ES2248853T3 - Nuevos analogos del peptido relacionado con la hormona paratiroidea. - Google Patents
Nuevos analogos del peptido relacionado con la hormona paratiroidea.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVOS ANALOGOS DE PTHRP, TRANSFORMADOS EN AGONISTAS O ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR DE PTH-2, MEDIANTE LA SUSTITUCION DE UNO O MAS RESIDUOS AMINOACIDOS DE PTHRP POR EL CORRESPONDIENTE RESIDUO O RESIDUOS DE PTH. SE DESCRIBE ASIMISMO UN PROCEDIMIENTO DE TRATAMIENTO DE DIVERSAS ENFERMEDADES ASOCIADAS CON UNA FUNCION ALTERADA DEL RECEPTOR PTH-2, UTILIZANDO DICHOS ANALOGOS DE PTHRP.
Description
Nuevos análogos del péptido relacionado con la
hormona paratiroidea.
La presente invención se relaciona con nuevos
análogos del péptido (PTHrP) relacionado con la hormona
paratiroidea. En particular, la invención se relaciona con análogos
del PTHrP que tienen una o más sustituciones e aminoácidos que le
confieren propiedades de antagonista o de antagonista del receptor
PTH-2 al análogo.
La hormona paratiroidea (PTH) es un regulador
principal de la homeostasis del calcio cuyas células objetivo
principales se encuentran en el hueso y en el riñón. La regulación
de la concentración de calcio es necesaria para el normal
funcionamiento de los sistemas gastrointestinal, esquelético,
neurológico, neuromuscular, y cardiovascular. La síntesis y
liberación de la PTH se controlan principalmente por medio del nivel
de calcio en el suero; un nivel bajo estimula y un nivel alto
suprime tanto la síntesis como la liberación. La PTH, a su vez,
mantiene el nivel de calcio en el suero promoviendo directa o
indirectamente la entrada de calcio en la sangre en tres sitios de
intercambio del mismo: intestino, hueso, y riñón. La PTH contribuye
ala absorción gastrointestinal neta de calcio, favoreciendo la
síntesis renal de la forma activa de la vitamina D. La PTH promueve
la reabsorción del calcio por el hueso inhibiendo a los osteoblastos
e, indirectamente, estimulando la diferenciación de las células que
reabsorben el hueso, los osteoclastos. También media al menos tres
principales efectos sobre el riñón: la estimulación de la
reabsorción tubular de calcio, el mejoramiento del despeje de
fosfato, y la promoción de un incremento en la enzima que completa
la síntesis de la forma activa de la vitamina D. La PTH ejerce
estos efectos principalmente a través de la activación mediada por
el receptor de la adenilato ciclasa, aunque también se ha reportado
la activación mediada por el receptor de la fosfolipasa C por la
PTH (Hruska y colaboradores, J. Clin. Invest. 79:230
(1987)).
La interrupción de la homeostasis del calcio
puede producir muchos desordenes clínicos (por ejemplo., enfermedad
severa de los huesos, anemia, deterioro renal, ulceras, miopatía, y
neuropatía) y usualmente es el resultado de condiciones que producen
una alteración en el nivel de la hormona paratimida. La
hipercalcemia es una condición que se caracteriza por una elevación
en el nivel de calcio en suero. A menudo se la asocia con
hiperparatiroidismo primario en el cual ocurre un exceso de la
producción de la PTH como resultado de una lesión (por ejemplo.,
adenoma, hiperplasia, o carcinoma) de las glándulas paratiroideas.
Otro tipo de hipercalcemia, la hipercalcemia humoral maligna (HHM)
es el síndrome paraneoplástico más común. Parece que resulta en la
mayoría de las instancias por la producción de los tumores (por
ejemplo, carcinomas espinales, renales, ováricos, o de vejiga) de
una nueva clase de hormona proteínica que comparte homología de
aminoácidos con la PTH. Estas proteínas relacionadas con la PTH
(PTHrP) parece que imitan ciertas de las acciones renales y
esqueletales de la PTH y se cree que interactúan con el receptor de
la PTH en estos tejidos. La PTHrP se encuentra normalmente en bajos
niveles en muchos tejidos, incluidos los queratinocitos, de
cerebro, de pituitaria, paratiroideos, de la corteza adrenal, la
medula, hígado fetal, de células como osteoblastos, y de tejidos
mamarios para lactancia. En muchas hipercalcemias humorales
malignas HHM, el PTHrP se encuentra en el sistema circulatorio en
altos niveles, produciendo así los altos niveles de calcio
asociados con la
HHM.
HHM.
Los perfiles farmacológicos de la PTH y del PTHrP
son casi idénticos en la mayoría de los sistemas de ensayo in
vitro, y los elevados niveles en sangre de la PTH (esto es,
hiperparatiroidismo primario) o el PTHrP (esto es, HHM) tienen
efectos comparables sobre la homeostasis iónica mineral (Broadus,
A.E. & Stewart, A.F., "Parathyroid
hormone-related protein: Structure, processing and
physiological actions," in Basic and Clinical Concepts,
Bilzikian, J.P. y colaboradores, eds., Raven Press, New York (1994),
pgs. 259-294; Kronenberg, H.M. y colaboradores,
"Parathyroid hormone: Biosynthesis, secretion, chemistry and
action," in Handbook of Experimental Pharmacology, Mundy,
G.R. & Martin, T.J., eds., Springer-Verlag,
Heidelberg (1993), pgs. 185-201). La similitud en
la actividad biológica de los dos ligandos puede explicarse por su
interacción con un receptor común, el receptor del PTH/PTHrP, que
se expresa abundantemente en los huesos y el riñón (Urena, P. y
colaboradores, Endocrinology 134:451-456
(1994)).
El enlazamiento ya sea de la
PTH-(1-34) o del PTHrP-(1-36)
radiomarcados con el receptor del PTH/PTHrP, es inhibido
competitivamente por cualquier ligando no marcado (Jiippner, H. y
colaboradores, J. Biol. Chem. 263:8557-8560
(1988); Nissenson, R.A. y colaboradores, J.Biol. Chem.
263:12866-12871 (1988)). De este modo, los sitios
de reconocimiento para los dos ligandos en el receptor del
PTH/PTHrP, probablemente se superpongan. Tanto en la PTH como en el
PTHrP, la región 15-34 contiene los determinantes
principales para el enlazamiento al receptor del PTH/PTHrP. Aunque
estas regiones muestran solamente una mínima homología de secuencia
(únicamente 3 identidades de aminoácidos), cada péptido
15-34 puede bloquear el enlazamiento tanto de la
PTH-(1-34) como del PTHrP-(1-34) al
receptor del PTH/PTHrP (Nussbaum, S. R. y colaboradores, J.
Biol. Chem. 255:10183-10187 (1980); Caulfield,
M.P. y colaboradores, Endocrinology
127:83-87 (1990); Abou-Samra, A.-B.
y colaboradores, Endocrinology 125:2215-2217
(1989)). Además, se requiere la porción
amino-terminal de cada ligando para que haya
bioactividad, y estas probablemente interactúen con los receptores
del PTH/PTHrP en formas similares, ya que 8 de 13 de estos residuos
son idénticos en la PTH y en el PTHrP.
El receptor del PTH/PTHrP es un miembro de una
familia distinta de receptores acoplados a la proteína G (Jüppner.
H. y colaboradores, Science 254:1024- 1026 (1991);
Abou-Samra, A.B. y colaboradores, Proc. Natl.
Acad. Sci (USA) 89:2732- 2736 1992)) que incluye
receptores para otras hormonas péptidos tales como la secretina
(Ishihara, T. y colaboradores, EMBO J.
10:1635-1641 (1991)), calcitonina (Lin, H.Y.
y colaboradores, Science 254:1022-1024
(1991)) y glucagón (Jelinek, L.J. y colaboradores, Science
259:1614-1616 (1993)). El uso de
oligonucleótidos degenerados correspondientes a las regiones
conservadas de la familia de receptores de la
PTH/secretina/calcitonina, Usdin y colaboradores han identificado un
nuevo cADN receptor derivado de cerebro de rata y de humano que
estaba más cercanamente relacionado al receptor de las PTH/PTHrP
(51% de identidad total de secuencia de aminoácidos) (Usdin, T. y
colaboradores, J. Biol. Chem.
