ES2248822T3 - Procedimientos y composiciones para la prevencion y el tratamiento de enfermedades asociadas al clostridium difficile. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION PROPORCIONA PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA PREVENIR Y TRATAR LA ENFERMEDAD ASOCIADA AL CLOSTRIDIUM DIFFICILE EN UN SUJETO, CARACTERIZADO PORQUE EL SUJETO PUEDE SER UN ANIMAL HUMANO O NO HUMANO. EL PROCEDIMIENTO COMPRENDE LA ADMINISTRACION AL SUJETO DE UNA CANTIDAD EFECTIVA DE UNA CEPA NO TOXICA DE C. DIFFICILE O UNA COMBINACION DE CEPAS. UNA CEPA ADECUADA NO TOXICA SE SELECCIONA ENTRE EL GRUPO M, T, C, P, S Y AP, TAL COMO SE DEFINE POR EL ANALISIS DE LA ENDONUCLEASA DE RESTRICCION. SE PROPORCIONAN IGUALMENTE COMPOSICIONES FARMACEUTICAS Y PRESENTACIONES EN DOSIS UNITARIAS QUE COMPRENDEN UNA UNICA CEPA O COMBINACION DE CEPAS SELECCIONADAS ENTRE UN GRUPO NO TOXICO DE C. DIFFICILE Y UN PROCEDIMIENTO PARA SELECCIONAR CEPAS NO TOXICAS DEL C. DIFFICILE.

Description

Procedimientos y composiciones para la prevención y el tratamiento de enfermedades asociadas con Clostridium difficile.

La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones útiles para prevenir y tratar las enfermedades asociadas con Clostridium difficile.

Las enfermedades asociadas con Clostridium difficile (CDAD) constituyen las causas más frecuentemente identificadas de diarrea intrahospitalaria (es decir, en centros sanitarios), que producen diarreas tanto endémicas como epidémicas. La incidencia de CDAD oscila entre < del 1% y el 7,8% de las altas hospitalarias. CDAD prolonga la hospitalización, aumenta los costes de los cuidados, y provoca una morbilidad considerable, especialmente en el 10-20% con recidiva, y una mortalidad de entre el 0,6 y el 2,3%. Los pacientes ancianos y aquellos que presentan permanencias hospitalarias largas tienen particularmente un alto riesgo.

La transmisión horizontal de C. difficile en el hospital para pacientes susceptibles que reciben antibióticos, representa la gran mayoría de la incidencia de CDAD. Ningún procedimiento de control de la infección ha mostrado un amplio éxito para prevenir la transmisión, y si ésta tiene lugar, las medidas profilácticas que apuntaron a prevenir los síntomas se han mostrado incómodas, ineficaces o ambas cosas. Por tanto, se requieren nuevas e innovadoras propuestas para prevenir las CDAD.

En los animales, las enfermedades relacionadas con C. difficile causan grandes pérdidas económicas. Especialmente, en la cría de caballos, los potros jóvenes son extremadamente susceptibles, y provocando la infección la muerte, generalmente; las chinchillas son asimismo vulnerables. El tratamiento antibiótico en animales no sólo es caro, sino que no es completamente efectivo. Son necesarios tratamientos y procedimientos profilácticos efectivos y relativamente baratos.

Aunque la utilización de una cepa no toxigénica de C. difficile se ha sugerido como una solución, la selección de las cepas se ha hecho al azar, y los resultados han sido ambiguos o decepcionantes. Por ejemplo, Wilson y Sheagren (1983) informan de que la colonización con una cepa de C. difficile que no se creía toxigénica pero que no se había caracterizado ulteriormente, de hámsters tratados con cefotoxina, dio lugar a una mejoría sólo del 72% en la supervivencia, comparada con los controles antes de la estimulación con C. difficile toxigénico. Aunque sea incluso más decepcionante, cuando las cepas toxigénicas y no toxigénicas se administraron al mismo tiempo, no se obtuvo un beneficio significativo de supervivencia.

Borriello y Barclay (1985) informaron de que la colonización previa con cepas no toxigénicas de C. difficile de hámsters tratados con clindamicina, los protegió durante por lo menos un corto tiempo de la colonización subsiguiente con una cepa toxigénica. A las cepas no toxigénicas se las designó, pero no se caracterizaron ulteriormente. En total, 13 de los 18 hámsters "protegidos" sobrevivieron hasta los 27 días, mientras que la totalidad de los 27 animales que se habían estimulado con sólo la cepa toxigénica murieron en un plazo de 48 horas. Sin embargo, incluso en los animales "protegidos", la cepa toxigénica se volvió eventualmente dominante y provocó enfermedad, teniendo lugar la muerte en la mayoría de los casos debido a la infección. Los autores concluyeron que era difícil de evaluar el grado al cual el tipo de propuesta (mencionada anteriormente) puede ser terapéuticamente útil. Delmee y Avesani describieron la virulencia de 10 serogrupos de Clostridium difficile en hámsters (Journal of Medical Microbiology, vol 33, nº 2, 1990, páginas 85-90).

Seal et al. (1987) informaron de que dos pacientes (denominados A y B) con diarrea recidivante provocada por C. difficile siguiendo una terapia con metronidazol y vancomicina, fueron colonizados con una cepa de C. difficile avirulenta y no toxigénica que se administró oralmente en tres dosis. La paciente A no sufrió una recidiva ulterior durante los 4 meses que se estuvo estudiando después del tratamiento con C. difficile no toxigénico. El paciente B sufrió una recidiva, pero se informó que más leve que las recidivas previas. Los autores reconocieron que no se mostraba que la bacterioterapia previniera o mitigara actualmente las recidivas. Verdaderamente, en uno de los dos pacientes, no había prevenido la recidiva. Obviamente, las conclusiones sobre sólo dos pacientes pueden cuestionarse. Los autores constataron asimismo que se requerían estudios ulteriores antes de que esta propuesta pudiera considerarse para llevar a cabo los ensayos clínicos en el hospital.

Corthier y Muller (1988) informaron de que la administración de una cepa no toxigénica de C. difficile a ratones gnotobióticos entre 18 horas y 10 días antes de la estimulación con C. difficile toxigénico, produjo una supervivencia del 100%, pero sin embargo, los controles mostraron una supervivencia del 60% en este experimento, sugiriendo sólo una mejoría del 40% aproximadamente. No puede determinarse a partir del artículo cuanto tiempo persistió este nivel de protección. Parece que los ratones se habían observado sólo durante 8 días después de la administración del C. difficile toxigénico.

Borriello (1988) revisó las propuestas bacterioterápicas para la prevención y tratamiento de la infección del tracto digestivo por C. difficile, que incluían la utilización de mezclas fecales completas, mezclas sintéticas de organismos fecales, lactobacilos, la levadura Saccharomyces boulardii, y el C. difficile no toxigénico in vitro, e in vivo en animales, e in vivo en el hombre. Llegó a la conclusión de que todas las propuestas bacterioterápicas necesitaban evaluarse ulteriormente, pero que una cepa no toxigénica de C. difficile puede cumplir los criterios para una preparación bien definida y "limpiadora".

La bacterioterapia experimental se encuentra en la utilización clínica en los Estados Unidos con Saccharomyces boulardii, una levadura que se ha informado que muestra algún beneficio en la reducción de las recidivas y en la prevención de la diarrea asociadas con los antibióticos, pero no es efectiva contra la diarrea por C. difficile (McFarland et al., 1994; Surawicz et al. 1989). Un problema con Saccharomyces es que son necesarias dos administraciones diarias durante 4 semanas, haciendo difícil la conformidad por parte de los pacientes.

La utilización con éxito de la instilación rectal de heces y mezclas bacterianas de organismos fecales para tratar las recidivas crónicas por C. difficile se constató en seis pacientes (Tvede y Rask-Madsen, 1989). La utilización de bacterioterapia no se ha extendido ampliamente debido a que los médicos son reacios y los pacientes, por razones estéticas, a utilizar preparaciones fecales.

