ES2249410T3 - Bcmp-7 como marcador para el diagnostico de cancer de pecho. - Google Patents

Bcmp-7 como marcador para el diagnostico de cancer de pecho.

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ES2249410T3 ES01905953T ES01905953T ES2249410T3 ES 2249410 T3 ES2249410 T3 ES 2249410T3 ES 01905953 T ES01905953 T ES 01905953T ES 01905953 T ES01905953 T ES 01905953T ES 2249410 T3 ES2249410 T3 ES 2249410T3
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Abstract

Un método para examinar y/o diagnosticar cáncer de pecho en un sujeto, cuyo método comprende la etapa de detectar y/o cuantificar la cantidad de un polipéptido en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto, en el que el polipéptido: a) comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 8); b) es un derivado que tiene una o más sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos, con relación a la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 8); o c) es un fragmento de un polipéptido como se ha definido en a) o b) anteriores, que tiene una longitud de al menos diez aminoácidos.

Description

BCMP 7 como marcador para el diagnóstico de cáncer de pecho.
La presente invención se refiere a la diagnosis, profilaxis y tratamiento de cáncer de pecho, y en particular al uso de una proteína que se ha aislado de preparaciones de membrana de linaje celular de cáncer de pecho y a composiciones que comprenden la proteína, incluyendo vacunas y anticuerpos que son inmunoespecíficos para la proteína, en tales diagnosis, profilaxis y tratamiento.
El cáncer de pecho es el cáncer diagnosticado más frecuentemente en mujeres. La implementación de programas de examen para la detección temprana de cáncer de pecho y el advenimiento de tratamientos anticáncer, tales como quimioterapia, radioterapia y terapias anti-estrógenos, para aumentar la resección quirúrgica han mejorado la supervivencia de pacientes con cáncer de pecho.
Sin embargo, algunos tumores de pecho se hacen refractarios a tales tratamientos, porque las células cancerosas desarrollan resistencia a fármacos de quimioterapia o pierden su sensibilidad a hormonas, conduciendo a una enfermedad recurrente o metastática que es a menudo incurable. Más recientemente, se ha enfocado la atención en el desarrollo de terapias inmunológicas (Green et al., Cancer Treat. Rev. 26, 269-286 (2000); Davis, Immunol. Cell Biol. 78, 179-195 (2000); Knuth et al., Cancer Chemother Pharmacol. 46, S46-51 (2000); Shiku et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 46, S77-82 (2000); Saffran et al., Cancer Metastasis Rev. 18, 437-449 (1999)), tales como vacunas de cáncer y anticuerpos monoclonales (mAbs), como medios para iniciar y fijar como objetivo una respuesta inmune del hospedante contra células tumorales. En 1998 la FDA aprobó el uso de Herceptina (Stebbing et al., Cancer Treat. Rev. 26, 287-290 (2000); Dillman, Cancer Biother. Radiopsarm. 14, 5-10 (1999); Miller & Sledge, Invest. New Drugs 17, 417-427 (1999)), un mAb que reconoce la proteína de receptor erbB2/HER2-neu, como tratamiento para cáncer de pecho metastático. En combinación con quimioterapia, la Herceptina ha mostrado prolongar el tiempo para la progresión de la enfermedad, cuando se compara con pacientes que reciben quimioterapia sola (Baselgs et al., Cancer Res. 58, 2825-2831 (1998)). Sin embargo, la Herceptina es sólo eficaz para tratar el 10-20% de pacientes cuyos tumores sobreexpresan la proteína erB2. Así, la identificación de otros objetivos o antígenos adecuados para inmunoterapia de cáncer de pecho se ha hecho crecientemente importante.
Un objetivo de proteína ideal para inmunoterapia de cáncer debe tener un perfil de expresión restringida en tejidos normales y sobreexpresarse en tumores, de tal modo que la respuesta inmune se fijará como objetivo células tumorales y no contra otros órganos. Además, el objetivo de proteína debe estar expuesto en la superficie celular, donde será accesible a agentes terapéuticos. Se han identificado antígenos tumorales para un cierto número de tipos de cáncer, usando técnicas tales como examen diferencial de cADN (Hubert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA USA 96, 14523-14528 (1999); Lucas et al., Int. J. Cancer 87, 55-60 (2000)), y la purificación de antígenos de la superficie celular que son reconocidos por anticuerpos específicos para tumores (Catimel et al., J. Biol. Chem. 271, 25664-25670 (1996)). Como método alternativo para identificar antígenos de tumores de pecho, los inventores han usado proteómicos para caracterizar el complemento de proteínas en membranas celulares aisladas del linaje celular de cáncer de pecho T-47D (ATCC: HTB-133). De esta forma, se ha identificado una proteína, denominada BCMP 7, que muestra expresión elevada en algunos linajes de cáncer de pecho, sugiriendo que puede ser un objetivo adecuado para terapia y diagnosis de cáncer.
La BCMP 7 es conocida. Por ejemplo, el documento WO98/07749 describe nuevos factores de crecimiento humano. Éstos incluyen una secuencia, identificada como huXAG-1, que corresponde a la BCMP 7 descrita aquí. El documento WO99/53040 describe un gran número de secuencias derivadas de una base de datos EST, incluyendo secuencias, identificadas como secuencias ID 265 y 288, que corresponden a la BCMP 7 discutida aquí. Se indican estas secuencias como expresadas más altamente en tejido de cáncer de ovario. El documento WO99/55858 describe un gran número de secuencias derivadas de una base de datos EST. Éstas incluyen secuencias, identificadas como secuencias ID 8 y 181, que corresponden a la BCMP 7 discutida aquí, que se indican como expresadas más altamente en tejido de cáncer de páncreas. El documento WO09841627 describe un cierto número de secuencias, y en particular las Seq ID Nos 1 y 2, que corresponden a la BCMP 7 discutida aquí. El documento WO98211217 describe también secuencias (Seq ID Nos 9 y 27) que corresponden a la BCMP 7 discutida aquí, que se obtuvieron de cáncer de estómago. El documento WO0053755 describe una secuencia (PRO 1030) que corresponde a la BCMP 7 descrita aquí. Se usó la multiplicación de copias de genes para cuantificar la relevancia de la proteína para un grupo de tumores. De éstos, aumenta el número de copias de genes en tumor de pulmón principal y tumor de colon principal. Las secuencias correspondientes a BCMP 7 están también presentes en el documento WO09940189. También se ha mostrado que la BCMP 7 se coexpresa con receptor de estrógeno en linajes celulares de cáncer de pecho (Thompson & Weigel, 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 111-116).
Sin embargo, estos documentos de la técnica anterior no revelan la implicación de BCMP 7 en cáncer de pecho y/o no identifican BCMP 7 como localizada en la membrana periférica y por tanto útil en un método inmunoterapéutico para cáncer de pecho.
Así, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para examinar y/o diagnosticar cáncer de pecho en un sujeto, cuyo método comprende la etapa de detectar y/o cuantificar la cantidad de un polipéptido en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto, en el que el polipéptido:
a)
comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1;
b)
es un derivado que tiene una o más sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos, con relación a la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1; o
c)
es un fragmento de un polipéptido como se ha definido en a) o b) anteriores, que tiene una longitud de al menos diez aminoácidos.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para la profilaxis y/o tratamiento de cáncer de pecho en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz terapéuticamente de al menos un polipéptido como se ha definido en el primer aspecto de la invención.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona el uso de al menos un polipéptido como se ha definido en el primer aspecto de la invención en la preparación de un medicamento de uso en la profilaxis y/o tratamiento de cáncer de pecho.
Según se usa aquí, tejido de pecho se refiere al propio pecho, así como al tejido adyacente y/o dentro de los estratos subyacentes al pecho. El sujeto puede ser un mamífero y es preferiblemente un ser humano, aunque están dentro del alcance de la presente invención monos, antropoides, gatos, perros, vacas, caballos y conejos.
En el segundo y tercer aspectos, los polipéptidos o fragmentos de ellos pueden proporcionarse en forma aislada o recombinante, y pueden fusionarse a otros restos. En particular, se consideran específicamente fusiones de los polipéptidos o fragmentos de ellos con proteínas de localización-informadoras tales como la Proteína Verde Fluorescente (Patentes de los EE.UU. Nº 5.625.048, 5.777.079, 6.054.321 y 5.804.387) o la proteína fluorescente DsRed (Matz et al. (1999) Nature Biotech. 17: 969-973). Los polipéptidos o fragmentos de ellos pueden proporcionarse en forma sustancialmente pura, es decir, libres en cierta extensión de otras proteínas. Así, puede proporcionarse un polipéptido en una composición en la que es el componente predominante presente (es decir, está presente en un nivel de al menos el 50%, preferiblemente al menos 75%, al menos 90% o al menos 95%, cuando se determina en base peso/peso excluyendo disolventes o vehículos).
Con el fin de apreciar más extensamente la presente invención, se discutirán ahora con mayor detalle polipéptidos dentro del alcance de los anteriores a)-c).
Polipéptidos dentro del alcance de a)
Un polipéptido dentro del alcance de a) puede consistir en la secuencia de aminoácidos particular dada en la Figura 1 o puede tener una secuencia de aminoácidos N-terminal adicional y/o C-terminal adicional con relación a la secuencia dada en la Figura 1.
Pueden proporcionarse secuencias N-terminal o C-terminal adicionales por diversas razones. Las técnicas para proporcionar tales secuencias adicionales son muy conocidas en la técnica. Pueden proporcionarse secuencias adicionales con el fin de alterar las características de un polipéptido particular. Esto puede ser útil para mejorar la expresión o regulación de expresión en sistemas de expresión particulares. Por ejemplo, una secuencia adicional puede proporcionar alguna protección contra división proteolítica. Esto se ha hecho para la hormona Somatostatina fusionándola en su término N a parte de la enzima \beta galactosidasa (Itakwa et al., Science 198: 105-63 (1977)).
También pueden ser útiles secuencias adicionales para alterar las propiedades de un polipéptido para ayudar en identificación o purificación. Por ejemplo, puede proporcionarse una proteína de fusión en la que un polipéptido está enlazado a un resto capaz de ser aislado por cromatografía de afinidad. El resto puede ser un antígeno o un epítope y la columna de afinidad puede comprender anticuerpos inmovilizados o fragmentos de anticuerpos inmovilizados que se unan a dicho antígeno o epítope (deseablemente con un alto grado de especificidad). La proteína de fusión puede eluirse usualmente de la columna por adición de un tampón apropiado.
Las secuencias N-terminal o C-terminal adicionales pueden, no obstante, estar presentes simplemente como resultado de una técnica particular usada para obtener un polipéptido y no necesitan proporcionar ninguna característica ventajosa particular al polipéptido. Tales polipéptidos están dentro del alcance de la presente invención.
Cualquiera que sea la secuencia N-terminal o C-terminal que esté presente, se prefiere que el polipéptido resultante presente la actividad inmunológica o biológica del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1.
Polipéptidos dentro del alcance de b)
Volviendo ahora a los polipéptidos definidos antes en b), se apreciará por la persona experta en la técnica que estos polipéptidos son variantes del polipéptido dado antes en a). Tales variantes presentan preferiblemente la actividad inmunológica o biológica del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1.
Pueden tener lugar alteraciones en la secuencia de aminoácidos de una proteína que no afecten a la función de una proteína. Éstas incluyen supresiones, inserciones y sustituciones de aminoácidos y pueden resultar de empalme alternativo y/o la presencia de lugares de traducción múltiples y lugares de detención. Pueden producirse polimorfismos como resultado de la infidelidad del proceso de traducción. Así, pueden tolerarse cambios en la secuencia de aminoácidos que no afecten a la función biológica o inmunológica de la proteína.
