ES2248644T3

ES2248644T3 - Metodo para separar en celulas individuales un grupo de celulas contenidas en una imagen de una muestra.

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Publication number: ES2248644T3
Application number: ES02807249T
Authority: ES
Inventors: Thomas Wittenberg; Matthias Grobe; Robert Couronne-Schmidt; Heiko Kuziela; Christian Muenzenmayer; Klaus Spinnler; Paulus Dietrich
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2002-04-22
Filing date: 2002-09-11
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2022-09-11
Also published as: WO2003090169A1; ATE302981T1; US20050202404A1; EP1481371B1; EP1481371A1; DE10217858C1; DE50204046D1

Abstract

Procedimiento para la separación de un grupo de células contenido en una imagen de una muestra en células individuales para una posterior clasificación de la muestra, en el que el grupo de células presenta una pluralidad de células solapadas unas con otras, con las siguiente etapas: (a) seleccionar (S102) un núcleo (ZK1) celular de una primera célula (Z1) que va a separarse del grupo de células, disponiéndose el núcleo (ZK1) celular de la primera célula (Z1) adyacente al núcleo (ZK2) celular de una segunda célula (Z2), solapándose el plasma celular de la primera célula (Z1) y el plasma celular de la segunda célula (Z2) uno con otro de manera que se forma un plasma (ZP) celular común; (b) determinar (S104) una contracción del plasma (ZP) celular común entre el núcleo (ZK1) celular de la primera célula (Z1) y el núcleo (ZK2) celular de la segunda célula (Z2); (c) separar el plasma (ZP) celular común en la contracción; (d) determinar una área del plasma (ZP) celular común en la que se espera el solapamiento del plasma celular de la primera célula (Z1) y de la segunda célula (Z2); (e) clasificar el área determinada para asociar secciones individuales de la misma con el plasma celular de la primera célula (Z1) y/o el plasma celular de la segunda célula (Z2); y (f) completar el plasma celular de la primera célula (Z1) obtenido en la etapa (c) basándose en las secciones clasificadas.

Description

Método para separar en células individuales un grupo de células contenidas en una imagen de muestra.

La presente invención se refiere a un procedimiento para separar un grupo de células contenidas en una muestra en células individuales, especialmente la presente invención se refiere a un procedimiento para separar un grupo de células contenido en una imagen de una muestra en células individuales para una posterior clasificación de la muestra, en el que los grupos de células presentan una pluralidad de células solapadas unas con otras.

Para el tratamiento con éxito de enfermedades cancerígenas son necesarios una detección y un tratamiento tempranos. Esto puede conseguirse a través de visitas médicas regulares preventivas contra el cáncer. En dichos exámenes se toman frotis del tejido que va a examinarse, realizándose habitualmente, en el caso de un examen de cáncer uterino (Carcinoma Cervix), mediante la prueba de PAP dada a conocer por el doctor griego George Papanicolau, que introdujo este procedimiento en 1942. Este frotis ginecológico del cérvix, es decir, del cuello de la matriz, o preparados celulares, que se obtuvieron de otros exámenes, denominados generalmente preparado citológico, deben clasificarse. Para ello, se aplican los preparados citológicos en un portaobjetos, se colorean y se evalúan bajo el microscopio por el especialista en citología.

Para ayudar a un especialista de este tipo en el diagnostico objetivo se utilizan últimamente programas de procesamiento de imágenes, con los que las células de un preparado se segmentan automáticamente y se clasifican en función de las propiedades morfométricas de los núcleos celulares y del plasma celular, por ejemplo, expansión del núcleo y del plasma, forma del núcleo y del plasma, tamaño relativo del núcleo y del plasma uno respecto a otro, etcétera, así como también en función de la texturización de la estructura de cromatina en los núcleos celulares. Sin embargo, los programas de procesamiento de imagen empleados aquí permiten solamente una segmentación fiable de las células de un preparado cuando estas células del preparado se presentan aisladas.

Aunque que los especialistas en citología, debido a su formación, están en condiciones de separar de manera implícita hasta cierto grado plasmas celulares solapados entre sí, para realizar a continuación a partir de ellos un diagnóstico en células sanas, inflamadas, displásticas o enfermas, véase por ejemplo el documento US 5 987 158, no se conocen procedimientos automatizados para segmentar y separar estas células solapadas.

De manera convencional, para los planteamientos de clasificación automatizada, se emplean exclusivamente células aisladas o se intercala una división de células manual entre las etapas automatizadas.

La desventaja del primer planteamiento, la utilización únicamente de células aisladas, radica en que aquí las células solapadas no se consideran posteriormente, es decir, se descartan, de manera que se pierde la información contenida en las células solapadas importante para la clasificación de una muestra.

Aunque con el segundo planteamiento se evita esta pérdida de información, sin embargo, la desventaja aquí consiste en que no es posible una evaluación previa totalmente automática de una muestra. En cuanto se encuentra o es probable un solapamiento, es necesario recurrir a un asesor humano para la separación. Tras la separación continúa el procedimiento automático.

Sin embargo, la presencia de células aisladas es por regla general la excepción en preparados citológicos. Es más, en los preparados/muestras citológicos, según el modo de preparación, se solapan mutuamente hasta un 80% de todos los plasmas celulares de un preparado. Por consiguiente, para casi cualquier clasificación de preparados citológicos es necesario prever una división de células manual o prescindir de la información contenida en estas células solapadas.

Partiendo del estado de la técnica anteriormente descrito, la presente invención se basa por tanto en el objetivo de crear un procedimiento que detecte un solapamiento de células o plasmas celulares y que segmente y separe las células individuales solapadas para facilitar los requerimientos para una clasificación/evaluación automática de una muestra.

Este objetivo se alcanza a través de un procedimiento según la reivindicación 1.