270:15455-15458 (1995)). Este nuevo receptor, el
receptor PTH-2, respondió eficientemente, en forma
potente, y específicamente a la PTH-(1-34), pero de
manera interesante, no respondió a todas las PTHrP. Id. Esta
observación implicó que las diferencias estructurales en los
ligandos de la PTH y del PTHrP determinó la selectividad para la
interacción con el receptor de la PTH-2. El receptor
de la PTH-2 se encontró predominantemente en el
cerebro y en el páncreas. Id.
Ya que el receptor de la PTH-2 se
encontró en el cerebro y en el páncreas, es probable que tenga un
papel fisiológico en el funcionamiento normal de esos órganos. Las
enfermedades asociadas con disfunción cerebral y pancreática, pueden
explicarse en realidad por medio de la acción alterada del receptor
de la PTH-2. Tales enfermedades pueden tratarse
entonces con un antagonista selectivo del receptor de la
PTH-2. Otros antagonistas que están disponibles no
son selectivos y por eso no son deseables, ya que antagonizarían
con el receptor del PTH/PTHrP, lo cual tendría consecuencias
negativas en términos de la regulación del calcio y de la función
de esqueleto.
Por lo tanto, existe la necesidad en el estado de
la técnica por el desarrollo de los agonistas y antagonistas
selectivos del receptor de la PTH-2: (1) para ayudar
a aclarar más el papel biológico del receptor de la
PTH-2; (2) para mapear los sitios específicos de
interacción ligando-receptor; y (3) como
composiciones nuevas potencialmente terapéuticas que pueden ser
utilizadas en el tratamiento de desordenes asociados con la acción
alterada o mutación genética del receptor de la
PTH-2.
Para empezar a definir los residuos involucrados
en la especificidad del ligandos del receptor de la
PTH-2, los inventores estudiaron la interacción de
diferentes ligandos híbridos del PTH/PTHrP y de otros análogos
relacionados con el péptido, con el receptor de la
PTH-2 humana. Los resultados mostraron que dos
sitios en la PTH y en el PTHrP cuentan completamente para las
diferentes fuerzas que exhibieron los dos ligandos con los
receptores de la PTH-2; el residuo 5 (His en el
PTHrP e Ile en la PTH) determinaron la capacidad de señalización,
mientras que el residuo 23 (Phe en el PTHrP y Trp en la PTH)
determinaron la afinidad de enlazamiento. Cambiando estos dos
residuos del PTHrP (esto es, el residuo 5 y el 23) por los
correspondientes residuos de la PTH, los inventores fueron capaces
de convertir el PTHrP en un ligando que se enlaza ávidamente al
receptor de la PTH-2, y estimula potencial y
completamente la formación de cAMP. El cambio del residuo 23
únicamente produjo [Trp^{23}]hPTHrP-(1-36),
que era un antagonista para el receptor de la
PTH-2, pero un agonista completo para el receptor
del PTH/PTHrP. Por lo tanto, los inventores concluyeron que los
residuos 5 y 23 en la PTH y en el PTHrP juegan un papel clave en
las interacciones de señalización y enlazamiento, respectivamente,
con el receptor de la PTH-2.
De esta forma, de acuerdo con un aspecto de la
presente invención, se provee un nuevo análogo del PTHrP que tiene
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 que es un potente
agonista del receptor de la PTH-2, así como un
potente agonista del receptor del PTH/PTHrP, en donde la secuencia
de aminoácidos se altera en los residuos aminoácidos 5 y 23. En una
modalidad preferida, el análogo del PTHrP se altera en los residuos
5 y 23 de los residuos correspondientes de la PTH. Más
preferiblemente, la invención incluye análogos del PTHrP que tiene
una sustitución de aminoácidos de histidina por isoleucina en la
posición 5 del PTHrP, así como de fenilalanina por triptófano en la
posición 23 del PTHrP. En una modalidad particular, el análogo del
PTHrP tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 con las
siguientes modificaciones: [Ile5,
Trp23]PTHrP-(1-36).
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se provee un nuevo análogo del PTHrP que tiene la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 que es un potente
antagonista selectivo del receptor de la PTH-2, así
como un agonista del receptor del PTH/PTHrP, en donde la secuencia
de aminoácidos se altera en el residuo aminoácido 23. En una
modalidad preferida, el análogo se altera en el residuo 23 del PTHrP
por el correspondiente residuo de la PTH. Más preferiblemente, la
invención incluye análogos del PTHrP que tienen una única
sustitución de aminoácidos de fenilalanina por triptófano en la
posición 23 del PTHrP. En una modalidad particular, el análogo del
PTHrP tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 con la
siguiente modificación:
[Trp^{23}]PTHrP-(1-36).
De acuerdo con aún otro aspecto adicional de la
invención, Se provee el uso de un análogo del PTHrP de acuerdo con
la invención, suficiente para inhibir la activación del receptor de
la PTH-2, en la elaboración de un medicamento para
tratar un desorden médico que resulta de la acción excesiva o
alterada del receptor de la PTH-2. En una modalidad
preferida, el análogo utilizado del PTHrP tiene una única
sustitución de aminoácidos de fenilalanina por triptófano en la
posición 23 del PTHrP. En una modalidad particular, el análogo del
PTHrP es [Trp^{23}]PTHrP-(1-36).
De acuerdo con aún un aspecto adicional de la
invención, se provee el uso de un análogo del PTHrP de acuerdo con
la invención, suficiente para activar al receptor del PTH/PTHrP y
de la PTH-2, en la fabricación de un medicamento
para el tratamiento de la osteoporosis. En una modalidad preferida,
el análogo utilizado del PTHrP tiene una sustitución de aminoácido
de histidina por isoleucina en la posición 5 del PTHrP, así como de
fenilalanina por triptófano en la posición 23 del PTHrP. En una
modalidad particular, el análogo del PTHrP es [Ile5,
Trp^{23}]PTHrP-(1-36).
Además, cualquier otra sustitución de aminoácidos
en las posiciones 5 y/o 23, que no destruyan la habilidad del
análogo del PTHrP para antagonizar o agonizar al receptor de la
PTH-2 (como se determina por los ensayos conocidos
por el operario capacitado y que se discuten más abajo), están
incluidas dentro del alcance de la presente invención.
La Figura 1 describe los perfiles de enlazamiento
del ligando y de señalización del cAMP de los receptores de las
PTH-PTHrP y PTH-2. Las células
COS-7 transfectadas con los receptores del
PTH/PTHrP humano (Figuras 1A y 1C) o los receptores de la
PTH-2 humana (Figuras 1B y 1D) fueron evaluados para
la inhibición de enlazamiento del radioligando (Figuras 1A y 1B), o
la acumulación de cAMP inducida por el ligando (Figuras 1C y 1D).
Los estudios de enlazamiento se llevaron acabo a temperatura
ambiente (RT) por 2 horas. Se utilizó ^{125}I-[NleTyr^{8,21},
Tyr^{34}] rPTH-(1-34)NH_{2} (100.000
CPM/pozo) como radioligando y se utilizaron diferentes cantidades de
[Tyr^{34}] hPTH-(1-34)NH_{2} no marcado
(\bullet) o
[Tyr^{36}]hPTHrP-(1-36)NH_{2}
(\sqbullet) como ligandos competidores. Los símbolos se indican
en la clave de la figura. La cantidad máxima de trazador que se
enlaza específicamente a los receptores del PTH/PTHrP y
PTH-2 en ausencia de competidor (B_{0}) fue de
\sim25% y \sim5% de la radioactividad total añadida,
respectivamente. Para los ensayos de estimulación de cAMP, se
trataron las células con ligandos por 1 hora a temperatura ambiente
en presencia de IBMX. Lo símbolos en las Figuras 1C y 1D son los
mismos que en las Figuras 1A y 1B. Los datos son la media (\pm
s.e.m.) de 3-10 experimentos, cada uno realizado
por duplicado.
La Figura 2 describe un análisis de Scatchard del
enlazamiento de la PTH-(1-34) a los receptores del
PTH/PTHrP o del PTH-2. Las células
COS-7 transfectadas con AND de plásmido (200
ng/pozo) que codifican tanto al receptor del PTH/PTHrP humano
(Figura 2A) como al receptor de la PTH-2 humana
(Figura 2B) fueron evaluadas en estudios de enlazamiento por
competición llevados acabo por seis horas a 4ºC. El radioligando
fue ^{125}I-[NleTyr^{8,21},
Tyr^{34}]rPTH-(1-34)amida (100.000
CPM/pozo), como trazador, y el ligando competidor fue el mismo
péptido no marcado. Los datos son la media (\pm s.e.m.) de cuatro
experimentos, cada uno realizado por duplicado. Los recuadros
muestran las gráficas de Scatchard de los puntos de los datos
individuales de las porciones lineales de cada experimento. Las
constantes de disociación media (kds) y los valores de Bmax, como
receptores/célula, derivadas de estos experimentos se muestran más
arriba de la sección s. El análisis estadístico indicó que las
densidades superficiales de los dos receptores, pero no los valores
de Kd, difieren significativamente (valores p = 0.0003, y 0.14,
respectivamente, de acuerdo a la prueba t de Student).
