ES2248958T3 - Material ceramico para osteoinduccion que comprende microporos en la superficie de macroporos. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un material biológico osteoinductor, basado en un material cerámico y que tiene una porosidad total de entre 20 y 90%, en la que los macroporos presentes tienen una dimensión de ente 0,1 y 1,5 mm, y donde los microporos presentes tienen una dimensión de entre 0,05 y 20 {mu}m. La invención se refiere también a un procedimiento para preparar dicho material biológico osteoinductor.

Description

Material cerámico para osteoinducción que comprende microporos en la superficie de macroporos.

La presente invención se refiere a un material osteoinductivo y a un proceso para la preparación de dicho material.

Se sabe que los fosfatos cálcicos, tal como la hidroxiapatita, son osteoconductivos, o bioactivos. Esto significa que actúan como una plantilla a lo largo de la cual tiene lugar el crecimiento óseo. Además, la formación ósea puede tener lugar directamente en la superficie del material, obteniéndose una unión fuerte con el tejido óseo. La osteoinducción, por otro lado, se considera una propiedad de los materiales que inducen la formación de tejido óseo. En el pasado, esta propiedad sólo se había descrito en relación con materiales que contienen factores osteoinductivos proteináceos, tales como las proteínas óseas morfogenéticas (BMP).

Sin embargo, recientemente, se han dado a conocer varios estudios que indican una posible capacidad osteoinductiva de los fosfatos cálcicos cuando se implantan intramuscularmente en perros o mandriles. En general, se asume que la presencia de una estructura porosa y una geometría específica del implante desempeña un papel crucial en el carácter osteoinductivo del implante.

Yamasaki y otros, en Biomaterials, 1992, vol. 13, no. 5, 308-312, han descrito que han encontrado formación ósea heterotópica alrededor de los gránulos cerámicos de hidroxiapatita porosa, pero no alrededor de los gránulos densos. Los gránulos porosos tienen un tamaño entre 200 y 600 \mum, y una microporosidad continua e interconectada que varía en diámetro desde 2 a 10 \mum.

La solicitud de patente europea 0 267 624 da a conocer una prótesis ósea basada en fosfato cálcico poroso que tiene poros abiertos con un tamaño medio de 0,01-2.000 \mum y poros cerrados con un tamaño medio de 0,01-30 \mum. Se dice que la prótesis tiene tanto una buena viabilidad como un grado adecuado de biocompatibilidad.

La patente de Estados Unidos 5.017.518 da a conocer un proceso para la producción de materiales cerámicos de fosfato cálcico con una superficie porosa. El proceso comprende la preparación de materiales cerámicos de fosfato cálcico no tratado, que comprende una mezcla de hidroxiapatita y fosfato tricálcico, y el tratamiento de dichos materiales cerámicos no tratados con una solución ácida para disolver selectivamente el fosfato tricálcico en la superficie de los materiales cerámicos.

En el Journal of Material Science: Materials in Medicine, vol. 9, no. 7, Julio 1998, páginas 381-384, Yokozeki y otros han descrito un injerto óseo de fosfato beta-tricálcico. El injerto se prepara por sinterización a 900ºC y tiene microporos de 0,2-0,5 \mum y macroporos de 0,15-0,4 mm, y una porosidad del 60%.

La solicitud de patente europea 0 410 010 da a conocer un implante óseo de hidroxiapatita con microporos que tienen un tamaño inferior a 5 \mum, macroporos que tienen un tamaño superior a 100 \mum, y una porosidad de hasta un 80%.

La patente de Estados Unidos 4.195.366 da a conocer un material cerámico de whitlockita policristalina sin poros o en forma porosa. El material cerámico tiene un tamaño de cristal de 0,3-3 \mum.

La patente de Estados Unidos 4.629.464 da a conocer un material de relleno óseo compuesto de una hidroxiapatita sinterizada con microporos de 0,02-0,1 mm, macroporos de 0,2-2,0 mm, y una porosidad del 40%. El material se prepara por sinterización de una emulsión de hidroxiapatita en presencia de peróxido de hidrógeno a una temperatura de 1100-1300ºC.