Sumario de la invención

La invención se refiere a la utilización de una cepa no toxigénica de C. difficile seleccionada de entre el grupo constituido por M3, M23 y T7, que se clasifican basándose en su patrón de endonucleasa de restricción sobre un gel de agarosa, según el procedimiento descrito en Clabots et al., J. Clin. Microbiol, vol. 31, 1993, páginas 1870-1875, para preparar un medicamento para su administración a un individuo, en el que se administra la cepa no toxigénica de C. difficile después de la inhibición del tratamiento antibiótico, en una cantidad suficiente para establecer la colonización del tracto gastrointestinal de un individuo, para prevenir la enfermedad asociada con C. difficile.

En una forma preferida, dicha cepa es una combinación de dos o más cepas no toxigénicas.

La invención se refiere asimismo a una composición farmacéutica que comprende una cepa no toxigénica de C. difficile, seleccionada de entre el grupo constituido por M3, M23 y T7, clasificados basándose en su patrón de endonucleasa de restricción sobre un gel de agarosa, según el procedimiento descrito en Clabots et al., J. Clin. Microbiol, vol 31, 1993, páginas 1870-1875, encontrándose dicha cepa en una cantidad suficiente para establecer la colonización del tracto gastrointestinal de un individuo, para prevenir la enfermedad asociada con C. difficile, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una forma de realización preferida dicha cepa T no toxigénica es una combinación de cepas no toxigénicas seleccionadas de entre el grupo constituido por las cepas M3, M23 y T7.

En otra forma de realización, esta composición se formula en una forma de dosificación unitaria.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento para seleccionar una cepa no toxigénica de C. difficile que es efectiva para prevenir la enfermedad relacionada con ésta, comprendiendo dicho procedimiento:

a) aislar una cepa de C. difficile a partir de un individuo en una población;

b) determinar que la cepa ni tenga la toxina A ni la B;

c) determinar la frecuencia relativa del grupo al que pertenece, por su patrón de endonucleasa de restricción sobre un gel de agarosa, la cepa aislada de (b);

d) seleccionar una cepa que pertenezca a un grupo encontrado en el individuo relativamente frecuente, en el q que frecuente se define como, por lo menos, un 5% de los aislados no toxigénicos encontrados en la población de los aislamientos.

En una forma de realización preferida, la cepa seleccionada es relativamente frecuente dentro de este grupo.

Además, la invención se refiere a la utilización de una o más cepas de C. difficile no toxigénico seleccionado de entre el grupo constituido por M3, M23 y T7, clasificado basándose en su patrón de endonucleasa de restricción sobre un gel de agarosa, según el procedimiento descrito en Clabots et al., J. Clin. Microbiol, vol. 31, 1993, páginas 1870-1875, en una cantidad que es efectiva para suprimir la población del C. difficile toxigénico en el tracto gastrointestinal de un paciente, en la preparación de un medicamento para controlar la diarrea en el paciente.

En una forma de realización preferida de dicha utilización, la cepa T no toxigénica es una combinación de cepas no toxigénicas seleccionadas de entre el grupo constituido por las cepas M3, M23 y T7.

Se describen procedimientos y composiciones para prevenir y tratar CDAD (enfermedades relacionadas con C. difficile) en individuos que incluyen al hombre y a los animales no humanos, por ejemplo, mamíferos y aves. "Individuos" son personas o animales que han recibido antimicrobianos o antineoplásicos (que tienen asimismo actividad antimicrobiana). Para la prevención de la enfermedad por C. difficile, se administra una composición de una cepa no toxigénica seleccionada de C. difficile en el intervalo de 24 horas aproximadamente después de recibir agentes antibióticos (antimicrobianos) o antineoplásicos. Esto es para permitir un tiempo en el que la flora intestinal normal pueda suprimirse, pero no un tiempo suficiente para que las cepas toxigénicas de C. difficile lleguen a establecerse en el tracto gastrointestinal. Ejemplos de tipos de agentes antimicrobianos conocidos por provocar un riesgo de enfermedad por C. difficile en los animales humanos y no humanos o en las aves, incluyen cefalosporinas, clindamicina, ampicilina, tetraciclinas.

Para el tratamiento de individuos que presentan la enfermedad por C. difficile, deben administrarse en primer lugar antibióticos (habitualmente vancomicina o metronidazol) que se dirijan a controlar la enfermedad, y entonces, para prevenir una recidiva, se administran las composiciones.

Los procedimientos comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de esporas (generalmente del orden de 5 x 10^{5} a 10^{6} unidades formadoras de colonias) de una cepa seleccionada no toxigénica de C. difficile. Pueden requerirse dosis repetidas o más altas para el tratamiento que para la prevención. La "efectividad" se determina mediante criterios clínicos que muestren que el riesgo de desarrollar CDAD se reduce en un 80% o más, cuando se compara con el de los pacientes o animales que se han expuesto en el mismo entorno comparativamente.

Se dan a conocer composiciones para utilizar en el procedimiento, que incluyen cepas seleccionadas no toxigénicas de C. difficile. Se encontraron ciertas cepas no toxigénicas (tipos) de C. difficile para prevenir mejor la enfermedad contra tipos toxigénicos específicos de C. difficile, que contra otros tipos toxigénicos. Se describen procedimientos para seleccionar estas cepas.

Una cepa no toxigénica apropiada es una cepa seleccionada a partir de los grupos M, T, C o AP u otros grupos no toxigénicos, tal como se describe por Clabots et al (1993) o como cepas tratadas mediante técnicas de ingeniería genética para que se conviertan en no toxigénicas. Estos grupos se seleccionan a causa de sus frecuencias relativamente altas como aislamientos de personas o humanos en los que se ha producido la colonización, prediciendo su éxito como colonizadores a los efectos de la invención. Generalmente, grupos "relativamente frecuentes" se encuentran en por lo menos el 5% de los aislamientos no toxigénicos, preferentemente en por lo menos el 15%; y más preferentemente en por lo menos el 25% de los aislamientos. De modo similar, dentro de un grupo, las cepas preferidas son aquellas que son más frecuentes. Una única cepa purificada del grupo M, o de otro grupo único, o una combinación de cepas dentro de un grupo o una combinación de cepas de distintos grupos, son apropiadas. Las cepas del grupo M, en particular M3 y M23 se prefieren individualmente o en combinación con otras cepas. Se proporcionan asimismo composiciones farmacéuticas y formas de dosificación única que comprenden una cepa seleccionada de entre los grupos no toxigénicos de C. difficile o una combinación de cepas.

En algunas condiciones, es ventajoso combinar dos o más cepas no toxigénicas que tienen espectros complementarios de prevención para obtener la prevención de la enfermedad contra un intervalo más amplio de organismos toxigénicos de C.difficile. Esta estrategia se basa en la suposición de que cada una de dos o más cepas colonizan de un modo efectivo cuando se administran conjuntamente y al mismo tiempo (de modo que ninguna cepa tiene la ventaja de ser la primera en llegar al tracto gastro intestinal). Cantidades equivalentes de cada tipo en la combinación, constituyen un punto de partida para la administración, para prevenir que cualquier tipo tenga una ventaja numeral. Las proporciones se ajustan si las cantidades iniciales no son efectivas.

Es posible aplicar técnicas de ingeniería genética a cepas toxigénicas de C.difficile, eliminando o manipulando los dos genes responsables de la producción de las toxinas de C. difficile, A y B, de modo que se creen cepas que ya no produzcan las toxinas responsables que causan las enfermedades asociadas a C. difficile (CDAD). Dichas cepas, que previenen las CDAD de la misma forma que las cepas no toxigénicas, se dan a conocer en la presente memoria. Dichas cepas tendrán que someterse a ensayos extensos de seguridad y eficacia en animales y en el hombre para asegurarse de que son seguras, por ejemplo, que no hayan adquirido ninguna propiedad de virulencia involuntaria como resultado de la ingeniería genética. Asimismo, tendrán que mostrar que son eficaces como medida preventiva mediante los procedimientos que se dan a conocer en la presente memoria, y no revertir a su estado toxigénico original o volver adquirir los genes toxínicos.

