ES2249585T3 - Procedimiento para detectar bacterias gram-positivas. - Google Patents
Procedimiento para detectar bacterias gram-positivas.Info
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Abstract
Procedimiento para la detección y/o para la identificación de bacterias gram-positivas con elevado contenido en GC, caracterizado porque a) se somete una composición de muestra a una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, estando presente un primer cebador que ha sido seleccionado del grupo consistente en los cebadores con las secuencias SEC ID Nº. 1, SEC ID Nº. 3, SEC ID Nº. 5, SEC ID Nº. 7 y SEC ID Nº. 9, y estando presente un segundo cebador que ha sido seleccionado del grupo consistente en los cebadores con las secuencias SEC ID Nº. 2, SEC ID Nº. 4, SEC ID Nº. 6, SEC ID Nº. 8 y SEC ID Nº. 10; b) se hibrida una composición que contiene el producto de amplificación del paso a) o una parte del mismo, con una o varias sondas, que han sido seleccionadas del grupo consistente en oligonucleótidos con la secuencias SEC ID Nºs. 11 a 42 y secuencias complementarias de ellas; y c) se determina el grado de la hibridación.
Description
Procedimiento para detectar bacterias
gram-positivas.
La presente invención se refiere al campo del
diagnóstico de microorganismos, en especial a la detección de
bacterias gram-positivas con elevado contenido en
GC como micobacterias, en el diagnóstico clínico.
La detección de bacterias y su identificación
exacta han jugado un rol muy importante en el diagnóstico clínico.
Así, en el caso de infecciones bacterianas un determinado agente
patógeno debería identificarse a ser posible rápidamente, para
poder comenzar un tratamiento correspondiente.
En este caso, las bacterias
gram-positivas, en especial las micobacterias,
desempeñan un rol importante. En la actualidad se conocen más de 100
especies de micobacterias, que han sido detectadas y diferenciadas
de material clínico. En este caso son de especial importancia
especies de micobacterias patógenas como el complejo
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium
intracelullare y Mycobacterium avium.
En el diagnóstico médico de rutina, así como en
la analítica de los alimentos, la identificación clásica de
bacterias tenía lugar por medio de medios selectivos y de
subsiguiente estudio de las propiedades bioquímicas. Sin embargo, en
este caso frecuentemente no es posible determinar la especie exacta.
Además, estos estudios requieren mucho tiempo, y para los estudios
ulteriores debe estar presente un cultivo puro. Precisamente los
grupos de bacterias de elevada complejidad, gran diversidad y
difíciles condiciones de desarrollo, son difícilmente accesibles
para la diferenciación clásica de cultivos, y/o retrasan
considerablemente el diagnóstico debido a su lento desarrollo.
En los últimos años se han introducido
progresivamente procedimientos basados en ácidos nucleicos para
detectar bacterias. En este caso, se llevan a cabo, por ejemplo,
reacciones de amplificación de ácidos nucleicos con cebadores
especie-específicas. La detección suele tener lugar
mediante electroforesis en gel o mediante sondas inmovilizadas en
placas de microtitulación. Sin embargo, técnicas de este tipo no
son adecuadas para detectar uno o varios organismos patógenos entre
muchos posibles. Un enfoque para este planteamiento es una tanda
de amplificación con una mezcla de diversos cebadores de
amplificación especie-específicos y correspondientes
sondas y/o un par de cebadores que sea complementario con respecto
a un segmento de bases de un grupo de organismos. En este caso, la
especificidad con respecto a las especies se garantiza por medio de
la estructura de las sondas.
Como secuencia diana u objetivo para la
amplificación de ácidos nucleicos
bacteria-específicos ya se han utilizado el ARN
ribosómico (ARNr) o el ADN ribosómico (ADNr) incluidas sus
estructuras de separador. La secuencia diana más frecuentemente
utilizada para el diagnóstico es el ARNr de 16S. Está representado
de manera óptima en los correspondientes bancos de datos. Sin
embargo, debido al carácter relativamente conservado, no siempre se
encuentran estructuras de secuencias especie- características. En
contraste con ello, la región separadora de ADNr de 16S - 23S es
sumamente variable dentro de muchas especies, y es muy adecuada para
la identificación de bacterias. También es superior al ARNr de 16S
en cuanto al contenido de su información estructural. Sin embargo,
también estas regiones diana son sólo adecuadas para diferenciar
entre un gran número de especies de micobacterias, ya que su
variabilidad de secuencia es demasiado elevada y con ello disminuye
la sensibilidad para sondas frente a esta región
diana.
diana.
Liesack et al. (1991) FEBS Lett 281,
114-116 divulgan la secuencia de nucleótidos
completa de ARNr de 23S y de 5S de Mycobacterium leprae y
diversas secuencias diana para la detección de bacterias. Entre
otros, se divulga una sonda de la zona de la hélice 54 para la
detección de Mycobacterium leprae. Sin embargo, a partir de
ello no es posible deducir que con ayuda de la región diana de la
hélice 54 sea posible diferenciar entre un número muy grande de
diversas especies de bacterias gram-positivas con
elevado contenido en GC, por ejemplo micobacterias.
Roller et al., J. of General Microbiology,
octubre de 1992, páginas 1167 - 1175, describen la relación
filogenética de la inserción de hélice 54 dentro de las bacterias
gram-positivas con elevado contenido en G + C, y
muestran que esta inserción también se encuentra disponible en el
ARNr de 23S maduro de Corynebacterium glutamicum. En este
lugar de la bibliografía no se revela ningún procedimiento de
detección ni procedimiento de diagnóstico, y tampoco se hace ningún
tipo de propuesta para secuencias de cebadores o de sondas. La
utilización de la inserción variable como secuencia diana para
diagnóstico no se revela en este lugar de la bibliografía.
