ES2248995T3 - Compuestos de espisulosina que tienen actividad antitumoral. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica conteniendo una cadena larga, cadena lineal de 2-amino-3-hidroxialcano, junto con un soporte farmacéuticamente aceptable.

Description

Compuestos de espisulosina que tienen actividad antitumoral.

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas de compuestos de espisulosina. Además se refiere al tratamiento de tumores, y proporciona nuevos compuestos citotóxicos y composiciones farmacéuticas para su uso frente a tumores. En un aspecto, la invención se refiere a compuestos antitumorales obtenidos a partir de organismos marinos.

Antecedentes de la invención

Ha habido un interés considerable en el aislamiento de compuestos bioactivos a partir de organismos marinos. Los procedimientos típicos implican programas de selección in vitro para valorar los extractos crudos con el fin de determinar las actividades antimicrobianas, antivirales, y citotóxicas. Ejemplos ilustrativos de compuestos bioactivos conocidos a partir de fuentes marinas incluyen brioestatinas, ecteinascidinas y además didemninas en donde la didemnina B, también conocida como aplidina, es el primer producto natural de origen marino en ensayo clínico.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona nuevas composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de tipo alcano o alqueno de cadena larga, cadena lineal, que tiene un grupo 2-amino y un grupo 3-hidroxi, junto con un soporte farmacéuticamente aceptable. El compuesto es un 2-amino-3-hidroxialcano. Preferiblemente el compuesto es un alcano o alqueno sustituido de C_{16} - C_{24}. El compuesto es preferiblemente un alcano sustituido, más preferiblemente un alcano sustituido de C_{18} - C_{20}. El alqueno sustituido es preferiblemente un mono- o di-alqueno sustituido, más preferiblemente un alqueno sustituido de C_{18} - C_{20}. En una realización, los compuestos tienen la estereoquímica parcial:

1

En particular, la presente invención proporciona composiciones que contienen bases de tipo esfingoide bioactivas, espisulosinas 285, 299 y 313 (1-3), esfingosina (también referida como 4-esfingenina o octadeca-4-esfingenina, 4) y dos compuestos relacionados, nonadeca-4-esfingenina (un homólogo con un carbono más, 5) y esfinga-4,10-dieno (un derivado de dehidroesfingosina, 6).

De este modo, las composiciones preferidas contienen uno o más de los siguientes compuestos preferidos:

2

espisulosina 285 (1), n = 12; espisulosina 299 (2), n = 13; espisulosina 313 (3), n = 14; así como:

3

esfingosina (4), n = 12 y nonadeca-4-esfingenina (5), n = 13; y

4

esfinga-4,10-dieno (6).

La espisulosina 285, es conocida en la literatura. El compuesto 1 y el diastereómero syn, se sintetizaron en primer lugar por investigadores croatas en la determinación de las configuraciones absolutas de bases de lípidos con o más átomos de carbono asimétricos, ver M. Pro\check{s}tenik, P. Alaupovic, Croat. Chem. Acta. 1957, 29, 393.

Se cree que los otros compuestos en las composiciones de esta invención son compuestos nuevos.

Los compuestos 1-3 muestran una citotoxicidad única frente a células de leucemia limfocítica de murino L1210. En un número de los ensayos de L1210, se observó una alteración morfológica diferente. Este efecto también se había descrito en nuestra anterior solicitud de patente provisional US de Nº 60/043.326. En esta solicitud de patente no hacemos ninguna reivindicación de patente con efecto sobre el propio L1210, y efectivamente ahora hay algunos datos preliminares que sugieren que los compuestos tales como la espisulosina 285 pueden carecer de actividad frente a los tumores de leucemia.

Se ensayó una muestra sintética de 1 frente a las células de leucemia de L1210 y mostró tanto alteración de la citotoxicidad como morfológica, actividad de la célula dirigida.

Inhibición de L1210 y actividad de la célula dirigida

Concentración	% citotoxicidad	% células dirigidas^{a}
0,5 \mug/ml	100	97
0,25 \mug/ml	99	100
0,1 \mug/ml	99	62
0,05 \mug/ml	96	71
0,025 \mug/ml	90	21
0,01 \mug/ml	45	1
* El porcentaje de células dirigidas es un porcentaje de las células vivas

La espisulosina 285 (1) también es activa frente a otras líneas de células de tumores in vitro, incluyendo P-388 (0.01 \mug/ml); A-549 (0.05 \mug/ml); HT-29 (0.05 \mug/ml) y MEL-28 (0.05 \mug/ml).

En una realización particularmente preferida, la presente invención se refiere al uso de la espisulosina 285, y de compuestos relacionados, en el tratamiento de todos los tipos de cáncer, tales como cánceres de pecho, próstata, vejiga, páncreas, pulmón, esófago, laringe, hígado, colon, tiroides, melanoma, riñón, testicular, leucemia, ovario, gastro-intestinal, carcinoma hepatocelular y cáncer de endotelio vascular. Otras formas de cáncer son bien conocidas por los expertos en la materia. Se prefiere que el uso de la espisulosina 285, y de compuestos relacionados sea frente a tumores sólidos, con un uso particularmente preferido frente a tumores de proliferación lenta tales como de próstata, pulmón, hígado, riñón, glándula endocrina y cáncer endotelial. En un aspecto, las composiciones son para uso en terapia dirigida al endotelio vascular para control de la vascularización del tejido y del tumor.

La presente invención está dirigida a compuestos bioactivos que se ha encontrado que poseen actividades antitumorales específicas y como tales serán útiles como agentes medicinales en mamíferos, particularmente en humanos. De este modo, otro aspecto de la presente invención se refiere a las composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos activos identificados en el presente documento y a los métodos de tratamiento utilizando dichas composiciones farmacéuticas.

Los compuestos activos de la presente invención muestran actividad antitumoral. De este modo, la presente invención también proporciona un método de tratamiento de cualquier mamífero afectado por un tumor maligno sensible a estos compuestos, que comprende la administración al individuo afectado de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto activo o de una mezcla de compuestos, o composiciones farmacéuticas de los mismos. La presente invención también se refiere a preparaciones farmacéuticas, que contienen como ingrediente activo uno o más de los compuestos de esta invención, así como a los procedimientos para su preparación.

Ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen cualquier sólido (comprimidos, pastillas, cápsulas, gránulos, etc.) o líquido (soluciones, suspensiones o emulsiones) con una composición adecuada o una administración oral, tópica o parenteral, y pueden contener el compuesto puro o en combinación con cualquier soporte u otros compuestos farmacológicamente activos. Estas composiciones pueden precisar ser estériles cuando se administran de forma parenteral.

La administración de la composición de la presente invención puede ser por cualquier método adecuado, tal como infusión intravenosa, preparaciones orales, administración intraperitoneal e intravenosa. La liberación intravenosa puede ser llevada a cabo durante cualquier periodo de tiempo adecuado, tal como de 1 a 4 horas o incluso mayor en el caso en que se requiera, a intervalos adecuados durante entre 2 a 4 semanas. Las composiciones farmacéuticas conteniendo espisulosina pueden ser liberadas por liposomas o encapsulación en nanoesferas, en formulaciones de liberación sostenida o por otros medios de liberación estándar.

La dosis correcta de una composición farmacéutica que comprenda los compuestos de esta invención variará de acuerdo con la formulación particular, el modo de aplicación, y el situs, huésped y bacteria o tumor a ser tratado en particular. También deberán tenerse en cuenta otros factores como la edad, el peso corporal, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la velocidad de excreción, el estado del huésped, las combinaciones de fármacos, las sensibilidades de la reacción y la severidad de la enfermedad. La administración debe ser llevada a cabo de forma continua o periódicamente dentro de la dosis máxima tolerada.

Los compuestos pueden ser proporcionados en las composiciones farmacéuticas de esta invención en la forma de una prodroga o precursor, que con la administración se convierte o es metabolizado al compuesto activo.

Las composiciones de esta invención pueden ser utilizadas con otros fármacos para proporcionar una terapia de combinación. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición, o ser proporcionados como una composición separada para administración al mismo tiempo o a tiempos diferentes. La identidad de otros fármacos no está limitada de forma particular, y los candidatos adecuados incluyen:

a)

fármacos con efectos antimitóticos, especialmente aquellos con elementos citoesqueléticos objetivo, incluyendo moduladores de microtúbulos tales como los fármacos del taxano (tales como el taxol, paclitaxel, taxotero, docetaxel), podofilotoxinas o alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina);

b)

fármacos antiempotabolitos tales como 5-fluorouracilo, citarabina, gemcitabina, análogos de purina tales como pentostatina, metotrexato);

c)

agentes alquilantes tales como mostazas nitrogenadas (tales como ciclofosfamida o ifosfamida);

d)

fármacos que se dirigen al DNA como los fármacos de antraciclina, adriamicina, doxorubicina, farmorubicina o epirubicina;

e)

fármacos que se dirigen a las topoisomerasas tales como el etopósido;

f)

hormonas y agonistas o antagonistas de hormonas tales como estrógenos, antiestrógenos (tamoxifeno y compuestos relacionados) y andrógenos, flutamida, leuprorelina, goserelina, ciprotrona u octreotide;

g)

fármacos que dirigen la transducción de la señal en células tumorales incluyendo derivados de anticuerpos tales como herceptina;

h)

fármacos alquilantes tales como fármacos de platino (cis-platino, carboplatino, oxaliplatino, paraplatino) o nitrosoureas;

i)

fármacos que potencialmente afectan la metástasis de tumores tales como los inhibidores de metaloproteinasa de la matriz;

j)

terapia génica y agentes antisentido;

k)

terapéuticos anticuerpos; y

l)

otros compuestos bioactivos de origen marino, principalmente las ecteinascidinas tales como la ET-743, o las didemninas tales como la aplidina.

La presente invención también se extiende a los compuestos para uso en un método de tratamiento, y al uso de los compuestos en la preparación de una composición para el tratamiento del cáncer.

La espisulosina 285 tiene un efecto en la morfología de la célula. Las células vero tratadas con espisulosina tuvieron una estructura de microfilamentos reducida, tal como se valoró por tinción de las células tratadas con espisulosina con faloidina, que tiñe la actina en los microfilamentos. La espisulosina también afecta la distribución del GTP pequeño que se une a la proteína Rho, aunque este efecto puede ser reducido o eliminado por pre-tratamiento con el LPA activador del Rho (Mackay y Hall, J. Biol. Chem., 273, 20685 - 20688, 1998).

Sin querer estar limitado por ninguna teoría, creemos que el mecanismo de acción de la espisulosina puede suponer la modulación de la acción de GTP pequeño unido a la proteína Rho, posiblemente a través de un efecto en la activación del LPA. Se conoce que la Rho está implicada en la formación de fibras de tensión (A. Hall, Science 279, 509 - 514, 1998), y tiene un papel en controlar la adhesión de las células y la motilidad mediante la reorganización del citoesqueleto de la actina (Itoh, y col., Nature Medicine, Vol 5, No. 2, 1999). La adhesión de las células del tumor a capas de células huésped y la subsiguiente migración transcelular son etapas clave en la invasión y la metástasis. Mediante la afectación (reducción) de los niveles de microfilamentos en la célula, a través de un efecto (inhibitorio) en la Rho, la espisulosina puede servir para limitar el desarrollo del cáncer a través de un efecto en el citoesqueleto de la célula. También es conocido que la Rho desencadena la progresión de la fase G1 del ciclo de la célula. De este modo, la modulación de la Rho también puede prevenir la transformación celular deteniendo la progresión del ciclo de la célula. Por consiguiente, la presente invención también se refiere al uso de la espisulosina en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde la espisulosina actúa para alterar la actividad de la proteína Rho.

El LPA, un activador de la Rho, puede ayudar a prevenir el efecto de la espisulosina en la formación de microfilamentos. Aunque no se conoce el objetivo específico de la espisulosina, la rojoucción observada de los microfilamentos de la actina en células tratadas con espisulosina y la estructura del lípido de la espisulosina sugieren que la espisulosina puede servir como un antagonista para el receptor de LPA, previniendo la interacción del LPA con su receptor para activar la Rho para producir los microfilamentos.

Los compuestos preferidos de esta invención fueron aislados inicialmente de la Spisula polynyma. La Spisula polynyma es una almeja comestible, que también es conocida como la almeja de las olas Stimpson surf clam o la almeja de las olas del Atlántico. Pertenece a la subfamilia Mactridae, a la superfamilia Mactroidea, clase Veneroida, subclase Heterodonta, clase Bivalvia, phylum Mollusca. La Spisula polynyma se encontró originariamente en la costa de Japón, donde es llamada hokkigai y es procesada para la elaboración de sushi. Ahora ha migrado a través del estrecho de Bering, y bajado a través de Greenland y Newfoundland, hasta el océano Atlántico. La almeja tiene una concha de color blanco-gris, de 7-10 cm de longitud. Es principalmente de color crema, excepto en la lengua que es de color púrpura en la almeja viva, pero que se vuelve de color rojo brillante después de ser cocida.