La presente invención está dirigida a proporcionar un material con una osteoinducción mejorada. Es un objetivo de la presente invención proporcionar un material que sea adecuado para utilizarse como implante en organismos vivos y funcionar como un sustituto (temporal) de tejidos óseos. Por tanto, el material debe ser tanto biocompatible como biodegradable.

Sorprendentemente, se ha encontrado que este objetivo se consigue mediante la provisión de un material cerámico que tiene tanto macroporos como microporos de tamaños específicos. Por tanto, la presente invención se refiere a un biomaterial osteoinductivo, el cual se basa en un material cerámico y tiene una porosidad total del 20 al 90%, en el que los macroporos están presentes con un tamaño que varía de 0,1 a 1,5 mm, y en el que los microporos están presentes en la superficie de los macroporos, teniendo dichos microporos un tamaño que varía de 0,05 a 20 \mum.

El material de la presente invención muestra un comportamiento osteoinductivo excelente en tejidos vivos. La formación del tejido óseo en la superficie del material de la presente invención ayuda a una aceptación favorable de un implante fabricado con dicho material. Además, la formación del tejido óseo acelera la recuperación de cualquier daño en la estructura ósea, lo cual es la razón de aplicar el implante.

Un biomaterial osteoinductivo, según la presente invención, se basa en un material cerámico. El biomaterial puede ser, por ejemplo, un implante médico formado por un material cerámico. También es posible que el biomaterial sea un implante médico de un material diferente, tal como un metal o un material polimérico, en el que el material cerámico está presente en forma de recubrimiento. Otra posibilidad se describe por M.L. Gaillard y C.A. van Blitterswijk en J. Mater. Sci., Materials in Medicine, 5:695-701 (1994). Esta posibilidad se refiere a un copolímero con propiedades de tipo hidrogel, que puede calcificarse en presencia de iones calcio y fosfato.

En principio, se puede utilizar cualquier material cerámico que sea tanto suficientemente biocompatible como suficientemente biodegradable para ser utilizado como implante en tejidos vivos. Preferiblemente, el material cerámico es capaz de proporcionar una superficie de fosfato cálcico, in vitro o in vivo, que tiene la presente estructura superficial específica. También se prefiere que el material cerámico sea capaz de adsorber agentes biológicamente activos, tales como factores de crecimiento (BMP, etc.), in vitro o in vivo. Algunos ejemplos adecuados de materiales cerámicos incluyen fosfatos cálcicos, materiales vitrocerámicos y materiales que contienen fosfatos cálcicos y/o materiales vitrocerámicos.

Preferiblemente, el material cerámico es un fosfato cálcico. Los fosfatos cálcicos preferidos son fosfato octocálcico, apatitas, tales como la hidroxiapatita y el carbonato de apatita, whitlockitas, tales como el fosfato \alpha-tricálcico y el fosfato \beta-tricálcico, y combinaciones de los mismos.

Un aspecto importante de la presente invención es la estructura física del biomaterial osteoinductivo. El material comprende tanto macroporos como microporos. La porosidad total varía del 20 al 90%, preferiblemente del 40 al 70%.

Los macroporos del material tienen un tamaño de 0,1 a 1,5 mm. Preferiblemente, el tamaño de los macroporos se encuentra entre 0,2 y 1 mm. Se ha encontrado que los tamaños indicados de los macroporos tienen una influencia beneficiosa significativa en el carácter osteoinductivo del material. También se prefiere que los macroporos estén interconectados.

Los microporos del material tienen un tamaño de 0,05 a 20 \mum. De acuerdo con esta realización, se promueve en gran medida la formación de tejido óseo. Un intervalo preferido para el tamaño de los microporos está entre 0,5 y 10 \mum. Los microporos están presentes, como mínimo, en la superficie de los macroporos. La microporosidad de la superficie del material se encuentra, preferiblemente, entre el 40 y el 60%.