Roller et al., Microbiology (1994),
páginas 2849 - 2858 describen sondas para la hibridación "in
situ" en el caso de bacterias gram-positivas
con elevado contenido en G + C, para señalar la uniformidad de este
grupo mediante estructuras homólogas de ARNr de 23S. La secuencia
allí estudiada no se encuentra en la hélice 54, sino en la hélice
69 del dominio IV de ARNr de 23S (véase la Figura 1, página
2852).
La Patente de los Estados Unidos Nº 5 703 217
describe polimorfismos para la diferenciación de especies de
micobacterias con el ARNr de 23S como secuencia diana. Por cierto,
para algunas pocas especies se presentaron ejemplos experimentales.
Sin embargo, las secuencias de sondas propuestas no son adecuadas
para deducir a partir de ellas una utilización práctica para la
diferenciación dentro del género Mycobacterium. Dado que las
secuencias divulgadas son en parte muy largas, debe tenerse en
cuenta una pérdida considerable de especificidad y una elevada
reactividad cruzada.
Ninguno de los documentos del estado relevante de
la técnica divulga un procedimiento para la detección y para la
identificación de bacterias gram-positivas con
elevado contenido en GC, en el que la región de la hélice 54 se
amplifica con las secuencias utilizando cebadores adecuados.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección y/o para la identificación de
bacterias gram-positivas con elevado contenido en
GC, conforme al cual se lleva a cabo en primer lugar una reacción
de amplificación de ácidos nucleicos y seguidamente se hibrida una
composición que contiene el producto de amplificación, o una parte
del mismo, con una o varias sondas. Finalmente se determina el grado
o extensión de hibridación.
Como reacción de amplificación de ácidos
nucleicos pueden emplearse diversas reacciones. Se prefiere emplear
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las diversas
configuraciones de la técnica de PCR son conocidas por las personas
expertas en la materia, véase, por ejemplo, Mullis (1990) Target
amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction.
Ann. Biol. Chem. (París) 48(8), 579-582.
Otras técnicas de amplificación que pueden llegar a utilizarse son
la amplificación basada en la cadena del ácido nucleico ("nucleic
acid strand-based amplification" - NASBA), la
amplificación mediada por la transcriptasa ("transcriptase
mediated amplification"
-TMA), la reacción de cadena de polimerasa-transcriptasa inversa ("reverse transcriptase polymerase chain reaction"
- RT-PCR), la amplificación de la Q-\beta-replicasa ("Q-\beta-replicase amplification" - (\beta-Q-Replicasa) y la amplificación por desplazamiento de la cadena sencilla ("single strand displacement amplification" - SDA). La NASBA y otros métodos de amplificación basados en transcripción se ilustran en Chan y Fox, Reviews in Medical Microbiology (1999), 10 (4), 185 - 196.
-TMA), la reacción de cadena de polimerasa-transcriptasa inversa ("reverse transcriptase polymerase chain reaction"
- RT-PCR), la amplificación de la Q-\beta-replicasa ("Q-\beta-replicase amplification" - (\beta-Q-Replicasa) y la amplificación por desplazamiento de la cadena sencilla ("single strand displacement amplification" - SDA). La NASBA y otros métodos de amplificación basados en transcripción se ilustran en Chan y Fox, Reviews in Medical Microbiology (1999), 10 (4), 185 - 196.
La reacción de amplificación de ácidos nucleicos
se lleva a cabo con una composición de muestra. La composición de
muestra puede ser cualquier composición de la que se sospeche que
contenga bacterias, en especial bacterias
gram-positivas con elevado contenido en GC. Puede
tratarse de material primario, por ejemplo secreciones de tráquea,
frotis de heridas, sangre, etc., o de cultivos de microorganismos
que ya se han cultivado en medios líquidos o sobre medios
sólidos.
Como par de cebadores en la reacción de
amplificación de ácidos nucleicos se encuentra presente conforme a
la invención un primer cebador con una de las secuencias SEC ID Nº.
1, SEC ID Nº. 3, SEC ID Nº. 5, SEC ID NO 7 o SEC ID Nº. 9, y un
segundo cebador con una de las secuencias SEC ID Nº. 2, SEC ID Nº.
4, SEC ID Nº. 6, SEC ID Nº. 8 o SEC ID Nº. 10. Las secuencias de los
cebadores individuales se han representado en la Figura 1.
En una forma de realización preferida, en la
reacción de amplificación de ácidos nucleicos se halla presente uno
de los pares de cebadores con las secuencias
SEC ID Nº. 1/SEC ID Nº. 2 (par de cebadores
1),
SEC ID Nº. 3/SEC ID Nº. 4 (par de cebadores
2),
SEC ID Nº. 5/SEC ID Nº. 6 (par de cebadores
3),
SEC ID Nº. 7/SEC ID Nº. 8 (par de cebadores 4),
y
SEC ID Nº. 9/SEC ID Nº. 10 (par de cebadores
5).