La persona experta apreciará que pueden hacerse a menudo diversos cambios en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tenga una actividad particular para producir variantes (conocidas a veces como "muteínas") que tengan al menos una proporción de dicha actividad, y que tengan preferiblemente una proporción sustancial de dicha actividad. Tales variantes de los polipéptidos descritos antes en a) están dentro del alcance de la presente invención y se discuten después con mayor detalle. Incluyen variantes alélicas y no alélicas.
Un ejemplo de una variante de la presente invención es un polipéptido como se ha definido antes en a), aparte de la sustitución de uno o más aminoácidos con uno o más aminoácidos distintos. La persona experta sabe que diversos aminoácidos tienen propiedades similares. Uno o más de tales aminoácidos de un polipéptido pueden sustituirse a menudo por uno o más aminoácidos distintos sin eliminar una actividad deseada de ese polipéptido.
Así, los aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina pueden sustituirse a menudo por otro (aminoácidos que tengan cadenas secundarias alifáticas). De estas posibles sustituciones, se prefiere usar glicina y alanina para sustituir por otro (porque tienen cadenas secundarias relativamente cortas) y usar valina, leucina e isoleucina para sustituir por otro (porque tienen cadenas secundarias alifáticas mayores que son hidrófobas).
Otros aminoácidos que pueden sustituirse a menudo por otro incluyen:
-
fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos que tienen cadenas secundarias aromáticas);
-
lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas secundarias básicas);
-
aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas secundarias ácidas);
-
asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas secundarias amidas); y
-
cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas secundarias que contienen azufre).
Se hace referencia a menudo a sustituciones de esta naturaleza como sustituciones de aminoácidos "conservadoras" o "semiconservadoras".
Pueden hacerse también supresiones o inserciones de aminoácidos con relación a la secuencia de aminoácidos dada antes en a). Así, por ejemplo, pueden suprimirse aminoácidos que no tengan un efecto sustancial sobre la actividad biológica y/o inmunológica del polipéptido, o al menos que no eliminen tal actividad. Tales supresiones pueden ser ventajosas porque pueden reducirse la longitud total y el peso molecular de un polipéptido conservando aún actividad. Esto puede permitir reducir la cantidad de un polipéptido requerido para un propósito particular, por ejemplo, pueden reducirse niveles de dosificación.
También pueden hacerse inserciones de aminoácidos con relación a la secuencia dada antes en a). Esto puede hacerse para alterar las propiedades de un polipéptido usado en la presente invención (por ejemplo, para ayudar en la identificación, purificación o expresión, como se ha explicado antes en relación con proteínas de fusión).
Pueden hacerse cambios de aminoácidos con relación a la secuencia dada antes en a) usando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida al lugar (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551).
Debe apreciarse que pueden hacerse sustituciones o inserciones de aminoácidos dentro del alcance de la presente invención usando aminoácidos que tienen lugar naturalmente o no tienen lugar naturalmente. Tanto si se usan o no aminoácidos naturales o sintéticos, se prefiere que estén presentes sólo L-aminoácidos.
Cualesquiera cambios de aminoácidos se hagan (mediante sustitución, inserción o supresión), los polipéptidos preferidos de la presente invención tienen al menos una identidad de secuencias del 50% con un polipéptido como se ha definido antes en a), y más preferiblemente el grado de identidad de secuencias es al menos 75%. Son más preferidas identidades de secuencias de al menos 90% o al menos 95%.
El porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos se determina alineando las secuencias con fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse aberturas en la primera secuencia para mejor alineamiento con la secuencia) y comparando los residuos de aminoácidos o nucleótidos en posiciones correspondientes. El "mejor alineamiento" es un alineamiento de dos secuencias que produce el mayor porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se determina por el número de residuos de aminoácidos o nucleótidos idénticos en las secuencias comparadas (es decir, % de identidad = nº de posiciones idénticas/nº total de posiciones x 100).
La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede conseguirse usando un algoritmo matemático conocido por los expertos en la técnica. Un ejemplo de un algoritmo matemático para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 87: 2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 90: 5873-5877. Los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 han incorporado tal algoritmo. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas con las moléculas de ácidos nucleicos de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas con las moléculas de proteínas de la invención. Para obtener alineamientos abiertos con fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Alternativamente, puede usarse PSI-Blast para realizar una búsqueda iterada que detecte relaciones distantes entre moléculas (Id.). Cuando se utilizan programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Otro ejemplo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers & Miller, CABIOS (1989). El programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del paquete de software de alineamiento de secuencias CGC ha incorporado tal algoritmo. Otros algoritmos para análisis de secuencias conocidos en la técnica incluyen ADVANCE y ADAM, como se describe en Torellis & Robotti (1994) Computer Appl. Biosci., 10: 3-5; y FASTA, descrito en Pearson & Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444-8. Dentro de FASTA, ktup es una opción de control que establece la sensibilidad y velocidad de la búsqueda.
Cuando estén presentes altos grados de identidad de secuencias habrá relativamente pocas diferencias en la secuencia de aminoácidos. Así, por ejemplo, puede haber menos de 20, menos de 10 o incluso menos de 5 diferencias.
Polipéptidos dentro del alcance de c)
Como se ha discutido anteriormente, es ventajoso a menudo reducir la longitud de un polipéptido, siempre que el polipéptido de longitud reducida resultante tenga todavía una actividad deseada o pueda producir anticuerpos útiles. El aspecto c) de la presente invención cubre por tanto fragmentos de polipéptidos a) o b) anteriores.
La persona experta puede determinar si un fragmento particular tiene o no actividad usando las técnicas descritas antes. Los fragmentos preferidos tienen al menos una longitud de 10 aminoácidos. Pueden tener una longitud de al menos 20, al menos 50 o al menos 100 aminoácidos.
Un polipéptido como se define aquí puede ser útil como material antígeno, y puede usarse en la producción de vacunas para el tratamiento o profilaxis de cáncer de pecho. Tal material puede ser "antígeno" y/o "inmunógeno". Generalmente, "antígeno" se toma para significar que la proteína es capaz de ser usada para producir anticuerpos o realmente es capaz de introducir una respuesta de anticuerpo en un sujeto. "Inmunógeno" se toma para significar que la proteína es capaz de lograr una respuesta inmune protectora en un sujeto. Así, en el último caso, la proteína puede ser capaz de no sólo generar una respuesta de anticuerpo sino, además, respuestas inmunes no basadas en anticuerpo.
Es bien sabido que es posible examinar una proteína o polipéptido antígenos para identificar regiones epitópicas, es decir, aquellas regiones que son responsables de la antigenicidad o inmunogenicidad de la proteína o polipéptido. Pueden usarse métodos muy conocidos por la persona experta para ensayar la antigenicidad de fragmentos y/u homólogos y/o derivados. Así, los fragmentos de la presente invención pueden incluir una o más de tales regiones epitópicas o ser suficientemente similares a tales regiones para conservar sus propiedades antígenas/inmunógenas. Así, para fragmentos según la presente invención, el grado de identidad es quizás irrelevante, porque pueden ser 100% idénticos a una parte particular de una proteína o polipéptido, homólogo o derivado como se describe aquí. El asunto clave puede ser que el fragmento conserve las propiedades antígenas/inmunógenas de la proteína de la que se deriva.
Homólogos, derivados y fragmentos pueden poseer al menos un grado de la antigenicidad/inmunogenicidad de la proteína o polipéptido de los que se derivan.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de un polipéptido como se define aquí en la producción de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de cáncer de pecho, en el que el medicamento es una vacuna. La vacuna comprende opcionalmente uno o más coadyuvantes adecuados. Los ejemplos de coadyuvantes muy conocidos en la técnica incluyen geles inorgánicos, tales como hidróxido de aluminio y emulsiones de agua en aceite, tales como coadyuvante de Freund incompleto. Otros coadyuvantes útiles serán bien conocidos por la persona experta.
En aspectos adicionales todavía, la presente invención proporciona:
(a) el uso de un polipéptido como se ha definido aquí en la preparación de una composición inmunógena, preferiblemente una vacuna;
(b) el uso de tal composición inmunógena para inducir una respuesta inmune en un sujeto; y
(c) un método para el tratamiento o profilaxis de cáncer de pecho en un sujeto, o de vacunación de un sujeto contra cáncer de pecho, que comprende la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de un polipéptido como se define aquí, preferiblemente como una vacuna.
Como se discutirá después, los polipéptidos usados en la presente invención encontrarán uso en un método inmunoterapéutico para cáncer de pecho. La persona experta apreciará que para la preparación de uno o más de tales polipéptidos, el método preferido se basará en técnicas de ADN recombinante. Además, pueden usarse moléculas de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos o fragmentos de ellos por derecho propio. Así, en un cuarto aspecto, la invención proporciona un método para examinar y/o diagnosticar cáncer de pecho en un sujeto, cuyo método comprende la etapa de detectar y/o cuantificar la cantidad de un ácido nucleico en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto, en el que la molécula de ácido nucleico:
a) comprende o consiste en la secuencia de ADN mostrada en la Figura 1 o su equivalente de ARN;
b) tiene una secuencia que es complementaria de las secuencias de a);
c) tiene una secuencia que codifica el mismo polipéptido que las secuencias de a) o b);
d) tiene una secuencia que muestra identidad sustancial con cualquiera de las de a), b) y c); o
e) una secuencia que codifica un derivado o fragmento de una molécula de aminoácido mostrada en la Figura 1.
En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un método para la profilaxis y/o el tratamiento de cáncer de pecho en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz terapéuticamente de al menos un ácido nucleico como se define en el cuarto aspecto de la invención.
En un sexto aspecto, la presente invención proporciona el uso de al menos un ácido nucleico como se ha definido en el cuarto aspecto de la invención en la preparación de un medicamento de uso en la profilaxis y/o el tratamiento de cáncer de pecho.
Estas moléculas de ácidos nucleicos se discuten ahora con mayor detalle.
Se prefiere si secuencias que muestran identidad sustancial con cualquiera de las de a), b) y c) tienen, por ejemplo, al menos 50%, al menos 75% o al menos 90% o 95% de identidad de secuencias.
Los polipéptidos usados en la presente invención pueden codificarse mediante una gran variedad de moléculas de ácidos nucleicos, teniendo en cuenta la degeneración bien conocida del código genético. Todas estas moléculas están dentro del alcance de la presente invención. Pueden insertarse en vectores y clonarse para proporcionar grandes cantidades de ADN o ARN para estudio adicional. Pueden introducirse vectores adecuados en células hospedantes para permitir la expresión de polipéptidos usados en la presente invención utilizando técnicas conocidas para la persona experta en la técnica.
La expresión "equivalente de ARN" cuando se usa antes indica que una molécula de ARN dada tiene una secuencia que es complementaria de la de una molécula de ADN dada, permitiendo el hecho de que en ARN "U" sustituya a "T" en el código genético. La molécula de ácido nucleico puede estar en forma aislada, recombinante o sintética químicamente.
Las técnicas para clonar, expresar y purificar proteínas y polipéptidos son muy conocidas para la persona experta. Pueden generarse fácilmente construcciones de ADN usando métodos muy conocidos en la técnica. Estas técnicas se describen, por ejemplo, en J. Sambrook et al., Molecular Cloning 2^{nd} Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989); en Old & Primrose Principles of Gene Manipulation 5ª Edición, Blackwell Scientific Publications (1994); y en Stryer, Biochemistry 4ª Edición, W.H. Freeman and Company (1995). Pueden facilitarse después modificaciones de construcciones de ADN y las proteínas expresadas tales como la adición de promotores, aumentadores, secuencias señal, secuencias líder, señales de comienzo y detención de traducción y regiones de control de estabilidad de ADN, o la adición de compañeros de fusión.