De acuerdo con la presente invención, el biomaterial consiste, preferiblemente, en cristales. Preferiblemente, el tamaño de los cristales es similar al tamaño de los microporos. Cuando éste es el caso, el biomaterial tiene una microrugosidad preferible. Por tanto, el tamaño de los cristales se encuentra, preferiblemente, entre 0,05 y 20 \mum, más preferiblemente entre 0,5 y 10 \mum.

El biomaterial osteoinductivo, según la presente invención, se puede utilizar ventajosamente en aplicaciones en las que se desea la formación ósea. Por tanto, el material se puede utilizar para la fabricación de implantes médicos, implantes particulares para la sustitución de huesos. El material se puede utilizar además para la fabricación de un esqueleto para la ingeniería de tejidos de un equivalente óseo.

La presente invención se refiere, además, a los procesos para la preparación de un biomaterial osteoinductivo como el descrito anteriormente.

En una primera realización, el biomaterial osteoinductivo se puede preparar mediante la sinterización de un material cerámico bajo tales condiciones, que se obtenga un biomaterial osteoinductivo como se ha descrito anteriormente. El material cerámico está, antes de la sinterización, en un estado calcinado. La sinterización se lleva a cabo, preferiblemente, a una temperatura entre 1000 y 1275ºC, se trata con una solución acuosa de un ácido orgánico y se lava para eliminar el ácido.

Preferiblemente, la sinterización se lleva a cabo a una temperatura entre 1150 y 1250ºC. La duración de la etapa de sinterización se puede elegir adecuadamente entre 6 y 10 horas, preferiblemente entre 7 y 9 horas. También se ha encontrado ventajoso llevar a cabo la sinterización mientras el material cerámico está sumergido en un polvo del material cerámico. Esto afecta de forma beneficiosa a la reactividad de la superficie del material, y, por consiguiente, también a la bioactividad (disolución, re-precipitación).

Tras la sinterización, el material se lija, preferiblemente, con papel de lija, tal como papel de lija de Si-C, para eliminar las impurezas químicas de la superficie.

A continuación, el material se trata con una solución acuosa de un ácido. Algunos ácidos adecuados, con respecto a esto, son cualquier ataque ácido, es decir, cualquier ácido que conduce a una ligera disolución del material basado en fosfato cálcico. Se ha encontrado que el uso de los siguientes ácidos conduce a resultados extremadamente favorables: ácido maleico, ácido clorhídrico, ácido fosfórico, y combinaciones de éstos. La concentración del ácido en la disolución se selecciona, preferiblemente, de manera que el pH de la solución se encuentre entre 0 y 4, más preferiblemente entre 1 y 3.

Tras el tratamiento con ácido, el cual dura, preferiblemente, entre 3 y 15 minutos, el material cerámico se lava para eliminar el ácido. El lavado se puede llevar a cabo adecuadamente utilizando etanol, agua o una combinación de
éstos.

Finalmente, se prefiere someter el biomaterial osteoinductivo obtenido a un tratamiento de esterilización, tal como una esterilización por vapor.

En una segunda realización, una emulsión de un polvo del material cerámico en una solución acuosa de un agente formador de réplicas negativas, el cual se quema o se evapora durante la sinterización, se sinteriza bajo tales condiciones que se obtiene un biomaterial osteoinductivo como el descrito anteriormente. Algunos agentes formadores de réplicas negativas adecuados incluyen peróxido de hidrógeno, levadura o bicarbonato. Preferiblemente, se utiliza peróxido de hidrógeno.

De este modo, primero, se añade el polvo a una solución acuosa del agente formador de réplicas negativas para formar una emulsión. La concentración del agente formador de réplicas negativas en la emulsión se encuentra, preferiblemente, entre 0,5 y 15% en peso, más preferiblemente entre 1 y 5% en peso, basándose en el peso de la solución. El polvo se añade en una proporción entre 0,5 y 5, preferiblemente entre 1 y 3 gramos por mililitro de solución. A continuación, la emulsión se puede colar en un molde que tenga una forma y un tamaño deseados y se sinteriza. La sinterización se lleva a cabo, preferiblemente, a una temperatura entre 800 y 1300ºC, más preferiblemente entre 1000 y 1200ºC durante un periodo de hasta 12 horas. Se debe tener precaución de que el periodo de sinterización no sea demasiado largo, ya que se obtendría un material denso.