Cada uno de los pares de cebadores puede
utilizarse para la amplificación de una zona de ácidos nucleicos que
abarque al menos una parte de la hélice 54 del ADNr/ARNr de 23S de
bacterias gram-positivas con elevado contenido en
GC. Los cebadores pueden amplificar, en diversa combinación, la zona
de la hélice 54 de todas las bacterias
gram-positivas ricas en G + C. En especial, el
cebador SEC ID Nº. 8 (Figura 1) está capacitado, bajo condiciones
de reacción adecuadas, para unirse de manera específica solamente a
los ácidos nucleicos de bacterias gram-positivas
ricas en G +C. La combinación del cebador SEC ID Nº. 3 (Figura 1)
con SEC ID Nº. 2 (Figura 1) o con SEC ID Nº. 4 (Figura 1),
amplifica de manera altamente específica complejo de M. chelonae,
M. kansasii, M. malmoense, complejo de M.
tuberculosis, M. avium, M. scrophulaceum y M.
interjectum.
La persona experta es consciente que partiendo de
la enseñanza de la presente invención es también posible desarrollar
cebadores que se aparten escasamente de los cebadores conformes a
la invención, pero que sin embargo funcionan. Así, también son
concebibles cebadores que con respecto a los cebadores conformes a
la invención con las secuencias SEC ID Nº^{s}. 1 a 10, presenten
en el extremo 5' y/ó 3' extensiones o acortamientos de por lo menos
uno, dos o tres nucleótidos. En especial, extensiones o
acortamientos en el extremo 5' del cebador pueden seguir
proporcionando cebadores capaces de funcionar, que pueden emplearse
conforme a la invención. También es concebible que nucleótidos
individuales, o unos pocos nucleótidos, de un cebador se hayan
intercambiado por otros nucleótidos, con la condición de que la
especificidad del cebador no se modifique excesivamente y no se
modifique demasiado la temperatura de fusión del cebador. A la
persona experta le es claro que, además de los nucleótidos usuales
A, G, C y T, también es posible llegar a utilizar nucleótidos
modificados, tal como inosina, etc. La enseñanza de la presente
invención posibilita modificaciones de este tipo, partiendo del
objeto de las reivindicaciones.
Conforme a la invención se hibrida una
composición que contiene el producto de amplificación o una parte
del mismo, con una o varias sondas. Las sondas son oligonucleótidos
que tienen una de las secuencias SEC ID Nº^{s}. 11 a 42 o una de
las secuencias complementarias de ellas. Las secuencias de las
sondas individuales están representadas en las Figuras 2A y 2B.
También en el caso de las sondas son concebibles modificaciones de
menor cuantía, sin que se resienta de manera sustancial su
funcionalidad. Las sondas de la presente invención pueden estar
alargadas y/o acortadas en el extremo 5' y/o en el extremo 3' en
unos pocos nucleótidos, preferentemente en a lo sumo tres
nucleótidos, mas preferiblemente a lo sumo dos nucleótidos, y de
manera más preferida todavía, en un nucleótido. También puede
concebirse que un nucleótido, o unos pocos de ellos, se intercambien
en la secuencia de las sondas conformes a la invención por otro
nucleótido, con la condición de que la hibridación siga siendo
posible en la secuencia diana. Esto incluye, en el caso de haber
modificaciones, que la temperatura de fusión de la sonda no difiera
excesivamente de la temperatura de fusión de la sonda original. En
este caso, la temperatura de fusión se calcula según la
fórmula:
Temperatura de
fusión = (número de pares de bases G/C) * 4ºC + (número de pares de
bases A/T) *
2ºC.
En principio, es posible que mediante hibridación
por medio de una única sonda específica se determine la especie de
bacteria. Sin embargo, también es posible hibridar la composición
que contiene el producto de amplificación o una parte del mismo,
con más de una sonda. Con ello se eleva el valor informativo del
procedimiento. Es posible el valor informativo más exacto cuando
una hibridación se lleva a cabo con todas las sondas con las
secuencias SEC ID Nº^{s}. 11 a 42 (o con las secuencias
complementarias de ellas). En este caso, se obtiene un perfil exacto
y puede determinarse la especie de bacteria con una seguridad
elevada. Así, por ejemplo, la sonda SEC ID Nº. 23 (Figura 23A) se
hibrida con ácidos nucleicos de las bacterias M.
Intracelullare, M. scrophulaceum y M. interjectum.
Sin embargo, M. intracellulare también puede separarse
mediante la sonda SEC ID Nº. 24 (Figura 2A) de M.
scrophulaceum y M. interjectum. La sonda SEC ID Nº. 25
(Figura 2A) hibrida con ácidos nucleicos de M. celatum, complejo
de M. chelomea, M. gordonae, M. kansasii, M. malmoense, complejo de
M. tuberculosis, M. scrophulaceum y M. interjectum y
otras especies del género micobacterias, pero hasta donde se sabe
solamente con especies del género micobacterias. Junto con SEC ID
Nº. 23 (Figura 2A) separa las especies M. scrophulaceum y
M. interjectum, según el estado actual del conocimiento, de
todas las otras micobacterias. Rige algo similar para la sonda SEC
ID Nº. 24. La hibridación tiene usualmente lugar de manera que la
composición que contiene el producto de amplificación o una parte
del mismo, o la sonda, se inmoviliza sobre una fase sólida y se
pone en contacto en cada caso con el otro participante que
interviene en la hibridación. En calidad de fases sólidas son
imaginables los materiales más diversos, por ejemplo nailon,
nitrocelulosa, poliestireno, materiales silicáticos, etc. También
es concebible que como fase sólida se emplee una placa de
microtitulación.
