ES2251015T3 - Nueva proteina quinasa activada por amp. - Google Patents

Nueva proteina quinasa activada por amp.

Info

Publication number
ES2251015T3
ES2251015T3 ES97902865T ES97902865T ES2251015T3 ES 2251015 T3 ES2251015 T3 ES 2251015T3 ES 97902865 T ES97902865 T ES 97902865T ES 97902865 T ES97902865 T ES 97902865T ES 2251015 T3 ES2251015 T3 ES 2251015T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
ampk
sequence
seq
sec
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES97902865T
Other languages
English (en)
Inventor
Bruce E. Kemp
David I. Stapleton
Kenneth I. Mitchelhill
Lee A. Witters
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
St Vincents Institute of Medical Research
Dartmouth College
Original Assignee
St Vincents Institute of Medical Research
Dartmouth College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by St Vincents Institute of Medical Research, Dartmouth College filed Critical St Vincents Institute of Medical Research
Application granted granted Critical
Publication of ES2251015T3 publication Critical patent/ES2251015T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A POLINUCLEOTIDOS DE AMK- AL SUB,1 , AMPK BE Y AMPK GA Y POLIPEPTIDOS Y FRAGMENTOS BIOLOGI CAMENTE ACTIVOS CODIFICADOS POR LOS MISMOS, ASI COMO VECTORES Y CELULAS HUESPED QUE CONTIENEN DICHOS POLINUCLEOTIDOS. ASIMISMO, SE PROPORCIONAN METODOS DE PREPARACION DE POLIPEPTIDOS Y ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA DICHOS POLIPEPTIDOS.

