programado para indicar un resultado positivo para
valores ULR de 10000 o más, y un resultado negativo para valores ULR
menores que 10000. La muestra de plasma
pre-tratamiento dio un resultado positivo, indicando
así un nivel de por lo menos alrededor de 200 equivalentes RNA. Por
otro lado, la muestra de plasma post-tratamiento dio
un resultado negativo, indicando así un nivel menor que 200
equivalentes RNA en la muestra de 100 \mul. El médico juzga si el
tratamiento con fármaco es efectivo para la reducción de la carga
viral.
Esta invención se ha descrito con referencia a un
número de ejemplos específicos y de realizaciones de la misma.
Obviamente, aquéllos expertos en la materia considerarán varias
realizaciones diferentes de la presente invención tras la revisión
de la descripción detallada que se ha hecho. De esta manera, el
alcance real de la presente invención puede determinarse mediante la
referencia a las reivindicaciones adjuntas.
<110> GEN-PROBE
INCORPORATED
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODO DE AMPLIFICACIÓN DE
POLINUCLEÓTIDOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> GP104-PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador T7A(-)4190
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatttaatac gactcactat agggagagtt tgtatgtctg ttgctattat gtcta
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador (+)4108
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacagcagtac aaatggcag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8933
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Inmunodeficiencia Humana
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(8933)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de transcritos producida a
partir del plásmido BH10.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8933
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la pseudodiana
IAC-Ascr
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4135)...(4155)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Posiciones mutadas: 4135,
4140-1, 4145, 4150, 4152-3, 4155
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VIH
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la sonda específica para
VIH AE(+)4134.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacaatttt aaaagaaaag gggggattgg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la sonda de captura
(-)3837 A30.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la sonda de captura
(-)4258 A30.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctgctgtcc ctgtaataaa cccgtttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VIH
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la sonda AE
(+)4134b.
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacaatttt aaaagaaaag gg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8933
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la pseudodiana
IAC-Bscr
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4140)...(4159)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Posiciones mutadas:
4140-42, 4145-47, 4152,
4156-57, 4159
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
Claims (38)
1. Un método para cuantificar los polinucleótidos
analito presentes en una muestra de prueba, comprendiendo los pasos
de:
Combinar una cantidad predeterminada de una
muestra de prueba con una cantidad predeterminada de pseudodiana,
conteniendo dicha muestra de prueba una cantidad desconocida de
polinucleótido analito;
Co-amplificar en una reacción de
amplificación de polinucleótidos la pseudodiana y cualquiera de los
polinucleótidos analitos contenidos en dicha muestra de prueba para
producir un conjunto de productos de amplificación, donde dicho
conjunto incluye tanto un amplicón analito si dicha muestra de
prueba contenía polinucleótido analito y un amplicón
pseudodiana;
Cuantificar el amplicón analito sin referencia a
la cantidad de amplicón pseudodiana, donde la cantidad de amplicón
analito está relacionada de una forma en la que es dependiente de
dosis de la cantidad desconocida de polinucleótido analito contenido
en dicha muestra de prueba.
2. El método de la Reivindicación 1, donde el
paso de cuantificar comprende la hibridación de dicho conjunto de
productos de amplificación a partir del paso de
co-amplificación con una sonda marcada específica
para el amplicón analito pero no para el amplicón pseudodiana y
luego detectar cualquier sonda marcada que haya hibridado
específicamente el amplicón analito.
3. El método de la Reivindicación 2, donde dicha
reacción de amplificación de polinucleótidos en el paso de
co-amplificación es seleccionada del grupo
compuesto por la reacción de Amplificación Mediada por
Transcripción, la reacción NASBA y la reacción en cadena de la
polimerasa.
4. El método de la Reivindicación 3, donde dicha
reacción de amplificación de polinucleótidos es la reacción de
Amplificación Mediada por Transcripción.
5. El método de la Reivindicación 3 o la
Reivindicación 4, cuando además comprende un paso para liberar
ácidos nucleicos contenidos en dicha muestra de prueba, siendo dicho
paso de liberación realizado de forma preliminar al paso de
combinación mencionado.
6. El método de la Reivindicación 5, cuando
además comprende un paso para capturar dicho polinucleótido analito
en un soporte sólido antes de dicho paso de
co-amplificación.
7. El método de la Reivindicación 6, donde el
soporte sólido es una cuenta derivatizada con un polinucleótido
sintético.