De este modo, la presente invención proporciona extractos activos de la almeja Spisula polynyma. Una realización de la presente invención está dirigida a nuevos compuestos aislado de la almeja Spisula polynyma, y el uso de todos los compuestos citotóxicos aislados de la misma como compuestos antitumorales.

Para valorar la actividad biológica, se homogenizó una almeja en metanol/tolueno 3:1. Se añadió una solución de cloruro sódico a este extracto de crudo, provocando el que se separar en una capa de tolueno y una capa acuosa. Esta última fue extraída de forma adicional con tolueno, diclorometano, acetato de etilo y 1-butanol. Estos extractos se ensayaron frente a las células de L1210, observándose citoxicidad significativa para el crudo inicial, los extractos de tolueno y diclorometano y menos actividad en las otras tres fracciones.

Citotoxicidad del L1210 de los Extractos de Crudo de Spisula polynyma^{a,b}

Concentración (\mug/ml)
Extracto	250	125	50	25	12.5	5
Crudo	98*	98*	92	25	0	0
Tolueno	100*	100*	100*	25	13	13
CH_{2}Cl_{2}	100*	100*	100*	91	20	13
EtOAc	98*	98*	92*	0	0	0
1-BuOH	83	33	0	0	0	0
Acuosos^{c}	94	75	0	0	0	0

Notas de pie de página:

(a)

citotoxicidad descrita como un % del crecimiento de la inhibición;

(b)

las entradas marcadas con * mostraron una actividad de la célula señalada;

(c)

se ensayó el extracto acuoso a 700, 350, 140 70, 35 y 14 \mug/ml.

Estos extractos también se ensayaron frente al virus Herpes simplex de Tipo I (HSV-1) y la células de riñón de mono CV-1 (a 100 \mug/disco de 6,35-mm), pero no se observó actividad. No se observó actividad antimicrobiana para estos extractos frente a Penicillium melinii (antiguamente P. atrovenetum) y Micrococcus luteus (antiguamente Sarcina lutea, ambos a 500 \mug/disco de 12,7- mm). Más tarde, se ensayaron otros extractos más purificados frente a Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, y Escherichia coli no observándose ninguna bioactividad.

También fueron asequibles métodos sintéticos para la preparación de compuestos de espisulosina, particularmente las espisulosinas 285 (1), 299 (2) y 313 (3).

La ruta sintética preferida está basada en la adición previa de órganometálicos a los N,N-dibencilamino aldehídos para rendir \beta-amino alcoholes con elevada estereoselectividad. Ver, Andrés y col., Org. Chem. 1996, 61, 4210 y Reetz y col., Angew Chem. Int. Ed Engl., 1987, 26, 1141. La adición controlada sin quelación de los reactivos de Grignard o de compuestos de órganolitio produce el diastereómero anti- y la adición controlada de quelación del órgano-zinc conduce de forma preferencial al diasteréomero syn-.

El Esquema I ilustra este procedimiento sintético preferido para la formación del Compuesto 1:

Esquema 1

5

Tal como se ha descrito en el Esquema I, el \beta-amino aldehído 50 puede ser preparado a partir del éster metílico de la L-alanina por dibencilación, en primer lugar, del grupo amino con bromuro de bencilo y carbonato potásico seguido por reducción con hidruro de litio y aluminio hasta el alcohol N,N-dibencilamino 40. La oxidación de Swern de 40 da lugar a 50 en un elevado rendimiento y puede ser utilizado sin purificación adicional para evitar la descomposición. La adición del reactivo de Grignard a 50 da lugar al diastereómero anti- con elevada selectividad. El compuesto, 60, puede ser fácilmente purificado, por ejemplo por cromatografía flash y HPLC. La desprotección de 60 por hidrogenolisis sobre el catalizador de Pearlman da lugar a 1 con alto rendimiento y un buen rendimiento global. Los compuestos 2 y 3 pueden ser preparados simplemente por incremento de la longitud de la cadena del reactivo de Grignard, y los compuestos restantes de la presente invención también pueden ser preparados por la apropiada selección del reactivo de Grignard.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A, 1B, 1C, 1D, 1E y 1F son ilustraciones de las morfologías de la célula observadas en los ensayos de los extractos de Spisula polynyma. La Figura 1A representa una célula normal; la Figura 1B representa una célula objetivo típica; la Figura 1C representa una célula objetivo atípica; la Figura 1D representa una célula con más de dos puntos; la Figura 1E representa una célula sobresalida; y la Figura 1F representa una célula objetivo y sobresalida combinadas.

La Figura 2 ilustra el esquema utilizado para separar los compuestos descritos en el presente documento de los extractos de la Spisula polynyma de la almeja.

La Figura 3 es una microfotografía para los resultados del Ejemplo A.

La Figura 4 es una microfotografía para los resultados del Ejemplo B.

La Figura 5 es un electroforetograma del Ejemplo C.

La Figura 6 es una microfotografía para los resultados en el Ejemplo D.

Con referencia a la Figura 1, en el ensayo del L1210 algunas de las células cambiaron desde ser esféricas (Figura 1A) a ovoides con largos puntos aproximadamente a 180ºC de distancia (Figura 1B). También se han observado otras varias formas en ensayos de estos extractos, incluyendo células con puntos separados no 180ºC (Figura 1C), células con más de dos puntos (Figura 1D), células con una protuberancia (Figura 1E) y células con una protuberancia sustituyendo uno de los puntos (Figura 1F). Sin embargo, la forma con dos puntos agudos, opuestos fue de lejos la que se observó de forma predominante y característica. Este tipo de cambio morfológico no había sido observado previamente durante la selección realizada sobre 1000 extractos marinos.

Descripción detallada de la invención Aislamiento de las Espisulosinas 285, 299, y 313

Para esta invención se recogieron Spisula polynyma, a una profundidad de -110 pies, a partir de un fondo de almejas en el borde este del banco de Stellwagon que está localizado fuera de la costa de New England, extendido desde cerca de Gloucester, Massachusetts, hacia el norte hasta Maine. Se enviaron vivas por la New England Clam Corporation (actualmente New Dawn Seafoods, Inc.) y a continuación se congelaron inmediatamente.

Se utilizó un esquema de purificación similar al procedimiento de extracción descrito anteriormente para el ensayo original de la bioactividad. En primer lugar se descongelaron 35 almejas y se separaron las conchas para dar 1,9 kg (peso húmedo). Se dejaron en reposo en metanol/tolueno 3:1 y se filtraron después de varias horas. Se repitió esta etapa seguida por homogenización y extracción extensiva con este mismo disolvente para dar un extracto crudo. A éste se añadió una solución de cloruro sódico 1 M que causó que el extracto se separara en dos capas. La capa acuosa inferior se extrajo de forma adicional con tolueno y se combinaron las capas de tolueno. A continuación se extrajo la capa acuosa resultante con diclorometano tal como se muestra en la Figura 2.

Se repartió el extracto de tolueno entre metanol y hexano. Se observó citotoxicidad y alteración celular casi exclusivamente en la fracción de metanol. El extracto de metanol así obtenido se aplicó a una columna flash de sílice, fluyendo con un gradiente escalonado de cloroformo/metanol (100:0, 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 70:30, 50:50, 0: 100). La mayor citotoxicidad y actividad de formación de células objetivo se eluyó de la columna muy tarde, aunque fracciones previas mostraron alguna citotoxicidad, pero no células objetivo. Este eluido más tardío fue purificado de forma adicional por cromatografía de sílice flash utilizando cloroformo/1-butanol/ácido acético/agua 8: 12:1:1. Se neutralizaron las fracciones con bicarbonato sódico antes de eliminar el disolvente para evitar la posible descomposición cuando se concentraron en ácido. Esto dio lugar a una serie de tres fracciones bioactivas.

Se ha observado en anteriores intentos de aislamiento que la bioactividad no se eliminó lavando una columna de extracción en fase sólida de ciano (SPE) con metanol, pero se encontró citotoxicidad para fluir con metanol formiato de amonio 0,01 M 3:1 (0,5 ml/min). Esto fue confirmado por cromatografía de una pequeña cantidad de una fracción bioactiva de una columna de HPLC ciano con el mismo sistema de disolventes y repitiendo a continuación le inyección bajo las mismas condiciones excepto la sustitución de la solución de formiato de amonio con agua. Los cromatogramas parecieron idénticos excepto que solo se observó un pico eluyendo a 15,6 min en el primero.

Las tres fracciones bioactivas de la segunda columna de sílice fueron cada una de ellas purificada por HPLC ciano con las mismas condiciones utilizadas anteriormente (excepto a 1 ml/min) para dar tres series de fracciones bioactivas. Se separó el formiato amónico pasando la muestra a través de una columna de SPE C-18 SPE, lavando primero con agua y fluyendo a continuación con metanol. Se encontró la principal citotoxicidad y la actividad de cambiar la morfología de cada serie (fracciones A, B, y C) en un pico comparable al discutido anteriormente. Sin embargo, la actividad se extendió a la mayoría de las fracciones. La TLC en sílice (cloroformo/1-butanol/ácido acético/agua) indicó que la fracción A (0,4 mg) contuvo una mancha (R_{f} 0,47), que se volvió de color rosa con ninhidrina. La fracción B (1,3 mg) mostró la misma mancha así como una ligeramente menor (R_{f} 0,44, rojo por la ninhidrina), mientras que la fracción C (0,2 mg) contuvo estas dos y una tercera (R_{f} 0,34, púrpura por la ninhidrina). Las tres mostraron una buena citotoxicidad y actividad formadora de células objetivo, con A mostrando una actividad ligeramente mayor que B y significativamente mayor que C. Esto indicó que la mancha más alta en CCF debe ser la que corresponde al compuesto(s) que causaron el cambio de morfología en las células L1210. Estas fracciones no se purificaron de forma adicional, pero fueron analizadas como mezclas. Los resultados de los bioensayos cuantitativos se discuten a continuación.

Se hizo un intento para determinar si un órgano particular de Spisula polynyma contenía la mayor parte o toda la bioactividad. Se anestesió una almeja viva con éter de dietilo y a continuación se diseccionó en nueve partes: pata, sistema digestivo, gónadas, sifón, branquias, corazón, manto, músculos aductores, y el resto de la masa visceral (con separación de los pies, el sistema digestivo y las gónadas). Estos se identificaron por comparación con las ilustraciones de otras almejas. Se homogenizó cada órgano en metanol/tolueno 3:1 y a continuación se trituró el extracto resultante con diclorometano y metanol para eliminar las sales. Aunque todos los extractos mostraron citotoxicidad (Tabla), solo los de las branquias y las gónadas mostraron actividad cambiante con la morfología. Los del sistema digestivo y los restantes de la masa visceral también mostraron una actividad formadora de células objetivo, posiblemente debido a la separación incompleta a partir de las gónadas. La falta de actividad formadora de células objetivo en otros órganos puede ser resultado tanto de una falta de 1-3 como de una concentración mucho menor.

En otro experimento, se extrajo una pata que había sido cocida durante un breve periodo de un modo análogo. Esto también mostró citotoxicidad, pero no actividad alteradora de la morfología. Sin embargo, cuando se extrajo de forma más extensiva una muestra mayor de material cocido, se observaron algunas células objetivo en el ensayo de L 1210. La CCF sobre sílice (cloroformo/1-butanol/ácido acético/agua 3:12:2:2, 100 \mug) de los extractos del sistema digestivo y las gónadas mostraron una mancha débilmente positiva a la ninhidrina a R_{f} 0,49.

\newpage

	250 \mug/ml	125 \mug/ml	50 \mug/ml
	%	%	%	%	%	%
Órgano	Inhibición	Señalado^{a}	Inhibición	Señalado^{a}	Inhibición	Señalado^{a}
pata	100	0, ad^{b}	100	0, ad	93	0,0
sistema	96	0,18	62	0,0	0	0,0
digestivo
gónadas	nr^{c}	nr	99	56,100	90	32,100
sifón	100	ad, ad	50	0,0	0	0,0
branquias	100	ad, ad	100	50, ad	98	100,93
corazón	100	ad, ad	nr	0,0	38	0,0
manto	100	0,0	99	0,0	95	0,0
músculos	100	añadido	100	0,0	95	0,0
aductores
masa	100	10, ad	100	2, ad	94	0,0
visceral
pata	100	0	100	0	97	0
cocida^{d}
pata	91	21	25	0	0	0
cocida^{e}

Notas de pie de página

\hskip0,4cm

^{a} El porcentaje de células dirigidas se midió entre 58 y 82 h después del inicio del ensayo.

\hskip0,4cm

^{b} ad = todos muertas.

\hskip0,4cm

^{c} nr = no leído debido a que el material precipitado en el ensayo que oscureció las células.

