ES2249483T3 - Agonistas selectivos del receptor de glucocorticoides. - Google Patents
Agonistas selectivos del receptor de glucocorticoides.Info
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Abstract
Un compuesto que tiene la estructura de la Fórmula I o la Fórmula II como se define más abajo, o un derivado farmacéutico aceptable suyo para uso en medicina. Fórmula I En la que R4, R5 = alquilo C(1-4).
Description
Agonistas selectivos del receptor de
glucocorticoides.
Los Glucocorticoides (GCs) han sido usados
terapéuticamente por muchos años para tratar inflamación como son
los inmunosupresores y en el tratamiento de desordenes
linfoproliferativos y ciertos otros tumores
malignos^{1-2}. Estos compuestos son los más
conocidos, eficaces y potentes agentes antiinflamatorios. El uso de
GCs ha sido limitado por sus devastadores efectos secundarios
múltiples. Esta invención trata de las mejoras para GCs de tal forma
que los efectos terapéuticos del agonista seleccionado se mantengan
pero que sean reducidos significativamente los potenciales que
provoca efectos secundarios perjudiciales en estos compuestos.
GCs primero fueron introducidos en la medicina en
el 1950's. El entusiasmo temprano para estos fármacos, debido al
éxito en controlar la inflamación en una extensión amplia de
enfermedades, fue pronto entibiado por la comprensión de que estos
compuestos causan en un amplio rango efectos secundarios que son a
menudo serios, y a menudo irreversible y en muchos casos más serios
que el estado inflamatorio bajo el tratamiento.
Las enfermedades en las que GCs ha demostrado
tener un efecto antiinflamatorio pronunciado incluye la artritis
inflamatoria tal como la artritis rematoidea, espondilitis
anquilosante y artropatía psoriásica, otras enfermedades reumatoides
tales como lupus eritematoso sistémico (LES)., esclerodermia.,
vasculitides incluyendo arteritis de la temporal y poliarteritis
nodosa, enfermedad inflamatoria intestinal como la enfermedad de
Crohns y la colitis ulcerativa, enfermedades de pulmón como el asma
y enfermedad obstructiva de las vías respiratorias, así como muchas
otras afecciones como polimialgia reumática. GCs también ha sido
usado exhaustivamente por sus propiedades inmunosupresoras en la
prevención y el tratamiento del rechazo de trasplante. Finalmente
GCs ha sido usado por sus efectos antitumoral en un número de
procesos malignos. La actividad de GCs en el tratamiento
linfoproliferativo y otros procesos malignos es atribuible a la
capacidad de GCs de inducir apoptosis^{3; \ 4}.
El uso de GCs, particularmente en enfermedades
inflamatorias, ha sido limitado por sus efectos secundarios que son
discutidos más abajo. Varias aproximaciones han sido tomadas para
superar los efectos secundarios de estos fármacos. El más frecuente
adoptado ha sido aplicar esteroide a nivel local en el sitio de la
inflamación. Los órganos objetivo donde este acercamiento ha sido
adoptado incluye el pulmón, con la inhalación oral para el
tratamiento del asma y en las enfermedades obstructiva de las vías
respiratorias; en la nariz, con la colocación local para el
tratamiento de rinitis alérgica; en el ojo con la colocación local
para el tratamiento de varias afecciones inflamatorias serias de los
ojos como uveítis; en articulaciones grandes con la inyección
intra-articular de esteroides se trata la
inflamación; y sobre la piel para el tratamiento del eccema, la
psoriasis y un rango de otras afecciones de la piel. La entrega
local ha permitido la reducción de dosis con una reducción
consiguiente en los efectos secundarios sistémicos. Los efectos
secundarios sistémicos han sido reducidos adicionalmente por la
introducción en estos recientes años, de supuestos "Esteroides
blandos" como fluticasona para la aplicación tópica. Estos
esteroides blandos se inactivan rápidamente por el metabolismo
siguiendo la absorción dentro de la circulación sistémica luego los
efectos secundarios se minimizan. La aplicación local de esteroides
blandos, sin embargo, todavía esta asociada con los efectos
secundarios locales importantes como que se adelgaza la piel. Los
esteroides blandos no son de uso cuando la administración sistémica
del fármaco se requiere en enfermedades tales como arteritis
temporal o polimialgia reumática.
Los efectos secundarios de los esteroides
incluyen lo siguiente:
La osteoporosis; el deterioro de crecimiento;
osteonecrosis avascular; miopatía cercana; intolerancia a la glucosa
(IGT); la retención de fluido inestable o edema; la hipertensión;
hipokalaemia; cara cushingoide el aumento de peso; obesidad; la
euforia; la psicosis; el insomnio; presión intracraneal elevada; el
empeoramiento de la epilepsia; el deterioro de memoria, la atrofia
hipocampica, ulceración péptidíca; pancreatitis; supresión del eje
de la glándula pituitaria de hipotalámico; presión intraocular
elevada; el glaucoma; papiloedema; adelgazamiento de la piel;
resistencia reducida a la infección; deteriorada la curación de la
herida.
A pesar de este catálogo de efectos secundarios
estos fármacos todavía son usados ampliamente porque sus efectos
antiinflamatorios exceden los de cualquiera de otra clase de
fármacos; y continúan teniendo un papel principal en el tratamiento
y prevención del rechazo de trasplante y el tratamiento de los
trastornos linfoproliferativo de ciertos otros tumores malignos.
Existe una necesidad para esteroides nuevos con la misma eficacia
que los fármacos existentes, pero con un potencial de efecto
secundario reducido.
GCs actúan vía receptores de glucocorticoide
específicos (GR), miembros de la superfamilia de receptores
nucleares. La unión de hormona promociona receptores de
dimerisación, la unión de ADN, y activación transcripcional. Este
mecanismo de la acción de GC está bien definido en vitro, y
es crítica para la regulación del eje de la glándula pituitaria
hipotalámica-suprarrenal y la gluconeogénesis en
vivo^{5-8}. Receptores de unión de hormona
también pueden influir en la transcripción de un gen en una manera
independiente, dimerisación por interferencia con la actividad de
los factores de transcripción, tales como AP-1 y
NFkB, el que está críticamente involucrado en la reacción
inflamatoria.
La inducción de apoptosis en timocitos y otro
tipo de célula es un efecto conocido, el efecto de GCs. El
mecanismo de inducción de GCs detrás de apoptosis no está claro,
aunque comúnmente se cree que la activación transcripcional para el
ejemplo de la activación vía^{9} de la caspasa. Esto permanece
polémico^{10-13} y una conclusión inesperada que
hicimos, resultado del primer aspecto de esta invención, es el
encontrar las actividades en relación con como pudiera ser la
diferenciada capacidad de GCs de provocar la activación y su
capacidad de provocar la represión y su capacidad de inducir
apoptosis. Los compuestos preferidos, como se habla más abajo, son
aquellos que conservan la capacidad de reprimir la expresión del gen
y la de inducir la apoptosis pero pierden la capacidad de activar
la expresión del gen.
La inducción de apoptosis en linfocitos T podría
ser importante para la actividad inmunosupresora de GCs. Además este
mismo mecanismo podría ser importante en los efectos
antiinflamatorios de GCs con la supresión de las células T de
memoria responsable de la inducción de respuesta para un
antigeno^{14}. Finalmente, hay pruebas de que en ciertas
enfermedades, los procesos inflamatorios por lo menos en parte
pueden depender de la falla de apoptosis en células inflamatorias.
Esto ha sido demostrado en el caso de los neutrofilos en la
enfermedad^{15} inflamatoria intestinal.
Después de la unión del ligando, la migración de
GR desde el citoplasma de la célula al núcleo, y se unen a elementos
de respuesta para glucocorticoide en la región reguladora de los
genes objetivos. El GR activado luego engancha cofactores,
incluyendo el receptor de glucocorticoide interactuando con la
proteína 1 (GRIP-1) y el coactivador 1 (SRC1) de
receptores de esteroides. Estas proteínas de accesorios se unen al
receptor y se enlazan a GR con la maquinaria de transcripción
general^{16-22}.
Los efectos de Glucocorticoide sobre la
transcripción pueden ser mediados por ambos, la unión directa de GR
activado al ADN como objetivo, homodimerisación y reclutamiento de
coactivadores pero también por interferencia de GR con otra función
de factor de transcripción, incluyendo AP-1, NFkB y
NUR77^{23-31}. Estos dos modos de la actividad del
receptor son disociables, que es un efecto negativo sobre la
actividad de NFkB conservada pero con la pérdida de transactivación.
Aparece que este segundo mecanismo es en gran parte responsable de
mediar la actividad antiinflamatoria deseable terapéuticamente del
GR^{28; \ 31-33}. Resulta interesante, que el
IC50 para la inhibición de AP-1 o NFkB (0,04 nM) es
más bajo que el EC50 para la activación de genes objetivos (5
nM)^{8-34}, aún a pesar suyo, altas dosis
de GCs son requeridas para tratar a pacientes con enfermedades
inflamatorias frecuentes. Aparece que citoquinas expresadas en el
sitio de la inflamación pueden inducir la respectiva resistencia de
glucocorticoide, posiblemente activando AP-1 ó
NFkB^{19, 23; \ 31; \ 34-37}. Esto es de
importancia como la señal de citoquinas
pro-inflamatoria por la activación de NFkB, y la
mayoría de las acciones antiinflamatorias de GCs se piensa que son
mediadas por oposición a las acciones de NFkB.