La Figura 3 describe las estructuras primarias de
la PTH, el PTHrP y de los ligandos híbridos (SEQ ID
NOS:1-7). Se muestran las regiones biológicamente
activas de la PTH, el PTHrP, y de los ligandos híbridos del
PTH/PTHrP usados en este estudio. Las secuencias correspondientes a
el PTHrP están sombreadas. Todos los péptidos contenían la
modificación carboxi-terminal de la
tirosina-amida, y correspondientes por lo demás a
la secuencia de la PTH humana nativa o del PTHrP humana.
La Figura 4 describe los efectos de las
sustituciones en la posición 23 sobre las propiedades de
enlazamiento de los fragmentos carboxi-terminales de
la PTH-(15-34) y del PTHrP-(15-36).
Se muestran las propiedades enlazantes de las
PTH-(15-34) o PTHrP-(15-36)
sustituidas o no sustituidas a las células COS-7 que
expresan ya sea a los receptores del PTH/PTHrP (Figura 4A) o a los
receptores de la PTH-2 (Figura 4B). Los estudios de
enlazamiento competitivo se realizaron a temperatura ambiente por 2
horas con ^{125}I-[NleTyr^{8,21},
Tyr^{34}]rPTH-(1-34)NH_{2}
(100.000 CPM/pozo) como radioligando. Los ligandos competidores no
marcados utilizados se indican en la clave de la figura, cuya
estructura se basó en la secuencia de la PTH o del PTHrP humano y en
la tirosina-amida contenida como residuo
carboxi-terminal. Los datos son la media (\pm
s.e.m.) de 3 ó 4 experimentos, cada uno realizado por
duplicado.
La Figura 5 describe los efectos de las
sustituciones en las posiciones 5 y 23 sobre el enlazamiento de la
PTH-(1-34) y del PTHrP-(1-36) a los
receptores del PTH/PTHrP y la PTH-2. Se muestra el
enlazamiento de los análogos sustituidos o no sustituidos de la
PTH-(1-34) o del PTHrP-(1-36) a las
células COS-7 expresando tanto a los receptores del
PTH/PTHrP (Figuras 5A y 5C) como a los receptores de la
PTH-2 (Figuras 5B y 5D). Los estudios de
enlazamiento competitivo (RT/2h) se realizaron con
^{125}I-[NleTyr^{8,21},
Tyr^{34}]rPTH-(1-34)amida (100.000
CPM/pozo) como radioligando. Los ligandos análogos no marcados del
PTHrP (Figuras 5A y 5B) y de la PTH (Figuras 5C y 5D), usados como
competidores, se indican en las claves de la figura; la estructura
de cada una se basó en la secuencia de la PTH o del PTHrP humanos y
en la tirosina-amida contenida como residuo
carboxi-terminal. Las curvas de enlazamiento de
[Tyr^{36}]hPTHrP-(1-36)NH_{2} y
[Tyr^{34}]hPTH-(1-34)NH_{2} de las
Figuras 1A y B se muestran nuevamente para comparación. Los datos
son la media (\pm s.e.m.) de 3-10 experimentos,
cada uno realizado por duplicado.
La Figura 6 describe los efectos de las
sustituciones en las posiciones 5 y 23 sobre la señalización del
cAMP por medio de la PTH-(1-34) y del
PTHrP-(1-36) con los receptores del PTH/PTHrP y de
la PTH-2. Se muestran las facultades de los
análogos de los péptidos sustituidos y no sustituidos de la
PTH-(1-34) o del PTHrP-(1-36) para
estimular la formación de cAMP en células COS-7 que
expresan ya sea a los receptores del PTH/PTHrP (Figuras 6A y 6C) o
al receptor de la PTH-2 (Figuras 6B y 6D). Las
células fueron tratadas con la cantidad indicada de péptido por 1
hora a temperatura ambiente en presencia de IBMX. Los ligandos
análogos utilizados del PTHrP (Figuras 6A y 6B) y de la PTH
(Figuras 6C y 6D) se indican en las claves de la figura; cada una se
basó en la secuencia de la PTH o del PTHrP humanos y contenían
tirosina-amida como residuo
carboxi-terminal. Las curvas de
[Tyr^{36}]hPTHrP-(1-36)NH_{2}, y
[Tyr^{34}]hPTH-(1-34)NH_{2} de las
Figuras 1C y 1D se muestran nuevamente aquí para comparación. Los
datos son la media (\pm s.e.m.) de 3-5
experimentos, cada uno realizado por duplicado.
La Figura 7 describe el antagonismo en la
formación de cAMP inducido por PTH-(1-34) en
células COS-7 que expresan a los receptores del
PTH/PTHrP o de la PTH-2. Las células
COS-7 que expresan ya sea a los receptores del
PTH/PTHrP o de la PTH-2 fueron tratados con dosis
variables de
[Leu^{11},D-Trp^{12}]hPTHrP(7-34)NH_{2}
o [Trp^{23},Tyr^{36}]hPTHrP-(1-36), más
una dosis estimuladora cercana al máximo del agonista,
[Tyr^{34}]hPTH-(1-34)NH_{2} (1
nM), y luego se incubaron en presencia de IBMX por 30 minutos a
temperatura ambiente. Los niveles intracelulares resultantes de cAMP
se expresan como el porcentaje de los niveles de cAMP en células
tratadas solamente con
[Tyr^{34}]hPTH-(1-34)NH_{2} (1
nM), que fueron de 167\pm17 y 70\pm8 pmoles/pozo para el
receptor del PTH/PTHrP y el receptor de la PTH-2,
respectivamente. Los niveles correspondientes de cAMP basal en
células no tratadas con péptido fueron de 8.4 \pm 0.3 y 9.0 \pm
11.7 pmoles/pozo, respectivamente. Los datos son la media (\pm
s.e.m.) de dos experimentos, cada uno realizado por duplicado.
Es importante observar que estos ligandos
híbridos, así como los [H5]PTH-(1-34), que
compitieron muy pobremente por enlazarse al receptor del PTH/PTHrP,
estimularon aún eficientemente la formación de cAMP (Tabla 1). Los
inventores han encontrado que el péptido híbrido 5 radioiodado se
enlaza eficientemente al receptor del PTH/PTHrP en las células
COS-7 (\sim8% de enlazamiento específico de la
radioactividad añadida). Parece por lo tanto que estos ligandos
alterados se enlazan al receptor del PTH/PTHrP, pero en un sitio
que no se sobrepone completamente con aquel utilizado por
^{125}I-[NleTyr^{8,21},Tyr^{34}]rPTH-(1-34)NH_{2}.
Las células COS-7 transfectadas
con plásmidos que codifican al receptor del PTH/PTHrP humano o el
receptor de la PTH-2 humana fueron evaluadas en
estudios de enlazamiento por competición que utilizaron
[Nie^{8,21},
Y^{34}]rPTH-(1-34)NH_{2} como
radioligando y los ligandos indicados no marcados como competidores.
Los ensayos fueron realizados por 2 horas a temperatura ambiente.
