ES2249385T3 - Procedimiento para descelularizar material extraño destinado a la produccion de bioprogtesis. - Google Patents

Procedimiento para descelularizar material extraño destinado a la produccion de bioprogtesis.

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ES2249385T3 ES01271089T ES01271089T ES2249385T3 ES 2249385 T3 ES2249385 T3 ES 2249385T3 ES 01271089 T ES01271089 T ES 01271089T ES 01271089 T ES01271089 T ES 01271089T ES 2249385 T3 ES2249385 T3 ES 2249385T3
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Abstract

Procedimiento para descelularizar material extraño alógeno y xenógeno con ayuda de detergentes biológicos para la producción de bioprótesis revestidas con células corporales del receptor de la prótesis, caracterizado porque, para aniquilar células y para recubrir las células y separar la unión con la matriz de tejido, el material extraño es tratado en primer lugar con ácido gálico y, para seguir aniquilando las células, es tratado con alcohol, y ambas etapas van seguidas de una operación de lavado, realizándose al menos la última operación de lavado en un flujo de los medios para obtener una acción mecánica sobre la matriz de tejido y las células a consecuencia de las fuerzas de flujo.

Description

Procedimiento para descelularizar material extraño destinado a la producción de bioprótesis.
La presente invención se refiere a un procedimiento para descelularizar material extraño alógeno y xenógeno con ayuda de detergentes biológicos para la producción de bioprótesis revestidas con células corporales del receptor de la prótesis.
Para la producción de bioprótesis de material extraño xenógeno o alógeno que se reviste con células corporales del receptor posterior de la prótesis es necesario que, para evitar reacciones inmunológicas y garantizar el crecimiento y la regeneración de las células corporales reasentadas, se facilite una estructura "acelular" liberada de células extrañas. Sin embargo, con el procedimiento de descelularización conocido y la utilización de detergentes biológicos no es posible una eliminación completa de todo el material celular de la matriz de tejido, de modo que no se descartan acciones virales -desconocidas hasta ahora-, por ejemplo de los virus contenidos en tejido porcino.
Un aparato para la esterilización y colonización, así como para la conservación de implantes de válvulas cardiacas es conocido solamente por la patente US nº 5.846.828. Este aparato dispone de una cámara que facilita un ambiente que corresponde a las condiciones fisiológicas en el corazón humano.
Por tanto, la invención se basa en el problema de indicar un procedimiento para descelularizar material extraño previsto para recubrirse con células corporales, de modo que se garantice una retirada completa pero cuidadosa de las células del tejido extraño.
Según la invención, el problema se resuelve con un procedimiento según las características de la reivindicación 1.
En otras palabras, la idea básica de la invención consiste en retirar las células extrañas del producto de partida alógeno o xenógeno previsto para un nuevo revestimiento con células corporales a través de la combinación de un tratamiento de ácido gálico con un tratamiento de alcohol y etapas de lavado intermedias o posteriores, así como producir un efecto mecánico sobre la matriz de tejido y las células a retirar a través de un medio fluyente al menos en la última etapa de lavado.
El ácido gálico utilizado preferentemente en forma de ácido desoxicólico produce una envoltura paulatina -acelerada durante el efecto mecánico- de las células con el ácido para crear una capa de separación entre la matriz de colágeno y elastina (en lo que sigue indicada como matriz de colágeno) y las células y soltar la unión con la matriz. Simultáneamente, el ácido desoxicólico tiene un efecto de aniquilación de las células. En la siguiente etapa de lavado se arrastran las células desprendidas y se elimina también el ácido desoxicólico. En el tratamiento con alcohol que sigue a esto, preferentemente en etanol o propanol, se retira completamente el ácido desoxicólico eventualmente presente todavía, que se disuelve bien en alcohol. Con el ácido desoxicólico restante y el alcohol eventualmente presentes se disuelven en la matriz células aún existentes, mientras que el alcohol tiene además un efecto aniliquilador de células y antiviral. La última etapa posterior de lavado es un flujo -preferentemente pulsante- cuyas fuerzas actúan, por un lado, sobre las paredes de la parte del órgano en cuestión y ensanchan la matriz y, por otro lado, actúan directamente sobre las células restantes aún existentes y las desprenden de la matriz ensanchada.
Asimismo, otras o todas las etapas del procedimiento pueden estar unidas con efectos de fuerza mecánicos a través de un flujo preferentemente pulsante del medio en cuestión. Así, el flujo de ácido desoxicólico pulsante ya citado anteriormente tiene como consecuencia, debido al movimiento y ensanchamiento de la matriz, una formación más rápida de la capa de separación entre la célula y la matriz de colágeno y, simultáneamente, un desprendimiento más fácil de la célula a través de las fuerzas que actúan sobre ésta.
A partir de las reivindicaciones adjuntas y de la descripción proporcionada a continuación de un ejemplo de forma de realización resultan características adicionales y configuraciones ventajosas de la invención.
