ES2248133T3

ES2248133T3 - Procedimiento para la determinacion de autoanticuerpos contra el receptor de tsh.

Info

Publication number: ES2248133T3
Application number: ES00969495T
Authority: ES
Inventors: Ulrich Loos; Waldemar Minich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-10-12
Filing date: 2000-10-12
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2020-10-12
Also published as: ATE302415T1; WO2001027634A2; DE50010992D1; EP1224473A2; EP1224473B1; WO2001027634A3

Abstract

Procedimiento para la determinación para diagnóstico diferencial de autoanticuerpos formados contra el receptor de TSH (TSHR) (TSHR-Auto-Ab) en una muestra de suero o de plasma de un paciente que padece una enfermedad de autoinmunidad de la glándula tiroides o en el que existe la sospecha de que padezca una enfermedad de este tipo, caracterizado porque en la muestra se determina la cantidad de al menos un tipo de autoanticuerpos (TSHR-Auto-Ab), que está seleccionado entre (i) autoanticuerpos estimuladores (TSAb), (ii) autoanticuerpos bloqueantes (TBAb) y/o (iii) TSHR-Auto-Ab no patógeno, con efecto ni estimulador ni bloqueante, así como, dado el caso, para obtener un valor de referencia, se determina la cantidad de todos los autoanticuerpos que se unen a un receptor de TSH (TSHR-Auto-Ab) en la muestra, haciendo reaccionar en una mezcla de reacción una parte de la muestra en fase líquida con un reactivo de unión disuelto y directamente marcado, en forma de una quimera r-TSHR marcada, en la que las secuencias del TSHR esenciales para la unión de autoanticuerpos estimuladores y/o bloqueantes (TSAb y/o TBAb) están reemplazadas por secuencias correspondientes que no originan la unión del tipo respectivo de autoanticuerpos, de otro receptor de la clase de receptores acoplados a proteína G, así como, dado el caso, se hace reaccionar otra parte de la muestra con un preparado de rhTSHR completo disuelto y directamente marcado, y se transforman en un precipitado los complejos de autoanticuerpos-rTSHR-quimera o de autoanticuerpo-rTSHR, formados en la reacción, se separa el precipitado de la fase líquida de la mezcla de reacción y se determina la cantidad de marcación en el precipitado.

Description

Procedimiento para la determinación de autoanticuerpos contra el receptor de TSH.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la determinación mediante inmunoprecipitación selectiva de diferentes tipos de autoanticuerpos contra el receptor de TSH, que se distinguen unos de otros en cuanto a su carácter patógeno, a proteínas de fusión marcadas de quimeras de receptor de TSH para realizar tal procedimiento, y al uso de quimeras de receptor de TSH marcadas en la determinación de autoanticuerpos contra el receptor de TSH, mediante inmunoprecipitación.

El receptor para la hormona TSH (hormona estimuladora de la glándula tiroides), el receptor de TSH (TSHR), desempeña un papel clave para el funcionamiento y el crecimiento de las células de la glándula tiroides. Este receptor es un miembro de una subfamilia de receptores de glicoproteína acoplada con proteína G, que además, en particular, comprende los receptores de las hormonas luteinizante/gonadotrofina coriónica (LH/CGR) y para la hormona folículoestimuladora (FSHR). Los receptores de esta subfamilia presentan un gran dominio extracelular N-terminal, que es de importancia esencial para la unión de ligandos y del que se demostró que participa de la transmisión de señales. La transmisión de la señal del TSHR se registra predominantemente por la activación de la adenilatociclasa, lo que conduce a un aumento del nivel intracelular del cAMP (monofosfato de adenosina cíclico).

Una parte del gran interés por el TSHR es atribuible al papel que desempeña como autoantígeno primario en diversas enfermedades de autoinmunidad de la glándula tiroides, que son acompañadas por la presencia de autoanticuerpos contra el TSHR (TSHR-Auto-Ab). A tales enfermedades de autoinmunidad de la glándula tiroides, en particular, pertenecen la enfermedad de Basedow (enfermedad de Graves-Basedow; en inglés: Graves' disease), una enfermedad de autoinmunidad que conduce a una hiperfunción de la glándula tiroides y que pertenece a las enfermedades humanas de autoinmunidad más frecuentes, así como la tiroiditis de Hashimoto y el mixedema idiopático, que pueden estar conectados con una hipofunción de la glándula tiroides.

El TSHR, en la superficie de las células de la glándula tiroides sólo está presente en muy bajas cantidades (en el orden de magnitud de 1000 a 10000 receptores por célula). A fines de 1989 se logró dilucidar la estructura química del receptor humano de TSH (hTSHR), es decir, la secuencia del ADN que lo codifica, así como de la secuencia de aminoácidos derivable del receptor mismo (véanse Libert F. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165: 1250-1255; Nagayama Y. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165: 1184-1190; véanse también los documentos EP-A-0433509 o WO-A-91/09121; así como los documentos WO-A-91/09137; WO-A- 91/10735 y WO-A-91/03483; además, Yuji Nagayama & Basil Rapoport, en: Molecular Endocrinology, Vol. 6, Nº 2, págs. 145-156 y la bibliografía allí citada). Desde entonces, se expresaron el polipéptido de hTSHR y péptidos parciales seleccionados de éste en un gran número de sistemas, demostrándose de este modo que un TSHR funcional sólo puede producirse en células de mamíferos, tanto en forma transitoria como en forma de una línea celular estable, por ejemplo, usando sistemas de expresión de adenovirus y virus Vaccinia.

La dificultad tradicional de marcar el hTSHR sin pérdida de funcionalidad y de proporcionarlo en una forma soluble o dispersable, dificultó hasta hoy en día el desarrollo de ensayos directos de inmunoprecipitación que puedan usarse clínicamente para detectar autoanticuerpos patológicos de hTSHR.

Del trabajo de N. G. Morgenthaler y col., Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 104 (1996) Suppl. 4, págs. 56-59 se conoce un ensayo de inmunoprecipitación para el TSHR-Auto-Ab. En este ensayo, como reactivo para la precipitación del TSHR-Auto-Ab presente en una muestra se usa una preparación de una parte extracelular de un receptor de TSH recombinante, marcado por la introducción de ^{35}S-metionina. El ensayo no presenta selectividad ni para TSHR-Auto-Ab estimulador (TSAb) ni para TSHR-Auto-Ab bloqueante (TBAb), pero también comprende tales TSHR-Auto-Ab que no compiten con bTSH. Sin embargo, la producción del receptor marcado por ^{35}S por traducción in vitro es sumamente complicada y costosa, y no existen aparatos de medición que sean apropiados para una medición clínica rutinaria de la radiación emitida por ^{35}S. Por ello, este procedimiento de medición no es apropiado para un diagnóstico clínico rutinario.

