ES2249049T3 - Un metodo para detectar y/o cuantificar un anticuerpo ige especifico en una muestra liquida. - Google Patents
Un metodo para detectar y/o cuantificar un anticuerpo ige especifico en una muestra liquida.Info
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Abstract
Un método para detectar y/o cuantificar un anticuerpo IgE específico contra un ligando en forma de antígeno, anticuerpo o hapteno en una muestra líquida biológica en términos de la capacidad del anticuerpo IgE para unirse a un receptor de IgE, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto (i) la muestra con (ii) un ligando libre disuelto en forma de un antígeno, un anticuerpo o un hapteno, para formar una mezcla I que comprende complejos que contienen IgE, (b) mezclar la mezcla I con un vehículo al que está unido (iii) el receptor de IgE, siendo dicho receptor de IgE CD23 (FceRII) y/o FceRI, para formar una mezcla II que comprende complejos que contienen IgE unida al vehículo, (c) separar los complejos que contienen IgE unida al vehículo de la mezcla II, y (d) determinar la cantidad de complejos que contienen IgE unida al vehículo que se ha formado.
Description
Un método para detectar y/o cuantificar un
anticuerpo IgE específico en una muestra líquida.
La presente invención se refiere a un método para
detectar y/o cuantificar un anticuerpo IgE específico para un
ligando en forma de antígeno, anticuerpo o hapteno en una muestra
líquida.
El documento 94/11734 describe un inmunoensayo de
dos sitios para un anticuerpo, que usa un marcador
quimioluminiscente y un ligando unido a biotina, comprendiendo
dicho método las etapas de (a) mezclar la muestra líquida con un
ligando antígeno, anticuerpo o hapteno unido a biotina o un
derivado funcional de la misma, un anticuerpo dirigido contra el
anticuerpo que se ha de detectar unido a partículas
paramagnéticas, y un compuesto quimioluminiscente de acridinio unido
a avidina, estreptavidina o un derivado funcional de las mismas,
para formar un complejo en fase sólida, (b) separar magnéticamente
la fase sólida de la fase líquida, (c) iniciar una reacción
quimioluminiscente, si la hay, en la fase sólida separada y (d)
analizar la fase sólida separada en relación con la presencia de
una fase quimioluminiscente, que es indicadora de la presencia de
dicho anticuerpo en la muestra.
El método de la técnica anterior es
particularmente adecuado para medir la concentración de
inmunoglobulinas específicas en fluidos corporales, tales como una
inmunoglobulina específica elegida entre el grupo de IgA, IgD, IgE,
IgG, IgM y subclases de las mismas.
El método de la técnica anterior es también
adecuado para la detección y cuantificación del contenido total de
inmunoglobulinas en una clase o subclase, tales como IgA, IgD, IgE,
IgG, IgM y subclases de las mismas.
El documento WO 98/23964 describe un método para
detectar IgE canina, felina y equina. Una realización del método
comprende las etapas de a) unir el receptor Fc\varepsilon humano
(Fc\varepsilonRI) a un sustrato, b) poner en contacto el
sustrato-Fc\varepsilonRI con una composición que
contiene IgE para formar un complejo de
sustrato-Fc\varepsilonRI-IgE, c)
eliminar el exceso de material no unido, d) añadir una molécula
indicadora en forma, p. ej., de un antígeno, que puede unirse
selectivamente a la IgE del complejo, en donde dicha molécula
indicadora puede ser conjugada con un marcador detectable, p. ej. un
marcador fluorescente o un ligando, tal como biotina, e) eliminar
el exceso de moléculas indicadoras y f) medir el complejo marcado
formado.
En otra parte del documento se menciona de un
modo general que el sustrato puede ser, p. ej., un material en
partículas, incluyendo partículas magnéticas, o una célula
recombinante que expresa el Fc\varepsilonRI. También se menciona
de un modo general que el marcador detectable puede ser un marcador
quimioluminiscente.
El ensayo de la técnica anterior descrito en el
documento WO 98/23964 utiliza un exceso de
sustrato-Fc\varepsilonRI y por tanto mide el
contenido total de la IgE específica que se ha de detectar, así
como otras inmunoglobulinas, p. ej. IgG, que pueden unirse al
Fc\varepsilonRI usado. El ensayo se lleva a cabo en estrictas
condiciones in vitro, que implican etapas de lavado después
de la adición de suero a sustrato-Fc\varepsilonRI
así como después de la adición de antígeno.
El trabajo "Regulation and targeting of
T-cell immune responses by antibodies IgE and
IgG", de Bheeka Escura et al., Immunology, vol.86, 343,
350, 1995, describe un método que comprende las etapas de a)
incubar IgE monoclonal quimérica de ratón/humana específca para NIP
(5-yodo-4-hidroxil-3-nitrofenilacetilo)
con alérgeno-NIP para formar un complejo, b)
incubar el complejo con células B, c) eliminar los complejos en
exceso mediante lavado, y d) incubar las células resultantes con
anticuerpo marcado con fluorescencia, contra el anticuerpo
específico de NIP, y e) detectar la fluorescencia.
El documento WO 99/51988, que fue publicado
después de la fecha de prioridad de la presente solicitud, describe
un método para detectar una inmunoglobulina biológicamente activa,
específica del alérgeno, usando una molécula de receptor I Fc
epsilon, que comprende formar un complejo de
Fc\varepsilonRI-inmunoglobulina-alérgeno,
y detectar el complejo formado. El documento menciona realizaciones
preferidas, en las que se ponen en contacto un alérgeno conjugado
con una partícula esférica de material plástico y la muestra que
contiene inmunoglobulina, para permitir la formación de un complejo
de inmunoglobulina-alérgeno unido al sustrato, y en
las que dicho complejo se pone en contacto con
Fc\varepsilonRI.
El problema técnico al que se dirige la presente
invención es proporcionar un método para detectar y/o cuantificar un
anticuerpo IgE específico en una muestra líquida, que permite que
las reacciones de unión entre las diversas sustancias reaccionantes
se lleven a cabo en condiciones más parecidas a la condiciones
in vivo, para dar una medida de la IgE que refleje la
capacidad de la IgE para ejercer sus funciones efectoras mediante
la unión a su receptor, en vez de medir solamente la presencia de
IgE en una muestra.
El método de la presente invención se caracteriza
porque comprende las etapas de
(a) poner en contacto (i) la muestra biológica
con (ii) un ligando libre disuelto en forma de un antígeno, un
anticuerpo o un hapteno, para formar una mezcla I que comprende
complejos que contienen IgE,
(b) mezclar la mezcla I con un vehículo al que
está unido (iii) el receptor de IgE, siendo dicho receptor de IgE
CD23 (Fc\varepsilonRII) y/o Fc\varepsilonRI, para formar una
mezcla I que comprende complejos que contienen IgE unida al
vehículo,
(c) separar los complejos que contienen IgE unida
al vehículo de la mezcla II, y
(d) determinar la cantidad formada de complejos
que contienen IgE unida al vehículo.
