ES2248876T3

ES2248876T3 - Utilizacion y preparacion de tejido metanefrico embrionario no humano.

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Publication number: ES2248876T3
Application number: ES98300045T
Authority: ES
Inventors: Marc R. Hammerman
Original assignee: University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1997-01-06
Filing date: 1998-01-06
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2018-01-06
Also published as: EP0853942B1; EP0853942A2; DK0853942T3; DE69831278D1; DE69831278T2; US5976524A; ATE302610T1; EP0853942A3

Abstract

SE APORTA TEJIDO EMBRIONARIO METANEFRICO QUE SE HA OBTENIDO DE UN DONANTE EN UNA ETAPA ADECUADA DE DESARROLLO EMBRIONARIO PARA USO EN UN METODO PARA AUMENTAR LA MASA DE NEFRONAS FUNCIONANTES DE UN RECEPTOR MEDIANTE LA IMPLANTACION DE DICHO TEJIDO METANEFRICO JUNTO AL OMENTUM DEL RECEPTOR O BAJO LA CAPSULA RENAL DEL RIÑON DEL RECEPTOR BAJO CONDICIONES QUE PERMITEN AL TEJIDO METANEFRICO REVASCULARIZARSE Y DESARROLLARSE PARA FORMAR ORINA.

Description

Utilización y preparación de tejido metanéfrico embrionario no humano.

Los riñones son órganos excretores que tienen la función general de mantener la constancia química y física de la sangre y otros fluidos corporales. Retiran el agua superflua y biológicamente inservible así como materiales tóxicos que se acumulan en la sangre.

En vertebrados, los riñones son órganos pares, con forma de judía, teniendo cada riñón un borde lateral o externo convexo, y un borde medial, interno que es cóncavo en el centro y convexo hacia cada extremidad. La parte central del borde medial tiene una fisura profunda llamada el hilio, a través del cual se extienden los vasos, nervios y el uréter. El hilio se expande en la cavidad central llamada el seno renal. Cada riñón está rodeado por una cápsula fibrosa, lisa y está compuesto de una medula interna rodeada por una sustancia cortical externa. La sustancia medular consta de masas cónicas estriadas llamadas pirámides renales, ordenadas de tal modo que sus bases están dirigidas hacia el borde lateral, mientras que sus ápices convergen hacia el seno renal. La sustancia cortical esta inmediatamente por debajo de la cápsula fibrosa y se arquea sobre las bases de las pirámides y se extiende entre las pirámides adyacentes hacia el seno renal.

Microscópicamente, el riñón está compuesto de varias unidades llamadas nefronas. El riñón humano esté compuesto de aproximadamente 1,25 millones de nefronas. Cada nefrona tiene una estructura compleja con dos partes principales: el glomérulo y el túbulo renal. El glomérulo es un conjunto de capilares no anastomosantes localizados en la sustancia cortical que deriva de una artriola llamada el vaso aferente que se ramifica para formar los bucles capilares. Los capilares se unen para formar la arteriola eferente. El glomérulo está rodeado por un saco membranoso de doble pared llamado la cápsula de Bowman, que es parte del túbulo renal. El túbulo renal está localizado parcialmente en la sustancia cortical, donde sigue un transcurso sinuoso enrollado y forma la capsula de Bowman, y parcialmente en la sustancia medular, en la que las circunvoluciones del túbulo desaparecen. Según entra en la sustancia medular, se vuelve lineal, y se hunde a una profundidad variable, y después se dobla para formar el bucle de Henle y asciende otra vez a la sustancia cortical donde se vuelve tortuoso y termina en un túbulo colector que se abre en un uréter. El uréter se abre en la vejiga urinaria.

Durante la embriogenesis, los rudimentos de los riñones permanentes, los metanefros, hacen su aparición durante la quinta semana de gestación en seres humanos, durante el dia 12 del desarrollo de rata embrionaria y durante el dia 11 del desarrollo de ratón embrionario. En este estado de desarrollo, la extensión de los conductos mesonéfricos, llamados brotes uretericos, juntan en sus extremos distales, el mesodermo intermedio caudal al mesonefros, denominado blastema metanéfrico. Numerosos extensiones surgen del extremo distal del brote uretérico que se introducen radialmente en la masa adyacente del blastema metanéfrico y da lugar a los conductos colectores de los riñones. Los extremos prosimales del brote uretérico dan lugar al uréter y la pelvis renal. El blastema metanéfrico se diferencia en todas las estructuras tubulares del tubulo renal adulto con la excepción del sistema colector. El crecimiento del segmento de nefrona y la diferenciación que sucede en cultivo de órgano metanéfrico recapitula de cerca lo que sucede in vivo. Una excepción es que la vascularización de la nefrona no tiene lugar en el sistema de cultivo de órgano metanéfrico porque el origen de los vasos sanguíneos glomerulares es, en parte, extrametanéfrico. Los seres humanos desarrollan una dotación completa de nefronas en aproximadamente 35 semanas de gestación. Sin embargo, en la nefrogénesis de roedores no se completa en el momento del nacimiento, si no que continúa durante las primeras 3 semanas después del nacimien-
to, en las que las nefronas continúan su desarrollo a partir de una zona nefrogénica localizada en la periferia del riñón.