Del documento DE 19801154 o J. Endocrinol. 160:239-245 (1999) se conoce un procedimiento que posibilita producir un rhTSHR completamente funcional, de forma pura, disuelta, y marcado de forma radiactiva. Entre otras cosas, se propone usar tal rhTSHR marcado de forma radiactiva para la determinación de la cantidad total de TSHR-Auto-Ab en un ensayo de precipitación, que como ventaja presenta que no sólo comprende aquellos TSHR-Auto-Ab que compiten con TSH marcado (es decir, las llamadas "inmunoglobulinas que inhiben la unión de TSH" o TBII). El procedimiento propuesto no permite diferenciar entre TSHR-Auto-Ab estimulador (TSAb), bloqueante (TBAb), así como, dado el caso, TSHR-Auto-Ab ni estimulador ni bloqueante "neutral", presentes en una muestra. Además, el trabajo con un marcador radioactivo en muchos casos es fundamentalmente indeseado.

El procedimiento conforme al documento DE 19801154 se fundamenta sobre un procedimiento para la producción de productos de fusión rhTSHR funcionales, que fue descrito en los documentos DE 19645729 o WO 98/20343 y allí servía para la producción de proteínas de fusión de rhTSHR que adicionalmente a la secuencia de TSHR presentaban restos peptídicos relativamente cortos, para una inmovilización o el marcado del TSHR o un resto peptídico biotiniado. Aún no se ha informado sobre la producción de proteínas de fusión con restos largos de proteínas, por ejemplo, restos de enzimas. Como dentro del marco de la presente solicitud también se recurre a las maneras de proceder dadas a conocer en los documentos DE 19645729 y DE 19801154, se hace expresa referencia al contenido de ambas publicaciones para completar lo que se da a conocer en la presente solicitud.

Por ello, el único ensayo que puede usarse hoy en día en la práctica clínica para la determinación de TSHR-Auto-Ab es un ensayo competitivo que trabaja de forma indirecta, en el que para la medición se usa la inhibición de la unión de b-TSH marcado a un TSHR porcino disuelto de glándulas tiroides de cerdos, o a un rhTSHR inmovilizado para usos de "tubo cubierto", conforme a los documentos DE 19651093 o WO 98/26294 o DE 19801319 o WO 99/3678 o a J. Clin.
Endocrinol. Metab., Vol 84, Nº 1, págs. 90-97 (1999). Sólo comprende los autoanticuerpos del llamado tipo TBII.

Un ensayo directo de inmunoprecipitación sería una ventaja para el diagnóstico de la enfermedad de Graves-Basedow porque, por ejemplo, podría permitir detectar todos los anticuerpos contra el TSHR, incluyendo los que se unen al TSHR pero no interfieren con la interacción de TSH o del competidor bTSH, con el TSHR. Como ínterin se ha descubierto que los TSHR-Auto-ab, también en el caso de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow, no sólo comprenden autoanticuerpos estimuladores que originan hipertiroidismo, sino que además también comprenden autoanticuerpos no patógenos "neutrales" e incluso aquéllos que son bloqueantes, por cierto sería deseable tener también a disposición un ensayo que sea selectivo para un tipo de autoanticuerpos que se ha de determinar y posibilite, por ejemplo, distinguir entre autoanticuerpos patógenos estimuladores, bloqueantes y "neutrales".

Para distinguir entre autoanticuerpos estimuladores, bloqueantes y neutrales, hasta ahora esencialmente se usaron bioensayos, en los que se averigua si la producción de cAMP en células que en su membrana contienen un TSHR natural o recombinante es aumentada por la presencia de determinados sueros o autoanticuerpos o si la producción de cAMP originada por una concentración dada de TSH en la muestra es debilitada por los sueros o autoanticuerpos. Dentro del marco de tales exámenes o para averiguar cuáles ámbitos de la secuencia del dominio extracelular del TSHR se unen a TSH o a los distintos tipos de autoanticuerpos (TSAb, TBAb), también ya se trabajó con quimeras de hTSHR, en las que determinadas secuencias parciales de hTSHR estaban reemplazadas por secuencias correspondientes de otros receptores acoplados con proteína G, en particular, receptores de LH-CG de ratas. Aquí en ensayos de estimulación de cAMP, usando células que expresan estas quimeras se demostró que para la unión de TSHR-Auto-Ab estimulador (TSAb) evidentemente se necesitan los aminoácidos del término N del hTSHR, y particularmente, aminoácidos de la secuencia 8-165, calculado desde el resto inicial de metionina. En cambio, para la unión de TSHR-Auto-Ab bloqueante (TBAb) demostraron ser necesarios los aminoácidos del término C del dominio extracelular del hTHSR, en particular, aminoácidos de la secuencia 261-370.

En cuanto al uso de quimeras de TSHR/LHCGR en bioensayos, en particular, son de mencionar los trabajos de Tahara K., Ban, K., Minegishi T., Kohn LD, 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 70-77, Tahara K., Ishikawa N., Yamamoto K., Hirai A, Ito K, Tamura Y, Yoshida S, Saito Y, Kohn LD, 1997, Thyroid 7: 867-877 y Grasso YZ, Kim MR, Falman C, Kohn LD. Tahara K, Gupta MK, 1999, Thyroid 9: 531-537. Para profundizar, se remite a los sitios de la bibliografía citados en los trabajos nombrados.

El objetivo de la presente invención es crear un procedimiento de diagnóstico diferencial para la determinación selectiva de TSHR-Auto-Ab con efectos patógenos diferentes, que funciona basándose en el principio de un ensayo de inmunoprecipitación, y en el que preferentemente además es posible prescindir del marcado radiactivo o de procedimientos de detección radioactivos.

Además, es otro objetivo de la presente invención crear los nuevos preparados marcados de hTSHR, apropiados para tal procedimiento.

Se alcanzan estos objetivos mediante un procedimiento conforme a la reivindicación 1, la quimera marcada rhTSHR, conforme a la reivindicación 7, así como, de forma muy general, mediante el uso de quimeras rhTSHR en forma de proteínas de fusión, conforme a la reivindicación 9.

En las reivindicaciones subordinadas 2 a 6 y 8 se reproducen configuraciones ventajosas, actualmente preferidas, de los objetos de las reivindicaciones 1 y 7.

En el texto anterior y sucesivo de esta solicitud, normalmente se caracterizan los reactivos usados y los analitos/biomoléculas, mediante diversas abreviaturas que siempre deben entenderse con los siguientes significados, salvo que para el experto resulte otra cosa del contexto concreto. El uso de las indicaciones especiales se realiza por razones de la descripción exacta de los ensayos y mediciones efectuados, pero no significa que los resultados y conclusiones descritos valgan sólo para el caso especial descrito y no pudieran generalizarse recurriendo al conocimiento relevante en la materia.

TSH =: Hormona estimuladora de la glándula tiroides (tireotropina). Si se usa la abreviatura TSH sin otros agregados, no se trata de un producto determinado, sino que se discute de forma general la unión o la función de la hormona.

^{125}I-bTSH =: bTSH (TSH bovina) marcada con yodo radioactivo, usada como competidor. En la descripción del ensayo de la empresa B. R. A. H. M. S. Diagnostica GmbH, ^{125}I-bTSH en particular representa un producto que se obtiene conforme a los documentos DE 4237430 C1 o EP 0668775 B1 y es un componente del TRAK-Assay® de la empresa B. R. A. H. M. S. Diagnostica GmbH.