Description

Nueva proteína quinasa activada por AMP.
Antecedentes de la invención
La proteína quinasa activada por 5'-AMP (AMPK) se identificó inicialmente como una proteína quinasa que regula la HMG-CoA reductasa (Ferrer et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 132, 497-504). A continuación, se mostró que la AMPK fosforilaba la acetil-CoA carboxilasa hepática (Carling et al. 1987) FEBS Lett. 223, 217-222) y la lipasa adiposa sensible a las hormonas (Garton et al. (1989) Eur. J. Biochem. 179, 249-254).
Se piensa, por tanto, que la AMPK juega una función reguladora clave en la síntesis de los ácidos grasos y del colesterol.
Se cree que la AMPK actúa como una proteína quinasa sensible al estrés metabólico, que bloquea las vías biosintéticas cuando los niveles de ATP celular son suprimidos y cuando el 5'-AMP aumenta en respuesta a la limitación del combustible y/o a la hipoxia (Corton et al. (1994) Current Biology 4, 315-324). La secuenciación parcial de los aminoácidos de la AMPK hepática (Mitchelhill et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2361-2364; Stapleton et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 29343-29346) reveló que está formada por 3 subunidades, la subunidad catalítica \alpha (63 kDa), y dos subunidades no catalíticas, \beta (40 kDa) y \gamma (38 kDa).
La AMPK es un miembro de la subfamilia de la proteína quinasa SNF1 de la levadura que incluye las proteína quinasas que se encuentran en plantas, nematodos y en humanos. La subunidad catalítica de la AMPK \alpha muestra una acentuada intensidad secuencial con el dominio catalítico de la proteína quinasa SNF1 de la levadura, que está implicado en la inducción de la invertasa (SUC2), bajo condiciones de estrés nutritivo, debido al hambre de glucosa (Celenza, J.L. y Carlson, M. (1986) Science 233, 1175-1180). Tanto Snf1p como AMPK requieren fosforilación mediante una proteína quinasa activadora para una actividad total. La relación secuencial entre snf1p y AMPK condujo al hallazgo de que estas enzimas comparten similitudes funcionales, fosforilando e inactivando ambas la acetil-coA carboxilasa de la levadura (Woods et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 19509-19516; Witters, L.A. y Watts, T.D. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 169, 369-376). Las subunidades \beta y \gamma de la AMPK no catalíticas están asimismo relacionadas con proteínas que interaccionan con snf1p; la subunidad \beta está relacionada con la familia SIP1/SIP2/GAL83 de reguladores de la transcripción y la subunidad \gamma, con SNF4 (denominada asimismo CAT-3) (Yang et al. (1994) EMBO J. 13, 5878-5886).
Previamente, se ha clonado una isoforma de la subunidad catalítica de la AMPK de mamíferos (Carling et al. (1994) J. Biol.Chem. 269, 11442-11448) y en la presente memoria, se le hace alusión como AMPK \alpha_{2}. La secuencia de AMPK se da a conocer en la patente WO 94/28116. La AMPK \alpha_{2} no complementa a SNF1 en la levadura, indicando que su gama completa de funciones, no es idéntica.
Ahora se ha identificado una nueva isoforma de la subunidad catalítica de la AMPK de mamíferos, a la que se alude en la presente memoria como AMPK \alpha_{1}. Además, se han clonado asimismo ADNc completos para las subunidades \beta y \gamma de AMPK, purificándose por tanto los polipéptidos codificados.
Sumario de la invención
Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una secuencia nucleica que codifica una AMPK \alpha de mamífero, secuencia de ácido nucleico que comprende SEC ID nº: 44.
Se proporciona además un vector que comprende la secuencia nucleótida.
Asimismo, se proporciona una célula huésped que comprende el vector.
En otras formas de realización, se proporciona un polipéptido recombinante codificado por la secuencia de ácido nucleico.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir la AMPK \alpha_{1} de mamíferos, que comprende:
(a)
cultivar las células huésped bajo condiciones que permitan la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica la AMPK \alpha_{1} de mamífero; y
(b)
recuperar la AMPK \alpha_{1} expresada a partir de la célula.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una sonda oligonucleótida que comprende por lo menos 10 nucleótidos, siendo capaz dicha sonda de 10 oligonucleótidos de hibridizarse a la secuencia de ácido nucleico que posee SEC ID nº: 67, que codifica los aminoácidos 352 a 366 de la AMPK \alpha_{1}, pero no a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMPK \alpha_{2} de mamífero, codificado por moléculas de ácido nucleico que poseen las secuencias SEC ID nº: 65 ó 66.
Además, se proporciona un polipéptido purificado o un fragmento de éste biológicamente activo, codificado por una secuencia de ácido nucleico, en el que dicho fragmento biológicamente activo no se encuentra en un polipéptido AMPK \alpha_{2} de mamífero codificado por moléculas ácido nucleicas que presentan las secuencias SEC ID nº: 65 ó 66 y que comprende:
(a)
por lo menos, una parte de SEC ID n^{os}: 1-12, 15-32, 35-38, 40 ó 43
(b)
SEC ID n^{os}: 14, 34, 39, 41 ó 42;
(c)
conserva la capacidad para estimular la fosforilación de moléculas proteicas; o
(d)
conserva la capacidad para imitar la unión del polipéptido AMPK á_{1} original a por lo menos un anticuerpo o molécula del substrato.
De acuerdo con esto, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica la AMPK \alpha_{1} de mamífero o a una secuencia que se hibridiza con ella, con la condición de que la secuencia no se hibridice con la AMPK \alpha_{2}, tal como se define en la Tabla 1 (SEC ID nº: 65) o en la Tabla 5 (SEC ID nº: 66) de la patente WO 94/28116.
Resultará evidente para los expertos en la materia que las sondas oligonucleótidas según la presente invención, pueden utilizarse en diversos procedimientos. Éstos incluyen el análisis de los elementos reguladores génicos; el análisis de la expresión génica in vivo; y la identificación de los ADNc homólogos de los mamíferos, y de la de los no mamíferos, que incluyen los asociados con la quinasa-quinasa.
Por "fragmento biológicamente activo" se entiende un fragmento que conserva por lo menos una de las actividades de la AMPK \alpha_{1} original, cuyas actividades incluyen (i) la capacidad para estimular la fosforilación de las moléculas proteicas, y (ii) la capacidad para imitar la unión de la AMPK \alpha_{1} original a por lo menos, un anticuerpo o molécula de substrato.
Resultará evidente para los expertos en la materia que pueden llevarse a cabo diversas modificaciones en los polipéptidos y fragmentos de la presente invención, sin afectar deletéreamente a la actividad biológica de los polipéptidos o fragmentos. Esto puede conseguirse mediante varios cambios, tales como sulfatación, fosforilación, nitración y halogenación; o mediante inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos, conservadoras o no (por ejemplo, D-aminoácidos, desaminoácidos) en la secuencia peptídica, en la que dichos cambios no alteren sustancialmente la actividad biológica total del péptido. Mediante sustituciones conservadoras, las combinaciones deseadas son: G,A; V, I, L, M; D,E; N, Q; S,T; K, R, H; F, Y, W, H; y ácidos P, N\alpha-alquilamino.
Asimismo, es posible añadir varios grupos a los polipéptidos o fragmentos de la presente invención, para conferir ventajas, tales como un aumento en la potencia de la semivida biológica ampliada, in vivo, sin alterar sustancialmente la actividad biológica total del péptido.
El polipéptido AMPK \alpha_{1} de mamífero de la presente invención puede utilizarse para identificar compuestos que regulan la acción de esta quinasa. Dichos compuestos son deseables, ya que por ejemplo, pueden utilizarse para reducir la biosíntesis del colesterol y de los ácidos grasos. Asimismo, pueden utilizarse para inhibir la liberación de éstos de los depósitos intracelulares por HSL. Además, pueden utilizarse para reducir los niveles del malonil CoA celular y promover la \beta-oxidación de los ácidos grasos por las mitocondrias.
Puede realizarse el cribado de los compuestos respecto a la actividad antagonista o agonista de la AMPK \alpha_{1} de mamíferos, exponiendo la AMPK \alpha_{1} de los mamíferos de la presente invención a aquellos compuestos, y evaluando la actividad de la AMPK \alpha_{1} de los mamíferos. Los procedimientos apropiados de cribado para identificar compuestos que regulan la actividad de la AMPK \alpha_{1} de mamíferos, incluyen cualquier sistema de ensayo convencional para determinar dichos efectos.
Además, los compuestos pueden cribarse respecto a la capacidad para regular la expresión de la AMPK \alpha_{1} de mamíferos en una célula, exponiendo al compuesto la célula transformada con el polinucleótido de SEC ID nº: 44, y evaluando el nivel de expresión del polinucleótido.
Procedimientos apropiados de cribado para identificar compuestos que regulan la expresión de la AMPK \alpha_{1} de mamífero, incluyen aquéllos que implican la detección y/o la determinación de la cantidad de la AMPK \alpha_{1} de mamífero, o del ARN mensajero que codifica la AMPK \alpha_{1} o proteína en presencia del compuesto pertinente de prueba.
Tal como se ha indicado anteriormente, se considera que los compuestos que regulan la actividad de la AMPK \alpha_{1} de mamífero, pueden utilizarse potencialmente en el tratamiento de, por ejemplo, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, obesidad, síndromes clínicos asociados con hipoxia o isquemia, (por ejemplo, infarto miocárdico, apoplejía), trastornos de la nutrición y diabetes mellitus.
Actualmente se han clonado los ADNc completos para las subunidades \beta y \gamma de la AMPK de los mamíferos. Estos clones se han utilizado para caracterizar la distribución tisular del ARNm de la subunidad y para expresar la proteína subunitaria, tanto en las bacterias como en las células de mamíferos. La identificación de sus secuencias completas ha conducido asimismo a la identificación de las familias proteicas para cada una de estas subunidades no catalíticas.
La presente invención se describirá ahora haciendo referencia a la descripción detallada siguiente. A este respecto, la presente invención se refiere sólo a su objetivo, que se incluye en las reivindicaciones.
La AMPK de los mamíferos, aislada a partir del hígado porcino y de rata, contiene tres subunidades polipeptídicas, denominadas AMPK \alpha, AMPK \beta y AMPK \gamma. La subunidad \alpha contiene la secuencia del dominio catalítico de la quinasa, y presenta una alta homología con varios miembros de la familia de la quinasa SNF1. Ahora se han identificado isoformas múltiples de la subunidad \alpha, siendo responsable la \alpha_{1} del 90% aproximadamente de la actividad AMPK detectada en los extractos hepáticos. Además, se ha establecido ahora que las subunidades completas \beta y \gamma de AMPK son homólogas probablemente a dos tipos de proteínas en S. cerevisiae. Esto amplía la información disponible previamente del análisis de la secuencia peptídica limitada y de los ADNc más pequeños derivados mediante PCR (Stapleton et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 29343-29346). Además, mediante la clonación del ADNc y de la secuenciación peptídica directa, se ha demostrado que las isoformas de las unidades \beta y \gamma de AMPK interaccionan con la subunidad catalítica \alpha_{1} en el hígado. Así, se ha descubierto ahora que estas subunidades no catalíticas, como las isoformas de la subunidad \alpha, poseen una distribución tisular más amplia, tal como se evidencia por el contenido en ARNm de varios tejidos de rata, que la esperada a partir de la distribución de la actividad de AMPK, que fue informada por Gao et al. (1995) Biochem. Biophys. Acta. 1200, 73-82 y Davies et al. (1989) Eur. J. Biochem. 186, 123-128.
Se ha identificado una isoforma de la subunidad catalítica de la AMPK de mamífero, y a la que se alude en la presente memoria como AMPK \alpha_{1}. Las isoformas \alpha_{1} (548 residuos) y \alpha_{2} (552 residuos) de AMPK tienen una identidad secuencial aminoácida del 90% en el interior del núcleo catalítico, pero sólo de un 61% en otros lugares. Las mayores diferencias en las secuencias \alpha_{1} y \alpha_{2} tienen lugar en sus colas COOH terminales, lo que sugiere que pueden interaccionar con distintas proteínas dentro de esta región.
Se ha descubierto ahora que el ARNm \alpha_{2} de 8,5 kb es muy abundante en el músculo esquelético, con niveles más bajos en el hígado, corazón y riñón. Al contrario, en todos los tejidos excepto en las gónadas, se encontraron niveles muy bajos del ARNm \alpha_{1} de 6 kb, donde se observó un nivel bajo de un ARNm de 2,4 kb. Los niveles bajos del ARMm \alpha_{1} explican porqué la isoforma \alpha_{1} fue más difícil de clonar que la isoforma \alpha_{2}. La isoforma \alpha_{1} de la subunidad catalítica de AMPK, sin embargo, representa el 94% aproximadamente o más, de la actividad fosfotransferasa del péptido SAMS del hígado de rata, constituyendo por tanto la isoforma hepática que se expresa de manera predominantemente
activa.
Con la enzima parcialmente purificada (purificada hasta la etapa DE-52), se cribó una serie de péptidos sintéticos que incluían análogos de proteínas que no se sabía fueran sustratos para la AMPK. Éstos incluyeron cadenas ligeras de la miosina, ADR1, glucógeno sintasa y fosfolemman. Los péptidos de fosfolemman que se ensayaron eran sustratos pobres y no se investigaron posteriormente. El péptido glucógeno sintasa, PLSRTLSVAAKK (SEC. ID. nº: 46) se fosforiló de forma dependiente del AMP al 40% aproximadamente de la tasa del péptido SAMS, siendo este péptido, sin embargo, un substrato excelente para diversas proteína quinasas, incluyendo la proteína quinasa C y la quinasa II dependiente de la calmodulina (Kemp, B.E. y Pearson, R.B. (1991) en Protein Phosphorylation, Hunter, T y Sefton, B.M. (eds) Methods in Enzymology, 200, 121-134). Los péptidos que se ensayaron de la cadena ligera de la miosina, se fosforilaron con tasas del 15% aproximadamente del péptido SAMS. Se descubrió que los péptidos ADR1 (225 a 234) y ADR1 (222 a 234)^{P229} se fosforilaron a tasas del 50% aproximadamente del péptido SAMS. Los resultados de estos experimentos indican que el péptido ADR1 (222 a 234)^{P229} es fosforilado con una Km aparente de 3 \muM aproximadamente, comparada con los 33 \muM para el péptido SAMS.
En vista del bajo Km del péptido ADR1 (222-234)^{P229} como un substrato para AMPK, se intentó la purificación por afinidad de la enzima con este péptido. Inicialmente, el péptido se unió con la Sepharose activada con CNBr. Aunque el péptido se unió a la Sepharose unida a las fracciones que contienen AMPK, la enzima no puedo eluirse de modo diferencial a partir de las proteínas contaminantes con gradientes salinos. Al contrario, cuando el péptido ADR1 (222-234)^{P229} se unió a la columna HiTrap de Pharmacia, la AMPK se unió muy estrechamente y necesitó 2M NaCl más etilenglicol al 30% para eluirla. A causa de que la enzima se unió tan estrechamente a esta columna de afinidad por el substrato, se pudo cargar la enzima en un tampón que contenía 0,5 M NaCl. La AMPK purificada resultante estaba formada por una subunidad catalítica de 63 kDa y subunidades de 40 kDa y 38 Kda relacionadas con sip2 y snf4, respectivamente. En algunas preparaciones la AMPK estaba asociada con un material de alto peso molecular que correspondía a la miosina no muscular, tal como se evaluó mediante secuenciación tripsínica del péptido. Se obtuvo una purificación aparente de hasta 38.000, con un rendimiento del 15% y una recuperación de 90 \mug de la enzima. La purificación múltiple puede constituir una sobreestimación, debido a la presencia de material inhibitorio no caracterizado en las fracciones iniciales. La enzima no pudo detectarse en SDS-PAGE hasta la etapa final de la purificación. La avidez de la enzima por el péptido unido a la resina HiTrap de Pharmacia fue mayor que la que se podría esperar de la unión libre del péptido a la enzima (Km 3 \muM). Ya que el péptido unido a Sepharose no se unió tan estrechamente a la enzima, parece razonable que la potenciación de la unión se deba en parte al engarce del ácido aminohexanoico entre el péptido y la resina. En el caso de la proteína quinasa dependiente de cAMP, existe una bolsa hidrofóbica entre las hélices D y G que es responsable de la unión de alta afinidad del péptido PKI inhibidor. Ya que el péptido ADR1 (222-234)^{P229}, LKKLTLRASFSAQ (SEC ID nº: 47) está unido mediante los residuos amino en su extremo N o los residuos Lys, es posible que el grupo de engarce hidrofóbico se haya yuxtapuesto fortuitamente a una bolsa hidrofóbica sobre la AMPK.