Las mutaciones específicas en la molécula de GR
pueden elevar receptores disociados^{25,25}, estas moléculas
relativamente inactivas con la transactivación es comparada con la
transpresion, y un número de ligandos sintéticos tienen actividad
diferencial sobre estas dos vías de GR, por ejemplo RU24858^{38}.
Sin embargo, ninguno de los ligandos descritos o moléculas tienen
una disociación suficientemente amplia de estas dos acciones de GR
podrían ser de uso terapéutico. Además RU24858 no induce apoptosis
y carece de una de las actividades más importantes de GCs, tan bien
como activar el receptor de progesterona, teniendo una carencia no
deseada de la acción de especificidad (datos no publicados).
Sería de valor inmenso identificar la media de la
acción objetivo específicamente del glucocorticoide para inhibir el
NFkB, AP-1 mantiene la capacidad de inducir
apoptosis, y al mismo tiempo reducir grandemente la actividad
transactivacional.
Estudios previos han tratado de diferenciar los
efectos de esteroides conocidos y nuevos en relación con la
capacidad de provocar la transactivación y transrepresión^{39,
40}. En la actualidad no han sido desarrollados nuevos compuestos.
Se describe una estrategia en el que somos capaces de identificar
compuestos con una actividad terapéutica útil.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente
invención se proporciona un método para tratar un estado
inflamatorio, tratar los estados hematológicos y otros tumores
malignos, provocando la inmunosupresión, o previniendo o tratando el
rechazo de trasplantes en el hombre u otros animales, lo que
comprende administrar a un paciente un compuesto que tiene la
estructura de la Fórmula I ó la Fórmula II como se define más abajo,
o un derivado farmacéutico aceptable semejante o profármaco para
este uso.
En el que: R = NH_{2}, NHR^{1}, NHOR^{2},
NHNHR^{2-}, NHCOR^{2},
y R^{1} = alquilo
C_{(1-4)}, cicloalquilo
C_{(3-6)}
En la que
n = 1-3,
R^{2} = metilo, etilo,
R^{3} = alquilo, cicloalquilo, alquilo
sustituido, cicloalquilo sustituido, arilo, heteroarilo, arilo
sustituido, o heteroarilo sustituido;
Fórmula
II
En la que R^{4}, R^{5} = alquilo
C_{(1-4)}.
Los grupos alquilos de cualquiera de R^{1} a
R^{5} podrían ser de cadenas lineales o ramificadas.
De acuerdo con este método los compuestos han
sido encontrado que inducen apoptosis en células
pro-inflamatorias.
De acuerdo con el segundo aspecto de la presente
invención se suministra un compuesto de acuerdo con la Fórmula III o
de la Fórmula IV definida más abajo:
Fórmula
III
En la que R^{6} y R^{7} son cualquiera de H,
CH_{3}CO, CH_{3}CH_{2}CO, CH_{3}CH_{2}CH_{2}CO que
proporciona que R^{6} y R^{7} no son ambas H, OR
\newpage
Fórmula
IV
En la que R^{8} y R^{9} son cualquiera de H,
CH_{3}CO, CH_{3}CH_{2}CO ó CH_{3}CH_{2}CH_{2}CO.
Los compuestos que tienen la estructura de la
Fórmula III o IV son útiles como profármacos. Por el término
"Profármaco" se representa un compuesto que pasa por una
conversión química para hacerse un fármaco activo cuando se
metaboliza por el cuerpo. Esto resulta normalmente con un aumento
de la eficacia del fármaco a través de un aumento de la absorción en
el cuerpo, una prolongación de la duración de la acción en el cuerpo
o a través de una reducción de ciertos efectos secundarios.
De acuerdo con el tercer aspecto de la presente
invención se proporciona un compuesto de acuerdo con la Fórmula I o
II como se define arriba, o un derivado farmacéutico aceptable suyo
o profármaco para este uso, o un compuesto de acuerdo con la Fórmula
III o IV, para usar como una medicina. Estos compuestos son
particularmente eficaces en el tratamiento de una afección
inflamatoria, para tratamiento hematológico y otros procesos
malignos, causando inmunosupresión o la prevención o tratamiento del
rechazo de trasplantes.
De acuerdo con el cuarto aspecto de la presente
invención se proporciona el uso de un compuesto de acuerdo con la
Fórmula I o II como se define arriba, o un derivado farmacéutico
aceptable suyo o profármaco para este uso, o un compuesto de acuerdo
con la Fórmula III o IV, en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de una afección inflamatoria, para tratar las
condiciones hematológicos y otros condiciones malignas, que provocan
inmunosupresión, prevención o tratamiento al rechazo de
trasplantes.
De acuerdo con el quinto aspecto de la presente
invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende
un compuesto de acuerdo con la Fórmula I o II como se definió
arriba, o un derivado farmacéutico aceptable cuyo profármaco en este
uso, o un compuesto de acuerdo con la Fórmula III o IV, y un
portador farmacéutico aceptable. Tal composición tiene un uso
especial en el tratamiento de una afección inflamatoria, para tratar
afecciones hematológicas y otras afecciones malignas, causando
inmunosupresión o la prevención o el tratamiento al rechazo de
trasplantes. El sexto aspecto de la presente invención es dirigido
al uso de esta composición en la fabricación de un medicamento para
el tratamiento de una afección inflamatoria, para tratar afección
hematológica y otras afecciones malignas, que provocan
inmunosupresión o previenen o tratamiento al rechazo de
trasplantes.
De acuerdo con un séptimo aspecto de la presente
invención se proporciona un método de inducir apoptosis en células
objetivo, que comprende administrar a las célula objetivo o a las
inmediaciones, en las que las células objetivo están ubicadas en un
compuesto de acuerdo con la Fórmula I o II como se define arriba o
un derivado farmacéutico aceptable suyo o profármaco para este uso,
o un compuesto de acuerdo con la Fórmula III o IV. El octavo
aspecto de la presente invención es dirigido al uso de compuestos de
acuerdo con la Fórmula I o II como se define arriba o un derivado
farmacéutico aceptable suyo o profármaco para este uso, o un
compuesto de acuerdo con la Fórmula III o IV, en la fabricación de
un medicamento para inducir apoptosis en células objetivo. La célula
objetivo son en general células pro-inflamatorias o
células malignas. Para este uso, este aspecto de la invención es
útil para tratar la inflamación y para tratar los hematológicos y
otros procesos malignos.
Los compuestos preferidos de la Fórmula I usado
de acuerdo con la presente invención incluyen ésos en la que R es
NHR^{1} y R^{1} es metilo, etilo, propilo, ciclopropilo, butilo,
ciclobutilo o
y n = 1, Los compuestos preferidos
adicionalmente son ésos, en los que el compuesto tiene la estructura
de la Fórmula I en la
que
y R^{3} es alquilo o alquilo
sustituido de cadena recta o ramificada, preferentemente alquilo o
alquilo sustituido C_{(1-6)}, más preferentemente
propilo o hexilo, o en la que R^{3} es un bencilo o un grupo
bencilo sustituido, preferentemente halobencilo, más preferentemente
fluorobencilo, o R^{3} es el grupo alquilo
sustituido
En la que n = 1-6,
preferentemente n = 1, o en la que R^{3} es un grupo cicloalquilo
C_{(3-6)} o cicloalquilo sustituido.
Los compuestos preferidos que tienen una
estructura de acuerdo con la Fórmula II incluyen ésos, en los que
R^{4} y/o de R^{5} son metilo y/o etilo.
Los ejemplos de los compuestos particularmente
preferidos usados de acuerdo con la presente invención, además de
los compuestos nuevos de la Fórmula III y IV, son designados como
"compuesto A" "compuesto G" y "compuesto H"
"Compuesto I" "compuesto K" "compuesto M"
"compuesto N" "compuesto S" "compuesto T",
"Compuesto 2", "Compuesto 3", "Compuesto 4",
"Compuesto 5" y "Compuesto 7", las estructuras de los
cuales son mostradas en Fig. 2A y 2B de los dibujos acompañantes. El
compuesto más preferente usado de acuerdo con la presente invención
es el compuesto G en vista de su potencia y selectividad superior
para transrepresión sobre transactivación.
Las composiciones de acuerdo con la invención
pueden tomar un número diferentes de formas que dependen, en
particular de la manera en la que está la composición. Para este
uso, por ejemplo, la composición puede estar en forma de un polvo,
pastilla, cápsula, líquido, ungüento, nata, gel, hidrogel, aerosol,
spray, micelas, liposomas o cualquier otra forma apropiada que
pueden ser administrados a una persona o animal. Será apreciado de
que el vehículo de la composición de la invención debe ser uno que
sea tolerado bien por el sujeto al que es dado y permita la entrega
de los compuestos al tejido designado. Los compuestos usados de
acuerdo a esta invención podrán ser administrados por cualquiera
ruta que incluya pero no estará limitada a la inhalación oral, la
colocación local dentro de la nariz o del ojo, la inyección local
dentro de las articulaciones o los músculos, de forma oral en forma
de cápsulas, pastillas, líquidos o suspensiones, por inyección en
una vena, músculo o bajo la piel y por vía tópica a la piel. El
vehículo consistirá de 0,1% a 99,9%, preferentemente 90% a 99,9% en
peso de la composición generalmente y podrá, en la ausencia de otros
adjuntos, constituir el balance de la composición.