La presente invención crea un procedimiento para separar un grupo de células contenido en una imagen de una muestra en células individuales para una clasificación posterior de la muestra, en el que el grupo de células comprende una pluralidad de células solapadas unas con otras, con las siguientes etapas:

a): seleccionar un núcleo celular de una primera célula que debe separarse del grupo de células, disponiéndose el núcleo celular de la primera célula adyacente a un núcleo celular de la segunda célula, solapándose el plasma celular de la primera célula y el plasma celular de la segunda célula uno con otro de tal manera que se forma un plasma celular común.

b): determinar una contracción del plasma celular común entre el núcleo celular de la primera célula y el núcleo celular de la segunda célula;

c): separar el plasma celular común en la contracción;

d): determinar un área del plasma celular común en la que se espera el solapamiento de los plasmas celulares de la primera célula y de la segunda célula;

e): clasificar el área determinada para asociar secciones individuales de la misma al plasma celular de la primera célula y/o al plasma celular de la segunda célula; y

f): completar el plasma celular de la primera célula obtenido en la etapa (c) basándose en las secciones clasificadas.

Según un ejemplo de realización preferido de la presente invención el procedimiento se basa en una imagen creada a partir de un preparado citológico o una muestra. La imagen se creó y se digitalizó, por ejemplo, mediante un microscopio, presentando cada imagen una resolución en función del dispositivo de toma (cámara, objetivo), por ejemplo 1000 x 700 píxeles. La imagen se tomó en la modalidad de luz transmitida o en la modalidad de fluorescencia, pudiendo emplearse también otras modalidades conocidas de toma de imágenes. Según otro ejemplo de realización, en lugar de una imagen se emplea una pluralidad de imágenes que se registran conjuntamente y se crearon con diferentes modalidades de toma de imágenes. Las diferentes modalidades de toma de imágenes comprenden, por ejemplo, la toma de una imagen en una modalidad de toma de luz transmitida y la toma de otra imagen en una modalidad de toma de fluorescencia. De manera alternativa, las dos imágenes, también pueden crearse con la modalidad de toma de fluorescencia, pero con diferentes parámetros con respecto a la fluorescencia.

Sobre la base de las imágenes creadas de esta manera, empleando el procedimiento según la invención, se realiza una segmentación o separación automática de grupos de células en células individuales que pueden servir de base para un procesamiento posterior automatizado para clasificar la muestra citológica.

La ventaja de la presente invención consiste en que puede prescindirse de intercalar una división de células manual y del coste de trabajo asociado y de la pérdida de tiempo y, al mismo tiempo, ya no se pierde la información contenida en los grupos de células, denominados también agrupamientos de células, para la clasificación de preparados citológicos, sino que se recurre a ellos para la clasificación, para poder establecer los resultados de la clasificación sobre una base más amplia de las células contenidas en el preparado citológico. De esta manera se deduce la ventaja de una mejora de la fiabilidad de la clasificación realizada posteriormente de los preparados.

Según otro ejemplo de realización preferido, el procedimiento según la invención comprende también las etapas de preparación necesarias para detectar, a partir de una toma (una imagen o varias imágenes) de la muestra, uno o varios grupos de células que después se separan según la invención en células individuales. Según este ejemplo de realización se realiza primero una detección y segmentación de núcleos celulares mediante una imagen de la muestra para crear una lista de núcleos celulares. A continuación, se realiza una detección y segmentación de plasmas celulares mediante la imagen de la muestra para crear una lista de los plasmas celulares. Los núcleos celulares se asocian a los plasmas celulares correspondientes y, mediante el número de núcleos celulares que se han asociado a un plasma celular, se detecta en la combinación si se trata de una agrupación de células o un grupo de células o de una célula individual segmentada.

En las reivindicaciones dependientes se definen variantes preferidas de la presente invención.

A continuación se explican detalladamente ejemplos de realización preferidos de la presente invención con ayuda de los dibujos adjuntos. Muestran:

la figura 1, las etapas del procedimiento individuales para segmentar un grupo de células detectado según el procedimiento según la invención,

las figuras 2A a 2E, la determinación de núcleos celulares adyacentes en un grupo de células según un ejemplo de realización preferido;

las figuras 3A a 3C, la localización de contracciones según un ejemplo de realización preferido de la presente invención mediante dos núcleos de células adyacentes;

las figuras 4A a 4E, la separación de un plasma celular común según un ejemplo de realización preferido,

las figuras 5A a 5B, la determinación de un área del plasma celular común, en la que se supone un solapamiento de los plasmas celulares según un ejemplo de realización preferido,

las figuras 6A a 6E, el completamiento de una célula separada según un ejemplo de realización preferido, y

la figura 7, otro ejemplo de realización preferido del procedimiento según la invención que comprende una detección de grupos de células a partir de una imagen de la muestra.

Con respecto a la siguiente descripción debe indicarse que en las figuras individuales los elementos similares o con la misma función están previstos con los mismos números de referencia.

A continuación, con ayuda de la figura 1, se explica detalladamente un primer ejemplo de realización preferido del procedimiento según la invención. La figura 1 muestra un diagrama de bloques en el que, partiendo de un grupo de células individual detectado en una imagen de la muestra, se realiza una segmentación del grupo de células en células individuales. Las configuraciones preferidas de las etapas individuales descritas en la figura 1 mediante el diagrama de bloques se explican más detalladamente a continuación mediante las figuras 2 a 6. En la imagen que sirve de base en la figura 1 ya se han determinado los núcleos celulares y los plasmas celulares que van a detectarse a partir de una imagen inicial de la muestra, de manera que están presentes las superficies de los núcleos celulares y de los plasmas celulares, preferiblemente como máscaras binarias. La detección de los núcleos celulares y los plasmas celulares contenidos en la imagen inicial de la muestra para detectar una agrupación de células en la imagen de la muestra se describe detalladamente más adelante.

La figura 1 muestra la separación de un grupo de células, una denominada agrupación de células, es decir de plasmas celulares con más de un núcleo celular, es decir, células solapadas unas con otras, en sus componentes de células individuales. En la figura 1 se explican, por un lado, las etapas individuales según el procedimiento preferido según la invención, estando asociada a cada una de las etapas individuales una representación esquemática de la agrupación de células tras la realización de la etapa correspondiente.