Por regla general, se marca al menos una sonda o
al menos un cebador. En este caso, son concebibles los marcajes más
diversos, como por ejemplo, colorantes fluorescentes, biotina o
digoxigenina. Marcajes fluorescentes conocidos son fluoresceína,
FITC, colorantes de cianina, etc. Los marcajes están usualmente
unidos de manera covalente con los oligonucleótidos. Mientras que un
marcaje de fluorescencia puede detectarse de manera directa, es
posible detectar los marcajes de biotina y de digoxigenina después
de incubación con moléculas de unión adecuadas. Por ejemplo, puede
detectarse un oligonucleótido marcado con biotina, poniéndolo en
contacto con una solución que contiene estreptavidina acoplada a una
enzima, en que la enzima, por ejemplo peroxidasa o fosfatasa
alcalina, transforma un substrato, que genera una sustancia
colorante o conduce a quimioluminescencia. Procedimientos de este
tipo son conocidos por la persona experta.
En una forma de realización de la invención, al
menos uno de los cebadores utilizados está marcado. Es preferible
que varios de los cebadores presentes en la reacción estén
marcados. Si se utilizan cebadores marcados, entonces por lo
general las sondas no están marcadas. En esta forma de realización
del procedimiento se inmovilizan las sondas sobre una fase sólida,
y seguidamente esta fase sólida se pone en contacto con la
composición que contiene el producto de amplificación o una parte
del mismo. La ventaja de este procedimiento consiste en que es
posible inmovilizar más de una sonda sobre la fase sólida. Es
preferible que sobre la fase sólida se inmovilicen al menos dos
sondas, más preferentemente por lo menos cinco sondas, más
preferentemente todavía, al menos diez sondas, lo más
preferentemente las sondas con las secuencias SEC ID Nº^{s}. 11 a
42 o con las secuencias complementarias correspondientes. Mediante
incubación del producto de amplificación o de una parte del mismo
con la fase sólida preparada de esta manera con sondas
inmovilizadas, es posible obtener por medio de un único paso de
hibridación una información acerca de la hibridación del producto
de amplificación con todas las sondas inmovilizadas. En este caso,
la fase sólida es preferiblemente un microconjunto ordenado de
sondas inmovilizadas sobre una fase sólida. "Chips de ADN" de
este tipo permiten que sobre una pequeña zona se inmovilice un
elevado número de diversos oligonucleótidos. Las fases sólidas, que
son adecuadas para chips de ADN, consisten preferentemente en
materiales silicáticos, como vidrio, etc. En esta forma de
realización, el marcaje del cebador es preferentemente un marcaje
de fluorescencia. El chip de ADN puede analizarse rápidamente
después de incubación con el producto de amplificación mediante un
dispositivo de escaneo. Los dispositivos de este tipo son conocidos
por la persona experta. Una visión general sobre la tecnología de
los chips la da McGlennen (2001) Miniaturization technologies for
molecular diagnostics. Clin Chem 47 (3),
393-402.
En otra forma de realización, al menos una de las
sondas presenta un marcaje. En este caso se inmoviliza usualmente la
composición que contiene el producto de amplificación o una parte
del mismo, sobre una fase sólida, y se la pone en contacto con una
composición que contiene por lo menos una sonda, que ha sido
seleccionada del grupo consistente en sondas con las secuencias SEC
ID Nº^{s}. 11 a 42 y secuencias complementarias de ellas. También
en esta forma de realización se prefiere llevar a cabo una
hibridación con más de una sonda. Para ello es posible poner a
disposición varias fases sólidas sobre los cuales está inmovilizado
el producto de amplificación. Sin embargo, también es posible
inmovilizar pequeñas cantidades del producto de amplificación sobre
una fase sólida, en varias zonas espacialmente separadas entre sí.
Estos diferentes lugares se ponen entonces en contacto en cada caso
con sondas distintas (hibridación).
La realización del procedimiento de hibridación
es conocida por la persona experta. Así, usualmente después de
incubación se exponen las fases sólidas con la solución que puede
contener los componentes que intervienen en la reacción de
hibridación, a condiciones estrictamente controladas, para separar
moléculas de ácido nucleico unidas de manera no específica. La
hibridación puede llevarse a cabo de manera convencional sobre una
membrana de nailon o de nitrocelulosa, como se ha descrito (Sambrook
et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory,
1989). Los principios mencionados en dicha obra pueden transferirse
por la persona experta a otras formas de realización.
Conforme a la invención a la invención, después
de la hibridación se determina el grado de hibridación. Esto tiene
usualmente lugar determinando la cantidad de marcaje que está unida
a la fase sólida. Las reacciones y los procedimientos de detección,
de este tipo, son de por sí conocidos por la persona experta.
Se divulgan oligonucleótidos que contienen una de
las secuencias SEC ID Nº^{s}. 1 a 42, así como oligonucleótidos
que tienen secuencias que son complementarias con respecto a una de
las secuencias SEC ID Nº^{s}. 11 a 42.
Además, se divulgan composiciones que contienen
por lo menos un oligonucleótido de este tipo. Es preferible que la
composición contenga un par de cebadores, en la que el primer
cebador ha sido seleccionado del grupo consistente en los cebadores
con la secuencias SEC ID Nº. 1, SEC ID Nº. 3, SEC ID Nº. 5, SEC ID
Nº. 7 y SEC ID Nº. 9, y en la que el segundo cebador ha sido
seleccionado del grupo consistente en los cebadores con la
secuencias SEC ID Nº. 2. SEC ID Nº. 4, SEC ID Nº. 6, SEC ID Nº.8 y
SEC ID Nº. 10. Lo más preferible, la composición contiene uno de los
pares de cebadores con las secuencias
SEC ID Nº. 1/SEC ID Nº. 2 (par de cebadores
1),
SEC ID Nº. 3/SEC ID Nº. 4 (par de cebadores
2),
SEC ID Nº. 5/SEC ID Nº. 6 (par de cebadores
3),
SEC ID Nº. 7/SEC ID Nº. 8 (par de cebadores 4),
y
SEC ID Nº. 9/SEC ID Nº. 10 (par de cebadores
5).