El receptor de IgE de baja afinidad CD23
(Fc\varepsilonRII) se encuentra en la superficie de los
eosinófilos, células B y T activadas y células dendríticas. El CD23
es un receptor multifuncional, que se ha demostrado que desempeña
un importante papel en la presentación del antígeno mediada por IgE.
Se cree que el CD23 une principalmente la IgE presente en forma de
complejos multicomponentes que contienen tanto IgE como
antígeno/alérgeno (1,2). Sin embargo, hay publicaciones según las
cuales la IgE monoclonal específica para NIP en forma monómera puede
unirse a CD23 (3). No obstante, no puede excluirse que tenga lugar
la agregación del anticuerpo IgE monoclonal purificado. El CD23
consiste en una cadena \alpha, y puede estar presente como
monómero, dímero o trímero.
El receptor Fc\varepsilonRI de IgE de alta
afinidad se encuentra en la superficie de los mastocitos y
basófilos, y también en células de Langerhans, monocitos y células
dendríticas. También se ha demostrado que el Fc\varepsilonRI
desempeña un importante papel en la presentación del
antígeno/alérgeno mediada por IgE (4). La IgE puede unirse al
Fc\varepsilonRI en forma de IgE monómera, complejos
IgE-antígeno/alérgeno y multicomponentes que
contienen tanto IgE como antígeno/alérgeno. El Fc\varepsilonRI en
los mastocitos y basófilos consiste en una cadena \alpha, una
cadena \beta y una cadena \gamma, y el Fc\varepsilonRI en las
células de Langerhans, monocitos y células dendríticas consiste en
una cadena \alpha y una
cadena \gamma.
cadena \gamma.
La presente invención se basa en el
reconocimiento de que es posible usar CD23 en un ensayo de
detección de anticuerpos con la condición de que se deje reaccionar
la muestra que contiene IgE con el antígeno/alérgeno antes o, como
muy tarde, al mismo tiempo que la unión a CD23.
La presente invención se basa además en el
reconocimiento de que, en general, un procedimiento de ensayo en el
que la muestra líquida que contiene IgE se deja reaccionar con el
antígeno/alérgeno en estado disuelto en una primera etapa, y en el
que la mezcla resultante completa se pone en contacto con el
vehículo-receptor de IgE, simula estrechamente las
condiciones en las que tienen lugar las reacciones idénticas in
vivo.
En particular, el ensayo de la invención simula
cualquier interferencia de otras inmunoglobulinas, así como de
cualquier otro componente que pudiese interferir, presente en la
muestra, interferencia que puede tener lugar durante la formación de
los complejos multicomponentes que contienen IgE y
antígeno/alérgeno, así como durante la formación del
IgE-antígeno/alérgeno. También es posible que la
interferencia de otros ingredientes de la mezcla resultante tenga
lugar en la unión entre vehículo-receptor de IgE por
una parte y IgE monómera, IgE-antígeno/alérgeno y
los complejos multicomponentes que contienen IgE y
antígeno/alérgeno.
Así, el ensayo de la invención hace posible medir
el nivel de IgE específica que, en condiciones in vivo,
puede unirse a los receptores CD23 y/o Fc\varepsilonRI ejerciendo
así su función biológica. En lo que sigue, esto se denomina como
nivel in vivo relevante de IgE. Un logro de la presente
invención es el reconocimiento de que tal medida del nivel in
vivo relevante de IgE contiene una valiosa información acerca
del sujeto del que se ha tomado la muestra, ya que es la capacidad
de la IgE presente para unirse a los receptores de IgE y no el
nivel total de IgE, lo que determina el estatus inmunológico de
dicho sujeto. Así pues, el ensayo de la presente invención ha
proporcionado una posibilidad de determinar el estatus inmunológico
del sujeto con mucha mayor exactitud que con los ensayos de la
técnica
anterior.
anterior.
En particular, el ensayo de la presente invención
es valioso en relación con el control y la evaluación del estatus
inmunológico de sujetos que reciben tratamiento de vacunación de
alergia específica (SAV: Specific Allergy Vaccination). Así, se ha
demostrado que el tratamiento de SAV tiene por resultado una
inhibición o reducción de la unión de la IgE a los receptores de
IgE, y por ello el nivel de IgE in vivo relevante da una
medida mucho más precisa de la gravedad de la enfermedad alérgica
que el nivel de IgE total, por cuanto los dos niveles mencionados
pueden diferir de forma significativa. Por ejemplo, el nivel in
vivo de IgE determinado por el método de la invención antes y
después del tratamiento SAV puede diferir en un factor de cuatro,
mientras que en comparación el nivel de IgE medido mediante un
ensayo de IgE convencional no cambia antes y después del
tratamiento
SAV.
SAV.
La presente invención se refiere además al uso
del método según cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 13ª para
controlar y evaluar el estatus inmunológico de sujetos, en
particular personas, incluyendo tanto los sujetos alérgicos como los
no alérgicos.
En particular, la presente invención se refiere
al uso del método según cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 13ª
para controlar y evaluar el estatus inmunológico de sujetos, en
particular personas, que reciben tratamiento de vacunación de la
alergia específica (SAV).
En una realización de la presente invención el
ligando está marcado.
La expresión "ligando marcado" significa
cualquier ligando que comprende un átomo o una parte marcados, p.
ej. un marcador de átomo radiactivo.
En otra realización de la invención, el ligando
usado en la etapa a) se une a (iv) un compuesto marcador. En otra
realización más de la invención, (iv) se añade un compuesto
marcador en la etapa a) además de (i) la muestra y (ii) el ligando.
También, (iv) puede añadirse un compuesto marcador a los complejos
que contienen IgE formados en la etapa a).
En una realización preferida de la invención (iv)
se añade un compuesto marcador a los complejos que contienen IgE
unida a un vehículo formados en la etapa (b).
En una realización de la invención
particularmente preferida (iv) se añade un compuesto marcador a los
complejos que contienen IgE unida a un vehículo resultantes de la
etapa de separación (c) para formar una mezcla II', en cuyo caso los
complejos marcados resultantes y que contienen IgE unida a un
vehículo se separan de la mezcla II' y se lavan antes de la etapa
(d).
La expresión "compuesto marcador" significa
cualquier sistema marcador adecuado usado convencionalmente en
inmunoensayos, que comprende marcadores luminiscentes, marcadores
quimioluminiscentes, marcadores enzimáticos, marcadores radiactivos,
marcadores fluorescentes y marcadores de absorbancia.