Los datos son la media (\pm s.e.m.) de los valores de IC_{50}
obtenidos a partir del número de experimentos indicados (n).
| IC_{50} (nM) de enlazamiento | ||||
| Receptor de las | Receptor de la | |||
| Ligando | PTH/PTHrP | PTH-2 | ||
| (n) | (n) | |||
| [Nle8,21, Y34]rPTH-(1-34)NH2 | 58\pm4 | 5 | 11\pm2 | 5 |
| [Y34] hPTH-(1-34)NH2 | 39\pm4 | 7 | 16\pm4 | 7 |
| [Y36]hPTHrP-(1-36)NH2 | 285\pm47 | 10 | 2.140\pm250 | 10 |
| Híbrido-1 | ||||
| \hskip1,5cm hPTHrP-(1-14)/[Y34]hPTH-(15-34)NH2 | 7.900\pm370 | 4 | 6063\pm96 | 4 |
| Híbrido-5 | ||||
| \hskip1,5cm hPTHrP-(1-18)/[Y34]hPTH-(19-34)NH2 | 4.970\pm1.560 | 4 | 500\pm62 | 4 |
| Híbrido-4 | ||||
| \hskip1,5cm hPTHrP-(1-21)/[Y34]hPTH-(22-34)NH2 | 19\pm6 | 4 | 11\pm3 | 4 |
| Híbrido-3 | ||||
| \hskip1,5cm hPTHrP-(1-23)/[Y34]hPTH-(24-34)NH2 | 1.000\pm471 | 4 | 6.050\pm990 | 4 |
| Híbrido-2 | ||||
| \hskip1,5cm hPTH-(1-14)/[Y34]hPTHrP-(15-34)NH2 | 497\pm144 | 4 | 750\pm210 | 4 |
| [Y36]hPTHrP-(15-36)NH2 | >10.000 | 4 | 4.970\pm970 | 4 |
| [W23, Y36] hPTHrP-(15-36)NH2 | >10.000 | 4 | 370\pm100 | 4 |
| [E22, W23, Y36]hPTHrP-(15-36)NH2 | >10.000 | 4 | 137\pm36 | 4 |
| [Y34]hPTH-(15-34)NH2 | >10.000 | 3 | 624\pm116 | 3 |
| [F23, Y34] hPTH-(15-34)NH2 | >10.000 | 4 | >10.000 | 4 |
| [W23, Y36]hPTHrP-(1-36)NH2 | 47\pm8 | 5 | 30\pm7 | 5 |
| [15, Y36]hPTHrP-(1-36)NH2 | 41\pm11 | 6 | 695\pm171 | 6 |
| [15, W23, Y36] hPTHrP-(1-36)NH2 | 16\pm3 | 5 | 10\pm1 | 5 |
| [F23, Y34]hPTH-(1-34)NH2 | 95\pm11 | 4 | 453\pm53 | 4 |
| [H5, Y34]hPTH-(1-34)NH2 | 5.100\pm1.000 | 4 | 249\pm18 | 4 |
| [H5, F23, Y34] hPTH-(1-34)NH2 | >10.000 | 3 | >10.000 | 3 |
Previamente, los presentes inventores habían
preparado una serie de ligandos híbridos del PTH/PTHrP con el
propósito de investigar si los dominios homólogos de la PTH y del
PTHrP podían ser intercambiados (Gardella, T.J. y colaboradores, J.
Biol. Chem. 270:6584-6588 (1995)). Los
presentes inventores han utilizado ahora estos ligandos híbridos y
análogos derivados de péptido para regiones del mapa de PTH y PTHrP
que contribuyen a la selectividad del ligando del receptor de la
PTH-2. Estos esfuerzos han conducido a la
identificación de dos residuos en los ligandos que juegan papeles
principales en la determinación de la eficiencia de enlazamiento y
en las interacciones de señalización con el receptor de la
PTH-2.
La presente invención provee un nuevo análogo del
PTHrP que es un potente agonista receptor de la
PTH-2, así como un potente agonista receptor del
PTH/PTHrP. En una modalidad preferida, se altera al análogo del
PTHrP en los residuos 5 y 23 de los residuos correspondientes de la
PTH. Más preferiblemente, la invención incluye análogos del PTHrP
que tienen una sustitución de aminoácidos de histidina por
isoleucina en la posición 5 del PTHrP, así como de fenilalanina por
triptófano en la posición 23 del PTHrP. En una modalidad
particular, el análogo del PTHrP es [Ile^{5},
Trp^{23}]PTHrP-(1-36).
De acuerdo con otro aspecto de al presente
invención, se provee un nuevo análogo del PTHrP que es un potente
antagonista selectivo del receptor de la PTH-2. En
una modalidad preferida, el análogo se altera en el residuo 23 del
PTHrP del residuo correspondiente de la PTH. Más preferiblemente,
la invención incluye análogos del PTHrP que tienen una única
sustitución de aminoácido de fenilalanina por triptófano en la
posición 23 del PTHrP. En una modalidad particular, el análogo del
PTHrP es [Trp^{23}]PTHrP-(1-36).
Además, cualquier otra sustitución de aminoácidos
de una naturaleza, que no destruya la habilidad del análogo del
PTHrP para antagonizar o agonizar al receptor de la
PTH-2 (como se determina por ensayos conocidos por
aquellos operarios calificados y que es discutido más adelante),
están incluidos en el alcance de la presente invención. El siguiente
Ejemplo es ilustrativo, y no pretende ser limitante.
La preparación y caracterización inicial de los
ligandos híbridos del PTH/PTHrP fue descrita previamente (Gardella,
T.J. et al., J. Biol. Chem.
270:6584-6588 (1995)). [Nle^{8,21},
Tyr^{34}]rat(r)PTH(1-34)NH_{2}
fue adquirido a Bachem Fine Chemicals (Tomance, CA). El
antagonista,
[Leu^{11},D-Trp^{12}]hPTHrP(7-34)NH_{2},
fue adquirido a Peninsula Laboratories (Belmont, CA). Todos los
otros péptidos fueron preparados en el centro para síntesis de
biopolímeros del Hospital General de Massachusetts (Boston, MA)
utilizando química en fase sólida y grupos protectores
F-moc. Se preparó
^{125}I-[Nle^{8,21},Tyr^{34}]rPTH-(1-34)NH_{2}
por yodación con cloramina-T, y se purificó por HPLC
(Shigeno, C. y colaboradores, J. Biol. Chem.
263:3872-3878 (1988)).
[^{125}I]-Na (2,000 Ci/mmol) se adquirido a
DuPont/New England Nuclear (Boston, MA). El medio modificado de
águila de Dulbecco (DMEM), la mezcla de EGTA/tripsina y 100x
antibiótico (10,000 unidades/ml de penicilina G y 10 mg/ml de
estreptomicina) era de GIBCO; el suero fetal bovino (FBS) era de
Hyclone Laboratories (Logan, UT).
Los cADN que codifican al receptor del PTH/PTHrP
humano (Schipani, E. y colaboradores, Endocrinology
132:2157-2165 (1993)) y al receptor de la
PTH-2 humana (Usdin, T. y colaboradores, J.
Biol. Chem. 270:15455-15458 (1995)) fueron
transportados sobre vectores de expresión pcADN-1 y
pcADNI/Amp (InVitrogen, San Diego, CA), respectivamente. Las células
COS-7 se cultivaron y transfectaron como se
describió previamente (Lee, C. y colaboradores, Mol.
Endocrinol. 9:1269-1278 (1995)). Las células se
transfectaron en placas de 24 pozos utilizando ADN de plásmido (200
ng/pozo) purificado por centrifugación en gradiente de cloruro de
cesio/bromuro de etidio. Los ensayos de enlazamiento del ligando y
de acumulación de cAMP fueron realizados tres días después de la
transfección, en cuyo momento la densidad celular alcanzó 500.000
\pm 100.000 células/pozo.
Las reacciones de enlazamiento se realizaron como
se describió previamente. Id. Cada pozo ( volumen final: 300
ml) contenía 26 fmoles de
^{125}I-[Nle^{8,21},Tyr^{34}]rPTH(1-34)NH_{2}
(100.000 CPM) y diferentes cantidades (0.4-300
pmoles) de un ligando competidor no marcado, ambos diluidos en
buffer de enlazamiento (Tris-HCI 50 mM, pH 7,7,
NaCl 100 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 2 mM, suero de caballo al 5%
inactivado por calor, suero fetal bovino al 0.5% inactivado por
calor). Las incubaciones se hicieron a temperatura ambiente por 2
horas, excepto para los experimentos que involucran el análisis
Scatchard, que fueron realizados a 4ºC por 6 horas. Al final de la
reacción de enlazamiento, se enjuagaron las células 3 veces con 0.5
ml de buffer de enlazamiento, se lisaron con 0.5 ml de NaOH 5 M, y
se hizo recuento del lisado completo. El enlazamiento no específico
del trazador (NSB), determinado en pozos que contenían 1 \muM de
[NleTyr^{8,21},
Tyr^{34}]rPTH-(1-34)NH_{2}, fue
\sim1% del total contadores añadidos. El enlazamiento específico
máximo (B_{0}) se calculó como el enlace de reactividad total a
las células en ausencia de ligando de la PTH no marcada, menos NSB.
Los valores de IC_{50} (la dosis del ligando competidor que
resultó en una inhibición del 50% del enlazante
^{125}I-[NleTyr^{8,21},Tyr^{34}]rPTH-(1-34)NH_{2})
se determinaron a partir de las gráficas de
log(B/B_{0}-B) vs. log[competidor].