Una vez se ha completado el desarrollo renal, no se forman nuevas nefronas bajo ninguna circunstancia. Las arterias renales suministran sangre al glomérulo, donde el plasma sanguíneo se filtra a través de las paredes porosas de los capilares. El filtrado drena al sistema de tubos donde la parte principal de agua y componentes de plasma se reabsorben en los vasos sanguíneos. El liquido restante que contiene materiales biológicamente inservibles a una alta concentración es la orina que pasa a través del uréter a la vejiga urinaria. La orina contiene cientos de compuestos orgánicos, incluyendo productos de la digestión proteica y del metabolismo, urea, creatinina, ácido úrico y otros. La perdida de masa renal funcional que sucede después de injuria al riñón adulto, se compensa a corto plazo, por hipertrofia e hiperfunción de las nefronas restantes. Sin embargo, estos cambios compensatorios a menudo son transitorios y bajo algunas circunstancias mal adaptados en el sentido en el que conducen a una pérdida adicional de masa renal funcional. Cuando los riñones no pueden funcionar adecuadamente, los materiales inservibles y/o tóxicos se acumulan en la sangre y otros fluidos fisiológicos y pueden conducir a enfermedad y muerte.

El fallo renal crónico en etapa final en seres humanos aflige a más de 250.000 individuos en los Estados Unidos, la mayoría de los cuales se tratan usando diálisis. La hemodiálisis externa retira el exceso de agua y compuestos orgánicos biológicamente inservibles del paciente. Un inconveniente de este tratamiento resulta de la ausencia de selectividad del proceso de difusión a través de la membrana polimérica que se usa, que no distingue entre moléculas inservibles y moléculas útiles, tales como aminoácidos, nucleótidos, iones minerales y muchos otros componentes útiles. Adicionalmente, el tratamiento generalmente es desagradable para el paciente porque antes de la diálisis, se acumulan productos de desecho en el cuerpo, y después de la diálisis hay una falta de equilibrio de los equilibrios y procesos químicos en el cuerpo debido a la retirada de componentes esenciales. Por tanto, está asociada una morbilidad considerable al tratamiento por diálisis. Adicionalmente, la hemodiálisis es un proceso caro, que consume mucho tiempo, que mantiene al paciente conectado a la maquina de diálisis durante varias horas, tres o cuatro veces a la semana.

Otro método para tratar el fallo del riñón es reemplazar los riñones que funcionan mal por un riñón que funciona de un organismo donante. En los Estados Unidos se realizan anualmente aproximadamente 5.000 transplantes de riñón. Como los riñones son órganos pares, y sólo uno es necesario para la vida normal, pueden usarse donantes voluntarios vivos, además de donantes cadavéricos, para proporcionar el riñón donante. Los inconvenientes asociados al transplante son la disponibilidad de riñones donantes y el rechazo inmunológico del órgano donante por el receptor de transplante.

Se han hecho intentos para aumentar la masa renal por injerto de riñón alogenito. Wolf et al. transplantaron trozos de tejido metanéfrico de ratones embrionarios en túneles fabricados en la corteza renal de ratones neonatos receptores (menos de un día de edad) que aún estaban experimentado nefrogénesis [Kidney International, Vol. 38 (1990), 991-997; y American J. of Kidney Diseases, Vol. XVII, Nº 6 (junio 1991), 611-614]. De dos a cuatro semanas después, los riñones quiméricos se retiraron de los ratones. Se observó que el tejido donante contenía características maduras, de funcionamiento diferenciadas en las neuronas, lo que indicaba que sucedía diferenciación después del transplante en el tejido metanéfrico donante. Cuando se injertaban trozos de tejido metanéfrico a ratones adultos, usando el mismo procedimiento que se usó para los ratones neonatos, el tejido donante se extruía de la corteza y se parecía a un tumor mal diferenciado por debajo de la cápsula renal. Los investigadores concluyeron que el riñón neonato, que en ratones aún experimenta nefrogénesis después del nacimiento, puede facilitar la diferenciación de un implante embrionario, pero que esta capacidad está ausente en el riñón adulto completamente diferenciado.

Barakat y Harrison, J. Anat. (1971), Vol 110, 3, 393-407, seccionaron metranefros originados de ratas embrionarias (dias 15-17) y riñones de ratas recién nacidas (<1 dia), en cuartos, y transplantaron cada cuarto en un sitio subcutáneo en la pared abdominal de cada rata recién nacida o adulta. En los hospedadores recién nacidos, los injertos formaron glomérulos y túbulos completamente diferenciados 8 días después del transplante. Sin embargo, con los hospedadores adultos, hubo infiltración linfocítica significativa en los injertos después de la misma cantidad de tiempo. De 11 a 12 días, los injertos en los hospedadores adultos se remplazaron en gran medida por fibrosis. Independientemente de si el tejido renal injertado era de origen fetal o neonato, cada una de las ratas hospedadoras adultas rechazó su injerto.

Abrahamson et al. transplantaron riñones de rata embrionarios completos (dia 17) bajo la capsula renal de hospedadores de rata maduros [Laboratory Investigation, Vol. 64, Nº 5, 629-639 (1991)]. Sucedió glomerulogénesis y tubulogénesis considerable, aunque estuvieron presentes anormalidades estructurales. Aunque los riñones implantados llegaron a estar conectados a la vasculatura del hospedador, no se hicieron observaciones con respecto a si las nefronas en funcionamiento estaban presentes. Fueron evidentes signos de rechazo en todos los injertos 10 dias después del transplante.