TSHR =: El receptor de TSH, un receptor glicoproteico fijado dentro de la membrana de la glándula tiroides. Si se usa la abreviatura TSHR sin otros agregados, no se trata de un producto determinado, sino que se discute de forma general la función del receptor o su participación de unión.

rTSHR =: Polipéptido (recombinante) producido por técnica genética, que presenta la secuencia de aminoácidos de un TSHR que existe en forma natural, en particular, de un TSHR humano (hTSHR), al menos en tal medida que se pueda denominar "receptor de TSH funcional", lo que significa que en cuanto a la unión de autoanticuerpos contra el TSHR, es decir, de hTSH, se comporta en una medida significativa como el TSHR natural, en particular, el TSHR humano. Si se usa la abreviatura rTSHR sin otros agregados, no se trata de un producto determinado, es decir, rTSHR puede representar el polipéptido recombinante completo, más o menos glicosilado, una secuencia parcial de una longitud suficiente, o un producto de fusión producido por técnica genética, de éstos (como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional PCT/EP97/06121). Sin otras explicaciones, un producto denominado simplemente "rTSHR" o "rhTSHR" se encuentra como preparado de membrana, de la que el producto, dado el caso, fue obtenido también como extracto purificado, mediante la solubilización apropiada mediante detergentes, de membranas de células usadas para la expresión del polipéptido recombinante.

WT rTSHR =: "Tipo salvaje de TSHR"- un rhTSHR esencialmente completo para la determinación de la cantidad total de TSHR-Auto-Ab (total) en una muestra.

TSHR de fusión =: rhTSHR con secuencias de aminoácidos añadidas, que prolongan la secuencia de polipéptidos de un TSHR funcional.

TSHR-LUC =: Una proteína de fusión de rhTSHR prolongada con el resto proteico de una enzima, en todos los ejemplos, una enzima luciferasa de luciérnaga (LUC).

TSHR/LH-CGR =: "quimera de TSHR", es decir, un rhTSHR, en el que partes de la secuencia de aminoácidos están reemplazadas por secuencias comparables de otro receptor, con otro comportamiento de unión frente a TSHR-Auto-Ab, en particular, secuencias no enlazantes, conforme a todos los ejemplos, por secuencias de un receptor de LH-CG de ratas (LH-CGR).

TSHR/LH-CGR-LUC =: \hskip0.2cm proteína de fusión de rhTSHR, que contiene una quimera de TSHR, así como un resto de {}\hskip0.3cm enzima, que en todos los ejemplos es un resto de luciferasa de luciérnaga.

TSHR-Auto-Ab =: autoanticuerpos contra el receptor de TSH de cualquier especificidad, detectables en muestras biológicas, en particular, en suero o plasma humano.

TSAb =: TSHR-Auto-Ab que estimula la glándula tiroides. Su detección es particularmente importante para el diagnóstico de la enfermedad de Graves-Basedow (en inglés: Grave's disease).

TBAb =: TSHR-Auto-Ab que bloquea el efecto de la TSH sobre la glándula tiroides, cuya detección puede relacionarse con un hipotiroidismo.

TBII =: TSHR-Auto-Ab detectable en ensayos competitivos que consisten en una competencia de TSH marcada con TSHR-Auto-Ab por los sitios de unión de una preparación de TSHR. Puede ser TSAb y/o TBab y/o TSHR-Auto-Ab neutral. El TRAK-Assay® de la empresa B. R. A. H. M. S. Diagnostica GmbH es un ensayo comercial (ensayo radiorreceptor) para la determinación de TSHR-Auto-Ab del tipo TBII.

Dentro del marco de los trabajos que se describen en la presente solicitud, con el propósito de crear ensayos selectivos de inmunoprecipitación para la determinación de tipos de TSHR-Auto-Ab, se crearon nuevos reactivos en forma de proteínas de fusión que contienen un resto de luciferasa de luciérnaga como ejemplo de un resto enzimático detectable, así como un receptor humano funcional recombinante de TSH (rh TSHR) que también se denomina "TSHR de tipo salvaje" (WT TSHR), así como tres diferentes quimeras de TSHR (quimeras A, B y C). Se construyeron de tal manera las quimeras, que debido a conocimientos que se habían obtenido con bioensayos con el uso de tales quimeras, pudiera esperarse que fueran selectivas para TSHR-Auto-Ab estimulador o bloqueante. Otra quimera (quimera C) era tal que no debiera reaccionar ni con TSHR-Auto-Ab estimulador ni con TSHR-Auto-Ab bloqueante y por ello debería ser selectiva para los llamados anticuerpos "neutrales", sin efecto patógeno conocido, si los sueros efectivamente también contuvieran tal TSHR-Auto-Ab neutral.

Con dichos nuevos reactivos se efectuaron diferentes series de ensayos en los que debía comprobarse, si la adición de un resto proteico enzimático afectaba la funcionalidad del resto de TSHR en el producto de fusión y/o si por la introducción en un producto de fusión se modificaba significativamente la actividad del resto enzimático acoplado. Tales exámenes también eran necesarios porque los productos de fusión de TSHR conocidos hasta ahora siempre contenían sólo restos peptídicos más cortos pero no restos enzimáticos largos, de naturaleza proteica.

Como se muestra más precisamente a continuación, se demostró que la funcionalidad del TSHR o de las quimeras de TSHR no se modifica significativamente por la adición de un resto enzimático, y que también el resto enzimático, que en los ejemplos concretos era un resto de luciferasa de luciérnaga, conserva su actividad y puede usarse para la reacción usual de comprobación.

Después de haber constatado que los productos de fusión TSHR-enzima o las quimeras de TSHR-enzima presentaban las reactividades deseadas, se usaron en ensayos de inmunoprecipitación, ensayándose sueros de personas normales y de pacientes con enfermedades tiroideas, y se compararon los resultados obtenidos con los resultados obtenidos con los ensayos conocidos desde antes, es decir, por un lado, con un ensayo competitivo para determinar los TSHR-Auto-Ab que compiten con TSH (TBII), y por el otro lado, con bioensayos en los que se medía la producción de cAMP de células transformadas.

A continuación, la invención se explica en mayor detalle mediante ejemplos de producción y de aplicación respectivamente con referencia a una figura.

Materiales y procedimientos Materiales

^{125}I-bTSH (56 \muCi/\mug), así como los equipos comerciales de TRAK-Assay®, usados para la determinación, igual que la suspensión usada de proteína A y los anticuerpos monoclonales de ratones contra el dominio extracelular del hTSHR fueron proporcionados por la empresa B. R. A. H. M. S. Diagnostica GmbH, Berlín. El plásmido pADNc3-rLHR(B9) fue proporcionado por el Dr. D. L. Segaloff (de la Universidad de Iowa, EE.UU.). El plásmido pSP-luc+NF fue adquirido en la empresa Promega (Heidelberg, Alemania). Como equipo de comprobación de inmunotransferencia ECL y equipo de cAMP-RIA se usaron equipos de la empresa Amersham (Braunschweig, Alemania). Los cebadores de ADN

P1 (5'-GTCATGCATCAGCTGCTGGTGCTGGCAGTG-3'),

P2 (5'-GTCGACGTCGTTATGTGTAAGTTATCACAG-3'),

P3 (5'-GTCCTTAAGAAAACACTGCCCTCCAAAGAAAAA-3')

y

P4 (5'-ATCGAGCTCTTCATTCTCCTCAAAGATGGC-3')

se adquirieron en la empresa Interactiva (Ulm, Alemania).