Las siguientes Formulaciones son dadas solamente
por vía de ejemplos. Un experto en la técnica podrá formular
cualquiera de los compuestos de acuerdo con la presente invención
cuando comparten las propiedades de la formulación con esteroides en
uso común.
| Tabletas de 500 microgramos del compuesto G | |
| Compuesto G | 0,5% p/p |
| Lactosa Ph Eur | 89,5% p/p |
| Povidona (K25) Ph Eur | 5,0% p/p |
| Dióxido de Siliccio Coloidal Ph Eur | 1,0% p/p |
| Agua Purificada Ph Eur | 20% p/p* |
| Estearato de Magnesio Ph Eur | 1,0% p/p |
| Glicolato sódico de almidón Ph Eur | 3,0% p/p |
| *El agua se evapora durante el proceso de secado y no aparece en la forma terminada |
\vskip1.000000\baselineskip
| B. Tabletas de 2 mg del Compuesto G | |
| Compuesto G | 2,0% p/p |
| Lactosa Ph Eur | 88% p/p |
| Povidona (K25) Ph Eur | 5,0% p/p |
| Dióxido de Siliccio Coloidal Ph Eur | 1,0% p/p |
| Agua Purificada Ph Eur | 20% p/p* |
| Estearato de Magnesio Ph Eur | 1,0% p/p |
| Glicolato sódico de almidón Eur | 3,0% p/p |
| *El agua se evapora durante el proceso de secado y no aparece en la forma terminada. |
| C. Inyección del fosfato sódico del Compuesto G a 4 mg/ml | |
| Fosfato sódico del Compuesto G | 0,4% w/v |
| Citrato sódico Ph Eur | 1,0% w/v |
| Bisulfito sódico Ph Eur | 0,2% w/v |
| Hidróxido sódico | QS* |
| Agua para inyección Ph Eur To | 100% v/v |
| *El hidróxido de sodio se usa para ajustar el pH a 7.5-8.5 |
A fin de que la presente invención pueda ser
fácilmente comprendida, los siguientes ejemplos son dados solamente
por vía de ilustración.
El trabajo descrito en la presente solicitud
resultando en esta invención surgió de nuestros estudios del
GR^{8}, Los resultados de este trabajo son incluidos en esta
descripción.
Usamos la estructura cristalina de las (PR) de
receptor de progesterona humana como una plantilla para hacer un
modelo del receptor de glucocorticoide humano porque las dos
moléculas tienen más de 50% de identidad en la región de unión de
ligandos, y una fuerte semejanza de secuencia. Las 12 hélices
observadas en el receptor de estrógeno (ER), las PR, y el receptor
de ácido retinóico (RAR) son preservadas en el GR humano. Además el
GR humano comparte a los aminoácidos fuertemente que hacen la
signatura^{41} del receptor nuclear. En común con las hélices de
PR 2 y 3 forman una hélice contigua como lo hacen las hélices 10 y
11,
La estructura terciaria del Dominio Ligando
enlazante de GR (LBD) contiene 251 aminoácidos
(Q527-K777) y se pronostica usando
SWISS-MODEL. El resultado incluye un alineamiento
estructural contra las plantillas ordenadas en 3D. Se usa el dímero
PR LBD 1,8 \ring{A} (1A28) como una plantilla y la identidad entre
estos dos LBDs es > 50%.
La verificación de la calidad de esta estructura
fue efectuada usando programa PROCHECK, que genera un esquema de
Ramachandran. Aproximadamente el 99% de los ángulos
\Phi-\phi en este modelo fueron colocados dentro
del más favorecido y también dentro de las regiones permitidas del
espacio conformacional. El análisis de energía de este modelo se
aplica en el programa^{42} Protein Structure Analysis
(Prosa). Este pronostica que cada residuo de energía de interacción
en la estructura fue negativo. La estructura 3D prevista para el LBD
de GR humano puede estar súper impuesto por encima de PR con una
desviación de la raíz cuadrada de 0,38 \ring{A} para (corridas)
para 250 átomos C\alpha.
El dominio ligando enlazante de GR humano (hGR)
es delineado por las hélices 5, 7,11 y 12, la vuelta \beta y los
lazos L6-7 y L11-12. La cavidad del
ligando enlazante se pronostica para ser linealizado por 18
aminoácidos. De éstos 15 se pronostica contribuye a colaborar en el
ambiente hidrofóbico de la cavidad: Met 560, Leu 563, Leu 566, Gly
567, Trp 600, Met 601, Met 604, A1a 605, Leu 608, Phe 623, Met 646,
Leu732, Tyr 735, Thr 739, Phe 749. Hay tres residuos polares, dos
a un final del Gln 570 de cavidad y Arg 611 y los demás en el Cys
736 del extremo de opuesto.
La estructura de la Dexametasona fue obtenida
desde Cambridge Structural Database (CSD). Predecimos que la
cavidad del ligando enlazante es una hendidura longitudinal con dos
residuos polares a un extremo y un residuo polar en el extremo
opuesto. No podemos determinar la orientación del ligando con
certeza absoluta dentro del cavidad, pero varias líneas de
evidencias soportan la orientación del anillo A del esteroide al
extremo de Arg 611 de la cavidad. Los ligandos para ambos el ER y el
PR son orientados en esta manera, y ambos cortisol como aldosterona
dentro del receptor de mineral corticoide son previstos para estar
en esta orientación, sobre la base del modelo y los estudios de
mutagénesis. La interacción de ligando con el receptor fue detectada
usando el programa de Ligplot, que también es usado para
graficar la interacción. Sobre la base de este análisis predecimos
que el dominio ligando enlazante del hGR tiene tres capas
antiparalelas, estructura helicoidal 12 V, que es muy homologo al de
PR. El ligando es enlazado por tres enlaces de hidrógeno; Arg 611
y Gln 570 que interactúan con el grupo de cetona sobre C3 del anillo
A del esteroide, y al grupo de cetona en la Cys 736 sobre el C20 del
anillo D. Uno adicional 15 aminoácidos se encuentra contribuyendo a
las interacciones hidrofóbicas con el ligando Arg 611, Gln 570 y Cys
736 son residuos conservados cuya importancia para la unión de
ligando ha sido verificada por estudios en mutantes naturales o por
ingeniería. El anillo aromático de Tyr 735 parecía constituir una
interacción hidrofóbica con el ligando. La distancia del anillo
aromático hasta el C22 sustituido del anillo D de esteroide es
calculado y es 2,98 \ring{A}, y al anillo de D 3,98 \ring{A}.
Sin embargo, el grupo de hidroxilo de la tirosina 735 fue orientado
fuera desde la cavidad del ligando enlazante.
Como Tyr 735 fue pronosticado para tener
interacción hidrofóbica con el anillo D de la Dexametasona, en el
que fue importante identificar los cambios en la afinidad del
ligando enlazante provocada por las mutaciones en la posición 735.
La mutagénesis dirigida por sitio para la fenilalanina (Tyr735Phe)
no resulta en ninguna alteración en la afinidad del ligando (4,3 nM
comparado con 4,6 nM la tipo salvaje), de acuerdo con la hipótesis
de que el anillo de benceno es suficiente para generar una
superficie hidrofóbica en la interacción del ligando. El cambio para
valina (Tyr735Val) resultó en la afinidad enlazante más baja
comparada con la de la naturaleza del tipo salvaje, pero solamente a
un grado menor (6 nM). El cambio para serina (Tyr735Ser), sin
embargo, resultó en una reducción dos veces en la afinidad del
ligando enlazante (10.4 nM).
Todos los receptores de mutante fueron expresados
en células COS7, y las mutaciones no modificaron los números de
receptores por células.
Todas las tres moléculas de GR mutante son
capaces de transactivar al promotor de MMTV. En respuesta a la
Dexametasona Tyr735Phe que tiene un EC50 similar al tipo salvaje
(8.6 nM comparado con 6 nM) y Tyr735Val un EC50 más bajo 14.8 nM.
Sin embargo, el potencial de transactivación máximo de ambas
moléculas de mutante GR fue menor que el tipo salvaje.
El EC50 de Tyr735Ser para transactivación fue
incrementado hasta 118 nM, y un cálculo exacto del efecto máximo no
fue posible. Está claro que este efecto es desproporcionado al
duplicar Kd, sugiriendo que la disrupción de la unión de ligando es
insuficiente para explicar el cambio observado en el receptor de
transactivación.
Adicionalmente, la hidrocortisona de ligando
fisiológico (100 nM) indujo la inducción de MMTV en 18 veces vía GR
tipo salvaje, 11 veces con el Tyr735Phe, 10.6 veces con la Tyr735Val
y dejó de inducir al reportado vía el Tyr735Ser. Para este uso, los
receptores mutados tienen el mismo orden de rango de la actividad
con ambos ligandos de agonista.