En una realización preferida de la invención, el
compuesto marcador (iv) es un compuesto quimioluminiscente unido
covalentemente a avidina, estreptavidina o un derivado funcional de
las mismas.
El marcador quimioluminiscente es preferentemente
un compuesto de acridiniio tal como
N-hidroxi-succinimida
dimetilacridinio-éster (NHS-DMAE). La
avidina/estreptavidina y el DMAE pueden acoplarse de acuerdo con los
métodos de Weeks et al., Clinical Chem., Vol. 29,
1474-1479 (1983). Otros ejemplos de compuestos
quimioluminiscentes adecuados para ser usados en la presente
invención son luminol, lucigenina y lofina.
En otra realización preferida de la invención, el
compuesto marcador (iv) es un marcador fluorescente unido
covalentemente a avidina, estreptavidina o un derivado funcional de
las mismas. Un ejemplo preferido de marcador fluorescente es
ficoeritrina (PE).
Dependiendo del tipo de sistema marcador usado,
el compuesto marcador puede unirse directamente al ligando o puede
acoplarse al ligando por medio de biotina. En una realización
preferida de la invención, el ligando se une a biotina o a un
derivado funcional de la misma. La biotina se une preferentemente al
ligando añadido en la etapa (a).
El compuesto marcador puede también acoplarse a
la IgE a detectar por medio de un anticuerpo contra la IgE, en el
que el anticuerpo contra la IgE se acopla a la IgE de manera que no
se vea impedida la unión de la IgE con el receptor de IgE. La
combinación del compuesto marcador y el anticuerpo de detección se
añade preferentemente a los complejos que contienen IgE unida al
vehículo formados en la etapa (b) o en la (c). Alternativamente, la
combinación de compuesto marcador y anticuerpo de detección se
añade previamente, bien sea simultáneamente con la muestra y el
ligando en la etapa (a) o bien se añade a los complejos que
contienen IgE formados en la etapa (a).
El anticuerpo de detección es preferentemente un
anticuerpo policlonal.
El uso de un sistema de detección que consiste en
un anticuerpo de detección acoplado a un compuesto marcador tiene
la ventaja de que puede usarse el mismo sistema independientemente
de la IgE a detectar. También, se cree que es ventajoso usar un
sistema de detección que permite el uso de un ligando no marcado, ya
que esto es lo que más se parece a las condiciones in
vivo.
Dependiendo del tipo de sistema marcador usado,
el compuesto marcador puede unirse directamente al anticuerpo de
detección, o puede acoplarse al anticuerpo por medio de biotina. En
una realización preferida de la invención, el anticuerpo de
detección está unido a biotina o a un derivado funcional de la
misma. La biotina se une preferentemente al anticuerpo de detección
añadido después de la etapa (c).
Preferentemente, la muestra que contiene IgE se
pone en contacto con el ligando y se deja incubar para formar una
mezcla I (etapa (a)) antes de poner en contacto la mezcla I con el
vehículo/receptor de IgE (etapa (b)). La duración de la incubación
de la muestra y el ligando puede ser de 1 a 120 minutos,
preferentemente de 5 a 60, más preferentemente de 10 a 40
minutos.
Se cree que este procedimiento es el que mejor
simula las condiciones in vivo, ya que permite que se formen
complejos de ligando y IgE antes de ponerse en contacto con el
receptor de IgE, y ya que CD23 se une a la IgE en forma de dichos
complejos.
Alternativamente, las etapas (a) y (b) se llevan
a cabo simultáneamente en una operación, es decir, la muestra que
contiene IgE, el ligando y el vehículo-receptor de
IgE se mezclan y se incuban juntos. En este caso la duración de la
incubación puede ser de 1 a 120, preferentemente de 5 a 60, más
preferentemente de 10 a 30 minutos.
El vehículo puede ser cualquier material sólido
usado comúnmente en ensayos inmunológicos, tal como una célula
biológica, p. ej. una célula B; un material en partículas
compuesto, p. ej., de vidrio, un metal como el hierro, o un
polímero; una partícula paramagnética; y una placa, un pocillo, un
disco o un tubo compuesto de un polímero.
El vehículo es preferentemente una partícula, lo
más preferentemente una partícula paramagnética. La expresión
"partícula paramagnética" significa cualquier partícula
paramagnética que pueda ser dispersada o suspendida en un medio
líquido, p. ej. partículas "Biomag" (partículas de óxido de
hierro recubiertas con grupos terminados con amina) comercializadas
por Advanced Magnetics Inc., EE.UU., y "Dynabeads" (óxido de
hierro revestido con un polímero) comercializadas por Dynal A.S.,
Noruega.
Cuando se usa un material en partículas como
vehículo, la separación del complejo en fase sólida de la fase
líquida, dependiendo del tipo de partícula sólida usada, puede
llevarse a cabo mediante separación magnética, filtración,
sedimentación, centrifugación, cromatografía o cromatografía en
columna, entre otros procedimientos.
En una realización preferida de la invención, la
IgE a detectar se cuantifica tanto usando CD23 solo para obtener
una primera medida como usando Fc\varepsilonRI solo para obtener
una segunda medida.
La presentación del antígeno mediada por CD23 a
concentraciones bajas de antígeno por medio de las células B
facilita la activación de las células T CD4+, que desempeña un
importante papel en las respuestas alérgicas en fase tardía, es
decir, en respuestas que aparecen entre aproximadamente 6 y 24 horas
después de la exposición. El disparo de Fc\varepsilonRI de
mastocitos y basófilos después del entrecruzamiento de IgE provoca
las respuestas alérgicas inmediatas. Así, las funciones biológicas
de CD23 y Fc\varepsilonRI son diferentes, y por ello los
resultados obtenidos con el ensayo de la invención usando como
receptor de IgE CD23 y Fc\varepsilonRI, respectivamente,
proporcionan distinta información acerca del estatus inmunológico
del sujeto del que proceden las muestras que contienen IgE. Por
tanto es ventajoso obtener resultados tanto para CD23 como para
Fc\varepsilonRI, con el fin de proporcionar una base más completa
para controlar y evaluar el estatus inmunológico del sujeto.
En otra realización preferida de la invención se
usa una combinación de CD23 y Fc\varepsilonRI. En el caso en que
el vehículo usado es un material en partículas, el CD23 y el
Fc\varepsilonRI pueden unirse a partículas distintas o a las
mismas partículas.
El método de la invención puede llevarse a cabo
usando un exceso de ligando en comparación con el nivel de IgE
esperado en la muestra. Es posible usar un gran exceso de ligando,
p. ej. una relación de ligando a IgE de hasta
10000.