Los procedimientos y composiciones son útiles para prevenir y tratar la enfermedad en el hombre o en los animales no humanos, y son particularmente útiles para prevenir y tratar las recidivas múltiples.

Descripción breve de los dibujos

Figura 1: muestra la frecuencia de aislamiento de los tipos no toxigénicos de C. difficile REA para los cuales se recuperaron más de 3 aislamientos. Las cepas se obtuvieron de los pacientes y del entorno de múltiples hospitales de Estados Unidos y de las instalaciones de los hospitales para enfermos crónicos, pero principalmente del Minneapolis VA Medical Center.

Figura 2: es una fotografía de patrones de bandas REA en un gel de agarosa para las cepas M1 de C. difficile (el aislamiento de referencia para el grupo M), M3, M23, M4, M2, y M14. Las cepas VPI 2018 (Wilson y Sheagren, 1983) y el tipo J9 de la cepa toxigénica REA se incluyen para comparación.

Figura 3: es una fotografía del gel de agarosa de los patrones de las bandas REA de los tipos S1, M3, M4, M23, T7, J9 y VPI 2018.

Descripción detallada de la forma de realización preferida

La invención se refiere a la utilización de una cepa no toxigénica de C. difficile seleccionada de entre el grupo constituido por M3, M23 y T7, clasificadas basándose en su patrón de endonucleasa de restricción sobre un gel de agarosa, según el procedimiento descrito en Clabots et al., J. Clin. Microbiol, vol. 31, 1993, páginas 1870-1875, para preparar un medicamento para su administración a un individuo, en el que se administra la cepa no toxigénica de C. difficile después de la inhibición del tratamiento antibiótico, en una cantidad suficiente para establecer la colonización del tracto gastrointestinal de un individuo, para prevenir la enfermedad asociada con C. difficile. En una forma preferida, dicha cepa es una combinación de dos o más cepas no toxigénicas.

La invención se refiere asimismo a una composición farmacéutica que comprende una cepa no toxigénica de C. difficile, seleccionada de entre el grupo constituido por M3, M23 y T7, clasificada basándose en su patrón de endonucleasa de restricción sobre un gel de agarosa, según el procedimiento descrito en Clabots et al., J. Clin. Microbiol, vol 31, 1993, páginas 1870-1875, estando dicha cepa en una cantidad suficiente para establecer la colonización del tracto gastrointestinal de un individuo, para prevenir la enfermedad asociada con C. difficile, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una forma de realización preferida dicha cepa T no toxigénica es una combinación de cepas no toxigénicas seleccionadas de entre el grupo constituido por las cepas M3, M23 y T7.

En otra forma de realización, esta composición se formula en una forma de dosificación unitaria.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento para seleccionar una cepa no toxigénica de C. difficile que es efectiva para prevenir la enfermedad relacionada con C. difficile, comprendiendo dicho procedimiento:

a) aislar una cepa de C. difficile a partir de un individuo en una población;

b) determinar que la cepa ni tenga la toxina A ni la B;

c) determinar la frecuencia relativa del grupo al que pertenece, por su patrón de endonucleasa de restricción sobre un gel de agarosa, la cepa aislada de (b);

d) seleccionar una cepa que pertenezca a un grupo encontrado en el individuo relativamente frecuente, en el que frecuente se define como, por lo menos, un 5% de los aislados no toxigénicos encontrados en la población de los aislamientos.

En una forma de realización preferida, la cepa seleccionada es relativamente frecuente dentro de este grupo.

Además, la invención se refiere a la utilización de una o más cepas de C. difficile no toxigénico seleccionadas de entre el grupo constituido por M3, M23 y T7, clasificadas basándose en su patrón de endonucleasa de restricción sobre un gel de agarosa, según el procedimiento descrito en Clabots et al., J. Clin. Microbiol, vol 31, 1993, páginas 1870-1875, en una cantidad que es efectiva para suprimir la población del C. difficile toxigénico en el tracto gastrointestinal de un paciente, en la preparación de un medicamento para controlar la diarrea en el paciente.

En una forma de realización preferida de dicha utilización, la cepa T no toxigénica es una combinación de cepas no toxigénicas seleccionadas de entre el grupo constituido por las cepas M3, M23 y T7.

Se describen procedimientos y composiciones para prevenir y tratar enfermedades relacionadas con C. difficile (CDAD) en el hombre y en los animales no humanos, por ejemplo, mamíferos y aves. La prevención se utiliza en la presente memoria para significar que el riesgo de desarrollar CDAD se reduce aproximadamente un 80% o más comparado con animales o humanos expuestos de modo comparativo en el mismo entorno. La prevención se alcanza administrando profilácticamente una cepa no toxigénica o una combinación de cepas de C. difficile a un individuo de riesgo. Un individuo de riesgo es uno que ha recibido agentes antimicrobianos o antineoplásicos que poseen actividad antimicrobiana, y que está en un entorno de alto riesgo tal como un hospital o una clínica particular (o una residencia para ancianos); o un rebaño o una manada de animales en los que la enfermedad debido a C. difficile tiene lugar o se producirá probablemente debido a la administración de antibióticos.

La presentación habitual de CDAD incluye la presencia de: (1) diarrea, definida mediante distintos criterios (por ejemplo, por lo menos seis heces acuosas durante 36 horas, tres heces no formadas en 24 horas o 2 días, u ocho heces no formadas durante 48 horas); (2) pseudomembranas que se aprecian en una endoscopia gastrointestinal inferior, o la toxina A o B de C. difficile que se detecta en las heces, o un cultivo positivo de heces respecto a la presencia de un C. difficile que produce una toxina; y (3) ninguna otra etiología que se reconozca para la diarrea (Gerding, 1995).

Cepas no toxigénicas de C. difficile

Un procedimiento comprende administrar a un individuo una cepa no toxigénica de C. difficile, preferentemente una cepa seleccionada a partir de uno o más de los grupos M, T, C, P, S y AP. Por ejemplo, el grupo M es un grupo de cepas de C. difficile que se identifica mediante análisis de restricción endonucléasica (REA) del ADN genómico total de 4000 aislamientos aproximadamente de C. difficile. La mayoría de los aislamientos se obtuvieron de pacientes y de fuentes medioambientales en el Minneapolis Veterans Affairs Medical Center durante un período de diez años. Los aislamientos restantes se obtuvieron de otros varios hospitales. El procedimiento en el que se llevó a cabo el tipado REA de estos aislamientos se describe en Clabots et al. (1993).

Los aislamientos de C. difficile se clasificaron en grupos basándose en la similitud de los patrones de las bandas de restricción del ADN en geles de agarosa. Brevemente, el primer aislamiento con un nuevo patrón de la banda de ADN se designó arbitrariamente como un tipo REA de referencia. Las similitudes entre los tipos REA nuevos y de referencia se marcaron mediante comparación visual de cada segmento de 1 mm de los 60 mm de los superiores de los patrones de las bandas del ADN procesados en el mismo gel. Se calculó un índice de similitud (SI) como el número de segmentos idénticos expresados como porcentaje de los segmentos totales. Cualquier nuevo tipo REA con un SI \geq 90% comparado con un tipo existente REA de referencia, se incluyó en ese grupo, proporcionándole una designación específica de tipo, por ejemplo, en el grupo "M", los tipos se denominan M1, M2, M3....M23...M35. Cualquier nuevo tipo REA con un SI < 90%, se denominó tipo REA primario de referencia para un nuevo grupo, y se utilizó para futuras comparaciones del grupo. Los grupos se denominaron mediante letras, y distintos tipos REA dentro de un grupo se denominaron mediante números arábigos.

