ES2249907T3 - Anticuerpos de union cd40 y peptidos ctl para el tratamiento de tumores. - Google Patents
Anticuerpos de union cd40 y peptidos ctl para el tratamiento de tumores.Info
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Abstract
La invención incluye anticuerpos de enlace CD40 junto con péptidos activadores de CTL, incluyendo antígenos tumorales, en una composición farmacéutica. Dicha composición sirve para aumentar el efecto antitumoral de un vacuna tumoral a base de péptidos, o al contrario para la activación de CTLs de tal forma que las CTLs activadas puedan actuar contra las células tumorales o infectadas. Los ligandos CD40 incluyen moléculas de anticuerpo, que incluyen fragmentos de inmunoglobulina como los Fab, (Fab¿)2 y Fv, los péptidos activadores de CTL incluyen el péptido E1A derivado de un adenovirus, que posee la secuencia SGPSNTPPEI (SEC ID NO:2), y el péptido E7 del HPV16 derivado de un papilomavirus humano de tipo 16, que posee la secuencia RAHYNIVTF (SEC ID NO:3). El anticuerpo de enlace CD40 y el péptido activador de CTL puede ser administrado a un paciente mediante medios adecuados, incluyendo una inyección, o se pueden administrar construcciones genéticas que codifiquen tal molécula y péptido, lamolécula y el péptido siendo producidos de ese modo in vivo o ex vivo. Dicha terapia genética se realiza según unos métodos muy conocidos en la técnica. Si la transfección o infección de las construcciones genéticas es efectuada ex vivo, las células infectadas o modificadas pueden ser administradas al paciente, o estas fases pueden ser realizadas in vivo por lo que el anticuerpo y el péptido son producidos endógenamente. La transfección o infección, si es efectuada ex vivo, puede ser realizada mediante métodos convencionales, incluyendo electroporación, transfección de fosfato cálcico, microinyección o incorporando las construcciones genéticas en liposomas adecuados. Vectores, incluyendo un vector de retrovirus, adenovirus o de parvovirus, o plásmidos, pueden ser utilizados para incorporar las construcciones genéticas, que son expresadas posteriormente in vivo o ex vivo.
Description
Anticuerpos de unión CD40 y péptidos CTL para el
tratamiento de tumores.
La invención incluye ligandos CD40 junto con
péptidos activadores de CTL, incluyendo antígenos tumorales, en una
composición farmacéutica.
Muchos tumores escapan a la vigilancia de nuestra
sistema inmunitario. En pacientes cancerosos existe claramente una
carencia cuantitativa y/o cualitativa de mecanismos específicos del
sistema inmunológico para eliminar células tumorales. Uno de estos
mecanismos está provisto por las células citotóxicas T (CTL) que
pueden reconocer y matar las células infectadas por un virus o
transformadas en células cancerosas. Previamente se postuló que las
células dendríticas (DC) estimulan las células T cooperadoras que, a
su vez, proporcionan cooperación para la activación de CTL. Los
presentes inventores han demostrado que la célula T cooperadora no
provee señales cooperadoras directamente a las CTL (por secreción
de IL2), sino más bien, la célula T cooperadora provee una señal a
las DC que induce una superficie de célula aún no caracterizada y/o
moléculas solubles que pueden activar las CTL en ausencia de
células T cooperadoras. La señal proporcionada por la célula T
cooperadora a las DC es mediada por una interacción de
CD40L-CD40. Este nuevo resultado ha aportado una
oportunidad única para la inmunoterapia cancerosa.
El sistema inmunitario es capaz de matar células
autólogas cuando éstas son infectadas por un virus o cuando se
transforman en células cancerosas. Este mecanismo potencialmente
peligroso debe estar, evidentemente, bajo control estricto. El
sistema inmunológico de CTL circula como precursores inactivos.
Para ser activada, la célula asesina T precursora debe reconocer su
péptido antígeno específico, que se presenta en forma de moléculas
MCH de clase I en APC profesionales. No obstante, con el fin de
preparar estas células T, las APC también necesitan que el antígeno
esté presente en un contexto coestimulador apropiado provisto por,
entre otras, las moléculas de superficie coestimuladoras B7.1 y
B7.2 y por la linfoquina IL-12.
Hasta hace poco se ha considerado que una célula
T cooperadora que reconoce el mismo antígeno en la misma APC
necesita activar completamente las CTL. La célula T cooperadora
específica va a proporcionar citoquinas tales como la
IL-2 necesaria para la activación de las CTL.
Guerder y Matzinger (J. Exp. Med. 176:553 (1992)), sin
embargo, propusieron el modelo "de licencia" para una
activación de CTL. En este modelo se ha sugerido que la célula T
cooperadora, cuando reconoce su antígeno en una APC profesional,
emita una señal de activación a las APC y el resultado es que sería
capaz de activar posteriormente una CTL sin necesitar la presencia
de la célula T cooperadora. Fue sólo muy recientemente, cuando se
averiguó el mecanismo molecular del modelo de licencia.
Schoenberger et al. (Nature 393:480 (1998)),
describieron el papel de la vía de CD40L-CD40 en el
modelo de licencia. Una interacción entre una célula T cooperadora
y DC a través de la fijación de CD40-CD40L produce
una activación de la DC, y permite así que la DC cebe de manera
eficiente la CTL naive.
Las DC circulan por los tejidos de nuestro cuerpo
y de esta manera pueden recoger, procesar y presentar antígenos.