\hskip0,4cm

^{d} Porcentaje de células dirigidas medido a las 72 h después del inicio del ensayo.

\hskip0,4cm

^{e} Esta muestra se extrajo de un modo similar al utilizado para obtener el extracto crudo del aislamiento de las
{}\hskip1,2cm fracciones A-C. El porcentaje de células dirigidas se midió a las 76 h después del inicio del ensayo.

En el procedimiento de aislamiento pueden encontrarse varias claves a la estructura de los compuestos bioactivos. La mancha de CCF que correlacionó la actividad visualizada como rosa o roja por la ninhidrina, sugiriendo que los compuestos contuvieron aminas primarias. También, mostraron un carácter amfifílico. Se extrajeron originalmente en tolueno a partir de metanol acuoso, pero a continuación fueron repartidos en metanol contra hexano. Aunque son solubles en disolventes no polares, requieren un disolvente muy polar (cloroformo/1-butanol/ácido acético/agua 3:12:2:2) para ser eluidos de sílice.

Sólo las fracciones A y B fueron razonablemente puras a partir de contaminantes inactivos tal como se muestra por CCF. La mayor parte de los estudios de determinación de estructura se llevaron a cabo en la fracción B debido a su tamaño relativo a los demás. Las Figuras 3 y 4 muestran los espectros de RMN H^{1} de esta fracción en CDCl_{3} y CD_{3}OD, respectivamente. Lo que fue inmediatamente obvio en estos espectros fue un pico correspondiente a una larga cadena de metilenos (1,25 ppm) y varios grupos metilo terminales solapados (0,87 ppm). Otros picos no estuvieron tan bien definidos. No se observaron picos correspondientes a los protones aromáticos, pero aparecieron varios picos en la región de los protones de alquenos. Otros varios parecieron corresponder a protones unidos a los carbonos sustituidos por heteroátomos. La principal diferencia entre los espectros en los dos diferentes disolventes fue que, en CD_{3}OD, el campo de un doblete de metilo (1.21 ppm) de los grupos metilo terminales fue claramente observado, mientras que en CDCl_{3} esta resonancia apareció solo como un hombro del campo superior en el pico de la cadena de metileno.

Se obtuvo una muestra auténtica de D-trans-eritro-esfingosina (4) de Sigma por comparación con el material aislado. El espectro de RMN H^{1} fue similar en muchos aspectos al de la fracción B. Tal como se esperaba, 4 mostró un gran pico debido a la larga cadena de metilenos (1,25 ppm), un grupo metilo terminal (0,87 ppm) y dos protones vinilo (5,75 y 5,46 ppm). Es de particular interés que la amplitud de las resonancias correspondientes a los protones en los carbonos sustituidos por heteroátomos (4,40, 3,66, 2,85 y 2,18 ppm). También, en CCF sobre sílice (cloroformo/1-butanol/ácido acético/agua 3:12:2:2), 4 tuvo un R_{f} de 0,43 y tomó color rojo con la ninhidrina, al igual que la mancha inferior en la fracción B y la mancha intermedia en C. Palmeta y Pro\check{s}tenik han descrito que el 2-amino-3-octadecanol y 4 mostraron valores de R_{f} muy similares (0,32 y 0,29, respectivamente) cuando se fluyeron sobe papel impregnado con ácido silícico con el sistema de disolvente di-isobutil cetona/ácido acético/agua (40:25:5).

Las fracciones A-C también se estudiaron por varios métodos espectrométricos de masas. El mayor ión en todos los espectros fue el de m/z 286. La medición de alta resolución de este pico (m/z 286,3109) permitió la asignación de la fórmula molecular C_{18}H_{40}NO (0,1 mmu) a la espisulosina 285 (1). Este compuesto deriva su nombre, en parte, de su peso molecular. Esta fórmula molecular indicó que la molécula está totalmente saturada. Se observó un gran pico correspondiente a la pérdida de agua a partir de este ión de M+H a 268,3019 (\delta -1.5 mmu). De este modo, 1 debe contener un grupo hidroxilo. Se observaron los iones correspondientes a los aductos de la matriz de m/z 286 a m/z 438,3078 (C_{22}H_{48}NO_{3}S_{2}, \Delta-0.2 mmu), 590, y 592.

Un metabolito primario bien conocido que, al igual que 1, consiste en una cadena de 18 carbonos sustituida con funcionalidades hidroxilo y amina es la esfingosina (4). Este compuesto tiene un oxígeno más y dos hidrógenos menos que 1. La analogía pareció válida debido a que la medición de alta resolución de m/z 300 para las espisulosinas indicó que había un doblete correspondiente al M+H de un homólogo superior (2) de m/z 286 (300,3270, C_{19}H_{42}NO, -0,4 mmu), junto con esfingosina (4) en sí misma (300,2914, C_{18}H_{38}NO_{2}, \Delta- 1.1 mmu). Esto también ayudó a explicar la presencia de protones alqueno en el espectro de RMN H ^{1}.

Varios otros picos fueron evidentes en todos los tres espectros. El ión a m/z 314 también fue un doblete correspondiente a C_{20}H_{44}NO (314,3439, \Delta -1,6 mmu), que fue el ión molecular de otro homólogo de 1, la espisulosina 313 (3), y C_{19}H_{40}NO_{2} (314,3075, \Delta -1,6 mmu) que fue un homólogo de la esfingosina (5). El compuesto 4 mostró aductos de la matriz del ión M+H a m/z 452,2885 (C_{22}H_{46}NO_{4}S_{2}, \Delta -1,7 mmu), 604,2831 (C_{26}H_{54}NO_{6}S_{4}, \Delta 0,3 mmu) y 606,2995 (C_{26}H_{56}NO_{6}S_{4}, \Delta 3,6 mmu), 5 exhibió aductos de la matriz del ión M+H a m/z 464,2888 (C_{23}H_{46}NO_{4}S_{2}, \Delta -2,0 mmu) y 618,2940 (C_{27}H_{56}NO_{6}S_{4}, \Delta- 5,1 mmu). Debe hacerse notar que, mientras que a m/z de 300 y 314 hubo dobletes de casi igual intensidad en la fracción B, solo fue medible un pico para los aductos de la matriz listados en la presente memoria a partir de la fracción B. Esto sugirió que estas dos series de compuestos, aunque muy similares en la estructura general, se comportaron de forma diferente en FABMS. Las series de espisulosina (saturadas) dieron iones moleculares mayores y aductos de matriz más débiles, mientras que se observó lo contrario para las series de esfingosina (no saturados).

Para establecer mejor las estructuras identificadas por los datos discutidos anteriormente, se prepararon varios derivados. El que proporcionó más información fue el derivado diacetilo de la espisulosina 285 (8). Debido a que la fracción B fue la mayor, se acetiló una parte del mismo con anhídrido acético en piridina. En el presente documento se hará referencia a esta mezcla de derivados acetilo como AcB. Por CCF sobre sílice (cloroformo/1-butanol/ácido acético/agua 3:12:2:2), la reacción pareció cuantitativa, apareciendo una nueva mancha a R_{f} 0,86. Por comparación, el derivado triacetilo del auténtico 4 (9) también fue sintetizado por el mismo método.

Se han aislado previamente dos series de compuestos relacionados con las espisulosinas. Gulavita y Scheuer describieron que una esponja Xestospongia sp. de Papua-Nueva Guinea contenía dos amino alcoholes de 14 carbonos epiméricos 134 y 135. Estos no se aislaron como aminas libres, pero en su lugar la mezcla fue acetilada para dar tanto los compuestos mono- (136, 137) y como los diacetilados (138, 139) que a continuación fueron separados. Jiménez y Crews han aislado varios iones moleculares del no derivatizado 1 a m/z 286. Este ión M + H (m/z 370) se fragmentó para dar m/z 310 y 268, presumiblemente por pérdida de ácido acético y a continuación el segundo grupo acetilo, respectivamente. Los iones comparables para las otras espisulosinas fueron pequeños, pero presentes a: m/z 384, 324 y 282 para el derivado diacetilo de 2 (144), y m/z 398, 338 y 296 para el derivado diacetilo de 3 (145). Los iones a partir de la esfingosina en la muestra fueron demasiado pequeños para poder establecer de forma definitiva que estaban presentes. Esto mostró de Nuevo que las dos series de compuestos tuvieron potenciales de ionización diferentes. El espectro de CIMS mostró grandes iones a m/z 370 y 310, pero aquí el ión a m/z 268 fue muy débil. Los homólogos mayores se observaron de nuevo a m/z 384 y 324 para 144, y a m/z 398 y 338 para 145. Los iones débiles a m/z 426 y 366 fueron indicativos de 133.

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Síntesis de Espisulosina 285

Para confirmar la estructura y determinar la estereoquímica de la espisulosina 285 se sintetizó el compuesto. Ninguno de los isómeros del 2-amino-3-octadecanol fueron conocidos previamente como productos naturales, pero tanto los isómeros 2S, 3S y 2S, 3R habían sido previamente sintetizados. Los homólogos superiores son compuestos nuevos.

Se utilizó una versión modificada de la síntesis de Prostenik y Alaupovic para obtener el material auténtico para comparación.

Esquema IX

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En primer lugar, se alquiló el malonato de dibencilo (147) con bromuro de tetradecilo (148). A continuación se condensó el tetradecilamalonato de dibencilo (149) con cloruro de N-ftaloil-L-alanilo (150) para dar 2-ftalimido-3- octadecanona (151) después de eliminar los grupos bencilo y de descarboxilación. Se trató esta cetona con exceso de borohidruro sódico, lo cual dio lugar a la reducción de uno de los carbonilos ftalimido además de la cetona, produciendo tanto 152, que tenía un carbonilo del ftalimido reducido a carbinolamina, y 153, que fue adicionalmente reducido. Estos dos productos pueden ser fácilmente separados entre sí por cromatografía flash sobre sílice.

La reducción de 151 a 152 produjo una mezcla de cuatro diastereómeros debido a la formación de dos nuevos centros quirales. En este punto, los diastereómeros fueron separados por HPLC ciano. A continuación se eliminó el grupo protector de cada uno por reducción adicional con borohidruro sódico seguido por ácido acético. Cuando se eliminó un estereocentro con el grupo protector, esto dio lugar a la producción de dos diastereómeros. Debido a que la síntesis se inició con la L-alanina, los dos productos fueron el (2S, 3S)-2-amino-3-octadecanol (154) y (2S, 3R)-2-amino-3-octadecanol (155).

Actividad Biológica

Aunque las espisulosinas fueron compuestos bastante simples, tal como se ha ilustrado en las Figuras 1A-1F, mostraron un tipo muy inusual de bioactividad. Tal como se ha discutido anteriormente, las espisulosinas causaron un cambio morfológico diferente en las células de leucemia L1210, además de citotoxicidad. Esta bioactividad, que se registró como el porcentaje de células vivas en las que se observó una morfología alterada, puede ser observada algunas veces tan pronto como a las 13 h después del inicio del ensayo y alcanzó un máximo a las 50-60 h, después de lo cual disminuyó. Generalmente se observaron 60 células para determinar este número, excepto en los ensayos en los que permanecían vivas menos que este número de células. Normalmente se midió el efecto morfológico a las 30-35 h después del comienzo del ensayo y de Nuevo aproximadamente 24 h más tarde, mientras que se determine la citotoxicidad cuando el número de células en los controles alcanzó aproximadamente 8000, normalmente en 3 días después del inicio del ensayo. Debe hacerse notar que las células dirigidas fueron células vivas y que fueron contabilizadas como tales para la lectura de la citotoxicidad. También, los ensayos en los que se registró un 100% de citotoxicidad pueden contener todavía células vivas (<0,5%) que pueden o no haber sido dirigidas. Se contabilizaron todas las células morfológicamente cambiadas en el porcentaje de células dirigidas.

Este cambio en la morfología se observó siempre en fracciones con una citotoxicidad bastante elevada. Generalmente, no se observó un número significativo de células dirigidas en los ensayos con menos del 70% de inhibición del crecimiento. Sin embargo, los ensayos en los que la citotoxicidad se acercó al 100% tuvieron a menudo menores porcentajes de células con una morfología alterada que aquellos con una inhibición del crecimiento del 90- 98%. Esto sugirió que las células alteradas pueden ser más fácilmente muertas. Se desconoce si el cambio en la citotoxicidad y en la morfología resulta del mismo mecanismo de acción. En un ejemplo, las células dirigidas a partir de un ensayo fueron cultivadas de Nuevo y revirtieron al estado normal. Esto sugirió que el efecto fue reversible después que el compuesto hubiera sido metabolizado. La acetilación reduce de forma drástica la bioactividad.