El grupo denominado arbitrariamente "M" contiene el número más grande de aislamientos (347 de los 4000 aislamientos toxigénicos y no toxigénicos tipificados hasta ahora), en el que "aislamientos" significa una muestra obtenida independientemente del organismo. Los miembros del grupo M están estrechamente relacionados, con un SI de más del 90% por definición. El grupo M contiene 35 tipos REA distintos (miembros de un tipo REA tienen un SI de 100%), siendo M3 y M23 los tipos REA más frecuentes. Todos los aislamientos del grupo M no son toxigénicos. El tamaño del grupo no está limitado a 35, porque nuevos tipos M se identifican de vez en cuando.

Las cepas M3 y M23 son cepas particularmente preferidas. Se ha descubierto que previenen las CDAD en el 95-100% de los hámsters que se estimularon de forma aguda con cepas toxigénicas de C. difficile conocidas por ser muy virulentas en el hombre y fatales el 100% en los hámsters (véase Ejemplo 1). Las cepas M son más protectoras en hámsters que previamente ensayaron cepas, para los que la supervivencia sólo mejoró en un 72% (Wilson y Sheagren, 1983, Boriello y Barclay, 1985), y no fue tan duradera como con las cepas M. M3 previene las CDAD durante por lo menos 60 días después de su administración, y los animales tratados con M3 permanecen libres de la enfermedad durante por lo menos 100 días después de la estimulación con cepas toxigénicas muy virulentas (Ejemplo 1). En vista de los resultados de los que se informó en la técnica anterior, no eran de un nivel muy alto de protección y el hecho de que ésta fuera extremadamente duradera.

Los grupos se guardaron en el VA Lakeside Medical Center, 333 East Huron, Chicago, Illinois 60611, como una biblioteca de más de 75 grupos REA distintos de C. difficile, incluyendo los grupos M, B, J, C, AP, P, S y T.

Aunque sin el deseo de comprometerse con ninguna teoría particular, se formula la hipótesis de que la capacidad de una cepa no toxigénica para proteger contra CDAD se correlaciona con su capacidad para colonizar el tracto digestivo. A su vez, se cree que los tipos REA aislados más frecuentemente a partir del hombre, son los mejores en la colonización del intestino humano. Para seleccionar una cepa o combinación de cepas para un animal particular, se sigue, por ejemplo, el procedimiento que se muestra en la Figura 1 para aislar y tipificar las cepas no toxigénicas, y los aislamientos más frecuentes que se encuentran en estas especies son seleccionados para llevar a cabo ensayos clínicos, tal como se describe en la presente memoria. Alternativamente, los mismos tipos no toxigénicos que se encuentran en el hombre (Figura 1) son apropiados asimismo para su utilización en los animales (véanse los ejemplos para los datos en los hámster). De este modo, otros miembros estrechamente relacionados del grupo M y otros grupos no toxigénicos aislados frecuentemente, (por ejemplo, el grupo T) y los tipos REA (por ejemplo, T1 y T7) son candidatos apropiados. Véase la Figura 1 que muestra la frecuencia de aislamiento de los tipos REA no toxigénicos de C. difficile para los que se encontraron más de 3 aislamientos.

Las cepas de C. difficile se cultivan e identifican como C. difficile mediante procedimientos microbiológicos estándar que se conocen bien en la técnica. Para técnicas apropiadas, véase Clabots et al., 1993) y Kristjansson et al. (1994). La concentración de C. difficile se mide mediante unidades formadoras de colonias (cfu), tal como bien se conoce en la técnica.

Las cepas de C. difficile útiles en la invención, se identifican posteriormente mediante el tipado REA tal como se describe en Clabots et al. (1993). Utilizando el aislamiento de referencia M1, pueden identificarse otros miembros del grupo M. La Figura 2 muestra geles de agarosa representativos de ADN tratado con el enzima de restricción Hind III, ADN de la cepa tipo M1 de Clostridium difficile (cepa referencia para el grupo MM), y las cepas M3, M23, M4, M2, M14 (los tipos M más frecuentemente aislados en orden descendiente de frecuencia de aislamiento), la cepa VPI 2018 utilizada por Wilson y Sheagren y no una cepa del grupo M, y la cepa tipo J9, una cepa toxigénica de C. difficile para comparación. En los carriles a la izquierda y a la derecha del gel, se muestran marcadores de peso molecular del ADN lambda tratado con el enzima de restricción Hind III. Las localizaciones del marcador de peso molecular de lambda para el gel M1 se indican mediante puntos negros. La Figura 3 es similar a la Figura 2, al mostrar los geles de M3, M4, M23, J9 y VPI 2018, y además muestra dos otros tipos no toxigénicos, T7 y S1. Utilizando aislamientos de un M3 y otros del tipo M, pueden identificarse otros aislamientos M3 mediante su patrón endonucleásico de restricción idéntico de las bandas o "huella" del ADN. Procedimientos similares se siguen para los otros grupos.

Individuos diana para la prevención y/o tratamiento

Los individuos con riesgo para las CDAD incluyen humanos y animales que reciben antibióticos o medicamentos antineoplásicos, especialmente los ancianos y aquellos que están hospitalizados durante largos períodos de tiempo o se encuentran en instituciones (residenciales).

Cepas de C. difficile del grupo M son útiles a causa de su capacidad para colonizar bien. Dichas cepas son útiles asimismo para fines terapéuticos, para tratar pacientes que han padecido recidivas de diarrea por C. difficile siguiendo un tratamiento antibiótico tal como con vancomicina o metronidazol. Dichos pacientes son extremadamente difíciles de curar, y se prefiere seleccionar la administración de las cepas no toxigénicas. Dicha terapia se administra preferentemente después de tratar al paciente en primer lugar con vancomicina o metronidazol para reducir la población del C. difficile toxigénico y controlar la diarrea. La vancomicina o el metronidazol se detienen durante 12 a 24 horas, y entonces, se administra oralmente la cepa no toxigénica de C. difficile, de la misma forma que la descrita para la utilización preventiva de la cepa. Dosis repetidas o dosis más altas de la C. difficile no toxigénica pueden ser necesarias para el tratamiento, comparado con la prevención de CDAD. Son apropiadas cepas M, T, AP, P, S y sus combinaciones. Las cepas M de C. difficile se prefieren para el tratamiento de recidivas, debido a la conocida alta tasa de colonización por las cepas M en el hombre, y la baja tasa de la enfermedad por C. difficile en el hombre colonizado por las cepas no toxigénicas de C. difficile.

La utilización de las cepas M para la prevención o tratamiento de animales es asimismo apropiado, particularmente en la industria del caballo y de la chinchilla, donde la enfermedad es habitual y frecuentemente fatal. La utilización de las cepas M en animales para la prevención o tratamiento de la enfermedad por C. difficile, se encuentra asimismo dentro del alcance de la invención.

Procedimiento para administrar el C. difficile no toxigénico

Para la prevención, la cepa no toxigénica de C. difficile se administra al individuo antes de que el paciente desarrolle CDAD. Por ejemplo, la cepa no toxigénica de C. difficile se administra poco después de que el paciente empiece a recibir antibióticos, especialmente si otros pacientes en el mismo lugar han desarrollado CDAD. El ritmo de administración a los pacientes que recibieron antibióticos es crítico. La colonización no tendrá lugar, probablemente, si no se han administrado los antibióticos, porque la flora bacteriana normal del tracto gastrointestinal (GI) prevendrá la colonización. Sin embargo, después de que se administren los antibióticos, las alteraciones en la flora del tracto GI permiten la colonización. Generalmente, la colonización protectora deberá llevarse a cabo dentro del intervalo de tiempo de 24 - 72 horas a partir del inicio de los antibióticos, para alcanzar la protección antes de que tenga lugar la exposición a las cepas toxigénicas. Sin embargo, la cepa no toxigénica puede administrarse en cualquier momento después del inicio del tratamiento antibiótico.