Se han usado tratamientos de inmunosupresión para evitar el rechazo de aloinjertos. Churchill et al. realizaron experimentos donde el riñón izquierdo de ratas adultas se retiraba y se reemplazaba por riñones de rata adulta donantes [Transplantation, Vol. 49: 8-13 (1990)]. Los receptores no inmunosuprimidos rechazaron los riñones transplantados, mientras que se evitó el rechazo en receptores inmunosuprimidos con inyecciones diarias de Ciclosporina A.

Un método para aumentar la masa de nefronas de un receptor en necesidad del mismo se describe en este documento. El método comprende implantar tejido metanéfrico obtenido de un donante embrionario en un estado apropiado de desarrollo fetal bajo la capsula renal del riñón del receptor, o en un pliegue omental del receptor en condiciones que permiten que el tejido metanéfrico llegue a estar vascularizado por los vasos sanguíneos del receptor y se desarrollen para formar nefronas maduras, que funcionen en el receptor. El donante embrionario puede ser alogénico o xenogénico para el receptor.

En particular, la invención proporciona tejido metanéfrico para su uso en un método para aumentar la masa de nefronas de un receptor implantando el tejido en el omento del receptor o bajo la cápsula renal del riñón del receptor. Se proporciona tejido metanéfrico no humano para su uso en trasplante xenogénico.

Esta invención se refiere al aumento de la masa de nefronas de un animal implantando tejido metanéfrico, obtenido de un donante embrionario en un estado apropiado de desarrollo fetal, bajo la capsula renal del riñón del receptor o en el pliegue ometal del receptor. El receptor puede ser un joven, un adulto, y puede ser alogénico o xenogénico para el donante. El tejido metanéfrico implantado llega a estar vascularizado por la vasulatura del receptor, y se diferencia para formar nefronas en funcionamiento, como se evidencia por la formación de orina, que puede estar contenida en quistes en el tejido donante.

El riñón metanéfrico donante se recoge en el estado apropiado de desarrollo fetal, que es preferiblemente pronto después de que el riñón metanéfrico comience su formación y antes del desarrollo de vasos sanguíneos en el metanefros que se origina en la parte interna o externa del metanefros. Si el tejido renal embrionario se recoge antes de este momento, puede diferenciarse en tejidos no renales tal como cabello e intestino una vez se ha implantado en el tejido receptor. Sin embargo, el tejido recogido demasiado tarde en el desarrollo del riñón metanéfrico que contiene vasos sanguíneos, puede contener mas células presentadoras de antígeno y antígenos de superficie celular y, por tanto, presentar más peligro de rechazo por el receptor. Por tanto, hay una "ventana de oportunidad" durante la cual el transplante de los metanefros en el receptor da como resultado el desarrollo de riñones quiméricos viables. Preferiblemente, los metanefros recogidos contendrán blastema metanéfrico, segmentos de brote uretérico, y nefronas primitivas, y no contendrá glomérulos.

El estado de desarrollo apropiado para recoger el metanefros variará dependiendo de la especie del donante. Generalmente, el metanefros puede recogerse de 1 a 5 días después de que se forme el metanefros. Preferiblemente, el metanefros se recoge de 1 a 4 dias después de que se forme el metanefros, y mas preferiblemente de aproximadamente 2 a 4 días después de la formación del metanefros. En ratas, el metanefros se forma en el día 12,5 de un periodo de gestación de 22 dias, y en el dia 11 de un periodo de gestación de 19 días en ratones. En estas especies, una franja de tiempo adecuada en la que recoger el metanefros donante de ratones o ratas está entre el segundo y el cuarto día después de que comience la formación del metanefros. Preferiblemente, el metanefros se recoge 3 días después de que comience la formación del metanefros.

En especies que tienen un periodo de gestación más largo, la franja de tiempo durante la cual el metanefros se recoge adecuadamente después de su formación, puede ser más largo. Generalmente, la franja de tiempo en la que el metanefro se recoge será de menos de aproximadamente un quinto del periodo de gestación total del donante, preferiblemente menos de aproximadamente una séptima parte del periodo de gestación total del donante, y más preferiblemente, menos de aproximadamente una décima parte del periodo de gestación total del donante. La Tabla 1 muestra el transcurso de tiempo (en dias) del desarrollo del metanefros y el periodo gestacional en algunos verte-
brados.

TABLA 1

	Formación de Metanefros(días)	Periodo Gestacional (días)
Humano	35-37	267
Macaco	38-39	167
Cerdo	20-30	114
Cobaya	23	67
Conejo	14	32
Rata	12,5	22
Ratone	11	19
Hámster	10	16
Pollo	6	21

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Los cerdos son donantes xenogénicos preferidos para seres humanos a causa de su tamaño de órgano comparable y su disponibilidad. Los metanefros de cerdo se recogen a aproximadamente el estado de 10 mm. Esto sucede entre aproximadamente el día 20 embrionario y el día 30 embrionario.