Normalmente, la construcción de ADN se insertará en un vector, que puede ser de origen fago o plásmido. La expresión de la proteína se consigue por la transformación o transfección del vector en una célula hospedante que puede ser de origen eucariota o procariota. Tales vectores y células hospedantes adecuadas forman aspectos de la presente invención.
Las secuencias de nucleótidos de la presente invención, incluyendo ADN y ARN, y que comprenden una secuencia que codifica un polipéptido como se define aquí (o un fragmento, homólogo o análogo del mismo), pueden sintetizarse usando métodos conocidos en la técnica, tal como usando métodos químicos convencionales o multiplicación por reacción en cadena de polimerasa (PCR). Las secuencias de nucleótidos de la presente invención permiten también la identificación y clonación del gen que codifica un polipéptido como se define aquí a partir de cualquier especie, por ejemplo, examinando genotecas de cADN, genotecas genómicas o genotecas de expresión.
Puede usarse el conocimiento de la estructura de ácidos nucleicos para producir anticuerpos y para terapia génica. Las técnicas para esto son muy conocidas por los expertos en la técnica, como se discute con más detalle aquí.
Usando sistemas de expresión apropiados, pueden expresarse polipéptidos de la presente invención en forma glicosilada o no glicosilada. Las formas no glicosiladas pueden producirse por expresión en hospedantes procariotas, tales como E. coli.
Pueden producirse polipéptidos que comprenden metionina N-terminal usando ciertos sistemas de expresión, mientras que en otros el polipéptido maduro carecerá de este residuo.
Se resumen seguidamente las técnicas preferidas para clonar, expresar y purificar un polipéptido usado en la presente invención:
Pueden prepararse polipéptidos nativamente o en condiciones desnaturalizantes y replegarse a continuación. Los vectores de expresión baculovírica incluyen plásmidos secretores (tales como pACGP67 de Pharmingen), que pueden tener una secuencia etiqueta de epítope clonada en marco (por ejemplo, myc, V5 o His) para ayudar a la detección y permitir la purificación subsiguiente de la proteína. Los vectores de expresión de mamíferos pueden incluir pCDNA3 y pSecTag (ambos de Invitrogen), y pREP9 y pCEP4 (Invitrogen). Los sistemas de E. coli incluyen la serie pBad (His etiquetada - Invitrogen) o la serie pGex (Pharmacia).
Además de moléculas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos usados en la presente invención, a las que se hace referencia aquí como moléculas de ácidos nucleicos "codificantes", la presente invención incluye también moléculas de ácidos nucleicos complementarias de ellas. Así, por ejemplo, ambas cadenas de una molécula de ácido nucleico de cadena doble están incluidas dentro del alcance de la presente invención (tanto si están como si no asociadas con otra). También están incluidas moléculas de mARN y moléculas de ADN complementario (por ejemplo, moléculas de cADN).
Las moléculas de ácidos nucleicos que pueden hibridarse con cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos discutidas antes también están cubiertas por la presente invención. Se hace referencia aquí a tales moléculas de ácidos nucleicos como moléculas de ácidos nucleicos "hibridantes". Las moléculas de ácidos nucleicos hibridantes pueden ser útiles como sondas o cebadores, por ejemplo.
Deseablemente, tales moléculas hibridantes tienen al menos 10 nucleótidos de longitud y preferiblemente tienen al menos 25 o al menos 50 nucleótidos de longitud. Las moléculas de ácidos nucleicos hibridantes se hibridan preferiblemente con ácidos nucleicos dentro del alcance de (a), (b), (c), (d) o (e) anteriores específicamente.
Deseablemente, las moléculas hibridantes se hibridan con tales moléculas en condiciones de hibridación rigurosas. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es cuando la hibridación intentada se realiza a una temperatura de alrededor de 35ºC a aproximadamente 65ºC usando una solución de sal que es aproximadamente 0,9 molar. Sin embargo, la persona experta será capaz de variar tales condiciones según sea apropiado con el fin de tener en cuenta variables tales como longitud de sonda, composición de base, tipo de iones presentes, etc. Para un alto grado de selectividad, se usan condiciones relativamente rigurosas para formar los dúplex, tales como condiciones de baja cantidad de sal o alta temperatura. Según se usa aquí, "condiciones altamente rigurosas" significa hibridación con ADN unido a filtro en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecilsulfato sódico (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65ºC, y lavado en 0,1 x SSC/SDS al 0,1% a 68ºC (Ausubel F.M. et al., reds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, en p. 2.10.3). Para algunas aplicaciones, se requieren condiciones menos rigurosas para formación de dúplex. Según se usa aquí, "condiciones moderadamente rigurosas" significa lavado en 0,2 x SSC/SDS al 0,1% a 42ºC (Ausubel et al., 1989, anterior). Las condiciones de hibridación pueden hacerse también más rigurosas por adición de cantidades crecientes de formamida, para desestabilizar el dúplex del híbrido. Así, pueden manipularse fácilmente condiciones de hibridación particulares, y se escogerán generalmente dependiendo de los resultados deseados. En general, temperaturas de hibridación convenientes en presencia de formamida al 50% son: 42ºC para una sonda que es del 95 al 100% idéntica al fragmento de un gen que codifica un polipéptido como se define aquí, 37ºC para una identidad del 90 al 95% y 32ºC para una identidad del 70 al 90%. En la preparación de genotecas genómicas, se generan fragmentos de ADN, algunos de los cuales codifican partes o la totalidad de un polipéptido como se define aquí. El ADN puede dividirse en lugares específicos usando diversas enzimas de restricción. Alternativamente, puede usarse ADNsa en presencia de manganeso para fragmentar el ADN, o el ADN puede zicallarse físicamente, como por ejemplo mediante sonicación. Los fragmentos de ADN pueden separarse después según tamaño por técnicas estándares, incluyendo aunque sin limitarse a ellas, electroforesis en gel de agarosa y poliacrilamida, cromatografía de columna y centrifugación con gradiente de sacarosa. Los fragmentos de ADN pueden insertarse después en vectores adecuados, incluyendo aunque sin limitarse a ellos, plásmidos, cósmidos, bacteriófagos lambda o T_{4} y cromosomas artificiales de levadura (YACs). (Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1D Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Glover, D.M. (red.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, R.U. Vol. I, II; Ausubel F.M. et al., reds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York). La genoteca genómica puede examinarse por hibridación de ácido nucleico con sonda marcada (Benton & Davis, 1977, Science 196: 180; Grunstein & Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961).
La manipulación del ADN que codifica una proteína es una técnica particularmente poderosa para modificar proteínas y para generar grandes cantidades de proteína con fines de purificación. Esto puede implicar el uso de técnicas de PCR para multiplicar una secuencia de ácido nucleico deseada. Así, los datos de secuencias proporcionados aquí pueden usarse para diseñar cebadores de uso en PCR, de manera que pueda fijarse como objetivo una secuencia deseada y multiplicarse después en alto grado.
Típicamente, los cebadores tendrán al menos cinco nucleótidos de longitud y tendrán generalmente al menos diez nucleótidos de longitud (por ejemplo, de quince a veinticinco nucleótidos de longitud). En algunos casos, pueden usarse cebadores de al menos treinta o al menos treinta y cinco nucleótidos de longitud.
Como alternativa adicional, puede usarse síntesis química. Ésta puede ser automatizada. Pueden sintetizarse químicamente secuencias relativamente cortas y ligarse entre sí para proporcionar una secuencia más larga.
Además de usarse como cebadores y/o sondas, pueden usarse moléculas de ácidos nucleicos hibridantes de la presente invención como moléculas anti-sentido para alterar la expresión de sustancias de la presente invención uniéndose a moléculas de ácidos nucleicos complementarias. Esta técnica puede usarse en terapia anti-sentido.
En una realización específica, la expresión de un polipéptido como se define aquí se inhibe mediante el uso de ácidos nucleicos antisentido. La presente invención proporciona el uso terapéutico o profiláctico de ácidos nucleicos que comprenden al menos seis nucleótidos que son antisentido para un gen o cADN que codifica un polipéptido como se define aquí o una porción del mismo. Según se usa aquí, un ácido nucleico "antisentido" se refiere a un ácido nucleico capaz de hibridarse en virtud de alguna complementariedad de secuencias con una porción de un ARN (preferiblemente mARN) que codifica un polipéptido como se define aquí. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario de una región codificante y/o no codificante de un mARN que codifica tal polipéptido. Tales ácidos nucleicos antisentido tienen utilidad como compuestos que inhiben expresión, y pueden usarse en el tratamiento o prevención de cáncer de pecho.
Una molécula de ácido nucleico hibridante de la presente invención puede tener un alto grado de identidad de secuencias a lo largo de su longitud con una molécula de ácido nucleico dentro del alcance de (a)-(e) anteriores (por ejemplo, al menos 50%, al menos 75% o al menos 90% o 95% de identidad de secuencias). Como se apreciará por la persona experta, cuanto más alta sea la identidad de secuencias de una molécula de ácido nucleico de cadena sencilla dada con otra molécula de ácido nucleico, mayor será la probabilidad de que se hibride con una molécula de ácido nucleico que sea complementaria de esa otra molécula de ácido nucleico en condiciones apropiadas.
A la vista de la descripción anterior, la persona experta apreciará que un gran número de ácidos nucleicos están dentro del alcance de la presente invención. Salvo que el contexto indique otra cosa, las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención pueden tener una o más de las siguientes características:
1)
pueden ser ADN o ARN;
2)
pueden ser de cadena sencilla o doble;
3)
pueden proporcionarse en forma recombinante, por ejemplo, enlazados covalentemente a una secuencia flanqueante 5' y/o 3' para proporcionar una molécula que no tiene lugar en la naturaleza;
4)
pueden proporcionarse sin secuencias flanqueantes 5' y/o 3', lo que tiene lugar normalmente en la naturaleza;
5)
pueden proporcionarse en forma sustancialmente pura. Así, pueden proporcionarse en una forma que esté sustancialmente exenta de proteínas contaminantes y/o de otros ácidos nucleicos; y
6)
pueden proporcionarse con intrones o sin intrones (por ejemplo, como cADN).
Si se desea, pueden usarse también en ensayos de hibridación un gen que codifica un polipéptido como se define aquí, un gen relacionado o secuencias o subsecuencias de ácidos nucleicos relacionadas, incluyendo secuencias complementarias. Pueden usarse como sonda de hibridación un polipéptido como se define aquí o subsecuencias del mismo que comprendan al menos 8 nucleótidos. Pueden usarse ensayos de hibridación para detección, pronostico, diagnosis o control de estados, trastornos o estados de enfermedad, asociados con expresión aberrante de genes que codifican un polipéptido como se define aquí, o para diagnosis diferencial de pacientes con signos o síntomas que sugieran cáncer de pecho. En particular, tal ensayo de hibridación puede realizarse por un método que comprende poner en contacto una muestra del paciente que contenga ácido nucleico con una sonda de ácido nucleico capaz de hibridarse con ADN o ARN que codifica un polipéptido como se define aquí, en condiciones tales que pueda tener lugar hibridación, y detectar o medir cualquier hibridación resultante. Pueden usarse nucleótidos para terapia de pacientes que tengan cáncer de pecho, como se describe después.