Para el análisis de Scatchard, los estudios de enlazamiento de
competición homóloga que se realizaron utilizaron
^{125}I-[NleTyr^{8,21},Tyr^{34}]rPTH-(1-34)NH_{2}
(26 fmoles/pozo) y cantidades variables (1.2-300
pmoles) del mismo ligando no marcado. Los estimados del número de
receptores/célula derivados a partir de estos estudios asumieron
una única clase de sitios de enlazamiento y una eficiencia de
transfección del 20% (Abou-Samra, A.B. y
colaboradores, Proc. Natl. Acad Sci (USA)
89:2732-2736 (1992)).
Las células transfectadas COS-7
se enjuagaron con 500 ml de buffer de enlazamiento. Se añadieron
entonces 200 ml de buffer IBMX (DMEM conteniendo IBMX 2 mM, 1 mg/ml
de albúmina de suero bovino, Hepes-NaOH 35 mM, pH
7.4) y 100 ml de buffer de enlazamiento o buffer de enlazamiento
conteniendo diferentes cantidades de un análogo de la PTH o del
PTHrP. Las placas se incubaron por 60 minutos a temperatura
ambiente. El buffer fue retirado entonces y las células fueron
lisadas colocando las placas sobre hielo seco en polvo y añadiendo
0.5 ml de HCl 50 mM. El lisado ácido se diluyó 1/30 en dH2O, y se
analizó una alícuota (5-50 ml) por su contenido de
cAMP por medio de un radioinmunoensayo. Los valores de EC_{50}
(la dosis de ligando que dio como resultado una respuesta máxima
del 50% (Emax) obtenida para ese ligando con el receptor relevante)
se determinaron a partir de las gráficas de
log(E/Emax-E) vs. log[ligando], donde
E es la respuesta medida de cAMP en la dosis de ligando
correspondiente. Para el estudio de los antagonistas, se aplicó el
péptido inhibidor [Leu^{11},
D-Trp^{12}]hPTHrP(7-34)NH_{2}
o el
[Trp^{23},Tyr^{36}]hPTHrP-(1-36)NH_{2}
a las células COS-7 en 100 \mul de buffer de
enlazamiento, dos minutos antes de la adición del buffer IBMX que
contenía una dosis estimuladora cercana a la máxima (1.5 nM) del
péptido agonista
[Tyr^{34}]hPTH-(1-34)NH_{2}. Las
células se incubaron entonces por 30 minutos a temperatura ambiente,
y el cAMP intracelular resultante fue medido por medio de RIA. Los
datos se analizaron utilizando el software AssayZap (Elsevier
Science Publishers BV, Cambridge, Reino Unido).
Las respuestas de enlazamiento y señalización de
cAMP obtenidas para las PTH-(1-34)
([Tyr^{34}]hPTH-(1-34)NH_{2}) y
PTHrP-(1-36)
([Tyr^{36}]hPTHrP-(1-36)NH_{2}) en
células COS-7 que expresan a los receptores del
PTH/PTHrP y la PTH-2 humanas se muestran en la
Figura 1. Con el receptor del PTH/PTHrP, tanto las
PTH-(1-34) como PTHrP-(1-36)
inhibieron completamente el enlazamiento del radioligando,
^{125}I-[NleTyr^{8,21},Tyr^{34}]rPTH-(1-34)NH_{2},
aunque la PTH-(1-34) fue 4.8 veces más potente que
el PTHrP-(1-36) (las IC_{50} = 39 y 285 nM,
respectivamente, p<0.001; Figura 1A y Tabla 1). Con las células
que expresan al receptor de la PTH-2,
PTH-(1-34) se enlaza con una afinidad aparentemente
alta, mientras que el PTHrP-(1-36) se enlaza
pobremente con una potencia que fue más de 100 veces más débil que
aquella de la PTH-(1-34) (Figura 1B y Tabla 1).
Tanto la PTH-(1-34) como el
PTHrP-(1-36) fueron agonistas totales y potentes de
la producción de cAMP en células COS-7 que expresan
al receptor del PTH/PTHrP (Figura 1C y Tabla 2). En contraste,
solamente la PTH-(1-34) fue un potente agonista con
el receptor de la PTH-2, mientras que el
PTHrP-(1-36) fue casi inactiva (Figura 1D). Estos
resultados confirman las actividades de estimulación de cAMP
marcadamente diferentes de la PTH y del PTHrP con el receptor de la
PTH-2 (Usdin, T. y colaboradores, J.
Biol. Chem.270:15455-15458 (1995)), y
demuestran que al menos parte del defecto de señalización que tiene
el PTHrP con este receptor puede ser atribuido a las débiles
interacciones de enlazamiento.
Los análisis de Scatchard de los datos de
competición de enlazamiento indicaron que el receptor de la
PTH-2 se expresó sobre la superficie de las células
COS-7 hasta niveles que fueron 5 veces menores que
el nivel de expresión alcanzados por el receptor del PTH/PTHrP
(Figuras 2A y 2B). Esta diferencia en los niveles de expresión es
probable que explique las menores respuestas de cAMP comparadas con
el receptor del PTH/PTHrP (Figura 1). Aunque, la razón para la
menor expresión del receptor de la PTH-2 no es
clara hasta el momento, la expresión fue completamente adecuada por
comparación de las interacciones de diferentes análogos de la PTH y
del PTHrP con este
receptor.
receptor.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Las células COS-7 transfectadas
con plásmidos que codifican al receptor del PTH/PTHrP humano o el
receptor de la PTH-2 humana fueron estimuladas con
el ligando indicado por 1 h a temperatura ambiente, y los niveles
resultantes de cAMP intracelular fueron cuantificados por RIA. Los
valores máximos indican el nivel más alto de cAMP que se logró para
cada ligando con cada receptor. Los valores basales medios de cAMP
(no restados) fueron 4,6 \pm 0,2 y 5,4 \pm 0,3 pmoles/pozo para
los receptores del PTH/PTHrP y la PTH-2,
respectivamente. Los datos son la media (\pm s.e.m.) de los
valores obtenidos a partir del número de experimentos indicado
(n).