En la figura 1 el procedimiento comienza con la etapa S100, en la que se facilita un grupo Z de células con una pluralidad de células Z1 a Z5. Cada una de las células Z1 a Z5 comprende un núcleo celular y un plasma celular. En cuanto al grupo de células facilitado en la etapa S100, se trata de una reproducción gráfica del grupo de células creada a partir de una toma digitalizada de una muestra citológica que va a examinarse, tal como se explicará a continuación detalladamente. El procedimiento según la invención se basa en la información gráfica contenida en la toma del grupo de células. No se realiza una modificación de la muestra citológica real o del preparado citológico preparado.

Una vez facilitado el grupo de células en la etapa S100, el procedimiento continúa en la etapa S102 en la que se detectan "vecinos" relevantes, es decir, núcleos celulares adyacentes relevantes para cada par de núcleos celulares. Un ejemplo de realización para seleccionar o detectar células adyacentes relevantes se describe a continuación de manera más detallada. En el ejemplo de realización general mostrado en la figura 1, suponiendo que las células Z1 y Z2 cumplen con los criterios necesarios para la presencia de "vecinos", la célula Z2 es adyacente a la célula Z1 que va a separarse. Asimismo, las células Z1 y Z3 son adyacentes a la célula Z2 que va a separarse. Las células Z2 y Z4 son adyacentes a la célula Z3 que va a separarse. Las células Z3 y Z5 son adyacentes a la célula Z4 que va a separarse. La célula Z4 es adyacente a la célula Z5 que va a separarse.

Una vez determinados los grupos celulares adyacentes en la etapa S102, el procedimiento continúa en la etapa S104 en la que se localizan los denominados puntos de contracción. Los puntos de contracción o contracciones son secciones del plasma celular común formado por todos los plasmas ZP celulares de todas las células Z1 a Z5, es decir secciones del plasma celular común, en las que una expansión del mismo es reducida o incluso mínima, comparada con la expansión habitual. La localización de los puntos de contracción según la etapa S104 se realiza basándose en una valoración del plasma común que se sitúa entre una célula que va a separarse y una célula adyacente a la célula que va a separarse. En el ejemplo de realización mostrado en la figura 1 se producen cuatro contracciones E1 a E4. La contracción E1 se sitúa entre la célula Z1 y la célula Z2 y se determinó en función de una observación de estas dos células. Las contracciones restantes también se determinaron mediante una observación de las células adyacentes.

Una vez determinados los puntos de contracción o contracciones en el plasma ZP común el procedimiento continúa en la etapa 106 en la que se realiza una separación del plasma celular común basándose en las contracciones localizadas en la etapa S104. Tal como puede observarse a partir de la figura 1, el plasma común se separó en las posiciones T1 a T4, de manera que las células Z1 a Z5 se presentan ahora en la imagen separadas una de otra.

Aunque las células Z1 a Z5 presentadas ahora individualmente se presentan ahora separadas, éstas no corresponden sin embargo a las células contenidas en el preparado citológico original en las posiciones correspondientes, dado que aquí sí que se presentó un solapamiento de los plasmas celulares que todavía no se ha considerado a través de la separación sencilla en la etapa S106. Por esta razón, el procedimiento según la invención determina en la etapa S108 un área para células adyacentes, en la que se espera un solapamiento de los plasmas celulares de las células. Según un ejemplo de realización preferido, para determinar esta área se traza un cuadrángulo que se extiende partiendo de un núcleo celular hacia un primer punto de contracción, desde allí hacia el segundo núcleo celular, desde allí al segundo punto de contracción y de vuelta al primer núcleo celular. En esta área se espera que se presente el plasma celular solapado. En la figura 1, las áreas de solapamiento, que se definen mediante el cuadrángulo que se acaba de describir, se indican con U1 a U4.

En la etapa S110 se realiza una binarización de las áreas U1 a U5 de solapamiento para asociar los puntos de la imagen de cada área de solapamiento, por medio de una etapa de clasificación, a una o ambas células implicadas.

En la etapa S112 se amplían las células Z1 a Z5 mostradas en la etapa 106 alrededor de las áreas de solapamiento asociadas a las células respectivas y, por tanto, se completan para dar lugar a células individuales que corresponden a las células contenidas en la muestra citológica original. De manera alternativa, en la etapa S112 puede realizarse una limpieza. Las células individuales presentes se separan todavía un poco más en la imagen para separarlas claramente entre sí.

Con respecto al ejemplo de realización preferido, se indica que la presente invención naturalmente no se limita al mismo. En general, la presente invención posibilita la separación de una agrupación de células o de un grupo de células que comprende dos células individuales superpuestas. También se determina aquí para cada núcleo celular qué células adyacentes relevantes se sitúan cerca (etapa S102). A continuación, entre los dos núcleos celulares adyacentes se detectan los puntos de contracción (S104) que sirven como marcación de aquellas células en las que finaliza el solapamiento. Entonces se separan primero las células entre los puntos de contracción y a continuación se determina el área de solapamiento de las células, tendida a través del cuadrángulo entre los puntos de contracción y las dos células. Los puntos de la imagen del área de solapamiento se asocian, mediante una etapa de clasificación, a una o ambas células respectivamente. A continuación se realiza una etapa de limpieza opcional, tal como se muestra también en la figura 1.

A continuación se describen por medio de las figuras 2 a 6 ejemplos de realización preferidos para implementar las etapas S102 a S112 descritas detalladamente por la figura 1.

A continuación, mediante la figura 2, se explica detalladamente la determinación de núcleos celulares adyacentes en un grupo de células según un ejemplo de realización preferido. Si se considera un grupo de células que debe separarse en células individuales, entonces en la separación de un núcleo celular se cuestiona primeramente qué otros núcleos celulares, y los plasmas celulares unidos a éstos, se disponen en general "cerca", de manera que éstos deben tenerse en cuenta en una división del plasma común. La expresión "cerca" representa una simplificación. La decisión de si deben tenerse o no en cuenta cada uno de los núcleos celulares en un grupo celular, contribuye de manera decisiva a si la superficie de plasma celular separado es correcta o no.

Según un ejemplo de realización preferido se responde a la pregunta de si un núcleo celular adyacente debe tenerse en cuenta en la separación de un núcleo celular considerado, basándose en una distancia existente entre los dos núcleos celulares, y de si los dos núcleos celulares están dispuestos en un plasma celular común.