Cultivo celular

Se cultivaron células HeLa en medio Eagle modificado de Dulbecco, que estaba suplementado con suero fetal bovino al 10%. Las células fueron cultivadas en una atmósfera con 5% de CO_{2}, a 37ºC.

Construcción de quimeras de TSHR/LH-CGR

Tres diferentes quimeras del TSHR humano, en el que secuencias parciales estaban reemplazadas por secuencias correspondientes de un LH-CGR de ratas, fueron construidas conforme a la descripción en Biochem. Biophys. Res. Commun., (1991), 179: 70-77. En una de las quimeras, que en lo sucesivo se denominará "quimera A", los aminoácidos 8-165 del TSHR estaban reemplazados por los aminoácidos comparables 10-166 de LH-CGR; en la "quimera B" los aminoácidos 261-370 del TSHR estaban reemplazados por los aminoácidos comparables 261-329 de un LH-CGR de ratas, mientras que en el caso de la "quimera C", estaban reemplazados tanto los aminoácidos 8-165, como los aminoácidos 261-370 del TSHR por aminoácidos comparables de LH-CGR.

En particular, para esto se partió del plásmido pADNc3-rLHR(B9), que contiene las secuencias del receptor de LH-CGR de ratas. Las secuencias de ADN que codificaban los aminoácidos 10-165, así como 261-329, fueron multiplicadas mediante la técnica de PCR, usando los pares de cebadores P1-P2 y P3-P4, que contenían los sitios de restricción NsII, AatII, Bfrl y SacI, obteniéndose fragmentos de PCR de NsII/AatII y Bfrl/SacI. Paralelamente a esto, se digirió un plásmido de pTMI-TSHR-FLAG-6HIS, que había sido obtenido conforme al documento DE 19645729 o Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 5: 282-290 (1997), con endonucleasas de restricción de PstI-AatII y BfrI/SacI. Se retiraron los fragmentos producidos de esta manera y se reemplazaron por los fragmentos de PCR obtenidos a partir del receptor de LH-CG de ratas, obteniéndose las secuencias de ADNc para las diferentes quimeras de TSHR/LH-CGR A, B y C.

El vector pTM1-TSHR-FLAG-6HIS o el nuevo vector obtenido a partir de éste con el ADN de TSHR/LH-CGR (pTM1-TSHR/LH-CGR) fueron linealizados con CIaI, y los extremos "adhesivos" fueron rellenados usando polimerasa de Klenow. Se recortó el fragmento destinado a la expresión usando BamHI, y se subclonó en el sitio de HIndII/BamHI de un vector de transferencia de Vaccinia p7,5K131, como está descrito en más detalle en el documento DE 19645729 o en Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 5: 282-290 (1997).

Preparación de vectores para la expresión de TSHR o de quimeras de TSHR/LH-CGR y de la enzima luciferasa

Usando el plásmido pSP-luc+NF, que contiene la secuencia de la luciferasa de luciérnagas, se unieron secuencias de ADN que codifican el TSHR humano completo del "tipo salvaje" o quimeras de TSHR/LH-CGR, con el ADNc que codifica la secuencia de luciferasa de luciérnaga, que comprende 550 aminoácidos. Para ello, se recortó la secuencia para la luciferasa de luciérnaga con BstEII y EcoRI del plásmido pSP-luc+NF y se introdujo en sitios correspondientes de los vectores p7,5K131-TSHR o p7,5131-TSHR/LH-CGR, con lo que se obtuvieron plásmidos de recombinación de Vaccinia p7,5K131-TSHR-LUC o p7,5K131-TSHR/LH-CGR-LUC.

Preparación de virus Vaccinia recombinantes

Usando la técnica descrita con mayores detalles en el documento DE 19645729 ó en Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 5: 282-290 (1997) o en J. Virol., 68: 8423-8427 (1994), se incorporó el ADNc para el constructo TSHR-luciferasa o TSHR/LH-CGR-luciferasa de plásmidos p7,5K131-TSHR-LUC o p7,5K131-TSHR/LH-CGR-LUC, en el genoma del virus Vaccinia del tipo salvaje Kopenhagen, por recombinación homóloga en el gen de timidinaquinasa.

Expresión y obtención de las proteínas de fusión TSHR-LUC o TSHR/LH-CGR-LUC como extracto celular

Se infectaron células HeLa confluentes que fueron cultivadas en una placa de 75 cm^{2} (aproximadamente 20 x 10^{6} células), con una unidad formadora de colonia (cfu) por célula, de un virus Vaccinia recombinante, y se incubaron durante 24 h a 37ºC. Se retiraron mediante raspado células infectadas y se transfirieron a una solución salina tamponada por fosfatos (PBS), y se lavaron cuatro veces con PBS, con centrifugación a 2500 rpm. Se lisaron las células obtenidas en 0,3 ml de un tampón A (Hepes-KOH 20 mM; pH 7,5; NaCl 50 mM; tritón X100 al 1%; glicerina al 10%), congelando y descongelando. Se centrifugó la suspensión obtenida a 30000 g durante 1 h, se recogió el sobrenadante (aproximadamente 8 mg/ml de proteína total) y se guardó a -70ºC.

El sobrenadante obtenido como fue descrito (extracto) fue usado en ensayos de inmunoprecipitación como TSHR-LUC o TSHR/LH-CGR-LUC.

Preparación de fracciones celulares

Como se describió anteriormente, se infectó una capa monocelular de células confluentes HeLa que se cultivaron en una placa de 75 cm^{2}, con una unidad formadora de placa por célula, de un virus Vaccinia recombinante, y se incubó durante 24 h a 37ºC. Células infectadas se lavaron con PBS, se recogieron y se sedimentaron mediante centrifugación a 1200 rpm. Se resuspendió el sedimento celular obtenido en 0,3 ml de un tampón que contenía Tris-ClH 10 mM, pH 7,6, NaCl 50 mM, glicerina al 10%, así como una mezcla de inhibidores de proteasa. Luego se homogeneizó la suspensión a 4ºC mediante 20 movimientos elevadores en un homogeneizador de vidrio/teflón y después se centrifugó durante 15 min a 800 g, así como, a continuación, durante 1 h a 30000 g. Se recolectó el sobrenadante (la fracción citoplasmática). Se trató el sedimento de membrana, homogeneizándolo a 4ºC mediante 20 movimientos elevadores en un homogeneizador de vidrio/teflón, en 0,3 ml de tritón X 100 al 1%, en el mismo tampón y luego se centrifugó a 30000 g, durante 1 h. Se recogió el sobrenadante (tritón X 100-extracto de membranas) y se lo guardó a -70ºC.