A continuación, la presente invención será elucidada a partir de los siguientes ejemplos no restrictivos.

Ejemplo 1 Preparación de los materiales

Se prepararon cuatro discos de diferentes tipos de hidroxiapatita porosa (HA) (aproximadamente 6x6x2 mm de tamaño):

A:

HA sinterizado a 1300ºC (figura 1)

B:

HA sinterizado a 1250ºC (figura 2)

C:

HA sinterizado a 1300ºC, y tratado con ácido (figuras 3 y 5)

D:

HA sinterizado a 1250ºC, y tratado con ácido (figuras 4 y 6).

Las figuras 1-4 están ampliadas x2500; las figuras 5 y 6 están ampliadas x81,5.

Se prepararon dos tipos de bloques de fosfato cálcico poroso (18x18x25 mm) a partir de la sinterización de hidroxiapatita a 1250ºC (HA1250; color blanco) o 1300ºC (HA1300; color azul). El HA1300 se preparó por una sinterización posterior de los bloques HA1250, durante 8 horas a 1300ºC (la temperatura se aumentó desde temperatura ambiente a 100ºC por hora, se mantuvo constante durante 8 horas, y se disminuyó a 100ºC por hora hasta temperatura ambiente), mientras estaban sumergidos en polvo de HA para obtener una capa superficial reactiva. El HA1300 contenía, aproximadamente, un 10-12% en peso de fosfato de \beta-tricálcico. Se lijaron los lados de todos los bloques con papel de lija de Si-C #220 para eliminar las impurezas químicas superficiales, y se cortaron los bloques en 4 partes de aproximadamente 8x8x25 mm. A partir de cada tipo de material se prepararon un total de veinte secciones de 2 mm de grosor. Los cantos de cada material (HA1250 y HA1300) se colocaron durante 10 minutos en una solución de ácido maleico al 2,5%. A continuación, todas las secciones (40 en total) se lavaron/enjuagaron mediante ultrasonidos durante 5 minutos en alcohol (70%) y agua destilada, respectivamente, se envasaron individualmente y se esterilizaron mediante esterilización por vapor.

Diseño experimental y procedimiento quirúrgico

Se crearon cuatro cavidades en el músculo paravertebral en la espalda de 7 cabras (2 cavidades a la izquierda y 2 cavidades a la derecha de la médula espinal) para cada uno de los cuatro implantes. Los implantes se insertaron de forma aleatoria en cada cavidad, asegurando que cada tipo de implante está presente sólo una vez en cada cabra. Cada tipo de material se evaluó a partir de siete replicados para el análisis estadístico, lo cual requiere el uso de 7 cabras.

Se obtuvieron siete cabras lecheras holandesas adultas (aproximadamente 40-60 kg; sin artritis CAE/CL y examinadas por un cirujano veterinario) de un criador de ganado profesional, y se mantuvieron en cuarentena durante 4 semanas antes del experimento. Previamente a la cirugía, las cabras se pesaron y se les administró ampicilina al 20% (2 ml/50 kg de peso corporal) mediante una inyección intramuscular. El procedimiento quirúrgico se llevó a cabo bajo inhalación de anestesia general. Tras una inyección intravenosa de Tiopental, una mezcla de óxido nitroso, oxígeno y fluotano mantuvo la anestesia. Se afeitó la espalda de cada cabra en dos zonas, a izquierda y derecha, a 10 cm del cordón espinal, respectivamente. Para cada uno de los cuatro lugares de implantación intramuscular (en cada cabra), se realizó una incisión de 3 cm, aproximadamente, seguida de disección por planos hasta que se alcanzó la fascia muscular del músculo paravertebral. Se realizó una incisión de 15 mm en la fascia muscular, utilizando unas tijeras Mayo, y, posteriormente, se preparó una cavidad intramuscular por disección directa seguida de la inserción del implante. La fascia muscular y la piel se cerraron en capas separadas utilizando suturas de vicrilo 3-0. Seis meses después de la operación, los animales fueron sacrificados utilizando una sobredosis de tiopental y cloruro potásico administrada por vía intravenosa.