10000.
En otra realización preferida de la invención
más, el número de moléculas de ligando está entre 100% y 10.000%,
preferentemente entre 100% y 1000%, más preferentemente entre 100%
y 200%, más preferentemente entre 100% y 150%, y lo más
preferentemente entre 100% y 120%, del número de moléculas de IgE a
detectar.
Como se desprende de lo anteriormente expuesto,
se prefiere que el ligando y la IgE se mezclen en cantidades de
magnitud correspondiente o con un moderado exceso de ligando. Esto
se prefiere porque se cree que corresponde a las condiciones in
vivo, con lo que se favorece la formación del complejo.
La relación preferida de ligando a IgE depende de
diversos factores tales como el tipo de vehículo, las
características de la IgE a detectar y las características del
receptor de IgE y ligando correspondiente a la IgE a detectar, y por
tanto ha de ser optimizada para el ensayo en concreto que se va a
llevar a cabo. Sin embargo, se prefiere en general que la relación
esté dentro de los límites mencionados anteriormente, ya que los
mejores resultados con respecto a la medida del nivel in vivo
relevante de IgE se obtienen con tal relación. Se cree que la
explicación para esto es que, como se mencionó anteriormente, la
presentación del antígeno mediada por CD23 es un mecanismo que
potencia la presentación del antígeno a bajas concentraciones de
antígeno. A concentraciones de antígeno elevadas, dicho mecanismo
se hace irrelevante porque será presentado antígeno suficiente por
las células de presentación del antígeno, incluso sin una captura
específica por el CD23. En otros términos, se cree que los complejos
de ligando e IgE se unen tanto a CD23 como a Fc\varepsilonRI, y
que el equilibrio se desplaza hacia la unión a CD23 para las
relaciones de ligando a IgE mencionadas anteriormente.
Preferentemente, el método de la invención se
lleva a cabo a una temperatura de 0ºC a 100ºC, más preferentemente
de 0ºC a 40ºC, y lo más preferentemente de 20ºC a 38ºC.
Si se usan células biológicas como vehículo, y si
se usa un sistema de detección que consiste en un anticuerpo de
detección acoplado con un compuesto marcador, el ensayo se lleva a
cabo entonces preferentemente a una temperatura relativamente baja
de 0ºC y 10ºC, más preferentemente de 0ºC y 6ºC, con el fin de
evitar que los complejos de IgE y alérgeno unidos a los receptores
de IgE en la superficie externa de la célula se internen dentro de
la célula antes de que haya tenido lugar el marcado, lo que daría
lugar a medidas incorrectas.
La presente invención en particular se refiere a
un método para detectar y/o cuantificar un anticuerpo IgE
específico en una muestra líquida, que comprende las etapas de
(a) poner en contacto (i) la muestra con (ii) un
ligando libre en forma de un antígeno, un anticuerpo o un hapteno,
para formar una mezcla I que comprende complejos que contienen IgE,
en donde el ligando está unido a biotina o a un derivado funcional
de la misma,
(b) mezclar la mezcla I con un vehículo al que
está unido (iii) el receptor de IgE, siendo dicho receptor de IgE
CD23 (Fc\varepsilonRII) y/o Fc\varepsilonRI, para formar una
mezcla II que comprende complejos que contienen IgE unida al
vehículo,
(b') separar los complejos que contienen IgE
unida al vehículo de la mezcla II y lavar dichos complejos,
(b'') añadir a los complejos lavados que
contienen IgE unida al vehículo una solución de (iv) un compuesto
quimioluminiscente unido covalentemente a avidina, estreptavidina o
un derivado funcional de las mismas, para formar una mezcla II',
(c) separar los complejos que contienen IgE unida
al vehículo de la mezcla II' y lavar dichos complejos,
(d) iniciar una reacción quimioluminiscente en
los complejos que contienen IgE resultantes y detectar o medir la
quimioluminiscencia resultante, si la hay.
En la presente invención, la expresión
"anticuerpo IgE específico" significa cualquier inmunoglobulina
específica del isotipo IgE así como cualquier otra inmunoglobulina
que tenga afinidad para los receptores de IgE CD23 y/o
Fc\varepsilonRI.
La expresión "muestra de líquido biológico"
significa cualquier líquido biológico, tal como sangre, plasma,
suero, orina, saliva y cualquier otro líquido, que es excretado,
segregado o transportado en un organismo biológico.
La expresión "ligando en forma de antígeno,
anticuerpo o hapteno" puede ser cualquier sustancia
inmunológicamente activa. "Antígeno" puede ser un alérgeno, p.
ej. polen de árboles, gramíneas, hierbajos, etc., alérgenos de
mohos, alérgenos de acáridos (ácaros) y animales tales como gatos,
perros, caballos, ganado y aves, alérgenos de insectos picadores y
alérgenos inhalados de insectos, y alérgenos alimentarios;
"anticuerpo" puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal,
incluyendo anticuerpos recombinantes y fragmentados; y
"haptenos" pueden ser restos de hidratos de carbono o
fragmentos de los mismos, inhibidores enzimáticos o fármacos, p. ej.
penicilina o un derivado de la misma.
En relación con la presente invención, la
expresión "receptor de IgE" significa CD23
(Fc\varepsilonRII) y/o Fc\varepsilonRI. El término "CD23"
significa cualquier formulación y cualquier parte del mismo,
incluyendo CD23 en forma pura o en una mezcla, solución o extracto;
CD23 sintético o recombinante; CD23 procedente de fuentes naturales;
y CD23 completo y partes del mismo. La cadena \alpha de CD23
puede usarse como trímero, dímero o monómero, y solamente la cadena
\alpha o la parte soluble de la misma, es decir la parte que se
extiende desde la superficie externa de la membrana celular, o una
sección de la parte soluble de la cadena \alpha, puede ser usada
como CD23. "Fc\varepsilonRI" significa cualquier formulación
del mismo y cualquier parte del mismo, incluyendo Fc\varepsilonRI
en forma pura o en una mezcla, solución o extracto;
Fc\varepsilonRI sintético o recombinante; Fc\varepsilonRI
procedente de fuentes naturales; y Fc\varepsilonRI entero y partes
del mismo. En particular, solamente la cadena \alpha, que es
principalmente responsable de la unión de IgE, o la parte soluble de
la misma, es decir la parte que se extiende desde la superficie
externa de la membrana celular, o una sección de la parte soluble
de la cadena \alpha, puede ser usada como Fc\varepsilonRI.
La expresión "ligando disuelto libre"
significa un ligando que está libre para complejos en forma no
impedida con IgE, y la expresión incluye ligandos en solución y
ligandos acoplados a una sustancia en solución.