Ensayos de inmunoprecipitación

Para los análisis de inmunoprecipitación descritos a continuación, se mezclaron 40 \mul de TSHR-LUC o TSHR/LH-CGR-LUC (2 x 10^{6} unidades relativas de intensidad luminosa) con 10 \mul de suero, y se incubó durante la noche a 4ºC. Para la precipitación de los inmunocomplejos formados, se añadieron 25 \mul de una suspensión de proteína A al 20% en tampón A, y se incubó la mezcla con sacudimiento, durante 1 h a 4ºC. Con centrifugación, se lavó la suspensión 4 veces con 1 ml de tampón A (sin tritón X 100). Finalmente, se resuspendió el sedimento en 50 \mul de tampón A (sin tritón X 100) y se determinó la actividad de luciferasa de la suspensión obtenida por el sedimento, mediante un luminómetro (Lumat 9501, empresa Berthold, Wildbad, Alemania), según el protocolo usual de determinación. Los resultados obtenidos se expresaron como unidades relativas unidas de intensidad luminosa.

Unión de ^{125}I-TSH a TSHR-LUC o a TSHR/LH-CGR-LUC

Se realizó el examen de la unión de ^{125}I-TSH a las diferentes proteínas de fusión de luciferasa disueltas en un volumen total de 200 \mul, que se componía de 50 \mul de solución de proteína de fusión (extracto celular), 50 \mul de suero estándar cero, así como 100 \mul de una solución de ^{125}I-TSH (aproximadamente 20000 cpm). La mezcla de reacción fue incubada durante 2 h a temperatura ambiente, después de lo cual se precipitaron los complejos de ^{125}I-TSH/proteínas de fusión por adición de 2 ml de polietilenglicol. Después de centrifugar a 2000 g durante 10 min, se midió la radiación gamma en el sedimento.

Se determinó el grado de unión no específico en presencia de TSH 10^{-7} M y ascendía a < 5% de la unión total.

Determinación de inmunoglobulinas que inhiben la unión de TSH (TBII)

Se efectuó la determinación del TSHR-Auto-Ab de las inmunoglobulinas que inhiben la unión de TSH (TBII), usando tubitos de ensayo que presentan un rhTSHR inmovilizado por afinidad mediante anticuerpos (TRAK Assay® de la empresa B. R. A. H. M. S. Diagnostica GmbH; véase también J. Clin. Endocrinol. Metab. 84: 90-97, 1999), conforme a las instrucciones del fabricante. Los resultados se indicaron usando una curva estándar (curva de desplazamiento con sueros estándar de 0, 1, 2, 4, 16, 40 UI/l del TRAK Assay®) en unidades internacionales/ litro (UI/l). La cantidad de autoanticuerpos en el suero en ensayo es proporcional al valor medido (UI/l).

Bioensayo para detectar TSHR-Auto-Ab estimulador (TSAb)

Se efectuó la detección de TSAb en sueros no fraccionados, usando células CHO, que expresan el TSHR de forma estable. Se realizó la determinación de cAMP extracelular en el sobrenadante, con un equipo comercial cAMP-RIA-Kit, conforme a las instrucciones del fabricante. Se calculó el índice de estimulación (SI) de forma correspondiente a la publicación Vlase y col., en Endocrinology (1995), 136: 4415-4423, de la siguiente manera:

SI (%) = 100 x (cAMP del paciente/cAMP de la muestra de control negativo).

Bioensayo para detectar TSHR-Auto-Ab bloqueante (TBAb)

Se añadió TSH bovino (10 mU/ml) a células CHO, que expresan el hTSHR de forma estable, o bien, con suero control, o bien con suero en ensayo. Se midió y se comparó la respectiva producción de cAMP, como fue descrito últimamente (Wallaschofski und Paschke, Clin. Endocrinol. 50: 365-372, 1999). La determinación de cAMP extracelular en el sobrenadante fue efectuada con un equipo comercial cAMP-RIA-Kit, conforme a las instrucciones del fabricante. El índice de inhibición (II) se calculó como:

II(%) = 100 x [1- (cAMP del TSH del paciente/cAMP del control negativo de TSH)].

Inmunotransferencia

Se sometieron proteínas a una electroforesis en gel poliacrílico (PAGE) en SDS al 8% y se transfirieron de manera usual a membranas de nitrocelulosa. Durante la noche, a 4ºC, a las membranas se añadieron anticuerpos monoclonales de ratón contra los aminoácidos 378-388 del dominio extracelular del TSHR, en una dilución de 1:20. A continuación, se determinaron anticuerpos unidos, usando un equipo de inmunotransferencia, comprobando una quimioluminiscencia aumentada.

Usando los materiales nombrados anteriormente y usando las técnicas descritas, se llevaron a cabo los ensayos descritos a continuación, cuyos resultados se explican más detalladamente con referencia a las figuras.

En las figuras:

La figura 1 muestra la unión de TSH a diversos productos expresados de rhTSHR en forma de curvas de desplazamiento, que muestran la inhibición de la unión de ^{125}I-bTSH, mediante cantidades crecientes de TSH no marcado, al TSHR del tipo salvaje (WT; \blacksquare; TSHR-LUC (\blacktriangle), así como a la quimera A-LUC (p). Los resultados están expresados como porcentaje de la unión total en ausencia de TSH no marcado, que para WTTSHR, TSHR-LUC y la quimera A-LUC ascendían a 4512 cpm, 2793 cpm y 2856 cpm. Cada valor es el valor medio \pm 2 SD de mediciones dobles en dos ensayos separados.

La figura 2 muestra la capacidad de sueros de control y sueros de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow para la inmunoprecipitación de WTTSHR-LUC, en comparación con la capacidad de estos sueros de inhibir la unión de ^{125}I-bTSH a un preparado de hrTSHR en un TRAK Assay competitivo tradicional. Las actividades de inmunoprecipitación de los sueros están expresadas como RLU (unidades relativas de intensidad luminosa) unidas, las actividades de inhibición se expresan en unidades internacionales/litro (UI/l), como se explica más detalladamente en el texto. La línea punteada horizontal es la línea para dos desviaciones estándar (SD) por encima del valor medio para personas normales (30737 RLU).

La figura 3 muestra la capacidad de los sueros de control y los sueros de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow para la inmunoprecipitación de la quimera C-LUC, en comparación con la capacidad de estos sueros de inhibir la unión de ^{125}I-bTSH a un preparado de hrTSHR en un ensayo competitivo tradicional, TRAK Assay®. Las actividades de inmunoprecipitación de los sueros están expresadas como RLU (unidades relativas de intensidad luminosa) unidas, las actividades de inhibición se expresan como unidades internacionales/litro (UI/l), como se explica más detalladamente en el texto. La línea punteada horizontal es la línea de dos desviaciones estándar (SD) por encima del valor medio para personas normales (38980 RLU).