Tratamiento del implante e histología

Tras el sacrificio de los animales, se extrajeron los implantes. Seis implantes de cada tipo de material se colocaron en un fijador de Karnovsky durante, como mínimo, una semana (4ºC), mientras que el séptimo implante se guardó a -70ºC para su análisis bioquímico. A continuación, se deshidrataron los implantes fijados mediante una serie de etanol y se embebieron en metacrilato de metilo. Se cortaron secciones semifinas con una sierra de diamante trabada internamente modificada, perpendicular al plano longitudinal de los implantes, y se examinó por microscopia óptica la formación de nueva osificación.

Resultados

Después de los seis meses de implante, la histología puso de manifiesto que las muestras HA estaban rodeadas de una fina cápsula de tejido fibroso. El tejido muscular adyacente tenía una apariencia normal. Ninguna de las muestras HA1250 y HA1300 mostró signos de degradación. Con el tratamiento ácido de las muestras HA1250, se podían observar algunas partículas HA sueltas en la periferia del implante, mientras que con el tratamiento ácido de HA1300 se observó bastante degradación superficial. Especialmente, en la superficie externa de estos implantes, había presentes muchas partículas HA sueltas en los tejidos de alrededor. Merece la pena destacar que, particularmente, tanto en la superficie externa como en la superficie de los poros de los implantes HA1250 tratados con ácido, había presentes numerosas células gigantes mononucleares y multinucleares individuales, con morfología más o menos cubicoidal. Además, en las muestras HA1250 tratadas con ácido era aparente la nueva osificación. Este tejido óseo era de aspecto normal y contenía osteoblastos y osteocitos. Ninguno de los otros materiales mostró osificación.

Ejemplo 2 Preparación del material

Se preparó una solución 2,0 M (A) de nitrato cálcico tetrahidratado (AR) en agua destilada (AD). Se preparó una segunda solución 2,0 M (B) de hidrógeno fosfato diamónico (AR) en agua destilada (AD). Con agitación y ajustando el pH justo por encima de 8,0 utilizando amoniaco (AR), la segunda solución (B) se añadió lentamente sobre la primera solución (A) en una proporción de 1,63:1 (volumen/volumen).

La solución mezclada obtenida se guardó en un armario a temperatura ambiente durante toda la noche. Al día siguiente, se ajustó el pH de la solución por encima de 10,00 con amoníaco. La solución se dejó envejecer a temperatura ambiente.

Transcurridos 30 días, se decantó la solución transparente para dejar una emulsión que se lavó cinco veces con agua destilada (AD). A continuación, la emulsión se filtró sobre 3 papeles de filtro (2* #3 y 1* #1) bajo presión negativa. La pasta en el filtró se lavó tres veces con agua destilada (AD), teniendo cuidado de que entre cada ciclo de lavado la pasta del filtro se secara pero no se rompiera. A continuación, la pasta se secó en una estufa a 50ºC y se trituró hasta obtener un polvo. El polvo resultante se tamizó con un tamiz de malla 140 para obtener un polvo de fosfato cálcico bifásico (BCP).

El polvo BCP se mezcló con una solución acuosa al 3,0% de peróxido de hidrógeno en una proporción de 1 gramo de polvo en 1 ml de solución. La emulsión resultante se vertió en un molde que consistía en un recipiente de plástico (diámetro 38 mm, altura 60 mm). El molde se colocó en una estufa a 60ºC para la espumación y el secado. A continuación, los bloques porosos secos se extrajeron cuidadosamente del recipiente y se sinterizaron a 1100ºC durante 10 horas (la temperatura se aumentó desde temperatura ambiente hasta 1100ºC en 10 horas, y tras la sinterización, la temperatura se disminuyó hasta temperatura ambiente en el mismo intervalo de tiempo).