| Acumulación de cAMP | ||||||
| Receptor del PTH/PTHrP | Receptor de la PTH-2 | |||||
| EC50 | Máximo | EC50 | Máximo | |||
| Ligando | (nM) | (pmoles/pozo) | (nM) | (pmoles/pozo) | ||
| (n) | (n) | |||||
| [Y34]hPTH-(1-34)NH2 | 0,46\pm0,18 | 113\pm13 | 5 | 0,6\pm0,1 | 81\pm5 | 5 |
| [Y36] hPTHrP-(1-36)NH2 | 0,32\pm0,04 | 103\pm10 | 5 | >1000 | 11\pm1 | 5 |
| [15, Y36]hPTHrP-(1-36)NH2 | 0,26\pm0,08 | 112\pm9 | 3 | 7,0\pm2,1 | 80\pm5 | 3 |
| [W23, Y36]hPTHrP-(1-36)NH2 | 0,26\pm0,05 | 123\pm14 | 4 | >1000 | 12\pm1 | 4 |
| [15, W23, Y36]hPTHrP-(1-36)NH2 | 0,21\pm0,06 | 109\pm10 | 4 | 0,5\pm0,3 | 65\pm7 | 4 |
| [H5, Y34]hPTH-(1-34)NH2 | 0,93\pm0,37 | 116\pm19 | 3 | >1000 | 10\pm1 | 3 |
| [F23, Y34]hPTH-(1-34)NH2 | 0,23\pm0,02 | 104\pm16 | 4 | 7,6\pm2,2 | 50\pm8 | 4 |
| [H5, F23, Y34]hPTH-(1-34)NH2 | 1,18\pm0,29 | 110\pm19 | 3 | >1000 | 7,1\pm0,9 | 3 |
| Híbrido-1 | ||||||
| [Y34]hPTHrP-(1-14)/hPTH-(15-34)NH2 | 0,23\pm0,04 | 140\pm17 | 3 | >1000 | 5,3\pm0,6 | 3 |
| Híbrido-5 | ||||||
| [Y34]hPTHrP-(1-18)/hPTH-(19-34)NH2 | 0,43\pm0,16 | 133\pm14 | 3 | >1000 | 6,2\pm0,4 | 3 |
| Híbrido-4 | ||||||
| [Y34]hPTHrP-(1-21)/hPTH-(22-34)NH2 | 0,27\pm0,06 | 107\pm17 | 4 | >1000 | 6,7\pm0,6 | 4 |
| Híbrido-3 | ||||||
| [Y34]hPTHrP-(1-23)/hPTH-(24-34)NH2 | 0,42\pm0,13 | 95\pm9 | 4 | >1000 | 11\pm1 | 4 |
| Híbrido-2 | ||||||
| [Y34]hPTHrP-(1-14)/hPTH-(15-34)NH2 | 0,74\pm0,37 | 123\pm28 | 3 | 2,1\pm0,5 | 58\pm12 | 3 |
Para localizar las regiones de la PTH y del PTHrP
responsables por la diferencia en las afinidades de enlazamiento
aparentes de los dos ligandos con el receptor de la
PTH-2, los inventores evaluaron la serie de los
análogos híbridos del PTH/PTHrP mostrados en la Figura 3 (SEQ ID
NOS: 3-7). Algunos de los ligandos híbridos (esto
es, híbridos 1 y 5) no fueron altamente informativos, porque a
diferencia de cada ligando principal, ellos compitieron pobremente
por enlazarse aún al receptor del PTH/PTHrP, indicando que estos
análogos fueron diferentes de cada ligando principal. En forma
similar, la débil eficacia de enlazamiento para estos ligandos
híbridos fue observada previamente en estudios con células de
osteosarcoma de rata (ROS 17/2.8). Aquellos resultados fueron
interpretados como alteraciones en la estructura del ligando
causada por incompatibilidad entre los residuos en la porción
1-14 amino-terminal del PTHrP, y la
región 15-34 de la PTH (Gardella, T.J. et
al., J. Biol. Chem. 270: 6584-6588
(1995)). Para los estudios actuales sobre el receptor de la
PTH-2, los análogos más informativos fueron el
híbrido-3 y el híbrido-4. El
enlace del híbrido-4, y de las
PTHrP-(1-21)/PTH-(22-34) al receptor
de la PTH-2 con gran eficacia (IC_{50} = 11 nM),
similar a la de la PTH-(1-34) (Tabla 1). Extendiendo
la secuencia del PTHrP en dos residuos produjo al
híbrido-3, y las
PTHrP-(1-23)/PTH-(24-34), que
compitieron pobremente por enlazarse al receptor del PTH/PTHrP
(IC_{50} = 1.000 nM), y por enlazarse con eficacia aún menor al
receptor de la PTH-2 (IC_{50} \sim 6.000 nM).
En este sentido, el perfil de enlazamiento del
híbrido-3 se parece a aquel del
PTHrP-(1-36).
Comparando las estructuras y las propiedades de
enlazamiento de los híbridos 3 y 4 condujo a los inventores a la
hipótesis de que los residuos divergentes en las posiciones 22 y/o
23 contribuyen a que el receptor de la PTH-2 se
enlace selectivamente. Para probar inicialmente el papel de los
residuos 22 y 23 en el enlazamiento del receptor, se prepararon
fragmentos más cortos del PTHrP-(15-36) en los
cuales Phe-22 y/o Phe-23 fueron
reemplazados por los correspondientes residuos Glu y Trp de la PTH.
El péptido principal no sustituido, del
PTHrP-(15-36), compitió débilmente por enlazarse al
receptor de la PTH-2 (Figura 4B). La eficacia del
enlazamiento mejoró considerablemente con la sustitución combinada
de Glu-22 y Trp-23 por Glu y Trp. La
mayor parte de esta mejora podría ser justificada por la
sustitución única de Trp por Phe-23 (Tabla 1, Figura
4B). El enlazamiento ya sea de los fragmentos no sustituidos o de
los sustituidos del PTHrP-(15-36) al receptor de
las PTH/PTHrP, podría no ser detectado en estos ensayos de
competición (Figura 4A).
Se introdujo la modificación de
Phe-23 por Trp en el PTHrP-(1-36) de
longitud completa, donde se encontró que mejora la eficiencia de
enlazamiento para el receptor de la PTH-2 en 17
veces, comparado al enlazamiento del PTHrP-(1-36)
por si misma (Figura 5B; Tabla 1). El cambio recíproco de Trp 23
por Phe en la PTH-(1-34) condujo a una reducción de
28 veces en la eficiencia de enlazamiento para el receptor de la
PTH-2, comparado con la PTH-(1-34)
no sustituida (Figura 5D y Tabla 1). De manera interesante, los
residuos divergentes en la posición 23 podrían contar también para
algunas de las diferencias en las afinidades aparentes de
enlazamiento que la PTH y el PTHrP exhibieron por el receptor del
PTH/PTHrP. De este modo,
[Trp^{23}]PTHrP-(1-36) se enlaza al
receptor del PTH/PTHrP con una afinidad 6 veces más fuerte de lo que
lo hizo el PTHrP-(1- 36) (Figura 5A; Tabla 1), y
[Phe^{23}]PTH-(1-34) se enlaza a este
receptor con una afinidad 2-3 veces menor d lo que
lo hizo la PTH-(1-34) (Figura 5C; Tabla 1). El
efecto de estos cambios en la posición 23 sobre el enlazamiento al
receptor del PTH/PTHrP podría ser predicho a partir de las
propiedades de enlazamiento que el híbrido-3 y el
híbrido-4 mostraron con este receptor (Tabla 1).
Las sustituciones anteriores en la posición 23 en
la PTH o en el PTHrP tuvieron un efecto my pequeño o no lo
tuvieron, sobre el señalización de cAMP por medio del receptor de
la PTH-2;
[Trp^{23}]PTHrP-(1-36) era aún inactiva y
[Phe^{23}]PTH-(1-34) era casi un agonista
completo (Figuras 6B y 6D; Tabla 2). La alta eficiencia del
híbrido-2, las
PTH-(1-14)/PTHrP-(15-34), en
estimular la producción de cAMP con el receptor de la
PTH-2, comparado con la débil actividad del
híbrido-1, las
PTHrP-(1-14)/PTH-(15-34) (Tabla 2),
sugirió que los residuos con la secuencia 1-14 de la
PTH y del PTHrP estaban involucrados en la modulación de las
propiedades de señalización de los dos ligandos con este
receptor.
Los estudios previos de enlazamiento en células
ROS 17/2.8 revelaron que la posición 5 (Ile en la PTH y His en el
PTHrP) era un sitio divergente en la región 1-14
que podría afectar dramáticamente la interacción
ligando-receptor (Gardella, T.J. y colaboradores,
J. Biol. Chem. 270:6584-6588
(1995)). Por lo tanto, se probaron los efectos de las sustituciones
recíprocas en la posición 5 sobre las interacciones de señalización
con el receptor de la PTH-2. Sorprendentemente,
[Ile^{5}]PTHrP-(1-36) se convirtió en un
agonista completo con el receptor de la PTH-2,
promoviendo la misma respuesta máxima de cAMP que aquella lograda
por la PTH-(1-34) (Figura 6B y Tabla 2). Sin
embargo, la EC_{50} de la respuesta de la
[Ile^{5}]PTHrP-(1-36) fue hasta 12 veces
más alta que aquella de la PTH-(1-34) (Los
EC_{50} = 7 y 0.6 nM, respectivamente). Por lo tanto, los
inventores combinaron la sustitución de la Ile-5
con la modificación Trp 23 para mejoramiento de la afinidad. El
análogo resultante,
[Ile^{5},Trp^{23}]PTHrP-(1-36), fue tan
potente y eficaz como la PTH-(1-34)
en ambos enlazamientos y en la producción de cAMP con el receptor de la PTH-2 (Figura 6B, Tablas 1 y 2).
en ambos enlazamientos y en la producción de cAMP con el receptor de la PTH-2 (Figura 6B, Tablas 1 y 2).
La observación de que
[Trp^{23}]PTHrP-(1-36) (histidina en la
posición 5) enlaza al receptor de la PTH-2 sin
estimular la producción de cAMP, sugiere que este análogo podría
funcionar como antagonista del receptor de la PTH-2.
La Figura 7 muestra que este análogo fue en realidad al menos tan
potente como [Leu^{11},
D-Trp^{12}]hPTHrP(7-34)NH_{2},
un antagonista muy potente del antagonista del receptor del
PTH/PTHrP (Nutt y colaboradores, Endocrinology
127:491-493 (1990)), en la inhibición de la
actividad inducida de la PTH-(1-34) sobre el
receptor de la PTH-2. Con el receptor del
PTH/PTHrP, [Trp^{23}]PTHrP-(1-36) no fue un
antagonista, sino que más bien aumentó la respuesta del agonista al
PTH-(1-34).