En otra realización, una preparación de oligonucleótidos que comprende 10 o más nucleótidos consecutivos complementarios con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido como se define aquí o un fragmento del mismo para su uso como vacunas para el tratamiento de cáncer de pecho. Tales preparaciones pueden incluir coadyuvantes u otros vehículos.
En una realización específica, se administran ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica un polipéptido como se define aquí o un derivado funcional del mismo, para promover la función del polipéptido mediante terapia génica. La terapia génica se refiere a la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o expresable. En esta realización, el ácido nucleico produce su proteína codificada que media en un efecto terapéutico promoviendo la función del polipéptido. Pueden usarse según la presente invención cualquiera de los métodos para terapia génica disponibles en la técnica.
En un aspecto preferido, el compuesto comprende un ácido nucleico como se define aquí, tal como un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define aquí o un fragmento o proteína quimérica del mismo, siendo dicho ácido nucleico parte de un vector de expresión que expresa un polipéptido como se define aquí o un fragmento o proteína quimérica del mismo en un hospedante adecuado. En particular, tal ácido nucleico tiene un promotor enlazado operativamente a la región de codificación del polipéptido, siendo dicho promotor inducible o constitutivo (y, opcionalmente, específico para tejido). En otra realización particular, se usa una molécula de ácido nucleico en la que las secuencias de codificación y cualesquiera otras secuencias deseadas están flanqueadas por regiones que promueven recombinación homóloga en un lugar deseado del genoma, proporcionando así expresión intracromosómica del ácido nucleico (Koller & Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438).
La entrega del ácido nucleico a un paciente puede ser directa, en cuyo caso el paciente se expone directamente al ácido nucleico o un vector que lleva el ácido nucleico; este método se conoce como terapia génica in vivo. Alternativamente, la entrega del ácido nucleico al paciente puede ser indirecta, en cuyo caso se transforman primero células con el ácido nucleico in vitro y se trasplantan después al paciente; este método se conoce como terapia génica ex vivo.
Un medio conveniente para detectar/cuantificar los polipéptidos usados en la presente invención implica el uso de anticuerpos. Así, los polipéptidos usados en la invención encuentran también uso en la producción de anticuerpos.
En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo que se une a al menos un polipéptido como se define en el primer aspecto de la invención para examen y/o diagnosis de cáncer de pecho en un sujeto. Preferiblemente, el anticuerpo se usa para detectar y/o cuantificar la cantidad de un polipéptido como se define en el primer aspecto de la invención en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto.
En una realización, puede usarse la unión de anticuerpo en secciones de tejido para detectar la localización de polipéptido aberrante o un nivel aberrante de polipéptido. En una realización específica, puede usarse anticuerpo para un polipéptido como se define aquí para ensayar el nivel del polipéptido en un tejido de paciente (por ejemplo, una biopsia de pecho), en el que un nivel aberrante de polipéptido es indicativo de cáncer de pecho. Según se usa aquí, un "nivel aberrante" significa un nivel aumentado o disminuido en comparación con el nivel en un sujeto exento de cáncer de pecho o un nivel de referencia. Si se desea, la comparación puede realizarse con una muestra equilibrada del mismo sujeto, tomada de una porción del cuerpo no afectada por cáncer de pecho.
Los inmunoensayos adecuados incluyen, sin limitación, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos usando técnicas tales como manchas de western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunosorbente enlazado a enzima), inmunoensayos "sandwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina con difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación a complemento, ensayos inmunoradiométricos, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteína A.
En un octavo aspecto, la presente invención proporciona un método para la profilaxis y/o el tratamiento de cáncer de pecho en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz terapéuticamente de un anticuerpo que se une a al menos un polipéptido como se define en el primer aspecto de la invención.
En un noveno aspecto, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo que se une a al menos un polipéptido como se define en el primer aspecto de la invención en la preparación de un medicamento de uso en la profilaxis y/o el tratamiento de cáncer de pecho.
Los anticuerpos preferidos se unen específicamente a polipéptidos de la presente invención de modo que pueden usarse para purificar y/o inhibir la actividad de tales polipéptidos. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales.
Así, puede usarse como inmunógeno el polipéptido usado en la invención, sus fragmentos u otros derivados, o análogos de ellos, para generar anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente tales como un inmunógeno. Los anticuerpos de la invención incluyen, pero no se limitan a ellos, anticuerpos policlonales, monoclonales, biespecíficos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab y fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una genoteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) y fragmentos de unión de epítopes de cualquiera de los anteriores. El término "anticuerpo" según se usa aquí se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones activas inmunológicamente de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un lugar de unión de antígeno que unen específicamente un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) o subclase de molécula de inmunoglobulina.
En la producción de anticuerpos, puede conseguirse un examen del anticuerpo deseado por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, ELISA (ensayo de inmunosorbente enlazado a enzima). Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen un dominio específico de un polipéptido usado en la invención, se pueden ensayar hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento de polipéptido que contenga tal dominio. Para seleccionar un anticuerpo que se una específicamente a un primer homólogo de polipéptido pero que no se una específicamente a (o se una menos ávidamente a) un segundo homólogo de polipéptido, se puede seleccionar sobre la base de unión positiva al primer homólogo de polipéptido y falta de unión a (o unión reducida a) el segundo homólogo de polipéptido.
Para preparar anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos hacia un polipéptido usado en la invención, puede usarse cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por linajes celulares continuos en cultivo. Por ejemplo, la técnica de hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256: 495-497), así como la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) y la técnica de hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. págs. 77-96). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de ellas.
El hibridoma que produce los mAbs usados en la invención puede cultivarse in vitro o in vivo. En una realización adicional de la invención, pueden producirse anticuerpos monoclonales en animales exentos de gérmenes utilizando tecnología conocida (PCT/US90/02545).
Los anticuerpos monoclonales incluyen, aunque sin limitarse a ellos, anticuerpos monoclonales humanos y anticuerpos monoclonales quiméricos (por ejemplo, quimeras humanas-de ratón). Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones se derivan de diferentes especies de animales, tal como las que tienen una región constante de inmunoglobulina humana y una región variable derivada de un mAb de ratón. (Véanse, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. Nº 4.816.567 y la Patente de los EE.UU. Nº 4.816.397). Anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especies no humanas que tienen una o más regiones determinantes complementarias (CDRs) de la especie no humana y una región de marco de una molécula de inmunoglobulina humana. (Véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. Nº 5.585.089).
Pueden producirse anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados por métodos de ADN recombinante conocidos en la técnica, por ejemplo, usando métodos descritos en los documentos WO 87/02671; EP-A-184.187; EP-A-171.496; EP-A-173.494; WO 86/01533; Patente de los EE.UU. Nº 4.816.567; EP-A-125.023; Better et al., 1988, Science 240: 1041-1043; Liu et al.1987, Proc. Ntl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47: 999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314: 446-449; Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison, 1985, Science 229: 1202-1207; Oi et al., 1986, Bio/Techniques 4: 214; Patente de los EE.UU. 5.225.539; Jones et al., 1986, Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; y Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141: 4053-4060.
Son particularmente deseables anticuerpos completamente humanos para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Tales anticuerpos pueden producirse usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina endógena, pero que pueden expresar genes de cadena pesada y ligera humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan de manera normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todo o una porción de un polipéptido usado en la invención. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno usando tecnología de hibridomas convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reajustan durante la diferenciación de células B, y experimentan a continuación cambio de clase y mutación somática. Así, usando tal técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE útiles terapéuticamente. Para tener un resumen de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg & Huszar (1995), Int. Rev. Immunol. 13: 65-93. Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, véanse, por ejemplo, Patente de los EE.UU. 5.625.126; Patente de los EE.UU. 5.633.425; Patente de los EE.UU. 5.569.825; Patente de los EE.UU. 5.661.016 y Patente de los EE.UU. 5.545.806. Además, compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) y Genpharm (San Jose, CA) pueden comprometerse para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando tecnología similar a la descrita antes.
Pueden generarse anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítope seleccionado usando una técnica a la que se hace referencia como "selección guiada". En este método, se usa un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconozca al mismo epítope. (Jespers et al. (1994) Bio/technology 12: 899-903).
Los anticuerpos usados en la presente invención pueden generarse también usando diversos métodos de exposición de fagos conocidos en la técnica. En métodos de exposición de fagos, se exponen dominios de anticuerpos funcionales en la superficie de partículas de fagos que llevan las secuencias de polinucleótidos que los codifican. En uno particular, tal fago puede utilizarse para exponer dominios de unión de antígeno expresados a partir de un repertorio o genoteca de anticuerpos combinatoria (por ejemplo, humana o de ratón). Puede seleccionarse un fago que expresa un dominio de unión de antígeno que se une al antígeno de interés o identificarse con antígeno, por ejemplo, usando antígeno marcado o antígeno unido o capturado a una superficie sólida o perla. El fago usado en estos métodos es fago típicamente filamentoso incluyendo dominios de unión fd y M13 expresados a partir de fago con dominios de anticuerpos Fab, Fv o Fv estabilizado con disulfuro fusionados recombinantemente a la proteína del gen III o el gen VIII del fago. Los métodos de exposición de fagos que pueden usarse para fabricar los anticuerpos usados en la presente invención incluyen los descritos en Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958 (1994); Persic et al., Gene 187: 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280 (1994); PCT/GB91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y Patentes de los EE.UU. Nº 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108.
Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección del fago, las regiones del fago que codifican anticuerpo pueden aislarse y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos o cualquier otro fragmento de unión de antígeno deseado, y expresarse en cualquier hospedante deseado, incluyendo células de mamíferos, células de insectos, células de plantas, levadura y bacterias, por ejemplo, como se describe después con detalle. Por ejemplo, pueden emplearse también técnicas para producir recombinantemente fragmentos de Fab, Fab' y F(ab')2 usando métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en los documentos WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6): 864-869 (1992); y Sawai et al., AJRI 34: 26-34 (1995); y Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988).
Los ejemplos de técnicas que pueden usarse para producir Fvs de cadena sencilla y anticuerpos incluyen los descritos en las Patentes de los EE.UU. 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203: 46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90: 7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240: 1038-1040 (1988).
La invención proporciona además el uso de anticuerpos biespecíficos, que pueden fabricarse por métodos conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en las que las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Milstein et al., 1983, Nature 305: 537-539). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesada y ligera de inunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las que sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se hace habitualmente por etapas de cromatografía de afinidad, es algo incómoda, y los rendimientos de producto son bajos. Se describen procedimientos similares en el documento WO 93/08829 y en Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10: 3655-3659.
Según un método diferente y más preferido, se fusionan dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (lugares de combinación anticuerpo-antígeno) a secuencias de dominios constantes de inmunoglobulina. La fusión es preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones de bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1), que contiene el lugar necesario para unión de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Se insertan en vectores de expresión separados ADNs que codifican las fusiones de cadenas pesadas de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, y se co-transfectan en un organismo hospedante adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones cuando relaciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Es posible no obstante insertar las secuencias de codificación para dos o las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en relaciones iguales produce altos rendimientos o cuando las relaciones no tienen significado particular.
En una realización preferida de este método, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina indeseadas, porque la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una vía fácil de separación. Este método se describe en el documento WO 94/04690. Para detalles adicionales para generar anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121: 210.