Durante la secuenciación de la AMPK porcina, se descubrió que la secuencia aminoácida de algunos péptidos derivados de la subunidad \alpha de AMPK del hígado de cerdo no se emparejó con la que se dedujo de la secuencia ADNc del hígado de rata (Carling et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 11442-11448; Gao et al. (1995) Biochem. Biophys. Acta. 1200, 73-82). Por tanto, la subunidad catalítica \alpha de la AMPK del hígado de rata se purificó, secuenciándose los péptidos que representaban un 40% de la proteína (residuos 222/548, SEC ID n^{os} 27-43). Ocho de los 16 péptidos contenían residuos no emparejados con la secuencia de ADNc AMPK que se había informado, pero que se emparejaron con la secuencia enzimática del hígado porcino (SEC ID n^{os} 13-26). Utilizando RT-PCR y el cribado de la biblioteca de ADNc, se obtuvo una secuencia de ADNc de la enzima del hipotálamo de rata que representaba la totalidad de las secuencias peptídicas de la subunidad catalítica de la AMPK purificada del hígado de rata que contenía desemparejamientos. La secuencia ADNc de esta subunidad catalítica de AMPK se ha denominado \alpha_{1}, ya que corresponde a la enzima purificada y se deriva claramente de un gen distinto a la secuencia a previamente clonada (a la que ahora se hace alusión como \alpha_{2}). La isoforma \alpha_{1} de la subunidad catalítica de la AMPK representa el 94% o más de la actividad fosfotransferásica del péptido SAMS del hígado de rata y es por tanto la isoforma hepática que se expresa de forma predominantemente activa. A pesar de secuenciar múltiples preparaciones de la subunidad catalítica de AMPK del hígado de cerdo y de ratas (SEC ID n^{os} 13-26 y 27-43, respectivamente), no se obtuvieron péptidos que emparejaran con la secuencia de la isoforma \alpha_{2}.
En el interior de los núcleos catalíticos de las isoformas \alpha_{1} y \alpha_{2}, existe una identidad aminoácida del 90%, pero sólo una identidad del 61% fuera del núcleo catalítico. Una acentuada homología entre las secuencias \alpha_{1} y \alpha_{2} en la proximidad de la hendidura de la unión con el substrato, que se dedujo de la estructura cristalina de la proteína quinasa para las posiciones P_{-5} a P_{+5}, sugiere que las especificidades del substrato están relacionadas. El bucle de anclaje del substrato (denominado asimismo labio o bucle de activación) contiene una inserción FL^{170} para \alpha_{1}, \alpha_{2} y snf1p que puede proporcionar un anclaje hidrofóbico para un residuo hidrofóbico P_{+3} o P_{+4} en el substrato peptídico. Existe asimismo E^{100} (E^{127} en la proteína quinasa dependiente de cAMP) y D^{103} disponible para una especificidad residual básica P_{-3} determinante para \alpha_{1}, \alpha_{2} y snf1p. Ambas isoformas contienen un residuo Thr-172 equivalente a Thr-197 en la proteína quinasa dependiente de cAMP, que tiene probablemente que ser fosforilada y es necesaria para una actividad óptima. Ya que las diferencias importantes en las secuencias \alpha_{1} y \alpha_{2} tienen lugar en sus colas COOH-terminales, pueden interaccionar con distintas proteínas en el interior de esta región.
El análisis de transferencia Northern de las subunidades \beta y \gamma reveló un patrón complejo de expresión. El ARNm de la subunidad \beta fue menos abundante con niveles similares a través de distintos tejidos, excepto el cerebro, mientras que el ARNm de la subunidad \gamma fue abundante en corazón, pulmón, músculo esquelético, hígado y riñón. Un informe inicial de la distribución en los tejidos de la actividad de la AMPK, había reivindicado que era predominante una enzima hepática (Davies et al. (1989) Eur. J. Biochem. 186, 123-128). En vista de la distribución del ARNm en las subunidades \alpha_{1} y \beta, se volvió a evaluar la distribución tisular de la actividad de AMPK. El riñón contenía la actividad específica más alta con niveles similares en el hígado, corazón y pulmón, y algo de actividad, si es que alguna, en el músculo esquelético. Está claro que la actividad de AMPK posee una distribución tisular más amplia que la apreciada hasta la fecha, remedando estrechamente la distribución de ARNm \alpha_{1} y no la de ARNm \alpha_{2}. Utilizando antisueros péptido específicos para \alpha_{1} (residuos 339-358) y \alpha_{2} (residuos 352-366) se descubrió que la inmunorreactividad \alpha_{2} predominaba en el corazón, hígado y músculo esquelético, donde se encuentran asimismo las concentraciones más altas de ARNm \alpha_{2}. Al contrario, la inmunorreactividad \alpha_{1} está ampliamente distribuida, como lo está el ARNm \alpha_{1} menos abundante. El anticuerpo para \alpha_{2} reconoció un componente menor en la preparación purificada de \alpha_{1}, pero no se han obtenido cantidades suficientes de ésta para determinar si representa una reactividad cruzada débil con una forma de \alpha_{1}, una isoforma adicional de AMPK o un contaminante de bajo nivel de la preparación de \alpha_{1} por parte de la isoforma \alpha_{2}. El anticuerpo para \alpha_{2} no inmunoprecipita la actividad \alpha_{1} a partir de la AMPK \alpha_{1} purificada por afinidad. Ambas \alpha_{1} y \alpha_{2} migran sobre SDS-PAGE a 63 kDa aproximadamente. Se descubrió asimismo que la inmunorreactividad de la \alpha_{2} hepática no fue fijada por la columna de afinidad del substrato peptídico. Esta columna se une específicamente a la isoforma \alpha_{1}. Utilizando la precipitación inmune del vertido de la columna de afinidad del substrato peptídico con un anticuerpo específico para \alpha_{2}, se descubrió que la isoenzima \alpha_{2} contenía las subunidades \beta y \gamma y catalizaba la fosforilación del péptido SAMS. Los precipitados inmunes de \alpha_{1} y \alpha_{2} mostraron una activación variable mediante el 5'-AMP, que oscilaba entre 2 y 3, y 3 y 4 veces, respectivamente. Asimismo, existió una banda aproximada de 60 kDa reconocida por el anticuerpo \alpha_{1} específico en extractos tisulares procedentes del corazón y del pulmón. Esta banda no se encuentra en la enzima hepática purificada y su relación con la isoforma \alpha_{1} no se conoce aún.
La proporción de la actividad fosfotransferásica del péptido SAMS unida a la columna de afinidad peptídica con un único paso varió (osciló entre 90 y 92%, n= 7 y entre 74 y 86%, n=6 en preparaciones hepáticas de rata). Con el reciclado, aproximadamente el 94% de la actividad, se unió a la columna. La actividad residual se atribuyó a la actividad de la isoforma \alpha_{2} basada en la inmunoprecipitación con el anticuerpo específico de \alpha_{2}. Sin embargo, la cantidad de proteína que sufrió inmunoprecipitación, basándose en la tinción con azul de Coomassie, indicaba que existía sustancialmente más proteína \alpha_{2} que la esperada, que procedía sólo del 6% de la actividad peptídica SAMS total. La actividad específica aparente de la isoforma AMPK \alpha_{2} hepática aislada de la rata con el péptido SAMS o la acetil CoA carboxilasa como substrato, fue más de 20 veces más baja que la isoforma AMPK \alpha_{1}. Esta estimación se basa en mediciones que utilizan la fracción enriquecida \alpha_{2} (estando agotada la \alpha_{1}) y en la cuantificación mediante inmunotransferencia comparada con la \alpha_{2} expresada bacterialmente.
La actividad específica de la isoforma \alpha_{2} purificada no se conoce todavía en ausencia del anticuerpo unido. Basándose en la secuencia ADNc \alpha_{2}, Carling et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 11442-11448 informaron que un anticuerpo peptídico específico inmunoprecipitó virtualmente toda la actividad de la AMPK hepática parcialmente purificada. El péptido que se utilizó en sus experimentos, PGLKPHPERMPPLI (SEC ID nº: 48) contiene 8/15 residuos que son idénticos (subrayados) entre \alpha_{1} y \alpha_{2}, por lo que parece razonable que sus antisueros policlonales puedan reconocer ambas isoformas.
Estos experimentos clarifican la existencia de una familia isoenzimática de subunidades catalíticas AMPK \alpha, aumentando de este modo la complejidad del análisis de actividad. Esto pone asimismo sobre el tapete la pregunta de qué función posee la isoforma \alpha_{2} y si \alpha_{2} se asocia con un subconjunto específico de las subunidades \beta y \gamma. Una fracción significativa del ARNm de la isoforma \alpha_{2} posee una deleción de 142 pares de bases fuera del marco de lectura y dentro de su dominio catalítico, que codificaría una proteína truncada funcional (Gao et al. (1995) Biochem. Biophys. Acta. 1200, 73-82; Verhoeven et al. (1995) Eur. J. Biochem. 228, 236-243). La estrecha relación secuencial entre las isoformas \alpha_{1} del cerdo, rata y hombre significa que existe una conservación importante entre las especies. Previamente, se informó de que el hígado humano no contiene ARNm AMPK (Aguan et al. (1994) Gene 149, 345-350). Sin embargo, está claro ahora que se sondeó el ARNm \alpha_{2} y no el ARNm de la isoforma dominante \alpha_{1}. El gen que codifica la subunidad catalítica de la AMPK hepática humana de la que se informó que se encontraba en el cromosoma 1, es por tanto el gen para la isoforma \alpha_{2}, mientras que el gen para la isoforma \alpha_{1} se localiza en el cromosoma 5. Se ha elaborado ahora el mapa de los genes de las subunidades de AMPK, en las siguientes localizaciones cromosómicas: \alpha_{1}, 5p12; \beta, 5q24.1; y \gamma, 12q13.1.
Una secuenciación genómica reciente ha revelado múltiples isoformas de las subunidades no catalíticas \beta y \gamma de la AMPK. Parece que están presentes por lo menos tres isoformas de la subunidad \gamma en el cerebro, estando presentes \gamma_{2} y \gamma_{3}, distintas de la isoforma \gamma_{1} del hígado de rata. El cerebro humano contiene asimismo múltiples isoformas de la subunidad \beta, distintas de la isoforma \beta_{1} del hígado de rata. Los números de registro para las isoformas putativas de las subunidades \gamma y \beta de AMPK son \gamma_{2}, M78939; \gamma_{3}, R52308; \beta_{2}, R20494 y \beta_{3}, R14746. De este modo, puede encontrarse una subfamilia potencialmente grande de las AMPK heterotriméricas, basada en varias combinaciones de la totalidad de las tres subunidades de AMPK.
Las relaciones estructurales entre las quinasas AMPK y SNF1, así como la presencia de múltiples isoformas, centra la consideración de los asuntos relacionados con las diversas funciones fisiológicas de esta nueva subfamilia de proteína quinasas. Mientras que AMPK regula el metabolismo lipídico en los hepatocitos bajo situaciones de estrés metabólico, sus funciones en otros tejidos, incluyendo corazón y riñón, son desconocidas. Estudios recientes han mostrado que la AMPK se activa durante la isquemia cardíaca, persistiendo la activación durante la revascularización, contribuyendo posiblemente al desacoplamiento gobernado por la isquemia de la función mecánica y metabólica cardíaca (Kudo et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 17513-17520).
La regulación de la acetil-CoA carboxilasa cardíaca por la AMPK juega un papel importante en la puesta en marcha del metabolismo cardíaco entre la utilización de glucosa y los ácidos grasos como combustible de oxidación. En las células \beta pancreáticas, en las que las subunidades de AMPK se expresan intensamente en las células de los islotes, la disponibilidad de glucosa regula rápidamente la acetil-CoA carboxilasa mediante cambios en la fosforilación dirigida por la AMPK, sugiriendo fuertemente un papel para la AMPK en el acoplamiento estímulo-secreción para la liberación de insulina. Además de estas funciones metabólicas, los miembros de la subfamilia de la proteína quinasa SNF1 parecen jugar funciones importantes en el desarrollo, con el gen par-1 de C. elegans jugando una función esencial en la embriogénesis.
La amplificación mediante PCR del ADNc hepático de ratas y cerdos con oligonucleótidos degenerados que corresponden a secuencias peptídicas seleccionadas AMPK \beta, dio lugar a dos productos PCR importantes (Stapleton et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 29343-29346). Un producto, un ADNc de rata con una longitud parcial de 309 pares de bases, se utilizó para cribar una biblioteca ADNc de hígado de rata, produciendo un clon de 1107 pares de bases (SEC ID nº: 61). La sonda PCR de criba correspondió a los residuos n^{os} 279-588 de esta secuencia. Este clon contiene un marco de lectura abierto que codifica un péptido de 270 aminoácidos (SEC ID nº: 62) que contiene la totalidad de las 15 secuencias peptídicas independientes (aunque algunas se solapan) que se obtienen a partir de un análisis secuencial extenso de la proteína purificada. El codón de metionina de inicio traduccional se asigna a partir de la secuencia típica Kozak que se encuentra presente para un codón de iniciación, y por la ausencia de cualesquiera codones de metionina corriente arriba en un marco de lectura. Mientras que en esta secuencia corriente arriba del extremo 5' no existe un codón de detención en el marco de lectura, una secuencia ADNc con una señalización (EST) que se expresa en el hombre (nº de registro T78033) en GenBank), contiene en la base de datos dicho codón de detención que precede al mismo inicio asignado para la metionina. Este marco de lectura, sin embargo, predice una proteína de 30.464 daltons, bien inferior al peso molecular estimado de 40 kDa que se evidencia en la electroforesis SDS-gel.
Para clarificar el tamaño del producto proteico que podría sintetizarse a partir de este ADNc, el clon de AMPK \beta se expresó tanto en las bacterias como en células de mamífero. En ambos sistemas de expresión, el producto proteico migra con un peso molecular más alto que el predicho. Cuando se purifica como una proteína de fusión marcada con His^{6} a partir de E. coli, la proteína aislada migra en geles SDS con un peso molecular aparente de 43.000 Da aproximadamente (el mismo que el estándar de la ovoalbúmina). Este corresponde a un producto polipeptídico AMPK \beta de 40 kDa con 3 kDa adicionales de una secuencia tag de fusión derivada del vector pET. Cuando se expresa en las células de mamífero a partir de un vector de expresión marcado HA, son evidentes dos polipéptidos, correspondiendo el producto más voluminoso a 40 kDa (después de la corrección para el tamaño de la marca epitópica HA). Un segundo producto de 42-43 kDa se evidencia asimismo utilizando este sistema de expresión. Considerados conjuntamente, estos datos demuestran que el producto proteico de esta AMPK \beta migra en SDS-PAGE con un peso molecular anómalamente alto.