La presente invención se describe con más detalle
en relación con las figuras, en las que:
La Fig. 1a muestra el nivel de fluorescencia
medido en un ensayo de la invención usando (i) ningún suero y
ningún alérgeno, (ii) un suero testigo y alérgeno, y (iii) suero de
paciente alérgico y alérgeno.
La Fig. 1b muestra el nivel de fluorescencia
medido en un ensayo de la invención usando (i) un suero testigo y
alérgeno, (ii) suero de paciente alérgico y alérgeno, (iii) suero
de paciente alérgico, anticuerpo contra CD19 y alérgeno, y (iv)
suero de paciente alérgico, anticuerpo contra CD23 y alérgeno.
La Fig. 1c muestra el nivel de fluorescencia
medido en un ensayo de la invención usando (i) ningún suero y
ningún alérgeno, (ii) suero de paciente alérgico y ningún alérgeno,
(iii) suero de paciente alérgico y alérgeno, (iv) suero de paciente
alérgico, alérgeno y anticuerpo contra IgG, y (v) suero de paciente
alérgico, alérgeno y anticuerpo contra IgE.
La Fig. 2a muestra el nivel de fluorescencia
medido en un ensayo de la invención usando (i) suero de paciente
alérgico y ningún alérgeno, (ii) suero de paciente alérgico y
alérgeno, (iii) suero de paciente alérgico, suero de paciente
alérgico tratado con SAV y alérgeno, y (iv) suero de paciente
alérgico tratado con SAV y alérgeno.
La Fig. 2b muestra el nivel de IgE de las
situaciones (i) a (iv) de la Fig. 2a, calculado basándose en
medidas del nivel de IgE de suero de paciente alérgico y suero de
paciente alérgico tratado con SAV en un ensayo de IgE total de
referencia.
La Fig. 3 es una representación en diagrama de
una realización preferida de la invención.
La Fig. 4 es una representación en diagrama de
una segunda realización preferida de la invención.
La Fig. 5 es una representación en diagrama de
una tercera realización preferida de la invención.
La Fig. 6 muestra el nivel de fluorescencia
medido en un ensayo de la invención usando (i) suero de paciente
alérgico, alérgeno y anticuerpo (1) dirigido contra el resto de
CD23 que se une a la IgE, (ii) suero de paciente alérgico, alérgeno
y anticuerpo (2) dirigido contra el resto de CD23 que se une a la
IgE, (iii) suero de paciente alérgico, alérgeno y anticuerpo
dirigido al resto de CD23 no de unión a la IgE, y (iv) suero de
paciente alérgico, alérgeno y anticuerpo contra CD14.
La Fig. 7a muestra el nivel de fluorescencia
medido en un ensayo de la invención usando suero de paciente
alérgico y dosis crecientes de alérgenos de gramíneas.
La Fig. 7b muestra el nivel de fluorescencia
medido en un ensayo de la invención usando suero de paciente
alérgico y dosis crecientes de un alérgeno mayor del abedul
expresado recombinantemente y purificado.
La Fig. 8a muestra el nivel de fluorescencia
medido en un ensayo de la invención usando dosis crecientes de
alérgenos de abedul y (i) suero de paciente alérgico al abedul y
suero de testigo no alérgico, (ii) suero de paciente alérgico y
suero de un paciente alérgico al abedul tratado con SAV (A), (iii)
suero de paciente alérgico al abedul y suero de un paciente
alérgico al abedul tratado con SAV (B), y (iv) suero de paciente
alérgico al abedul y suero de un paciente alérgico a las gramíneas
tratado con SAV.
La Fig. 8b muestra el nivel de fluorescencia
medido en un ensayo de la invención usando dosis crecientes de un
alérgeno mayor del abedul expresado recombinantemente y purificado,
y (i) suero de paciente alérgico al abedul y suero de testigo no
alérgico, (ii) suero de paciente alérgico y suero de un paciente
alérgico al abedul tratado con SAV (A), (iii) suero de paciente
alérgico al abedul y suero de un paciente alérgico al abedul
tratado con SAV (B), y (iv) suero de paciente alérgico al abedul y
suero de un paciente alérgico a las gramíneas tratado con SAV.
La Fig. 3 muestra las etapas de una realización
preferida del ensayo de la invención en principio. En una primera
etapa se mezclan un alérgeno biotinilado y una muestra que contiene
IgE específica para el alérgeno (designada "IgE" en la figura)
y se incuban para formar una mezcla I que contiene complejos que
incluyen varias moléculas de IgE y varias moléculas de alérgeno,
comprendiendo además la mezcla I exceso de IgE y alérgeno. En una
segunda etapa, se añade un vehículo en partículas al cual se unen
varias moléculas de CD23 (y/o varias moléculas de
Fc\varepsilonRI), y dichos complejos se unen al vehículo a través
de CD23 para formar una mezcla II. Posiblemente, puede unirse una
cantidad menor de IgE a CD23 en forma monómera. En una tercera
etapa, los complejos unidos al vehículo se separan de la mezcla II
y se lavan una o más veces para eliminar las sustancias
reaccionantes no unidas. También, el lavado eliminará cualquier
posible complejo no unido que pueda estar presente, ya que, como se
mencionó anteriormente, es posible que la interferencia que tiene
lugar en el presente ensayo sea el resultado de una inhibición de la
unión de los complejos al receptor de la IgE. La separación de los
complejos de la mezcla II puede llevarse a cabo, p. ej., mediante
separación magnética, si se usan partículas paramagnéticas como
vehículo. Un marcador quimioluminiscente, preferentemente un
reactivo de estreptavidina-éster de acridinio, se incuba con los
complejos unidos al vehículo para unir el marcador a la biotina
unida al complejo. Después de la incubación, los complejos marcados
unidos al vehículo se separan y se lavan para eliminar los moléculas
de marcador que no han reaccionado, y se inicia la reacción
quimioluminiscente mediante el empleo de una sustancia reaccionante
adecuada, p. ej. hidróxido sódico, y se mide la quimioluminiscencia
de los complejos marcados unidos al vehículo.
La Fig. 4 muestra las etapas de una realización
preferida del ensayo de la invención en principio. En una primera
etapa, un alérgeno biotinilado, una muestra que contiene IgE
específica para el alérgeno (designada "IgE" en la figura) y un
vehículo en partículas al que están unidas varias moléculas de CD23
(y/o varias moléculas de Fc\varepsilonRI), se mezclan y se
incuban para formar una mezcla II que contiene complejos unidos al
vehículo incluyendo varias moléculas de IgE y varias moléculas de
alérgeno, comprendiendo además la mezcla II exceso de IgE y
alérgeno, así como complejos no unidos. Después, los complejos
unidos al vehículo se separan de la mezcla II y se lavan una o más
veces.