Se divulga una fase sólida sobre la que se
encuentra inmovilizado al menos un oligonucleótido con una de las
secuencias SEC ID Nº^{s}. 11 a 42 o con una secuencia
complementaria de ellas. Cuando hay varios oligonucleótidos
inmovilizados, éstos están separados espacialmente entre sí sobre la
fase sólida. Otro aspecto de la invención son los oligonucleótidos
con las secuencias SEC ID Nº^{s}. 11 a 42 o con una secuencia
complementaria de ellas, inmovilizados sobre la fase sólida, estando
la fase sólida configurada como chip de ADN.
Además, la invención se refiere a un kit para la
detección y/o para la identificación de bacterias
gram-positivas con elevado contenido en GC, en
especial micobacterias, que contiene al menos un par de cebadores,
estando el primer cebador seleccionado del grupo consistente en los
cebadores con las secuencias SEC ID Nº. 1, SEC ID Nº. 3, SEC ID Nº.
5, SEC ID Nº. 7 y SEC ID Nº. 9, y estando el segundo cebador
seleccionado del grupo consistente en los cebadores con la
secuencias SEC ID Nº. 2, SEC ID Nº. 4, SEC ID Nº. 6, SEC ID Nº. 8 y
SEC ID Nº.10; y al menos un oligonucleótido con una de las
secuencias SEC ID Nº^{s}. 11 a 42 o con una de las secuencias
complementarias de ellas. Lo más preferible el kit contiene uno de
los pares de cebadores con la secuencias
SEC ID Nº. 1/SEC ID Nº. 2 (par de cebadores
1),
SEC ID Nº. 3/SEC ID Nº. 4 (par de cebadores
2),
SEC ID Nº. 5/SEC ID Nº. 6 (par de cebadores
3),
SEC ID Nº. 7/SEC ID Nº. 8 (par de cebadores 4),
y
SEC ID Nº. 9/SEC ID Nº. 10 (par de cebadores
5).
Las formas de realización preferidas del chip de
ADN y del kit de la presente invención corresponden a aquellas del
procedimiento conforme a la invención.
Finalmente, la invención se refiere también a la
utilización de uno o varios de los oligonucleótidos con las
secuencias SEC ID Nº^{s}. 1 a 10 como cebador en una reacción de
amplificación de ácidos nucleicos para la detección y/o para la
identificación de bacterias gram-positivas con
elevado contenido en GC.
La invención se refiere también a la utilización
de uno o más de los oligonucleótidos con la secuencias SEC ID
Nº^{s}. 11 a 42 o con las secuencias complementarias de ellas,
como sondas en una reacción de hibridación, para la detección y/o
para la identificación de bacterias gram-positivas
de elevado contenido en GC.
Las sondas ARNr/ADNr de 23S aquí descritas y su
utilización para el reconocimiento y la diferenciación de bacterias
de la rama filogenética de las bacterias
gram-positivas con elevado contenido en GC, tienen
gran importancia en la microbiología médica. Por lo general, estas
especies son muy difíciles de diferenciar con métodos morfológicos
o bioquímicos, y/o en virtud de su lento desarrollo retrasan
considerablemente la identificación. Mediante zonas flanqueantes
conservadoras es posible acceder a esta región genética con un
único conjunto de cebadores (cebadores de ampli-
ficación genéricos) de una amplificación de ácidos nucleicos. Con ello es posible el empleo de la tecnología de chip.
ficación genéricos) de una amplificación de ácidos nucleicos. Con ello es posible el empleo de la tecnología de chip.
La Figura 1 muestra las secuencias de ácidos
nucleicos de los cebadores con las secuencias SEC ID Nº^{s}. 1 a
10.
La Figura 2A muestra una composición de las
sondas con las secuencias SEC ID Nº^{s}. 11 a 27 y los organismos
diana asociados en cada caso.
La Figura 2B muestra las secuencias de las sondas
con las secuencias SEC ID Nº^{s}. 28 a 42 y los correspondientes
organismos diana asociados.
Los siguientes ejemplos tienen por objeto
ilustrar la invención con mayor detalle.
Se obtienen ácidos nucleicos bacterianos a partir
de medios nutrientes sólidos, medios líquidos o a partir de material
primario después de tratamiento preliminar correspondiente.
| Especie | Abreviatura | ATCC Nº |
| Mycobacterium avium | M.avi | 25291 |
| Mycobacterium celatum | M.cel | |
| Mycobacterium chelonae | M. che | 14472 |
| Mycobacterium fortuitum | M.fo1 | 6841 |
| Mycobacterium fortuitum | M.fo2 | |
| Mycobacterium peregrinum | M.per | |
| Mycobacterium gordonae | M.gor | 14470 |
| Mycobacterium malmoense | M.mal | 29571 |
| Mycobacterium phlei | M.phl | 11758 |
| Mycobacterium tuberculosis | M.tub | 27294 |
| 25177 | ||
| Mycobacterium xenopi | M.xen | 19971 |
| Mycobacterium intracelullare | M.int | 13950 |
| Mycobacterium scrophulaceum | M.scr | 19981 |
| Mycobacterium interjectum | M.itm | |
| Mycobacterium kansasii | M.kan | 12478 |
| Mycobacterium marinum | M.mar | 827 |
| Escherichia coil | E.col | |
| ADN humano | ADNh | |
| Control Negativo | N-Kon |
Para ello, de medios sólidos se extrajo material
bacteriano mediante un asa de inoculación estéril, y se suspendió en
300 \mul de Tris/HCl 10 mM pH 7,5. De los cultivos líquidos se
extrajo 1 ml, se centrifugó durante 5 min a 13.000 rpm en una
centrifugadora de mesa, se desechó el sobrenadante y se resuspendió
en 300 \mul de Tris/HCl 10 mM pH 7,5. Se licuó material primario
con acetilcisteína y se "descontaminó" con NaOH/SDS. Las
suspensiones de células, así obtenidas, se incubaron durante 15 min
a 95ºC en un termomezclador (Eppendorf, Hamburgo, Alemania), se
sonicaron durante 15 min en un baño de ultrasonidos (Bandelin) y se
centrifugaron durante 10 min a 13.000 rpm en una centrifugadora de
mesa. Del sobrenadante se emplearon en cada caso 5 \mul en la
reacción de amplificación.