8. El método de la Reivindicación 6, donde la
cantidad predeterminada de dicha pseudodiana en el paso de
combinación oscila entre 1,0 x 10^{3} y 2 x 10^{8} moléculas,
preferiblemente entre 1,0 x 10^{4} y 2 x 10^{8} moléculas, y
preferentemente entre 1,0 x 10^{5} y 2 x 10^{8} moléculas.
9. El método de la Reivindicación 5, donde el
espécimen biológico se encuentra en una muestra de sangre o de
plasma y donde los ácidos nucleicos mencionados comprenden ácidos
nucleicos virales.
10. El método de la Reivindicación 9, donde el
polinucleótido analito se libera a partir de viriones VIH.
11. El método de la Reivindicación 5, donde la
cantidad predeterminada de la pseudodiana en el paso de combinación
oscila entre 1,0 x 10^{3} y 2 x 10^{8} moléculas,
preferiblemente entre 1,0 x 10^{4} y 2 x 10^{8} moléculas, y
preferentemente entre 1,0 x 10^{5} y 2 x 10^{8} moléculas.
12. El método de la Reivindicación 4, cuando
además comprende un paso para aislar dicho polinucleótido analito y
la pseudodiana mencionada tras el paso de combinación y antes del
paso de co-amplificación.
13. El método de la Reivindicación 4, donde la
cantidad predeterminada de la pseudodiana es entre 1,0 x 10^{3} y
2 x 10^{8} moléculas, preferiblemente entre 1,0 x 10^{4} y 2 x
10^{8} moléculas, y preferentemente entre 1,0 x 10^{5} y 2 x
10^{8} moléculas.
14. El método de la Reivindicación 2, donde dicha
sonda marcada está marcada con éster de acridina.
15. El método de la Reivindicación 14, donde el
paso de cuantificación comprende la medida por luminometría de la
sonda marcada con éster de acridina que específicamente ha hibridado
el amplicón analito.
16. El método de la Reivindicación 1, donde
además comprende un paso para consultar la curva estándar que
relaciona las cantidades de pre-amplificación de
polinucleótido analito y las cantidades de
post-amplificación de amplicón analito.
17. El método de la Reivindicación 4, donde
además comprende un paso para consultar la curva estándar que
relaciona las cantidades de pre-amplificación de
polinucleótido analito y las cantidades de
post-amplificación de amplicón analito.
18. El método de la Reivindicación 15, donde
además comprende un paso para consultar la curva estándar que
relaciona las cantidades de pre-amplificación de
polinucleótido analito y las cantidades de
post-amplificación de amplicón analito.
19. El método de la Reivindicación 4, donde la
reacción de Amplificación Mediada por Transcripción utiliza un grupo
pareado de cebadores oligonucleótidos con las secuencias ID DE SEC
Nº 1 y ID DE SEC Nº 2.
20. El método de la Reivindicación 19, donde la
pseudodiana tiene una secuencia de polinucleótidos seleccionada a
partir del grupo compuesto por la ID DE SEC Nº 4 y la ID DE SEC Nº
9.
21. Un método para relacionar las cantidades de
pre-amplificación de polinucleótido analito y las
cantidades de post-amplificación de amplicón
analito, donde dicho método comprende los pasos de:
Obtener una pluralidad de muestras de control,
donde cada muestra de control tiene una cantidad predeterminada
diferente de polinucleótido analito;
Combinar cada una de la pluralidad de muestras de
control con una cantidad predeterminada constante de pseudodiana
para obtener como resultado una pluralidad de muestras de control
mezcladas;
Co-amplificar en una pluralidad
de reacciones de amplificación la pseudodiana y el polinucleótido
analito presente en cada una de la pluralidad de muestras de control
mezcladas para producir un conjunto de productos de amplificación
que incluyen amplicón pseudodiana y un amplicón analito;
Cuantificar el amplicón analito para cada una de
dichas pluralidades de reacciones de amplificación sin referencia a
la cantidad de amplicón pseudodiana presente en dicho conjunto de
productos de amplificación; y
Preparar una curva estándar teniendo las
diferentes cantidades predeterminadas de dicho polinucleótido
analito representado contra las cantidades cuantificadas del
amplicón analito mencionado producido en cada una de la pluralidad
de reacciones de amplificación, relacionando así las cantidades de
pre-amplificación de dicho polinucleótido analito en
la mencionada pluralidad de muestras de control con las cantidades
de post-amplificación de amplicón analito
sintetizado en la pluralidad de reacciones de amplificación.