Para determinar si el cambio en la morfología de las células L 1210 células fue causado por la esfingosina (4) o por compuestos relacionados, se obtuvieron compuestos auténticos y se ensayaron frente a las células L1210. Tanto la esfingosina como la estearilamina (131) mostraron una citotoxicidad moderada, pero no un efecto morfológico. Las esfingomielinas son derivados bien conocidos de 4 en los que se ha añadido una unidad de fosforil colina al alcohol primario y se ha acilado la amina por un ácido graso. Una mezcla de esfingomielinas aislada de cerebro de bovino (Sigma), que consistió principalmente en estearoil y nervonoil esfingomielinas (161, 162), mostraron una citotoxicidad mínima y no células dirigidas. La citotoxicidad del derivado de fosforilcolina de 4 (163, Sigma) puede ser, al menos, parcialmente debido a la hidrólisis de 163 a 4.

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Citotoxicidad de los Compuestos Modelo

Compuesto	Concentración (\mug/ml)	% Inhibición	% Células dirigidas
128	5	100	0
	2,5	100	0
	1	75	0
	0,5	31	0
	0,25	13	0
	0,1	0	0
161+162	50	7	0
	25	0	0
	10	0	0
131	5	99	0
	2,5	96	0
	1	19	0
	0,5	0	0
	0,25	0	0
	0,1	0	0
163	50	88	0
	25	50	0
	10	38	0

La esfingosina y otras aminas de cadena larga, incluyendo la estearilamina, son conocidas por ser citotóxicas. Esta bioactividad, tal como se ha medido frente a las células de ovario de hámster chino (CHO), ha mostrado ser máxima para los homólogos de 18 átomos de carbono. Se encontró que los cuatro estereoisómeros de la esfingosina son casi igualmente activos. La reducción del doble enlace de 4 para producir dihidroesfingosina (164) no afectó la citotoxicidad. La adición de un grupo N-metilo a 164 tampoco causó ningún cambio significativo en la bioactividad, mientras que la acilación de la amina causó una mayor disminución de la citotoxicidad.

No se describió citotoxicidad para los compuestos relacionados (134, 135, 140-142) que habían sido aislados a partir de otras fuentes marinas, aunque, pudieron no haber sido ensayados en este tipo de ensayo. Una mezcla de 134 y 135 fue activa frente a C. albicans (zona de inhibición de 8-mm para 19 \mug de una mezcla de los dos). Se ha descrito que el xestaminol A muestra una débil actividad frente a varias bacterias Gram-positivas y Gram-negativas y hongos. También ha mostrado actividad antihelmíntica frente a Nippostrongylus brasiliensis. Tanto el 140 como el 142 mostraron alguna actividad frente a transcriptasa reversa.

En la tabla se resume la actividad de las fracciones A-C, del derivado acetilo de la fracción B y de los compuestos 154 y 155. Los resultados del ensayo confirmaron claramente que los análisis de RMN asignaron 155, no 154, como el mismo que 125. La acetilación también disminuye de forma drástica la bioactividad.

TABLA IX Bioactividad de las Fracciones A-C, AcB, y 154 y 155

				% Células dirigidas^{a/b}
Muestra	Concentración	% Inhibición^{c}	Tiempo	1º	2º
	(\mug/ml)
Fracción A	2,5	100	35,59	ad	ad
	1,25	100		25	ad
	0.5	90		42	45
	0,25	85		45	55
	0,125	75		8	35
	0,05	19		0	0
Fracción B	2,5	100	35,59	0	7
	1,25	93		3	21
	0,5	90		2	43
	0,25	80		7	37
	0,125	75		5	21
	0,05	7		0	0
Fracción C	2,5	90	55	0
	1,25	88		0
	0,5	63		0
AcB	10	31	27	0
	5	38		0
	2	13		0
	1	0		0
	0,5	0		0
	0,2	0		0
154	5	100	27	0
	2,5	100		0
	1	63		0
	0,5	0		0
	0,25	0		0
	0,1	0		0
155	5	100	27	ad
	2,5	100		22
	1	100		64
	0,5	99		56
	0,25	96		40
	0,1	63		33

Notas de pie de página

\hskip0,4cm

^{a} A no ser que se indique de otro modo, el porcentaje de células dirigidas se leyó dos veces. El número de horas
{}\hskip1,2cm después del inicio del ensayo al que se hicieron estas mediciones se indicó en la columna tiempo.

\hskip0,4cm

^{b} ad = todas muertas.

\hskip0,4cm

^{c} El porcentaje de inhibición del crecimiento que se registró lo fue como el porcentaje de células vivas en los
{}\hskip1,2cm pocillos tratados en comparación con los pocillos control. Posible Modo de Acción

La bioactividad de las espisulosinas puede ser debida a su similitud a la esfingosina. En la nomenclatura de los esfingolípidos, la espisulosina 285 sería considerada como 1-deoxiesfinganina. Las espisulosinas pueden competir con la esfingosina para los sitios de unión o ser incorporadas en los esfingolípidos tales como esfingomielinas, ceramidas o gangliósidos. En cualquier caso, las espisulosinas pueden romper las funciones celulares controladas por estos compuestos. La esfingosina y sus derivados están implicados en la regulación del crecimiento y la diferenciación celular. La esfingosina es un potente inhibidor de la protein kinasa C, compitiendo con el diacilglicerol por el sitio de unión, que puede explicar su citotoxicidad. Los estudios estructura actividad han mostrado que su inhibición requiere una amina cargada positivamente y de este modo los derivados N-acilo fueron inactivos. Si las espisulosinas actúan por competencia con la esfingosina, esto explicaría la relativa falta de actividad de los acompuestos acetilados (AcB). Hay una evidencia creciente que la esfingosina puede actuar como un Segundo mensajero por regulación de la actividad de la proteína kinasa C. También ha mostrado que inhibe la diferenciación de las células HL-60 tratadas con 12-miristato-13-acetato de forbol, un conocido activador de la protein kinasa C. Las espisulosinas deben ser ensayadas para la inhibición de la protein kinasa C. Se desconoce si la inhibición de esta enzima puede causar los efectos morfológicos observados para las espisulosinas, pero la protein kinasa C está implicada en el control del crecimiento y la diferenciación celular.

Experimental

Los espectros de RMN se obtuvieron en espectrómetros General Electric GN 500 y QE 300 y Varian U400. Para el análisis por RMN las muestras se disolvieron en CDCl_{3} o CD_{3}OD. Se describieron los desplazamientos químicos (D) en ppm por debajo del campo del tetrametilsilano (TMS) y se reverenciaron al pico del disolvente residual o TMS. Se registraron los espectros de FABMS de baja o alta resolución en un espectrómetro VG ZAB-SE o VG 70-SE4F, utilizando una mezcla 3:1 de ditiotreitol -ditioeritritol (bala mágica) como la matriz. Se registraron los espectros de FABMS/MS en un VG 70-SE4F con la misma matriz, utilizando helio como gas de colisión. Se registraron los espectros de masas de CI en un espectrómetro VG VSE, operando en el modo alternativo CI/EI con metano como gas reactivo. Se obtuvieron los espectros de IR en un espectrómetro IBM IR/32 FTIR. Se midieron las rotaciones ópticas en un polarímetro digital JASCO DIP-370.

Cromatografía

Se llevó a cabo la HPLC (cromatografía líquida de alta presión) utilizando una columna ciano Alltech Econosphere (4,6 x 250 mm, con un tamaño de partículas de 5 \mum). El sistema de HPLC utilizado consistió en una bomba modelo Beckman 114M, un inyector Rheodyne 71 y un detector de longitud de onda variable Isco V^{4} o Beckman 165 o un detector de selección de fotodiodo Waters 990.

Se llevó a cabo la cromatografía de capa fina (CCF) en placas de gel de sílice precortadas (Merck 60 F-254) y en placas de fase de unión ciano (EM Science CN F_{254S} HPTLC). Se visualizaron las manchas por UV (254 nm), ninhidrina (5% en etanol), ácido fosfomolíbdico (5% en etanol) y/o yodo. Se llevó a cabo la cromatografía en columna de sílice tanto con gel de sílice de 50-200 \mum como de 40-63 \mum (Merck). Se utilizaron otras cromatografías de columna Chromatorex ODS (Fuji-Division 100-200 mesh) y Sephadex LH-20 (Pharmacia). Se llevó a cabo la cromatografía contracorriente de alta velocidad (HSCCC) en un separador-extractor en espiral multi-capa Ito (P.C., Inc.) con una espiral de #10 y una mini-bomba Milton-Roy. Se llevó a cabo la extracción en fase sólida (SPE) en columnas de fase normal (sílice, Alltech Maxi-Clean), en fase reversa (C-18, Sep-Pak de Waters), y en fase unida (CN, Fisher
PrepSep).

Ensayos Biológicos

Se llevó a cabo la citotoxicidad frente a células de leucemia limfocítica por disolución de las muestras en metanol y/o hexano para aplicar a los pocillos de ensayo secos y se dejó evaporar el disolvente. Se añadieron las células (1000) en un medio esencial mínimo (MEM, 1 ml) y se incubaron a 37ºC. Se registró la inhibición del crecimiento como el porcentaje estimado de células vivas en pocillos de muestra respecto las de los pocillos control. Esto se midió cuando los pocillos control alcanzaron las 8000 células, generalmente tres días después del comienzo del ensayo.

Se contabilizaron las células que cambiaron morfológicamente (Figuras 1A-1F) como células vivas cuando se determinó el porcentaje de inhibición del crecimiento. Se valoraron los cambios morfológicos a lo largo del periodo de ensayo. Se determinó el porcentaje de células dirigidas por contabilización del número de células alteradas en aproximadamente 60 células vivas. Este porcentaje varió con la duración del tiempo en que había ido transcurriendo el ensayo. Este generalmente alcanzó su máximo aproximadamente 50 horas después del comienzo del ensayo, pero pudieron observarse células dirigidas tan pronto como a las 13 horas después del comienzo del ensayo y todavía pudieron observarse cuando se midió el porcentaje de inhibición del crecimiento. Los porcentajes de células dirigidas fueron contabilizados a menudo tanto después de aproximadamente 35 horas como después de 55 horas. El tiempo al que se hizo esta medición es indicado con la fecha.

Se llevaron a cabo ensayos antimicrobianos utilizando el método de difusión de disco de filtro (6.35 o 12.7 mm, Schleicher & Schuell). Se impregnaron los discos de papel con muestras (50-500 \mug) en solución y se dejaron secar. A continuación se situaron estos discos en agar inoculado con Bacillus subtilis, Penicillium melinii (antiguamente P. atrovenetum), Micrococcus luteus (antiguamente Sarcina lutea), Escherichia coli o Saccharomyces cerevisiae. Estas placas se incubaron durante 12-24 h (32-35ºC, excepto para P. melinii, 25-27ºC).

Extracción de la Spisula polynyma para los Ensayos Biológicos Iniciales

Se descongeló una almeja (Spisula polynyma) y se separó la concha (35,32 g, peso húmedo). Se situó en un mezclador con 350 ml de metanol/tolueno 3:1 y se homogenizó. Se filtró el extracto de color amarillo-marrón y se añadió sobre una solución de cloruro sódico 1M (100 ml). Se separó la capa superior de tolueno y la capa acuosa se extrajo con tolueno (75 ml). Se combinaron las dos capas de tolueno y se separó el disolvente para dar un residuo aceite de color marrón (333,9 mg). La capa acuosa se extrajo de forma adicional con diclorometano (2 x 75 ml), lo cual condujo a un residuo de color Amarillo-marrón (18,6 mg) después de la eliminación del disolvente. A continuación se extrajo la capa acuosa con acetato de etilo (75 ml). La fase inferior fue la capa orgánica debido a la presencia de algo de diclorometano que permaneció en la fase acuosa después de la última etapa. La capa superior se extrajo de forma adicional con acetato de etilo (245 ml), la capa orgánica superior se extrajo de nuevo con agua (100 ml), y los dos extractos de acetato de etilo se combinaron para dar un residuo amarillo (36,8 mg) después de la eliminación del disolvente. Se concentraron las capas acuosas combinadas hasta la mitad y se extrajeron dos veces con 1-butanol (150 ml, 75 ml). Las capas de butanol combinadas se extrajeron de Nuevo con agua (75 ml), dando lugar a un residuo amarillo (132,8 mg) después de la eliminación del butanol. Se concentraron las capas acuosas combinadas para dar un residuo en forma de aceite ligeramente amarillo (946,1 mg). Se trituró cada extracto con diclorometano para eliminar las sales para dar los extractos de tolueno (302,2 mg), de diclorometano (18,6 mg), de acetato de etilo (36,7 mg), de butanol (120,9 mg) y acuoso que se analizaron (590,4 mg) que se analizaron.

Fracciones A, B, y C

Se descongelaron treinta y cinco almejas y se separaron las conchas para dar una muestra de Spisula polynyma (1,9 kg) que fue remojada en metanol/tolueno (3:1, 2 x 1.5 l). A continuación los sólidos fueron triturados en el mismo disolvente (6 x 1,5 l) y se filtraron los extractos resultantes. Se añadió una solución de cloruro sódico 1 M (3 l) a este extracto de crudo (12 l) y se separó la capa superior de tolueno resultante. La capa acuosa se extrajo de nuevo con tolueno (2 x 2.5 l), seguido por diclorometano (4 x 2.5 l) tal como se muestra en la Figura 1.