Experimentos con animales

Para probar la osteoinducción del fosfato de cálcico bifásico (BCP) preparado anteriormente, se implantaron cilindros de BCP en los músculos del muslo de perros durante 90 días. La osificación inducida por el BCP se analizó por histología, por microscopia electrónica de retrodispersión (BSE) y microanálisis por dispersión de energía de rayos X (EDX).

1. Preparación de los implantes

Los bloques labrados a partir del cuerpo cerámico de BCP, como el obtenido anteriormente, se pulieron en cilindros (5 mm de diámetro, 6 mm de longitud). Los implantes se lavaron por ultrasonidos con etanol al 70% durante 15 minutos, dos veces con agua desmineralizada (15 minutos cada vez), se secaron a 50ºC, y, a continuación, se esterilizaron con vapor (121ºC) durante 30 minutos antes de implantarlos.

2. Preparación de los animales

Se seleccionaron ocho perros sanos (machos y hembras, 2-6 años, 10-15 kg) y se utilizaron para probar la osteoinducción del BCP.

3. Procedimiento quirúrgico

El procedimiento quirúrgico se llevó a cabo bajo anestesia general (30 mg pentobarbital sódico/kg peso corporal) y bajo condiciones estériles. Después del afeitado, la piel se esterilizó con yodo y alcohol al 70%. Con un escalpelo, se realizó una incisión longitudinal en la piel. A partir de una separación directa, se dispuso del músculo del muslo. De nuevo, con un escalpelo, se realizó una pequeña incisión longitudinal en el músculo del muslo y se obtuvo una bolsa muscular por separación directa. Se insertó un cilindro de BCP en la bolsa muscular (se implantó un implante de BCP en cada perro). El procedimiento quirúrgico se finalizó con la sutura de la bolsa muscular y la piel en capas con hilo de seda. A los animales se les inyectaron intramuscularmente 1,6 millones de unidades de penicilina 3 veces en 3 días.

4. Obtención de las muestras

90 días después de la cirugía, se sacrificaron los animales con una sobredosis de pentobarbital sódico, y las muestras implantadas con el tejido que las rodeaba se recolectaron y se fijaron inmediatamente en una solución tamponada de formaldehído al 4% (pH=7,4). Se recogieron un total de 8 muestras de 8 perros.

5. Preparación histológica

Las muestras fijadas se lavaron con PBS (3 cambios de PBS, 2 días cada uno), a continuación se deshidrataron con una serie de soluciones de etanol (70%, 80%, 90%, 96% y 100% x2) y se embebieron en MMA. Se realizaron secciones no descalcificadas finas (10-20 micras) y se tiñeron con Azul de Metileno y Fucsia Básico para el examen histológico. Algunas secciones de recubrieron con carbono y se observaron por BSE y EDX.

6. Resultados

Incidencia de la osificación

\bullet

Se encontró osificación en todas las muestras (8 de 8)

Identificación de la osificación inducida

\bullet

Histológicamente, se encontró tejido óseo en los poros dentro de los implantes. Eran obvios la matriz ósea mineralizada, la línea de cicatrización de los osteoblastos y los osteocitos. La observación por BSE mostró que el tejido óseo estaba mineralizado y contenía lagunas de osteocitos, el análisis EDX mostró que los tejidos mineralizados estaban compuestos de Ca y P.

7. Conclusión

La implantación de tejidos blandos (tanto intramuscularmente como subcutáneamente) es el modelo de estudio de la osteoinducción. La osificación en el BCP cerámico seguida de la implantación intramuscular mostró que el BCP probado es osteoinductivo.