Los estudios discutidos antes demuestran que la
falla del PTHrP para enlazarse eficientemente y activar al receptor
de la PTH-2 puede ser atribuida a dos residuos,
fenilalanina en la posición 23 e histidina en la posición 5. En la
PTH, que es completamente eficaz con el receptor de la
PTH-2, estos residuos son reemplazados por
triptófano y por isoleucina, respectivamente. Intercambiando los
residuos 5 y 23 del PTHrP con los correspondientes residuos de
isoleucina y de triptófano de la PTH, y del PTHrP podría
convertirse en un eficiente y completo agonista del receptor de la
PTH-2.
La histidina en la posición 5 en del PTHrP
bloqueó la activación del receptor de la PTH-2. En
estudios previos de enlazamiento por competición en las células ROS
17/2.8, el residuo 5 fue identificado como un determinante
importante para la interacción con el receptor del PTH/PTHrP
receptor (Gardella, T.J. y colaboradores, J. Biol. Chem.
270:6584-6588 (1995)). Estos primeros estudios
sugieren que este residuo estaba involucrado en interacciones
intramoleculares putativas entre las porciones 1-14
con las porciones 15-34 del ligando. La evidencia
para esto incluye la capacidad de la sustitución de la His en
posición 5 con la Ile en esa misma posición en el PTHrP para
"remediar" los efectos perjudiciales que las sustituciones
carboxiterminales (esto es, en las posiciones 19, 21 y 24) tenían
sobre la eficiencia del enlazamiento. Parece ahora que el papel
completo del residuo 5 en el ligando en la PTH y en el PTHrP es más
complejo, ya que los datos actuales indican que este residuo modula
fuertemente las interacciones de señalización con el receptor de la
PTH-2 receptor.
El enlazamiento débil del PTHrP al receptor de la
PTH-2 puede ser atribuido al residuo de fenilalanina
en la posición 23; reemplazando este residuo por el correspondiente
triptófano de la PTH mejoró el enlazamiento al receptor de la
PTH-2 71 veces. La sustitución del Trp por Phe en la
posición 23 podría explicar también el enlazamiento seis veces más
débil que el PTHrP-(1-36) exhibió por el receptor
del PTH/PTHrP, comparado con la PTH-(1-34) (Tabla
1). Tal enlazamiento más débil del PTHrP fue observado en los
primeros estudios con el receptor del PTH/PTHrP humano clonado
expresado en las células COS-7, aunque, se
observaron eficiencias de enlazamiento casi equivalentes con el
receptor del PTH/PTHrP clonado de rata (Schipani, E. y
colaboradores, Endocrinology
132:2157-2165 (1993)). Los primeros estudios
con el receptor del PTH/PTHrP endógenas a las células ROS 17/2.8
también encontraron una eficiencia de enlazamiento comparable para
los dos ligandos (Jüppner, H. y colaboradores, J. Biol.
Chem. 263:8557- 8560 (1988); Nissenson, R.A. y colaboradores,
J. BioL Chem. 263:12866-12871
(1988)). Por lo tanto, puede esperarse que los receptores del
PTH/PTHrP de rata y humano, y el receptor de la
PTH-2 humana, difieran cada uno en el sitio o en
los
sitios en que reconocen al residuo 23 en el ligando. De esta forma, con ambos receptores, la modificación del triptófano en el Trp 23 en el PTHrP mejoró la afinidad de enlazamiento del análogo hasta cerca de aquel de la PTH-(1-34).
sitios en que reconocen al residuo 23 en el ligando. De esta forma, con ambos receptores, la modificación del triptófano en el Trp 23 en el PTHrP mejoró la afinidad de enlazamiento del análogo hasta cerca de aquel de la PTH-(1-34).
Los efectos sobre la actividad de una variedad de
modificaciones en la posición 23 en la PTH han sido investigados
previamente en los receptores del PTH/PTHrP. Rosenblatt y
colaboradores encontraron que la adición de un grupo voluminoso
orto- nitrofenilsulfenilo al nitrógeno del indol de la Trp 23 tuvo
poco o ningún efecto sobre la bioactividad (Rosenblatt, M. &
Potts, J.T., Endo. Res. Comm. 4: 115-133
(1977)), ni tampoco lo hizo una sustitución de naftilalanina en
este sitio (Nakamoto, C. y colaboradores, Biochemistry
34:10546-10552 (1995)). Sin embargo, la metilación
de la columna vertebral nitrogenada en Phe 23, o, la sustitución
de D-Trp por Trp 23, redujo severamente la afinidad
de enlazamiento del receptor (Caulfield, M.P. & Rosenblatt,
M.,T.E.M. Jan/Feb: 164-168 (1990)).
El análisis mutacional de los residuos 23-34 de la
PTH-(1-84) mostró que la sustitución de la
cisteína del Trp 23 redujo la bioactividad en más de 10 veces,
mientras que la sustitución de la leucina redujo la actividad en un
50% (Gardella, T.J. et al., "Scanning mutagenesis of the
23-25 region of parathyroid hormone reveals
important determinants of receptor binding", in Calcium
Regulating Hormones and Bone Metabolism; Basic and Clinical
Aspects, Vol. 11, Cohn, D.V. y colaboradores, eds., Elsevier
Science Publishers BV, Amsterdam (1992), pgs.
218-222). Los estudios por RMN sobre los análogos de
la PTH (Barden, J.A. & Kemp, B.E., Biochemistry
32:7126-7132 (1993); Marx, U. Y colaboradores, J.
Biol. Chem.270:15194-15202 (1995); Klaus,
W. y colaboradores, Biochemistry
30:6936-6942 (1991); Bundi, A. y colaboradores,
Eur. J. Biochem. 91:201-208 (1978)) y de los
análogos del PTHrP (Barden, J.A. & Kemp, B.E., Eur.
J. Biochem. 184: 379-394 (1989); Ray,
F.R. y colaboradores, Eur. J. Biochem.
211:205-211 (1993)) sugieren que el residuo
aromático en esta posición en cada ligando está involucrado en las
interacciones hidrófobas intramoleculares. El residuo 23 puede, por
lo tanto, ser importante para mantener la estructura del ligando,
así como modular las interacciones de enlazamiento del
receptor.
Debido a que el análogo del
PTHrP-(1-36) que contiene la modificación Trp 23
exhibió una alta afinidad de enlazamiento por el receptor de la
PTH-2 sin tener una actividad agonista detectable,
lo evaluamos como un antagonista potencial del receptor de la
PTH-2. Este análogo fue al menos tan eficiente como
[Leu^{11},
D-Trp^{12}]hPTHrP(7-34)NH_{2},
un antagonista previamente caracterizado del receptor del PTH/PTHrP
en la inhibición de la acción del agonista de la
PTH-(1-34) sobre el receptor de la
PTH-2; sin embargo, a diferencia del análogo del
antagonista truncado en forma aminoterminal, sin embargo,
[Trp^{23}]PTHrP-(1-36) fue un agonista
eficiente y completo con el receptor del PTH/PTHrP (Figuras 6A y
7A). Debido a que este nuevo análogo parece ser un antagonista
selectivo para el receptor de la PTH-2, podría ser
potencialmente útil para los estudios in vivo dirigidos a
una elucidación adicional del papel fisiológico del receptor de la
PTH-2 receptor.
La PTHrP se expresa en muchos tejidos fetales y
adultos y es un morfógeno vital de desarrollo, una función que
probablemente sea mediada por el receptor da las PTH/PTHrP
(Karaplis, A.C. y colaboradores, Genes & Dev.
8:277-289 (1994)). Es interesante que la
fenilalanina se preserve en la posición 23 en todos los ligandos
nativos del PTHrP, a pesar de las implicaciones de la invención de
que el triptófano en este sitio, como se lo encuentra en todos los
ligandos nativos de la PTH, es completamente compatible con el
enlazamiento al receptor del PTH/PTHrP receptor. Puede ser que la
fenilalanina haya sido seleccionada para la posición 23 en el
PTHrP, debido a su habilidad para inhibir el enlazamiento al
receptor de la PTH-2. Igualmente, el residuo de
histidina conservado en la posición 5 en el PTHrP puede haber sido
seleccionado debido a que bloquea las interacciones de señalización
con el receptor de la PTH-2. Juntos, estos dos
residuos que se conservaron en el PTHrP asegurarían de este modo
que las interacciones productivas con el receptor de la
PTH-2 no ocurrirían.