A continuación, se incuba un marcador
quimioluminiscente, preferentemente un reactivo de
estreptavidina-éster de acridinio, con los complejos unidos al
vehículo, para unir el marcador a la biotina unida al complejo.
Después de la incubación, los complejos marcados unidos al vehículo
se separan y se lavan para eliminar las moléculas de marcador que
no han reaccionado, y se inicia la reacción quimioluminiscente
mediante el uso de un reactivo adecuado, p. ej. hidróxido sódico, y
se mide la quimioluminiscencia de los complejos marcados unidos al
vehículo.
La Fig. 5 muestra las etapas de otra realización
preferida de la invención. En una primera etapa de incubación, un
alérgeno y una muestra que contiene IgE específica para el alérgeno
(designada "IgE" en la figura) se mezclan y se incuban para
formar una mezcla A que contiene complejos que incluyen varias
moléculas de IgE y varias moléculas de alérgeno, comprendido además
la mezcla A exceso de IgE y alérgeno. En una segunda etapa de
incubación, se añade un vehículo en partículas, al cual se unen
varias moléculas de CD23 (y/o varias moléculas de
Fc\varepsilonRI), y dichos complejos se unen al vehículo a través
de CD23, para formar una mezcla B. Posiblemente, una menor cantidad
de IgE puede unirse a CD23 en forma monómera. Subsiguientemente,
los complejos unidos al vehículo se separan de la mezcla B y se
lavan una o más veces para eliminar las sustancias reaccionantes no
unidas. También, el lavado eliminará cualquier posible complejo no
unido que pueda estar presente, ya que, como se mencionó
anteriormente, es posible que la interferencia que tiene lugar en
el presente ensayo sea el resultado de una inhibición de la unión de
los complejos al receptor de la IgE. La separación de los complejos
de la mezcla B puede llevarse a cabo, p. ej., mediante separación
magnética, si se usan partículas paramagnéticas como vehículo. En
una tercera etapa de incubación se añade anticuerpo biotinilado
contra la IgE (anticuerpo de detección) para formar una mezcla C.
El anticuerpo de detección es policlonal y se unirá a todas las IgE
al margen de la especificidad de la IgE. Los complejos unidos al
vehículo resultantes se separan de la mezcla C, y dichos complejos
se lavan. En una cuarta etapa de incubación, un marcador
quimioluminiscente, preferentemente un reactivo de
estreptavidina-éster de acridinio, se incuba con los complejos
unidos al vehículo para unir el marcador a la biotina unida al
complejo. Después de la incubación, los complejos marcados unidos
al vehículo se separan y se lavan para eliminar los moléculas de
marcador que no han reaccionado, y se inicia la reacción
quimioluminiscente mediante el empleo de un reactivo adecuado, p.
ej. hidróxido sódico, y se mide la quimioluminiscencia de los
complejos marcados unidos al vehículo.
En lo que sigue, la invención se describe con más
detalle haciendo referencia a los Ejemplos.
En los ejemplos se utilizan las abreviaturas
siguientes (por sus siglas en inglés):
FITC: isotiocianato de fluoresceína
EBV: virus de Epstein Barr
SU: unidades estándar
SAV: vacunación de alergia específica
Se incubó extracto de Betula verrucosa (Bet v)
marcado con FITC (1 \mug/ml) con suero testigo 734 (IgE no
detectable en un ensayo de referencia que mide el contenido total
de IgE (MagicLite®, ALK-ABELLÓ, Hoersholm,
Dinamarca)), o con suero de paciente alérgico al abedul 1464 (>
800 SU/ml de IgE específica del abedul en el ensayo MagicLite®) a
una concentración de suero final de 60%. Se añadieron células B
transformadas en EBV procedentes de un paciente alérgico en medio
de cultivo, a una concentración final de 4 x 10^{6}/ml y se
incubaron durante 1 hora a 37ºC, seguido por dos lavados para
eliminar el exceso de alérgeno. Después de lavar las células, se
analizó la unión de Bet v marcada con FITC (Bet v*) a las células B
midiendo la fluorescencia usando un citómetro de flujo
FACSCalibur.
Los resultados se muestran en la Fig. 1a, en la
que se indica la intensidad media de fluorescencia (Mean
Fluorescence Intensity: MFI) para (i) nada de suero y nada de Bet v
(fondo) designado "medio solamente" en la Fig. 1a, (ii) s734 y
Bet v, y (iii) s1464 y Bet v. Los resultados señalan que puede ser
demostrada directamente la unión de extracto de alérgeno de abedul
marcado con FITC a los linfocitos B que expresan CD23.
En experimentos de bloqueo con anticuerpo contra
CD23 y anticuerpo contra CD19 para referencia, las células
EBV-B fueron incubadas durante 1 hora a 4ºC con
estos anticuerpos antes de añadir las células a los mezclas de Bet v
y suero. La Fig. 1b muestra la intensidad media de fluorescencia
(MFI) para (i) suero s734, (ii) s1464, (iii) s1464 y anticuerpo
contra CD19, y (iv) s1464 y anticuerpo contra CD23. Como se
desprende de la Fig. 1b, la preincubación de las células B con
anticuerpo contra CD23 inhibe la unión del extracto de abedul
marcado con FITC a las células B, mientras que la preincubación con
un anticuerpo contra un antígeno de superficie de las células B
irrelevante, CD19, no inhibe la unión. Esto demuestra que el
extracto de abedul marcado con FITC se une a CD23, el receptor de
IgE de baja afinidad.
Se llevaron a cabo experimentos adicionales, en
los que anticuerpos policlonales anti-IgG o
anti-IgE se preincubaron con el suero del paciente
alérgico (s1464) durante 1 hora a 37ºC antes de añadir Bet v. La
Fig. 1c muestra la intensidad media de fluorescencia (MFI) para (i)
el fondo, (ii) s1464 y no Bet v, (iii) s1464 y Bet v, (iv) s1464,
an-ticuerpo contra IgG y Bet v, (v) s1464,
anticuerpo contra IgE y Bet v. Como se desprende de la Fig. 1c, la
IgE, pero no la IgG, es responsable de la unión del extracto de
abedul marcado con FITC a los linfocitos B.
En conclusión, los experimentos mostrados en la
Fig. 1a-c indican que la unión de un alérgeno
marcado a CD23 en un vehículo sólido está mediada por IgE, y puede
detectarse con facilidad.