Todos los cebadores se sintetizaron
comercialmente (Interactiva, Ulm, Alemania). La tanda de PCR
contenía tampón 1 x Taq (Qiagen, Hilden, Alemania), por cada 1
\muM de cebador, 200 \muM de dNTP (Roche) y 1 U de Hotstar
Taq-polimerasa (Qiagen, Hilden, Alemania). La
amplificación por PCR fue llevada a cabo sobre un Termociclador PE
9600 (ABI, Weitenstadt, Alemania) con 15 min a 95ºC, 10 ciclos con
30 s a 95ºC y 2 min a 60ºC, y con 20 ciclos de 10 s a 95ºC, 50 s a
55ºC y 30 s a 70ºC.
Para la amplificación de ARN con la técnica
NASBA, se utilizó el kit de amplificación NucliSens (Organon
Tecnika, Boxtel, Países Bajos) según las indicaciones del
fabricante:
1. - Producción de la mezcla de amplificación: se
disuelven 8 \mul de "reagent sphere" en tampón "reagent
dilution" (contiene las enzimas necesarias para la reacción), 5
\mul de solución de KCl, concentración final KCl 70 mM y 2 \mul
de solución de cebador, concentración final cebador 0,5 \muM;
2. - Añadir 5 \mul de solución de ARN e incubar
durante 60 min a 41ºC en el baño de agua.
El amplificado de ADN/ARN se detectó con un gel
de agarosa teñido de bromuro de etidio, o por hibridación.
Todas las sondas se biotinilaron en el extremo
5', para poder detectar híbridos de secuencia diana/sonda por medio
de la enzima informadora acoplada a estreptavidina. Como sondas se
emplearon oligonucleótidos con la secuencias SEC ID Nº^{s}. 11 a
27 (véase la Figura 2A).
Papel secante (Blotting Paper GB002, Schleicher
& Schüll, Dassel, Alemania) y una membrana de nailón (Biodyne,
A. Pall, Portsmouth, Inglaterra) se recortaron a las dimensiones
del aparato de transferencia (Minifold Schleicher & Schüll,
Dassel, Alemania), y se imbibieron con 10 x SSC. En las aberturas
del equipo ensamblado se dispusieron 250 \mul de solución de
desnaturalización (NaOH 50 mM; NaCl 1,5 M) y se añadieron mediante
pipeta 20 \mul de amplificado. Después de la aplicación de un
vacío se esperó hasta que todo el líquido hubiese pasado por
completo por succión. Seguidamente se enjuagó con tampón 10 x SSC.
La membrana, después de haberse secado por completo en un
Reticulador de UV (UV-Stratalinker 2400, Stratagene,
La Jolla, EE.UU.) se fijó a 1.200 Joule/cm^{2}, y se lavó con
agua destilada y se secó.
Todas las hibridaciones se llevaron a cabo a 50ºC
en una estufa de hibridación (Hybaid Mini Oven MkII,
MWG-Biotech, Ebersberg, Alemania) en tubos de
vidrio. La membrana revestida de amplificado de ADN/ARN se enrolló
en estado seco y se colocó en un tubo de vidrio. A continuación se
sometió a incubación la membrana bajo rotación constante durante 5
min con tampón de hibridación precalentado. Después de la adición
de 2 pmol de sonda biotinilada tuvo lugar durante una hora la
reacción de hibridación. La sonda, no unida o sólo parcialmente
unida, se separó mediante incubación durante 30 min con
tampón-Stringent a 50ºC con un solo recambio del
tampón Stringent precalentado. Seguidamente se añadió reactivo
bloqueante y se continuó la incubación durante otros 15 min a 37ºC.
Los híbridos se detectaron colorimétricamente mediante un conjugado
de estreptavidina-fosfatasa alcalina por adición de
NBT/BCIP, o autoradiográficamente, mediante el rociado de un
substrato de quimioluminescencia (Lumi-Phos, 530,
Cellmark Diagnostics, Abindon, Inglaterra). A ello se añadió
conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina y se
incubó durante 30 min a 37ºC. A continuación se lavó la membrana
dos veces durante 15 min con tampón substrato. Seguidamente se
separó la membrana, se aplicó reactivo Lumi-Phos por
rociado, seguido por una exposición durante 2 h de una película de
rayos X. Como alternativa a ello, se añadió tampón substrato con
NBT/BCIP y se esperó el desarrollo de color.