Los metanefros se retiran quirúrgicamente en un ambiente de disección y se suspenden en medio adecuado, tal como un mezcla 1:1 de Medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio Hams F12 (Rogers et al. J.Cell Biol. 113:1447-1453 (1991), y se colocan en hielo en condiciones estériles, hasta que se transplantan. Deben transplantarse tan pronto como sea posible en el receptor, preferiblemente una hora después de la retirada del donante embrionario, y más preferiblemente, en 30 minutos. Se prefiere dejar el metanefros completo intacto para el transplante. Pueden usarse uno o más metanefros por receptor, dependiendo del aumento en la masa de nefronas que el receptor nece-
sita.

Se realiza cirugía en el receptor para exponer uno o ambos riñones. Los metenfros donantes pueden implantarse directamente en el riñón para provocar la formación de riñón quimérico, o en un pliegue del omento donde forma un riñón quimérico que funciona independientemente del riñón del receptor. El aumento es una estructura membranosa que conecta con los intestinos. Es un sitio preferido para el implante, particularmente si el tejido metanéfrico implantado pretende reemplazar un riñón que funciona mal o no funciona, que se retirará en el momento posterior al implante del tejido donante. Aunque un metanefros donante puede colocarse adyacente a cualquier parte del omento, es preferible implantarlo en un pliegue del omento que retendrá el riñón en desarrollo en el sitio del implante. Es más preferible implantar el metanefros en un pliegue del omento localizado cerca de uno de los riñones del receptor, particularmente cerca del uréter, de modo que el uréter en desarrollo del metanefros pueda conectarse fácilmente con el sistema escretor del receptor.

Cuando se implanta en el riñón del receptor, se hace una incisión, suficientemente grande para recibir el tejido donante en la capsula renal fibrosa que rodea el riñón receptor. La localización de la incisión puede ser en cualquier sitio en una parte viable del riñón receptor, pero más adecuadamente estará en un borde externo del riñón que está fácilmente accesible durante la cirugía. El tejido donante se coloca entre la cápsula y la corteza del riñón receptor.

Los metanefros implantados se dejan crecer y diferenciar en el receptor en condiciones que permiten que el tejido metanéfrico vascularice y se desarrolle para formar nefronas maduras, que funcionen. Las condiciones adecuadas pueden incluir el uso de procedimientos pre o post-operatorios para evitar el rechazo del implante o el uso de factores de crecimiento que faciliten el desarrollo y funcionamiento del tejido metanéfrico.

En algunos casos de transplante alogénico, no hay rechazo del hospedador del metanefros transplantado. Sin embargo, en el caso de transplante xenogénico, deben tomarse medidas para evitar el rechazo. Típicamente, esto se hará inmunosuprimiendo al receptor después del transplante. Los tratamientos con ciclosperina A (CSA) pueden proporcionar suficiente inmunosupresión para evitar el rechazo del tejido donante. Los regímenes de tratamiento con CSA para evitar el rechazo del transplante son conocidos en el campo médico. Las técnicas de inmunosupresión local se describen por Gruber, Transplantation 54:1-11 (1992). En la patente de EEUU Nº 5.560.911, se describen anticuerpos dirigidos frente a idiotipos en anticuerpos humanos anti animal de origen natural para su uso en la inhibición de rechazo de xenoinjerto. Los anticuerpos anti-idiotipo se inyectan en el receptor del xenoinjerto para unirse a los idiotipos expresados en anticuerpos anti-xenoinjerto. Se ejemplifican anticuerpos anti-idiotipo que se unen a anticuerpos humanos anti-cerdo, para evitar el rechazo de tejidos de cerdo transplantados por un paciente humano. También son conocidas las globulinas anti-linfocitos para la prevención del rechazo de transplante (Lacy et al. Diabetes, Vol. 30:285-291 (1981)). Como alternativa a la inmunosupresión, el metanefros implantado puede tratarse antes del transplante para reducir su antigenicidad. Los enfoques ejemplares para la reducción de inmunogenicidad de transplantes por modificación de la superficie se describen por Faustman documento WO 92/04033 (1992).

La administración de factores de crecimiento en el momento de y después del implante del tejido metanéfrico donante puede facilitar el desarrollo y función del tejido. Se sabe que numerosos factores de crecimiento son beneficios para el desarrollo del riñón. Un factor de crecimiento preferido es el factor de crecimiento tipo insulina (IGF-I), y factores de crecimiento que tienen actividad similar a IGF-I. Los factores de crecimiento se administran preferiblemente al hospedador de manera continua, por ejemplo, por bombas osmóticas subcutáneas, hasta que el tejido metanéfrico se ha desarrollado suficientemente. Como alternativa, podrían administrarse factores de crecimiento que promueven la angiogénesis, tal como el factor de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF), en el sitio del implante en el momento del implante.

Los riñones metanéfricos transplantados usando las técnicas descritas en este documento crecen, y llegan a estar vascularizados en gran parte por el receptor, para formar riñones quiméricos. Se cree que la vascularización por el receptor puede facilitar la aceptación del tejido xenogénico transplantado. Cuando se implantan en el riñón del receptor, los metanefros llegan a estar embebidos en el parénquima del riñón receptor. Los metanefros donantes comienzan a formar diversas estructuras maduras que se pueden distinguir de las estructuras en el tejido renal receptor adyacente, incluyendo glomérulos y túmulos maduros, papila renal, y uréter. Después de un periodo suficiente de desarrollo, es evidente que los glomérulos son capaces de filtrar el plasma. Por lo tanto, el implante del tejido metanéfrico contribuye a un aumento en la masa de nefronas del receptor.