Después de la recogida de antígenos, éstas migran hacia los
ganglios linfáticos de drenaje donde presentan antígenos a las
células T. Se conoce el hecho de que una DC necesita ser activada
para actuar de manera óptima. Las DC latentes sólo expresan niveles
modestos de MCH y de moléculas coestimuladoras y son unos
estimuladores pobres de células T. Las DC pueden ser activadas por
citoquinas inflamatorias y productos bacterianos, con los que se
consigue una sobrerregulación de las MCH y de las moléculas
coestimuladoras. La activación de las DC en DC totalmente maduras,
que expresan unos niveles óptimos de moléculas MCH, moléculas
coestimuladoras y linfoquinas tales como la IL-12,
requiere una estimulación adicional de estas células a través del
receptor CD40. Por consiguiente, con la combinación de citoquinas
inflamatorias en el lugar de absorción de antígeno y la interacción
de CD40L-CD40 durante la interacción de una célula
T cooperadora se consigue una capacidad óptima para permitir a la
DC la activación de las CTL.
Muchos tumores escapan a la vigilancia
inmunológica mediante unos mecanismos específicos de las CTL. Si
las DC reúnen antígenos tumorales en condiciones no inflamatorias
el número de células T cooperadoras que son activadas puede ser
demasiado inferior para inducir suficientes CTL que activar para
inducir una reacción antitumoral apropiada. Este concepto ha
incitado a los investigadores a ayudar al sistema inmunitario
mediante la administración de citoquinas tales como
IL-2 y IL-12 que estimulan
directamente la actividad de las CTL o intensificando la
presentación de antígenos mediante la administración de células
tumorales transfectadas con GM-CSF. Estas
estrategias han producido resultados variables pero alentadores.
Resulta evidente que todavía existe una gran
necesidad de encontrar formas para generar y/o mejorar las
reacciones protectoras antitumorales que impliquen una inmunidad
celular y humoral. La vía de activación de CD40 resultó ser una vía
inmunorreguladora más importante para la generación de reacciones
inmunológicas humorales primarias y celulares. En el modo descrito
anteriormente, la vía de CD40 en DC es responsable de la inducción
de reacciones antitumorales de las CTL. Además, la activación de la
vía de CD40 en macrófagos estimula una fuerte actividad
tumoricida.
La invención incluye anticuerpos de enlace CD40
junto con péptidos activadores de CTL, incluyendo antígenos
tumorales, en una composición farmacéutica. Dicha composición sirve
para aumentar el efecto antitumoral de un vacuna tumoral a base de
péptidos, o al contrario para la activación de CTLs de tal forma
que las CTLs activadas puedan actuar contra las células tumorales o
infectadas. Los ligandos CD40 incluyen moléculas de anticuerpo, que
incluyen fragmentos de inmunoglobulina como los Fab, (Fab')_{2} y
Fv, los péptidos activadores de CTL incluyen el péptido E1A
derivado de un adenovirus, que posee la secuencia SGPSNTPPEI (SEC
ID NO:2), y el péptido E7 del HPV16 derivado de un papilomavirus
humano de tipo 16, que posee la secuencia RAHYNIVTF (SEC ID
NO:3).
El anticuerpo de enlace CD40 y el péptido
activador de CTL puede ser administrado a un paciente mediante
medios adecuados, incluyendo una inyección, o se pueden administrar
construcciones genéticas que codifiquen tal molécula y péptido, la
molécula y el péptido siendo producidos de ese modo in vivo
o ex vivo. Dicha terapia genética se realiza según unos
métodos muy conocidos en la técnica. Si la transfección o
infección de las construcciones genéticas es efectuada ex
vivo, las células infectadas o modificadas pueden ser
administradas al paciente, o estas fases pueden ser realizadas in
vivo por lo que el anticuerpo y el péptido son producidos
endógenamente. La transfección o infección, si es efectuada ex
vivo, puede ser realizada mediante métodos convencionales,
incluyendo electroporación, transfección de fosfato cálcico,
microinyección o incorporando las construcciones genéticas en
liposomas adecuados. Vectores, incluyendo un vector de retrovirus,
adenovirus o de parvovirus, o plásmidos, pueden ser utilizados para
incorporar las construcciones genéticas, que son expresadas
posteriormente in vivo o ex vivo.
Aquí se demuestra que la célula T cooperadora
para el cebado de CTL es mediada por interacciones del ligando
CD40-CD40 (CD40L), y que la carencia de cebado de
CTL en ausencia de células CD4^{+} T pueden ser restituida por un
anticuerpo monoclonal (mAb) mediado por una activación de CD40 de
APC derivada de la médula ósea en presencia de péptidos activadores
de CTL incluyendo antígenos tumorales. Además, un bloqueo de CD40L,
expresado por células CD4^{+} T, produce un fracaso del aumento de
la inmunidad de CTL. Este defecto puede ser superado por una
estimulación in vivo de CD40. La estimulación in vivo
de CD40 puede mejorar notablemente la eficacia de las vacunas
antitumorales a base de péptidos, o al contrario activar las CTLs
para conseguir una reacción de la célula antitumoral o
antiinfectada.