La comparación de la secuencia de la \beta AMPK del hígado de rata con la base de datos, revela que presenta una acusada homología con las tres proteínas de la levadura (Sip1p, Sip2p y Gal83p) y con dos secuencias EST-ADNc humanas recientemente clonadas. Esta alineación, con un espacio abierto intermedio (o separación) según la secuencia de la proteína Sip1p de S. cerevisiae (Yang et al. (1992) Science, 257, 680-682) es muy sorprendente en el extremo C de AMPK \beta y de estas proteínas de la levadura.
La subunidad \beta de AMPK es un homólogo mamífero de un tipo de proteínas en la levadura, representado por Sip1p/Sip2p/Gal83p. Se sabe que el producto del gen GAL83 afecta a la represión de la glucosa de los genes GAL. Se ha mostrado que todas estas proteínas interaccionan con la proteína quinasa Snf1p bien en el sistema bi-híbrido o mediante inmunoprecipitación. Se ha propuesto que estas proteínas sirven como adaptadores que promueven la actividad de Snf1p hacia dianas específicas. Basándose en el análisis de los mutantes de la levadura, se ha sugerido que estas proteínas pueden facilitar la interacción de Snf1p con dianas únicas y distintas. De interés es la demostración de un dominio muy conservado de alrededor de 80 aminoácidos en el extremo C de Sip1p/Sip2p/Gal83p, denominado dominio ASC (asociación con el complejo Snf1p) (Yang et al. (1994) EMBO J.13, 5878-5886). Tal como se estudia en el sistema de 2 híbridos, el dominio ASC de tanto Sip1p como de Sip2p interacciona fuertemente con Snf1p. Sin embargo, la interacción de Sip2p con Snf1p no se ha perdido enteramente al llevarse a cabo la deleción de este dominio, sugiriendo que el dominio ASC no es únicamente el responsable de esta interacción proteína-proteína. Un dominio ASC putativo está asimismo muy conservado en el extremo C de la AMPK \beta del hígado de rata (residuos aminoácidos 203 a 270), sugiriendo que esta región puede ser responsable, en parte, de la unión a la subunidad \alpha de AMPK.
AMPK \beta, como Sip2p y Gal83p, es fosforilada in vitro cuando se asocia con una subunidad catalítica (AMPK \alpha o Snf1p, respectivamente). Las mutaciones de Gal83p pueden abolir la mayoría de la actividad de la Snf1p quinasa detectable en los complejos inmunes, precipitada con el anticuerpo anti-Snf1p. Un mutante Sip2p/E gal 83/E muestra una actividad reducida de la proteína quinasa Snf1, que es restaurada después de la expresión de las proteínas de fusión LexA Sip2p o Gal83p en la cepa mutante (Yang et al. (1994) EMBO J. 13, 5878-5886). Considerados conjuntamente, estos datos sugieren la posibilidad de que AMPK \beta pueda servir asimismo como una molécula adaptadora para la unidad catalítica AMPK \alpha y que regulará positivamente la actividad de AMPK.
AMPK \beta aparece con una migración anómala en los geles SDS, migrando el polipéptido con una M_{r} 10 kDa más grande aproximadamente que el tamaño predicho a partir del ADNc. Esta migración más lenta es evidente para tanto la proteína de fusión-His^{6} que se expresa bacterialmente como para la proteína expresada en las células COS7. Estas observaciones sugieren que estructuras de orden superior son responsables de la migración anómala en SDS-PAGE. La subunidad \beta de AMPK se autofosforila in vitro; esto sugiere que las dos bandas de AMPK \beta que se expresan después de la transfección de células de mamífero con AMPK \beta ADNc pueden provenir de una modificación post-traduccional similar que dé lugar a cambios más pequeños de movilidad. De forma interesante, este comportamiento migratorio aberrante de AMPK \beta es similar a la de su homólogo de la levadura, Gal83p. La proteína (o proteínas) de fusión LexA de Gal83, que se expresa(n) en las levaduras, migra(n) asimismo con un peso molecular superior al esperado y muestran más de una banda en los geles SDS, de acuerdo con la fosforilación conocida de Gal83p por Snf1p. El análisis de espectroscopía de masas de la subunidad \beta indica que la glicina amino terminal es miristilada y que la subunidad es aislada en formas mono y difosforiladas.
Utilizando el procedimiento MOPAC y otros protocolos de amplificación mediante PCR, se obtuvo un ADNc de 192 pares de bases que corresponden a la secuencia AMPK \gamma de hígado de rata, que se utilizó para el cribado de una biblioteca para obtener un ADNc de hígado de rata de longitud parcial de 1,3 kb aproximadamente. Esta secuencia no contenía un codón inicial de metionina o la totalidad de las secuencias peptídicas obtenidas a partir de la proteína purificada. Intentos para ampliar esta secuencia al extremo 5' utilizando una biblioteca de cebadores de extensión y de 5'-RACE sólo tuvieron éxito añadiendo a esta secuencia aproximadamente 200 nt, sin identificación del codón inicial. Se utilizó entonces un ADNc de rata de longitud parcial para rastrear una biblioteca hepática fetal humana, que dio lugar al clon completo (de longitud completa) que se muestra en SEC ID nº: 63. Este clon contiene una secuencia aminoácida deducida (SEC ID nº: 64) que corresponde a la totalidad de las 22 secuencias peptídicas independientes (con algunas que se solapan), obtenidas a partir de la AMPK \gamma purificada del hígado de cerdo y de rata, que confirma la identidad clonal.
Una típica secuencia Kozak de iniciación de la traducción rodea el codón inicial asignado de metionina; este inicio está asimismo en un marco de lectura con un codón de detención corriente arriba del extremo 5'. La metionina de iniciación que se asigna es seguida por un marco de lectura abierto que predice una proteína de 331 aminoácidos y de 37.546 Da, que corresponde al peso molecular observado en la electroforesis del gel SDS de la proteína, cuando se purifica a partir del hígado porcino y de rata. La expresión de un ADNc AMPK \gamma truncado de rata (residuos aminoácidos 33 a 331) y del AMPK \gamma humano completo (331 residuos aminoácidos) en las células COS7 da lugar a productos que están de acuerdo con el peso molecular predicho para cada ADNc (34.081 y 37.577 daltons, respectivamente). El producto AMPK \gamma de hígado de rata expresado en las bacterias mostró asimismo el peso molecular predicho por el ADNc. Así, de modo distinto a AMPK \beta, no existe una migración anómala del producto proteico de ADNc AMPK \gamma.
La comparación de las secuencias aminoácidas de AMPK \gamma con la base de datos da lugar a una alineación significativa de esta proteína con Snf4p de S. cerevisiae. Además, el ADNc humano completo de la presente invención se alinea asimismo con varias otras secuencias EST-ADNc de longitud parcial procedentes del cerebro, mama, placenta, hígado y corazón, de las que existe información reciente en la base de datos. La inspección de estas secuencias revela que existen múltiples isoformas de la proteína AMPK \gamma humana. Asimismo, existen probablemente familias isofórmicas similares de AMPK \gamma que se expresan en la rata y en el cerdo. Esta última expectativa se basa en el análisis secuencial de otras 14 secuencias ADNc AMPK \gamma parciales derivadas de MOPAC, identificadas mediante la hibridización colonial de los productos AMPK \gamma MOPAC con oligonucleótidos degenerados marcados con P^{32}. Estos productos mostraron por lo menos dos patrones reproducibles de heterogeneidad nucleótida en el interior del núcleo no degenerado.
La AMPK \gamma hepática humana y de rata es un homólogo mamífero de la Snf4p de S.cerevisiae (CAT3) (Celenza et al. (1989) Mol. Cell. Biol., 9, 5045-5054; Schuller, H.J. y Entian, K.D. (1988) Gene, 67, 247-257; Fields, S. y Song, O.K. (1989) Nature 340, 245-246). Se mostró que Snf4p interaccionaba con la proteína Snf1p en la primera utilización que se ha informado del sistema de 2 híbridos, coinmunoprecipitándose asimismo con ella (Haygood, M.G. (1993) Biotechniques 15, 1084-1089). Verdaderamente, en el aislamiento de la Snf1p quinasa de la levadura, Snf4p, pero no de las otras proteínas que interaccionan con Snf1p, se copurifica en una proporción estequiométrica 1:1 con el polipéptido Snf1p. El análisis de los mutantes SNF4 en la levadura, sugiere que Snf4p regula asimismo positivamente la actividad de su subunidad catalítica asociada, Snf1p. Por analogía, nuestra predicción es que AMPK \gamma tendrá asimismo dicha influencia positiva en la subunidad \alpha de AMPK.
El examen de la base de datos revela que, además de la homología de AMPK \gamma para Snf4p, existen 2 ó 3 proteínas humanas distintas altamente homólogas o idénticas a nuestras secuencias humanas AMPK \gamma y del hígado de la rata. Sin embargo, algunas de estas secuencias de la base de datos, tal como se predijo a partir de EST-ADNc en el cerebro, corazón, mama y placenta, son distintas entre ellas y a nuestros clones; algunas, por ejemplo, tienen una prolongación C-terminal. Esto indica que existe una familia de isoformas de mamífero de subunidades potenciales \gamma de AMPK, cada una, tal vez, con distinta expresión tisular y funciones reguladoras. Se sugiere que estas isoformas gamma distintas se designen como \gamma_{1}, \gamma_{2}, \gamma_{3}, ... \gamma_{n}, pues sus secuencias completas están definidas. La secuencia de la AMPK \gamma hepática humana y de rata de la presente invención se denomina en la presente memoria como AMPK \gamma_{1}.
La unidad catalítica \alpha de AMPK se expresa ampliamente en varios tejidos de la rata. Las secuencias de AMPK \beta y de AMPK \gamma tienen una amplia expresión tisular similar. Dos tipos de ARNm AAMPK-\gamma de 2,7 y 1,9 kb son evidentes en las preparaciones del ARNm total; sólo la última se encuentra en (forma de) polyA+- ARN procedente del hígado de rata, sugiriendo que el ARNm más voluminoso es un precursor no procesado. Sólo se evidencia un tipo único de ARNm de 1,9 kb para AMPK \beta. Ambos ARNms, el de AMPK \gamma y el de AMPK \beta, se expresan intensamente en el riñón, tejido adiposo blanco, pulmones y bazo, mientras que el ARNm AMPK \gamma parece expresarse más intensamente en el corazón y en el cerebro. Aunque puede detectarse, el nivel de ARNm para cada subunidad es relativamente bajo en el músculo esquelético, glándulas mamarias para la lactancia e hígado. En otros estudios, se han encontrado concentraciones altas de ARNm para ambas subunidades en las células del hepatoma Fao de la rata y en las células HIT que secretan insulina del hamster Sirio, expresando ambas progenies celulares niveles sustanciales de actividad AMPK.
La AMPK se reconoció en primer lugar como una proteína quinasa activa sobre las enzimas del metabolismo lipídico (acetil-CoA carboxilasa, HMG CoA reductasa y lipasa sensible a las hormonas). Sin embargo, como se ha observado para la subunidad \alpha de AMPK, las subunidades \beta y \gamma_{1} de AMPK poseen una distribución más amplia que la que podría esperarse para una proteína activa sólo en la regulación del metabolismo lipídico. Aunque los ARNms para cada una son detectables en los tejidos lipogénicos "clásicos" como el hígado, el tejido blanco adiposo y la glándula mamaria para la lactancia, concentraciones altas de ARNm en tejidos no lipogénicos como corazón, cerebro, bazo y pulmones, por ejemplo, sugieren que estas proteínas tienen funciones que se prolongan más allá de la regulación de la biosíntesis de los ácidos grasos y de los esteroles, y de la oxidación de los ácidos grasos.
Por ejemplo, la homología sorprendente de la totalidad de las tres subunidades respecto a las proteínas de la levadura que están implicadas en respuestas nutricias (glucosa), sugiere que las tres proteínas de mamíferos pueden estar implicados en la regulación de la glucosa (u otro nutriente) de la expresión génica en los tejidos de mamíferos o en otras respuestas adaptativas a un medio nutricio cambiante. Además, la AMPK puede constituir un "sensor metabólico" importante unido a la selección del combustible oxidativo en el corazón y para la sensibilidad a la glucosa en la célula beta pancreática, siendo importante quizás para la secreción de insulina.
Se proporcionan los siguientes ejemplos no limitativos para ilustrar posteriormente la presente invención.
Ejemplos Ejemplo 1 Purificación de la subunidad catalítica de AMPK (\alpha_{1}) Purificación enzimática
Se purificó la AMPK a partir del hígado porcino. Se homogenizó un hígado de 1 kg en 4000 ml de tampón. Se preparó una fracción PEG 6000 entre el 2,5 y el 7,0% (peso/vol) y la fracción resultante se procesó por lotes en 1500 ml de DEAE celulosa (Whatman, Clifton, NJ), eluyéndose con tampón que contenía 0,25 M NaCl (2.000 ml). El eluado se cromatografió en 150 ml de Sepharose Blue (Pharmacia, Uppsala, Suecia), eluyéndose la AMPK con tampón que contenía 1 M NaCl. La fracción enzimática se concentró y desaló mediante una precipitación de PEG-6000 al 10% (peso/vol) que precedía a la cromatografía por afinidad del substrato peptídico. La columna por afinidad del substrato peptídico se lavó con el mismo tampón que contenía Triton X-100 al 0,1% (vol/vol) y 0,5M NaCl, eluyéndose la AMPK con este tampón que contenía 2 M NaCl y etilenglicol al 30% (vol/vol).
Ensayos de la proteína quinasa
La AMPK se ensayó según los procedimientos descritos por Davies et al. (1989) Eur. J. Biochem. 186, 123-128, utilizando el substrato peptídico SAMS HMRSAMSGLHLVKRR-amida (SEC ID nº: 49). La enzima se diluyó en tampón de dilución (20 mM HEPES pH 7,0, 0,1% (vol/vol) Triton X-100) antes del ensayo y se iniciaron las reacciones añadiendo 10 ml de la enzima diluida a la mezcla reactiva que contenía el substrato peptídico. Las reacciones se detuvieron retirando alícuotas de 30 ml y aplicándolas a documentos P81 según los procedimientos descritos por Pearson, R.B. Mitchelhill, K.I. y Kemp, B.E. (1993) en Protein Phosphorylation: A Practical Approach, Hardie, G.D. (ed) Oxford University Press, págs 265-291.
Síntesis peptídica
Los péptidos se sintetizaron utilizando un sintetizador 430 de Applied Biosystems según los procedimientos descritos por Pearson, R.B. Mitchelhill, K.I. y Kemp, B.E. (1993) en Protein Phosphorylation: A Practical Approach, Hardie, G.D. (ed) Oxford University Press, págs 265-291. Todos los péptidos se purificaron mediante cromatografía de intercambio catiónico seguido por cromatografía de fase inversa. Los péptidos se analizaron mediante análisis cuantitativo de aminoácidos, utilizando un analizador de aminoácidos Beckman 6300. La columna por afinidad del substrato peptídico se preparó acoplando el péptido ADRI (222-234)^{P229} a una columna HiTrap (Pharmacia) de superosa activada por el éster de N-hidroxisuccinamida. Esta resina contiene un brazo espaciador de ácido 6-aminohexanoico. Las condiciones de acoplamiento se llevaron a cabo según las instrucciones del fabricante, con 10 mg de péptido por 5 ml de columna, controlándose el acoplamiento peptídico mediante HPLC de fase inversa.
Ejemplo 2 Aislamiento de ADNc que codifica la subunidad catalítica (\alpha_{1}) de AMPK Secuenciación peptídica
Los péptidos se derivaron a partir de la subunidad \alpha_{1} porcina y de la rata de la AMPK, mediante proteolisis in situ según los procedimientos descritos por Mitchelhill et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2361-2364 y secuenciada en un Secuenciador Proteico 471A de Applied Biosystems, o en un Secuenciador Proteico G1000A de Hewlett Packard.
Estudios de la actividad de distribución tisular