Con el procedimiento propuesto se consigue que se proporcionen partes de órganos acelulares, es decir, libres de material celular de toda clase y, por tanto, de virus, tales como válvulas cardiacas o vasos, como producto de partida para la producción de bioprótesis a través del recubrimiento posterior con células corporales del correspondiente receptor.
El dispositivo para el tratamiento de la parte del órgano que consta de material extraño en un medio fluyente comprende una cámara de descelularización para alojar la parte del órgano en cuestión y una bomba para generar el flujo de medio, las cuales están integradas de forma consecutiva en un conducto anular. En el conducto anular se encuentran válvulas de carga y descarga para suministrar y evacuar el correspondiente medio de tratamiento. La cámara de descelularización está unida de forma soltable con el conducto anular, de modo que éste y, por tanto, la parte de órgano que se encuentra en el medio pueden moverse también. En el recipiente está fijada bajo pretensado longitudinal a la dirección de flujo la parte del órgano a tratar mediante cosido a piezas de inserción formadas de manera correspondiente a la parte del órgano.
Un ejemplo de forma de realización de la invención se explica con mayor detalle haciendo referencia al dibujo, en el que:
La figura 1 muestra un dispositivo para descelularizar una válvula cardiaca en un circuito de flujo;
La figura 2 muestra una vista en sección de una cámara de descelularización que aloja la válvula cardiaca y que está integrada a en el circuito de flujo;
La figura 3a muestra un vista en sección microscópica de una pared de una válvula aórtica descelularizada según el procedimiento conforme a la invención; y
La figura 3b muestra una representación ampliada de un segmento de tejido medial de la pared de la válvula aórtica según la figura 3a.
En el ejemplo de forma de realización descrito en la presente memoria se libera de grasa, se corta a medida y se calibra una válvula aórtica porcina extraída en el matadero, y también se la analiza para determinar la presencia de gérmenes (hongos, bacterias aerobias y anaerobias, microplasma). Un almacenamiento intermedio a un máximo de 4ºC no debe pasar de siete días.
La válvula cardiaca preparada de este modo se introduce en una solución de ácido desoxicólico (o un ácido gálico con efecto similar) al 1 a 2% en peso y se la almacena en ella hasta 24 h a 37ºC. El ácido desoxicólico es capaz de formar con ácido graso los denominados aductos en forma de compuestos de inclusión, de modo que el ácido desoxicólico puede aplicarse paulatinamente en todos los lados en la célula y, por tanto, se suelta su unión de adherencia con la matriz de tejido. El ácido desoxicólico tiene al mismo tiempo un efecto aniquilador de las células.
A continuación, la válvula cardiaca tratada de este modo se lava en una serie de dilución de solución de tampón de fosfato (PBS) con concentración cada vez pequeña bajo el movimiento simultáneo de la válvula cardiaca para retirar de la matriz de tejido las células tratadas con el ácido desoxicólico.
En la tercera etapa que sigue, la válvula cardiaca es tratada a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos en alcohol al 40% para conseguir así un efecto antiviral y seguir aniquilando células eventualmente presentes en la estructura de colágeno. Dado que el alcohol es un buen disolvente, se enjuagan simultáneamente los restos del ácido eventualmente existentes todavía y se desprenden más células.
En una serie de dilución adicional de solución de tampón de fosfato (PBS - Phosphat Buffer Solution) se lava de nuevo la válvula cardiaca y, a continuación, se la trata mecánicamente en un flujo del medio PBS pulsante. A través del flujo del medio pulsante se ensancha rítmicamente la válvula cardiaca atravesada por el flujo en dirección longitudinal en una cámara de descelularización y fijada bajo pretensado y, al mismo tiempo, es solicitada mecánicamente por las fuerzas de flujo. Por tanto, también se arrancan mecánicamente de la estructura de colágeno las células restantes, de forma que, finalmente, existe una estructura acelular de la que se retira material celular de todo tipo y en la que, por tanto, tampoco pueden estar contenidos virus. Una válvula cardiaca así tratada de este modo -matriz de tejido libre de células y también de los medios de descelularización utilizados-, como se representa en la figura 2, es excelentemente adecuada para un recubrimiento nuevo con células endoteliales corporales del receptor posterior de una bioprótesis de este tipo, que puede implantarse en el cuerpo humano sin el peligro de reacciones inmunológicas o influencias virales.
La invención no está limitada, ni en el tipo y origen del material extraño previsto para la producción de bioprótesis ni tampoco en los parámetros del procedimiento, a la variante de tratamiento explicada anteriormente a título de ejemplo, siempre que se realicen las etapas esenciales del procedimiento, es decir, tratamiento en un ácido gálico formador de aductos y en alcohol con lavado intermedio o posterior en combinación con un flujo preferentemente pulsante a través de la parte del órgano en cuestión para producir un efecto mecánico cuidadoso sobre el tejido. Así, también es posible dejar que transcurran no sólo la última etapa de lavado, sino en su lugar o adicionalmente otras o todas las etapas de tratamiento en un medio fluyente. Se forman así mecánicamente la acción del medio correspondiente, ya que se consigue un acceso mejor en todos los lados a las células y estas células, por el efecto de la fuerza del flujo pulsante, son arrancadas o desprendidas más fácilmente de la matriz de colágeno ensanchada.