También se debe tener en cuenta que un péptido
activador de CTL puede volverse tolerogénico, lo que significa que
la reacción huésped contra las células de expresión de dicho
péptido es inhibida en ausencia de anti-CD40. No
obstante, dicho péptido combinado con un anticuerpo
anti-CD40 activador convierte la tolerización en
una activación fuerte de CTL. Además, como se indicó anteriormente,
una ligación de CD40 puede proporcionar una vacuna protectora a
base de péptido específica del tumor que puede inducir una
inmunidad de CTL terapéutica en ratones con tumor.
Estos descubrimientos juntos demuestran que el
par de ligando CD40-CD40 actúa como un interruptor
que determina si las CTL periféricas naives son cebadas o
toleradas. En consecuencia los agentes de enlace de CD40 tales como
anticuerpos monoclonales y otros ligandos estimuladores pueden ser
utilizados de manera eficaz en combinación con un péptido activador
de CTL.
Figura
1
Unos esplenocitos de ratones normales (a) o
ratones B6 con reducción de CD4 (b) inmunizados con MECs de
Ad5E1-BALB/c fueron sometidos a unas pruebas con
varias proporciones efector/diana para determinar una tisis de
células singénicas MEC cargadas con el peptido
E1B_{192-200} (líneas continuas), que es
derivado de un adenovirus humano y posee la secuencia VNIRNCCYI
(SEC ID NO:1) o un péptido restringido D^{d} de control
HPV-16 E_{749-57} (líneas
discontinuas). Cada línea representa un ratón. Los datos mostrados
representan un experimento de tres realizados con resultados
similares.
Figura
2
Uno esplenocitos de ratones B6 con reducción de
CD4 (a, b) o ratones bloqueados con deficiencia de
I-Ab de clase II (KO) (c, d) fueron inmunizados con
MECs de Ad5E1-BALB/c y tratados con o bien el
anticuerpo FGK45 (a, c) activador de CD40 (Ab) o un anticuerpo
isotipo de control (b, d). Estos esplenocitos fueron evaluados para
determinar una actividad de CTL E1B específico en células
singénicas asignadas MEC cargadas o bien con el péptido
E1B_{192-200} (líneas continuas) o con el péptido
de control HPV-16E_{749-57}
(líneas discontinuas). Cada línea representa un único ratón. Los
datos indicados provienen de dos experimentos independientes.
Proporción E/T, proporción efector/diana.
\newpage
Figura
3
Se extrajeron unos espenocitos de unos ratones B6
MT no tratados (a), deficientes de célula B con reducción de CD4
(b, c), que fueron inmunizados con MECs de
Ad5E1-BALB/C y que recibieron o bien un anticuerpo
isotipo de control (b) o el anticuerpo FGK45 activador de CD40 (c).
Estos esplenocitos fueron evaluados para determinar una actividad
CTL E1B específico en células diana singénicas MEC cargadas con o
bien el péptido E1B_{192-200} (líneas continuas)
o el péptido de control HPV E7_{49-57} (líneas
discontinuas). Cada línea representa un ratón. Los datos mostrados
representan un experimento de dos realizados con resultados
similares.
Figura
4
Se extrajeron unos esplenocitos de ratones B6
inmunizados con MECs de Ad5E1-BALB/c y tratados con
el anticuerpo MR-1 de bloqueo CD40L (a), o
anticuerpo de control (b), o de ratones tratados con el anticuerpo
MR-1 de bloqueo de CD40L en combinación con el
anticuerpo FGK45 activador de CD40 (c) 24 h después de la
inmunización. Estos esplenocitos fueron evaluados para determinar
la actividad de CTL E1B específico en células diana singénicas MEC
cargadas con el péptido E1B_{192-200} (líneas
continuas) o el peptido de control HPV-16
E7_{49-57} (líneas discontinuas). Cada línea
representa un ratón. Los datos mostrados representan un experimento
de tres realizados con resultados similares. Proporción E/T,
proporción efector/diana.
Figura
5
Unos ratones C57BL/6 fueron inyectados s.c. dos
veces (en un intervalo de una semana) con 20 \mug de péptido E1A
(a, b) o péptido de control (c, d) en IFA, y con un provocador i.p.
1 día más tarde con SAMB7 (b, d), una línea celular de expresión de
cantidades elevadas de péptido E1A. Unos cultivos masivos derivados
de estos ratones fueron evaluados para determinar la citotoxicidad
específica en células diana de E1A pulsadas con el péptido E1A
(-\blacksquare-) o el péptido HPV16 E7 (-\medcirc-). Se muestra
una tisis específica de cultivos masivos representativos en
distintas proporciones de efector a diana (E/T). Este experimento
ha sido repetido 4 veces con resultados comparables.
Figura
6
Unas células de bazo derivadas de ratones no
tratados C57BL/6 (-), o de ratones inyectados s.c. 16 horas antes
con 100 \mug de péptido HPV16 E1A o E7 en IFA fueron utilizadas
como células estimuladoras para un clon de CTL E1A específico. Se
muestra la incorporación (cpm) de timidina [^{3}H] +/- S.E.M
para distintos efectores de concentraciones estimuladoras, sin
sustracción de contenidos anteriores. Los resultados son
representativos de 5 experimentos independientes.