Se evidencia que los glomérulos filtran por la detección de orina en los metanefros donantes. Esto puede hacerse midiendo los niveles de nitrógeno de urea y/o creatinina en fluido aspirado del tejido donante. Dicho fluido puede estar contenido en uno o más quistes asociados al tejido donante (véase Ejemplo 1). La orina esta definida en este documento como un fluido que tiene una concentración de creatinina y/o nitrógeno de urea que es más alta que la concentración de los componentes correspondientes encontrados en el plasma del receptor. La concentración diferencial varía, y se reducirá con hidratación aumentada del receptor. Sin embargo, generalmente, la concentración de creatinina en los metanefros donantes será al menos dos veces la concentración encontrada en el plasma del receptor. La concentración de nitrógeno de urea en los metanefros donantes generalmente será de al menos un cincuenta por ciento mayor que la concentración de nitrógeno de urea en el plasma del receptor.

Para facilitar la externalización de la orina que se forma en el tejido renal donante de riñones quiméricos, puede usarse un procedimiento de anastomosis de uréter a uréter convencional usado para conectar el uréter de los riñones donantes con el del riñón receptor. Cuando se implantan los metanefros en el omento del receptor, la externalización de orina puede conseguirse uniendo el uréter directamente con el uréter o la vejiga del receptor. Estos procedimientos, y otros procedimientos conocidos en la técnica para la externalización de la orina se resumen en Adult and Pediatric Urology, 3a edición, Guillenwater, et al., Eds. 987-994 y 2369-2375 (1996). En algunos casos, puede no ser necesaria la cirugía después del transplante ya que los riñones donantes transplantados intrarrenales pueden incorporarse en el sistema colector del hospedador.

Para que pueda entenderse más completamente la invención descrita en este documento, se exponen los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos son para propósitos ilustrativos sólo, y no para interpretarse como limitantes del alcance de la invención de ningún modo.

Ejemplo 1 Transplante alogénico de metanefros en riñón hospedador Métodos de transplante

Se retiraron quirúrgicamente metanefros completos, con cápsulas renales intactas en un ámbito de disección, de embriones de rata Sprague-Dawley E15 (Harlan, Indianapolis IN), y se suspendieron en solución salina en hielo en condiciones estériles. Quince minutos después de la retirada, se implantaron cuatro metanefros por receptor bajo la cápsula de riñones normales de ratas Sprague-Dawley hembra normales exogámicas de seis semanas de edad
(NL).

Algunas de las ratas receptoras habían experimentado nefrectomía contralateral (UNX) o nefrectomía unilateral e infarto de riñón contralateral de la mitad (1 1/2 NX) usando los procedimientos descritos en S.A. Rogers et al., J. cell. Biol., 113:1447 (1991). Los metanefros transplantados fueron aproximadamente de 700 \mum de diámetro y, como se esperaría para este estado de desarrollo, contenían segmentos de brote uretérico y algunas nefronas en desarrollo, pero no glomérulos. Cuando se observaron, las ratas receptoras recibieron Ciclosporina A (CSA) comenzando después del transplante (5 mg/kg de peso corporal por día inyectado por vía subcutánea) en vehículo (aceite de cacahuete). Como control, sólo se inyectó vehículo.

Desarrollo Estructural de Metanefros

Cuatro o seis semanas después, se retiraron los riñones de las ratas. Cuando se examinaron los riñones del receptor después del transplante, los quistes que contenían fluido transparente rodeaban los sitios donde los metanefros se transplantaron bajo la cápsula de ratas NL, UNX o 1 1/2 NX. Las estructuras que se parecen a riñones pequeños de aproximadamente 7 mm (7000 \mum) de diámetro estaban presentes bajo los quistes y estaban embebidos en el riñón receptor más grande. Por tanto, el diámetro de los metanefros transplantados había aumentado 10 veces reflejando un aumento de 1000 veces el volumen. El examen histológico de secciones fijadas embebidas en parafina, y cortadas de la masa de tejido teñido con hematoxilina y eosina reveló que las estructuras estaban integradas en el parénquima de riñones receptores, y que estaban presentes grupos de linfocitos en la superficie de contacto del transplante-
receptor.

Los metanefros transplantados en riñones de ratas tratadas con vehiculo que habían experimentado 1 ½ NX experimentaron crecimiento, desarrollo y vascularización in vivo. Contenían glomérulos y túbulos maduros que podían distinguirse de los glomérulos y túbulos en el tejido renal receptor adyacente por su tamaño más pequeño y diferentes características de tinción en secciones de parafina teñidas con hematoxilina y eosina. Los vasos sanguíneos estaban presentes en los metanefros transplantados. Algunos eran identificables como arterias. Los glomérulos en metanefros transplantados contenían glóbulos rojos, distinguiéndolos de los glomérulos del crecimiento de metanefros de rata en cultivo de órgano, en que la vascularización no sucede. Estaban presentes quistes en el parénquima de metanefros transplantados que contenían estructuras que se parecen a papilas renales. Otras estructuras estaban revestidas con epitelio transitorio característico del uréter. Los linfocitos se acumularon alrededor de la periferia de los metanefros transplantados, pero no hubo evidencia de rechazo de elementos tubulares o vasculares. Se observó crecimiento, desarrollo y vascularización similares de los metanefros transplantados en ratas que habían experimentado UNX o en riñones de ratas NL.