Se preparó para cada tejido, una fracción de sulfato de amonio saturado al 35%, siguiendo la homogeneización en un tampón de homogeneización de AMPK (HB, 50 mM Tris-HCL, pH 8,5, 250 mM sacarosa, 5 mM pirofosfato sódico, 50 mM fluoruro sódico, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM benzamidina, 1 \mug/ml inhibidor de la tripsina de soja y 0,2 mM de fenilmetil-sulfonilfluoruro). El sedimento resultante se volvió a suspender en 5 ml de HB y se ensayó respecto a la concentración proteica. La AMPK se ensayó según los procedimientos descritos por Mitchelhill et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2361-2364, con las modificaciones siguientes: se utilizó un volumen de reacción final de 120 \mul; para iniciar la reacción se utilizaron alícuotas enzimáticas (30 \mul) que contenían 1 \mug de proteína prediluída en 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 y Triton X-100 al 0,05% (vol/vol). Después de 2, 4 y 6 minutos, se eliminaron tres alícuotas (30 \mul). Se llevaron a cabo reacciones por duplicado \pm 5'- AMP (200 \muM), con un substrato peptídico mínimo de control. La actividad específica de la enzima se determinó utilizando tasas lineales de fosforilación con el substrato peptídico sintético específico SAMS. La AMPK se purificó a partir del hígado porcino o de la rata, tal como se describe en el Ejemplo 1, utilizando la cromatografía por afinidad del substrato.
Aislamiento del ADNc AMPK
Un ADNc marcado radioactivamente (774 pares de bases) que codifica la AMPK \alpha_{1} se utilizó para cribar una biblioteca ADNc Zap II del hipotálamo de la rata (Stratagene, la Jolla, CA) según las instrucciones del fabricante. Los positivos se purificaron en las placas en tandas subsiguientes de cribado, rescatándose los fásmidos de los clones positivos con fagos auxiliadores (Stratagene). El cribado de 7 x 10^{6} placas produjo tres clones únicos, estando formado el más voluminoso por un marco abierto de lectura, que corresponde a AMPK \alpha_{1} (2 a 549).
El extremo 5' de AMPK \alpha_{1} se aisló utilizando un equipo 5'-RACE de Gibco (Life Technologies, Grand Island, USA) con un cebador específico \alpha_{1} para los residuos 41 a 48 y el ADNc del hígado de rata. La AMPK \alpha_{1} humana (14 a 270) se aisló a partir de ADNc hepático humano fetal que se cebó con oligonucleótidos con sentido y antisentido parcialmente degenerados para la secuencia peptídica \alpha_{1} mediante RT-PCR. Los residuos 291 a 448 del AMPK humano \alpha_{1} consistían en un clon de ADNc hepático humano completo obtenido a partir del Lawrence Livermore National Laboratory (clon 78297, nº T50799 de registro).
Transferencia Northern
Una transferencia Northern de múltiples tejidos de rata (MTN) (Clontech, Palo Alto, CA, USA) que contenía 2 mg de poly(A) + ARN de tejidos individuales, se sondeó con AMPK \alpha_{1} de rata marcada con ^{32}P y ADNc \alpha_{2} según las instrucciones que se proporcionaron.
Producción de anticuerpos anti-AMPK
Se prepararon anticuerpos policlonales para AMPK \alpha_{1} y \alpha_{2} de la forma siguiente. Los péptidos basados en las secuencias aminoácidas predichas de AMPK \alpha_{1} para los residuos 339-358 (DFYLATSPPDSFLDDHHLTR SEC ID nº: 50) y de AMPK \alpha_{2} para los residuos 352-366 (MDDSAMHIPPGLKPH (SEC ID nº: 51) se sintetizaron y acoplaron a la hemocianina de lapa (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, H-2133) mediante un residuo de cisteína añadido al extremo N del péptido, utilizando el reactivo heterobifuncional N succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Nuevos conejos Zealand White se inmunizaron con 2 mg del conjugado peptídico, inicialmente con un 50% (vol/vol) de adyuvante completo de Freund y con un 50% (vol/vol) de adyuvante incompleto de Freund en inmunizaciones subsiguientes. Los conejos se reinmunizaron quincenalmente con 2 mg de conjugado peptídico y desangrándose 7 días después de las inyecciones de reinmunización. Los anticuerpos peptídicos anti AMPK \alpha_{1} y \alpha_{2} se purificaron mediante cromatografía de afinidad peptídica.
Transferencia Western
Se prepararon múltiples tejidos de rata de la forma siguiente. Los tejidos de rata se homogenizaron en AMPK HB y se preparó una fracción 6000 de polietilenglicol del 2,5 al 7%. El sedimento resultante se volvió a suspender en 5 ml de HB y se ensayó respecto a la concentración proteica. Cien microgramos de cada fracción de tejido se analizaron mediante SDS PAGE (geles de acrilamida al 13%); se transfirieron a nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Dassal, Alemania); y se sondearon con 3 \mug/ml y 6 \mug/ml de los anticuerpos AMPK \alpha_{1} y \alpha_{2} purificados por afinidad, respectivamente. El anticuerpo primario se detectó utilizando un anticuerpo anti IgG de conejo conjugado con peroxidasa de rábano (DAKO, Carpinteria, CA, USA) y 3,3'-diamino-bencidina al 0,032% (D-5637, Sigma) junto con H_{2}O_{2} al 0,064%.
P Purificación de AMPK \alpha_{2}
El anticuerpo de AMPK \alpha_{2} purificado por afinidad (2 mg) se acopló con Sepharose 4B activada por CNBr (Pharmacia, Uppsala, Suecia), según las instrucciones del fabricante. La fracción no unida de la columna de afinidad para el substrato se aplicó directamente a la columna del anticuerpo de AMPK \alpha_{2}, se lavó con 5 volúmenes de PBS y se eluyó con 200 mM de tampón de glicina pH 2,5, neutralizándose inmediatamente.
Ejemplo 3 Aislamiento de los ADNc que codifican las subunidades no catalíticas de AMPK Aislamiento de AMPK y secuenciación peptídica
Se aisló la AMPK hepática de la rata y del cerdo. La secuencia peptídica derivada de las subunidades beta (40 kDa) y gamma (38 kDa) del hígado de la rata se obtuvieron después de la separación de las subunidades mediante electroforesis SDS gel, elución de las bandas y digestión proteásica in situ según los procedimientos descritos por Mitchelhill et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2361-2364 y Stapleton et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 29343-29346.
Aislamiento del ADNc de la subunidad \beta de AMPK
Las secuencias peptídicas derivadas de la subunidad \beta de AMPK se utilizaron para generar ADNc de la subunidad \beta de AMPK de longitud parcial, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) según los procedimientos descritos por Gao et al. (1995) Biochem. Biophys. Acta, 1200, 73-82. Un producto, un ADNc de 309 pares de bases, se utilizó para cribar una biblioteca ADNc \lambdaZAPII de hígado de rata (Stratagene). Los filtros se hibridizaron con ^{32}P-ADNc, se marcaron con alfa-^{32}P-CTP (3.000 mCi/mmol), New England Nuclear) mediante cebado al azar (Random Primer ADNc Labeling System, Gibco/BRL), en formamida al 50%, 10X de Denhardt, 1 M NaCl, 50 mM Tris-Cl (pH 7,5), y 100 \mug/ml de ADN espermático de salmón a 42ºC durante 18 horas. Se lavaron entonces a temperatura ambiente 3 x 10 minutos y entonces a 55ºC durante 15 minutos. La autoradiografía se llevó a cabo por l noche a -80ºC. Todas las placas se consiguieron por duplicado y las placas positivas se purificaron mediante 3 tandas adicionales de sembrado y recribado.
Aislamiento del ADNc de la subunidad \gamma de AMPK
Allí donde las secuencias peptídicas se listan en la presente memoria, las letras Y, H, N y R indican regiones de degeneración. Para la subunidad \gamma de AMPK, se generó un ADNc de 67 pares de bases mediante la técnica MOPAC descrita por Lee, C.C. y Caskey, C.T., (1990) en PCR Protocols, (Innis, M.A. Gelfand, D.H., Srinsky, J.J. y White T.J. editores), págs 46-53, Academic Press, Inc., Londres. Los cebadores degenerados de PCR se sintetizaron correspondiendo a las secuencias N y C-terminales de un péptido AMPK \gamma del hígado de la rata, de 17 aminoácidos (VVDIYSKFDVINLAAEK (SEC ID nº: 52). La secuencia del cebador con sentido fue GCGGATCCGTNGAYATH
TA (SEC ID nº: 53) y la secuencia del cebador antisentido fue CGGAATTCYTTYTCNGCNGCNA (SEC ID nº: 54). Los sitios BamHI y EcoRI se añadieron a los extremos 5' de estos cebadores. La estrategia fue crear una secuencia nucleótida no degenerada que corresponde a la parte media de la secuencia peptídica que podría utilizarse en la criba de la biblioteca. El ADNc total de hígado de rata, preparado con oligo-dT y hexámeros al azar (equipo de pre-amplificación GIBCO/BRL), se utilizó con PCR para amplificar un oligonucleótido de 67 unidades metaméricas (incluyendo cebadores) que corresponde a una parte del ADNc AMPK \gamma El producto PCR purificado se digirió con BamHI y EcoRI, o uniéndose al plásmido pBluescript para la transformación de las bacterias DH5\alpha. La hibridización colonial se utilizó para identificar clones de interés; las colonias se emplazaron, a partir de las placas de replicación, sobre los filtros de nitrocelulosa. Después de la lisis bacteriana y de la desnaturalización del ADN, los filtros se sondearon con una mezcla de dos sondas oligonucleótidas degeneradas, marcadas en el extremo con ^{32}P que corresponden a la secuencia aminoácida (KFDVINLA (SEC ID nº: 55) interna a la de los dos cebadores PCR. Estos oligonucleótidos (#1: AARTTYGAYGTNATHAAYCTNGC (SEC ID nº: 56); #2: AARTTYGAYGTNATHAAYTTRGC (SEC ID nº: 57)), se añadieron en una proporción de dos partes de oligo #1 a una parte de oligo #2 para reflejar la degeneración del codón Leu. Las colonias positivas se identificaron y el ADN plasmídico se aisló a partir de cada uno para análisis secuencial. Dicho ADNc se seleccionó y la secuencia oligonucleótida de 23 unidades metaméricas del "núcleo" no degenerado se sintetizó entonces para utilizar en el cribado de la biblioteca (CTCCAAGTTTGATGTTATCAACC (SEC ID nº: 58)). El cribado de 10^{6} placas aproximadamente con esta sonda, sin embargo, no produjo ningún clon positivo.
El ADNc de 23 unidades metaméricas no degenerado se utilizó entonces en conjugación con cebadores degenerados construidos a partir de otras dos secuencias peptídicas para generar un ADNc AMPK \gamma más voluminoso mediante PCR. Tanto los cebadores oligonucleótidos degenerados con sentido como los antisentido que corresponden a las secuencias peptídicas EELQIG (SEC ID nº: 59) y FPKPEFM (SEC ID nº: 60), se utilizaron conjuntamente con la secuencia con sentido no degenerada derivada de MOPAC para generar todos los productos PCR posibles, utilizando ADNc de hígado de rata como matriz. El producto más voluminoso (192 pares de bases) que se obtuvo, se subclonó en pCR-Script (Stratagene), y se secuenció. Esta secuencia que ahora tenía una secuencia aminoácida predicha que correspondía a los tres péptidos AMPK \gamma utilizados en la estrategia PCR, se utilizó entonces para el cribado de la biblioteca, como anteriormente. El cribado de 2 x 10^{6} placas con esta producto PCR más voluminoso dio lugar a varios clones positivos; sin embargo, ninguno de los ADNc de rata (1 a 1,3 kb) aislados correspondía a un marco de lectura abierto completo (de longitud total). En un esfuerzo para ampliar la secuencia al extremo 5' del ORF, se construyó una biblioteca de ampliación de cebadores, utilizando un cebador antisentido AMPK-\gamma específico (Stratagene; \lambda ZAPII). Un cribado adicional de esta biblioteca, aunque produjo alguna secuencia prolongada al extremo 5', no produjo el codón Met de iniciación. La aplicación de una estrategia 5'-RACE con ADNc de hígado de rata, no tuvo asimismo éxito al intentar la prolongación de la secuencia, aunque se obtuvo un producto 5'-RACE a partir del hígado porcino. La secuencia ADNc 5' más larga (520 pares de bases) de la rata se utilizó entonces para cribar una biblioteca hepática fetal humana, que produjo un ADNc AMPK \gamma completo.
Preparación del plásmido y secuenciación del ADN
El ADN plasmídico se preparó utilizando las columnas Qiagen Mini o Midi (Chatsworth, CA) según las instrucciones del fabricante. El ADN se secuenció, con cebadores vectoriales o génicos específicos, utilizando un equipo de Applied Biosystems Prism (tm) (Foster City, CA) de una reacción preparada para la Secuenciación Dioxi del Ciclo del Finalizador Colorante, ciclándose en un Termociclador PCR de Perkin-Elmer, según las instrucciones del fabricante. Los finalizadores de colorante se eliminaron de las reacciones secuenciales resultantes utilizando una columna Centri-Step (Princeton Separations, Inc). Las reacciones de secuenciación purificadas se secaron entonces en un Speed-Vac y se analizaron en un secuenciador automático de ADN (modelo 373 de Applied Biosystems).
Expresión bacteriana de ADNc
El ADNc completo de la subunidad \beta de AMPK de la rata y un ADNc de longitud parcial de la subunidad \gamma de AMPK (aa 33 a 331) se expresaron en E. coli utilizando el sistema vectorial pET, que introduce polihistidina (His6) y las secuencias señalizadoras del epítopo T7 de fusión (Novagen, Madison, WI). La expresión bacteriana se indujo con 1,0 mM IPTG a 37ºC durante 2 horas. La proteína expresada se detectó mediante tinción con azul de Coomassie e inmunotransferencia con el anticuerpo monoclonal anti-T7 (Novagen). Las proteínas de fusión se purificaron a partir de los cuerpos de inclusión de las bacterias mediante cromatografía de afinidad por el níquel bajo condiciones de desnaturalización. His6-AMPK \beta o His6-AMPK \gamma se solubilizaron a partir de los cuerpos de inclusión en 6 M urea, según las instrucciones del fabricante. Después de la aplicación de la muestra, la columna se lavó ampliamente con Tris-Cl (20 mM; pH 7,9), 0,5 M NaCl (0,5 M), imidazol (20 mM) y urea (6M). La proteína His-6 se eluyó con el mismo tampón, que contenía 300 mM de imidazol.
Expresión celular de ADNc
El ADNc completo de \beta de AMPK de rata, una \gamma de AMPK de longitud parcial de la rata (aa 33 a 331) y los ADNc completos de la subunidad \gamma de la AMPK humana se expresaron asimismo en las células COS7. Los ADNc se clonaron en un vector pMT2, alineado en un marco de lectura con un marcador epitópico (pMT2-HA) de la hemaglutinina (HA). La transfección se llevó a cabo utilizando el reactivo Lipofectamina (Gibco/BRL), según el protocolo general del fabricante. Las células se sembraron a razón de 3 x 10^{5}/pocillo en placas de 6 pocillos en DMEM que contenía suero fetal de ternera al 10% y penicilina/estreptomicina. Al día siguiente, las células se cambiaron a DMEM sin suero y sin antibióticos, y entonces se añadieron, diluidos en el mismo medio, conjugados de lipofectamina-ADN (2 \mug de ADN; 10 \mul de lipofectamina por pocillo). Después de 5 horas de incubación a 37ºC, se añadió a cada pocillo un volumen idéntico de medio que contenía suero fetal de ternera al 20%. A la mañana siguiente, el medio se cambió al medio celular original. Las células se recuperaron 48 horas después de la transfección. Después de lavar con PBS, las células se lisaron en un tampón que contenía Tris-Cl (50 mM;pH 7,5), NaCl (100 mM), NaF (50 mM), NaPP_{i} (5 mM), EDTA (1 mM), DTT (2 mM) y NP-40 (0,5%) con varios inhibidores de la proteasa.
Para la lisis completa, las células se situaron en hielo durante 15 minutos, seguido por el raspado y rotación vigorosa (15 segundos) del lisado. Después de eliminar los restos mediante una breve centrifugación, este lisado se utilizó para electroforesis en SDS gel e inmunotransferencia. Las transferencias se sondearon con un anticuerpo monoclonal anti-HA (derivado de la progenie de hibridoma 12CA5). Después de un sondeo secundario con un anticuerpo anti-IgG peroxidasa de ratón, los borrones (de la inmunotransferencia) se revelaron mediante ECL (Amersham).
Análisis de transferencia Northern
El ARN total se aisló de los tejidos de ratas macho Sprague -Dawley (con un peso de entre 150 y 200 gramos; Charles River) o de las glándulas mamarias para la lactación de ratas hembras, utilizando un procedimiento de isotiocianato de guanidio-cloruro de litio. Los ARN se fraccionaron sobre geles de agarosa/formaldehído al 1%, con una transferencia capilar a la nitrocelulosa (MSI). Las sondas de ADNc se marcaron mediante cebado al azar.