Fiqura
7
Un tipo de ratones salvajes C57BL/6 (a, b) y de
ratones H-2^{b} CD404^{-/-} (c, d) fueron
inyectados s.c. con 20 \mug de péptido E1A en IFA solo (c), en
combinación con un anticuerpo de control de rata IgG2a (a), o en
combinación con el mAb anti-CD40
FGK-45 (b, d). Los cultivos masivos de estos ratones
fueron evaluados para determinar la citotoxicidad específica de E1A
en células diana pulsadas con el péptido E1A (-\blacksquare-), el
peptido HPV16 E7 (-\medcirc-) o células tumorales transformadas
Ad5E1 (-\blacklozenge-). Se muestra una lisis específica de
cultivos masivos representativos de diferentes proporciones E/T.
Este experimento ha sido repetido 18 veces (ratones B6) y 2 veces
(ratones CD40-/-), respectivamente, con resultados comparables. En
(e) se muestra el % de tisis específico de 23 respectivamente 37
cultivos masivos de CTL derivados de ratones B6 inyectados con
péptido E1A en IFA solo (izquierda) o en combinación con el mAb
anti-CD40 (derecha) en un E/T de 60. Se muestra una
desviación media más estándar de cada grupo (E1A contra
E1A+anti-CD40: p<0.01, prueba T de Student).
Figura
8
Unos ratones fueron inyectados s.c. con 25.000
células singénicas transformadas (TC-1) HPV16. Unos
ratones C57BL/6 permanecieron sin tratamiento (-\medcirc-) o
después de 6 días recibieron 100 \mug de péptido HPV16 E7 i.p.
en IFA (-\square-), 100 \mug de peptido HPV16 E7 i.p. en IFA en
combinación con el mAb FGK-45
anti-CD40 (-\blacksquare-) o un péptido de
control i.p. en IFA en combinación con el mAb FGK-45
anti-CD40 (-\medbullet-). El porcentaje de
ratones con tumores está indicado para distintos grupos de
tratamiento (n=10) en (a). Las diferencias entre el grupo tratado
con el péptido HPV16 más el mAb anti-CD40, y los
otros tres grupos eran estadísticamente significantes (p<0.01)
(prueba Log-Rank). En (b) se muestra el porcentaje
de animales supervivientes (grupo tratado con péptido E7 contra
grupo tratado con péptido E7 más anti-CD40: p =
0.002, prueba Log-Rank).
Los anticuerpos de enlace CD40 de la invención
pueden ser formados mediante una producción convencional y técnicas
de selección. Los anticuerpos monoclonales de CD40
anti-ratón de rata y de hámster ("Mabs") están
descritos cada uno en Nature 393: 474-77
(1998) y están disponibles comercialmente (Pharmingen, Inc., CA).
El MAb de CD40 anti-ratón, designado por FGK45, que
es utilizado en los experimentos descritos a continuación, está
descrito por Rolink. A. et al., Inmunity
319-330 (1996). Los MAbs de CD40
anti-humano puede ser formados con las técnicas
siguientes muy conocidas en la técnia, y descritas por G. Köhler y
C. Milstein (Nature, 1975: 256: 495-497).
Los MAbs pueden ser cultivados inmunizando roedores (por ejemplo
ratones, ratas, hámsters y conejillos de India) o bien con CD40
naive tal como se expresan en células o purificados a partir de
plasma o de orina humanos, o de CD40 recombinante o de sus
fragmentos, expresados en un sistema eucariótico o procariótico. Se
pueden utilizar otros animales para la inmunización, por ejemplo
primates no humanos, ratones transgénicos que expresen
inmunoglobulinas humanas y ratones con inmunodeficiencia combinada
severa (SCID) transplantados con limfocitos humanos B. Se pueden
generar hibridomas mediante procedimientos convencionales por medio
de una fusión de limfocitos B de animales inmunizados con células
de mieloma (por ejemplo Sp2/0 y NS0), tal como está descrito por G.
Köhler y C. Milstein Id. Además, los MAbs
anti-CD40 pueden ser generados mediante un filtrado
de bibliotecas monocatenarias recombinantes Fv o Fab de limfocitos
humanos B en sistemas expresados en fagos. La especificidad de los
MAbs con respecto a las CD40 pueden ser evaluada mediante un ensayo
immunoenzimático ligado a enzimas (ELISA), inmunoimpresión
occidental, u otras técnicas inmunoquímicas. La actividad
activadora de los anticuerpos en CTLs, en combinación con un
péptido activador de CTL, puede ser determinada mediante los ensayos
descritos en los ejemplos más abajo.
Para tratar seres humanos, los MAbs
anti-CD40 son usados preferiblemente en forma
quimérica, desinmunizada, humana o como anticuerpos humanos. Estos
anticuerpos pueden reducir la inmunogenicidad y de esta manera
evitar una reacción humana al anticuerpo anti-ratón
(HAMA). Se prefiere que el anticuerpo IgG4, IgG2, u otro IgG o IgM
mutado genéticamente no aumente la citotoxicidad celular
dependiente del anticuerpo (S.M. Canfield y S.L. Morrison, J.
Exp. Med., 1991: 173: 1483-1491) y complemente
una citolisis mediada (Y.Xu et al., J. Biol. Chem.,
1994: 269: 3468-3474; V.L. Pulito et al.,
J. Immunol., 1996; 156: 2840-2850).
Los anticuerpos quiméricos son producidos
mediante procesos recombinantes conocidos en la técnica, y poseen
una región variable animal y un región constante humana. Los
anticuerpos humanos presentan un grado superior de secuencias
péptidas humanas que los anticuerpos quiméricos. En un anticuerpo
humano, sólo las regiones determinantes complementarias (CDRs) que
son responsables del enlace antígeno y de la especificidad son
derivados animales y poseen una secuencia de aminoácidos que
corresponde al anticuerpo animal, y sustancialmente todas las
partes restantes de la molécula (excepto, en algunos casos, las
porciones pequeñas de las regiones de estructura situadas dentro de
la región variable) son derivados humanos y corresponden a una
secuencia aminoácida de un anticuerpo humano. Ver L. Riechmann
et al., Nature, 1988; 332: 323-327; G.