A modo de ejemplo pueden considerarse las células Z1 y Z2 mostradas en la figura 2A que presentan en cada caso un núcleo ZK1 y ZK2 celular. Además, las células presentan en cada caso un plasma ZP1 y ZP2 celular que se solapa uno sobre otro, por lo que se forma un plasma ZP celular común. La distancia permitida entre los dos núcleos ZK1 y ZK2 celulares se sitúa entre una distancia máxima y una distancia mínima. La distancia máxima y la distancia mínima se determinan empíricamente. En un ejemplo de realización preferido en el que la información sobre las células Z1 y Z2 individuales se presenta en imágenes binarias, existen para los núcleos celulares individuales las denominadas máscaras binarias, y del mismo modo, existe para el plasma ZP celular común una máscara binaria. Según un ejemplo de realización preferido, se considera la distancia euclidiana entre el punto central de la máscara binaria del núcleo ZK1 celular que va a separarse y el punto central de la máscara binaria de los núcleos celulares restantes, aquí núcleo ZK2 celular, debiendo ser la distancia inferior a 300 píxeles. Asimismo, en el ejemplo de realización se determina la distancia mínima que se comprueba restando a la distancia de los puntos centrales, en cada caso, la distancia media de todos los puntos de contorno del punto central de las dos máscaras binarias. El valor resultante, según el ejemplo de realización preferido, no debe ser inferior a 30 píxeles. Los valores de píxeles que se acaban de describir son válidos, al igual que los valores de píxeles mencionados a continuación, para imágenes con una resolución de 1000 x 700 píxeles. Dependiendo de la cámara, el objetivo, etcétera, pueden crearse imágenes con otras resoluciones para las que son válidos otros valores de píxeles.

Si ahora está presente otro núcleo ZK2 celular adyacente al núcleo ZK1 celular que va a separarse, el cual cumple los requisitos con respecto a la distancia, entonces debe garantizarse adicionalmente que estos dos núcleos celulares pertenecen al plasma ZP celular común. Para determinar esto, entre los núcleos SK1 y SK2 celulares o entre los puntos centrales de las máscaras binarias asociadas se coloca una recta G que debe situarse completamente dentro del plasma celular común de la agrupación de células, tal como se muestra en la figura 2A.

Si éste no es el caso, el núcleo celular no se rechaza todavía, sino que se comprueba primero una denominada "unión indirecta". La comprobación de la unión indirecta se describe mediante las figuras 2B y 2C. Expresado en palabras sencillas, una "unión indirecta" es una línea de unión formada por dos rectas G1 y G2, en la que la recta G1 se extiende desde el núcleo ZK1 celular hasta un punto común, el punto K de encuentro, y en la que la recta G2 se extiende desde el segundo núcleo ZK2 celular hacia el punto K de encuentro común, tal como se muestra en la figura 2B. Geométricamente esta unión puede describirse de la siguiente manera. Entre los dos núcleos ZK1 y ZK2 celulares o los puntos centrales de las máscaras binarias asociadas existe un número de puntos que tienen en cada caso la misma separación con respecto a los núcleos celulares. Estos puntos se disponen en una recta L (véase la figura 2C) que se sitúa perpendicular a la recta G que une los núcleos ZK1 y ZK2 celulares, estando dispuesta la recta L centrada entre los dos núcleos celulares. Todos los puntos situados en la recta L se consideran ahora individualmente. Para cada uno de los puntos considerados se forma una recta G1 partiendo del núcleo ZK1 celular, y una recta G2 partiendo del núcleo ZK2 celular hacia el punto examinado. A continuación se comprueba si las dos rectas G1 y G2 se sitúan dentro del plasma ZP celular común. Si éste es el caso, mediante estas dos rectas G1 y G2 podría producirse una unión indirecta entre los puntos centrales.

Si la consideración de todos los puntos diera lugar a que la existencia varias de estas uniones indirectas, entonces se elige aquella que presenta el ángulo mayor entre las dos rectas G1 y G2, o la que se sitúa lo más cerca posible a la recta G, la cual representa la unión más próxima entre el núcleo celular, o aquella unión en la que las dos rectas G1 y G2 son lo más cortas posible. Las tres condiciones que se acaban de mencionar son equivalentes. El punto seleccionado al final es el punto K de encuentro ya mencionado mediante la figura 2B.

Según un ejemplo de realización preferido se prevé además que el punto K de encuentro se sitúe separado solamente una distancia predeterminada del punto A de plomada en el que la recta L corta a la recta G. En un ejemplo de realización preferido, esta distancia máxima es de aproximadamente 50 píxeles.

Si se cumple tanto este requisito de separación como el requisito de unión de los dos núcleos celulares, entonces los dos núcleos celulares se consideran adyacentes uno respecto al otro. Si no se cumple uno o los dos requisitos, entonces el núcleo ZK1 celular que va a separarse originariamente ya no se tiene en cuenta y se rechaza.

Aunque mediante las figuras 2A a 2C se ha descrito un ejemplo, naturalmente la presente invención no se limita al mismo, especialmente no al empleo de dos núcleos celulares. En la figura 2D se muestran cinco núcleos ZK1 a ZK5 celulares con sus correspondientes uniones directas e indirectas que pueden encontrarse de la manera descrita anteriormente. En el caso de la imagen de ejemplo mostrada en la figura 2D, se trata de una representación ampliada del grupo celular asociado a la etapa S102 en la figura 1.

En una situación en la que se presentan más de dos núcleos celulares y con los que se presenta una unión indirecta para dos núcleos celulares adyacentes, existe el punto K de encuentro anteriormente descrito. Para este punto K de encuentro se tienen en cuenta ahora las distancias con respecto a los otros núcleos celulares y se determina si una de estas distancias es inferior a la distancia del punto de encuentro con respecto al núcleo celular que va a separarse, tal como se muestra en la figura 2E. En este caso, tras determinar la unión indirecta entre el núcleo ZK1 celular y el núcleo ZK2 celular, se determinó que la distancia X del punto K de encuentro con respecto al núcleo ZK3 celular es inferior a la distancia del punto K de encuentro con el núcleo ZK1 celular. El núcleo ZK2 celular, al que se recurrió inicialmente para la consideración indirecta, se rechaza por tanto para la separación posterior del núcleo ZK1 celular y, en su lugar, aparece el núcleo ZK3 celular.