22. El método de la Reivindicación 1 o la
Reivindicación 21, comprendiendo también un paso para la detección
de amplicón pseudodiana.
23. El método de la Reivindicación 6 ó la
Reivindicación 21, donde dicho polinucleótido analito es un
polinucleótido viral.
24. El método de la Reivindicación 23, donde el
polinucleótido viral es un polinucleótido VIH.
25. El método de la Reivindicación 21, donde
dicha cantidad constante predeterminada de la pseudodiana citada
oscila entre 1,0 x 10^{3} y 2 x 10^{8} moléculas,
preferiblemente entre 1,0 x 10^{4} y 2 x 10^{8} moléculas, y
preferentemente entre 1,0 x 10^{5} y 2 x 10^{8} moléculas.
26. El método de la Reivindicación 21, donde
dicha pluralidad de reacciones de amplificación en el paso de
co-amplificación se selecciona a partir del grupo
compuesto por una pluralidad de reacciones de Amplificación Mediada
por Trascripción, una pluralidad de reacciones NASBA y una
pluralidad de reacciones PCR.
27. El método de la Reivindicación 26, donde
dicha pluralidad de reacciones de amplificación en el paso de
co-amplificación es una pluralidad de reacciones de
Amplificación Mediada por Trascripción.
28. El método de la Reivindicación 26 ó la
Reivindicación 27, donde el paso cuantificador implica la
hibridación de dicho conjunto de productos de amplificación del paso
de co-amplificación con una sonda marcada específica
para el amplicón analito, pero no para el amplicón pseudodiana, y
posteriormente la detección cuantitativa de cualquier sonda marcada
que hibride específicamente el amplicón analito.
29. El método de la Reivindicación 28, donde la
sonda marcada está marcada con éster de acridina.
30. El método de la Reivindicación 28, que además
comprende el paso para capturar dicho polinucleótido analito en un
soporte sólido con anterioridad al paso de
co-amplificación.
31. Un método para determinar si una muestra
biológica contiene un polinucleótido analito, incluyendo los pasos
de:
Obtención de una muestra biológica para evaluar
si existe presencia del polinucleótido analito;
Combinación de la muestra biológica con una
pseudodiana para obtener una muestra mezclada;
Aislamiento de ácidos nucleicos a partir de la
muestra mezclada, obteniendo así un conjunto de moléculas entre las
cuales se encuentra la pseudodiana y cualquiera de los
polinucleótidos analito mencionados presentes en la muestra
biológica;
Realización de una reacción de amplificación de
polinucleótido para co-amplificar la pseudodiana y
cualquiera de dichos polinucleótidos analitos contenidos en dicho
conjunto de moléculas para fabricar productos de amplificación,
formando así amplicones pseudodiana y formando así amplicones
analitos si dicho conjunto de moléculas incluye dicho polinucleótido
analito;
Detección en dichos productos de amplificación de
cualquiera de los amplicones analito mencionados sin detectar los
amplicones pseudodiana citados; y
Determinación de si la muestra biológica contiene
dicho polinucleótido analito si dichos amplicones analito son
detectados en los productos de amplificación.
32. El método de la Reivindicación 31, donde la
reacción de amplificación es seleccionada a partir del grupo
compuesto por una reacción de Amplificación Mediada por
Trascripción, una reacción NASBA y una reacción PCR.
33. El método de la Reivindicación 32, donde la
reacción de amplificación es una reacción de Amplificación Mediada
por Trascripción.
34. El método de la Reivindicación 32 o la
Reivindicación 33, donde el paso de detección comprende primero una
hibridación de la sonda de polinucleótidos marcada con especificidad
de unión con los amplicones analito y luego la medición de la medida
de la unión específica entre la sonda de polinucleótidos marcada y
los amplicones analito.
35. El método de la Reivindicación 34, donde el
paso de aislamiento comprende la inmovilización de dicha pseudodiana
y dicho polinucleótido analito en un soporte sólido.
36. El método de la Reivindicación 34, donde el
paso de detección comprende la detección por luminometría.
37. El método de la Reivindicación 36, donde el
polinucleótido analito proviene de los viriones VIH.
38. El método de la Reivindicación 37, donde la
pseudodiana tiene una secuencia seleccionada a partir del grupo
compuesto por la ID de SEC Nº 4 y la ID de SEC Nº 9.
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