Winter, United States Patent No. 5,225,539; C.Queen et
al., Patente US No. 5,530,101.
Los anticuerpos desinmunizados son anticuerpos en
los que los epítopos de células T y B han sido eliminados, como se
describe en la Solicitud de Patente Internacional PCT/GB98/01473.
Estos reducen la inmunogenicidad cuando son aplicados in
vivo.
Se pueden formar anticuerpos humanos de distintas
maneras, incluyendo el uso de bibliotecas de expresión de la
inmunoglobulina humana (Stratagene Corp., La Jolla, California)
para producir fragmentos de anticuerpos humanos (VH, VL, Fv, Fd,
Fab, o (Fab')_{2}, y utilizar estos fragmentos para construir
anticuerpos humanos completos utilizando técnicas similares a las
que se utilizan para producir anticuerpos quiméricos. Los
anticuerpos humanos pueden ser producidos también en ratones
transgénicos con un genoma de inmunoglobulina humana. Dichos
ratones son comercializados por Abgenix, Inc., Fremont, California,
y Medarex, Inc., Annandale, New Jersey.
También se pueden crear ligandos individuales de
cadena de péptidos en las que unas regiones Fv de cadena pesada y
ligera están conectadas. Los anticuerpos de cadena simple
("ScFv") y su método de construcción están descritos en la
Patente U.S. N°. 4.946.778. De manera alternativa, los Fab pueden
ser construidos y expresados por medios similares (M.J. Evans et
al., J.Immunol.Meth., 1995; 184:
123-138). Todos los anticuerpos humanos completa y
parcialmente son menos inmunogénicos que los MAbs murinos completos,
y los fragmentos y anticuerpos de cadena simple son menos
inmunogénicos también. Todos estos tipos de anticuerpos por lo tanto
tienen menos probabilidades de producir una reacción inmunológica o
alérgica. En consecuencia, son más apropiados para una
administración in vivo en seres humanos que los anticuerpos
animales al completo, especialmente cuando se necesita una
administración repetida o a largo plazo. Además, el tamaño más
pequeño del fragmento de anticuerpo puede ayudar a mejorar la
biodisponibilidad de un tejido, que puede ser fundamental para una
mejor acumulación de dosis en casos de enfermedad grave, tal como
para el tratamiento de tumores.
En base a las estructuras moleculares de las
regiones variables de los mAbs anti-CD40 o de los
péptidos activadores de CT conocidos, se puede utilizar un diseño
molecular modelado y molecular racional para generar y seleccionar
las moléculas que imitan las estructuras moleculares de la región
de enlace de los anticuerpos o de los péptidos, respectivamente, y
activadores de CTLs. Estas pequeñas moléculas pueden ser péptidos,
peptidomiméticos, oligonucleótidos, u otros compuestos orgánicos.
Las moléculas imitadoras pueden ser usadas para el tratamiento de
cánceres e infecciones. De manera alternativa, se pueden usar
procedimientos de selección a gran escala comúnmente usados en este
campo para aislar las moléculas apropiadas de bibliotecas de
compuestos.
La dosificación de los anticuerpos de enlace CD40
de la invención puede ser determinada fácilmente mediante una
extrapolación a partir de pruebas y ensayos in vitro
descritos a continuación, o de experimentos animales o a partir de
procesos clínicos humanos. Los anticuerpos de la invención serán
preferiblemente administrados por inyección, los ensayos y pruebas
que demuestran la eficacia de la invención están descritos a
continuación.
Se utilizó un sistema de modelo bien
caracterizado para probar el mecanismo de cooperación de las
células T para la activación primaria de las respuestas de CD8+CTL
in vivo. Unos ratones C57BL/6 (con el complejo principal de
histocompatibilidad (MCH) H-2^{b}) inmunizados con
unas células embrionarias de ratón (MECs) alogénicas BALB/C
(H-2^{d}) de expresión de una región temprana 1
de un adenovirus humano de tipo 5 (MECs Ad5EI- BALB/C) generaron
fuertes reacciones de CTL contra un epítopo restringido
H-2D^{b} de la proteina de adenovirus EIB
(EIB_{192-200}) (Figura 1a). Puesto que las
moléculas de MHC alogeneicas H-2^{d} expresadas
por los MECs Ad5EI-BALC/c no pueden cebar los CTLs
huésped restringidos de H-2^{b}, la generación de
CTLs específicas de E1B debe requerir un cebado cruzado, que es, la
incorporación y representación restringida de
H-2^{b} de antígeno por los APCs huésped. Un
cebado cruzado de CTLs E1B específico es estrictamente
cooperador-dependiente (Figura 1b), puesto que los
ratones con reducción de células (T_{h})T cooperadoras de
CD4+ antes de la inmunización ya no alcanzaban una reacción de CTL
E1B específico.