La invención proporciona el uso de fragmentos, derivados o análogos activos funcionalmente de las moléculas de inmunoglobulina anti-polipéptido. "Activo funcionalmente" significa que el fragmento, derivado o análogo es capaz de lograr anticuerpos anti-anti-idiotipo (es decir, anticuerpos terciarios) que reconocen el mismo antígeno que se reconoce por el anticuerpo del que se derivan el fragmento, derivado o análogo. Específicamente, en una realización preferida, la antigenicidad del idiotipo de la molécula de inmunoglobulina puede aumentarse por supresión de marco y secuencias de CDR que son terminales a la secuencia de CDR que reconoce específicamente el antígeno. Para determinar que secuencias de CDR se unen al antígeno, pueden usarse péptidos sintéticos que contienen las secuencias de CDR en ensayos de unión con el antígeno por cualquier método de ensayo de unión conocido en la técnica.
La presente invención proporciona fragmentos de anticuerpos tales como, aunque sin limitarse a ellos, fragmentos F(ab')2 y fragmentos Fab. Los fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopes específicos pueden generarse por técnicas conocidas. Los fragmentos F(ab')2 consisten en la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada, y se generan por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo. Los fragmentos Fab se generan reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. La invención también proporciona dímeros de cadena pesada y cadena ligera de los anticuerpos de la invención o cualquier fragmento mínimo de los mismos tal como Fvs o anticuerpos de cadena sencilla (SCAs) (como se describe, por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. 4.946.778; Bird, 1988, Science 242: 423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334: 544-54), o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el anticuerpo de la invención. Se forman anticuerpos de cadena sencilla enlazando fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv mediante un puente de aminoácido, produciendo un polipéptido de cadena sencilla. Pueden usarse técnicas para el montaje de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra et al., 1988, Science, 242: 1038-1041).
En otras realizaciones, la invención proporciona proteínas de fusión de las inmunoglobulinas de la invención (o fragmentos activos funcionalmente de las mismas), por ejemplo en los que la inmunoglobulina se fusiona mediante un enlace covalente (por ejemplo, un enlace péptido), en el término N o el término C, a una secuencia de aminoácido de otra proteína (o porción de la misma, preferiblemente una porción de la proteína de 10, 20 o 50 aminoácidos) que no es la inmunoglobulina. Preferiblemente la inmunoglobulina, o fragmento de ella, se enlaza covalentemente a la otra proteína en el término N del dominio constante. Como se ha indicado antes, tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación, el aumento de la vida media in vivo y aumentar la entrega de un antígeno a través de una barrera epitelial al sistema inmune.
Las inmunoglobulinas usadas en la invención incluyen análogos y derivados que se han modificado, es decir, por la incorporación covalente de cualquier tipo de molécula siempre que tal incorporación covalente no perjudique a la unión inmunoespecífica. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados y análogos de las inmunoglobulinas incluyen los que se han modificado adicionalmente, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosfilación, amidación, derivación por grupos protectores/bloqueadores conocidos, división proteolítica, enlace a un ligando celular u otra proteína, etc. Puede realizarse cualquiera de numerosas modificaciones químicas por técnicas conocidas, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, división química específica, acetilación, formilación, etc. Adicionalmente, el análogo o derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
Los anticuerpos anteriores pueden usarse en métodos conocidos en la técnica relativos a la localización y actividad de los polipéptidos usados en la invención, por ejemplo, para formar imagen o radioimagen de estas proteínas, medir niveles de las mismas en muestras fisiológicas apropiadas, en métodos de diagnóstico, etc., y para radioterapia.
Los anticuerpos de la invención pueden producirse por cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, en particular, por síntesis química o por expresión recombinante, y se producen preferiblemente por técnica de expresión recombinante.
La expresión recombinante de anticuerpos, o fragmentos, derivados o análogos de ellos, requiere la construcción de un ácido nucleico que codifique el anticuerpo. Si la secuencia de nucleótidos del anticuerpo es conocida, puede montarse un ácido nucleico que codifique el anticuerpo a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, como se describe en Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242) que, en breve, implica la síntesis de oligonucleótidos superpuestos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, reasociación y ligación de esos oligonucleótidos, y posterior multiplicación por PCR de los oligonucleótidos ligados.
Alternativamente, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo puede obtenerse clonando el anticuerpo. Si no está disponible un clon que contenga el ácido nucleico que codifica el anticuerpo particular, pero es conocida la secuencia de la molécula de anticuerpo, puede obtenerse un ácido nucleico que codifique el anticuerpo de una fuente adecuada (por ejemplo, una genoteca de cADN de anticuerpo, o una genoteca de cADN generada a partir de cualquier tejido o células que expresen el anticuerpo) mediante multiplicación por PCR usando cebadores sintéticos hibridables con los extremos 3' y 5' de la secuencia o por clonación usando una sonda de oligonucleótido específica para la secuencia del gen particular.
Si no está disponible una molécula de anticuerpo que reconozca específicamente un antígeno particular (o una fuente de una genoteca de cADN para clonar un ácido nucleico que codifique tal anticuerpo), pueden generarse anticuerpos específicos para un antígeno particular por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, inmunizando un animal, tal como un conejo, para generar anticuerpos policlonales o, más preferiblemente, generando anticuerpos monoclonales. Alternativamente, puede obtenerse un clon que codifique al menos la porción Fab del anticuerpo examinando genotecas de expresión de Fab (por ejemplo, como se describe en Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) para clones de fragmentos Fab que se unan al antígeno específico o examinando genotecas de anticuerpos (véase, por ejemplo, Clackson et al., 1991, Nature 352: 624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937).
Una vez que se obtiene un ácido nucleico que codifica al menos el dominio variable de la molécula de anticuerpo, puede introducirse en un vector que contenga la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véanse, por ejemplo, los documentos WO 86/05807; WO 89/01036; y la Patente de los EE.UU. Nº 5.122.464). También están disponibles vectores que contienen la cadena ligera o pesada completa para co-expresión con el ácido nucleico para permitir la expresión de una molécula de anticuerpo completa. Después, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo puede usarse para introducir la(s) sustitución(es) o supresión(es) de nucleótidos necesaria(s) para sustituir (o suprimir) los uno o más residuos de cisteína de la región variable que participan en el enlace disulfuro intracadenas con un residuo de aminoácido que no contenga un grupo sulfhidrilo. Tales modificaciones pueden realizarse por cualquier método conocido en la técnica para introducir mutaciones o supresiones específicas en una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, aunque sin limitarse a ellos, mutagénesis química, mutagénesis dirigida por el lugar in vitro (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551), métodos basados en PCR, etc.
Además, pueden usarse técnicas desarrolladas para producir "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452-454) empalmando genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad para antígenos apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Como se ha descrito antes, un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones se derivan de diferentes especies de animales, tales como los que tienen una región variable derivada de un mAb de ratón y una región constante de anticuerpo humano, por ejemplo, anticuerpos humanizados.
Una vez que se ha obtenido un ácido nucleico que codifica una molécula de anticuerpo, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo puede producirse por tecnología de ADN recombinante usando métodos muy conocidos en la técnica. Así, se describen aquí métodos para preparar los polipéptidos usados en la invención expresando un ácido nucleico que contiene las secuencias de la molécula de anticuerpo. Pueden usarse métodos que son muy conocidos por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contengan una molécula de anticuerpo que codifique secuencias y señales de control de la transcripción y la traducción apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas de síntesis y recombinación genética in vivo. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) y Ausubel et al. (reds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).
El vector de expresión se transfiere a una célula hospedante por técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan después por técnicas convencionales para producir un anticuerpo de la invención.
Las células hospedantes usadas para expresar un anticuerpo recombinante de la invención pueden ser células bacterianas tales como Escherichia coli, o, preferiblemente, células eucariotas, especialmente para la expresión de molécula de anticuerpo recombinante completa. En particular, es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO), conjuntamente con un vector tal como el principal elemento promotor de gen temprano intermedio de citomegalovirus humano (Foecking et al., 198, Gene 45: 101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8: 2).
Puede utilizarse una variedad de sistemas de hospedante-vector de expresión para expresar una molécula de anticuerpo de la invención. Tales sistemas de hospedante-expresión representan vehículos mediante los que pueden producirse las secuencias de codificación de interés y purificarse seguidamente, pero también representan células que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias de codificación de nucleótidos apropiadas, pueden expresar la molécula de anticuerpo de la invención in situ. Éstas incluyen, aunque sin limitarse a ellos, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN bacteriófago recombinante, ADN plásmido o ADN cósmido que contengan secuencias de codificación de anticuerpo; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contengan secuencias de codificación de anticuerpo; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contengan las secuencias de codificación de anticuerpo; sistemas de células de plantas infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmido recombinante (por ejemplo, plásmido Ti) que contengan secuencias de codificación de anticuerpo; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, COS, CHO, BHK, células 293, 3T3) que alberguen construcciones de expresión recombinantes que contengan promotores derivados del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, promotor de metalotionenina) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de virus de la viruela 7.5K).
En sistemas bacterianos, puede seleccionarse ventajosamente un cierto número de vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para la molécula de anticuerpo expresada. Por ejemplo, cuando ha de producirse una gran cantidad de tal proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas que comprendan una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), en el que la secuencia que codifica el anticuerpo puede ligarse individualmente al vector enmarcado con la región de codificación lac Z de manera que se produzca una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13; 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509); y similares. Pueden usarse vectores pGEX para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutationa S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas por adsorción y unión a unas perlas de glutationa-agarosa de matriz seguidas por elución en presencia de glutationa libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir lugares de división con proteasa de trombina o factor Xa, de manera que el producto génico objetivo clonado pueda liberarse del resto GST.
En un sistema de insectos, se usa como vector para expresar genes extraños virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV). El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica el anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de polihedrina) del virus y ponerse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina). En células hospedantes de mamíferos, puede utilizarse un cierto número de sistemas de expresión basados en virus (por ejemplo, un sistema de expresión de adenovirus).
Como se ha comentado antes, puede escogerse una cepa de células hospedantes que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y elabore el producto génico en la manera específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y elaboración (por ejemplo, división) de productos proteínicos pueden ser importantes para la función de la proteína.
Para la producción a largo plazo, con alto rendimiento, de anticuerpos recombinantes, se prefiere expresión estable. Por ejemplo, pueden producirse linajes celulares que expresen establemente un anticuerpo de interés transfectando las células con un vector de expresión que comprenda la secuencia de nucleótidos del anticuerpo y la secuencia de nucleótidos de un seleccionable (por ejemplo, neomicina o higromicina), y seleccionar la expresión del marcador seleccionable. Tales linajes celulares diseñados pueden ser particularmente útiles para examinar y evaluar compuestos que interactúen directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.
Los niveles de expresión de la molécula de anticuerpo pueden aumentarse por multiplicación del vector (para un análisis, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa anticuerpo es multiplicable, un aumento en el nivel de inhibidor presente en un cultivo de célula hospedante aumentará el número de copias del gen del marcador. Puesto que la región multiplicada está asociada con el gen del anticuerpo, aumentará también la producción del anticuerpo (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257).
La célula hospedante puede co-transfectarse con dos vectores de expresión de la invención, codificando el primer vector un polipéptido derivado de cadena pesada y codificando el segundo vector un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten igual expresión de polipéptidos de cadenas pesada y ligera. Alternativamente, puede usarse un vector simple que codifica ambos polipéptidos de cadenas pesada y ligera. En tales situaciones, la cadena ligera debe ponerse antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, 1986, Nature 322: 52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2197). Las secuencias de codificación para las cadenas pesada y ligera pueden comprender cADN o ADN genómico.
Una vez que la molécula de anticuerpo usada en la invención se ha expresado recombinantemente, puede purificarse por cualquier método conocido en la técnica para purificar una molécula de anticuerpo, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad tal como con proteína A o antígeno específico, y cromatografía de columna de clasificación por tamaños), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas.