Después de la eliminación del disolvente, se repartió el extracto de tolueno (21,55 g) entre metanol y hexano (1,5 l cada uno). La capa de metanol se extrajo de forma adicional con hexano (4 x 11). Se concentraron las capas de hexano combinadas hasta aproximadamente 1,8 l y se enfriaron ambos extractos (-10ºC). Se separaron las dos capas que resultaron en cada caso. A continuación se extrajeron con metanol las capas de hexano combinadas (0,5 l). Este procedimiento dio lugar un extracto de hexano y tres extractos de metanol de los que el primer extracto de metanol (6,8 g) contuvo la mayor bioactividad.

Se separó la fracción de metanol bioactiva por cromatografía flash sobre sílice utilizando un gradiente escalonado de cloroformo/metanol (100:0, 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 70:30, 50:50, 0:100) para dar 12 fracciones. Aunque las fracciones tercera, cuarta, séptima y octava poseyeron alguna citotoxicidad, no mostraron ninguna actividad formadora de células dirigidas. Esta actividad se encontró en las últimas dos fracciones junto con la mayor parte de la citotoxicidad.

Se combinaron estas dos fracciones (370 mg) y se purificaron de forma adicional por otra columna flash sobre sílice, utilizando cloroformo/1-butanol/ácido acético/agua (8:12:1:1). Para eliminar el ácido acético, cada una de las 12 fracciones así obtenida fue neutralizada por adición de (a) cloroformo (un cuarto de volumen), (b) lavado con bicarbonato sódico al 5% hasta que el pH de la capa acuosa estuvo por encima de 7 (2-3 x mitad del volumen), y a continuación (c) lavado de la capa orgánica con agua (mitad del volumen). La tercera, cuarta y quinta fracción poseyó toda la actividad formadora de células dirigidas y esencialmente toda la citotoxicidad. Se purificó de forma separada cada una de estas fracciones por HPLC en una columna ciano con metanol/formiato amónico 0,01 M 3:1 (1 ml/min). Se recogieron seis fracciones, de las que la más bioactiva fue la quinta, de cada fracción de sílice. Se separó el formiato amónico a partir de cada fracción por adición de agua (2-8 ml), aplicando la muestra a una columna de SPE (C- 18), lavando con agua (5-10 ml) y a continuación fluyendo con metanol (5 ml). Esto dio lugar a las fracciones A (0,4 mg, rendimiento de 2 x 10^{-5}%), B (1,3 mg, rendimiento de 7 x 10^{-5}%) y C (0,2 mg, rendimiento de 1 x 10^{-5}%), a partir de las fracciones de sílice tercera, cuarta y quinta, respectivamente, que se fluyeron todas a t_{r} 7.9 min.

Fracción A

Sólido blanco; CCF sobre sílice (3:12:2:2 CHCl_{3}/1-BuOH/AcOH/H_{2}O) R_{f} 0,47 (positivo a la ninhidrina, rosa);

IR (NaCl) 2922, 2853, 1734, 1593, 1462, 1377, 1061 cm^{-1};

RMN H^{1} (CDCl_{3}) \delta 5,38, 5,15, 3,82, 3,67, 3,44, 3,24, 2,31, 2,03, 1,67, 1,60, 1,55, 1,25, 1,10, 0,86;

FABMS m/z 606, 604, 592, 590, 466, 452, 438, 314, 300, 286, 268;

CIMS m/z 354, 340, 338, 328, 326, 324, 314, 312, 310, 300, 298, 296, 286, 284, 268, 266, 149, 139, 137, 1, 123, 111, 109, 97, 95, 85, 83, 71, 69, 59, 57, 55.

Análisis calculado para C_{18} H_{40} NO: 286,3110 (M+H). Encontrado: 286,3115 (HRFABMS).

Fracción B

Sólido blanco; CCF sobre sílice (3:12:2:2 CHCl_{3}/1-BuOH/AcOH/H_{2}O) R_{f} 0,47 (positivo a la ninhidrina, rosa), 0,44 (positivo a la ninhidrina, rojo);

IR (NaCl) 3273, 2953, 2918, 2851, 1639, 1591, 1510, 1466, 1379, 1344, 1059, 970 cm^{-1};

RMN H^{1} (CDCl_{3}) \delta 5,98, 5,78, 5,55, 5,44, 5,32, 4,43, 3,78, 3,65,3,24, 2,15, 2,08, 2,00, 1,95, 1,70, 1,44, 1,25, 1,19, 0,87;

FABMS m/z 618,2940, 616, 606,2955, 604,2831, 592, 590, 480, 466, 464,2888, 452,2885, 438, 314,3439, 314,
3075, 300,3273. 300,2914, 286, 268;

CIMS mlz 354, 352, 342, 340, 338, 328, 326, 324, 314, 312, 310, 300, 298, 296, 286, 284, 282, 280, 268, 266, 219, 193, 179, 165, 149, 137, 123, 111, 109, 97, 95, 85, 83, 71, 69, 59, 57, 55.

Fracción C

Sólido blanco; CCF sobre sílice (3:12:2:2 CHCl_{3}/1-BuOH/AcOH/H_{2}O) R_{f} 0,47 (positivo a la ninhidrina, rosa), 0,44 (positivo a la ninhidrina, rojo), 0,34 (positivo a la ninhidrina, púrpura);

IR (NaCl) 2924, 2853, 1593, 1456, 1352, 1063, 972 cm^{-1};

FABMS m/z 620, 618, 616, 606, 604, 602, 466, 464, 452, 438, 314, 300, 298,2741, 296, 286, 280, 268; CIMS m/z 354, 352, 340, 338, 336, 328, 326, 324, 322, 314, 312, 310, 308, 300, 298, 296, 294, 292, 286, 284, 282, 280, 278, 268, 179, 165, 149, 137, 135,1, 123, 121, 111, 109, 97, 95, 85, 83, 81, 71, 69, 60, 59, 57, 55.

Reparto Inicial

Se descongelaron veintidós almejas S. polynyma y se separaron las conchas para dar 1,3 kg del organismo (peso húmedo). Este se situó en un mezclador Waring con metanol/tolueno 3:1 (1,5 l) y se trituró en una pasta espesa que se filtró a través de una capa de celite. El residuo sólido se extrajo de forma adicional (4 x 1,5 l) y se filtró de forma similar. A continuación se situaron los sólidos restantes en metanol/tolueno 5:1 (750 ml) y se dejaron empapar durante 36 h, antes del filtrado. Se añadieron sobre los filtrados combinados (7,8 l) de cloruro sódico 1 M (2 l). Después de eliminar la capa superior de tolueno, se extrajo la capa acuosa con tolueno (2 x 1,5 l) y diclorometano (3 x 1,5 l). Se concentró la restante capa acuosa hasta la mitad y se extrajo con acetato de etilo (2 x 1 l). Se diluyó la capa acuosa resultante con agua (2 l) y se extrajo dos veces con 1-butanol (1,5 l, 1 l). La eliminación de los disolventes y la trituración con diclorometano y metanol dio lugar a los extractos de tolueno (14,1 g), de diclorometano (0,75 g), de acetato de etilo (1,3 g), de 1-butanol (0,2 g) y acuoso (1,9 g) que se analizaron.

El extracto de tolueno se repartió entre hexano y metanol (750 ml cada uno). La capa de metanol resultante se extrajo de forma adicional con hexano (2 x 750 ml, 2 x 500 ml). Se combinaron las capas de hexano y se concentraron hasta aproximadamente 3 l y a continuación ambos extractos se enfriaron (-10ºC) lo que causó que cada uno de ellos se separara en dos capas. Se concentraron las capas de metanol combinadas a vacío para dar un residuo marrón (extracto de metanol 1, 536 g). Las capas de hexano se concentraron de forma adicional hasta aproximadamente 1 l y se extrajeron de nuevo con metanol (500 ml). Se eliminó el disolvente de cada uno de estos 2 extractos de metanol (4,26 g) y del extracto de hexano (4,52 g).

Fracción D

Se separó una parte del primer extracto de metanol (594 mg) por HSCCC, utilizando hexano/acetato de etilo/metanol/agua (4:7:4:3, MP = UP) a 4 ml/min. Esto dio lugar a 12 fracciones de las que la tercera, cuarta y quinta contuvieron la mayor parte de la bioactividad. Se combinaron estas tres fracciones (158 mg) y se cromatografiaron sobre Sephadex LH-20, eluyendo con metanol. Esto dio lugar a ocho fracciones de las que la cuarta (8,4 mg) poseyó la mayor parte de la actividad biológica. Esta fracción bioactiva se purificó de forma adicional por HPLC en una columna ciano con metanol/formiato amónico 0,01 M 3:1 (0,5 ml/min). Se recogieron ocho fracciones y se eliminó el formiato amónico de cada una de ellas por adición de agua (2-8 ml), aplicando la muestra a una columna SPE (C-18), lavando con agua (5-10 ml) y eluyendo a continuación con metanol (5 ml). La fracción séptima (t_{r} 15,8 min, sólido blanco amorfo, 0,3 mg, rendimiento del 2x10^{-4}%) demostró que contenía los compuestos bioactivos y en el presente documento se hace referencia a la misma como fracción D. La CCF sobre sílice (1-BuOH/AcOH/H_{2}O, 4:1:5, capa superior) mostró cuatro manchas por visualización con ácido fosfomolíbdico: R_{f} 0,53 (mayoritaria), 0,35 (mayoritaria), 0,31 (minoritaria), y 0,19 (minoritaria). La sexta fracción inactiva mostró todas las mismas manchas excepto la de Rf 0,53. El espectro de FABMS de la fracción D mostró picos intensos a m/z 286,3019, 300,3270 y 268,3019, y picos más débiles a m/z 314, 438, 452, 464, 590, 592, 669, 797, 809 y 825. También se observaron los últimos tres iones listados en la mayoría de las demás fracciones de HPLC y parecieron corresponder a la mancha de CCF a R_{f} 0,35.

Análisis calculado para C_{18} H_{40} NO: 286,3110 (M+H). Encontrado: 286,3109 (HRFABMS).

Fracción E

Se sometió a HSCCC una segunda porción del primer extracto de metanol descrito anteriormente (633 mg). El sistema de disolventes utilizado fue hexano/metanol/agua (5:4:1, UP = MP, 5 ml/min), que dio una retención e fase estacionaria pobre. Esto dio lugar a 10 fracciones con la bioactividad extendida a través de la mayoría de ellas. Se combinaron las primeras tres fracciones (310 mg) y se purificaron de forma adicional por HSCCC utilizando hexano/acetato de etilo/metanol/agua (4:7:4:3, LP = MP, 2 ml/min) para dar 12 fracciones. Las fracciones segunda a quinta (85 mg), conteniendo la mayor parte de la bioactividad, fueron cromatografiadas en una columna flash de C-18, eluyendo con un gradiente escalonado de metanol/agua/cloroformo (90:10:0, 95:5:0, 100:0: 0, 95:0:5, 90:0:10, 50:0:50). Esto dio lugar a 10 fracciones que fueron todas ellas bioactivas.

Las fracciones cuarta a sexta a partir de la primera elución de HSCCC fueron combinadas con una fracción secundaria de la columna de Sephadex LH-20 discutida bajo la fracción D (270 mg). Este material fue sometido a HSCCC, utilizando las mismas condiciones que la segunda elusión acabada de describir excepto que la velocidad de flujo fue de 3 ml/min. Esto dio lugar a nueve fracciones de las que la segunda y la tercera contuvieron la mayor parte de la citotoxicidad y de la actividad alteradora de la célula. Se combinaron estas dos fracciones (42 mg) y se separaron en una columna flash de C-18, utilizando un gradiente escalonado de metanol/agua (80:20, 90:10, 95:5, 100:0). Esto dio lugar a 12 fracciones de las que de la ocho a la once mostraron una actividad alteradora de la morfología y citotoxicidad. Se combinaron todas las fracciones, excepto de la primera a quinta de la primera columna de C-18 con las fracciones octava a onceava de la segunda (50,4 mg) y se separaron por CCF preparativa sobre sílice con cloroformo/1-butanol/ácido acético/agua (3:12:2:2). Se dividió la placa en ocho fracciones, que se rascaron y se eluyeron con metanol. Se trituró el residuo de cada fracción, después de eliminar el disolvente, con diclorometano y se filtró. La segunda fracción de la parte superior de la placa (Rf 0,80-0,42) contuvo el material bioactivo y se hace referencia al mismo como fracción E (5,7 mg). La CCL sobre sílice analítica de la fracción E, eluyendo con el mismo sistema de disolventes, mostró una única mancha por visualización con ninhidrina (R_{f} 0,44), pero el reactivo de pulverización de ácido fosfomolíbdico mostró otro material que se rascó de la tercera mitad de la placa. El espectro de FABMS de la fracción B mostró una m/z de 286 como pico mayoritario, con picos menores a m/z 268, 300, 438, 452, y 592.