Ejemplo 3 Preparación del material

Se preparó una mezcla de SiO_{2} (cantidad relativa 29,4% en peso, AR, tamaño de partícula 0,5-10 micras), NaHCO_{3} (cantidad relativa 34,1% en peso, AR), CaCO_{3} (cantidad relativa 28,6% en peso, AR) y Na_{2}HPO_{4} (cantidad relativa 7,9% en peso, AR). Esta mezcla se sinterizó durante 10 horas a 1000ºC y durante 2 horas a 1300ºC. Tras el enfriamiento, se obtuvo un material vitrocerámico.

El material vitrocerámico se rompió mecánicamente en pequeñas partículas, que posteriormente se molieron con bolas en un polvo fino. El polvo se tamizó a través de un filtro de malla de 200. El polvo vitrocerámico se mezcló con una solución acuosa de peróxido de hidrógeno al 3% en una proporción de 2,4 gramos de polvo en 1 ml de solución. La emulsión resultante se vertió en un recipiente de plástico (diámetro 38 mm, altura 60 mm). El molde se colocó en una estufa a 50ºC para la espumación y el secado. A continuación, los bloques porosos secos se sinterizaron a 800-1000ºC durante 2 horas (el incremento de temperatura fue de 5ºC/min). Eventualmente, se dejó que los bloques se enfriaran de forma natural en el horno.

Experimentos con animales

Para probar la osteoinducción de los materiales vitrocerámicos preparados anteriormente, se implantaron cilindros vitrocerámicos en los músculos de muslo de perros durante 90 días. La osificación inducida por los materiales vitrocerámicos se analizó por histología, microscopia electrónica de retrodispersión (BSE) y microanálisis por dispersión de energía de rayos X (EDX).

1. Preparación de los implantes

Los bloques vitrocerámicos labrados a partir del cuerpo vitrocerámico, como el preparado anteriormente, se pulieron en cilindros (5 mm de diámetro, 6 mm de longitud). Los implantes se lavaron por ultrasonidos con etanol al 70% durante 15 minutos, dos veces con agua desmineralizada (15 minutos cada vez), se secaron a 50ºC, y, a continuación, se esterilizaron con vapor (121ºC) durante 30 minutos antes de implantarlos.

2. Preparación de los animales

Se seleccionaron ocho perros sanos (machos y hembras, 2-6 años, 10-15 kg) y se utilizaron para probar la osteoinducción del material vitrocerámico.

3. Procedimiento quirúrgico

El procedimiento quirúrgico se llevó a cabo bajo anestesia general (30 mg pentobarbital sódico/kg peso corporal) y bajo condiciones estériles. Después del afeitado, la piel se esterilizó con yodo, etanol y etanol al 70%. Con un escalpelo, se realizó una incisión longitudinal en la piel. A partir de una separación directa, se dispuso del músculo del muslo. De nuevo, con un escalpelo, se realizó una pequeña incisión longitudinal en el músculo del muslo y se obtuvo una bolsa muscular por separación directa. Se insertó un cilindro vitrocerámico en la bolsa muscular (se implantó un implante en cada perro). El procedimiento quirúrgico se finalizó con la sutura de la bolsa muscular y la piel en capas con hilo de seda. A los animales se les inyectaron intramuscularmente 1,6 millones de unidades de penicilina durante 3 días.

4. Obtención de las muestras

90 días después de la cirugía, los animales se sacrificaron con una sobredosis de pentobarbital sódico, y las muestras implantadas con el tejido que las rodeaba se recolectaron y se fijaron inmediatamente en una solución tamponada de formaldehído al 4% (pH=7,4). Se recogieron un total de 8 muestras de 8 perros.

5. Preparación histológica

Las muestras fijadas se lavaron con PBS (3 cambios de PBS, 2 días cada uno), a continuación se deshidrataron con una serie de soluciones de etanol (70%, 80%, 90%, 96% y 100% x2) y se embebieron en MMA. Se realizaron secciones no descalcificadas finas (10-20 micras) y se tiñeron con Azul de Metileno y Fucsia Básico para el examen histológico. Algunas secciones de recubrieron con carbono y se observaron por BSE y EDX.