Transrepresión por GR activado generalmente tiene
un EC50 más bajo que la transactivación, y coloca menores requisitos
severos sobre el receptor. Para este uso han sido identificado
ligandos que promocionan la transrepresión en ausencia de
transactivación, pero no viceversa. Revisamos la capacidad de las
moléculas GR mutante de inhibir a NFkB p65 mediando la
transactivación a través de un elemento de respuesta de NFkB
vinculado con luciferasa. El reportado fue dirigido por
co-transfección de un vector de expresión
p65, El receptor tipo salvaje consiguió supresión importante en
Dexametasona 0,1 nM y la supresión máxima a 1 nM, como Tyr735Phe y
Tyr735Val. Tyr735Ser tenía un menor, pero consistente aumento en
IC50 para este efecto, sin supresión en Dexametasona 0,1 nM. Estos
datos son compatibles con el Kd observado para la unión a
Dexametasona, y muestra la curva dosis-respuesta
para transrepresión estando desplazada a la izquierda en comparación
con la transactivación. En contraste con los datos de
transactivación Tyr735Phe y Tyr735Val funcionaron de forma semejante
a GR tipo salvaje, mostrando que la sustitución de Tyr735 en el
deterioro selecto de la transactivación, la falta de cambios
importantes en la afinidad de unión del ligando y la transrepresión.
Tyr735Ser tiene un IC50 ligeramente superior para la transrepresión:
comparada a las otras tres moléculas de GR revisadas, a compatible
con la observación que es su afinidad es reducida por Dex. Sin
embargo, a 100 nM de Dex, la Tyr735Ser ha conseguido la máxima
supresión en la que la dosis observada con el GR tipo salvaje, en el
contraste sorprendente de los resultados vistos sobre
transactivación.
Por consiguiente decidimos sintetizar una serie
de: compuestos con un rango de sustituyentes sobre el anillo D, como
en nuestro trabajo previo se indicó la interacción entre el anillo D
del esteroide y la tirosina 735 es esencial para la transactivación.
También sintetizamos un número de compuesto con las modificaciones
en/o alrededor de la posición C17, los compuestos son mostrado en
2. Estos compuestos y el glucocorticoide agonista no selectivo
controlan la molécula de Dexametasona como se muestra en Fig. 1
donde fue evaluada para la transrepresión, transactivación y
actividad apoptosis tal como sigue:
La línea celular COS7 (ECACC:87021302) se obtiene
desde células de riñón transformadas de monos verdes africanos
(Cercopithecus aethiops). Esta línea celular deficiente en GR
endógeno es por consiguiente usada extensamente como herramienta
para el estudio de la función de GR por expresión artificial
controlada vía transfección.
La línea celular A549 (ECACC:86012804) se obtiene
de célula epitelial de pulmón humano, desde un carcinoma. Esta línea
celular contiene GR endógeno funcional y se estimula por Factor de
Necrosis Tumoral (TNF) para producir IL-8.
La línea celular de HEP G2 (ECACC: 85011430) se
obtiene de células epitelial de hígado humano desde un carcinoma
hepatocelular diferenciado. Esta línea celular tiene GR endógeno
funcional y se estimula por activación de GR para inducir amino
transferasa de tirosina.
La línea celular de CEM-C7A es un
clon de esteroide sensible de la línea celular
CCRF-CEM (ECACC 85112105). Esta es la línea celular
de linfoblastoide T con GR endógeno funcional.
Células COS 7 y células A549 son cultivadas en
DMEM con Glutamax (Gibco BRL, Paisley, R.U.), y 10% suero
fetal vacuno (FCS). HEP G2 se cultiva en DMEM con Glutamax
(Gibco BRL) 1% aminoácido esencial (Gibco BRL) y 10%
FCS. Células de CEM-C7A son cultivadas, en Optimem
(Gibco BRL) con 5% FCS.
pcDNA3-GR
AH3-Luc
NRE-Luc
P65
Todas las transfecciones fueron llevadas a cabo
usando Lipofectamina plus (Gibco BRL), de acuerdo a las
instrucciones de manufactura, previamente descritas. I. En resumen,
todas las células son inoculadas a 5x10^{5} por 10 cm en placa de
cultivo de tejido 18 horas antes de la transfección, los próximos
días los plásmidos relevantes se mezclan con medio libre de suero y
reactivo "Plus"(Gibco BRL) y se incuban por
15 minutos, reactivo lipofectamina se adiciona a la mezcla y se
incuba por 15 minutos adicionales, esta mezcla fue adicionada a las
células en medio libre de suero en placa de cultivo de tejido de 10
cm. y por 3 horas, las células son luego tripsinisadas dividas en
placas de 24 huecos, las células salen para recobrar durante la
noche y fue tratada con esteroides por 16 horas antes de cosechar.
Todos los experimentos son llevados a cabo desde una transfección
en triplicado y en ocasiones separadas con resultados similares.
El gen de luciferasa cataliza la producción de la
luz del sustrato luciferina. Cuando los plásmidos que contienen
este gen son transfectados dentro de la línea celular y la actividad
del gen puede ser ensayada por la intensidad de la luminisencia. El
ensayo de luciferasa produce luminiscencia a través de una oxidación
ATP-dependiente de luciferina, que la cantidad de la
luz producida puede ser medida por un luminómetro y es una medida de
la actividad de gen (Davis, 1996). La intensidad de la luz
fue medida en un Luminometro (LB9501, Berthold). La
intensidad de la luz debe ser proporcional a la concentración de
luciferasa en el rango de 10^{-16}M (10 pg/L) hasta 10^{-8} M
(1 mg/L).
Medir la luminiscencia de la células tratadas 150
\mul buffer de lisis reportado 1X (RLB: 25 mM de
Tris-fosfato pH = 7,8; 10 mM MgCl_{2}, glicerina
15%; Triton 1%, 1 mM EDTA) se adiciona a las placas de 24 pocillos
para destruir las células e incubar a la temperatura ambiente por
30 minutos mientras se agita. Luego 100 \mul de fragmentos de
célula a temperatura ambiente son mezclados con 100 \mul de
reactivo de Ensayo Luciferasa (LAR 1 mM ATP 0,3 mM
D-Luciferina, 66% RLB). Esta reacción es mezclada en
un luminómetro (LB 9501, Berthold) y la luz producida fue
medida por un periodo de 5 segundos.
En este ensayo el GR fue expresado
artificialmente en una línea celular que carecía de GR endógeno y un
elemento de respuesta de glucocorticoide (GRE) "Conducciendo" a
un gen de luciferasa reportado que se usa para medir la activación
dependiente al ligando.
Célula de COS7 fueron transfectadas con 1 \mug
pcDNA3-GR y 3 \mug
AH3-Luc por placa de cultivo de tejido 10 cm. Las
células fueron vertidas en placas de 24 pocillos después de
transfección y los esteroides fueron adicionados inmediatamente.
Después de que 18 horas de incubación, las células se destruyeron y
fue efectuado un ensayo de luciferasa.
SRC-1 es un importante
co-activador de la acción de GR que se asocia con el
GR en una manera dependiente del ligando. La capacidad de
SRC-1 para asociarse con el GR de esta manera puede
ser usado como una medida de la potencia del ligando que medió la
transactivación. Llevar a cabo este ensayo en plásmidos que generan
el Dominio del Ligando enlazante VP16-GR (LBD) y
proteínas de fusión como GAL4-SRC-1
en el gen de luciferasa enlazante reportado GAL4 construido para
transfectar en una línea celular deficiente en
SRC-1 endógeno. La proteína de fusión
GAL4-SRC-1 puede unirse a sitios
específicos corriente arriba del gen de luciferasa reportado. Si la
proteína de fusión SRC-1 asociada con el enlace del
ligando y la proteína de fusión de VP16-GRLBD luego
el dominio de activación VP-16 aumenta la expresión
del gen de luciferasa. La respuesta de dosis del ligando fue
analizada para la unión de SRC-1 con los compuestos
mostrados en Fig. 1 y 2A.
En este método una aproximación colorimétrica es
usada para cuantificar la actividad de TAT. La enzima TAT cataliza
la siguiente reacción:
L-tirosina +
2-oxoglutarato \leftrightarrow
4-hidroxifenilpiruvato (pHPP) +
L-glutamato
Esta reacción también requiere fosfato piridoxal
(PLP) como cofactor.
Las condiciones de álcali fuertes pueden ser
usadas para cambiar pHPP por
\rho-hidroxibenzaldehído (pHBA) y luego oxalato.
La cantidad de pHBA puede ser ensayado midiendo su absorbancia a 331
nm (coeficiente de extinción 19,900M^{-1}cm^{-1}) luego esta
figura se asume ser directamente proporcional a la actividad de TAT.
Células de HEPG2 estaban cultivadas hasta que confluyen sobre una
placa de 10 cm; (-10^{-7} células). Estas
células fueron raspadas y luego resuspendidas en 500 \mul de 0,14M
KCl en hielo. Las células fueron destruidas por 3 ciclos de
sonicación de 10 segundos explosión a potencia completa (50 W, 20
kHz Sonicator; Jencons, Leighton Buzzard, R.U.). Las células
fueron guardadas en hielo entre cada estallido. Los escombros de la
suspensión de células destruidas fueron hilados luego más abajo
(microcentrifuga 13000 rpm, 20 min) y la concentración de proteína
del sobrenadante fue ensayado usando el método de Bradford. Luego
100 \mug de proteína fueron usado para ensayar la actividad
de
TAT.