Los metanefros transplantados en riñones de ratas 1 1/2 NX tratadas con CSA se examinaron 4 semanas después del transplante. Los resultados de dichos transplantes fueron similares a los de riñones de ratas 1 1/2 NX tratadas con vehículo excepto en no se observaron linfocitos periféricos.

Integración de Metanefros Transplantados en Tejido Renal Receptor

Para determinar si los metanefros transplantados llegaron a estar integrados en los riñones receptores, se examinaron los riñones de ratas NL seis semanas después del transplante. Para aclarar la sangre del órgano, se prefundieron los riñones usando una solución de Ringer modificada inyectada en la aorta distal a las arterias renales después de la oclusión de la aorta proximal a los riñones y transección de la vena cava inferior. Esto da como resultado un palidecimiento del riñón según se reemplaza la sangre por prefundido. Normalmente, el riñón completo palidece como se describe por Bortz et al. [J. Cell Biol., 107:811 (1988)]. Sin embargo, después de la perfusión de riñones que contenían un metanefros transplantado, la sangre permanecía en la estructura transplantada con relación al riñón receptor. Muy probablemente, esto refleja una perfusión reducida en los vasos sanguíneos quiméricos (obtenidos de riñones transplantados y hospedadores) que habían demostrado suministrar los metanefros transplantados con relación a la perfusión en aquellos que suministran al riñón hospedador (Robert et al., Am. J. Physiol., 271:F744 (1996)). La sangre podía localizarse en las papilas del riñón receptor en una distribución característica de los vasa recta como se describe por Dworkin et al. (The Kidney, B.M. Brenner ed. W.B. Saunders Philadelphia, 247-260
(1996)).

Los riñones se tiñeron usando lectina tetragonobolus purpurea (TPL), como se describe por Rogers et al., Am. J. Physiol. 264:F996 (1993), que se expresa en conductos colectores de riñones de rata en desarrollo antes del nacimiento y durante varias semanas del nacimiento, pero no en conductos colectores de riñón de ratas adultas. El riñón de rata adulta, se expresa TPL en túbulos distales y ramas ascendentes gruesas medulares del bucle de Henle. El tejido de riñón receptor, TPL se expresó en la corteza en el túbulo distal y la rama ascendente gruesa medular como se esperaría. Sin embargo, TPL también se expresó en una población de conductos colectores que radian desde el metanefros transplantado hacia la papila del riñón receptor junto con los vasa recta que contienen sangre que se esperaría que proporcionaran su suministro sanguíneo, haciendo evidente que el sistema colector y los vasa recta del metanfros transplantado llegan a estar incorporada en las papilas del riñón receptor.

Ensayo de la Función del Riñón Quimérico

Los niveles de nitrógeno de urea y creatinina se midieron en fluido de quiste aspirado, y en sangre de la aorta, y orina de la vejiga de las ratas tratadas con vehiculo 1 1/2 NX usando métodos de escritos por Rogers et al. [(Am. J Physiol. 264:F917 (1993)]. Los niveles de nitrógeno de urea se aumentaron en 2,6 veces y 15 veces respectivamente, en fluido de quiste y orina de vejiga con relación a la sangre, y los niveles de creatinina se aumentaron 12 veces y 28 veces, respectivamente, como se muestra en la Tabla 2 (Todas las medidas se hicieron en el momento del sacrificio; se hicieron comparaciones usando el procedimiento de múltiple comparación descrito por C.W. Dunnett, J Am. Statistical Assoc, 50:1096 (1995)). Por tanto, tanto el nitrógeno de urea como la creatinina se concentraron en el fluido de quiste con relación a la sangre, indicando que el fluido de quiste era orina. Las concentraciones de nitrógeno de urea y creatinina en el fluido de quiste fueron significativamente inferiores a las concentraciones en la orina de vejiga, indicando que la orina del quiste no se originaba de la orina filtrada de la vejiga. Esto es consistente con los informes de que la capacidad de un riñón de 4 semanas de edad (riñón transplantado) para eliminar el nitrógeno de urea y creatinina de la sangre con relación a un riñón de 10 semanas de edad (riñón receptor), está reducida [Aperia et al., Am. J. Physiol., 228:1319 (1975)].

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TABLA 2

Plasma	Fluido de quiste	Orina de vejiga
Creatinina/ureaN*	Creatinina/ureaN*	Creatinina/ureaN*
	Ratas 1 1/2 NX (n=7)
1,14\pm08/53,8+-6,3	13,4\pm2,2/136\pm16	32,3\pm5/800\pm72
Creatinina	UreaN (nitrógeno de urea)
Plasma<fluido de quiste, p<0,01	\hskip0,8cm Plasma<fluido de quiste, p<0,01
Fluido de quiste<orina de vejiga, p<0,01	\hskip2cm Fluido de quiste<orina de vejiga, P<0,01
* mg/dl

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Ejemplo 2 Transplante xenogénico de metanefros en riñón hospedador

Los metanefros de ratón suizo N.I.H (E14) se transplantaron por debajo de la capsula renal de ratas Sprague Dawley 1 ½ NX. Cuatro semanas después del transplante, todos los metanefros que quedaron que se habían implantado en los riñones de ratas que no recibieron tratamiento con CSA eran una masa de tejido fibrótico. Sin embargo, en receptores tratados con CSA, los metanefros crecieron, se vascularizaron y se desarrollaron. La presencia de una cavidad recubierta urotelial al que contenía una papila renal en los metenefros transplantados indicó que sucedía filtración glomerular en el tejido renal donante.