La hibridización se llevó a cabo en 5x Denhardt's, 0,2 M Tris (pH 7,4), 1 M NaCl y 0,1 mg/ml de ADN espermático de salmón a 42ºC durante 20 horas. Los filtros se lavaron secuencialmente con 2X SSPE/SDS al 0,1%, (temperatura ambiente; 2 x 15 minutos), 0,2 X SSPE/SDS al 0,1% (temperatura ambiente; 2 x 15 minutos), y con 0,2X SSPE/SDS al 0,1% (55ºC; 2 x 15 minutos). La autoradiografía se llevó a cabo a -80ºC durante 18-48 horas en una película Kodak XAR con pantallas de potenciación.
Análisis de la secuencia del ADN y de las secuencias de ADN
Las secuencias de ADN se analizaron utilizando el paquete de software GCG y el MacVector®. Las secuencias se compararon con la base de datos, utilizando BLAST y GCG; las alineaciones de los aminoácidos se realizaron utilizando el programa Pileup de GCG. Las secuencias se formatearon utilizando un Excel® macro. Las secuencias de ADN que se describen en la presente memoria se han depositado en el GenBank con los siguientes números de registro: AMPK \beta de hígado de rata (U42411), AMPK \gamma de hígado de rata (U42413) y AMPK \gamma de hígado fetal humano (U42412).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Dartmouth College, St. Vicents Institute of Medical Research, Kemp et al.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nueva proteína quinasa activada por AMP
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 64
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DIRECCIÓN: Jane Massey Licata, Esq.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 210 Lake Drive East, Suite 201
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Cherry Hill
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: NJ
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: U.S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CP: 08002
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: DISQUETE, 3,5 PULGADAS, 1.44 Mb
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM 486
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: WINDOWS PARA GRUPOS DE TRABAJO
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: WORDPERFECT 5.1
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US97/00270
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 enero 1997
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: PN7450
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 8 ENERO 1996
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
DATOS DE ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Jane Massey Licata
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO:32.257
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO: DC-0028
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (609) 779-2400
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FAX: (609) 779-8488
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 347
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 1
1 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Ser Phe Leu Asp Asp His His Leu Thr Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 56
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 70
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 4
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 64
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 5
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 6
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 257
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 6
\vskip1.000000\baselineskip
5
6 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 7
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 55
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 7
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 8
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Leu Asp Asp His His Leu Thr Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 9
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 56
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 9
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 10
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Pro Asn Asp Ile Met Ala Glu Val Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 11
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 70
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 11
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 12
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 64
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 12
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 13
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Gly Arg Val Lys Ile Gly His Tyr Ile Leu Gly Asp Thr Leu}
\sac{Gly Val Gly Thr Phe Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 14
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Glu Lys Glu Ser Arg Arg Leu Phe Gln Gln Ile Leu Ser Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 15
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Leu Lys Pro Glu Asn Val Leu Leu Asp Ala His Met Asn Ala}
\sac{Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Asn Met Met Ser Asp Gly Glu}
\sac{Phe Leu Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 16
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Val Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Ala Gly Pro Glu Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 17
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Met Leu Gln Val Asp Pro Met Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 18
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Asp Ile Arg Glu His Glu Xaa Phe Lys Gln Asp Leu Pro Lys}
\sac{Tyr Leu Phe Pro Glu Asp Pro Ser Tyr Ser Xaa Thr Met Ile Asp}
\sac{Asp Glu Ala Leu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 19
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Gln Asp Pro Leu Ala Val Ala Tyr His Leu Ile Ile Asp}
\sac{Asn Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 20
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Phe Tyr Leu Ala Thr Ser Pro Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 21
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Ser phe Leu Asp Asp His His Leu Thr Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 22
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Pro Phe Leu Val Ala Glu Ala Glu Thr Pro Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 23
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Glu Leu Asn Pro Gln Lys Xaa Lys His Gln Gly Val Arg Lys}
\sac{Ala Lys Xaa His Leu Gly Ile Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 24
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Asp Tyr Glu Xaa Lys Val Val Asn Pro Tyr Tyr Leu Arg}
\sac{Val Arg Arg Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 25
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Met Ser Leu Gln Leu Tyr Gln Val Asp Ser Arg The Tyr Leu}
\sac{Leu Asp Phe Arg Ser Ile Asp Asp Xaa Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 26
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Ala Glu Ala Gln Gly Lys Ser Ser Glu Ala Ser Leu Thr Xaa}
\sac{Ser Val Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 27
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Gly His Tyr Ile Leu Gly Asp Thr Leu Gly Val Gly Thr Phe}
\sac{Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 28
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 28
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Tyr Gln Val Ile Ser Thr Pro Ser Asp Ile Phe Met Val Met}
\sac{Glu Tyr Val Ser Gly Gly Glu Leu Phe Asp Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 29
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Leu Phe Gln Gln Ile Leu Ser Gly Val Asp Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 30
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 30
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Leu Lys Pro Glu Asn Val Leu Leu Asp Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 31
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 31
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Asn Met Met Ser Asp Gly Glu Phe}
\sac{Leu Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 32
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 32
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ile Xaa Asp Gly Ile Phe Tyr Thr Pro Gln Tyr Leu Asn Pro}
\sac{Xaa Val Ile Xaa Leu Leu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 33
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 33
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Ile Arg Glu His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 34
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 34
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Leu Phe Pro Glu Asp Pro Ser Tyr Ser Xaa Xaa Met Ile Asp}
\sac{Asp Glu Ala Leu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 35
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 35
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn His Gln Asp Pro Leu Ala Val Ala Tyr His Leu Ile Ile Asp}
\sac{Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 36
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 36
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Phe Tyr Leu Ala Thr Xaa Pro Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 37
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 37
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Xaa Phe Leu Asp Asp His Xaa Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 38
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 38
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Pro Phe Leu Val Ala Glu Thr Pro Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 39
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 39
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp His Leu Gly Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 40
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 40
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gln Ser Arg Pro Asn Ile Met Ala Glu Val Xaa Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 41
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 41
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Val Asn Pro Tyr Tyr Leu Arg Val Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 42
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 42
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Ser Leu Gln Leu Tyr Gln Val Asp Ser Arg Thr Tyr Leu Leu}
\sac{Leu Phe Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 43
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 43
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Asp Ser Asp Ala Glu Ala Gln Gly Lys Pro Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 44
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1647
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 44
\vskip1.000000\baselineskip
11
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 45
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 45
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Phe Tyr Leu Ala Thr Ser Pro Pro Asp Ser Phe Leu Asp Asp}
\sac{His His Leu Thr Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 46
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 46
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Leu Ser Arg Thr Leu Ser Val Ala Ala Lys lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 47
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 47
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Lys Lys Leu Thr Leu Arg Ala Ser Phe Ser Ala Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 48
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 14
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 48
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gly Leu Lys Pro His Pro Glu Arg Met Pro Pro Leu Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 49
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 49
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Met Arg Ser Ala Met Ser Gly Leu His Leu Val Lys Arg Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 50
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 50
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Phe Tyr Leu Ala Thr Ser Pro Pro Asp Ser Phe Leu Asp Asp}
\sac{His His Leu Thr Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 51
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 51
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asp Asp Ser Ala Met His Ile Pro Pro Gly Leu Lys Pro His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 52
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 52
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Val Asp Ile Tyr Ser Lys Phe Asp Val Ile Asn Leu Ala Ala}
\sac{Hlu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 53
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 53
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Thr Asn Gly Ala Tyr Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 54
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 54
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Gly Ala Ala Thr Thr Cys Tyr Thr Thr Tys Thr Cys Asn}
\sac{Gly Cys Asn Gly Cys Asn Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 55
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 55
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Phe Asp Val Ile Asn Leu Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 56
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 56
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ala Arg Thr Thr Tyr Gly Ala Tyr Gly Thr Asn Ala Thr His}
\sac{Ala Ala Tyr Cys Thr Asn Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 57
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 57
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ala Arg Thr Thr Tyr Gly Ala Tyr Gly Thr Asn Ala Thr His}
\sac{Ala Ala Tyr Thr Thr Arg Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 58
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 58
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Thr Thr Thr Gly Ala Thr Gly Thr}
\sac{Thr Ala Thr Cys Ala Ala Cys Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 59
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 59
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Glu Leu Gln Ile Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 60
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 60
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Pro Lys Pro Glu Phe Met}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 61
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1978
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 61
\vskip1.000000\baselineskip
13
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 62
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 270
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 62
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 63
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1576
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 63
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 64
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 331
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 64
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 65
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 2761
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 65
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 66
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1783
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 66
\vskip1.000000\baselineskip
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 67
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATGATCACC ATTTAACTCG GCCTCACCCT GAGAGAGTAC CATTC 
\hfill
45