Se incubó extracto de Betula verrucosa (Bet v) (1
\mug/ml) marcado con FITC con suero 894 de paciente alérgico al
abedul (> 800 SU/ml de IgE específica del abedul en el ensayo
MagicLite®)a una concentración final de suero de 40% en ausencia o
en presencia de un suero (también el 40%) de un paciente que recibe
SAV del abedul durante más de 4 años (suero 1490, 88 SU/ml de IgE
específica del abedul en el ensayo MagicLite®). Se añadieron
células B transformadas en EBV procedentes de un paciente alérgico,
en medio de cultivo a una concentración final de 4 x 10^{6}/ml y
se incubaron durante 1 hora a 37ºC, seguido por dos lavados para
eliminar el exceso de alérgeno. Después de lavar las células, se
analizó la unión de Bet v marcada con FITC (Bet v*) a las células B
midiendo la fluorescencia usando un citómetro de flujo
FACSCalibur.
La Fig. 2a muestra la intensidad media de
fluorescencia (MFI) para (i) s894 y no Bet v, (ii) suero s894 y Bet
v, (iii) ambos s894 y s1490, y Bet v, y (iv) s1490 y Bet v. Como se
desprende de la Fig. 2a, la adición de s1490 reduce la unión de IgE
y alérgeno del abedul marcado con FITC a CD23 a los niveles de
fondo. Esto indica la presencia de un factor que interfiere con la
unión a CD23, mediada por IgG, del alérgeno del abedul marcado con
FITC.
A título de comparación, la Fig. 2b indica el
nivel total calculado de IgE especifica del alérgeno del abedul
para las mismas situaciones de sustancias reaccionantes (i)-(iv)
que en la Fig. 2a, siendo calculados los niveles sobre la base de
medidas separadas del nivel total de IgE en s894 y s1490, medido
por el ensayo MagicLite®.
A partir de la Fig. 2a-b puede
llegarse a la conclusión de que el ensayo de la invención que emplea
CD23 como agente de captura produce resultados muy diferentes a los
del ensayo MagicLite® de IgE total de la técnica anterior, que
emplea un anticuerpo contra IgE como agente de captura. Además, se
ha de suponer que los resultados obtenidos por el ensayo de la
invención expresan mejor el estatus del sujeto examinado, ya que la
presentación del antígeno in vivo es facilitada por el
CD23.
Se llevaron a cabo experimentos de bloqueo con
tres distintos anticuerpos monoclonales contra CD23, vgr. dos
anticuerpos contra CD23 que se unen específicamente al resto de
unión de IgE de CD23 (ML 233 de Pharmingen, comercializado por
Becton-Dickinson, Dinamarca, y MHM6 de DAKO A/S,
Dinamarca), y un anticuerpo que se une específicamente a una región
de CD23 no implicada en la unión de IgE (EBV CS35 de
Becton-Dickinson, Dinamarca). Finalmente, se incluyó
un anticuerpo contra una molécula de superficie irrelevante (CD14)
como referencia (de DAKO A/S, Dinamarca). Las células B
transformadas en EBV fueron preincubadas con 10 \mug/ml de cada
anticuerpo, durante 1 hora a 4ºC, se lavaron para eliminar el
anticuerpo no unido, antes de la incubación con complejos. Los
complejos se generaron poniendo en contacto suero s1464 procedente
de un donante con alergia al polen de abedul (> 800 SU/ml de IgE
específica del abedul en el ensayo MagicLite®) a una concentración
final de suero del 80%, con 1 \mug/ml de Bet v, durante 1
hora a 37ºC. Los complejos se dejaron en contacto con las
células-EBV tratadas con anticuerpo, durante 1 hora
a 4ºC. Subsiguientemente, las células se lavaron y los complejos
unidos se tiñeron incubando con un anticuerpo biotinilado que
reconoce IgE humana (PU PED0048 de ALK-Abello),
seguido por lavado e incubación con un conjugado de
estreptavidina-ficoeritrina (Southern Biotechnology
Associates, comercializado por KEBO, Dinamarca). Después de un
lavado final, la unión de los complejos de
IgE-alérgeno a las células EBV se analizó midiendo
la fluorescencia usando un citómetro de flujo FACSCalibur.
De la Fig. 6 puede sacarse la conclusión de que
la unión de alérgeno a CD23 está medida por la interacción con el
resto de unión de IgE de CD23, y no por una interacción no
específica. Además, la unión de complejos no marcados puede
detectarse fácilmente mediante un anticuerpo contra IgE.
Se generaron complejos poniendo en contacto
sueros procedentes de dos donantes individuales que tienen alergia a
los alérgenos del polen de gramíneas (Phleum p) (s1043: 582
SU/ml, y s1524: 658 SU/ml de IgE específica de Phleum p en el
ensayo con MagicLite®), con dosis crecientes de un extracto de
alérgenos de gramíneas. Se dejó proceder a la reacción durante 1
hora a 37ºC. Subsiguientemente se añadieron a la reacción células B
transformadas en EBV, durante 1 hora a 4ºC. Las células se lavaron
y los complejos unidos se visualizaron y analizaron como se
describió en el Ejemplo 3. La Figura 7a muestra la media geométrica
de la intensidad de fluorescencia para (i) s1043 y (ii) s1524. Cada
muestra se estudió por duplicado, y se calculó la media.
\newpage
En la Fig. 7b, se puso en contacto s1464
(descrito en el Ejemplo 3) con dosis crecientes de Bet v 1
recombinante, uno de los alérgenos mayores del polen de abedul. El
experimento se llevó a cabo como se describió para la Fig. 7a.
Las Fig. 7a y b muestran que, en una realización
de la invención, usando el mismo anticuerpo contra IgE para la
detección, es posible medir IgE específicas para diferentes
alérgenos. El ensayo puede usarse para medir IgE específica para el
extracto de alérgeno completo, así como alérgenos individuales
purificados. Las Fig. 7a y b demuestran también que se requieren
alérgenos individuales a dosis diferentes para obtener una señal
óptima.
El suero de un donante alérgico al polen de
abedul, s1464, se mezcló (1:1) con los sueros siguientes: (i) suero
de un donante no alérgico s745 (0 SU/ml), (ii), (iii) donantes que
han recibido SAV para el polen de abedul (s1490 y s1598; 88 y 57
SU/ml de IgE específica para abedul en el ensayo Magiclite®,
respectivamente), y (iv) donantes con alergia al polen de gramíneas
(s808954; 137 SU/ml de IgE específica de gramíneas y 4 SU/ml de IgE
específica de abedul en el ensayo Magiclite®). Después de la
incubación con un extracto de alérgenos de polen de abedul (Bet
V, Fig. 8a) o bien un alérgeno recombinante purificado
procedente de polen de abedul (Bet v 1, Fig. 8b), a una
concentración final de 40% de cada suero, se añadieron células B
transformadas en EBV durante una hora, a 4ºC, las células se
lavaron y los complejos unidos se detectaron como se describió
anteriormente.