Ejemplo 3 Transplante alogénico de metanefros en omento hospedador.

Los metanefros se diseccionaron de ratas Sprague-Dawley E15 como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1 y se implantaron en ratas Sprague Dawley UNX exogénicas de 6 semanas de edad y en ratas que no tenían tejido renal nativo retirado, en pliegues omentales cerca de los riñones del receptor. Las ratas receptoras no recibieron ninguna supresión después del transplante.

Después de 6 semanas, los metanefros transplantados se retiraron y se examinaron. Habían asumido una forma de tipo riñón in situ, tenían uréteres intactos y eran aproximadamente una tercera parte del diámetro de los riñones nativos. Las secciones de metanefros transplantados se prepararon y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Estaban presentes tanto tejido cortical como medular. Las cortezas contenían glomérulos bien desarrollados que contenían glóbulos rojos, tubulos proximales con membranas con borde en cepillo bien desarropas, y túbulos distales. Las medulas contenían conductos colectores bien desarrollados. Los uréteres estaban revestidos con epitelio transitorio. Las acumulaciones raras de linfocitos se observaron, pero no hubo evidencia de rechazo de elementos tubulares o vasculares.

En contraste con el descubrimiento en ratas que experimentaron nefrectomía unilateral en el momento del implante, hubo poco crecimiento o ninguno de los metanefros cuando se implantaron en ratas que no tenían tejido nativo retira-
do.

Ejemplo 4 Conexión de metanfros implantado a la vejiga y demostración de eliminación de inulina en metenefros transplantados

Los metanefros se diseccionaron de embriones de ratas Sprague-Dawley E15 como se ha descrito previamente en los Ejemplos 1 y 3 y se implantaron en 45 minutos en el omento de ratas Sprague Dawley UNX (hospedadoras) hembra de 6 semanas de edad anestesiadas. Durante la misma cirugía, las ratas hospedadoras habían experimentado nefrectomía unilateral usando métodos descritos por Miller et al., Am. J. Physiol 259:747-751 (1990).

Seis semanas después del transplante, se realizó ureteroureterostomía de extremo a extremo usando una técnica microvascular (sutura 10-0 interrumpida) entre el uréter de un metanfros implantado y el uréter del riñón que se había retirado. Cuatro semanas después todo el tejido renal nativo restante (el riñón contra lateral) se retiró de las ratas hospedadoras, después de lo cual se midieron las eliminaciones de inulina y creatinina en las ratas conscientes después del remplazamiento de un catéter de vejiga con un hueco interior y revestimiento intravenoso como se ha descrito por Miller et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 89:11876-11880 (1992). Las medidas iniciales para inulina se realizaron en orina y muestras de sangre obtenidas antes del inicio de las infusiones de inulina. Estos valores "de fondo" se sustrajeron de las medidas realizadas después del inicio de infusión de inulina. La infusión de inulina se inició sólo después de la retirada de todo el tejido renal nativo restante y el drenaje de toda la orina restante en la vejiga (10-20 \mul). Sólo los metanefros implantados permanecieron conectados a la vejiga. Como control, se hizo un intento para medir las eliminaciones en ratas que habían experimentado nefrectomía bilateral, pero no tenían metanefros transplantados conectados a la vejiga. Sin embargo, en contraste con el caso en ratas con un metanefros transplantado conectado a la vejiga (resultados analizados a continuación), no apareció orina en el catéter de la vejiga después de una recogida de 3 horas de tiempo en ratas que no tenían metanefros transplantado.

Las creatininas en plasma en el momento de las medidas (después de la retirada de todo el tejido renal nativo) fueron 1,3\pm0,06mg/dl, aproximadamente 3 veces el normal. Las eliminaciones de inulina y creatinina fueron 0,11\pm0,02 y 0,65\pm0,18 \mul/min/100 g de peso corporal respectivamente (media \pm SE). El peso corporal medio de las ratas fue 238\pm3,0 g. El peso medio de los metenefros fue 71\pm15 mg. El volumen medio de orina recogida durante 3 horas fue 49\pm13 \mul. Las eliminaciones de inulina y creatinina en un grupo de 5 ratas normales de tamaño similar fueron 0,92\pm0,14 y 0,84\pm0,12 ml/min/100 g respectivamente. Los resultados se muestran en la Tabla 3 a continua-
ción.

Ejemplo 5 Reducción adicional de la masa renal del hospedador en el momento del implante o administración de IGF-I al hospedador para potenciar el desarrollo de metanefros

Los pesos de los metanefros transplantados en el omento de ratas que habían experimentado nefrectomía unilateral e infarto contralateral parcial (reducción adicional de la masa renal de hospedador) en el momento del implante se aumentaron más de 2 veces (145 vs 71 mg) y las eliminaciones de inulina expresadas por gramo de peso de riñón se aumentaron en más de 12 veces en comparación con los valores obtenidos en ratas que experimentaron nefrectomía unilateral sin infarto renal contralateral parcial. Los volúmenes de orina (145\pm24 \mul/3 horas) también se aumentaron significativamente (p<0,005, ensayo t de Student). Estas observaciones, junto con el descubrimiento de que el crecimiento y el desarrollo de metanefros transplantados no sucede si no se retira la masa renal en nativa en el momento del implante, indican que el estimulo que da como resultado el crecimiento renal compensatorio después de la reducción de la masa renal (véase Miller et al., Am.J. Physiol. 259: 747-741 (1990)) también puede potenciar el crecimiento y desarrollo de metanefros transplantados.