Las cepas no toxigénicas de C. difficile se administran a un individuo oral o enteralmente, mediante, por ejemplo, una sonda gástrica o nasogástrica. Pueden determinarse empíricamente las formas y las cantidades efectivas de dosificación para prevenir CDAD, llevando a cabo dichas determinaciones según las especificaciones de los expertos en la materia. Por éstos, se entiende que las cantidades de dosificación variarán según la cepa particular M o de otro grupo que se utilice, tal como se da a conocer en la presente memoria, la situación del paciente (que incluye las enfermedades que se estén tratando, edad y tamaño), otros medicamentos que se le estén administrando, incluyendo los antibióticos, y otros factores que se conocen bien en la técnica médica que puedan afectar a la dosificación. Las cantidades y el número
de dosis necesarias para un tratamiento con éxito, pueden ser más altas que las que se requieren para la prevención.

Se selecciona una dosis de C. difficile no toxigénico que sea suficientemente alta para colonizar el tracto GI del receptor, por ejemplo, son apropiadas entre 10^{4} y 10^{6} cfu por k de peso corporal. Las dosis exactas que son necesarias en el hombre se aquilatan mediante estudios en voluntarios humanos normales. Para ciertas cepas y en ciertas situaciones, pueden requerirse dosis múltiples o más grandes, como cuando el paciente está recibiendo de forma continua antimi-
crobianos (porque los antimicrobianos que se administran pueden inhibir o eliminar al C. difficile que se está dando).

Las dosis que pueden tomarse como ejemplo son aquellas que se encuentran dentro del intervalo de entre aproximadamente 10^{4} a aproximadamente 10^{8} cfu aproximadamente, preferentemente de entre 10^{4} y aproximadamente 10^{6} cfu, por kg. Dosis más altas o su administración repetida, pueden requerirse si la colonización no se establece con la primera dosis administrada. Se espera que una dosis única establezca la colonización, pero la administración concomitante de ciertos antimicrobianos a los que el C. difficile no toxigénico es susceptible, puede necesitar la administración de dosis adicionales.

Preferentemente, la cepa no toxigénica se administra como una composición farmacéutica que comprende la cepa no toxigénica de C. difficile en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con la cepa no toxigénica, tal como una solución salina o de glucosa, debiendo asimismo no perjudicar al paciente y no inhibir o eliminar el crecimiento de los microorganismos en la composición.

La cantidad de la cepa que se combinará con un vehículo para producir una forma de dosificación unitaria variará, dependiendo de los factores que se han descrito anteriormente. La cantidad será generalmente la que constituya la dosis efectiva más baja que (sea susceptible) de producir la colonización y un efecto terapéutico o preventivo. Dicha determinación se realiza llevando a cabo ensayos en voluntarios normales que reciben en primer lugar un antimicrobiano tal como la clindamicina, seguido a las 24-48 horas por la cepa oral no toxigénica de C. difficile que va a ensayarse.

Los procedimientos para preparar formulaciones o composiciones farmacéuticas son bien conocidos. Incluyen la etapa de asociación de la cepa no toxigénica con el vehículo. Las formulaciones de la invención que son apropiadas para la administración oral, incluyen aquellas que son en forma de cápsulas, obleas, píldoras, comprimidos, polvos, gránulos o constituyen una suspensión en un líquido acuoso, conteniendo cada una una cantidad predeterminada de una cepa, bien como célula vegetativa o bien en forma de espora. Las esporas son el estado preferido del organismo para la administración, porque sobreviven a la sequedad, a la liofilización y a la exposición al aire. Los procedimientos para preparar esporas de C. difficile incluyen el crecimiento en un medio líquido o sólido para inducir la esporulación (Wilson et al., 1992). La cuantificación del número de esporas que se encuentran presentes se determina mediante el cultivo de diluciones decimales de la suspensión de esporas bajo condiciones anaeróbicas de incubación.

Se utilizan las esporas liofilizadas en una cápsula o en una forma líquida de dosificación. Además de la cepa grupal, la forma de dosificación líquida puede contener vehículos inertes, utilizados habitualmente en la técnica, tales como, por ejemplo, agua, tampones u otros disolventes acuosos. Además de diluyentes inertes, la forma líquida de dosificación puede incluir asimismo adyuvantes tales como agentes de suspensión, edulcorantes, saborizantes y colorantes. [por ejemplo, una solución de glucosa, una solución de fructosa]. Puede asimismo desearse la inclusión de agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico, y similares, en la forma líquida de dosificación. Otra forma preferida de dosificación es un polvo gránulos que pueden reconstituirse en una forma líquida de dosificación justamente antes de utilizarla, añadiendo agua o un diluyente similar.

Las formulaciones se presentan apropiadamente en contenedores multidosis o de dosis unitaria precintados, por ejemplo, ampollas o viales. Las formulaciones pueden guardarse en condiciones de liofilización y administrarse añadiendo un vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes de su utilización. Las formulaciones liofilizadas pueden administrarse asimismo en forma de cápsulas, sin utilizar un vehículo líquido. Pueden prepararse las suspensiones extemporáneas a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos.

Para utilización clínica, los estudios continuados en hámsters se utilizan para clasificar la eficacia de las cepas y de sus combinaciones, incluyendo ensayos de la duración de la prevención, así como de la eficacia cuando se continua la utilización de antimicrobianos.

A los voluntarios humanos se les administrará un antimicrobiano seguido por C. difficile no toxigénico para determinar si se colonizan los tractos gastrointestinales de los voluntarios, la dosis necesaria para obtenerlo, la duración de la colonización, y la seguridad/efectos secundarios de la colonización. Si estos estudios muestran que los voluntarios están colonizados de modo seguro durante un período de tiempo suficiente (probablemente uno o varios meses), se seleccionará entonces una cepa o combinación de ellas para llevar a cabo un ensayo de prevención en los pacientes.

El ensayo de prevención en los pacientes se llevará a cabo en múltiples hospitales, donde a los pacientes que están empezando el tratamiento antibiótico se les invitará a participar en un ensayo doble ciego, controlado por placebo, para determinar si la enfermedad por C. difficile puede prevenirse colonizando a los pacientes con la C. dificile no toxigénica. Se seleccionarán hospitales que posean altas tasas de CDAD en sus instituciones. Los objetivos serán: 1) número de casos de CDAD en pacientes tratados respecto a los que recibieron placebo, 2) éxito en la colonización de los pacientes con la C. difficile no toxigénica, 3) efectos adversos o secundarios en los pacientes tratados, respecto a los no tratados.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se presentan a título ilustrativo y no limitativo.

Ejemplo 1 Utilización de la cepa M3 para prevenir CDAD en los hámsters A. Establecimiento de CDAD en el hámster

El modelo Sirio de hámster es con mucho el utilizado más frecuentemente y el modelo mejor descrito de CDAD en un animal. Se considera pronóstico de los resultados en el hombre, aunque la enfermedad es más grave y más fatal a menudo en los hámsters que en el hombre (Onderdonk, 1988).

Se obtuvieron de Sasco, Inc., Omaha, NB, hámsters de entre 80 y 120 g libres de patógenos específicos, y se alojaron en jaulas aislantes individuales dotadas con filtros de aire en sus tapas y con suelos con redes de alambre para minimizar la coprofagia. Las jaulas, el alimento, los recipientes de agua, el agua y las colchonetas se sometieron al autoclave en bolsas precintadas antes de utilizarlos para minimizar la contaminación de los animales mediante las esporas de C. difficile. El personal que manejaba a los animales llevaba guantes estériles para minimizar la contaminación. Todos los animales tenían sedimentos fecales cultivados en un medio selectivo de taurocolato-cefoxitina-cicloserina-fructosa-agar (TCCFA) para C. difficile antes del estudio para asegurarse de que estaban libres del organismo.