A continuación, mediante las figuras 3A a 3C se explica detalladamente un ejemplo de realización preferido para localizar puntos de contracción por medio de dos núcleos celulares adyacentes. Tras realizar la etapa descrita detalladamente por la figura 2, existe ahora para el núcleo ZK1 celular que va a separarse una lista en los núcleos celulares que debe tenerse en cuenta en la separación. En el presente ejemplo de realización, esta lista contiene únicamente el núcleo ZK2 celular adyacente. Si resulta que la lista está vacía, es decir que no existe ningún núcleo celular adyacente al núcleo ZK1 celular considerado que va a separarse, entonces este núcleo celular, y sobre todo el plasma celular correspondiente, no puede separarse. En consecuencia, este núcleo celular se rechaza. Esto puede ocurrir cuando el núcleo ZK1 celular actual se sitúa en el plasma celular de una agrupación de células con varios núcleos celulares, pero ninguno de estos núcleos celulares cumple los requisitos anteriormente descritos con respecto a la distancia y unión. Además de los núcleos celulares incluidos en la lista, también se indica en ella la posición del punto K de encuentro que se determinó para la unión indirecta más corta entre el núcleo celular contenido en la lista y el núcleo celular que va a separarse. Si la unión es una unión directa, entonces el punto de encuentro es el punto central entre los núcleos celulares considerados, en el ejemplo de realización, tal como se describió anteriormente, entre el núcleo ZK1 celular que va a separarse y el núcleo ZK2 celular adyacente.

Basándose en el núcleo celular que va a separarse y el núcleo celular adyacente, así como basándose en el punto K de encuentro se buscan ahora puntos E1, E1' de contracción (véase la figura 3A). Según un ejemplo de realización preferido, en cuanto a los puntos de contracción, se trata del punto más estrecho del plasma ZP celular que une ambos núcleos ZK1 y ZK2 celulares, tal como se muestra en la figura 3A mediante las flechas allí indicadas.

Para encontrar los puntos de contracción se coloca una recta a través del punto K de encuentro, que discurre paralela a la recta G entre los dos núcleos celulares. Si existe una unión directa entre los núcleos celulares, entonces se trata en este caso de la recta G.

A continuación se consideran todos los puntos de contorno del plasma que pertenece al grupo de células, del plasma ZP celular común. Para cada punto de contorno la perpendicular se corta en la recta situada a través del punto de encuentro, y a continuación se buscan los dos puntos de contorno que cumplen los siguientes requisitos.

El primer requisito consiste en que los puntos deben situarse "entre" los núcleos celulares, es decir, el punto de plomada debe situarse en el tramo entre los núcleos celulares. Esta área se limita todavía más, según otro ejemplo de realización, porque de los dos extremos del tramo entre los núcleos celulares se declara "no válida" una parte de la longitud de la distancia media correspondiente de los puntos R_{n} de contorno con respecto al punto S central del núcleo celular, tal como se ilustra en la figura 3B por medio la flecha asociada a la recta G.

El segundo requisito es que uno de los puntos buscados debe situarse "a la izquierda" y uno de los puntos buscados debe situarse "a la derecha" de la recta G seleccionada, tal como se ilustra en la figura 3C, en la que el primer punto E1 se sitúa por encima de la recta G, y el segundo punto E1' se sitúa por debajo de la recta. En la determinación de la perpendicular esto se expresa en signos positivos o negativos.

El último requisito consiste en que a ambos lados de la recta G se selecciona, en cada caso, el punto con la perpendicular más corta.

Si se cumplen todos estos requisitos, se determinan entonces los puntos E1 y E1' de contracción entre el núcleo ZK1 celular que va a separarse y el núcleo ZK2 celular adyacente. Si no se encuentra ningún punto de contorno que satisfaga los requisitos anteriormente mencionados, se interrumpe el procedimiento para el núcleo ZK1 celular considerado dado que no se encontró ninguna posición apropiada para una división.

Después de hallar los puntos de contracción, se explica detalladamente un ejemplo de realización preferido mediante la figura 4 para separar el plasma celular común.

Los puntos de contracción detectados se añaden según un ejemplo de realización preferido a la lista existente de los núcleos celulares relevantes. Entre cada par, compuesto del núcleo celular que va a separarse y de un núcleo celular relevante incluido en la lista por ser adyacente, basándose en los puntos de contracción, se traza una recta entre los mismos, y el plasma celular común del grupo celular se "corta" en esta recta. Este corte se realiza para obtener una base aproximada para el área que va a separarse del plasma celular común.

Según un ejemplo de realización preferido que contiene información sobre el plasma celular común y los núcleos celulares en una máscara binaria, que contiene píxeles "blancos" y "negros", el corte se realiza introduciendo una línea "negra" entre los puntos de contracción de un par, lo que se realiza para todos los puntos de contracción.

En la figura 4A se muestra una máscara binaria de un grupo de células en el que tres de los plasmas celulares que no van a detectarse en la máscara binaria deben separarse entre sí. En la figura 4A va a detectarse únicamente el contorno del plasma ZP celular común. Por razones de sencillez, las secciones individuales de la máscara binaria en la figura 4A se indican por ZK1, ZK2, ZK3. Solamente se considera la separación de la sección ZK1. El algoritmo funciona de tal manera que se trazan rectas T1, T2 en las posiciones de contracción para separar las secciones individuales entre sí. A continuación se llena el área que va a cortarse de manera que se crea la máscara binaria mostrada en la figura 4C, que a continuación, tal como se muestra en la figura 4C, se invierte. Una operación de corte boleana de la máscara binaria mostrada en la figura 4D con la máscara binaria original según la figura 4A lleva a la máscara binaria en la figura 4E que contiene solamente la sección del plasma celular común que va a separarse del grupo celular.

