ES2251420T3

ES2251420T3 - Metodo para tratar tejidos.

Info

Publication number: ES2251420T3
Application number: ES00990711T
Authority: ES
Inventors: Steven Unilever Research Colworth HOWELL; Julie Unilever Research Colworth LITTLE; C.P.E. Unilever Res.Vlaardingen VAN DER LOGT; Neil James Unilever Research Colworth PARRY
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-08
Publication date: 2006-05-01
Anticipated expiration: 2020-12-08
Also published as: DE60023555T2; US20020019324A1; US6579842B2; EP1246898A2; WO2001046356A2; CA2394722A1; WO2001046356A3; DE60023555D1; ATE307871T1; AR027082A1; BR0016659A; CA2394722C; AU3009401A; ZA200204465B; EP1246898B1

Abstract

Un método para aplicar un agente beneficioso a un tejido para llevar a cabo una actividad predeterminada, que comprende el tratamiento previo de dicho tejido con una molécula de unión multiespecífica, teniendo dicha molécula de unión una alta afinidad de unión a dicho tejido a través de una especificidad y siendo capaz de capturar y unirse a dicho agente beneficioso a través de otra especificidad, seguido por la puesta en contacto de dicho tejido pretratado con dicho agente beneficioso para llevar a cabo dicha actividad predeterminada con dicho tejido, donde dicha molécula de unión es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, o un derivado de los mismos.

Description

Método para tratar tejidos.

Campo técnico

La presente invención se relaciona generalmente con la utilización de moléculas multiespecíficas, y en particular anticuerpos multiespecíficos, para el tratamiento de tejidos, especialmente prendas de vestir, con un agente beneficioso. Más concretamente, la invención se relaciona con un método para aplicar un agente beneficioso a un tejido para llevar a cabo una actividad predeterminada. En un modo de realización preferido, la invención se relaciona con un método de decoloración de manchas sobre tejidos que comprende la utilización de moléculas multiespecíficas para el tratamiento previo de tejidos con manchas.

Antecedentes y técnica anterior

Los agentes multifuncionales, en particular los multiespecíficos, incluyendo los biespecíficos, son suficientemente conocidos en la técnica. El gluteraldehído, por ejemplo, es ampliamente utilizado como agente de unión o de entrecruzamiento. El desarrollo de anticuerpos bifuncionales y multifuncionales ha abierto un amplio rango de nuevas oportunidades en diversos campos tecnológicos, en particular en diagnóstico, pero también en el área de los detergentes.

El documento WO-A-98/56885 (Unilever) divulga una enzima decolorante que es capaz de generar un compuesto químico decolorante y que tiene una alta afinidad para unirse a las manchas presentes en tejidos, así como una composición enzimática decolorante que contiene dicha enzima decolorante, y un proceso para decolorar manchas en los tejidos. La afinidad de unión se puede deber a una parte de la cadena polipeptídica de la enzima decolorante o la enzima puede tener un elemento que sea capaz de generar un compuesto químico decolorante que se asocie a un reactivo con alta afinidad para unirse a las manchas presentes en los tejidos. En el último caso, el reactivo puede ser biespecífico, teniendo una especificidad para las manchas y otra para la enzima. Ejemplos de reactivos biespecíficos como los mencionados en la divulgación son anticuerpos, especialmente los derivados de Camelidae que tienen solo una región variable del polipéptido de la cadena pesada (V_{HH}), péptidos, mímicos de péptidos y otras moléculas orgánicas. La enzima, que tiene un enlace covalente con un punto funcional del anticuerpo, es usualmente una oxidasa, como por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y alcohol oxidasa, que es capaz de formar peróxido de hidrógeno u otro agente decolorante. Así, si el reactivo multiespecífico es un anticuerpo, la enzima forma un conjugado enzima/anticuerpo que constituye uno de los ingredientes de una composición detergente. Durante el lavado, dicho conjugado enzima/anticuerpo de la composición detergente es dirigido hacia las manchas en la ropa por otro punto funcional del anticuerpo, mientras la enzima conjugada cataliza la formación de un agente decolorante en las proximidades de la mancha, y la mancha será sujeta a decoloración.