Para investigar si la transmisión a través de
CD40 puede reemplazar las células T cooperadoras de CD4+ en un
cebado de CTL, se redujeron in vivo unas células T de CD4+
en ratones antes de la inmunización con MECs Ad5E1BALB/c. Un día
después de la inmunización, los ratones recibieron una única
inyección del anticuerpo activador de CD40
anti-ratón mAb FGK45, o un anticuerpo de control
conjugado de isotipo. La administración de FGK45 a ratones
inmunizados pobres de CD4, produjo el restablecimiento eficiente de
las reacciones de CTL E1B específico (Figura 2a) mientras que éstas
no se produjeron durante el tratamiento con los anticuerpos de
control (Figura 2b). El cebado de CTLs E1B específico no fue
detectado en ratones naives tratados con FGK45 solo (no mostrado).
Para tratar la posibilidad de que el efecto de FGK45 fuera mediado
a través de células D4+ latentes que no fueron reducidas por el
tratamiento con el anticuerpo anti-CD4, unos ratones
bloqueados B6 I-A^{b}, con reducción de células T
periféricas de CD4+ funcional maduras, fueron inmunizados con MECs
Ad5EI-BALB/C. La reacción a la inmunización en
estos ratones refleja lo que se ha podido ver en los ratones pobres
en CD4, en los que las CTLs E1B específico sólo podían ser
detectadas en ratones que recibieron el anticuerpo activador de
CD40 (Figura 2c), y no en los que recibieron el anticuerpo de
control (Figura 2d).
También se estudió si la necesidad de anticuerpos
anti-CD40 para el cebado de CTLs en ratones pobres
en CD4 puede ser reemplazada por lipopolisacarido bacteriano (LPS)
(50 \mug por intravenosa), un inductor potente de citoquinas
proinflamatorias, o por administración de IL-2 (1 x
10^{5} unidades en un adyuvante incompleto Freund, subcutáneo)
seguido de una inmunización con MECs Ad5EI-BALB/c.
Mientras que los ratones pobres en CD4 tratados con FGK45
presentaron una fuerte actividad de CTL E1B específico, ni el
tratamiento de LPS o el de IL-2 produjeron un cebado
de CTL detectable (no mostrado).
La ligación de CD40 en células B regula su
actividad coestimuladora, lo que sugiere una función para estas
células en el restablecimiento de un cebado de CTL mediante el
tratamiento con unos anticuerpos activadores de CD40. Para tratar
esta cuestión, unos ratones B6 MT, presentando una deficiencia de
células maduras B, fueron inmunizados con los MECs alogeneicos
Ad5EI-BALB/c. El cebado cruzado de CTLs E1B
específico no requería las células maduras B (Figura 3a). No
obstante, cuando eran pobres en células CD4+, los ratones con
deficiencia de células B no generaban una reacción de CTL E1B
específico (Figura 3b). La activación a través de CD40 con el
anticuerpo monoclonal FGK45 restituía completamente la capacidad de
los ratones MT pobres en CD4 para cebar los CTLs E1B específico
(Figura 3c). De esta manera no se necesitaron células B tales como
APCs o células secundarias para el cebado cruzado en este sistema
modelo, ni tampoco fueron necesarias para el restablecimiento
mediado por CD40 del cebado cruzado de CTLs en ausencia de células
T cooperadoras de CD4+. Estos resultados demuestran que la
activación de APC derivado de una médula ósea a través de CD40
puede desviarse del requisito de las células T cooperadoras de CD4+
en el cebado cruzado de CTLs E1B específico.
\newpage
Si la interacción CD40L-CD40
representa la vía fisiológica utilizada por células T cooperadoras
de CD4+ para cooperar con las CTLs, el bloqueo de la capacidad de
las células T de CD4+ para interactuar con APC a través de una
interacción CD40L-CD40 será deseada con el fin de
disminuir el cebado de las reacciones de CTL E1B específico en
ratones normales. Unos ratones B6 fueron inmunizados con MECs
Ad5E1-BALB/c y posteriormente tratados con, o bien
el anticuerpo MR1 de bloqueo de CD40L o el anticuerpo de control. El
bloqueo de CD40L produce unas reacciones de CTL E1B específico
drásticamente reducidas (Figura 4a) en comparación con la eficiencia
del cebado de CTL que se ha visto en ratones que han recibido los
anticuerpos de control (Figura 4b). La falta de cebado inducido por
un bloqueo de CD40L fue completamente restablecida después de la
transmisión de CD40 por FGK45 (Figura 4c). Por lo que, la falta de
cebado de CTL inducido por el bloqueo de CD40L reside en la
deficiencia de las células T_{H} para transmitir, mejor que
recibir, señales mediadas por CD40L.
Un sistema modelo descrito previamente ha sido
utilizado (Toes et al., J. Immunol. 156:3911 (1996)).
Se ha mostrado que la vacunación s.c. con el epítopo de CTL
derivado de Ad5E1A de SGPSNTPPEI (SEC ID NO: 2) en IFA impide
controlar en ratones la excrecencia de tumores de expresión de
Ad5E1A. Esto indica que la vacuna E1A/IFA indujo más bien una
supresión que una inducción de la inmunidad de CTL E1A específico.
Además, la administración de la vacuna E1A/IFA en ratones
transgénicos (TCR) receptores de células T, que expresa las cadenas
TCR \alpha y \beta de un clon de CTL E1A específico, elimina
esencialmente una inmunidad mediada por CTL específica de un tumor.