La figura 4 muestra la diferencia de la formación de inmunoprecipitado de TSHR-LUC y de la quimera C-LUC (WT-C) con sueros de personas normales y de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow, en comparación con la capacidad de estos sueros de inhibir la unión de ^{125}I-TSH a un preparado de rhTSHR. Las actividades de inmunoprecipitación de los sueros están expresadas como valores de RLU unidas, las actividades de inhibición, como está explicado en el texto, se expresan en UI/l. La línea punteada horizontal indica el valor de dos desviaciones estándar (SD) por encima del valor medio para pacientes normales (3384 RLU).

La figura 5 muestra la diferencia de la formación de un inmunoprecipitado de TSHR-LUC y la quimera A-LUC (WT-A) en sueros de pacientes normales (n = 62) y en sueros de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow (n = 63), en comparación con la capacidad de estos sueros de estimular la síntesis de cAMP en un bioensayo de cAMP. Las actividades de inmunoprecipitación de los sueros están expresadas como RLU unidas, las actividades estimuladoras de cAMP de expresan como índice de estimulación (SI). La línea punteada horizontal es la línea para dos desviaciones estándar (SD) por encima del valor medio para pacientes normales (7000 RLU). La línea punteada vertical muestra el límite del SI para sueros normales (200%).

La figura 6 muestra la diferencia de la formación de inmunoprecipitado de las quimeras A y C (A-C) por sueros de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow (n = 63), en comparación con la capacidad de estos sueros de inhibir la síntesis de cAMP en un bioensayo de cAMP. Las actividades de inmunoprecipitación de los sueros están expresadas como RLU unidas, las actividades bloqueantes de cAMP están expresadas como índice de inhibición (II). La línea punteada horizontal muestra el valor de las desviaciones estándar (SD) por encima del valor medio para personas normales (835 RLU). La línea punteada vertical muestra el límite del II para sueros de personas normales (10%).

A continuación, se describen en más detalle las diferentes mediciones, usando los nuevos productos de fusión TSHR-LUC y TSHR/LH-CGR-LUC.

Reactividad de los productos de fusión TSHR-LUC y TSHR/LH-CGR-LUC con ^{125}I-TSH

Para examinar la cuestión de que si los productos de fusión de luciferasa manifiestan un comportamiento de unión frente a TSH que corresponda a lo esperado, se hicieron reaccionar con ^{125}I-TSH los lisados de células HeLa que contenían los productos de fusión correspondientes y que habían sido infectadas con un virus Vaccinia recombinante apropiado conforme a los ensayos anteriores, y se midió el grado de unión de ^{125}I-TSH, en función de la cantidad de TSH no marcado presente simultáneamente en la solución de reacción. Los resultados de los ensayos están representados en la figura 1, en la que el valor de 100% representa la cantidad total de ^{125}I-TSH unido en ausencia de TSH no marcado. Se demostró que no se reconocen diferencias fundamentales en las curvas de desplazamiento, que se obtuvieron para las proteínas de fusión TSHR-LUC y la quimera A-LUC, en la que los aminoácidos de TSHR 8-165 están reemplazados. El valor absoluto para la unión máxima de TSH para el tipo salvaje de TSHR era aproximadamente 1,6 veces mayor que para los productos de fusión de LUC. Si se tiene en cuenta que en la expresión del tipo salvaje de TSHR en las células HeLa se obtiene una densidad de receptores de aproximadamente 150000 receptores por célula, puede calcularse que tales células HeLa producían aproximadamente dos tercios de esta cantidad, es decir, aproximadamente 100000 moléculas fusionadas de receptor-luciferasa por célula.

Los otros productos de fusión de quimera, es decir, quimera B-LUC y quimera C-LUC, en los que los que los restos de TSHR 261-.370 o los restos de TSHR 8-165, así como 261-370 fueron reemplazados por restos de LH-CGR de ratas, no fueron capaces de unirse específicamente a ^{125}I-TSH. Estos resultados coinciden con lo que era de esperar a partir de datos de la bibliografía (Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 70-77 (1991), J. Clin. Endocrinol. Metab. 81: 1758-1787 (1996)).

Se debe señalar expresamente que todos los productos de fusión presentaban la actividad enzimática de la luciferasa de luciérnaga. La intensidad de la luminiscencia de lisados celulares que contenían los productos de fusión TSHR-LUC o TSHR/LH-CGR-LUC era altamente idéntica, midiéndose aproximadamente 10^{9} RLU por ml de lisado.

Como resultó de los ensayos antes descritos para preparar fracciones de membrana celular, en todos los casos, más del 90% de la actividad de luciferasa estaba localizada en la fracción de membrana. Se halló sólo aproximadamente el 10% de la actividad de luciferasa en la fracción citoplasmática hidrosoluble. Los datos medidos de luciferasa, igual que los experimentos de inmunotransferencia mostraban que todos los productos de fusión fueron expresados en células HeLa con aproximadamente la misma eficiencia, mediante la técnica descrita.

Detección de TSHR-Auto-Ab en sueros de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow, usando productos de fusión TSHR-LUC, así como usando los diversos productos de fusión TSHR/LH-CGR-LUC

Se usaron productos de fusión TSHR-LUC y TSHR/LH-CGR-LUC para detectar autoanticuerpos en sueros de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow mediante análisis por inmunoprecipitación, según el procedimiento general descrito anteriormente. Si se parte de la base de que los epítopos de TSAb están localizados en el intervalo de los aminoácidos 25-165 del TSHR y los epítopos del TBAb están localizados en el intervalo de los aminoácidos 261-370, puede recurrirse a los resultados de las mediciones del análisis de inmunoprecipitación para la determinación de las cantidades relativas de los diferentes tipos de autoanticuerpos en sueros de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow. Debería valer lo siguiente:

(i): la unión de productos de fusión que contienen WTTSHR (WT) debería ser proporcional a la cantidad total de TSHR-Auto-Ab en los sueros,

(ii): la diferencia de los valores para la unión de TSHR-LUC y de la quimera A-LUC (WT-A) (o entre las quimeras B-LUC y C-LUC, es decir B-C) por los sueros en ensayo debería corresponder a la cantidad de TSAb en estos sueros,

(iii): la diferencia entre los valores de unión para TSHR-LUC y la quimera B-LUC (WT-B) (o entre las quimeras A-LUC y C-LUC, es decir, A-C) debería reflejar la cantidad de TBAb en sueros,

(iv): el grado de la unión a la quimera C-LUC, que no contiene epítopos para TSAb ni para TBAb, debería reflejar la cantidad de autoanticuerpos neutrales.

Se demostró que los productos de fusión tanto de TSHR, como de las tres quimeras TSHR/LH-CGR, manifestaban una evidente interacción con los autoanticuerpos presentes en los sueros de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow. La tabla 1 muestra los valores medios de unión que se obtuvieron usando sueros de 62 voluntarios de control y 74 pacientes con enfermedad de Graves-Basedow.

TABLA 1

	TSHR	Quimera A	Quimera B	Quimera C
Controles (n = 62)	19573	17965	22251	22794
Pacientes (n = 74)	97065	40209	130481	33832

Los productos de fusión de las quimeras A y C (que no presentan epítopos para TSAb) en todos los 74 casos interactuaron con autoanticuerpos patológicos de forma menos buena que los productos WT-TSHR. Inesperadamente, se demostró que el producto de fusión de la quimera B (que no contiene epítopos para TBAb) en todos los casos unía más activamente a los autoanticuerpos patológicos que productos de fusión del WT-TSHR. Posiblemente, esto pueda atribuirse a una modificación de la estructura del receptor, favorable para la unión de TSAb.