Alternativamente, puede purificarse fácilmente cualquier proteína de fusión utilizando un anticuerpo específico para la proteína de fusión expresada. Por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht et al. permite la purificación fácil de proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en linajes celulares humanos (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972-897). En este sistema, el gen de interés se subclona en un plásmido de recombinación de viruela de tal modo que el marco de lectura abierto del gen se fusiona traduccionalmente con una etiqueta amino-terminal consistente en seis residuos de histidina. La etiqueta sirve como dominio de unión matriz para la proteína de fusión. Se cargan extractos de células infectadas con virus de viruela recombinante en columnas de Ni^{2+} ácido nitriloacético-agarosa y se eluyen selectivamente proteínas etiquetadas con histidina con tampones que contienen imidazol.
En una realización preferida, anticuerpos de la invención o fragmentos de ellos se conjugan con un resto diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos pueden usarse para diagnosis o para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse acoplando el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, núclidos radioactivos, materiales que emiten positrones (de uso en tomografía de emisión de positrones) e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos. Véase en general la Patente de los EE.UU. Nº 4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos de uso como diagnósticos según la presente invención. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y los núclidos radioactivos adecuados incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{111}In y ^{99}Tc.
Los anticuerpos usados en la invención o fragmentos de ellos pueden conjugarse a un resto de agente terapéutico o fármaco para modificar una respuesta biológica dada. El resto de agente terapéutico o fármaco no debe considerarse limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudominas o toxina de difteria; una proteína tal como factor de necrosis de tumores, \alpha-interferón, \beta-interferón, factor de crecimiento de nervios, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno de tejidos, un agente trombótico o un agente anti-angiógeno, por ejemplo, angiostatina o endostatina; o un modificador de respuesta biológica tal como linfoquina, interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-2 (IL-2), iknterleuquina-6 (IL-6), factor estimulantes de colonias de macrófagos de granulocitos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento de nervios (NGF) u otro factor de crecimiento.
Las técnicas para conjugar tal resto terapéutico con anticuerpos son muy conocidas, véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (reds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985; Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2ª Ed.), Robinson et al. (reds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies `84: Biological And Clinical Applications; Pinchera et al. (reds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabelled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (reds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rew., 62: 119-58 (1982).
Alternativamente, un anticuerpo puede conjugarse con un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpos como se describe en la Patente de los EE.UU. Nº 4.676.980.
Un anticuerpo con o sin un resto terapéutico conjugado con él puede usarse como un terapéutico que se administra solo o en combinación con factor(es) citotóxico(s) y/o citoquina(s).
Como se ha comentado aquí, ciertos polipéptidos, moléculas de ácidos nucleicos y anticuerpos encuentran uso en el tratamiento o profilaxis de cáncer de pecho. Pueden formularse formulaciones farmacéuticas, que comprenden al menos un polipéptido o fragmento del mismo, una molécula de ácido nucleico o un anticuerpo de uso en la invención, opcionalmente junto con uno más excipientes, vehículos o diluyentes aceptables farmacéuticamente. Preferiblemente, la formulación farmacéutica es de uso como vacuna y, así, serán aceptables cualesquiera componentes adicionales para uso como vacuna. Además, la persona experta apreciará que pueden añadirse uno o más coadyuvantes adecuados a tales preparaciones de vacuna.
El medicamento se suministrará usualmente como parte de una composición farmacéutica estéril que incluirá normalmente un vehículo aceptable farmacéuticamente. Esta composición farmacéutica puede estar en cualquier forma adecuada (dependiendo del método deseado de administrarla a un paciente).
Puede proporcionarse en forma de dosificación unitaria, se proporcionará generalmente en un recipiente cerrado y puede proporcionarse como parte de un juego. Tal juego incluiría normalmente (aunque no necesariamente) instrucciones de uso. Puede incluir una pluralidad de dichas formas de dosificación unitaria.
La composición farmacéutica puede adaptarse para administración por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral (incluyendo bucal o sublingual), rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal, sublingual o transdérmica), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica). Tales composiciones pueden prepararse por cualquier método conocido en la técnica farmacéutica, por ejemplo mezclando el ingrediente activo con el(los) vehículo(s) o excipiente(s) en condiciones estériles.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración oral pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas o pastillas; como polvos o gránulos; como soluciones, jarabes o suspensiones (en líquidos acuosos o no acuosos; o como espumas o cremas batidas comestibles; o como emulsiones).
Los excipientes adecuados para pastillas o cápsulas de gelatina dura incluyen lactosa, almidón de maíz o derivados del mismo, ácido esteárico o sales del mismo.
Los excipientes adecuados para su uso con cápsulas de gelatina blanda incluyen, por ejemplo, aceites vegetales, ceras, grasas, polioles semisólidos o líquidos, etc.
Para la preparación de soluciones y jarabes, los excipientes que pueden usarse incluyen por ejemplo agua, polioles y azúcares. Para la preparación de suspensiones, pueden usarse aceites (por ejemplo, aceites vegetales) para proporcionar suspensiones de aceite en agua o agua en aceite.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración transdérmica pueden presentarse como parches discretos destinados a permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un período prolongado de tiempo. Por ejemplo, el ingrediente activo puede entregarse desde el parche por iontoforesis como se describe en general en Pharmaceutical Rsearch, 3(6): 318 (1986).
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica pueden formularse como ungüentos, cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, geles, pulverizaciones, aerosoles o aceites. Para infecciones del ojo u otros tejidos externos, por ejemplo boca y piel, las composiciones se aplican preferiblemente como un ungüento o crema tópicos. Cuando se formulan en un ungüento, el ingrediente activo puede emplearse con una base de ungüento parafínica o miscible con agua. Alternativamente, el ingrediente activo puede formularse en una crema con una base de crema de aceite en agua o una base de agua en aceite. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica al ojo incluyen gotas de ojos en las que el ingrediente activo se disuelve o suspende en un vehículo adecuado, especialmente un disolvente acuoso. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica en la boca incluyen comprimidos, pastillas y lavados bucales.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración rectal pueden presentarse como supositorios o enemas.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración nasal en las que el vehículo es un sólido incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de partículas, por ejemplo, en el intervalo de 20 a 500 micrómetros que se administra de la manera en que se toma el rapé, es decir, por inhalación rápida a través del paso nasal desde un recipiente del polvo mantenido cerrado hasta la nariz. Las composiciones adecuadas en las que el vehículo es un líquido, para administración como pulverización nasal o como gotas nasales, incluyen soluciones acuosas o en aceite del ingrediente activo.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración por inhalación incluyen polvos de partículas finas o nieblas que pueden generarse por medio de diversos tipos de aerosoles presurizados dosificados, nebulizadores o insufladores.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración vaginal pueden presentarse como formulaciones en pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o pulverización.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración parenteral incluyen solución de inyección estéril acuosa y no acuosa que puede contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hagan a la formulación sustancialmente isotónica con la sangre del receptor propuesto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes de espesamiento. Los excipientes que pueden usarse para soluciones inyectables incluyen agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales, por ejemplo. Las composiciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o dosis múltiples, por ejemplo, ampollas y viales cerrados, y pueden guardarse en estado liofilizado, que requiera sólo la adición del líquido estéril llevado, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de usar. Pueden prepararse soluciones y suspensiones de inyección extemporánea a partir de polvos, gránulos y pastillas estériles.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes de conservación, agentes solubilizantes, agentes estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, edulcorantes, colorantes, oloríferos, sales (las propias sustancias de la presente invención pueden proporcionarse en forma de una sal aceptable farmacéuticamente), tampones, agentes de revestimiento o antioxidantes. También pueden contener agentes activos terapéuticamente además de la sustancia de la presente invención.
Las dosificaciones del polipéptido, el ácido nucleico o el anticuerpo usados en la presente invención pueden variar entre amplios límites, dependiendo de la enfermedad o trastorno a tratar, la edad y el estado del individuo a tratar, etc., y un médico determinará finalmente las dosificaciones apropiadas a usar. Esta dosificación puede repetirse tan a menudo como sea apropiado. Si se desarrollan efectos secundarios, puede reducirse la cantidad y/o frecuencia de la dosificación, según la práctica clínica normal.
A la vista de la importancia de BCMP 7 en cáncer de pecho, lo siguiente forma aspectos adicionales de la presente invención:
i) Un método para examinar compuestos que modulan, es decir, regulan hacia arriba o regulan hacia abajo, la expresión de un polipéptido usado en la invención, que comprende la etapa de determinar la presencia o ausencia y/o cuantificar al menos un polipéptido o anticuerpo de la invención en una muestra biológica;
ii) un método para comprobar/valorar el tratamiento de cáncer de pecho en un paciente, que comprende la etapa de determinar la presencia o ausencia y/o cuantificar al menos un polipéptido usado en la invención en una muestra biológica obtenida de dicho paciente;
iii) un método para identificar células de cáncer de pecho metastático en una muestra biológica obtenida de un sujeto, que comprende la etapa de determinar la presencia o ausencia y/o cuantificar al menos un polipéptido de la invención.
iv) métodos para tratar cáncer de pecho, que comprenden administrar a un paciente una cantidad eficaz terapéuticamente de un compuesto que modula (por ejemplo, regula hacia arriba o regula hacia abajo) o complementa la expresión o la actividad biológica (o ambas) de un polipéptido como se define aquí en pacientes que tienen cáncer de pecho, con el fin de (a) prevenir el comienzo o el desarrollo de cáncer de pecho; (b) prevenir la progresión de cáncer de pecho; o (c) mejorar los síntomas de cáncer de pecho.
En el contexto de la presente invención, la muestra biológica puede obtenerse de cualquier fuente, tal como una muestra de suero o una muestra de tejido, por ejemplo, tejido del pecho. Cuando se busca la evidencia de metástasis, se observaría en lugares principales de metástasis de pecho tales como nódulos linfáticos, hígado, pulmón y/o huesos.
En una realización, se analiza en tejido de pecho de un sujeto la detección cuantitativa de un polipéptido como se define aquí, en la que un cambio de la abundancia del polipéptido en el tejido del pecho del sujeto con relación a tejido del pecho de un sujeto o sujetos exentos de cáncer de pecho (por ejemplo, una muestra testigo o un intervalo de referencia determinado previamente) indica la presencia de cáncer de pecho.
La invención proporciona también juegos de diagnóstico, que comprenden un anticuerpo contra un polipéptido como se define aquí. Además, tal juego puede comprender opcionalmente uno o más de los siguientes: (1) instrucciones de uso del anticuerpo para diagnosis, pronóstico, comprobación terapéutica o cualquier combinación de estas aplicaciones; (2) un compañero de unión marcado para el anticuerpo; (3) una fase sólida (tal como una tira reactiva) sobre la que se inmoviliza el anticuerpo; y (4) una marca o inserto que indica una aprobación reguladora para uso diagnóstico, de pronóstico o terapéutico o cualquier combinación de ellos. Si no se proporciona compañero de unión marcado para el anticuerpo, el propio anticuerpo anti-polipéptido puede marcarse con un marcador detectable, por ejemplo, un resto quimioluminiscente, enzimático, fluorescente o radioactivo.
La invención proporciona también un juego que comprende una sonda de ácido nucleico capaz de hibridarse con ARN que codifica un polipéptido como se define aquí. En una realización específica, un juego comprende en uno o más recipientes un par de cebadores (por ejemplo, cada uno en el intervalo de tamaños de 6-30 nucleótidos, más preferiblemente 10-30 nucleótidos y aún más preferiblemente 10-20 nucleótidos) que, en condiciones de reacción apropiadas, pueden cebar la multiplicación de al menos una porción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define aquí, tal como mediante reacción en cadena de polimerasa (véase, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CA), reacción en cadena de ligasa (véase documento EP 320.308), el uso de replicasa Q\beta, reacción de sonda cíclica u otros métodos conocidos en la técnica.