Solución 10 x SSC
(Standard-Saline-Citrat, Citrato
Salino Estándar)
NaCl 1,5 M, citrato trisódico 0,15 M;
Tampón de
hibridación:
SDS al 7% (dodecilsulfato de Na), tampón fosfato
0,25 M pH 7,5;
\newpage
Solución de Lavado Stringent
(Tampón
Stringent):
TMCL (cloruro de tetrametilamonio) 3 M, Tris/Cl
50 mM, EDTA 2 mM, SDS al 0,1%;
Solución para desnaturalización de
los sitios de unión de
membrana:
5 g/l de reactivo de bloqueo (Roche) en tampón
ácido maleico pH 7,5 (4,13 g de NaCl y 5,53 g de ácido maleico en
500 ml de agua, el pH se ajustó a 7,5 con NaOH 5 M).
Tampón
substrato:
Tris/Cl 274 mM pH 7,5, citrato de Na_{3} 68,6
mM, NaCl 200 mM, MgCl_{2} 27,4 mM *6 H_{2}O:
BCIP:
50 mg/ml de sal fosfato toluidinio de
5-bromo-3-indonilo
en dimetiformamida al 100%;
NBT:
75 mg/ ml de sal nitro azul tetrazolio en
dimetilformamida al 70%.
Los autorradiogramas se evaluaron
densimétricamente. Como valor 100% se consideró el punto de
amplificado de la especie a partir del cual se derivó la secuencia
de sonda. Como controles se acompañó siempre una muestra a la que en
lugar de solución de ácidos nucleicos se adicionó agua y una muestra
con SDN humano aislado como puntos sobre la membrana.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Con los métodos aquí descritos es posible
identificar y diferenciar las bacterias correspondientes a partir
de material primario (por ejemplo secreciones de tráquea, frotis de
heridas, sangre, y similares) o a partir de medios bacterianos
líquidos o sólidos. En el caso de material no primariamente estéril
es previamente necesario separar mediante procedimientos de
descontaminación usuales la flora acompañante no resistente a los
ácidos. Esto rige tanto para la instalación (equipo de laboratorio)
del cultivo, como también para el tratamiento preliminar de
material primario.
Con los métodos de acuerdo con el Ejemplo 1 se
estudiaron otras muestras con bacterias
gram-positivas con elevado contenido en GC. Las
especies de bacterias estudiadas fueron:
| Corynebacterium amycolatum | C. amy | ATCC Nº |
| Corynebacterium callunae | C. cal | |
| Corynebacterium diphteria gravis | C.dpg | |
| Corynebacterium glutamicum | C.glu | |
| CDC Corynebacterium Grupo G | C.grC | |
| Corynebacterium jeikeium | C.jei | |
| Corynebacterium matrucchoti | C.mat | |
| Corynebacterium minitussimun | C.min | |
| Corynebacterium pseudodiphteriticum | C.pdp | |
| Corynebacterium pseudotuberculosis | C.ptb | |
| Corynebacterium ulcerans | C.ulc | |
| Corynebacterium striatum | C.str | |
| Corynebacterium xerosis | C.xer | 373 |
| Nocardia asteroides | N.ast | |
| Rhodoccus equi | R.equ | |
| Tsukamurelia paurometabolum | T.prm | |
| Escherichia coli | E. col | |
| ADN humano | ADNh | |
| Control negativo | N-Kon |
Como sondas se utilizan oligonucleótidos con las
secuencias SEC ID Nº^{s}. 28 a 42 (véase la Figura 2b).
La evaluación tuvo lugar también como se describe
en el Ejemplo 1. Los resultados se han resumido en la Tabla 4.
<110> Hain Diagnostica GmbH
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<120> Procedimiento para la detección de
bacterias gram-positivas
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> Hain
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<140>
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<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 42
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver, 2,1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADM
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcgatggac aacgggttga t
\hfill21
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtacggcta ccttcctgcg tca
\hfill23
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADH
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggtactaa ccacccaaaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttaccactga ctggtacggc ta
\hfill22
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipggacctaagg cgaggccg
\hfill18
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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\hskip-.1em\dddseqskipgccttcctgc gtcacccc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskipagtgagaatg caggcatgag
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipcttaggatgg ttatagttac ca
\hfill22
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipgcgtaatagc tcact
\hfill15
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 14
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipcggaacttac ccga
\hfill14
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<210> 11
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 16
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskipcgactacgcc tgtcgg
\hfill16
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<210> 13
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
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<210> 16
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<211> 15
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<212> ADM
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
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\hskip-.1em\dddseqskiptggtcacggt ggttt
\hfill15
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<210> 17
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<211> 15
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<212> ADM
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
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<210> 18
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<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADM
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagcacaatt gattc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADM
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggaggttc ggggc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
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\hskip-.1em\dddseqskipatcggccagg ttttg
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<210> 21
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
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<400> 21
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagttctgq ggctg
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<210> 22
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<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 23
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<211> 16
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
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<400> 23
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill16
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 15
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 15
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipacgcscatat acggg
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<210> 26
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<211> 15
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<20> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
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<400> 27
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\hfill15
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<211> 16
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
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<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 17
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccacccgaa tgcctcc
\hfill17
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<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatggatct gctgg
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccataagca cccgc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccaccgcgg atgca
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccaccctga agcgtg
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgcctcgg gatca
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgattgggcg tgttct
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtgtgagac tcattg
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtgtgggtg tgtgt
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
<210) 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttactgtgr ttascct
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcatccttt cgtcac
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatccggacgg attct
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccgccttc gaacct
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccttgatc accttcg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (16)
1. Procedimiento para la detección y/o para la
identificación de bacterias gram-positivas con
elevado contenido en GC, caracterizado porque
a) se somete una composición de muestra a una
reacción de amplificación de ácidos nucleicos, estando presente un
primer cebador que ha sido seleccionado del grupo consistente en
los cebadores con las secuencias SEC ID Nº. 1, SEC ID Nº. 3, SEC ID
Nº. 5, SEC ID Nº. 7 y SEC ID Nº. 9, y estando presente un segundo
cebador que ha sido seleccionado del grupo consistente en los
cebadores con las secuencias SEC ID Nº. 2, SEC ID Nº. 4, SEC ID Nº.