En resumen, los presentes inventores han
identificado dos sitios en la PTH y en el PTHrP que cuentan para la
selectividad del ligando del receptor de la PTH-2.
Los inventores están construyendo ahora quimeras entre los
receptores de la PTH-2 y del PTH/PTHrP, como una
aproximación hacia la identificación de los sitios receptores
afines involucrados en esta selectividad del ligando por los dos
ligandos. Los perfiles funcionales de tales quimeras de receptor
que interactúan con los ligandos modificados de la PTH y del PTHrP
ayudarían a refinar y a restringir los modelos de los complejos
formados entre estos ligandos de péptidos y sus receptores
acoplados a la proteína G.
De acuerdo aún con otro aspecto adicional de la
invención, se provee un método para tratar un desorden medico que
resulta de una acción alterada o excesiva del receptor de la
PTH-2, que comprende administrar a un paciente una
cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo del PTHrP,
suficiente para inhibir la activación del receptor de la
PTH-2 de dicho paciente. En una modalidad preferida,
el análogo del PTHrP utilizado en el método tiene una sustitución
sencilla de aminoácido de fenilalanina por triptófano en la
posición 23 del PTHrP. En una modalidad particular, el análogo del
PTHrP es [Trp^{23}]PTHrP-(1-36).
En esta modalidad, un paciente que se sospecha
que tiene un desorden resultante de la acción alterada del receptor
de la PTH-2, puede ser tratado utilizando los
análogos del péptido de la invención que mostraron ser antagonistas
selectivos del receptor de la PTH-2. Tales
antagonistas incluyen a los compuestos de la invención que se ha
determinado que (por medio de los ensayos descritos aquí)
interfieren con la activación celular mediada por el receptor de la
PTH-2 o de otros análogos que tienen propiedades
similares.
Para administrar al antagonista, se utiliza el
péptido apropiado en la elaboración de un medicamento, generalmente
formulado en un vehículo apropiado o excipiente tal como, por
ejemplo, suero fisiológico, y administrado en forma intravenosa,
intramuscular, subcutánea, u oralmente, en una dosificación que
provea la adecuada inhibición del enlazamiento de la PTH al
receptor de la PTH-2. La dosificación típica sería
de 1 ng a 10 mg del anticuerpo o péptido por kg de peso corporal
por día.
De acuerdo aún con un aspecto adicional de la
invención, se provee un método para tratar la osteoporosis, que
comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente
efectiva de un análogo del PTHrP, suficiente para activar al
receptor del PTH/PTHrP y al receptor de la PTH-2 de
dicho paciente. En una modalidad preferida, el análogo del PTHrP
utilizado en el método tiene una sustitución aminoácida de
histidina por isoleucina en la posición 5 del PTHrP, así como de
fenilalanina por triptófano en la posición 23 del PTHrP. En una
modalidad particular, el análogo del PTHrP es [Ile^{5},
Trp^{23}]PTHrP-(1-36). Pueden utilizarse
dosificaciones y formas de administración similares a las descritas
anteriormente para el antagonista del PTHrP, para la administración
de un agonista del PTHrP, por ejemplo, para el tratamiento de
condiciones tales como la osteoporosis.
Por "agonista" se desea un ligandos capaz de
mejorar o de potenciar una respuesta celular mediada por el
receptor de la PTH-2 receptor. Por
"antagonista" se desea un ligandos capaz de inhibir una
respuesta celular mediada por el receptor de la
PTH-2. Si cualquier candidato "agonista" o
"antagonista" de la presente invención puede mejorar o inhibir
tal respuesta celular, es algo que puede determinarse utilizando
ensayos de enlazamiento o una respuesta celular ligando/receptor de
una proteína conocida en el estado de la técnica, que incluya lo
descrito en otra parte en esta solicitud.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: The General Hospital Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
- Fruit Street
\vskip0.500000\baselineskip
- Boston, MA 02114
\vskip0.500000\baselineskip
- Estados Unidos de Norte América
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos Análogos del Péptido Relacionado con la Hormona Paratiroidea
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Sterne, Kessler, Goldstein and Fox P.L.L.C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1100 New York Avenue, N.W., Suite 600
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Washington
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: DC
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de Norte América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 20005
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA EN QUE PUEDE LEERSE EN EL COMPUTADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICTUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US97/13360
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 30-JULIO-1997
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/025.471
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 31-JULIO-1996
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Golstein, Jorge A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 29.021
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DEL EXPEDIENTE: 0609.431PC01/JAG/KRM
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN SOBRE LOS MEDIOS DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (202) 371-2600
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Teléfax: (202) 371-2540
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu
Gly Lys His Leu Asn}
\sac{Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys
Leu Gln Asp Val His}
\sac{Asn Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys
Gly Lys Ser Ile Gln}
\sac{Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu
Ile Ala Glu Ile His}
\sac{Thr Ala Glu Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys
Gly Lys Ser Leu Asn}
\sac{Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys
Leu Gln Asp Val His}
\sac{Asn Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys
Gly Lys Ser Ile Gln}
\sac{Asp Leu Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys
Leu Gln Asp Val His}
\sac{Asn Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys
Gly Lys Ser Ile Gln}
\sac{Asp Leu Arg Arg Arg Glu Trp Leu Arg Lys Lys
Leu Gln Asp Val His}
\sac{Asn Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys
Gly Lys Ser Ile Gln}
\sac{Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu Arg Lys Lys
Leu Gln Asp Val His}
\sac{Asn Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu
Gly Lys His Ile Gln}
\sac{Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu
Ile Ala Glu His Thr}
\sac{Tyr}
Claims (12)
1. Un análogo de péptido (PTHrP) relacionado con
la hormona paratiroidea que tiene la secuencia de aminoácidos de la
SEQ ID NO: 2 que es un agonista del receptor de la hormona
paratiroidea (PTH)-2, así como un agonista del
receptor del PTH/PTHrP, en donde la secuencia de aminoácidos está
alterada en los residuos aminoácidos 5 y 23.
2. El análogo del péptido PTHrP de la
reivindicación 1, en donde dicha alteración en el residuo
aminoácido 5 del PTHrP comprende una sustitución de aminoácidos de
histidina por isoleucina, y dicha alteración en el residuo
aminoácido 23 del PTHrP comprende una sustitución de aminoácidos de
fenilalanina por triptófano.
3. Un análogo del PTHrP que tiene la secuencia de
aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 con las siguientes modificaciones:
[Ile^{5}, Trp^{23}]PTHrP-(1-36).
4. Un análogo del PTHrP que tiene la secuencia de
aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que es un antagonista selectivo del
receptor de la PTH-2, así como un agonista del
receptor del PTH/PTHrP, en donde la secuencia de aminoácidos está
alterada en el residuo aminoácido 23.
5. El análogo del PTHrP de la reivindicación 4,
en donde dicha alteración en el residuo aminoácido 23 del PTHrP
comprende una sustitución de aminoácidos de fenilalanina por
triptófano.
6. Un análogo del PTHrP que tiene la secuencia de
aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 con las siguientes modificaciones:
[Trp^{23}]PTHrP-(1-36).
7. El uso del análogo del PTHrP de la
reivindicación 4, suficiente para inhibir la activación del
receptor de la PTH-2, en la elaboración de un
medicamento para tratar un desorden médico que resulta de una
acción alterada o excesiva del receptor de la
PTH-2.
8. El uso del análogo del PTHrP de la
reivindicación 5, suficiente para inhibir la activación del
receptor de la PTH-2, en la elaboración de un
medicamento para tratar un desorden médico que resulta de una
acción alterada o excesiva del receptor de la
PTH-2.
9. El uso del análogo del PTHrP de la
reivindicación 6, suficiente para inhibir la activación del
receptor de la PTH-2, en la elaboración de un
medicamento para tratar un desorden médico que resulta de una
acción alterada o excesiva del receptor de la
PTH-2.
10. El uso del análogo del PTHrP de la
reivindicación 1, suficiente para activar al receptor del PTH/PTHrP
y al receptor de la PTH-2, en la elaboración de un
medicamento para tratar la osteoporosis.
11. El uso del análogo del PTHrP de la
reivindicación 2, suficiente para activar al receptor del PTH/PTHrP
y al receptor de la PTH-2, en la elaboración de un
medicamento para tratar la osteoporosis.
12. El uso del análogo del PTHrP de la
reivindicación 3, suficiente para activar al receptor del PTH/PTHrP
y al receptor de la PTH-2, en la elaboración de un
medicamento para tratar la osteoporosis.
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