Se administró la clindamicina a grupos de diez hámsters mediante una aguja para alimentación por sonda nasogástrica con una dosis de 30 mg/kg. Cinco días después de recibir el antibiótico, se administraron a los animales preparaciones de esporas de C. difficile B1 o J9 toxigénico mediante alimentación por sonda nasogástrica. Las preparaciones de esporas se obtuvieron según el procedimiento de Wilson 1982 y 1983, pero se administraron en una alícuota única de 100 cfu por animal. Esta dosis se había predeterminado previamente que era letal en estudios de intervalos de dosis.

Las cepas toxigénicas que se utilizaron fueron tipos REA B1 y J9, que se identificaron mediante su patrón endonucleásico de restricción distinto (Clabots et al,. 1993). Estas dos cepas se seleccionaron a causa de que provocan epidemias de CDAD en pacientes humanos en los hospitales. Estas cepas son muy virulentas, produciendo CDAD en casi un 50% de los pacientes de los que se aislaron.

La diarrea y la mortalidad se controlaron, y las heces se cultivaron utilizando medio TCCFA. La totalidad de los 20 hámsters que recibían cualquiera de las dos cepas toxigénicas de C. difficile desarrollaron heces que dieron resultados de cultivo positivo para el organismo de estimulación en las 24 horas posteriores a la inoculación, desarrollando todos los animales diarrea, muriendo dentro de las 48 horas a partir de la inoculación (mortalidad del 100% en 48 horas). El examen postmortem mostró una colitis marcada y cecitis con un ciego amplio dilatado y fluido hemorrágico (el colon y el ciego son el sitio de CDAD en los hámsters).

B. Pretratamiento de hámsters con M3 para prevenir CDAD provocado por B1

Se administró oralmente M3 de tipo REA no toxigénico mediante sonda nasogástrica a un grupo de 10 hámsters, 48 horas después del tratamiento con clindamicina, tal como se describe anteriormente en la sección A. El inóculo oral era una preparación de esporas (preparada tal como se describe en la sección A) que contiene un gran número de esporas (5 x 10^{5} a 10^{6} por animal) para alcanzar una colonización con una dosis única.

Las heces se cultivaron utilizando medio TCCFA. Todos los hámsters tenían contajes altos de M3 en los sedimentos fecales entre 28 y 72 horas después de la inoculación con las esporas.

Los animales se estimularon entonces en el día 5 después del tratamiento con clindamicina (3 días después de la administración de M3) con 100 cfu por animal de B1 toxigénico mediante sonda nasogástrica, tal como se describe en la sección A. Se hizo el seguimiento de la diarrea y la mortalidad durante 30 días y se compararon con los mismos datos procedentes de los animales no protegidos previamente estudiados (véase la sección A). Las heces se cultivaron utilizando medio TCCFA en los días 1, 2 y 3 después de la estimulación con el aislamiento toxigénico, y a continuación, semanalmente. El medio selectivo que contenía eritromicina se utilizó para diferenciar la mezcla del organismo toxigénico de estimulación (resistente a la eritromicina) y los organismos no toxigénicos protectores (sensibles a la eritromicina) a lo largo del tiempo.

Los animales que sobrevivieron a la estimulación aguda a los 30 días, se observaron durante otros 69 días para ver si se presentaba cualquier enfermedad con retraso debida al organismo toxigénico. Los cultivos fecales semanales continuaron para determinar si la colonización con el aislamiento no toxigénico persistía.

La totalidad de los 10 hámsters a los que se administró M3 permanecieron bien (sin diarrea) durante el período completo de seguimiento que osciló entre 63 y 99 días. Los animales se sacrificaron desde el principio del día 63, a intervalos, hasta el día 99, y el examen postmortem no reveló evidencia de enfermedad en el colon o en el ciego. Los animales tenían M3 detectable en las heces durante un promedio de 65 días (intervalo de 4 a 92 días).

C. Pretratamiento de hámsters con M3 para prevenir CDAD provocado por J9

A doce hámsters se les administró clindamicina, a la dosis de 30 mg/kg, mediante una sonda nasogástrica, tal como se describe en la sección A. Dos días después, a 10 hámsters se les administraron 6,5 x 10^{5} cfu de esporas de C. difficile M3 por animal, mediante una sonda nasogástrica, tal como se describe en la sección B. Dos hámsters sirvieron como controles no tratados, esto es, a ellos no se les administró M3.

Las heces se cultivaron utilizando medio TCCFA. Nueve de los diez hámsters que recibieron M3 mostraban contajes altos de M3 en los sedimentos fecales entre las 28 y 72 horas posteriores a la inoculación de las esporas. Al décimo hámster que recibió M3 y a los dos controles (a los que no se les administró M3), no se les detectó M3 en los sedimentos fecales.

Tres días después de la administración de M3 (cinco días después de la administración de la clindamicina), a la totalidad de los 12 hámsters se les administraron 500 cfu de esporas de cepas toxigénicas J9 de C. difficile mediante una sonda nasogástrica tal como se describe en la sección A. Se controlaron la diarrea y la mortalidad durante 30 días y se compararon con los mismos datos procedentes de los animales no protegidos previamente estudiados (véase la sección A). Las heces se cultivaron utilizando medio TCCFA en los días 1,2 y 3 después de estimulación con el aislamiento toxigénico, y entonces, semanalmente. El medio selectivo que contenía eritromicina se utilizó para diferenciar la mezcla de los organismos toxigénicos de estimulación (resistente a la eritromicina) y los organismos no toxigénicos protectores (sensibles a la eritromicina) a lo largo del tiempo.

Los animales que sobrevivieron a la estimulación aguda a los 30 días, se observaron durante otros 23 días para ver si se presentaba cualquier enfermedad con retraso debida al organismo toxigénico. Los cultivos fecales semanales se continuaron para determinar si la colonización con el aislamiento no toxigénico persistía.

Nueve de los diez hámsters que recibieron M3 permanecieron bien (es decir, sin diarrea) durante todo el tiempo de seguimiento, que fue de 53 días. Cultivos semanales de las heces mostraron a la cepa M3 en los sedimentos fecales durante 56 días (después de M3) en 8 de los 9 animales y durante 32 días en el noveno animal. La cepa J9 no se encontró en las heces de los animales. Los nueve hámsters se sacrificaron en el día 53 (56 días después de la administración de M3), y el examen postmortem no mostró evidencia de enfermedad del colon o del ciego.

Los dos hámsters de control que no recibieron la cepa M3 y el hámster que recibió M3, pero no se detectó en sus sedimentos fecales, es decir, no mostró evidencia de colonización, murieron entre las 30 y 48 horas de la inoculación de J9 y se recuperó la cepa J9 a partir de las heces entre las 4 y las 29 horas a partir de la inoculación. El examen postmortem mostró una dilatación acusada del ciego, cecitis, colitis y grandes cantidades de fluido cecal sanguinolento.

Por tanto, la protección fue efectiva en 9 de los 10 hámsters que recibieron la cepa M3 de C. difficile. El animal en el que falló la protección no presentaba cantidades detectables de M3 en los sedimentos fecales en el momento de estimulación con la cepa J9 toxigénica, mientras que los otros nueve hámsters presentaban M3 detectable.

D. Seguridad y durabilidad de la prevención mediante M3

Se cultivaron sedimentos fecales de doce hámsters sirios para C. difficile y se mostró que estaban libres del organismo. Cinco días después se les administraron 30 mg/kg de clindamicina mediante una sonda nasogástrica, tal como se describe en la sección A. Dos días después se les administraron entre 0,5 y 1,0 x 10^{6} cfu de esporas de la cepa M3 de C. difficile por animal, mediante una sonda nasogástrica, tal como se describe en la sección B.