TAT.
Para realizar el ensayo de TAT se hace la mezcla
de la siguiente reacción en un eppendorf de 1,5 ml:
| 900 \mul | 7 mM L-Tirosina en 0.2 M KPO_{4} |
| 30 \mul | 0.3 M Ketoglutarato |
| 30 \mul | 1.2 mM PLP |
| ? | 100 \mug de proteína celular |
| ? | 0.2 M KPO_{4} |
| 1000 \mul |
Para cada reacción fue colocada una reacción de
control sin el ketoglutarato. Las muestras se incuban a 37ºC por 20
minutos y luego se adicionan 60 \mul de NaOH 10M. Las muestras son
incubadas a temperatura ambiente por unos 30 minutos adicionales y
luego la absorbancia de cada muestra se ensaya a 331 nm en un
espectrofotómetro (Ultrospec III, Pharmacia).
Para realizar este ensayo el GR y la p65 son
expresados artificialmente en una línea celular carente de GR y
deficiente en p65 endógena. La capacidad de p65 para activar un
elemento de respuesta de NFkB (NRE) "Conduciendo" un gen de
luciferasa reportado podría luego ser reprimida por GR de una manera
dependiente al ligando, por consiguiente, es usado para medir luego
la transrepresión.
Células de COS7 se transfectan con 1 \mug de
pcDNA3-GR, 3 \mug NRE-Luc y 200
ng de p65 por placa de cultivo de tejido de 10 cm. Las células son
vertidas en una placa de 24 pocillos después de la transfección y
se dejan durante 18 horas para recuperarse antes de adicionar los
esteroides de la Fig. 1 y 2A. Después de otras 18 horas en que se
incuban, las células se destruyen y se realiza un ensayo de
luciferasa.
En este ensayo TNF es usado para estimular la
actividad de NFkB en una línea celular que expresa el GR endógeno.
La capacidad de NFkB de activar una NRE "Conduciendo" un gen de
luciferasa reportado podría luego ser reprimido por GR en una manera
dependiente del ligando y, por consiguiente, usado para medir
transrepresión.
Células de COS7 se transfectan con 3
NRE-Luc de placa de cultivo de tejido de 10 cm. Las
células se adicionan y son vertidas en una placa de 24 pocillos
después de la transfección y se dejan durante 18 horas para
recuperar antes los esteroides de la Fig. 1 y 2. Después adiciona
TNF a las muestras después de 3 horas de incubación con los
esteroides y después de otras 15 horas, las células se destruyen y
se realiza el ensayo de luciferasa.
En este ensayo de TNF se usa para estimular la
actividad de NFkB en una línea celular que expresa el GR endógeno.
La capacidad de NFkB de inducir la transcripción de gen de
IL-8 podía ser reprimido por GR en una manera
dependiente al ligando y, por consiguiente, se usa luego para medir
la transrepresión.
Células de COS7 se transfectan con 3
NRE-Luc en placa de cultivo de tejido de 10 cm. Las
células son vertidas en placa de 24 pocillos después de la
transfección y se dejan durante 18 horas para recuperarse antes de
adicionar los esteroides de la Fig. 1 y 2A. Después de la
incubación durante 3 horas con los esteroides, TNF se adiciona a las
muestras sobre el sobrenadante de célula, después de otras 15 horas
un ensayo de IL-8 se ejecuta de acuerdo con las
instrucciones del fabricantes (R & D). Brevemente, triplicados
de 100 \mul de una dilución de 1:2 de sobrenadante de célula y
100 \mul de una serie de dilución conocida de IL-8
se adicionan a los pocillos de una placa de micro titulación
cubierta con un anticuerpo monoclonal de IL-8, las
muestras son incubadas y lavadas con un anticuerpo policlonal
IL-8 biotinilizados durante 1 hora a temperatura
ambiente. La solución de peroxidasa de Streptavidina de rábano de
caballo se adiciona a todos los pocillos luego y es incubado por 30
minutos antes de ser lavado. Tetrametilo de benzidina (TMB;
Chromagen) se adiciona a todos los pocillos y se incuba en la
oscuridad por 10 minutos, la reacción es detenida por la adición de
H_{2}SO_{4} y la absorbancia de cada uno se lee en un
espectrofotómetro usando como longitud de onda 450 nm. El análisis
de regresión se lleva a cabo sobre los datos estándares y los
desconocidos y se expresan como pg/ml de IL-8 en
comparación con el patrón.
El GR no ligado está presente en el citoplasma de
las células en asociación con proteínas de conmoción por calor
(HSPs). La unión de un ligando agonista al GR causa la disociación
de los HSPs y la translocación para el núcleo. Un tipo de ligando
antagonista I puede unirse al GR pero puede translocarlo al núcleo.
Un ligando antagonista de tipo II puede unirse a GR, translocando al
núcleo y se une al ADN pero puede activar la transcripción del gen.
Por consiguiente, la capacidad de un supuesto ligando translocando
al GR ayuda a condicionar su estado como un agonista o antagonista.
Células de COS7 fueron transfectadas con 5 \mug de una proteína
fluorescente verde (GFP) titulada en el vector de expresión de GR.
Después de la transfección, estas células se dividen en 6 pocillos
de la placa con un cubre objeto de microscopio estéril colocado en
la parte inferior de cada uno. Las células se permiten recuperarse
durante 18 horas y luego el medio se quita, las células se lavan
tres veces con fosfato estéril salino (PBS) y el nuevo medio se
adiciona conteniendo carbón FCS en lugar de FCS normal. Las células
se incuban durante 18 horas y luego los esteroides de Fig. 1 y 2A
son adicionados hasta una concentración final de 100 nM. Las células
se incuban durante 3 horas adicionales y luego el medio se extrae y
las células se fijan a los cubre objetos de vidrio adicionando
metanol helado e incubando a -20ºC por 30 minutos. Los cubre
objetos con las células transfectadas asociadas con ellos fueron
montados en los porta objetos y la localización celular del GFP, el
GR titulado fue analizado por microscopio de fluorescencia usando un
microscopio de Axioplan 2 (Zeiss, Oberkochen, Alemania) y software
de análisis KS300 v3,0 (Zeiss).
Un antagonista de tipo II debe ser capaz de
competir la actividad agonista. Cuando un antagonista no tiene
capacidad de transactivarse, la competición puede ser medida por la
inhibición de un agonista en un ensayo de transactivación. RU486 es
un antagonista de tipo II de la función de GR y puede competir
contra el agonista Dexametasona por la unión de un ligando, esta
interacción puede ser usada como un control positivo para este
análisis.
Como con el ensayo de transactivación
previamente descrito, en el que GR fue artificialmente expresado en
una línea celular que carecía de GR endógeno y el GRE
"Conduciendo" un gen de luciferasa reportado es usado para
medir la activación dependiente del ligando. Células de COS7 fueron
transfectadas con 1 \mug pcDNA3-GR y 3 \mug
AH3-Luc por placa de cultivo de tejido de 10 cm.
Las células son vertidas dentro de la placa de 24 pocillos después
de la transfección y los esteroides son adicionados inmediatamente.
Todos los pocillos excepto el control negativo fueron tratados con
50 \muM Dexametasona para generar una concentración final de 100
nM. Ciertos esteroides de la Fig. 2A se adicionan a la misma
concentración a todos los pocillos de muestra. Después de 18 horas
de la incubación las células se destruyen y se efectúa un ensayo de
luciferasa.
Como el GR LBD tiene homologia fuerte con el PR
LBD hay una posibilidad de que cualquiera de los esteroides
evaluados de las Figs. 1 y 2A activa uno de estos receptores y
también puede activar los demás. La presencia de la actividad de
progesterona ilegítimo se asocia con los esteroides de las Fig. 1 y
2A y son examinados probado usando un ensayo de transactivación con
PR en lugar del GR.
El PR fue expresado artificialmente en una línea
celular que carecía de PR endógeno y una GRE "Conduciendo" un
gen de luciferasa reportado es usado para medir la activación
dependiente al ligando.
Células de COS7 fueron transfectados con 1 \mug
pSEO-PRB y 3 \mug AH3-Luc en una
placa de cultivo de tejido de 10 centímetros. Las células son
vertidas dentro de una placa de 24 pocillos después de la
transfección y los esteroides de las Fig. 1 y 2A son añadidos
inmediatamente para generar una concentración final de 100 nM.
Después de de 18 horas de incubación las células se destruyen y se
efectúa un ensayo de luciferasa.
Apoptosis (la muerte de célula programada) es
mediado por una proteína llamada Bax, la transcripción de esta es
principalmente controlada por GR de una manera dependiente al
ligando. Para medir la capacidad de un ligando GR para provocar
apoptosis en una línea celular apropiada se incubada con el ligando
y se lleva a cabo después de tres días un conteo de células
viables.
Células de CEM-C7A son vertidas
en una placa de 96 pocillos a 5 x 10^{5}/pocillos. Los esteroides
de las Fig. 1 y 2A son añadidos inmediatamente para generar una
concentración final de 100 nM. Después de la incubación, a unos tres
días el número de células vivas en cada pocillo se ensaya usando
Celltiter 96 Aqueous Non-Radiactive Cell
Profilation (Promega). Este ensayo es un método calorimétrico
para determinar el número de células viables en el ensayo de
proliferación o químico sensible.