Estos experimentos examinaron los efectos de una administración de
péptidos en una población monoclonal de CTL. Para establecer si una
vacunación s.c. de péptidos E1A induce también una tolerancia de CTL
E1A específico en el nivel policlonal de CTL, unos ratones de tipo
salvaje C57BL/6 (wt) fueron inyectados con o bien el peptido E1A
(Figura 5a y 5b) o con un péptido de control (Figura 5c y 5d). Un
día más tarde los ratones fueron estimulados con una línea celular
singénica expresando altos niveles de del péptido E1A en su
superficie (Figura 5b y 5d). Una inyección de esta línea celular en
ratones cebados con el péptido de control induce fácilmente una
inmunidad específica de E1A (Figura 5d). No obstante, la capacidad
de los ratones para alcanzar respuestas de CTL E1A específico fue
anulada después de una vacuna de E1A/IFA (Figura 5b). Estos datos
indican que una inyección del péptido E1A conduce no sólo a una
tolerancia específica de E1A en ratones transgénicos TCR sino
también en ratones de expresión de un repertorio de células T E1A
específico policlonal.
Puesto que una inyección s.c. de una vacuna
E1A/IFA conduce a una tolerancia sistémica de CTL, se investigó si
el péptido E1A es dispersado sistémicamente y presentado al CTL
precursor en la periferia. En consecuencia, unos ratones fueron
inyectados s.c. con el peptido E1A o el péptido de control derivado
de E7 del Virus de Papiloma Humano (HPV) 16 emulsionado en IFA. Las
células de bazo de estos ratones fueron aisladas 16 h más tarde y
utilizadas como células estimuladoras in vitro para producir
un clon de CTL E1A específico. Unos esplenocitos de ratones a los
que se inyectó el péptido E1A s.c. indujeron una proliferación
específica, mientras que los esplenocitos de ratones a los que se
inyectó s.c. el péptido E7 no lo consiguieron (Figura 6). Además,
no proliferó un clon de control de CTL en las células de bazo
derivadas de ratones a los que se inyectó E1A (datos no mostrados).
Por lo tanto, estos datos indican que el péptido E1A inyectado s.c.
en IFA es sistémicamente presentado en la periferia por, entre
otros, esplenocitos.
En vista de los efectos de tolerancia descritos
anteriormente de la vacuna de péptidos E1A, se cuestionó el hecho
de saber si una estimulación de CD40 in vivo era suficiente
para prevenir una tolerización periférica de CTL y restablecer el
cebado de CTL. En consecuencia, se investigó si la inyección de
péptidos de tolerancia combinados con la estimulación de CD40 in
vivo podía prevenir la inducción de una tolerancia de CTL
periférica conduciendo a la inmunidad de CTL específica de un
tumor.
En los ejemplos 1 y 2 se ha mostrado que la
estimulación de CD40 in vivo puede reemplazar la necesidad
de células T cooperadoras de CD4+ en el cebado de respuestas de
CTL cooperador-dependiente. Puesto que una
actividad de célula T cooperadora mediada por CD4+ está implicada en
la prevención de la inducción de una tolerancia periférica de CTL,
los inventores se cuestionan sobre el hecho de saber si una
activación de CD40 in vivo es suficiente para prevenir una
tolerización de CTL E1A específico periférico. Para este fin, unos
ratones fueron inyectados con una vacuna de E1A/IFA en combinación
con el mAb FGK-45 activador de
anti-CD40. Los ratones que recibieron esta
combinación alcanzaron unas fuertes respuestas de CTL E1A específico
(Figura 7b y 7e), mientras que los ratones que recibieron la vacuna
de E1A/IFA (Figura 7e) o de mAb solo no las alcanzaron (no
mostrado). Con la combinación de vacuna E1A/IFA y de mAb
anti-CD40 no se consiguió generar CTL en ratones
con deficiencia de CD40 (Figura 7c y 7d). Además, con una
co-inyección de la vacuna E1A/IFA con un mAb de
control conjugado de isotipo (Figura 6a) o IL-2 no
se consiguió convertir una tolerancia de CTL inducida por la vacuna
E1A/IFA en un cebado de CTL (no mostrado). La gama y variación de
respuestas al epítopo E1A en el péptido E1A solo, o el péptido E1A
más anti-CD40 de los animales vacunados, son
mostradas en la figura 7e. De esta manera, la activación sistémica
de CD40 puede convertir una tolerancia de CTL periférica inducida
con péptidos en una inmunidad mediada por CTL específica del tumor
y de los péptidos.
La inducción de una inmunidad específica de E1A
se correlacionó estrechamente con la presencia de células T de CD8+
en el bazo de ratones vacunados teñidas con tetrámeros
H-2-D^{b} conjugados de PE
conteniendo el péptido E1A (D^{b}/E1A). 10 días después de la
vacunación, células T de CD8+ teñidas con tetrámeros Db/E1A pueden
ser detectadas por medio de una citometría de flujo en ratones
inyectados con péptidos E1A y el mAb anti-CD40,
pero no en ratones inyectados con péptidos E1A solo (no mostrado).
En los ratones inyectados con péptidos E1A, el porcentaje de
células CD8+ teñidas con los tetrámeros Db/E1A era de
aproximadamente 3%. En ratones vacunados con un adenovirus
completo, induciendo una inmunidad potente específica de E1A, se
detectaron cantidades comparables de células de bazo CD8+ reactivas
con tetrámero D^{b}/E1A. Estos resultados indican que la
expansión de células T de CD8+ E1A específico en ratones que
recibieron la vacuna E1A/IFA en combinación con el mAb
anti-CD40 fue sustancial y equivalente a la que se
identificó en animales vacunados con virus.