Todos los animales demostraron contajes altos de la cepa M3 de C. difficile en sus heces entre 24 y 77 horas después de la inoculación. Los sedimentos fecales de cada hámster se cultivaron semanalmente entonces para documentar la persistencia de la colonización. Las heces permanecieron positivas para la cepa M3 durante 28 a 84 días después de la inoculación.

Se hizo el seguimiento de la mortalidad y diarrea como mediciones de la seguridad de la cepa M3. Todos los animales permanecieron bien. Cuatro animales se sacrificaron para llevar a cabo el examen patológico 60 días después de recibir M3. Este examen no demostró anormalidades en el colon o el ciego.

Cincuenta y cuatro días después de recibir M3, tres hámsters se estimularon con 100 cfu por animal de la cepa toxigénica J9 mediante una sonda nasogástrica, tal como se describe en la Sección C. Estos animales permanecieron bien durante 30 días y no desarrollaron efectos patológicos a partir de la estimulación con J9. Los sedimentos fecales permanecieron positivos para M3 en 2 de los 3 animales durante todo el período de observación, y durante 42 días en los animales restantes.

Los cinco hámsters restantes se estimularon 60 días después de recibir la cepa M3 protectora con 100 cfu por animal de la cepa B1 toxigénica de C. difficile mediante sonda nasogástrica, tal como se describe en la Sección B. Aunque Me3 ya no pudo demostrarse en los sedimentos fecales de estos animales, éstos permanecieron bien y no desarrollaron efectos patológicos como resultado de la estimulación con B1. A los hámster se les hizo un seguimiento durante otros 82-100 días después de la estimulación con B1 y no dieron muestras de patología. En el examen postmortem, no hubo evidencia de cecitis o colitis. M3 se aisló del ciego de un animal 159 días después de la inoculación de M3, que constituyó 117 días después el último cultivo positivo del sedimento fecal para M3.

Así, la protección otorgada por M3 es extremadamente duradera, pues los hámsters fueron completamente protegidos de la estimulación con las cepas B1 y J9 toxigénicas y altamente virulentas durante 54-60 días, después de ser colonizados con la cepa M3.

E. Ausencia de genes de virulencia en M3

La producción de la toxina A y probablemente la producción de la toxina B (las dos toxinas se encuentran juntas casi invariablemente), constituyen los factores de virulencia más importantes en C. difficile. (Barriello et al., 1990; Lyerly et al., 1988). La cepa M3 se ensayó para determinar si producía toxinas A o B o contenía los genes para estas dos toxinas.

El ensayo estándar de citotoxicidad de las células HEp-2 se utilizó para ensayar la toxina B en un sobrenadante de cultivos de M3 que crecieron en un medio de carne picada (CMM), tal como se describe en Johnson et al. (1990). Se encontró que M3 no era citotóxico, indicando la ausencia de la Toxina B.

Los sobrenadantes de los cultivos M3 que crecieron en CMM a 37ºC durante 7 días, se ensayaron asimismo respecto a la toxina A utilizando un ensayo ELISA comercial (TOX-A TEST, Techlab, Blacksburg, VA). Se encontró que M3 no producía la Toxina A.

La hibridización Southern se utilizó para determinar si los genes que codificaban las toxinas A y B se encontraban en M3. Se utilizó una modificación de las técnicas de transferencia descritas por Southern (1975) para llevar a cabo este análisis. Brevemente, el ADN de M3 C. difficile se extrajo, se purificó, se digirió mediante HindIII, y se separó mediante electroforesis en gel de agarosa, tal como se describe en Clabots et al., (1993). Después de la electroforesis, el ADN se hidrolizó mediante despurinización ácida, se desnaturalizó en tampón alcalino, y se neutralizó entonces. El ADN se transfirió entonces a un filtro sintético Zetabind de membrana (AMF-Cuno, Meriden, Conn.) mediante una transferencia capilar en una solución altamente salina, enjuagándose el filtro en un tampón de escasa salinización, y secándose a 80ºC. Las secuencias génicas de la Toxinas A y B se ensayaron utilizando sondas ADN oligonucleótidas derivadas de las secuencias publicadas de cada gen (Barroso et al., 1990; Dove et al., 1990). Una sonda oligonucléotida de 19 unidades metaméricas procedente de la secuencia del gen de la toxina A que se repite 5 veces cerca del extremo 3', y una secuencia de 20 unidades metaméricas de la posición 503 cercana al extremo 5' del gen de la toxina B, se utilizaron para sondear M3. Asimismo, se utilizó una ampliación del conjunto de sondas de la toxina A y de la toxina B, conjunto que se obtuvo a partir de los digestos de restricción de los genes clonados de la toxina A y de la toxina B. Las sondas se marcaron con P^{32} -desoxicitidina trifosfato mediante cebado al azar, hibridizándose entonces al ADN fijado al filtro, utilizando los procedimientos de Sambrook et al. (1989). Las bandas hibridizadas se visualizaron entonces mediante autorradiografía.

Ninguna de las sondas para los genes de la Toxina A y de la Toxina B mostraron hibridización. Por tanto, se encontró que M3 no contenía ni el gen para la toxina A ni el gen para la toxina B.

Las evidencias fenotípica y genotípica indican que M3 no produce las toxinas A y B y no contiene los genes que codifican estas dos toxinas. La ausencia de estos factores de virulencia proporciona una confirmación posterior de que la administración de M3 a los pacientes humanos es segura.

Ejemplo 2 Utilización de M23 para prevenir CDAD en hámsters A. Pretratamiento con M23 para prevenir CDAD causado por B1

Un aislamiento M del tipo REA, M23, el segundo tipo M o más frecuentemente aislado que se encuentra en un estudio de pacientes asintomáticos que transportaron C. difficile en sus heces, se utilizó para generar los datos siguientes. El M23 tipo REA no toxigénico se administró mediante sonda nasogástrica a una dosis de 10^{6} cfu de esporas a 10 hámsters Syrian Golden 48 horas después del tratamiento con clindamicina, tal como se describe en el ejemplo 1, en la sección A. A los hámsters que recibieron clindamicina no se les administró M23 y sirvieron como controles no protegidos.

Las heces se cultivaron utilizando medio TCCFA. A la totalidad de los 10 hámsters que recibieron esporas M23, se les detectó una cepa M23 de C. difficile en las heces, entre 50 y 72 horas después de la administración mediante la sonda nasogástrica. A los dos hámsters de control no se les detectó C. difficile en las heces.

Los hámsters se estimularon entonces el día 5 siguiendo el tratamiento con clindamicina (3 días después de la administración de M23), con 100 cfu por animal de la cepa toxigénica B1 de C. difficile mediante sonda nasogástrica, tal como se describe en la Sección B del Ejemplo 1. La diarrea y la mortalidad se controlaron durante 28 días como mínimo después de B1 para todos los animales supervivientes. Las heces se cultivaron utilizando medio TCCFA en los días 1, 2 y 3 y semanalmente después de la estimulación con el aislamiento B1 toxigénico. Como en el Ejemplo 1, el medio selectivo que contenía eritromicina se utilizó para diferenciar la mezcla de los organismos toxigénicos de estimulación (resistentes a la eritromicina) de los organismos no toxigénicos protectores (sensibles a la eritromicina) a lo largo del tiempo.

Los animales que sobrevivieron a la estimulación aguda durante por lo menos 28 días, se sacrificaron a razón de dos animales cada una a dos semanas, hasta un máximo de 65 días después de la estimulación con B1, para observar la evidencia en el retraso de una patología o la evidencia histológica o morfológica de ésta. Los cultivos fecales semanales se continuaron para determinar si la colonización con el aislamiento no toxigénico persistía. La totalidad de los 10 hámsters a los que se administró la cepa M23 permanecieron sin diarrea y sobrevivieron al período completo de observación (de 28 a 65 días) sin evidenciar la enfermedad. No se encontró evidencia de la enfermedad en el colon o ciego de los animales sacrificados. La cepa M23 se detectó en las heces de la totalidad de 10 animales hasta el momento del sacrificio entre los días 28 a 65. La cepa B1, la cepa de la estimulación toxigénica, nunca se detectó en las heces de los animales que recibieron M23.