6. Resultados

Incidencia de la osificación

\bullet

Se encontró osificación en 6 de las 8 muestras

Identificación de la osificación inducida

\bullet

Histológicamente, se encontró tejido óseo en los poros dentro de los implantes. Eran obvios la matriz ósea mineralizada, la línea de cicatrización de los osteoblastos y los osteocitos. La observación por BSE mostró que el tejido óseo estaba mineralizado con lagunas de osteocitos, el análisis EDX mostró que los tejidos mineralizados estaban compuestos de Ca y P.

7. Conclusión

La implantación de tejidos blandos (tanto intramuscularmente como subcutáneamente) es el modelo de estudio de la osteoinducción. La osificación en el material vitrocerámico seguida de la implantación intramuscular mostró que el material vitrocerámico probado es osteoinductivo.

Claims (19)

1. Biomaterial osteoinductivo, que se basa en un material cerámico y que tiene una porosidad total del 20 al 90%, en el que los macroporos están presentes con un tamaño que varía entre 0,1 y 1,5 mm, y en el que los microporos están presentes en la superficie de los macroporos, teniendo dichos microporos un tamaño que varía entre 0,05 y 20 \mum.

2. Biomaterial osteoinductivo, según la reivindicación 1, en el que la macroporosidad se encuentra entre 0,2 y 1 mm.

3. Biomaterial osteoinductivo, según la reivindicación 1 ó 2, en el que la microporosidad se encuentra entre 0,5 y 10 \mum.

4. Biomaterial osteoinductivo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la porosidad total se encuentra entre el 40 y el 70%.

5. Biomaterial osteoinductivo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que está compuesto de cristales que tienen un tamaño de cristal entre 0,05 y 20 \mum, preferiblemente entre 0,5 y 10 \mum.

6. Biomaterial osteoinductivo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el material cerámico es un fosfato cálcico, un material vitrocerámico o un material que contiene un fosfato cálcico y/o un material vitrocerámico.

7. Biomaterial osteoinductivo, según la reivindicación 6, en el que el material cerámico es un fosfato cálcico seleccionado del grupo que consiste en fosfato octocálcico, apatitas, tales como la hidroxiapatita y el carbonato de apatita, whitlockitas, tales como el fosfato \beta-tricálcico y el fosfato \alpha-tricálcico, y combinaciones de éstos.

8. Material osteoinductivo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la microporosidad de la superficie del material está entre el 40% y el 60%.

9. Proceso para la preparación de un biomaterial osteoinductivo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se sinteriza un material cerámico a una temperatura entre 1000 y 1275ºC, se trata con una solución acuosa de un ácido, y se lava para eliminar el ácido.

10. Proceso, según la reivindicación 9, en el que el ácido se selecciona del grupo que consiste en ácido maleico, ácido clorhídrico, ácido fosfórico y combinaciones de éstos.

11. Proceso, según las reivindicaciones 9 ó 10, en el que el pH de la solución acuosa se encuentra entre 0 y 4.

12. Proceso, según las reivindicaciones 9-11, en el que el lavado se lleva a cabo utilizando etanol, agua o una combinación de éstos.

13. Proceso para la preparación de un biomaterial osteoinductivo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que se prepara una emulsión de un polvo de un material cerámico en una solución acuosa de un agente formador de réplicas negativas, emulsión que se sinteriza a una temperatura de 800-1200ºC.

14. Proceso, según la reivindicación 13, en el que el agente formador de réplicas negativas es peróxido de hidrógeno.

15. Proceso, según las reivindicaciones 9-14, en el que el biomaterial osteoinductivo se esteriliza.

16. Biomaterial osteoinductivo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, obtenible mediante un proceso, según cualquiera de las reivindicaciones 9-15.

17. Implante médico que comprende un biomaterial osteoinductivo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 ó 16.

18. Esqueleto para la ingeniería de tejidos de un equivalente óseo que comprende un biomaterial osteoinductivo, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 ó 16.

19. Utilización de un biomaterial, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 ó 16, en la fabricación de un medicamento para inducir la formación de tejidos óseos en organismos vivos, preferiblemente mamíferos.