Fracción F

Se separó una tercera porción del primer extracto de metanol (468 mg) por cromatografía sobre sílice flash, utilizando el sistema de disolvente cloroformo/1-butanol/ácido acético/agua (8:12:1:1). Para eliminar el ácido acético, cada una de las 10 fracciones así obtenida se neutraliza por (a) adición de agua (la mitad del volumen de la fracción) y separación de las dos fases, (b) extracción de la capa acuosa con cloroformo (mitad del volumen x 2), (c) lavado de las capas orgánicas combinadas con bicarbonato sódico al 5% hasta que el pH de la capa acuosa estuvo por encima de 7 (2 a 3 x la mitad del volumen), y a continuación (d) lavado de la capa orgánica con agua (mitad del volumen). La tercera fracción (24 mg), que poseyó la mayor parte de la bioactividad, se cromatografió en Sephadex LH-20, eluyendo con metanol, para dar ocho fracciones. La sexta fracción (2,3 mg) se separó por HPLC repetida, utilizando las mismas condiciones que para la separación de la fracción A-C. Se separó el formiato amónico como la fracción A-C. La fracción que se eluyó a t_{r} 8,1 min fue la biológicamente más activa y se hace referencia a la misma como fracción F. Esta fue demasiado pequeña como para que pudiera obtenerse un peso adecuado, pero probablemente fue de 100-200 \mug (aproximadamente un rendimiento de 1 a 2 x 10^{-4} %). Las fracciones que se eluyeron más tarde que ésta también mostraron ser tanto citotóxicas y con actividad formadora de células dirigidas, aunque menos potentes. Esto sugirió que el compuesto(s) bioactivo no se eluyó a un pico bien definido al igual que los diferentes homólogos eluidos a tiempos diferentes, pero no fueron bien separados. La CCF sobre sílice (3:12:2:2 CHCl_{3}/1-BuOH/AcOH/H_{2}O) mostró una mancha positiva a la ninhidrina a R_{f} 0,44. Las últimas fracciones eluidas también mostraron esta misma mancha, pero menos intensa. El espectro FABMS de la fracción F muestra (en orden decreciente de intensidad) m/z 286, 268, 300, 314, 344, 438, 452, 592, 669.

Disección

Se situó una almeja viva en un recipiente con aproximadamente 10 ml de éter dietílico y se enfrió (4ºC) durante 20 h. Se diseccionó en nueve órganos: pata, sistema digestivo (incluyendo el estómago, intestinos y saco de estilo cristalino), gónadas, sifón, branquias, corazón, manto, músculos aductores, y el resto de la masa visceral. Cada órgano se empapó en primer lugar en metanol/tolueno (3:1, 10 ml/g de muestra) y a continuación se homogenizó en un mezclador Virtis. Se filtraron los extractos y se eliminó el disolvente. Se trituró el residuo con diclorometano y metanol para dar 155 mg (pata), 60 mg (sistema digestivo), 147 mg (gónadas), 101 mg (sifón), 65 mg (branquias), 2,5 mg (corazón), 168 mg (manto), 101 mg (músculos aductores) y 252 mg (masa visceral).

En un experimento separado, se extrajo de un modo análogo una pata que había sido calentada (189 mg). Se extrajo de un modo más extensivo una muestra mayor de almejas calentadas (483 g) empapándolas en primer lugar en metanol/tolueno 3:1 (3 x 500 ml) y a continuación se homogenizó la muestra en los mismos disolventes (5 x 500 ml). Se evaporó una pequeña muestra de los extractos combinados y se disolvió de nuevo en metanol para su valoración.

Procedimientos Generales

Las rotaciones ópticas se midieron en un polarímetro digital Jasco DIP-370, con una célula de 3,5 X 50 mm 1 ml. Los puntos de fusión se determinaron en un aparato de puntos de fusión de capilar Thomas Hoover. Los RMN de H^{1} y de C^{13} se registraron en un espectrofotómetro Varian Unity-400 o Unity -500. Los desplazamientos químicos se describieron en ppm relativos al disolvente (7,26, CDCl_{3} y 3,30, CD_{3}OD). Los espectros de masas de alta resolución (HRFAB) y de bombardeo atómico rápido (FAB) se registraron en un espectrómetro de masas VG ZAB-SE o 70 SE4F. La CCF se llevó a cabo en placas de capa fina con gel de sílice 60 de Merck. Las separaciones cromatográficas se llevaron a cabo por cromatografía flash utilizando gel de sílice de 230-400 mesh de Merck. Todas las reacciones sensibles a la humedad se llevaron a cabo en un utensilio de vidrio secado al horno, bajo atmósfera de N_{2} . Los solventes fueron destilados antes de su uso: el THF sobre cetil benzofenona, el CH_{2}Cl_{2} sobre CaH_{2} y los demás disolventes se utilizaron de grado reactivo.

Éster metílico del ácido (S)-2-(N,N-Dibencilamino)propiónico (30)

A un balón de fondo redondo de 300 ml se añadió 20 (10,0 g, 71,6 mmol), bromuro de bencilo (25,73 g, 150,4 mmol), K_{2}CO_{3} (9,90 g, 71,6 mmol) y CH_{3} CN (172 ml). Se agitó la mezcla a 60 C hasta que la reacción fue completa por CCF. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y se separó el sólido por filtración. Se concentró el filtrado a vacío para dar un aceite que se purificó por cromatografía flash sobre gel de sílice (hexano/EtOAc 9:1) para dar un aceite incoloro.

[\alpha]^{25}_{D} = 113,6 (c 1,2, CHCl_{3});

RMN H^{1} (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 1,35 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 3,53 (q, 1H, J = 7,0 Hz), 3,65 (d, 2H, J = 1,38 Hz), 3,75 (s, 3H), 3,85 (d, 2H, J = 13,8 Hz), 7,22-7,42 (m, 10H);

RMN C^{13} (100 MHz) \delta 14,9, 51,1, 54,3, 56,0,2,8,4,1, 4,5, 139,1,175,1;

FABMS m/z 284,1 (M+H), 282,1 (M-H), 224,2 (M-COOCH_{3});

HRFABMS calculado para C_{18} H_{22} NO_{2} M_{r} 284,1651 (M+H), encontrado M_{r} 284,1650.

(S)-2-(N,N-Dibencilamino)-1-propanol (40)

Sobre una suspensión de LiAlH_{4} (550 mg, 14,5 mmol) en THF (20 ml) se añadió gota a gota una solución de 30 (910 mg, 3,21 mmol) en THF (2 ml). Se agitó la solución durante 15 minutos y a continuación se calentó a 65ºC durante 3 horas. Se enfrió la reacción a 0ºC y se finalizó con HCl 0,1 N HCl. Se filtró la reacción a través de Celite y se lavó la Celite con THF (2x15 ml) y se eliminó el disolvente a vacío. La cromatografía flash sobre gel de sílice (4:1 hexano/EtOAc, R_{f} = 0,30) dio lugar a 750 mg (rendimiento del 92%) de un sólido incoloro:

Punto de fusión 40-41ºC (de hexano) Punto de fusión de la literatura 40-41ºC (de hexano) Ver, Stanfield y col., J. Org. Chem. 1981,49, 4799-4800;

[\alpha]^{25}_{D} =+86,6 (c 1, CHCl_{3}) Literatura [\alpha]^{23}_{D} =+ 88,2 (c 1, CHCl_{3});

RMN H^{1} (500 MHz CDCl_{3}) \delta 0,98 (m, 3H), 2,98 (m, 1H), 3,13 (m, 1H), 3,35 (m, 3H), 3,45 (m, 1H), 3,81 (m, 2H), 7,19-7,41 (m. 10H);

RMN C^{13} (1 MHz) \delta 8,6, 52,9, 54,1, 62,7, 3,2, 4,5, 5,0, 5,3;

FABMS m/z 256,2 (M+H), 224,2 (M-CH_{2}OH);

HRFABMS calculado para C_{17} H_{22} NO M_{r} 256,1701 (M+H), encontrado M_{r} 256,1702.

(S)-2-(N,N-Dibencilamino)propionaldehído (50)

Se añadió DMSO seco (0,53 ml, 7,43 mmol) sobre una solución agitada de cloruro de oxalilo (0,31 ml, 3,6 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (7,5 ml) a -78ºC. Se dejó agitar la solución durante 15 minutos seguido por la adición de 40 (740 mg, 2,90 mmol) en CH_{2} Cl_{2} (7,5 ml). Después de 30 minutos, se añadió Et_{3} N (1,0 ml, 7,2 mmol) y se dejó calentar hasta temperatura ambiente. Se extrajo la solución con NaHCO_{3} (20 ml) y se extrajo la capa acuosa con CH_{2}Cl_{2} (2 x 15 ml). Se lavó la capa orgánica con una solución de NaCl saturada, se secó con MgSO_{4} y se concentró a vacío a temperatura ambiente para dar 720 mg (rendimiento del 98%) de un aceite amarillo que se transformó en un sólido cuando se enfrió a -20 C. El aldehído se utilizó sin purificación adicional:

Punto de fusión 52-54ºC, Punto de fusión de la literatura 55,5ºC Ver, Dix y col., Arch Pharm (Weinheim) 1995, 328, 203-205.;

[\alpha]^{26}_{D} =-36,0 (c 1, CHCl_{3} Literatura [\alpha]^{20}_{D} = -35,1 (c 1, EtOAc);

RMN H^{1} (400 MHz, CDCl3) \delta 1,19 (d, 2H, J= 7,0 Hz), 3,34 (q, 1H, J= 7,0 Hz), 3,58 (d, 2H, J= 13,7 Hz), 3,74 (d, 2H, J= 13,7 Hz), 7,26 (m, 2H), 7,33 (m, H), 7,42 (m, 4H), 9,74 (s, 1H);

RMN C^{13} (100 MHz) \delta 6,7, 54,9, 62,8, 3,3, 4,4, 4,8, 139,1, 204,6;

FABMS m/z 408,2 (M+MB), 254,2 (M+H), 22,2 (M-CHO);

HRFABMS calculado para C_{17} H_{20} NO M_{r} 254,1545 (M+H), encontrado M_{r} 254,1545.

(2S,3R)-2-(N,N-Dibencilamino)-3-octadecanol (60)

Se añadieron virutas de Mg (237 mg, 9,75 mmol), dibromoetano (16 \muL, 0,189 mmol) en THF (160 \muL) sobre un matraz de dos bocas equipado con un condensador de reflujo. Se añadió ½ ml de una solución de 1-bromopentadecano (970 mg, 3,33 mmol, 3,25 ml THF). Después de que la reacción se hubiera iniciado se añadió el resto gota a gota. Sobre la solución grisácea se añadió gota a gota, 50 (105 mg, 0,413 mmol) en THF (0,5 ml). Se dejó agitar la reacción durante toda la noche seguido por la adición de H_{2}O (5 ml) y de 0,1 N HCl hasta que la solución se volvió clara. Se extrajo la mezcla con EtOAc (3 x 10 ml). Se lavó la capa orgánica con NaHCO_{3} al 5% y a continuación con una solución saturada de NaCl y se secó sobre MgSO_{4} . Se eliminó el disolvente a vacío para dar una mezcla de sólido-aceite (750 mg). Se purificó el material crudo por cromatografía flash sobre sílice (hexano/EtOAc 8:1, R_{f} = 0,34) para dar 120 mg de un sólido. Este sólido se purificó de forma adicional por HPLC sobre sílice (hexano/EtOAc 93:7) para dar un sólido ceroso incoloro (94,3 mg, 49% de rendimiento):

[\alpha]^{25}_{D} =+16,3 (c 1, CHCl_{3});

^{1}H NMR (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,88 (t, 3H, J = 7,0 Hz), 1,10 (d, 3H, J = 6,7 Hz), 1,16-1,41 (m ancho, 26H), 1,56 (m, 1H), 1,69 (m, 1H), 1,79 (m, 1H), 2,72 (quin, 1H, J= 6,7 Hz), 3,47 (d, 2H, J= 13,8 Hz), 3,60 (m, 1H). 3,76 (d, 2H, J = 13,8 Hz), 7,22 (m, 2H), 7,30 (m, 4H), 7,34 (m, 4H); ^{13}C NMR (1 MHz) \delta 8,67, 14,11, 22,68, 25,90, 29,35, 29,61, 29,64, 29,68, 29,69,31,91, 34,27, 54,79, 57,26, 73,65, 2,89, 4,25, 4,77, 140,17;

FABMS m/z 465 (M+H), 448 (M-H_{2}O), 464 (M-H), 388 (M-Ph), 224 (M-C_{16} H_{33}O); HRFABMS calculado para C_{32}H_{52}NO M_{r} 466,4049 (M+H), encontrado M_{r} 466,4037.