Un dispositivo para descelularizar una válvula cardiaca está representado en la figura 1. Este comprende un conducto anular 1 en el que están integradas una cámara de descelularización 2 que aloja la válvula cardiaca 3 a tratar, una bomba de membrana 3 y una cámara de compensación 4 montada inmediatamente a continuación de la cámara de descelularización. La bomba de membrana 3 está conectada a una unidad de accionamiento (no representada) a través de un conducto de tubo flexible 5. En las dos conexiones de la bomba de membrana 3 al conducto anular 1 están integradas una válvula de salida 6 y una válvula de entrada 7, cuya función corresponde aproximadamente a la de una válvula cardiaca. Sin embargo, en el tratamiento de válvulas cardiacas puede renunciarse también a la válvula de salida 6 a causa de las compuertas de válvula ya existentes allí.
La pieza principal del dispositivo es la cámara de descelularización 2 para descelularizar una válvula aórtica porcina 8 con ayuda del efecto adicional de fuerzas de flujo. La cámara de descelularización 2 consta de un cilindro hueco transparente 9 de piacrilo con piezas de inserción 10 y 11 de Teflon fijadas de forma centrada y hermética en los lados frontales abiertos, que están unidas con el conducto anular 1 a través de racores de conexión 12, 13 y presentan respectivamente un segmento de fijación 14, 15 que penetra en el cilindro hueco 9, con agujeros de fijación 16, 17 dispuestos radialmente en la periferia para mantener tirante la válvula aórtica 8 bajo tensión en sus bordes frontales. El diámetro exterior de los dos segmentos de fijación 14, 15 de las piezas de inserción 10, 11 corresponde aproximadamente al diámetro de la válvula aórtica 8. La pieza de inserción 11 trasera en la dirección de flujo se puede arriostrar a través de un nervio de collarín 18 y una primera junta 27 en el lado interior de un nervio anular 20 unido con el cilindro hueco 9 concretamente con ayuda de un anillo roscado 21 cuya rosca interior engrana con una rosca exterior de la pieza de inserción 11. La pieza de inserción 10 presenta un collarín 22 que se aplica a la superficie frontal del cilindro hueco 9 y se puede arriostrar con éste utilizando una tapa roscada 23 con rosca interior que engrana con una rosca exterior del cilindro hueco 9. Para la fijación estanca a los líquidos se ha previsto una segunda junta 19. El tramo de tubo flexible del conducto anular 1 montado a continuación de la cámara de descelularización consta de material flexible (silicona), de modo se garantiza el flujo a su través debido a la acción de bombeo pulsante.
A causa de la configuración y disposición descritas anteriormente de las piezas de inserción 10, 11, una válvula aórtica 8 correspondientemente preparada puede ser cosida por fuera del cilindro hueco 9 a los segmentos de fijación opuestos 14, 15 de las piezas de inserción 10, 11. En esta forma se introduce la válvula aórtica 8 en el cilindro hueco 9. A través de unas válvulas de carga y de descarga 24, 25 en el conducto anular 1 o de uno de los racores de conexión 13, 14, se introduce en primer lugar ácido desoxicólico en la cámara de descelularización 2 y el conducto anular 1 y, a continuación, se pone en funcionamiento la bomba de membrana 3, de modo que un flujo de ácido desoxicólico fluye continuamente sobre o a través de la válvula aórtica 8 y, debido a la acción mecánica sobre el tejido, se completa del desprendimiento y retirada de las células extrañas para el receptor de la válvula cardiaca. Después de evacuar el ácido desoxicólico se introduce una solución fisiológica de sal común o solución de tampón de fosfato y se lava hasta retirar completamente el ácido desoxicólico y los componentes tóxicos. La operación de lavado va acompañada de un tratamiento de la válvula cardiaca 8 en alcohol, seguido por una etapa de lavado en solución de tampón de fosfato.
En el dispositivo descrito anteriormente se realizan todas las etapas de tratamiento del procedimiento de descelularización en un flujo pulsante del respectivo medio. En este caso, la dirección de flujo corresponde aproximadamente al curso natural del flujo en el estado implantado de la bioprótesis. Para sustituir los medios, se utilizan las válvulas de carga y descarga 24, 25, pudiendo suministrarse también solución de lavado continuamente fresca para la operación de lavado y pudiendo evacuarse la solución de lavado gastada.
Discrecionalmente, también es posible llevar a cabo una o varias etapas de tratamiento, liberadas del conducto anular y de la bomba de membrana, sin flujo a través de la cámara de descelularización que se hace girar eventualmente con motor o de forma manual, o también, como se menciona al principio, realizar etapas de tratamiento individuales fuera de la cámara de descelularización.
Lista de símbolos de referencia
1
Conducto anular
2
Cámara de descelularización
3
Bomba de sangre/bomba de membrana
4
Cámara de compensación
5
Conducto de tubo flexible (para 3)
6
Válvula de salida
7
Válvula de entrada
8
Válvula aórtica (bioprótesis)
9
Cilindro hueco
10
Primera pieza de inserción (delante en la dirección de flujo)
11
Segunda pieza de inserción (detrás en la dirección de flujo)
12
Racor de conexión
13
Racor de conexión
14
Segmento de fijación
15
Segmento de fijación
16
Agujeros de fijación
17
Agujeros de fijación
18
Nervio de collarín de 11
19
Primera junta
20
Nervio anular de 9
21
Anillo roscado
22
Collarín de 10
23
Tapa roscada de capuchón
24
Válvula de carga y descarga
25
Válvula de carga y descarga
26
Válvula de membrana.