Además, se demostró que sueros de personas normales mostraban una unión de aproximadamente la misma actividad a todos los productos de fusión, es decir, WT-TSHR y todas las quimeras, encontrándose las diferencias en todos los casos en el intervalo de 10 a 15%. Los resultados mostrados en la tabla 1 permiten calcular que el contenido medio de los diferentes tipos de autoanticuerpos para los 74 sueros medidos de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow ascendía a aproximadamente 59% de TSAb, a aproximadamente 7% de TBAb y a aproximadamente 35% de TSHR-Auto-Ab neutral, indicados como porcentaje respecto a la cantidad total de TSHR-Auto-Ab. Existía una correlación positiva de los valores de unión para cada combinación de productos de fusión, cuando se comparaba su comportamiento de inmunoprecipitación en 74 sueros de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow (r en el intervalo de 0,57 a 0,91; p < 0,001, véase la tabla 2).

TABLA 2

Quimeras	WT y A	WT y B	WT y C	A y B	A y C	B y C
comparadas
Correlación	0,60	0,89	0,57	0,63	0,91	0,66

Se determinó la cantidad total de TSHR-Auto-Ab en los sueros en ensayo, usando el TSHR del tipo salvaje fusionado con luciferasa. En la figura 2 se muestra la especificidad en una inmunoprecipitación de TSHR-LUC, usando 62 sueros control y 74 sueros de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow de diferente gravedad. Sólo dos de los 62 sueros normales con el producto de fusión que contenía TSHR presentaron una actividad de inmunoprecipitación que era mayor que un valor que correspondía al valor medio para personas normales más dos desviaciones estándar (30740 RLU). Los valores de unión para todos los demás sueros control se encontraban en el intervalo de10000 a 30000 RLU. El nivel determinado por separado de la unión no específica de TSHR-LUC por la suspensión de proteína A en ausencia de un suero ascendía a aproximadamente 1000 RLU. En contraste con los sueros control, 73 de los 74 sueros de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow fueron medidos como positivos en el ensayo de inmunoprecipitación. En estos casos, el grado de unión se encontraba en el intervalo de 30000 a 240000 RLU.

Los datos mostrados indican una alta especificidad del ensayo de inmunoprecipitación de TSHR-LUC o de TSHR/
LH-CGR-LUC. En una comparación directa también se obtuvo una correlación positiva (r = 0,61; p < 0,001) entre los resultados obtenidos con el ensayo de inmunoprecipitación y los resultados de una medición de TBII de los 74 sueros de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow, con el ensayo competitivo TRAK Assay®. Ensayos control dieron por resultado que sueros de pacientes que padecían una enfermedad de autoinmunidad (sueros de diez pacientes con diabetes mellitus juvenil) precipitaban los productos de fusión de TSHR sólo con una eficiencia muy baja. Las actividades de precipitación aquí eran comparables con aquéllas que se obtenían con personas normales, encontrándose los valores de unión en el intervalo de 10000 a 23000 RLU.

Detección de TSHR-Auto-Ab "neutral" en sueros de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow, usando quimeras TSHR/LH-CGR-LUC

Se determinó la cantidad de TSHR-Auto-Ab "neutral" en los sueros en ensayo usando el producto de fusión de la quimera C-LUC. Se demostró, que pudo detectarse tal TSHR-Auto-Ab neutral en todos los 62 sueros de voluntarios control y en todos los 74 sueros de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow. Los valores de unión para los sueros control se encontraban en el intervalo de 10000 a 50000 RLU, mientras que para los sueros de los pacientes se encontraban en el intervalo de 10000 a 110000 RLU. La mayoría de los sueros de pacientes (57 de 74) contienen aproximadamente la misma cantidad de TSHR-Auto-Ab que los sueros control. La cantidad relativa del TSHR-Auto-Ab en los sueros de los pacientes se encuentra en el intervalo de 10 a 75% de la cantidad total de TSHR-Auto-Ab, mientras que prácticamente todo el TSH-Auto-Ab en los sueros control pertenecen al TSHR-Auto-Ab neutral (90-100%). La figura 4 muestra las diferencias del grado de precipitación con productos de fusión de TSHR de tipo salvaje y de la quimera C, con sueros iguales. Los valores obtenidos dan por resultado la suma de TSAb y TBAb (sin anticuerpos neutrales) en los sueros examinados. En este caso, la diferencia entre sueros control y sueros de pacientes es más pronunciada, siendo todos los 74 pacientes claramente positivos en el presente ensayo. Por el otro lado, sólo podían considerarse dos de los sueros control como positivos, lo que indica que posiblemente algunas personas normales pueden tener cierta cantidad, tanto de TSHR-Auto-Ab estimulador, como de TSHR-Auto-Ab bloqueante. La correlación entre los
resultados obtenidos por este ensayo y los obtenidos en el TRAK Assay® era positiva (r = 0,56; p < 0,001; n = 74).

Detección de TSAb en sueros de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow, usando quimeras TSHR/LH-CGR-LUC

Se calculó la cantidad de TSAb (TSHR-Auto-Ab estimulador) en sueros de pacientes, mediante la diferencia de la actividad de unión del producto de fusión con el WT-TSHR y aquélla de la quimera A. La figura 5 muestra la comparación para el índice de estimulación (SI) de 62 sueros control y 63 sueros de pacientes, determinado en un bioensayo tradicional de cAMP, comparado con la diferencia de la actividad de unión de los productos de fusión de WT-TSHR y la de la quimera A (WT-A) en estos sueros. En el ensayo de inmunoprecipitación, 59 de los 62 sueros control dieron resultado negativo (actividad de unión < 7000 RLU), mientras que tres sueros pueden considerarse débilmente positivos (actividad de unión de 8400, 7340 y 7160 RLU). Dos de los sueros normales, que en la figura 5 se señalan con una flecha, resultaron ser positivos en el bioensayo de cAMP (SI = 2930 y 3080%; el límite de SI para personas normales se encuentra en el intervalo de 200%). Sin embargo, estos dos pacientes, según indicación del ensayo de inmunoprecipitación, así como la evaluación clínica, no eran pacientes con enfermedad de Graves-Basedow. En los sueros de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow, 40 de 63 sueros (63%) resultaron ser positivos en el bioensayo de cAMP (SI \geq 200%), mientras que en el ensayo de inmunoprecipitación 61 de 63 sueros (97%) resultaron ser positivos (WT-A). Existía una correlación positiva entre los resultados que se obtuvieron en el bioensayo de cAMP y aquéllos que se obtuvieron en el ensayo de inmunoprecipitación (WT-A) (r = 0,43; p < 0,001; n = 63). Cuando sólo se tenían en cuenta los sueros que también reaccionaban positivamente en el bioensayo de cAMP (SI \geq 200%), la correlación se mejoraba mucho (r = 0,61; p < 0,001; n = 40).