La asignación de la configuración 2S,3R está basada en comparación de los desplazamientos químicos de los protones bencilo en 60 a valores de la literatura para los diastereómeros syn y anti del 2-(N,N-dibencilamino)-3-pentanol. El isómero anti tiene una diferencia de desplazamiento químico de 0,29 ppm y el syn es 0,52 ppm. La comparación de los otros pares de syn-anti muestran que el intervalo para el isómero syn está comprendido entre 0,44 y 0,54 ppm y para el anti entre 0,05 y 0,29 ppm. El valor para 60 es 0,29 ppm.

(2S,3R)-2-Amino-3-octadecanol (1)

A un matraz de fondo Redondo de 15 ml se añadió 60 (88,2 mg, 0,189 mmol) en MeOH (2 ml) y Pd (OH)_{2} -C al 20% (11 mg). Se agitó la mezcla bajo una presión de 1 atmósfera toda la noche. Se eliminó el catalizador por filtración a través de un filtro de una jeringa de 25 mm (membrana de nylon de 0,2 \mum) y se lavó el filtro con 4 ml de MeOH. A continuación se eliminó el disolvente a vacío para dar 51,50 mg de un sólido blanco. Se purificó el producto por cromatografía sobre un tubo de 6 ml de LC-Si SPE (CH_{2}Cl_{2}/MeOH 90:10 seguido por MeOH del 100%) para dar 49,47 mg (92% de rendimiento) de un sólido blanco:

Punto de fusión 66-67ºC;

[\alpha]^{26}_{D} =+24,9 (c 1, CHCl_{3});

RMN H^{1} (500 MHz, CD_{3}OD) \delta 0,89 (t, 3H, J = 7,0 Hz), 1,05 (d, 3H, J = 6,6 Hz), 1,20-1,56 (m ancho, 31H), 2,81 (qd, 1H, J_{1} =6,6 Hz, J_{2} = 3,8 Hz), 3,42 (dt, 1H, J_{1} = 8,8 Hz, J_{2} = 3,8 Hz);

RMN C^{13} (1 MHz) ä 14,60, 16,82, 23,90, 27,40, 30,65, 30,90, 30,95, 30,96, 33,23, 34,13, 52,33, 76,16;

FABMS m/z 286,3 (M+H), 268,3 (M-OH),

HRFABMS calculado para C_{18}H_{40}NO M_{r} 286,3110 (M+H), encontrado M_{r} 286,3109.

Se separó una mezcla de diastereómeros de 3-hidroxi-2-(1-metil-2-2-hidroxi-heptadecil)-isoindolin-1-ona (152, 22 mg) por una HPLC ciano con hexano/2-propanol (98:2, 1 ml/min) para dar cuatro compuestos (152a-152d). Se determinó la pureza de cada pico por una nueva inyección en HPLC. Análisis calculado para C_{26} H_{44} NO_{3} : 418,3321 (M+H). Encontrado: 418,3321 HRFABMS).

152a: 4,2 mg; t_{r} 13,3 min;

RMN H^{1} (CDCl_{3}) \delta 7,77 (1 H, d, 7,3), 7,58 (2H, m), 7,50 (1H, m), 5,91 (2H, s), 4,51 (1H, m), 3,78 (1H, m), 1,58 (2H, m), 1,40 (3H, d, 7,1), 1,24 (26H, m), 0,87 (3H, t, 6,5); FABMS m/z 418, 400;

relación relativa de los diastereómeros 17:1:0:0 (152a:152b:152c:152d).

152b: 13,7 mg; t_{r} 13,9 min;

RMN H^{1} (CDCl_{3}) \delta 7,70 (1 H, d, 7,3), 7,54 (2H, m), 7,47 (1H, m), 5,88 (2H, s), 4,37 (1H, m), 3,85 (1H, m), 1,52 (2H, m), 1,27 (3H, d, 7), 1,25 (26H, m), 0,87 (3H, t, 6,5); FABMS m/z 41, 400;

relación relativa de los diastereómeros 1:6,8:0:0 (152a:152b:152c:152d).

152c: 1,4 mg; t_{r} 20,0 min;

RMN H^{1} (CDCl_{3}) \delta 7,78 (1H, d, 7,3), 7,59 (2H, m), 7,51 (1H, m), 5,93 (2H, s), 4,12 (1H, m), 3,99 (1H, m), 1,58 (2H, m) 1,37 (3H, d, 7,0, 1,25 (26H, m), 0,87 (3H, t, 6,5); FABMS m/z 418, 400;

relación relativa de los diastereómeros 0:2,5:45:1(152a:152b:152c:152d).

152d: 1,5 mg; t_{r} 21,7 min;

RMN H^{1} (CDCl_{3}) \delta 7,77 (1 H, d, 7,3), 7,59 (2H, m), 7,51 (1H, m), 5,86 (2H, s), 4,12 (1H, m), 3,90 (1H, m), 1,58 (2H, m), 1,45 (3H, d, 6,6), 1,24 (26H, m), 0,87 (3H, t, 6,5); FABMS m/z 418, 400;

relación relativa de los diastereómeros 0:1:2:21 (152a:152b:152c:152d).

Cada diastereómero se desprotegió de forma separada siguiendo el método de Osby y col. Cada isómero se disolvió en 2- propanol/agua (6:1, 0,1 M para 152a y 152b, 0,7 M para 152c y 152d). Se añadió borohidruro sódico (5-10 equivalentes) a cada solución, la cual se agitó a continuación a 25ºC durante 24 h. A continuación se ajustó el pH de cada solución a pH 4,5 con ácido acético y se agitó a 80ºC durante un periodo adicional de 24 h. Se añadió formiato amónico para dejar el pH de cada solución por encima de 7 y a continuación se eliminó el disolvente de cada uno mediante una corriente de nitrógeno. Se aplicó el residuo de cada uno sobre una columna de SPE de sílice, que se lavó en primer lugar con hexano:2-propanol (9:1) y a continuación se eluyó el producto con 2-propanol. El RMN H^{1} indicó que 152a y 152d produjeron 154 (1,15 mg, 40%, y 0,48 mg, 47% respectivamente), mientras que 152b y 152c produjeron 155 (3,35 mg, 42%, y 0,38 mg, 40%, respectivamente).

154: Sólido blanco; CCF sobre sílice (3:12:2:2 CHCl_{3}/1-BuOH/AcOH/H_{2} O) R_{f} 0,48 (positivo a la ninhidrina, rosa);

IR (NaCl) 2919, 2851, 1563, 1466, 1406, 758 cm^{-1};

FABMS m/z 438, 286, 268, 85, 70, 69, 57, 55, 44.

Análisis calculado para C_{18} H_{40} NO: 286,3110 (M+H). Encontrado 286,3115 (HRFABMS).

155: Sólido blanco; CCF sobre sílice (3:12:2:2 CHCl_{3}/1-BuOH/AcOH/H_{2} O) R_{f} 0,50 (positivo a la ninhidrina, rosa);

IR (NaCl) 3281, 2917, 2849, 1568, 1520, 1470, 1412 cm^{-1};

FABMS m/z 438, 286, 268, 85, 70, 69, 57, 55, 44,

Análisis calculado para C_{18} H_{40} NO: 286,3110 (M+H). Encontrado: 286,3109 (HRFABMS).

Acetilación

Se disolvió una parte de la fracción B (560 \mug) en anhídrido acético (200 \muL) y piridina (400 \muL) y se agitó a 25ºC durante 4,5 h, a cuyo tiempo no pudo observarse ningún resto del producto de partida por CCF. Se eliminó el disolvente mediante una corriente de nitrógeno para dar AcB: sólido de color blanco crudo;

CCF sobre sílice R_{f} 0,86 (3,12:2:2 CHCl_{3}/1-BuOH/AcOH/H_{2}O, ácido fosfomolíbdico), 0,65 (9:1 CHCl_{3}/MeOH, ácido fosfomolíbdico);

IR (NaCl) 2922, 2853, 1741, 1651, 1547, 1460 1371, 1234, 1022, 970 cm^{-1};

FABMS m/z 370, 310, 268;

\newpage

CIMS m/z 426, 424, 412, 410, 398, 384, 370, 368, 364, 338, 324, 310, 165, 149, 139, 1, 121, 111, 97, 86, 61, 57, 55.

Análisis calculado para C_{22}H_{44}NO_{3}: 370,3321 (M+H). Encontrado: 370,3326 (HRFABMS).

Triacetilesfingosina (133)

Siguiendo un procedimiento similar a de Grode y Cardellina D-eritro-esfingosina (4, 2 mg, 6,7 \mumol, Sigma) en anhídrido acético (1 ml) y piridina (2 ml) se agitó a 25ºC durante 4,5 h, a cuyo tiempo no pudo observarse ningún resto de material de partida por CCF. Se eliminó el disolvente mediante una corriente de nitrógeno para dar 133: sólido blanco;

CCF sobre sílice R_{f} 0,86 (3:12:2:2 CHCl_{3}/1-BuOH/AcOH/H_{2}O, ácido fosfomolíbdico), 0,65 (9:1 CHCl_{3}/MeOH, ácido fosfomolíbdico);

FABMS m/z 580, 426, 366, 306, 264;

CIMS m/z 468, 454, 426, 424, 394, 366, 364, 306, 264, 144, 85, 84, 83, 61.

(2S, 3S)-2-Acetamido-3-acetoxioctadecano (156)

Se agitó (2S, 3S)-2-amino-3-octadecanol (154, 150 \mug, 0,5 \mumol) en anhídrido acético (50 \mul) y piridina (100 \mul) a 25ºC durante 5 h, a cuyo tiempo no se pudo observar restos de producto de partida por CCF. Se eliminó el disolvente con una corriente de nitrógeno para dar 156: sólido blanco;

CCF sobre sílice R_{f} 0,86 (3:12:2:2 CHCl_{3}/1-BuOH/AcOH/H_{2}O, ácido fosfomolíbdico);

IR (NaCl) 3286, 2924, 2853, 1740, 1653, 1541, 1456, 1371, 1238 cm^{-1};

FABMS m/z 522, 370, 328, 310, 286, 268.

Análisis calculado para C_{22} H_{44} NO_{3:} 370,3321 (M+H). Encontrado: 370,3326 (HRFABMS).

(2S, 3R)-2-Acetamido-3-acetoxioctadecano (157)

Se agitó (2S, 3R)-2-amino-3-octadecanol (155, 750 \mug, 2,6 \mumol) en anhídrido acético (200 \muL) y piridina (400 \muL) a 25ºC durante 5h, a cuyo tiempo no se observó ningún resto de producto de partida por CCF. Se eliminó el disolvente con una corriente de nitrógeno para dar 157: sólido blanco;

CCF sobre sílice R_{f} 0,86 (3:12:2:2 CHCl_{3}/1-BuOH/AcOH/H_{2}O, ácido fosfomolíbdico);

IR (NaCl) 3289, 2917, 2849, 1728, 1637, 1545, 1464, 1369, 1240 cm^{-1};

FABMS m/z 522, 370, 328, 310, 286, 268.

Análisis calculado para C_{22}H_{44}NO_{3}: 370,3321 (M+H). Encontrado: 370,3319 (HRFABMS).

Acetónido de Espisulosina 285 (146)

Se disolvió una parte de la fracción A (40 \mug) en acetona (200 \muL) a la que se añadió ácido clorhídrico 0,1 N (20 \muL). Se agitó esta solución a 25ºC durante 24 h, después de lo cual se eliminó el disolvente con una corriente de nitrógeno. El FABMS indicó que se había formado una pequeña cantidad del acetónico 146:

m/z 592, 452, 438, 326,3430, 300, 286, 268.

Análisis calculado para C_{21}H_{44}NO: 326,3423 (M+H). Encontrado 326,3430 (HRFABMS).

(4S, 5R)-4-Metil-5-(n-pentadecil)-oxazolidinona (158)

Se disolvió (2S, 3R)-2-amino-3-octadecanol (155, 750 \mug, 2,6 \mumol) en diclorometano (100 \muL) al que se añadió 1,1'-carbonildiimidazol (0,85 mg, 5,3 \mumol) y trietilamina (0,4 \muL, 2,9 \mumol). Se agitó la solución durante 5 h y a continuación se eliminó el disolvente con una corriente de nitrógeno. Se analizó el producto crudo 158 sin purificación:

IR (NaCl) 36, 2919, 2851, 1742, 1713, 1551, 1470, 1395, 1321, 49, 1239, 1094, 1061, 1001, 768, 743, 664 cm^{-1};

FABMS m/z 785, 623, 474, 406, 362, 328, 312, 286, 268.

Análisis calculado para C_{19}H_{38}NO_{2}: 312,2903 (M+H). Encontrado: 312,2903 (HRFABMS).