Claims (14)

1. Procedimiento para descelularizar material extraño alógeno y xenógeno con ayuda de detergentes biológicos para la producción de bioprótesis revestidas con células corporales del receptor de la prótesis, caracterizado porque, para aniquilar células y para recubrir las células y separar la unión con la matriz de tejido, el material extraño es tratado en primer lugar con ácido gálico y, para seguir aniquilando las células, es tratado con alcohol, y ambas etapas van seguidas de una operación de lavado, realizándose al menos la última operación de lavado en un flujo de los medios para obtener una acción mecánica sobre la matriz de tejido y las células a consecuencia de las fuerzas de flujo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el flujo de los medios es pulsante.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque para desprender las células con ácido gálico se utiliza un ácido dexosicólico que envuelve las células.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque se utiliza entre 1 y 2% de ácido dexosicólico.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza entre 30 y 60% de alcohol para aniquilar las células.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque se utiliza 40% de alcohol.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como medio de lavado se utiliza una solución de tampón de fosfato.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque el lavado realizado en un medio en reposo se lleva a cabo mientras se reduce de forma escalonada la concentración del medio de lavado.
9. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque en un medio en reposo del tratamiento con ácido desoxicólico dura hasta 24 horas, el del tratamiento en alcohol dura aproximadamente 20 minutos y el del lavado dura aproximadamente 60 minutos.
10. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el tratamiento del material extraño en ácido desoxicólico y/o en alcohol y/o el ciclo de lavado intermedio se llevan a cabo en un flujo pulsante de los medios de manera aproximadamente correspondiente a las condiciones naturales del flujo en el órgano en cuestión.
11. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 10, caracterizado porque la velocidad de los medios fluyentes es variable.
12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1, 10 y 11, caracterizado porque el flujo de los medios de lavado se renueva continua o discontinuamente.
13. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque la concentración del flujo del medio de lavado se reduce gradualmente.
14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 y 10 a 13, caracterizado porque el material extraño que se va a tratar se mantiene bajo pretensado en la dirección de flujo dentro del flujo del medio respectivo.
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