Claims (7)

1. Secuencia de ácido nucleico que codifica la AMPK \alpha_{1} de mamífero, que comprende la secuencia de ácido nucleico SEC ID nº: 44.
2. Vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1.
3. Célula huésped que comprende un vector según la reivindicación 2.
4. Polipéptido recombinante codificado por la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1.
5. Procedimiento para producir la AMPK \alpha_{1} de mamífero, que comprende:
(a)
cultivar células según la reivindicación 3, bajo condiciones que permitan la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica la AMPK \alpha_{1} de mamífero; y
(b)
recuperar la AMPK \alpha_{1} expresada a partir de la célula.
6. Sonda oligonucleótida que comprende por lo menos 10 nucleótidos, siendo capaz dicha sonda oligonucleótida de hibridizarse a una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1, que tiene la SEC ID nº: 67, que codifica los aminoácidos 352-366 de la AMPK \alpha_{1}, pero no a una secuenciación de ácido nucleico que codifica un polipéptido AMPK \alpha_{2} de mamífero, codificado por moléculas de ácido nucleico que tienen las secuencias SEC ID nº: 65 ó 66.
7. Polipéptido purificado o fragmento de éste biológicamente activo codificado por una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que dicho fragmento biológicamente activo no se encuentra en un polipéptido AMPK \alpha_{2} de mamífero, codificado por moléculas de ácido nucleico que tienen las secuencias SEC ID nº: 65 ó 66 y comprende:
(a)
por lo menos una parte de SEC ID n^{os}: 1-12, 15-32, 35-38, 40 ó 43
(b)
SEC ID n^{os}: 14, 34, 39, 41 ó 42;
(c)
conserva la capacidad para estimular la fosforilación de moléculas proteicas; o
(d)
conserva la capacidad para imitar la unión del polipéptido AMPK \alpha_{1} original a por lo menos un anticuerpo o molécula del substrato.
ES97902865T 1996-01-08 1997-01-07 Nueva proteina quinasa activada por amp. Expired - Lifetime ES2251015T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AUPN745096 1996-01-08
AUPN7450A AUPN745096A0 (en) 1996-01-08 1996-01-08 Novel amp activated protein kinase