Aunque los descubrimientos descritos
anteriormente muestran que la provisión de cooperación a través de
la estimulación de CD40 es suficiente para prevenir la tolerización
de CTL después de la administración de una vacuna de péptidos
tolerogénicos, éstos no tratan la cuestión sobre si la eficacia de
las vacunas anticancerígenas que normalmente inducen una inmunidad
protectora, en vez de una tolerancia, puede ser mejorada mediante
una activación a través de CD40. Se examinó si una estimulación de
CD40 in vivo beneficiaba los resultados de la vacunación con
un péptido derivado de HPV16 E7. Una vacunación con este péptido
induce una inmunidad mediada por CTL protectora contra un
provocador con células tumorales transformadas de HPV16. Además,
este péptido puede ser utilizado en un ámbito terapéutico cuando es
cargado en DC activadas in vitro sugiriendo que la
resistencia de la respuesta antitumoral es mejorada cuando es
presentada por DC activadas.
Unos ratones recibiendo el péptido E7 en
combinación con una estimulación de CD40 alcanzaron una respuestas
más potente de CTL en comparación con ratones tratados con péptido
E7 sólo (datos no mostrados), lo que indica que una estimulación de
CD40 aumenta también la eficacia de la vacuna de péptidos HPV16 E7
y confirma los resultados descritos anteriormente con el péptido
E1A. Además, los ratones tratados 6 días después con una inyección
s.c. de HPV16E6/E7 negativo de CD40 transformaron las células
tumorales con el péptido HPV16 E7 solo (cuadrados abiertos) son
capaces de retrasar el crecimiento tumoral, aunque con el tiempo la
mayoría de los animales mueren por el tumor (Figura 8). No obstante,
cuando se combinaba una vacunación de péptidos HPV 16 E7 con una
inyección de mAb anti-CD40, el crecimiento tumoral
se reducía de forma notable y 7 de 10 ratones rechazaron el tumor,
mientras que los animales inyectados con un péptido de control y el
mAb anti-CD40 eran incapaces de controlar el
crecimiento del tumor. Estos resultados muestran que el efecto de
los regímenes de vacunación puede ser mejorado de forma notable
cuando la inmunización es combinada con una estimulación de CD40
in vivo. Estos datos proporcionan la base para el desarrollo
de vacunas antitumorales extremadamente potentes y nuevas para
pacientes cancerosos.
<110> CENTRO UNIVERSITARIO MÉDICO DE
LEIDEN
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Ligandos CD40 y Péptidos CTL para el
tratamiento de Tumores
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> E 2774 EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US99/11419
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-05-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/086,625
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-05-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Versión Windows 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Asn Ile Arg Asn Cys Cys Tyr Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gly Pro Ser Asn Thr Pro Pro Glu
Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus de papiloma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (11)
1. Composición farmacéutica que comprende un
anticuerpo de enlace CD40 y un péptido activador de CTL.
2. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1 donde el anticuerpo de enlace CD40 es un fragmento
del anticuerpo seleccionado del grupo consistente en fragmentos
V_{H}, V_{L}, Fv, Fd, Fab, (Fab)_{2} y scFv.
3. Composición farmacéutica según la
reivindicación 2 donde el anticuerpo de enlace modificado CD40 es
humano, humanizado, quimérico o desinmunizado.
4. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 donde el péptido activador de CTL es el
péptido E1A derivado de un adenovirus, que posee la secuencia
SGPSNTPPEI (SEC ID NO: 2), o el péptido HPV16 E7 derivado del
papilomavirus de humano de tipo 16, que posee la secuencia
RAHYNIVTF (SEC ID NO: 3).
5. Uso de un anticuerpo de enlace CD40 según las
reivindicaciones 1 a 3 y de un péptido activador de CTL tal como se
define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la
preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de
tumores o de enfermedades infecciosas.
6. Uso según la reivindicación 5 en el que una
composición farmacéutica es adecuada para ser directamente
administrada al tumor.
7. Uso de construcciones genéticas codificantes
para un anticuerpo de enlace CD40 según las reivindicaciones 1 a 3
y un péptido activador de CTL tal como se define en cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de una composición
farmacéutica para el tratamiento de tumores o de enfermedades
infecciosas.
8. Uso según la reivindicación 7 en el que las
construcciones genéticas son incorporadas en un vector de
etrovirus, adenovirus o parvovirus, o en el que las construcciones
genéticas, incorporadas opcionalmente en un vector viral o
plásmido, son incorporadas en un liposoma adecuado.
9. Uso según las reivindicaciones 7 u 8 donde el
péptido activador de CTL es el péptido E1A derivado de un
adenovirus, que posee la secuencia SGPSNTPPEI (SEC ID NO: 2), o el
péptido HPV 16 E7 derivado del papilomavirus humano de tipo 16, que
posee la secuencia RAHYNIVTF (SEC ID NO: 3).
10. Célula aislada que comprende las
construcciones genéticas según cualquiera de las reivindicaciones 7
a 9.
11. Uso de una célula según la reivindicación 10
para la preparación de una composición farmacéutica para el
tratamiento de tumores o de enfermedades infecciosas.
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|---|---|---|---|
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