En Resumen, el ensayo esta compuesto de las
soluciones de un compuesto nuevo de tetrazolium (3-(4,5
dimetiltiazol-2-ilo)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium,
MTS) y un reactivo de acoplamiento de electrón (metosulfato de
fenazina; PMS). MTS es bioreducido por las células en un producto
formazan que es soluble en un medio de cultivo de tejido. La
absorbancia del formazan a 490 nm puede ser medida directamente
desde una placa de ensayo de 96 pocillos sin procesamiento
adicional. La conversión de MTS respecto a formazan acuoso, soluble
es lograda por enzimas deshidrogenasa que encontraron en células
activas metabolicamente. La cantidad del producto formazan como
medida por la cantidad de absorbancia a 490 nm es directamente
proporcional al número de células vivas en el cultivo.
Compuestos que fueron evaluados en dos lotes como
sigue:
- Lote 1: Compuestos, A, H y D. Compuestos C y E demostrado ser demasiado insoluble para dar los resultados reproducibles y cualquiera de los datos son presentados sobre estos compuestos.
- Lote 2: Compuestos G hasta T inclusive.
En todos los casos, Dexametasona, la estructura
que es mostrada en la Fig. 1, se incluyen como un control
activo.
La capacidad de todos los compuestos colocados en
la Fig. 2A para transactivar son primero evaluados en 1, 10 y 100 nM
(Fig. 3 y 4). El Compuesto D parece ser más activo provocando más
transactivación que la Dexametasona (Fig. 3). Fue encontrado que los
compuestos L, O, Q y R fallaron por generar una respuesta a
cualquier concentración. El Compuesto G es mucho menos potente y
tiene un efecto máximo más bajo cuando se compara con Dexametasona.
Todos los otros compuestos demuestran alguna capacidad para
transactivar con una inducción máxima diferente aunque esta
respuesta es "Desplazada a la derecha" comparado con la
Dexametasona (Fig. 3 y 4).
Para evaluar el posterior potencial de
transactivación de los compuestos probados en estos experimentos se
repiten a 1, 10, 100 y 500 nM con los compuestos que han generado
alguna respuesta en el primer experimento (i.e. Todos exceptúan de
L, O, Q y R). Este experimento confirma que los compuestos H, I, J,
K, M, N y S tienen una respuesta máxima similar comparado con la
Dexametasona aunque todos ellos responden con un "Desplazamiento a
la derecha" (Fig. 5). Los Compuestos G, P y T tienen una
"Respuesta desplazada a la derecha" y un máximo reducido
comparado Dexametasona, aunque solamente es leve en el caso de T
(Fig. 5). El Compuesto G tiene una respuesta máxima global más baja
y también la respuesta más baja a cualquier dosis comparado con los
otros compuestos (Fig. 5).
La capacidad de todos los compuestos mostrada en
la Fig. 2A de enganchar SRC-1 es evaluada en
comparación con Dexametasona. Fueron evaluados en concentraciones 1,
10 y 100 nM (Fig. 6 y 7). Fue encontrado que solamente el compuesto
D engancha SRC-1 a la misma extensión como la
Dexametasona. El compuesto A produce una respuesta
sub-máxima (\approx 50%). A las concentraciones
clínicamente relevantes de 1 y 10 nmolar el compuesto G no causa la
transactivación como medición por enganche con
SRC-1. Aún a las más altas concentraciones
evaluadas, el compuesto G no causó enganche con
SRC-1. Ninguno del resto de los compuestos que
engancha SRC-1 son tan bueno como Dexametasona y
solamente los compuesto J, K, R, S y T generan una respuesta
importante en 100 nM.
La capacidad del compuesto G de activar el gen de
la tirosina amino transferasa endógena (TAT) es comparada con
Dexametasona a las concentraciones de 1 \muM. Es encontrado que
existe una reducción importante en la actividad de TAT que usa
compuesto G cuando el ligando de GR se compara a la Dexametasona (p
= 0,014, dos t-prueba seguida) (Fig. 8).
La capacidad de los compuestos de la Fig. 2A de
reprimir p65 y estimulación de un elemento de respuesta NFkB es
evaluado a 1, 10 y 100 nM (Fig. 9 y 10). Los compuestos A y H son
menos potentes que la Dexametasona pero provocan la misma reacción
máxima a 100 nM. El compuesto D es tan potente como la Dexametasona
(Fig. 9). En la segunda serie de compuestos, se encuentra que
solamente tres de los compuestos (L, O y R) fallan completamente en
reprimir la función de P65 totalmente pero algunos compuestos no
demostraron ningún efecto en 1 y 10 nM con solamente una represión
insignificante a 100 nM (J, P y Q). El compuesto remanente todo
reprimido de P65 por lo menos es tan bien como Dexametasona con una
respuesta "Desplazamiento a la Izquierda" y la represión máxima
más grande en el caso de los compuestos G y T.
La capacidad de los compuestos de Fig 2A para
transrepresar la activación de TNF en células de A549 se muestra en
las Fig. 11 y 12. La capacidad de compuesto G de reprimir la
activación de TNF de células A549 es probada usando un gen de NRE
reportado y 1, 10, 100 y 500 nM del compuesto. Es encontrado que el
compuesto G reprimió por lo menos también como Dexametasona y
también tenía una respuesta "Desplazada a la Izquierda" con la
represión máxima mayor. Los Compuestos A, D y H son también
evaluados en el ensayo. Todos los compuestos presentan
transrepresión.
La capacidad de los compuestos de la Fig. 2A para
transrepresar la activación de IL-8 en células A549
son mostrados en Fig 13 y 14. La capacidad de 100 nM del compuesto G
de reprimir la activación de TNF de células de A549 también es
evaluada usando producción de IL-8 como un punto de
final endógeno. Es encontrado que compuesto G reprime la producción
de IL-8 mejor que la Dexametasona (p = 0,0076, dos
t-test). Los Compuestos A, D y H presentaba
transrepresión en este ensayo.
Los Compuestos A, D y H provocan la localización
nuclear del receptor de glucocorticoide GFP titulado, por lo tanto
son capaces de unirse a GR (Fig. 15). La capacidad de ciertos
compuestos del segundo juego de compuestos en provocar translocación
se muestra en Fig. 16. El compuesto O falló por causar
translocación, compatible con la inactividad en todo los demás
ensayos y la conclusión de que este compuesto no se una al receptor
de glucocorticoide. Los otros compuestos evaluados provocaron
translocación del receptor al núcleo.
Los cuatro antagonistas supuestos fueron
identificados por su falta de la función en cualquier
transactivación o ensayo de transrepresión (L, O, Q y R). Para
chequear función antagonista de tipo II como la capacidad de estos
compuestos de competir con Dexametasona por la unión de GR fue
evaluada usando RU486, un antagonista de tipo II de GR bien
definido, como un control positivo. Células COS7 son transfectadas
con un gen reportado susceptible a la transactivación y luego es
estimulado con 1 nM Dexametasona. RU486 (1, 10,100 nM) compite con
la función Dexametasona de una manera de dosis dependiente con una
represión de transactivación máxima de \approx50%. Los compuestos
L, O, Q y R fallan para reprimir transactivación de Dexametasona y
por tanto fallan para actuar como antagonistas competitivos, (Fig.
17).
La actividad de progesterona expuesta por los
compuestos tal como se muestra en Fig. 18 es evaluado por un ensayo
de transactivación usando el vector de expresión de PRB reportado de
AH3-luc. En este sistema progesterona 100 nM causa
una inducción fuerte del gen reportado mientras que Dexametasona 100
nM causa muy poco aumento en el gen reportado activación sobre el
control negativo. Los Compuesto G, H, I y P presentan un gen de
activación reportado similar o reducido comparado con la
Dexametasona. Compuestos J, K, L, M, N, O, Q, R, S y T presentan la
activación de un gen reportado ligeramente aumentado comparado con
la Dexametasona. Cualquiera de los compuestos demuestra la potencia
de progesterona en la activación de PRB, la más fuerte, L, solamente
demuestra \sim40% que la activación generada por la
progesterona.
Células de CEM C7A son una línea celular de
linfoblasto T humano que pasa por apoptosis en respuesta al
glucocorticoide. El mecanismo exacto es incierto, pero comúnmente
se relaciona con la acción linfocitolitica del glucocorticoide en
vivo, y puede hacer un modelo de los aspectos de glucocorticoide
mediando anti-inflamación. En la primera serie de
compuestos, Dexametasona y compuesto A son los más potentes
inductores de apoptosis. RU24858 afectó la proliferación pero no
produjo apoptosis significativamente (Fig. 20). Tenemos datos
previos de envergadura usando RU24858, y constantemente falla la
apoptosis inducida. En la segunda serie de compuestos, apoptosis fue
producido por G hasta K pero no por compuesto Q. Este último
compuesto no tenía ninguna actividad en cualquiera de los ensayos y
es pensado no unirse. El hecho de que apoptosis se produce por
compuestos muy selecto, compuesto G el que está no tiene la
actividad de transactivación esencialmente pero tiene actividad de
transrepresión alta es una conclusión inesperada y en contraste con
la actividad de otros agonistas selectos como RU24858.