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2251015T3 true ES2251015T3 (es) 2006-04-16

Family

ID=3791768

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES97902865T Expired - Lifetime ES2251015T3 (es) 1996-01-08 1997-01-07 Nueva proteina quinasa activada por amp.

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP0873354B1 (es)
JP (1) JP4448201B2 (es)
AU (2) AUPN745096A0 (es)
CA (1) CA2241786C (es)
DE (1) DE69734817T2 (es)
ES (1) ES2251015T3 (es)
WO (1) WO1997025341A1 (es)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000018895A1 (en) * 1998-09-25 2000-04-06 The Children's Medical Center Corporation Short peptides which selectively modulate the activity of protein kinases
KR100806954B1 (ko) * 1999-09-10 2008-02-22 엥스티튀 나시오날 드 라 르세르쉬 아그로노미끄 ＡＭＰＫ의 γ사슬 변이체, 이를 코드하는 ＤＮＡ 서열 및 그의 용도
US20020142310A1 (en) * 2000-04-07 2002-10-03 Leif Andersson Variants of the human AMP-activated protein kinase gamma 3 subunit
AUPR972801A0 (en) * 2001-12-21 2002-01-24 St. Vincent's Institute Of Medical Research Oligosaccharide binding domains
WO2003064466A1 (en) * 2002-02-01 2003-08-07 Arexis Ab Variants of the alpha 1 subunit of human ampk
US20050155091A1 (en) * 2002-02-01 2005-07-14 Thomas Svensson Prkag3 gene promoter and uses thereof
DK1476012T3 (da) 2002-02-01 2010-05-31 Arexis Ab Transgene mus, der udtrykker PRKAG3
JP4585186B2 (ja) * 2003-07-31 2010-11-24 杏林製薬株式会社 肥満、糖尿病及び脂質代謝異常の新規な予防又は治療剤
GB0715284D0 (en) * 2007-08-06 2007-09-12 Medical Res Council Crystal structure of ampk and uses thereof
WO2014180908A1 (en) * 2013-05-08 2014-11-13 Deutsches Krebsforschungszentrum Acip/peptide-based inhibition of cancer cachexia

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994028116A1 (en) * 1993-05-21 1994-12-08 Zeneca Limited Nucleic acid encoding amp-activated protein kinase

Also Published As

Publication number Publication date
EP0873354B1 (en) 2005-12-07
AUPN745096A0 (en) 1996-02-01
EP0873354A1 (en) 1998-10-28
DE69734817D1 (de) 2006-01-12
AU714905B2 (en) 2000-01-13
WO1997025341A1 (en) 1997-07-17
DE69734817T2 (de) 2006-06-29
JP4448201B2 (ja) 2010-04-07
EP0873354A4 (en) 2002-01-09
CA2241786A1 (en) 1997-07-17
CA2241786C (en) 2010-05-25
JP2000503202A (ja) 2000-03-21
AU1693697A (en) 1997-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wymann et al. Wortmannin inactivates phosphoinositide 3-kinase by covalent modification of Lys-802, a residue involved in the phosphate transfer reaction
Alessi et al. Mechanism of activation of protein kinase B by insulin and IGF‐1.
Volinia et al. A human phosphatidylinositol 3‐kinase complex related to the yeast Vps34p‐Vps15p protein sorting system.
Woods et al. The kinase DYRK1A phosphorylates the transcription factor FKHR at Ser329 in vitro, a novel in vivo phosphorylation site
Walsh et al. The inhibitor protein of the cAMP-dependent protein kinase
US20060228346A1 (en) Constitutively active phosphatidylinositol 3-kinase and uses thereof
CA2383244A1 (en) Protein kinases
US20030229209A1 (en) Extracellular signal-regulated kinase sequences and methods of production and use
JPH09503213A (ja) プロスタグランジンレセプターｉｐをコードするｄｎａ
ES2251015T3 (es) Nueva proteina quinasa activada por amp.
Lim et al. SPIN90 (SH3 ProteinInteracting with Nck, 90 kDa), an Adaptor Protein That Is Developmentally Regulated during Cardiac Myocyte Differentiation
ES2254151T3 (es) Proteina de union al antigeno de goodpasture.
US6124125A (en) AMP activated protein kinase
Rosorius et al. Characterization of phosphorylation sites in the cytoplasmic domain of the 300 kDa mannose-6-phosphate receptor
NO338436B1 (no) Antistoffer mot NIK og fremstilling og anvedelse derav
US5716818A (en) Protein tyrosine kinase
US7195762B2 (en) Density enhanced protein tyrosine phosphatases
RENDÓN-HUERTA et al. Characterization of calreticulin as a protein interacting with protein kinase C
US5821069A (en) Method for determining tyrosine kinase in a sample
ES2230586T3 (es) Proteina tab1 y asdn que la codifica.
US6753413B1 (en) P35NCK5A binding proteins
WO1999001559A1 (en) Novel mapk kinase
EP0560890B1 (en) A novel protein tyrosine kinase
US5573935A (en) Protein tyrosine kinase A6
US7794995B2 (en) Purified PKB Ser 473 kinase and uses thereof