La invención proporciona métodos para identificar agentes, compuestos candidatos o compuestos de ensayo que se unen a un polipéptido como se define aquí o tienen un efecto estimulador o inhibidor en la expresión o actividad de un polipéptido como se define aquí.
La presente invención proporciona también ensayos de uso en el descubrimiento de fármacos con el fin de identificar o verificar la eficacia de compuestos para el tratamiento o prevención de cáncer de pecho. Puede ensayarse en los compuestos de ensayo su capacidad para modular niveles de un polipéptido como se define aquí en un sujeto que tenga cáncer de pecho. Los compuestos capaces de modular niveles de un polipéptido como se define aquí en un sujeto que tenga cáncer de pecho para con niveles encontrados en sujetos exentos de cáncer de pecho o para producir cambios similares en modelos de animales experimentales de cáncer de pecho pueden usarse como compuestos primeros para descubrimiento de fármacos adicionales, o usarse terapéuticamente. La expresión de un polipéptido como se define aquí puede ensayarse mediante, por ejemplo, inmunoensayos, electroforesis en gel seguida por visualización, detección de actividad o cualquier otro método enseñado aquí o conocido por los expertos en la técnica. Tales ensayos pueden usarse para examinar fármacos candidatos, en comprobación clínica o en desarrollo de fármacos, en donde la abundancia de un polipéptido como se define aquí puede servir como marcador sustituto de una enfermedad clínica.
Esta invención proporciona además nuevos agentes identificados por los ensayos de examen descritos antes y usos de los mismos para tratamientos como se describe aquí. Además, la invención proporciona también el uso de un agente que interactúa con, o modula actividad de, un polipéptido como se define aquí en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer de pecho.
La invención proporciona el tratamiento o prevención de diversas enfermedades y trastornos por administración de un compuesto terapéutico. Tales compuestos incluyen, aunque sin limitarse a ellos,: un polipéptido como se define aquí y análogos y derivados (incluyendo fragmentos) de él; anticuerpos para él; ácidos nucleicos que codifican un polipéptido como se define aquí, análogos o derivados; ácidos nucleicos antisentido para un gen que codifica un polipéptido como se define aquí o agonistas y antagonistas de un polipéptido como se define aquí. Un aspecto importante de la presente invención es la identificación de un gen que codifica un polipéptido como se define aquí implicado en cáncer de pecho. El cáncer de pecho puede tratarse o prevenirse por administración de un compuesto terapéutico que modula la función o expresión de un polipéptido como se define aquí en el tejido del pecho de pacientes con cáncer de pecho.
En una realización, uno o más anticuerpos cada uno de los cuales se une específicamente a un polipéptido como se define aquí se administran solos o en combinación con uno o más compuestos o tratamientos terapéuticos adicionales. Los ejemplos de tales tratamientos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, taxol, ciclofosfamida, tamoxifeno y doxorubacina.
Los compuestos de la invención incluyen, aunque sin limitarse a ellos, cualquier compuesto, por ejemplo, una pequeña molécula orgánica, proteína, péptido, anticuerpo, ácido nucleico, etc. que restablezca el perfil hacia normal con la condición de que tales compuestos o tratamientos incluyan, aunque sin limitarse a ellos, taxol, ciclofosfamida, tamoxifeno y doxorubacina.
En otra realización, pueden mejorarse síntomas de cáncer de pecho disminuyendo el nivel o la actividad de un polipéptido como se define aquí usando secuencias génicas que codifican un polipéptido como se define aquí conjuntamente con métodos de "supresión" de genes, de ribozima o de triple hélice bien conocidos para disminuir la expresión génica del polipéptido. En este método, se usan moléculas de ribozima o triple hélice para modular la actividad, la expresión o la síntesis del gen, y mejorar así los síntomas del cáncer de pecho. Tales moléculas pueden diseñarse para reducir o inhibir la expresión de un gen objetivo mutante o no mutante. Las técnicas para la producción y uso de tales moléculas son muy conocidas por los expertos en la técnica.
También puede reducirse la expresión de polipéptido endógeno inactivando o "suprimiendo" el gen que codifica el polipéptido, o el promotor de tal gen, usando recombinación homóloga dirigida al objetivo (por ejemplo, véase Smithies et al., 1985, Nature 317: 230-234; Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51: 503-512; Thompson et al., 1989, Cell 5: 313-321; y Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438). Por ejemplo, puede usarse un gen mutante que codifica un polipéptido no funcional (o una secuencia de ADN no relacionada completamente) flanqueado por ADN homólogo del gen endógeno (las regiones codificantes o regiones reguladoras del gen que codifica el polipéptido), con o sin un marcador seleccionable y/o un marcador seleccionable negativo, para transfectar células que expresan el gen objetivo in vivo. La inserción de la construcción de ADN, mediante recombinación homóloga dirigida al objetivo, produce la inactivación del gen objetivo. Tales métodos son particularmente adecuados en el campo agrícola en el que pueden usarse modificaciones de células ES (estaminales embriónicas) para generar descendientes de animales con un gen objetivo inactivo (por ejemplo, véase Thomas & Capecchi, 1987 y Thompson, 1989, anteriores).No obstante, este método puede adaptarse para su uso en seres humanos con la condición de que las construcciones de ADN recombinante se administren directamente o fijen como objetivo al lugar requerido in vivo usando vectores víricos
apropiados.
También se ha encontrado que BCMP 7 se expresa elevadamente en linajes celulares de cáncer de próstata. Por consiguiente, para las aplicaciones discutidas antes con respecto a cáncer de pecho, BCMP 7 encuentra la misma aplicación con respecto a cáncer de próstata.
Las características preferidas de cada aspecto de la invención son para cada uno de los otros aspectos mutatis-mutandis. Los documentos de la técnica anterior mencionados aquí se incorporan en la extensión más completa permitida por la ley.
Ejemplos
Se describirá ahora la invención con referencia a los siguientes ejemplos, que no deben considerarse en modo alguno limitativos del alcance de la presente invención. Los ejemplos se refieren a las figuras, en las que:
La Figura 1 muestra las secuencias de nucleótidos y aminoácidos predichas de BCMP 7. La secuencia señal N-terminal predicha está subrayada. Los espectros de masas asignados a la proteína predicha están en negrita y subrayados. Los espectros de masas en tándem están en negrita y bastardilla; y
La Figura 2 muestra la distribución en tejidos de mARN de BCMP 7. Los niveles de mARN en tejidos normales y en linajes celulares de carcinoma de pecho y de próstata se cuantificaron por RT-PCR en tiempo real. Los niveles de mARN se expresan como el número de copias ng^{-1} de cADN.
La Figura 3 muestra la expresión de BCMP 7 en tejidos de pecho normales y de tumores equivalentes. Los niveles de mARN de BCMP 7 en tejidos normales y de tumores equivalentes de siete pacientes con cáncer de pecho se midieron por RT-PCR en tiempo real. Los niveles de mARN se expresan como el número de copias ng^{-1} de cADN.
Ejemplo 1 Identificación y clonación de BCMP 7
El linaje celular de carcinoma de pecho T-47D se cultivó en medio DMF12, suplementado con suero de becerro fetal al 10%, glutamina 2 mM, penicilina al 1% y estreptomicina al 1%. Se desarrollaron las células a 37ºC en una atmósfera humidificada del 95% de aire y 5% de dióxido de carbono.
Se cosecharon 10^{8} células por tripsinización y centrifugación, y se usaron para preparar proteínas de membrana para separación por 1D PAGE (Bennett, J.P. Techniques in lipid and membrane biochemistry. Holland: Elsevier. (1982); Fujiki, Y., Fowler, S., Shio, H., Hubbard A.L. & Lazarow, P.B. Polypeptide and phospholipid composition of the membrane of rat liver peroxisomes: comparison with endoplasmic reticulum and mitochondrial membranes. J. Cell Biol. 93, 103-110 (1982)). Tras sonicación de las células cosechadas (MSE Soniprep 150, sonda de fondo plano durante 10 segundos con una amplitud de 5 micrómetros), el homogenado de células se centrifugó a 4ºC y 1.000 x g durante 10 min. Se globulizaron membranas de células centrifugando el sobrenadante a 4ºC y 100.000 x g durante 1 h, y se lavó el glóbulo por centrifugación en NaCl 1 M.
La proteína de membrana se solubilizó por homogeneización en detergente Tx114 (Tris HCl 50 mM, EDTA 0,2 mM, Tx114 al 1,5%)(pH 7,4), y la mezcla de proteína se centrifugó a 13.000 x g durante 3 min, seguido por extracción de la fracción soluble con una mezcla de metanol y cloroformo (Boyd, R.S., Duggan, M.J., Shone, C.C. & Foster, K.A. The effect of botulinum neurotoxins on the release of insulin from the insulinoma cell lines HIT-15 and RINm5F. J. Buol. Chem. 270, 18216-18218 (1995)). La muestra de proteína extraída se solubilizó finalmente en tampón de lisis 1D y se separaron las proteínas por 1D PAGE.
Espectrometría de masas
Las proteínas excindidas del gel de 1D se digirieron con tripsina y se analizaron por MALDI-TOF-MS (Voyager STR, Applied Biosystems) usando un láser de longitud de onda 337 nm para desorción y el modo de análisis reflectrón. Dos masas seleccionadas para BCMP 7 ([M+H] = 1293,7 y 1268,6) se caracterizaron adicionalmente por espectrometría de masas en tándem usando un QTOF-MS equipado con una fuente de iones de nanopulverización, (Micromass UK Ltd.). Antes del análisis MALDI, las muestras se desalaron y concentraron usando C18 Zip TipsTM (Millipore). Las muestras para MS en tándem se purificaron usando un sistema nano LC (LC Packings) incorporando material C18 SPE.
Los espectros de masas en tándem no interpretados de péptidos en tríptico se exploraron usando el programa de exploración SEQUEST (Eng et al., 1994, J. Am. Soc. Mass Spectrum. 5: 976-989), versión v.C.1. Los criterios para identificación de base de datos incluían: la especificidad de división de tripsina; la detección de un grupo de iones a, b e y en péptidos devueltos de la base de datos y un incremento de masa para todos los residuos de Cys para responder de carbamidometilación. La base de datos explorada era una base de datos construida de ingresos de proteínas en la base de datos no redundante mantenida por el National Centre for Biotechnology Information (NCBI) que es accesible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
Se encontraron tres espectros de proteína BCMP 7 (dos espectros en tándem, Tabla 1, y un espectro de masas MALDI, Fig. 1) que equivalían a los siguientes registros de mARN: número de admisión AF007791, AF038451 en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/, que definen un marco de lectura abierto (ORF) de 175 aminoácidos (Fig. 1).
TABLA 1 Información de secuencia de aminoácidos derivada de análisis de espectrometría de masas en tándem de BCMP 7
Ion precursor de péptido m/z Secuencia
1293,7 IMFVDPSLTVR
1268,6 HLSPDGQYVRR
Se multiplicó un clon de longitud completa por PCR a partir de cADN de colon (Fig. 1) Preparación de ARN total y síntesis de cADN
Se preparó ARN total a partir de células cultivadas y muestras de tejidos usando reactivo Trizol (Life Technologies) según las intrucciones del fabricante, y se resuspendió en agua exenta de ARNsa con una concentración de 1 \mug/\mul. Se usaron de 1 a 5 \mug de ARN total como plantilla para síntesis de cADN usando un cebador de oligo dT y el juego de transcripción inversa Superscript II (Life Technologies). Se purificaron los cADNs en columna (Qiagen) y se eluyeron con una concentración de 10 ng/\mul.