Antes de que, a continuación, se determine una posible área de solapamiento, según un ejemplo de realización preferido se considera la distancia entre los dos puntos de contracción. Si esta distancia sobrepasa un valor límite predefinido, determinado empíricamente, por ejemplo 40 píxeles, entonces debe suponerse que en esta superficie de corte los plasmas celulares de los núcleos celulares adyacentes estaban únicamente en contacto pero no se habían solapado realmente. Si se determina una situación de este tipo, entonces no es necesario ningún procesamiento adicional, sino que la sección separada muestra realmente la célula presente en la muestra original.

Además se comprueba si la distancia de los puntos de contracción no sobrepasa un valor máximo, por ejemplo 350 píxeles. Si se determina que se ha sobrepasado el valor máximo, entonces debe suponerse que la determinación de los puntos de contracción no se ha desarrollado correctamente, dado que no es probable un solapamiento de esta longitud, o bien la agrupación de células debe contemplarse como indivisible, al menos en este punto. En esta situación finaliza la separación del núcleo celular en cuestión con el plasma celular.

Una vez separada la base aproximada del plasma celular del grupo de células, se supone básicamente que en cada una de las superficies de corte se ha ajustado un solapamiento de plasmas celulares de distintas células. Por tanto, en una etapa subsiguiente debe determinarse un área en la que debe buscarse este solapamiento de los plasmas.

Mediante las figuras 5A y 5B se describe un ejemplo de realización preferido mediante el que se determina un área en cuestión en la que se esperan solapamientos de los plasmas celulares de las células contenidas en la muestra original.

Tal como se muestra mediante la figura 5A, con los dos puntos E1, E1' de contracción y los dos núcleos ZK1 y ZK2 celulares se forma un cuadrángulo que, por lo general, tiene la forma de un rombo. Dentro de este cuadrángulo se espera un solapamiento de los plasmas celulares en la muestra original. La superficie interior del cuadrángulo se representa de nuevo como una máscara binaria según un ejemplo de realización preferido, y se corta con la máscara binaria del plasma celular común del grupo de células de manera boleana, dado que el solapamiento naturalmente solo puede situarse dentro del plasma y por tanto no debe considerarse ningún píxel fuera del plasma. Esto es necesario dado que, naturalmente, partes del cuadrángulo pueden situarse también fuera del plasma. A continuación, de la máscara binaria resultante se resta la máscara binaria de los núcleos celulares en cuestión, dado que tampoco se recurre a las áreas de los núcleos celulares para detectar las áreas de solapamiento de los plasmas celulares.

En un grupo de células puede ocurrir que existan varios núcleos celulares adyacentes para el núcleo celular que va a cortarse. Para cada uno, se determinan los puntos de contracción y se forman posibles áreas de solapamiento. Si ocurriera que se cortan dos o más de estas posibles áreas de solapamiento, éstas se agrupan en una sola máscara binaria y se tratan conjuntamente. Mediante la figura 5B se muestra una situación de este tipo, representándose el área de solapamiento con rayas.

Tal como se ha expuesto anteriormente, dentro del área de solapamiento se supone el solapamiento de los plasmas celulares de las células individuales contenidas en la muestra original. Esto se distingue, por ejemplo, en una imagen de luz transmitida de la muestra, por regla general por un valor tricromático más oscuro, dado que dos plasmas solapados aparecen más oscuros que un plasma. Esta diferencia puede resolverse de la manera más sencilla con un histograma y una determinación adecuada de valores umbral.

Según un ejemplo de realización preferido, respecto al área de solapamiento determinada se crea un histograma local de la imagen creada, por ejemplo, de la imagen de luz transmitida. A continuación se examina el histograma para determinar un valor umbral y, con éste, binarizar la imagen creada dentro de la máscara binaria. Este examen puede realizarse, por ejemplo, utilizando el procedimiento de Otsu, que se describe detalladamente en T. Lehmann, W. Oberschelp, E. Pelikan y R. Reptes en "Bildverarbeitung für die Medizin", Springer, Berlín 1997. De esta manera, en la máscara binaria los píxeles más oscuros en el solapamiento se representan blancos y los píxeles más claros en el solapamiento negros. Esto se ilustra en las figuras 6A y 6B, mostrando la figura 6A la máscara poco definida del plasma celular ya descrita anteriormente. La figura 6B muestra la máscara binaria de solapamiento que se produce por las etapas anteriormente descritas.

Esta máscara binaria de solapamiento se fusiona con la máscara binaria según la figura 6A, de lo que resulta la máscara binaria mostrada en la figura 6C. Los artefactos que se encuentran todavía en el contorno se limpian, de manera se produce la forma final, tal como se muestra en la figura 6E.

De la manera descrita anteriormente, los grupos de células en un preparado pueden descomponerse en células individuales mediante del procedimiento según la invención, de manera que, por medio de la automatización en este punto, se consigue una automatización global del procedimiento de clasificación para preparados citológicos.

Tal como se ha mencionado anteriormente, el procedimiento según la invención comienza con una agrupación de células o un grupo de células que se ha detectado a partir de una toma de una muestra citológica. A continuación, meditante la figura 7 se describe un diagrama de bloques de otro ejemplo de realización preferido de la presente invención, según el cual el procedimiento comprende las etapas necesarias para la preparación de un grupo de células.

En este ejemplo de realización, el procedimiento comienza con la etapa S200 en la que se realiza una toma de una imagen de la muestra citológica en una o varias modalidades. Tal como ya se ha mencionado anteriormente, la toma de una imagen se realiza con una modalidad de toma, por ejemplo, de luz transmitida o de fluorescencia. De manera alternativa, pueden crearse también varias imágenes multimodales registradas conjuntamente, por ejemplo mediante la creación de imágenes de una muestra en una primera modalidad de toma y en una segunda modalidad de toma. La primera modalidad de toma puede ser, por ejemplo, una modalidad de toma de luz transmitida, y la segunda modalidad de toma puede ser una modalidad de toma de fluorescencia. De manera alternativa pueden emplearse también modalidades de toma de fluorescencia con diferentes parámetros.