Detección de TBAb en sueros de pacientes con enfermedad de Graves-Basedow, usando quimeras TSHR/LH-CGR-LUC

Se determinaron los TBAb en los sueros de pacientes, por la diferencia del comportamiento de unión de los productos de fusión con LUC de las quimeras A y C. La figura 6 muestra la comparación del índice de inhibición (II) de 62 sueros control y 63 sueros de pacientes (determinado por el bioensayo de cAMP), con la diferencia del comportamiento de unión para los productos de fusión con las quimeras A y C (A-C). 58 de los 62 sueros control tuvieron resultado negativo en el bioensayo de cAMP (II < 10%), y todos los sueros control resultaron ser negativos en el ensayo de inmunoprecipitación (actividad de unión < 835 RLU). Usando el bioensayo de cAMP, en 31 de 63 sueros de pacientes (49%) se constató una actividad de TBAb, mientras que en el ensayo de inmunoprecipitación (A-C) 45 de 63 sueros de pacientes (71%) dieron un resultado positivo de TBAb. Nueve sueros de pacientes con enfermedad de Basedow positivos en el ensayo de inmunoprecipitación, dieron resultado negativo en el bioensayo de cAMP, y viceversa, nueve sueros positivos en el bioensayo de cAMP dieron resultado negativo en el ensayo de inmunoprecipitación. Existía una débil correlación positiva entre los resultados del bioensayo de cAMP y aquéllos del ensayo de inmunoprecipitación de (A-C) (r = 0,25; p < 0,05; n = 63). Sin embargo, cuando sólo se tenían en cuenta aquellos sueros de pacientes que dieron resultado positivo en cuanto a TBAb en el bioensayo de cAMP (II \geq 10%), se obtenía una correlación significativa (r = 0,57; p < 0,001; n =31). No existía una correlación entre los valores de II de diferentes sueros de pacientes y la capacidad de estos sueros de precipitar productos de fusión de TSHR o TSHR/LH-CGR (no se muestran datos).

Los datos expuestos muestran una alta sensibilidad y especificidad del ensayo de inmunoprecipitación conforme a la invención usando productos de fusión marcados por enzima, que contenían las quimeras TSHR/LH-CGR o el tipo salvaje TSHR. De esta manera, el ensayo conforme a la invención demuestra ser un instrumento muy prometedor para el diagnóstico y el examen de la aparición, de la remisión y de la recaída de la enfermedad de Graves-Basedow. Como los ensayos con el uso de productos de fusión, con luciferasa de luciérnaga como resto enzimático, transcurrieron con éxito, puede partirse de la base de que los ensayos correspondientes también puedan producirse con otros restos enzimáticos que pudieran ser más apropiados, en particular, desde el punto de vista de costos, para un uso clínico práctico, y que sean componentes de sistemas de comprobación conocidos, mediante ensayos enzimáticos. En particular, debe pensarse en restos enzimáticos que estén seleccionados entre peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa o cloranfenicolacetiltransferasa.

Claims

1. Procedimiento para la determinación para diagnóstico diferencial de autoanticuerpos formados contra el receptor de TSH (TSHR) (TSHR-Auto-Ab) en una muestra de suero o de plasma de un paciente que padece una enfermedad de autoinmunidad de la glándula tiroides o en el que existe la sospecha de que padezca una enfermedad de este tipo, caracterizado porque en la muestra se determina la cantidad de al menos un tipo de autoanticuerpos (TSHR-Auto-Ab), que está seleccionado entre (i) autoanticuerpos estimuladores (TSAb), (ii) autoanticuerpos bloqueantes (TBAb) y/o (iii) TSHR-Auto-Ab no patógeno, con efecto ni estimulador ni bloqueante, así como, dado el caso, para obtener un valor de referencia, se determina la cantidad de todos los autoanticuerpos que se unen a un receptor de TSH (TSHR-Auto-Ab) en la muestra, haciendo reaccionar en una mezcla de reacción una parte de la muestra en fase líquida con un reactivo de unión disuelto y directamente marcado, en forma de una quimera r-TSHR marcada, en la que las secuencias del TSHR esenciales para la unión de autoanticuerpos estimuladores y/o bloqueantes (TSAb y/o TBAb) están reemplazadas por secuencias correspondientes que no originan la unión del tipo respectivo de autoanticuerpos, de otro receptor de la clase de receptores acoplados a proteína G, así como, dado el caso, se hace reaccionar otra parte de la muestra con un preparado de rhTSHR completo disuelto y directamente marcado, y se transforman en un precipitado los complejos de autoanticuerpos-rTSHR-quimera o de autoanticuerpo-rTSHR, formados en la reacción, se separa el precipitado de la fase líquida de la mezcla de reacción y se determina la cantidad de marcación en el precipitado.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se usa la quimera de rTSHR, disuelta y directamente marcada, como proteína de fusión, en el que la secuencia de la quimera de rTSHR está unida con un resto peptídico marcado de forma radiactiva o con un resto enzimático que es parte de un sistema de detección para el análisis enzimático, conservando la funcionalidad deseada.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la enzima en la proteína de fusión rTSHR está seleccionada entre luciferasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa o cloranfenicolacetiltransferasa.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los complejos formados por anticuerpos y el reactivo de unión marcado se transforman en un precipitado mediante precipitación con un precipitante selectivo para anticuerpos humanos.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los complejos formados por autoanticuerpos y el reactivo de unión marcado se transforman en un precipitado mediante la precipitación con proteína A.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se usan proteínas de fusión de quimeras rTSHR directamente marcadas, que contienen una enzima para una reacción de detección por quimioluminiscencia, así como secuencias de quimeras de hTSHR, en las que los aminoácidos 8 a 165 y/o 261 a 370 del TSHR humano completo están reemplazados por secuencias correspondientes de un receptor LH/CG de ratas.

7. Proteína de fusión que contiene una secuencia de una quimera marcada de rTSHR, en la que las secuencias esenciales para la unión de autoanticuerpos estimuladores y bloqueantes (TSAb y TBAb) del TSHR están reemplazadas por secuencias correspondientes que no originan la unión del tipo respectivo de autoanticuerpos, de otro receptor de la clase de los receptores acoplados a proteína G, unida a una enzima que es parte de un sistema de detección para el análisis enzimático.

8. Proteínas de fusión según la reivindicación 7, caracterizada porque como enzima contienen luciferasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa o cloranfenicolacetiltransferasa.

9. Uso de quimeras rh-TSHR-LH-CGR en forma disuelta y directamente marcada, en particular, unida con enzimas en forma de proteínas de fusión, para la determinación selectiva de autoanticuerpos estimuladores, bloqueantes y/o de acción ni estimuladora ni bloqueante, no patógenos, contra el TSHR en muestras de pacientes, por formación de un complejo de autoanticuerpos estimuladores, bloqueantes y/o ni de acción estimuladora ni bloqueante, no patógenos contra el TSHR y una quimera rhTSHR-LH-CGR e inmunoprecipitación.