Clonación de cADN de BCMP 7
El ORF de BCMP 7 de longitud completa predicho se multiplicó por PCR a partir de cADNs de colon, usando los siguientes cebadores: F, 5' CATCTCGAGCAGAGTTGCCATGGAGAAAAT 3', R, 5' CATGGATCCTTTCTTACAATTCAGTCTTCAGC 3' (lugares de restricción en negrita - no homólogos con secuencias de BCMP 7). Las reacciones contenían 10 ng de cADN y reactivos para PCR (Qiagen), y se usaron los siguientes parámetros de ciclación: 40 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 30 segundos. Los productos de PCR se purificaron en columna (Qiagen), se clonaron en un vector T/A (Invitrogen) y se verificó a continuación la secuencia de nucleótidos (Universidad de Oxford, Equipo de determinación de secuencias, R.U.).
La proteína de BCMP 7 predicha es 100% idéntica a hAG-2, una nueva proteína humana codificada por un cADN clonado del linaje celular de cáncer de pecho MCF-7 (Thompson, D.A. & Weigel, R.J. La hAG-2, la homóloga humana del gen de glándula de cemento de Xenopus laevis XAG-2, se coexpresa con receptor de estrógeno en linajes celulares de cáncer de pecho. Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 111-116 (1998)). La hAG-2 es la homóloga humana de XAG-2, una proteína de Xenopus laevis que se expresa en la glándula de cemento durante el desarrollo de la rana (Aberger, F., Weidinger, G., Grunz, H & Richter, K. Anterior specification of embyonic ectoderm: the role of the Xenopus cement gland-specific gene XAG-2. Mech. Dev. 72, 115-130 (1998)).
Se predice que BCMP 7 es una proteína extracelular con una secuencia señal N-terminal (http://psort.nibb.ac.jp) (Figura 1).
Ejemplo 2 Expresión de mARN de BCMP 7 en tejidos humanos
Se usó RT-PCR cuantitativa en tiempo real (Held, C.A., Stevens, J., Livak, K.J. & Williams, P.M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996); Morrison, T.B., Weis, J.J. & Wittwer, C.T. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. Biotechniques 24, 954-958 (1998)) para analizar la distribución de mARN de BCMP 7 en mARNs de tejido humano normal (Clontech) y linajes celulares de cáncer de pecho y de próstata (Fig. 2), y tejido de pecho normal derivado de mamoplastias de reducción cosmética y tejido de pecho canceroso de cirugía (Fig. 3). La aprobación ética para las muestras de pecho normal y canceroso se obtuvo en la cirugía (Oxford, R.U.). Los cebadores usados para PCR fueron como sigue: sentido, 5' AGATACCACAGTCAAACCTG 3', antisentido, 5' GCACTCATCCAAGTGATGAA 3'. Las reacciones contenían 10 ng de cADN, preparado como se ha descrito antes, reactivos de detección de secuencia verde SYBR (PE Biosystems) y los cebadores sentido y antisentido se ensayaron en un sistema de detección de secuencia ABI7700 (PE Biosystems). Las condiciones de PCR fueron 1 ciclo a 50ºC durante 2 min, 1 ciclo a 95ºC durante 10 min y 40 ciclos a 95ºC durante 15 s, y 60ºC durante 1 min. La acumulación de producto de PCR se midió en tiempo real como el aumento de la fluorescencia verde de SYBR, y se analizaron los datos usando el programa de Detector de Secuencias v1.6.3 (PE Biosystems). Se generaron curvas estándares que relacionan el número de copias de plantilla inicial con la fluorescencia y el ciclo de multiplicación usando como plantilla el producto de PCR multiplicado, y se usaron para calcular el número de copias de BCMP 7 en cada muestra.
Los niveles más altos de expresión de BCMP 7 se observaron en el colon, con niveles más bajos de expresión en la glándula mamaria, la próstata, la glándula salival, el intestino delgado, el estómago y la tráquea (Fig. 2). Se detectó también mARN de BCMP 7 en células T-47D, la fuente de proteína BCMP 7 usada en este estudio, y la expresión en este linaje celular se elevó en comparación con tejido mamario normal. El mARN de BCMP 7 se detectó también en los linajes celulares de cáncer de próstata PC3 y PC3M: la expresión en células PC3 se elevó en comparación con la próstata normal. Se detectó poco o nulo mARN de BCMP 7 en los otros linajes celulares o tejidos normales examinados.
Para examinar si la elevación observada en la expresión de BCMP 7 en algunos linajes de carcinoma de pecho se reitera en muestras clínicas, se midió también la expresión de mARN en muestras de tejidos normales y tumorales equivalentes de siete pacientes con cáncer de pecho (Fig. 3). La expresión de BCMP aumentó en seis de las siete muestras de tumores, con relación a sus tejidos normales equivalentes, mostrando cuatro de las muestras una elevación de la expresión de más de 4 veces. Estas observaciones sugieren que esta proteína tiene potencial como objetivo terapéutico.
Se mostró que la expresión de hAG-2 era coincidente con la expresión del ER, y los niveles de mARN de hAG-2 en células MCF7 aumentó cuando se trataron las células con estradiol (Thompson y Weigel, anterior). De acuerdo con estos datos, el mARN de BCMP 7 se detectó en células T-47D positivas del ER, pero no se observó expresión en los linajes celulares negativos del ER CAL51, BT20 y MDA-MB-488 (Figura 2).
Localización cromosómica
Una exploración Blast de una base de datos genómicos humanos con la secuencia de cADN de BCMP 7 (Fig. 1) encontró que el ingreso de Genbank AC073333 contiene el gen de BCMP 7 completo. El AC073333 contiene secuencias del cromosoma 7 humano. El gen de BCMP 7 se ha localizado adicionalmente a chr7p21.3 (Petek, E., Windpassinger, C., Egger, H., Kroisel, P.M. & Wagner, K. Localization of the human anterior gradient-2 gene (AGR2) to chromosome 7p21.3 by radiation hybrid mapping and fluorescence in situ hybridisation. Cytogenet. Cell Genet. 89, 141-142 (2000)).
<110> Oxford Glycosciences (UK) Ltd.
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Boyd, Robert Simon 
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Stamps, Alasdair Craig 
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Terrett, Jonathan Alexander 
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Tyson, Kell Louise 
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<120> BCMP7
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<130> NJL/P32141WO
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<140> PCT/GB01/00734
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<141> 2001-02-21
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<150> GB 0004576.5
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<151> 2000-02-25
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<160> 8
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<170> PatentIn versión 3.0
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<210> 1
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 1
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\sa{Ile Met Phe Val Asp Pro Ser Leu Thr Val Arg}
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<210> 2
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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\sa{His Leu Ser Pro Asp Gly Gln Tyr Val Pro Arg}
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<210> 3
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221>
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<223> cebador
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<400> 3
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catctcgagc agagttgcca tggagaaaat 
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30 
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<210> 4
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221>
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<223> cebador
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskip
catggatcct ttctttacaa ttcagtcttc agc 
\hfill
33 
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<210> 5
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<213> Secuencia artificial
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\hskip-.1em\dddseqskip
agataccaca gtcaaacctg 
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20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221>
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<233> cebador
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gcactcatcc aagtgatgaa 
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<210> 7
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<211> 543
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<220>
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<221> CDS
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<222> (11)..(535)
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<400> 7
1
2 
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<210> 8
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<211> 175
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 8
3
4

Claims (14)

1. Un método para examinar y/o diagnosticar cáncer de pecho en un sujeto, cuyo método comprende la etapa de detectar y/o cuantificar la cantidad de un polipéptido en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto, en el que el polipéptido:
a)
comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 8);
b)
es un derivado que tiene una o más sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos, con relación a la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO: 8); o
c)
es un fragmento de un polipéptido como se ha definido en a) o b) anteriores, que tiene una longitud de al menos diez aminoácidos.
2. El método según la reivindicación 1ª, en el que el polipéptido:
a)
consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 8); o
b)
se un derivado que tiene una identidad de secuencias de al menos el 90% de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 8).
3. El uso de al menos un polipéptido como se ha definido en las reivindicaciones 1ª o 2ª en la preparación de un medicamento de uso en la profilaxis y/o el tratamiento de cáncer de pecho.
4. El uso según la reivindicación 3ª, en el que el medicamento es una vacuna.
5. Un método para examinar y/o diagnosticar cáncer de pecho en un sujeto, cuyo método comprende la etapa de detectar y/o cuantificar la cantidad de un ácido nucleico en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto, en el que la molécula de ácido nucleico:
a)
comprende o consiste en la secuencia de ADN mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 7) o su equivalente de ARN;
b)
tiene una secuencia que es complementaria de las secuencias de a);
c)
tiene una secuencia que codifica el mismo polipéptido que las secuencias de a) o b);
d)
tiene una secuencia que muestra identidad sustancial con cualquiera de las de a), b) y c); o
e)
una secuencia que codifica un derivado o fragmento de una molécula de aminoácido mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 8).
6. El uso de al menos un ácido nucleico como se define en la reivindicación 5ª, en la preparación de un medicamento de uso en la profilaxis y/o el tratamiento de cáncer de pecho.
7. El uso de un anticuerpo que se une a al menos un polipéptido según las reivindicaciones 1ª o 2ª, para examen y/o diagnosis de cáncer de pecho en un sujeto según la reivindicación 1ª.
8. El uso de un anticuerpo que se une a al menos un polipéptido como se ha definido en las reivindicaciones 1ª o 2ª, en la preparación de un medicamento de uso en la profilaxis y/o el tratamiento de cáncer de pecho.
9. El uso según las reivindicaciones 7ª u 8ª, en el que el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido como se ha definido en las reivindicaciones 1ª o 2ª.
10. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 7ª a 9ª, en el que el anticuerpo es monoclonal.
11. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8ª a 10ª, en el que el anticuerpo está conjugado a un resto terapéutico.
12. El uso según la reivindicación 11ª, en el que el resto terapéutico se selecciona entre un segundo anticuerpo o fragmento o derivado del mismo, un agente citotóxico o una citoquina.
13. Un método para examinar compuestos anti-cáncer de pecho que modulan la expresión de un polipéptido como se ha definido en las reivindicaciones 1ª o 2ª, que comprende la etapa de determinar la presencia o ausencia y/o cuantificar al menos un polipéptido como se ha definido en las reivindicaciones 1ª o 2ª o al menos un anticuerpo como se ha definido en las reivindicaciones 8ª o 9ª en una muestra biológica.
14. Un método para comprobar/valorar un tratamiento de cáncer de pecho en un paciente, que comprende la etapa de determinar la presencia o ausencia y/o cuantificar al menos un polipéptido como se ha definido en las reivindicaciones 1ª o 2ª o al menos un anticuerpo como se ha definido en las reivindicaciones 8ª o 9ª en una muestra biológica obtenida de dicho paciente.
15ª. Un método para identificar células de cáncer de pecho metastáticas en una muestra biológica obtenida de un sujeto, que comprende la etapa de determinar la presencia o ausencia y/o cuantificar al menos un polipéptido como se ha definido en las reivindicaciones 1ª o 2ª o al menos un anticuerpo como se ha definido en las reivindicaciones 8ª o 9ª.
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