La unión de compuesto G para el receptor de
glucocorticoide fue investigada usando un patrón. Las condiciones
son como siguen:
| Fuente | Células Humanas HeLa 53 |
| Ligando | 6 nM^{3}H Dexametasona |
| Vehículo | 0.4% DMSO |
| Tiempo de incubación/ Temp | 2 hours @25ºC. |
| Buffer Incubación | RPMI 1640, 10 nM Hepes, pH 7.2 |
| Ligando No específico | 20 \muM Dexametasona |
| Kd | 5 nM |
| B_{max} | 61000 R/células |
| Unión Específica | 75% |
| Método Cuantificación | Unión Radiológica |
| Criterio Significancia | >50% de estimulación máx. ó inhibición. |
Valores de IC_{50} fueron determinados por una
regresión de cuadrados no lineal. Los valores de k, fueron
calculados usando la ecuación de Cheng y Prusoff usando el IC_{50}
observado del compuesto de prueba, la concentración del radio
ligando empleado en el ensayo, y los valores históricos para la Kd
del ligando. El coeficiente de Hill (n_{H}), definido como la
pendiente de la curva unión, fue calculado.
El Compuesto G enlazado al receptor de
glucocorticoide. La curva de unión fue desplazada a la derecha
cuando se comparaba con Dexametasona. Esto fue una sorpresa
encontrada, en el ensayo de transrepresión, Compuesto G fue por lo
menos tan eficaz como la Dexametasona. Es posible especular que el
enlazante en este ensayo es más indicativo de la actividad de
transactivación al de los compuestos que la actividad de
transrepresiva de los compuestos.
El compuesto G también es mostrado para no unirse
al receptor de progesterona en un ensayo de unión al receptor
clásica (datos no indicados). Compuesto G también es mostrado para
no unirse a otros miembros del receptor familia excelente de
esteroide. Curiosamente, en una encuadernación de receptor clásica
ensayar (Fig. 19) G compuesto parecía ser uno menos potente que la
Dexametasona ligando por el GR demasiado las conclusiones en ambos
el in vitro e in vivo ensayar ser sorprendente, con
compuesto G indicar la misma actividad más grande en
transrepresión.
Evaluar la validez de los modelos adicionales
en vitro, como predictor de los efectos antiinflamatorios
en vivo y la inducción de síntesis de proteínas
(transactivación), el compuesto G fue estudiado en un modelo animal
clásico de inflamación.
Los ratones albino suizos outbreds machos
(18-20 g peso corporal) fueron comprados desde
Bantin y Kingman (cepa T.O.; Hull, Humberside) y mantenido con una
dieta de pastilla como comida, usual con agua del grifo y un ciclo
de luz/oscuridad de 12:00 h (ad limitum). Todos los animales
fueron alojados por tres días previos a la experimentación para
permitir que el peso corporal alcance 20-22 g. Al
día del experimento los ratones tenían en el rango de
24-26 g.
Bolsitas de aire fueron ejecutado sobre la
espalda de los ratones: por inyección de aire (2,5 ml s.c.) en el
día 0 y el día 3 (Perretti and Flower, 1993).
Al día 6 ratones fueron sometidos al vehículo
(300 \mug, grupo A y D), o tratado con Dexametasona (3 \mug,
grupo B) o compuesto G (3 \mug, grupo C) a 1 h inyectado
intra-peritoneal (i.p.), grupo E fue dejado sin
tratar. Compuesto G y Dexametasona fueron preparados por dilución de
soluciones de stock en DMSO en aceite de parafina (concentración de
DMSO final, menos que 0,01%).
Zimosan A fue permitida al descongelar a
temperatura ambiente durante 30 minutos antes de ser adicionado a
PBS estéril a una concentración de 2 mg/ml formando una suspensión
homogénea.
A tiempo cero, los ratones reciben 0,5 ml de
zimosan (1 mg) (grupo A, B, C) inyectados a nivel local con
aire-petaca. Grupos D y E fueron dejados sin tratar
en este punto de tiempo. A las 4 horas post-zimosan,
los animales fueron colocados en CO_{2}. Bolsitas de aire fueron
lavadas luego con 2 ml de PBS conteniendo 3 mM de EDTA y los hígados
fueron recuperados y se congelan para su análisis posterior.
El número de leucocitos pasado (\geq 90%
leucocitos morfonuclear, PMN) fue determinado en fluido desde cada
aire-petaca, tomando una alícuota (100 \mul) del
fluido de lavado y diluyendo 1:10 en el solución de Turk's (0,01%
cristal violeta en 3% de ácido acético). Las muestras fueron
vorteadas y luego 10 \mul de la solución de célula teñidas fue
colocada en un hematocimometro Neubauer y los números de
neutrofilos contados usando la luz de microscopio. (Olympus
B061)
Cuantificación de Tirosina Amino Transferasa
(TAT) proteína en el hígado: En este método un enfoque colorimétrico
es usado para cuantificar la actividad de TAT. La enzima TAT
cataliza la siguiente reacción:
L-tirosina + 2
oxoglutarato \leftrightarrow 4 hidroxifenillpiruvato (pHPP) +
L-glutamato
Esta reacción también requiere fosfato de
piridoxal (PLP) como un co-factor.
Las condiciones de álcali fuertes pueden luego
ser usadas para cambiar pHPP por
p-hidroxibenzaldehído (pHBA y oxalato). La cantidad
de pHBA puede ser luego evaluada midiendo su absorbancia a 331 nm
(coeficiente de extinción 19,900 M^{-1} cm^{-1}) esta cifra es
luego asumida directamente proporcional a la actividad TAT.
Hígados fueron homogeneizados y las células
fueron guardadas en hielo. Los restos celulares en suspensión fueron
entonces hacerlas girar (13000 rpm, microcentrifuga, 20 minutos) y
la concentración de proteína del sobrenadante fue ensayada usando el
método de Bradford. 100 \mug de proteína se usan para ensayar la
actividad de TAT. Para realizar el ensayo de TAT la siguiente mezcla
de reacción se hace en un vial de 1,5 ml
| 900 \mul | 7 mM L-Tirosina in 0.2 M KPO_{4} |
| 30 \mul | 0.3 M Ketoglutarato |
| 30 \mul | 1.2 mM PLP |
| ? | 100 \mug de proteína celular |
| ? | 0.2 M KPO_{4} |
| 1000 \mul |
Para cada reacción, una reacción de control es
colocada sin el ketoglutarato. Las muestras se incuban a 37ºC
durante 20 minutos y luego 60 \mul de NaOH 10M se adicionan. Las
muestras se incuban a temperatura ambiente por unos 30 minutos
adicionales y luego la absorbancia de cada muestra es ensayada a 331
nm sobre un espectrofotometro (Ultrospec III, Pharmacia).
- Grupo A, vehículo i.p. + Zimosan intra-bolsa, n = 8
- Grupo B, Dexametasona + Zimosan intra-bolsa, n = 8
- Grupo C, compuesto G, Zimosan intra-bolsa, n = 8
- Grupo D, vehículo i.p., n=8
- Grupo E, no tratamiento, n = 8
Los números Neutrofilos son comparados entre
grupos que usando prueba de Bonferroni ANOVA plus Ia. Niveles de
TAT fueron comparados usando una prueba-t.
Los resultados de acumulación de neutrofilos son
mostrados en la tabla I que más abajo y el ensayo de TAT en Fig.
22,
| Efecto del compuesto G sobre zimosan migración de neutrofilos inducido (10^{6} por ratón) | ||
| evaluado a 4 h punto de tiempo (datos acumulativos) | ||
| Grupo Experimental | Estímulos | Neutrofilos (10^{6} por ratón) |
| A (vehículo) | Zimosan 1 mg | 9.15 \pm 0.92 |
| B (Dexametasona) | Zimosan 1 mg | 6.23 \pm 0.44* |
| C (Compuesto G) | Zimosan 1 mg | 6.33 \pm 0.79* |
| D (vehículo) | ninguno | 0 |
| Leyenda: Valores sobre la media \pm S.E. de 8 ratones por grupo P < 0.05 vs grupo A. |
Dexametasona y compuesto G provocan una reducción
significativa (-30%) de acumulación de neutrofilo. El ensayo de TAT
muestra que todos los animales que habían recibido el vehículo ip
del fármaco, tienen elevado niveles de TAT comparado con los
controles sin tratar. Esto fue debido a la tensión relacionada con
una reacción inflamatoria producida por el vehículo y el asociarse
se aumentó los niveles de glucocorticoide endógeno. La Dexametasona
causa el ascenso adicional de TAT, a diferencia del compuesto G.
Este experimento por tanto muestra que el compuesto G y la
Dexametasona tienen un efecto anti-inflamatorio
equivalente cuando se administran a la misma dosis y que el
compuesto G, a diferencia de la Dexametasona, no causa la inducción
de la enzima gluconeogenica, amino tirosina transferasa, a esta
dosis. Esto demuestra que el compuesto G en vivo, y otros
compuestos de la serie mostrada tienen selectividad en el ensayo
en vitro, tendrá la reducción deseada de los efectos
secundarios que resultan de la transactivación.