Investigación Adicional de Cambios en la Morfología de la Célula Materiales

El ácido lisofosfatidico (LPA), los anticuerpos de la tubulina y la faloidina fueron todos ellos obtenidos de Sigma. La fluoresceína y el anticuerpo de anti-ratón de cabra marcado con rojo Texas fueron obtenidos de Amersham (U. K.). El anticuerpo intensificado frente a la proteína Rho fue obtenido de Sta Cruz Biotechn.

Cultivo de células

Se hicieron crecer células Vero en un medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal al 10%. Se añadió espisulosina o LPA a estos cultivos a una concentración de 0,2 - 1,0 \mug y 50-10 \muM respectivamente, entre 4 y 24 horas. Se contabilizaron las células con el procedimiento del hemocitómetro de exclusión del fármaco utilizando una solución de azul de tripano al 0,4% en solución salina tamponada Hanks (Celis y Celis, "General Procedures for Tissue Culture in Cell Biology, a Laboratory Handbook" Academic Press Inc, Vol 1, pp. 5-17.)

Ejemplo A La espisulosina 285 provoca cambios en la morfología de la célula

Se incubaron células Vero con espisulosina 285 (0,5 \muM) durante 4 horas. La Figura 3 es una microfotografía para los resultados del Ejemplo A. Se alteró la forma de la célula a partir de una forma poligonal (células no tratadas, panel a) a una forma fusiforme (panel b). El panel c representa un aumento mayor del cultivo al que se añadió la espisulosina.

Ejemplo B El cambio en la morfología de la célula es debido a un efecto en los microfilamentos de la célula

Con el fin de identificar la organización del microfilamento y la organización del microtúbulo en las células tratadas con espisulosina, se tiñeron las células con faloidina para detectar los polímeros de actina, y un anticuerpo de antitubulina para detectar la tubulina.

Se incubaron células Vero en presencia (panel b, d) o ausencia (a, c) de 0,5 \muM de espisulosina durante 4 horas. Las células crecidas en cubreobjetos se fijaron con metanol a - 20ºC (para el anticuerpo de la tubulina) o con paraformaldehído al 4% en PBS en solución salina tamponada con fosfato (peso/v) para la incubación de faloidina. En el segundo caso las células se lavaron con Triton X100 al 0,2% en PBS. Se lavaron los cubreobjetos con PBS y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo de tubulina (diluido 1/1000 en PBS) o con faloidina (1 mg/ml). Después del lavado con PBS los portaobjetos incubados con el anticuerpo de la tubulina se cubrieron por encima con anticuerpos anti-ratón de cabra marcados con rojo Texas o fluoresceína (diluido 1:50 en PBS). Los cubreobjetos se montaron con Mowiol y se almacenaron en la oscuridad a 4ºC hasta su observación.

La Figura 4 es una microfotografía para los resultados en el Ejemplo B. El panel "a" representa las células teñidas con faloidina (tinte de actina) y no se trataron con espisulosina. El panel "b" representa las células teñidas para la faloidina y tratadas con espisulosina. El panel "c" representa las células teñidas para la tubulina y no tratadas con espisulosina. El panel "d" representa las células teñidas para la faloidina y tratadas con espisulosina. Hay una dramática disminución en la actina en las células tratadas con espisulosina, en comparación con las células no tratadas. Bajo las mismas condiciones, la red de microtúbulos permanece en una forma polimerizada.

Ejemplo C Efecto de la espisulosina en la proteína Rho

El GTP pequeño unido a la proteína Rho está implicado en la formación de la actin-miosina "fibras tensionadas" (Hall, A., Science, 279, 1998, p 509 - 514). Por consiguiente, se analizaron la mobilidad electroforética y la distribución celular de la Rho en las células tratadas con espilosina.

La Figura 5 es un electroforetograma del Ejemplo C. El panel A, se fraccionaron cantidades equivalentes de proteína a partir de un extracto celular a partir de células no tratadas (a) o a partir de células tratadas con espisulosina 0,5 \muM (20 horas) (b) por electroforesis de gel y se hicieron correr en papel de nitrocelulosa para analizar la cantidad de la proteína Rho.

En el panel B se llevó a cabo el experimento tal como se ha descrito anteriormente, excepto que se fraccionó el homogenizado en una fracción particulada (membrana, "M") y una fracción soluble ("S").

Se llevó a cabo el fraccionamiento subcelular colocando las células en un tampón hipotónico (0,25 M de sacarosa, 20 mM de HEPES pH 7,4, 2 mM de EDTA, 1 mM de PMSF, 10 \mug/ml de aprotinina, leupeptina y pestatina), y se lisiaron con un Dounce. En primer lugar se centrifugó el homogenizado a 750 g durante 5 minutos para eliminar los núcleos y las células no rotas, y se centrifugó el sobrenadante de forma adicional a 30.000 g durante 1 hora (4ºC) para aislar una fracción en partículas tipo gránulos (fracción de la membrana putativa) y un sobrenadante. Se caracterizaron las diferentes fracciones por electroforesis y Western Blotting utilizando un anticuerpo frente a la proteína Rho.

No se observó un cambio significativo en la cantidad o movilidad de la Rho en el tratamiento de las células con espisulosina. Sin embargo, se observó una disminución en la proporción de Rho asociada con la fracción del particulado.

Ejemplo D Efecto del ácido lisofosfatídico (LPA) en la acción de la espisulosina

Se conoce que el LPA incrementa el nivel de fibras tensionadas por activación de la proteína Rho. Se examinó el efecto del LPA en las células tratadas con espisulosina, y en células no tratadas.

Se incubaron células Vero en ausencia (a) o presencia (b) de 10 \muM de LPA durante 2 horas, o en presencia (c) de 0,5 \muM de espisulosina durante 20 horas, o en presencia (d) de 10 \muM de LPA en primer lugar (2 horas) y después con 0,5 \muM de espisulosina durante otras 18 horas adicionales.

La Figura 6 es una microfotografía para los resultados en el Ejemplo D. El panel b indica el efecto del LPA en incrementar el nivel de actina. La incubación de células Vero con espisulosina durante 24 horas dio lugar a la aparición de células redondeadas, ver panel c. Estas células se separaron del plato del cultivo y murieron. La adición de LPA antes de la espisulosina previene el cambio morfológico promovido por la espisulosina.

Datos in vivo Ejemplo E El efecto de la Espisulosina 285 in vivo

Se ensayó la espisulosina 285 es estudios in vivo frente a modelos de xenoinjertos de cáncer de próstata humano (PC-3) y cáncer renal humano (MRI-H-121). Estos modelos utilizan tumores humanos sólidos implantados que crecen y se incrementan en volumen con el tiempo. El volumen promedio del crecimiento del tumor en animales control proporciona la base para la comparación. Para los compuestos activos se inhibió el crecimiento del tumor tanto completamente (valores de %T/C < 1%, o negativos), o parcialmente (> 1% T/C - 50% T/C). Un nivel de actividad que sea menor del 40% T/C es considerado estadísticamente significativo. Las dosis de espisulosina utilizadas se dieron como el máximo tolerado, dosis no letal (MTD), ½ MTD y ¼ MTD. La liberación del fármaco fue por vía intraperitoneal.

Cáncer de próstata humano PC-3

Compuesto	Dosis Total	% T/C	Día	Comentario
	(mg/kg)
Espisulosina 285	9,990	- 21%	11	estasis (remisión completa)
Espisulosina 285	5,010	-1%	11	estasis (remisión completa)
Espisulosina 285	2,499	223%	15
Control		100%	15

Cáncer renal humano MRI-H-121

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Compuesto	Dosis Total	% T/C	Día	Comentario
	(mg/kg)
Espisulosina 285	9,990	28%	11	inhibición (remisión parcial)
Espisulosina 285	5,010	35%	11	inhibición (remisión parcial)
Espisulosina 285	2,499	43%	15
Control		100%	15

La espisulosina 285 es efectiva frente a ambos tipos de tumores, reduciendo de forma significativa el tamaño del tumor en el caso del modelo PC-3 de cáncer de próstata humano a dosis mayores. La espisulosina 285 reduce el crecimiento del cáncer renal humano, con efectos que continúan hasta unas pocas semanas después de la última dosis del fármaco.

Ejemplo F

Se llevó a cabo una selección in vitro expandida de la espisulosina 285 frente a diferentes líneas celulares. Se obtuvieron los siguientes datos:

Categoría	Línea	Tumor	IC50	Índice terapéutico de
				CV-1
Sólido	SK-HEP-1	Hígado	3,51 E-15	7863
	PANC-1	Páncreas	1,71 E-12	16
	HT-29	Colon	2,56 E-12	11
	786-0	Renal	2,75 E-12	10
	FADU	Faringe	4,99 E-12	6
	Hs 746T	Estómago	7,89 E-12	3
	SK-OV-3	Ovario	1,40 E-11	2
	MX-1	Mamario	3,89 E-11	1
	RAMOS	Burkitts	4,82 E-11	1
	P3HR1	Burtkitts	6,73 E-11	0
	SW684	Fibrosarcoma	1,05 E-09	0
Linfoma	U-937	Linfoma	1,96 E-11	1
	H9	Linfoma	3,10 E-11	1
Leucemia	HL60	Leucemia	8,50 E-12	3
	ARH77	Leucemia	1,36 E-12	2
	K562	Leucemia	1,57 E-11	2
	CCRF-SB	Leucemia	1,05 E-09	0
Normal	CV-1	Fibroblastos de riñón	2,76 E-11	1

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El intervalo de las potencias de las IC50 frente a las líneas de células tumorales son desde nanomolar, 1,05 E-09 nM, a fentamolar, 3,51 E-15 fM. Es excepcional ir más allá de un intervalo nM y pM para encontrar un fármaco que tenga actividad en el intervalo de fM.

Las actividades frente a los tumores sólidos fueron generalmente 1 log más potentes que frente a las leucemias y linfomas. Entre los tumores sólidos, el crecimiento más lento fue el más sensible, culminando con el crecimiento muy lento del hepatoma SK-HEP-1.

Se observaron los mejores índices terapéuticos comparados con las líneas celulares normales de CV-1 con los tumores sólidos de crecimiento más lento, mientras que la potencia de la IC50 (2,76 E-11) fue comparable a la de la leucemia/linfomas. Los TIs del tumor sólido oscilaron entre 1-20 unidades y el TI para el hepatoma fue >3 log.

La línea celular del tumor renal estuvo en el grupo más activo, las potencias de pM, que correlacionan bien los datos del xenoinjerto in vivo.

Referencias

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La presente invención ha sido descrita en detalle, incluyendo las realizaciones preferidas de la misma. Sin embargo, será bien apreciado por los expertos en la materia, teniendo en cuenta la presente descripción, que se pueden hacer modificaciones y/o mejoras a esta invención.

Claims (17)

1. Una composición farmacéutica conteniendo una cadena larga, cadena lineal de 2-amino-3-hidroxialcano, junto con un soporte farmacéuticamente aceptable.

2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el 2-amino-3-hidroxialcano es de C_{16} -C_{24}.

3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el 2-amino-3-hidroxialcano es de C_{18} -C_{20}.

4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1. 2, o 3, en donde el 2-amino-3-hidroxialcano es un 2-amino-3-hidroxi alcano de C_{18}.

5. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el 2-amino-3-hidroxialcano es un compuesto de fórmula:

9

y está seleccionado entre la espisulosina 285 (1), n = 12; la espisulosina 299 (2), n = 13; y la espisulosina 313 (3), n = 14.

6. Una composición de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones que es para uso en el tratamiento del cáncer.

7. Una composición de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, que es para uso en el tratamiento de un cáncer seleccionado entre cáncer de pecho, cabeza y cuello, próstata, vejiga, páncreas, pulmón, esófago, hígado, colon, tiroides, melanoma, riñón, testicular, de ovario, y gastro-intestinal.

8. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es para uso en el tratamiento de un cáncer seleccionado entre leucemia y linfoma.

9. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es para uso en terapia dirigida al endotelio vascular para control de la vascularización del tejido y del tumor.

10. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5 en donde el compuesto es la espisulosina 285 y la composición es para uso en el tratamiento de un tumor sólido.

11. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5 en donde el compuesto es la espisulosina 285 y la composición es para uso en el tratamiento de un tumor de lenta proliferación.

12. Una composición de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en donde el compuesto actúa para alterar la actividad de la proteína Rho.

13. Una composición de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, con otro fármaco para uso en terapia combinada.

14. Un 2-amino-3-hidroxialcano de cadena lineal, de cadena larga, para uso en un método de terapia.

15. El uso de un 2-amino-3-hidroxialcano de cadena lineal, de cadena larga, en la preparación de una composición para uso en el tratamiento del cáncer.

16. El uso de la espisulosina 285 en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

17. Un 2-amino-3-hidroxialcano de cadena lineal, de cadena larga, con la excepción del 2-amino-3-hidroxi alcano de C_{18}.