Las Fig. 8a y b representan los resultados como
medias geométricas de la intensidad de fluorescencia. Comparando
los niveles totales de IgE (medidos en ensayos Magiclite®) en cada
muestra (i-iv) con la señal obtenida empleando CD23
como agente de captura, puede llegarse a la conclusión de que el
ensayo de la invención mide un "tipo" diferente de IgE
formadora de complejo, que se une a CD23. Como se explicó
anteriormente, se cree que los niveles de este "tipo" de IgE
reflejan mejor el estatus del sujeto examinado que los niveles de
IgE medidos por medios convencionales.
(1)
"Serum-IgE-Facilitated Allergen
Presentation in Atopic Disease", van der Heijden et
al., The Journal of immunology, Vol. 150,
3643-3650, 1993.
(2) "IgE-antigen complexes
enhance Fc\varepsilonR and Ia expression by murine B
lymphocytes", Richards et al., J. Exp. Med.,
Vol. 168, 571, 1998.
(3) Santamaria et al., Hum
Immunol., Vol. 37, 23-30, 1993.
(4) "The High Affinity IgE Receptor
(Fc\varepsilonRI) Mediates IgE-Dependant Allengen
Presentation", Maurer et al., The Journal of
Immnunology, Vol 154, 6285-6290,
1995.
Claims (22)
1. Un método para detectar y/o cuantificar un
anticuerpo IgE específico contra un ligando en forma de antígeno,
anticuerpo o hapteno en una muestra líquida biológica en términos
de la capacidad del anticuerpo IgE para unirse a un receptor de IgE,
que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto (i) la muestra con (ii) un
ligando libre disuelto en forma de un antígeno, un anticuerpo o un
hapteno, para formar una mezcla I que comprende complejos que
contienen IgE,
(b) mezclar la mezcla I con un vehículo al que
está unido (iii) el receptor de IgE, siendo dicho receptor de IgE
CD23 (Fc\varepsilonRII) y/o Fc\varepsilonRI, para formar una
mezcla II que comprende complejos que contienen IgE unida al
vehículo,
(c) separar los complejos que contienen IgE unida
al vehículo de la mezcla II, y
(d) determinar la cantidad de complejos que
contienen IgE unida al vehículo que se ha formado.
2. Un método según la reivindicación 1ª, en el
que el ligando está marcado.
3. Un método según la reivindicación 1ª, en el
que el ligando usado en la etapa a) está unido a (iv) un compuesto
marcador.
4. Un método según la reivindicación 1ª, en el
que (iv) se añade un compuesto marcado en la etapa (a) además de (i)
la muestra y (ii) el ligando.
5. Un método según la reivindicación 1ª, en el
que se añade un compuesto marcador a los complejos que contienen IgE
unida al vehículo formados en la etapa (b).
6. Un método según la reivindicación 1ª, en el
que (iv) se añade un compuesto marcador a los complejos que
contienen IgE unida al vehículo resultantes de la etapa de
separación (c) para formar una mezcla II'.
7. Un método según la reivindicación 6ª, en el
que los complejos que contienen IgE marcada y unida al vehículo se
separan de la mezcla II' y se lavan antes de la etapa (d).
8. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 3ª a 7ª, en el que (iv) el compuesto marcador es un
compuesto quimioluminiscente unido covalentemente a avidina,
estreptavidina o un derivado funcional de las mismas.
9. Un método según la reivindicación 8ª, en el
que el compuesto quimioluminiscente es un compuesto de
acridinio.
10. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el ligando está unido a
biotina o un derivado funcional de la misma.
11. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la muestra que contiene IgE
se pone en contacto con el ligando y se deja incubar para formar
una mezcla I (etapa(a)) antes de poner en contacto la mezcla
I con el vehículo/receptor de IgE (etapa (b)).
12. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1ª a 10ª, en el que la etapa (a) y (b) se llevan a
cabo simultáneamente en una operación.
13. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el vehículo es un material
en partículas.
14. Un método según la reivindicación 13ª, en el
que el vehículo es un material paramagnético en partículas.
15. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la IgE a detectar se
cuantifica tanto usando CD23 solo para obtener una primera medida
como usando Fc\varepsilonRI solo, para obtener una segunda
medida.
16. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el número de moléculas de
ligando está entre el 100% y el 200% del número de moléculas de IgE
a detectar.
17. Un método según la reivindicación 1ª que
comprende usar un sistema de detección en forma de un compuesto
marcador acoplado a un anticuerpo contra la IgE a detectar.
18. Un método según la reivindicación 17ª, en el
que el compuesto marcador se acopla al anticuerpo mediante
biotina.
19. Un método según las reivindicaciones 17ª o
18ª, en el que el sistema de detección se añade a los complejos
unidos al vehículo formados en la etapa (c).
20. Un método para detectar y/o cuantificar un
anticuerpo IgE específico en una muestra de líquido biológico en
términos de la capacidad del anticuerpo IgE para unirse a un
receptor de IgE, que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto (i) la muestra con (ii) un
ligando libre en forma de un antígeno, un anticuerpo o un hapteno,
para formar una mezcla I que comprende complejos que contienen IgE,
en donde el ligando está unido a biotina o un derivado funcional de
la misma,
(b) mezclar la mezcla I con un vehículo al que
está unido (iii) el receptor de IgE, siendo dicho receptor de IgE
CD23 (Fc\varepsilonRII) y/o Fc\varepsilonRI, para formar una
mezcla II que comprende complejos que contienen IgE unida al
vehículo,
(b') separar los complejos que contienen IgE
unida al vehículo de la mezcla II, y lavar dichos complejos,
(b'') añadir a los complejos lavados que
contienen IgE unida al vehículo una solución de (iv) un compuesto
quimioluminiscente unido covalentemente a avidina, estreptavidina o
un derivado funcional de las mismas, para formar una mezcla II'.
(c) separar los complejos que contienen IgE unida
al vehículo de la mezcla II' y lavar dichos complejos,
(d) iniciar una reacción quimioluminiscente en
los complejos que contienen IgE resultantes y detectar o medir la
quimioluminiscencia resultante, si la hay.
21. El uso del método según cualquiera de las
reivindicaciones 1ª a 17ª para controlar y evaluar el estatus
inmunológico de un sujeto.
22. El uso del método según cualquiera de las
reivindicaciones 1ª a 17ª para controlar y evaluar el estatus
inmunológico de un sujeto que recibe Vacunación de Alergia
Específica (SAV).
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|---|---|---|---|
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