En la etapa siguiente S202 se detectan los núcleos celulares que se encuentran en la toma y se segmentan para crear una lista de los núcleos celulares contenidos en la imagen o en la toma. Paralelamente a esto, en la etapa S204, se realiza la detección de los plasmas celulares contenidos en la toma y una segmentación de los mismos para crear de nuevo una lista que contiene ahora los plasmas celulares en la toma. Debe indicarse que, en el caso de la utilización de varias imágenes, la segmentación de núcleos celulares y la segmentación de plasmas celulares no deben realizarse de las mismas imágenes. De manera preferida, la segmentación de plasmas celulares se realiza en función de imágenes de luz transmitida, mientras que la segmentación de núcleos celulares puede realizarse basándose en imágenes de fluorescencia. Una vez detectados los núcleos celulares y los plasmas celulares en la muestra, en la etapa S206 los núcleos celulares se asocian a los plasmas, por medio de las listas creadas. A continuación, en la etapa S208 se comprueba si a un plasma se ha asignado únicamente un núcleo celular individual. Si éste es el caso, entonces se presenta una célula individual que no necesita ninguna segmentación adicional y el procedimiento termina en la etapa S210. Si se determina que a un plasma se ha asignado más de un núcleo celular, entonces el procedimiento pasa a la etapa S212 en el que se determina que existe un grupo de células. Este grupo de células se separa a continuación en la etapa S214 de tal manera que, finalmente, se presentan las células individuales en las etapas S216 y S218 para el procesamiento posterior. Con respecto a los pasos realizados en la etapa S214 se remite a la descripción anterior del ejemplo de realización preferido para la separación de grupos de células.

A continuación se describe un ejemplo de realización preferido para detectar y segmentar plasmas celulares y núcleos celulares en la toma de una muestra citológica.

Opcionalmente, la segmentación de plasmas celulares se realiza en una imagen de luz transmitida o en una imagen de fluorescencia de la muestra. La segmentación de plasmas celulares se realiza mediante la utilización de histogramas. Aquí se calcula un valor umbral predeterminado (por ejemplo mediante el procedimiento de Otsu mencionado anteriormente) con el que se binariza la imagen de luz transmitida para separar de esta manera los plasmas celulares del fondo más claro. Para la formación de histogramas y la formación de valores umbral pueden implementarse diferentes procedimientos muy conocidos en el estado de la técnica.

La imagen binaria de la toma de las células, que se origina mediante el planteamiento basado en el histograma, se examina ahora para determinar regiones en la imagen binaria que reproducen el plasma, incluido el núcleo, de una célula o que reproducen una agrupación de células de células solapadas. Cada área independiente en la imagen binaria representa una región propia y a cada región propia, es decir a cada plasma de la célula o a cada superficie de una agrupación de células de células solapadas, se asocia una imagen parcial, por ejemplo en forma de una máscara binaria.

La segmentación de núcleos celulares se realiza de manera similar a la segmentación de plasmas celulares, opcionalmente en la imagen de luz transmitida o en la imagen de fluorescencia. También aquí se emplea el planteamiento conocido basado en histogramas para detectar núcleos celulares en la toma de la prueba citológica, de tal manera que se producen imágenes parciales para núcleos celulares individuales en forma de máscaras binarias.

La lista de imágenes parciales (máscaras binarias) que resulta de la segmentación de los plasmas celulares, en la que cada imagen parcial corresponde al plasma de una célula o a la superficie de una agrupación de células de células solapadas, y las imágenes parciales de los núcleos celulares en cuestión que resultan de la segmentación de los núcleos celulares, se relacionan mediante una sencilla operación boleana. Si la cantidad de corte de las máscaras binarias del núcleo celular y de la máscara binaria de un plasma celular no está vacía, entonces se asocia el núcleo celular al plasma celular. Si se determina que a un plasma celular se asocia únicamente un núcleo celular, entonces en este caso ya se trata de células segmentadas con un plasma y un núcleo celular. Si a un plasma se asocian dos o más núcleos celulares, entonces se presenta una agrupación de células o un grupo celular que debe separarse según la invención.

En un ejemplo de realización de la presente invención, basándose en las imágenes parciales asociadas a los núcleos celulares detectados, se realiza una clasificación de los núcleos celulares que comprende una comparación de parámetros seleccionados del núcleo celular con parámetros predeterminados, para determinar si un núcleo celular detectado es apropiado para un procesamiento posterior.

En función de la toma de la muestra citológica preparada y procesada de esta manera, el procedimiento según la invención realiza la descomposición de las agrupaciones de células segmentadas en células individuales.

En la descripción anterior del ejemplo de realización preferido se ha expuesto que el área de solapamiento se forma por medio de un cuadrángulo. La presente invención no se limita a esta configuración, es más, el área de solapamiento puede extenderse por una superficie de cualquier forma entre los puntos E1, E1' de contracción y los núcleos ZK1 y ZK2 celulares.

Claims

1. Procedimiento para la separación de un grupo de células contenido en una imagen de una muestra en células individuales para una posterior clasificación de la muestra, en el que el grupo de células presenta una pluralidad de células solapadas unas con otras, con las siguiente etapas:

(a): seleccionar (S102) un núcleo (ZK1) celular de una primera célula (Z1) que va a separarse del grupo de células, disponiéndose el núcleo (ZK1) celular de la primera célula (Z1) adyacente al núcleo (ZK2) celular de una segunda célula (Z2), solapándose el plasma celular de la primera célula (Z1) y el plasma celular de la segunda célula (Z2) uno con otro de manera que se forma un plasma (ZP) celular común;

(b): determinar (S104) una contracción del plasma (ZP) celular común entre el núcleo (ZK1) celular de la primera célula (Z1) y el núcleo (ZK2) celular de la segunda célula (Z2);

(c): separar el plasma (ZP) celular común en la contracción;

(d): determinar una área del plasma (ZP) celular común en la que se espera el solapamiento del plasma celular de la primera célula (Z1) y de la segunda célula (Z2);

(e): clasificar el área determinada para asociar secciones individuales de la misma con el plasma celular de la primera célula (Z1) y/o el plasma celular de la segunda célula (Z2); y