En experimentos adicionales, se implantaron metanefros en ratas que experimentaron nefrectomía unilateral, usando los mismos procedimientos que los descritos en el Ejemplo 4, con la adicción de comenzando en el momento de la ureteroureterostomía, las ratas recibieron infusión continua de factor de crecimiento tipo insulina (IGF-I) (60 \mul/día/animal de IGF-I humana recombinante; Genentech, So. San Francisco, USA). Como se muestra en la Tabla 3 a continuación, la administración del factor de crecimiento potencia la eliminación de inulina de los metanefros transplantados:

TABLA 3

	Imp/UNX	Imp/UNX+	Imp/IGF	Normal
				(2 riñones)
	(N=7)	(N=3)	(N=4)	(N=5)
Creatinina (mg/ dl)	1,3\pm0,06	1,2\pm0,05	1,2\pm0,05	0,5\pm0,02
Masa renal (g)	0,97\pm0,02	0,15\pm0,02*	0,10\pm0,02	3,16\pm0,6
Eliminación de Inulina
(\mul/ min/ 100 g)	0,11\pm0,02	0,97\pm0,33**	0,65\pm0,22***	920\pm140
(\mul/ min/ g KW)	2,42\pm0,70	30,1\pm8,7**	17,1\pm3,5***	750
Eliminación de Creatinina
(\mul/ min/ 100 g)	0,65\pm0,18	1,2\pm0,4	3,0\pm0,1****	840\pm120
(\mul/ min/ g KW)	26,7\pm6,9	31,6\pm4,5	77,2\pm10****	710
\begin{minipage}[t]{155mm} Implante/UNX v. implante/UNX+: * p<0,05;** p< 0,01, procedimiento de comparación múltiple (C.W. Dunnett, supra).\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{155mm} Implante/UNX v. implante/IGF: *p<0,01; *p< 0,01, procedimiento de comparación múltiple (C.W. Dunnett, supra*).\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{155mm} KW, peso de riñón; UNX, nefrectomía unilateral; UNX+, nefrectomía unilateral más infarto renal contralateral parcial.\end{minipage}
Los datos son la media \pm SE.

Claims

1. Tejido metanéfrico embrionario que se ha obtenido de un cerdo en un cerdo en un estado adecuado de desarrollo embrionario para el uso para aumentar la masa de nefronas en funcionamiento de un receptor humano implantando el tejido metanéfrico cerca del omento del receptor humano o bajo la cápsula renal del riñón del receptor humano en condiciones que permiten que el tejido metanéfrico se vascularice y se desarrolle para formar orina.

2. El tejido metanéfrico embrionario de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tejido metanéfrico embrionario contiene blastema metanéfrico, segmentos o brote uretérico, y nefronas primitivas, pero que no contiene glomérulos.

3. El tejido metanéfrico embrionario de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el tejido metanéfrico comprende al menos un metanefros completo con cápsula renal intacta.

4. El tejido metanéfrico embrionario de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el tejido metanéfrico se obtiene antes del desarrollo de los vasos sanguíneos en el tejido metanéfrico.

5. El tejido metanéfrico embrionario de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el tejido metanéfrico es de un cerdo a aproximadamente el estado de 10 mm.

6. El tejido metanéfrico embrionario de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el tejido metanéfrico es de un cerdo de entre aproximadamente el día 20 embrionario al día 30 embrionario.

7. Uso de tejido metanéfrico embrionario que se ha obtenido de un embrión no humano en la preparación de tejido metanéfrico donante para tratar una enfermedad renal en un ser humano.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el tejido metanéfrico embrionario comprende blastema metanéfrico, segmentos de brote uretérico y nefronas primitivas pero no comprende glomérulos.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 7 o reivindicación 8, en el que el tejido metanéfrico embrionario comprende al menos un metanefros completo con cápsula renal intacta.

10. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que el tejido metanéfrico embrionario se obtiene antes del desarrollo de los vasos sanguíneos en el tejido metanéfrico.

11. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el tejido metanéfrico embrionario se obtiene de 1 a 5 días después de la formación de metanefros.

12. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el tejido metanéfrico embrionario se obtiene de 2 a 4 días después de la formación de metanefros.

13. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el tejido metanéfrico embrionario es de un cerdo.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el tejido metanéfrico embrionario es de un cerdo a aproximadamente el estado de 10 mm.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el tejido metanéfrico embrionario es de un cerdo de entre aproximadamente el día 20 embrionario y el día 30 embrionario.

16. Uso del factor de crecimiento tipo insulina (IGF-I) en la preparación de un medicamento para potenciar el crecimiento y desarrollo de tejido metanéfrico embrionario que se ha obtenido de un embrión no humano y se ha implantado en un receptor humano.