6, SEC ID Nº. 8 y SEC ID Nº. 10;
b) se hibrida una composición que contiene el
producto de amplificación del paso a) o una parte del mismo, con una
o varias sondas, que han sido seleccionadas del grupo consistente
en oligonucleótidos con la secuencias SEC ID Nº^{s}. 11 a 42 y
secuencias complementarias de ellas; y
c) se determina el grado de la hibridación.
2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1,
caracterizado porque la reacción de amplificación de ácidos
nucleicos es una reacción en cadena de polimerasa.
3. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque en la
reacción de amplificación de ácidos nucleicos se encuentrapresente
uno de los pares de cebadores con las secuencias
SEC ID Nº. 1/SEC ID Nº. 2 (par de cebadores
1),
SEC ID Nº. 3/SEC ID Nº. 4 (par de cebadores
2),
SEC ID Nº. 5/SEC ID Nº. 6 (par de cebadores
3),
SEC ID Nº. 7/SEC ID Nº. 8 (par de cebadores 4),
y
SEC ID Nº. 9/SEC ID Nº. 10 (par de cebadores
5).
4. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque por lo
menos una sonda o un cebador está marcado.
5. Procedimiento conforme a la reivindicación 4,
caracterizado porque el marcaje se selecciona del grupo
consistente en marcaje de fluorescencia, biotina y
digoxigenina.
6. Procedimiento conforme a la reivindicación 4 ó
5, caracterizado porque por lo menos uno de los cebadores
presenta un marcaje.
7. Procedimiento conforme a la reivindicación 6,
caracterizado porque una o varias sondas se inmovilizan
sobre una fase sólida y seguidamente la fase sólida se pone en
contacto con la composición que contiene el producto de
amplificación del paso a) o una parte del mismo.
8. Procedimiento conforme a la reivindicación 7,
caracterizado porque sobre la fase sólida se inmovilizan por
lo menos dos sondas.
9. Procedimiento conforme a la reivindicación 7 u
8, caracterizado porque sobre la fase sólida se inmovilizan
las sondas con las secuencias SEC ID Nº^{s}. 11 a 42 o una
secuencia complementaria correspondiente de las mismas, en el que
las sondas individuales están inmovilizadas en zonas espacialmente
separadas entre sí de la fase sóli-
da.
da.
10. Procedimiento conforme a la reivindicación 4
ó 5, caracterizado porque por lo menos una de las sondas
presenta un marcaje.
11. Procedimiento conforme a la reivindicación
10, caracterizado porque el producto de amplificación o una
parte del mismo se inmoviliza sobre una fase sólida y se pone en
contacto con una composición que contiene por lo menos una sonda que
ha sido seleccionada del grupo consistente en sondas con las
secuencias SEC ID Nº^{s}. 1 a 42 y secuencias complementarias de
ellas.
12. Kit para la detección o para la
identificación de bacterias gram-positivas con
elevado contenido en GC, que contiene
a) al menos un par de cebadores, en el que el
primer cebador ha sido seleccionado del grupo consistente en los
cebadores con la secuencias SEC ID Nº. 1, SEC ID Nº. 3, SEC ID Nº.
5, SEC ID Nº. 7 y SEC ID Nº. 9, y el segundo cebador ha sido
seleccionado del grupo consistente en los cebadores con la
secuencias SEC ID Nº. 2, SEC ID Nº. 4, SEC ID Nº. 6, SEC ID Nº. 8 y
SEC ID Nº. 10;
b) al menos un oligonucleótido con una secuencia
que ha sido seleccionada del grupo consistente en las secuencias SEC
ID Nº^{s}. 11 a 42 y secuencias complementarias de ellas.
13. Kit conforme a la reivindicación 13, que
contiene uno de los pares de cebadores
SEC ID Nº. 1/SEC ID Nº. 2 (par de cebadores
1),
SEC ID Nº. 3/SEC ID Nº. 4 (par de cebadores
2),
SEC ID Nº. 5/SEC ID Nº. 6 (par de cebadores
3),
SEC ID Nº. 7/SEC ID Nº. 8 (par de cebadores 4),
y
SEC ID Nº. 9/SEC ID Nº. 10 (par de cebadores
5).
14. Uso de uno o varios de los oligonucleótidos
con las secuencias SEC ID Nº^{s}. 1 a 10 como cebador en una
reacción de amplificación de ácidos nucleicos, en la que se lleva a
cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos para la
detección y/o para la identificación de bacterias
gram-positivas con elevado contenido en GC.
15. Uso de uno o varios de los oligonucleótidos
con las secuencias SEC ID Nº^{s}. 11 a 42 o de las secuencias
complementarias de ellas como sondas en una reacción de
hibridación, en el que se lleva a cabo la reacción de hibridación
para la detección y/o para identificación de bacterias
gram-positivas con elevado contenido en GC.
16. Chip de ADN con una fase sólida, sobre la
cual están inmovilizados los oligonucleótidos con las secuencias SEC
ID Nº^{s}. 11 a 42 o con una de las secuencias complementarias de
ellas, estando los diversos oligonucleótidos separados
espacialmente entre sí.
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