(f): completar el plasma celular de la primera célula (Z1) obtenido en la etapa (c) basándose en las secciones clasificadas.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa (a) comprende las siguientes etapas:

-: (a.1.) determinar una distancia (G) entre el núcleo (ZK1) celular de la primera célula (Z1) y el núcleo (ZK2) celular de la segunda célula (Z2);

-: (a.2.) determinar si el núcleo (ZK1) celular de la primera célula (Z1) y el núcleo (ZK2) celular de la segunda célula (Z2) están dispuestos en el plasma (ZP) celular común;

-: (a.3.) si en la etapa (a.1) se determina que la distancia queda fuera de un área predeterminada, y/o si en la etapa (a.2.) se determina que los núcleos celulares no están dispuestos dentro del plasma celular (ZP) común, clasificar los núcleos (ZK1, ZK2) celulares como no adyacentes; y

-: (a.4.) si en la etapa (a.1.) se determina que la distancia queda fuera de un área predeterminada, y si en la etapa (a.2.) se determina que los núcleos celulares no están dispuestos dentro del plasma (ZP) celular común, clasificar los núcleos (ZK1, ZK2) celulares como adyacentes.

-: Procedimiento según la reivindicación 2, en el que, en la etapa (a.2.) se determina si el núcleo (ZK1) celular de la primera célula (Z1) y el núcleo celular (ZK2) de la segunda célula (Z2) están unidos por una recta (G) que discurre completamente por dentro del plasma (ZP) celular común, o si entre el núcleo (ZK1) celular de la primera célula (Z1) y el núcleo (ZK2) celular de la segunda célula (Z2) existe un punto común (K) respecto al cual los núcleos (ZK1, ZK2) celulares presentan la misma distancia y que se sitúa en el plasma celular (ZP) común.

3. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el núcleo (ZK1) celular de la primera célula (Z1) y el núcleo (ZK2) celular de la segunda célula se clasifican como no adyacentes, si existe otra célula (Z3) con un núcleo (ZK3) celular cuya distancia al punto (K) común es más pequeña que la distancia del núcleo (ZK2) celular de la segunda célula (Z2) al punto común (K).

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa (c) incluye las siguientes etapas para determinar dos puntos (E1, E1') de contracción del plasma (ZP) celular común:

: para todos los puntos de contorno del plasma (ZP) celular común que se sitúan entre los núcleos (ZK1, ZK2) celulares, determinar la distancia de cada punto de contorno a una línea (L) recta determinada y seleccionar los puntos de contorno como puntos (E1, E1') de contracción que presentan una determinada distancia respecto a la recta.

5. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la distancia predeterminada es una distancia mínima de todos los puntos de contorno considerados.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que, en la etapa (c), la primera célula (Z1) se separa del grupo de células a través de una línea (T) de separación determinada por la contracción.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 7, en el que la etapa (d) incluye las siguientes etapas:

: determinar el área situada entre los núcleos (ZK1, ZK2) celulares y los puntos (E1, E1') de contracción.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 8, en el que, en la etapa (e), el área determinada se clasifica basándose en la transparencia del plasma (ZP) celular común en las secciones individuales.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 9, en el que al menos una célula adicional en el grupo de células está dispuesta adyacente a la primera célula, y en el que también se realizan las etapas (b) a (e) para la primera célula y la célula adicional.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 10, en el que la imagen de la muestra se genera mediante una toma de la muestra en una modalidad de toma de luz transmitida, o en el que la imagen comprende una pluralidad de imágenes parciales que se registran conjuntamente y que se generan en la misma o en diferentes modalidades de toma.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 11, en el que el método comprende las siguientes etapas anteriores a la etapa (a):

-: detectar y segmentar (S102) núcleos celulares en una imagen de la muestra para generar una lista de núcleos celulares;

-: detectar y segmentar (S204) plasmas celulares en la imagen para generar una lista de plasmas celulares;

-: asociar (S206) los núcleos celulares con los correspondientes plasmas celulares; y

-: detectar (S208) plasmas celulares que están asociados con más de un núcleo celular para determinar un grupo de células para una posterior separación.

12. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la etapa de detección y segmentación (S202) de los núcleos celulares se basa en una imagen de la muestra generada en una modalidad de toma de luz trasmitida o una modalidad de toma de fluorescencia, en el que los núcleos celulares se detectan basándose en un histograma y un valor umbral predeterminado, y en el que cada núcleo celular detectado se asocia a una imagen parcial.

13. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que, basándose en las imágenes parciales asociadas a los núcleos celulares detectados, se realiza una clasificación de los núcleos celulares que comprende una comparación de parámetros seleccionados del núcleo celular con parámetros predeterminados, para determinar si un núcleo celular detectado es adecuado para un procesamiento posterior.

14. Procedimiento según la reivindicación 13 o 14, en el que la etapa de búsqueda y segmentación (S204) de plasmas celulares se basa en una imagen de la muestra generada en una modalidad de toma de luz transmitida o en una modalidad de toma de fluorescencia, en el que los plasmas celulares se detectan en la imagen basándose en una detección del contorno o basándose en un histograma y un valor umbral predeterminado, en el que cada plasma celular detectado se asocia a una imagen parcial.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 12 a 15, en el que la imagen de la muestra se binariza en la búsqueda y segmentación de núcleos celulares y plasmas celulares, y en el que las imágenes parciales están formadas por máscaras binarias.

16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 13 a 16, en el que la etapa de asociación (S206) de núcleos celulares con plasmas celulares correspondientes y de detección (S208) de grupos celulares comprende la comparación de las imágenes parciales generadas para los núcleos celulares y los plasmas celulares, en el que, dependiendo de la comparación, uno o más núcleos celulares se asocian con un plasma celular, en el que las imágenes parciales asociadas con cada uno se asocian con un primer grupo que contiene imágenes parciales de un plasma celular y un núcleo celular y un segundo grupo que contiene imágenes parciales de un plasma celular y una pluralidad de núcleos celulares, en el que las imágenes parciales del segundo grupo indican un grupo de células que sirven de base para el procesamiento
posterior.