Al contrario, los dos hámsters de control que recibieron clindamicina, pero no la cepa M23, presentaron ambos la cepa toxigénica B1, que se detectó en las heces a las 24 horas de la administración de la cepa B1, muriendo a las 72 horas de dicha administración de B1. Se observó una típica cecitis hemorrágica en el examen postmortem.

B. Seguridad y duración de la prevención mediante M23

A diez hámsters Syrian Golden se les administraron 10^{6} cfu por animal de la cepa M23 de C. difficile, mediante una sonda nasogástrica, dos días después del pretratamiento con clindamicina por vía oral, 30 mg/kg mediante sonda nasogástrica, tal como se describe en el Ejemplo 2, Sección A. Dos animales de control recibieron clindamicina, pero no recibieron la cepa M23.

Se hicieron cultivos de las heces fecales a todos los animales, que se llevaron a cabo utilizando medio TCCFA, iniciándose 24 horas después de la administración mediante sonda nasogástrica de M23, y que continuaron semanalmente. La totalidad de los diez animales que recibió M23, presentaba los cultivos fecales positivos para el organismo entre las 72 y las 96 horas después de recibir M23. Todos los animales permanecieron bien y los cultivos fecales permanecieron positivos durante 42 días en todos los animales que no evidenciaron efectos secundarios de colonización. El desarrollo y la ganancia de peso fueron indistinguibles de los animales de control que permanecieron, asimismo, bien y no colonizados.

La totalidad de los 12 hámsters se estimularon con 100 cfu de las esporas de la cepa B1 toxigénica a los 41 días después de la administración de clindamicina (39 días después de M23 en 10 de los animales). Todos los animales permanecieron bien y sobrevivieron a la estimulación con este aislamiento virulento de C. difficile. Las heces de la totalidad de los 10 animales colonizados con M23 permanecieron colonizadas con el organismo. Los animales de control permanecieron negativos para el C. difficile en las heces.

Ya que sobrevivieron ambos animales de control, no se aclaró si el efecto de la clindamicina había disminuido, no dejando ya susceptibles a los animales a la estimulación con el C. difficile toxigénico. Para resolver este asunto, a ambos animales de control y a cinco animales colonizados con M23, se les volvió a administrar oralmente clindamicina con una dosis de 30 mg/kg 49 días después de la clindamicina original (47 días después de la administración de M23). Cinco días después de la readministración de clindamicina, la totalidad de los siete hámsters se estimularon otra vez con 100 cfu de las esporas de la cepa B1 toxigénica de C. difficile. Se encontró que ambos animales de control tenían B1 C. difficile en sus heces a las 24 horas de la estimulación, muriendo a las 72 horas de ésta. Cuatro de los cinco animales colonizados por M23 permanecieron colonizados con M23 y sobrevivieron sin enfermedad aparente.

Se encontró que un animal colonizado con M23 tenía B1 en los cultivos fecales y murió 48 horas después de la estimulación con la cepa B1. En resumen, cuatro de cinco (80%) de los animales colonizados con M23 se protegieron de la reestimulación con la cepa B1 toxigénica después de volver a administrar la clindamicina. Dos animales no colonizados de control murieron debido a la infección por B1. El examen postmortem mostró una cecitis hemorrágica típica en los tres animales que murieron. Los animales supervivientes se sacrificaron 10 días después de la estimulación con B1 y no mostraron evidencia de cecitis o colitis en el examen postmortem.

Como lo fue la cepa M3 y todos los tipos del grupo REA M, se encontró que la cepa M23 no era citotóxica en el ensayo estándar de citotoxicidad de las células HEp-2 y no reaccionó en el Ensayo TOX-A para la Toxina A (TOX-A-TEST, TechLab, Blacksburg, VA). El sondeo molecular de M23 para los genes de la toxina A y la toxina B fue asimismo negativo.

Para la utilización clínica, los estudios continuados en los hámsters se utilizan para clasificar la eficacia de las cepas y de sus combinaciones, incluyendo los ensayos de duración de la prevención y de la eficacia cuando la utilización de los antimicrobianos es continua.

Ejemplo 3 Cepas de C. difficile no toxigénicas tratadas mediante técnicas de ingeniería genética

Se prepararon cepas de C. difficile no toxigénicas tratadas mediante ingeniería genética, a) seleccionando una cepa toxigénica de C. difficile; b) suprimiendo los genes que codifican la toxina A y la toxina B, obteniendo dicha supresión mediante procedimientos genéticos recombinantes. (Los genes de la toxina A y de la toxina B se identifican y se clonan).

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Claims (9)

1. Utilización de una cepa no toxigénica de C. difficile, seleccionada de entre el grupo constituido por M3, M23 y T7, clasificada basándose en su patrón de endonucleasa de restricción sobre un gel de agarosa, según el procedimiento descrito en Clabots et al., J. Clin. Microbiol, vol. 31, 1993, páginas 1870-1875, para la preparación de un medicamento para su administración a un individuo, en el que la cepa no toxigénica de C. difficile se administra después del inicio del tratamiento antibiótico, en una cantidad suficiente para establecer la colonización del tracto gastrointestinal de un individuo para prevenir la enfermedad asociada con C. difficile.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que una cepa es una combinación de dos o más cepas no toxigénicas.

3. Composición farmacéutica que comprende una cepa no toxigénica de C. difficile, seleccionada de entre el grupo constituido por M3, M23 y T7, clasificada basándose en su patrón de endonucleasa de restricción sobre un gel de agarosa, según el procedimiento descrito en Clabots et al., J. Clin. Microbiol, vol 31, 1993, páginas 1870-1875, encontrándose dicha cepa en una cantidad suficiente para establecer la colonización del tracto gastrointestinal de un individuo para prevenir la enfermedad asociada con C. difficile, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. Composición según la reivindicación 3, en la que la cepa T no toxigénica es una combinación de cepas no toxigénicas seleccionadas de entre el grupo constituido por las cepas M3, M23 y T7.

5. Composición según la reivindicación 3 ó 4, formulada en una forma de dosificación unitaria.

6. Procedimiento para la selección de una cepa no toxigénica de C. difficile que es efectiva para prevenir la enfermedad relacionada con C. difficile, comprendiendo dicho procedimiento:

(a)

aislar una cepa de C. difficile a partir de un individuo e en una población;

(b)

determinar que la cepa no tenga la toxina A ni la B;

(c)

determinar la frecuencia relativa del grupo al que la cepa aislada de (b) pertenece por su patrón de endonucleasa de restricción sobre un gel de agarosa;

(d)

seleccionar una cepa que pertenezca a un grupo relativamente frecuente encontrado en el individuo, en el que frecuente se define como por lo menos un 5% de los aislados no toxigénicos encontrados en la población de los aislamientos.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la cepa seleccionada es relativamente frecuente dentro de su grupo.

8. Utilización de una o más cepas de C. difficile no toxigénica seleccionadas de entre el grupo constituido por M3, M23 y T7, clasificadas basándose en su patrón de endonucleasa de restricción sobre un gel de agarosa, según el procedimiento descrito en Clabots et al., J. Clin. Microbiol, vol. 31, 1993, páginas 1870-1875, en una cantidad que es efectiva para suprimir la población de C. difficile toxigénico en el tracto gastrointestinal de un paciente, en la preparación de un medicamento para controlar la diarrea en el paciente.

9. Utilización según la reivindicación 8, en la que la cepa T no toxigénica es una combinación de cepas no toxigénicas seleccionadas de entre el grupo constituido por las cepas M3, M23 y T7.