Una observación interesante adicional de este
estudio en el ratón era que el compuesto G no actuó como un
antagonista hacia la transactivación. Esto puede ser visto porque el
compuesto G no redujo el nivel de TAT comparado con los grupos de
control de vehículo.
Los investigadores previos han postulados
identificar esteroides selectivos^{44, 45} Ellos no han tenido
éxito en identificar compuestos útiles. Esto es totalmente
inesperado que nosotros fuéramos capaces de identificar una serie
especial de compuestos, como la que se define en la anterior
Fórmula I, II y III, que sorpresivamente tiene la funcionalidad, en
particular, para identificar un compuesto (compuesto G) con un grado
muy considerable de selectividad. Como los datos de más arriba
demuestran, los ejemplos de compuestos de acuerdo con la invención
son identificados como compuestos A, G, H, I, K, M, N, S y T, las
estructuras son mostradas en la Fig. 2A, y los ejemplos comparativos
de compuestos que caen fuera del alcance de la presente invención
son identificados como compuestos D, J, L, O, P, Q y S, las
estructuras que son también mostradas en la Fig. 2A.
Las series seleccionadas de los análogos de la
Dexametasona de la presente invención tienen una estructura acorde a
la fórmula I, II, III y IV que se definió con anterioridad y
presenta la selectividad por transrepresión sobre la translocación.
Las series seleccionadas de compuestos de la presente invención se
unen evidentemente al receptor de glucocorticoide y no provocan
transactivación o provocan menos transactivación que la
Dexametasona, significativamente en las concentraciones que impiden
el proceso inflamatorio. Ésta es tradicionalmente una situación en
la que uno esperaría ver una actividad antagonista. Esto es
sorprendentemente no evidente. Desde el punto de vista clínico esto
es de considerable importancia como un antagonista para la
transactivación contrarrestaría los efectos de esteroides endógenos
y produce un estado equivalente a una falta de esteroide conocido
como la enfermedad de Addison que esta caracterizada por la
reducción de la presión sanguínea, hipokalaemia; coma, reducida
resistencia al estrés y la infección.
Para este uso, de los experimentos descritos más
arriba, las series seleccionadas de los análogos de Dexametasona
acorde a las Fórmulas I, II y III como se define han sido demostrado
tener las características necesarias para un agonista de receptor de
esteroide selectivo con los efectos secundarios reducidos, nombrados
los compuestos definidos:
- 1.-
- Causa la transrepresión a la misma extensión o significativamente más grande que la Dexametasona e impide la inflamación tan eficazmente como la Dexametasona
- 2.-
- No transactivar a las concentraciones clínicamente relevantes en los ensayos en vitro y en los ensayos en vivo también falla el transactivar y por lo tanto no provoca el característico efecto secundario del esteroide que resulta de formar este mecanismo y el que seriamente limita la utilidad del fármaco en la práctica clínica.
- 3.-
- No antagoniza los efectos de esteroides endógenos y por tanto no tiene la capacidad de inducir efecto secundario de Addisonian.
- 4.-
- Inducir apoptosis que es un mecanismo importante para la selección clonal y el tratamiento de la inflamación y el rechazo de trasplante y se da la base por la que los esteroides tratan los hematológicos y otros tumores malignos.
De esta manera, los compuestos particulares que
tienen una fórmula estructural de acuerdo con la fórmula I, II o II
tal como se definió anterior han demostrado tener las
características de un grupo de esteroides que tienen el perfil
terapéutico deseado con los efectos secundarios reducidos mientras
se mantiene la eficacia. Otros investigadores han identificado
moléculas que tienen un poco de selectividad en ensayo in
vitro. El RU24858 es demostrado que tiene una selectividad 2
veces para la transrepresión sobre transactivación in vitro.
Este compuesto sin embargo dejó de mostrar el perfil deseado en
vivo^{44-45} en que el compuesto G fue
demostró tener el perfil deseado en vivo y esto es casi por
supuesto debido a que indica gran selectividad (aproximadamente 1000
pliegue in vitro), es muy potente para la transrepresión y
porque deja de inducir una transactivación máxima incluso a muy
altas concentraciones.
Un experto en el estado de la técnica apreciará
que el proceso siguiente pueda ser usado en el orden de sintetizar
un nuevo compuesto de acuerdo con Fórmula III y IV desde un
compuesto G
- 1.-
- La protección de las dos funciones hidroxilo con grupos de R (los grupos R son seleccionado de aquellos definidos anteriormente como Fórmula III y IV),
- 2.-
- La formación del enol acetato por el tratamiento con acetato de isopropenilo y un catalizador acídico o básico,
- 3.-
- Remover los dos grupos de protección.
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Claims (23)
1. Un compuesto que tiene la estructura de la
Fórmula I o la Fórmula II como se define más abajo, o un derivado
farmacéutico aceptable suyo para uso en medicina.
Fórmula
I
En la que: R = NH_{2}, NHR^{1}, NHOR^{2},
NHNHR^{2}, NHCOR^{2},
y R^{1} = alquilo
C_{(1-4)}, cicloalquilo
C_{(3-6)},
En la que
n = 1-3,
R^{2} = metilo, etilo,
R^{3} = alquilo C_{(1-6)},
bencilo ó halobenzilo;
OR
Fórmula
II
En la que R^{4}, R^{5} = alquilo
C_{(1-4)}.
2. Un compuesto según la reivindicación 1, en la
que el compuesto tiene la estructura de la Fórmula I en la que R es
NHR^{1} y R^{1} es metilo, etilo, propilo, ciclopropilo, butilo,
ciclobutilo o
y n =
1.
3. Un compuesto según la reivindicación 2, en la
que R_{1} es bencilo ó metilo.
4. Un compuesto según la reivindicación 1, en la
que el compuesto tiene la estructura de la Fórmula I, en la que R
es
y R^{3} es alquilo,
preferentemente alquilo
C_{(1-6)}.
5. Un compuesto según la reivindicación 4, en la
que R^{3} es propilo ó hexilo.
6. Un compuesto según la reivindicación 1, en la
que el compuesto tiene la estructura de la Fórmula I, en la que R
es:
y R^{3}
es
donde n =
1-6.
7. Un compuesto según la reivindicación 6, en la
que R^{3} es bencilo.
8. Un método según la reivindicación 1, en la que
el compuesto tiene la estructura de la Fórmula 1, donde R es
y R^{3} es un
halobencilo.
9. Un compuesto según la reivindicación 8, en la
que R^{3} es fluorobencilo.
10. Un compuesto según la reivindicación 1, en la
que el compuesto tiene una estructura según la Fórmula II y R^{4}
y/o R^{5} son metilo y/o etilo.
11. Un compuesto según la reivindicación 10, en
la que R^{4} y R^{5} es metilo.
12. Un compuesto según reivindicación 1 ó 2, en
las que el compuesto es:
13. Un compuesto según reivindicación 4 en la que
R^{3} es propilo.
14. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en la que el compuesto es administrado
a un paciente para inducir apoptosis en células
pro-inflamatorias y/o células malignas.
15. Un compuesto como se define en la Fórmula
III o la Fórmula IV más abajo
Fórmula
III
en la que R^{6} Y R^{7} son
cualquiera de H, CH_{3}CO, CH_{3}CH_{2}CO o
CH_{3}CH_{2}CH_{2}CO, previendo que R^{6} y R^{7} no sean
H, OR ó
ambas.
Fórmula
IV
en la que R^{8} y R^{9} son
cualquiera de H, CH_{3}CO, CH_{3}CH_{2}CO o
CH_{3}CH_{2}CH_{2}CO.
16. Un compuesto según reivindicación 15 para uso
como una medicina.
17. Un compuesto según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 14, o un derivado farmacéutico aceptable
suyo para el uso en tratamiento de una afección inflamatoria, para
tratar los hematológicos u otros tumores malignos, para provocar
inmunosupresión o para la prevención o el tratamiento del rechazo de
trasplantes.
18. Uso del compuesto según una cualquiera de
las reivindicaciones de 1 a 16, o un derivado farmacéutico aceptable
suyo para el uso en tratamiento de una afección inflamatoria, para
tratar los hematológicos u otros tumores malignos, para provocar
inmunosupresión o para la prevención o el tratamiento del rechazo de
trasplantes.
19. Una composición farmacéutica que comprende
un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 16, o
un derivado farmacéutico aceptable suyo y un portador adecuado
farmacéuticamente.
20. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 19 para el uso en tratamiento de una afección
inflamatoria, para tratar los hematológicos u otros tumores
malignos, para provocar inmunosupresión o para la prevención o el
tratamiento del rechazo de trasplantes.
21. Uso de una composición farmacéutica según
reivindicación 19 en la producción de un medicamento para el
tratamiento de una afección inflamatoria, para tratar los
hematológicos u otros tumores malignos, para provocar
inmunosupresión o para la prevención o el tratamiento del rechazo de
trasplantes.
22. Uso de una composición farmacéutica según la
reivindicación 19 en la producción de un medicamento para inducir
apoptosis en células objetivo.
23. Uso de un compuesto según una cualquiera de
las reivindicaciones de 1 a 16, o un derivado farmacéutico aceptable
suyo en la producción de un medicamento para inducir apoptosis en
células objetivo.
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