El documento WO-A-98/00500 (Unilever) divulga composiciones detergentes en las que se aplica un agente beneficioso sobre un tejido a través de un medio para la deposición de un péptido o proteína que tiene una alta afinidad por el tejido. El agente beneficioso puede ser un agente suavizante de tejidos, un perfume, un lubricante polimérico, un agente fotosensible, látex, resina, un agente fijador del tinte, material encapsulado, un antioxidante, un insecticida, un agente antimicrobiano, un agente repelente de la suciedad o un agente eliminador de la suciedad. El agente beneficioso se encuentra unido a o adsorbido en un medio para la deposición de péptidos o proteínas que tiene una alta afinidad por el tejido. Preferiblemente, el medio para la deposición es una proteína de fusión que contiene el dominio de unión a la celulosa de una enzima de celulasa. Se afirma que las composiciones depositan efectivamente el agente beneficioso sobre el tejido durante el ciclo de lavado.

De acuerdo con el documento DE-A-196 21 224 (Henkel), se puede evitar el traspaso de tintes de una prenda de vestir a otra durante el proceso de lavado o aclarado mediante la adición al líquido de lavado o aclarado de anticuerpos contra el tinte.

El documento WO-A-98/07820 (P&G) divulga, entre otras, composiciones de tratamiento de aclarado que contienen anticuerpos dirigidos a la celulasa y suavizantes estándar activos (como, por ejemplo, DEQA).

Los documentos WO-A-98/23716, WO-A-00/36094, WO-A-01/32848 y WO-A-01/14629 también divulgan composiciones decolorantes con una alta afinidad por las pieles y los tejidos.

Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que un proceso en dos etapas en el que se combinan unas moléculas multiespecíficas para un tratamiento preliminar de un tejido, y a continuación una etapa en la que se combina un agente beneficioso con dichas moléculas multiespecíficas, dará como resultado un direccionamiento más eficiente del agente beneficioso hacia el tejido y, en consecuencia, un proceso en el que el agente beneficioso puede ejercer su actividad esperada más eficientemente.

Sobre la base de este principio, la invención se puede poner en práctica según varios modos de realización, que se explicarán más abajo.

Resumen de la invención

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para aplicar un agente beneficioso a un tejido para que ejerza una actividad predeterminada que comprende un tratamiento preliminar de dicho tejido con una molécula de unión multiespecífica, teniendo dicha molécula de unión una alta afinidad por dicho tejido a través de una de sus especificidades y siendo capaz de capturar y unirse a dicho agente beneficioso a través de otra de sus especificidades, poniéndose en contacto a continuación dicho tejido pretratado con dicho agente beneficioso, para que este ejerza dicha actividad predeterminada sobre dicho tejido.

Breve descripción de los gráficos

La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos del inserto HindIII/EcoRI del plásmido Fv4715-myc que codifica pelB líder-VH4715 y pel líder-VL4715.

La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos del inserto HindIII/EcoRI del plásmido scFv4715-myc que codifica pelB líder-VH4715-linker-VL4715.

La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos del inserto HindIII/EcoRI del plásmido Fv3299-hidro2 que codifica pelB líder-VH3299 y pel líder-VL3299 con cola hidrofilo2.

La Figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos del inserto HindIII/EcoRI del plásmido Fv3418 que codifica pelB líder-VH3418 y pel líder-VL3418.

La Figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos del inserto HindIII/EcoRI del plásmido pOR4124 que codifica pelB líder-VLlys-linker-VHlys.

La Figura 6 muestra que una superficie activada puede recoger la glucosa oxidasa (A: HCG, anticuerpo biespecífico, glucosa oxidasa; B: HCG, glucosa oxidasa; C: no HCG, anticuerpo biespecífico, glucosa oxidasa).

La Figura 7 proporciona una visión diagramática de una estrategia de clonación para obtener un anticuerpo biespecífico.

La Figura 8 muestra el alineamiento predicho de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos biespecíficos. Los CDRs Kabat, las colas de detección y purificación están enmarcados; las diferencias en los aminoácidos están en negrita.

La Figura 9 muestra que una superficie de vino tinto activada con un anticuerpo biespecífico (Fig 9 A) puede recoger más glucosa oxidasa de la que puede unirse a una superficie de vino cuando se mezclan el anticuerpo biespecífico y la glucosa oxidasa en un solo paso (Fig 9 B).

La Figura 10 muestra el constructo de ADN pUR4536.

La Figura 11 muestra el constructo de ADN pPIC9.

La Figura 12 muestra la secuencia de ADN del anti-RR6-VHH8-his-CBD.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona en un aspecto la aplicación de una molécula de unión multiespecífica a un tejido con el que tiene una alta afinidad de unión a través de una especificidad, para permitir que un agente beneficioso, que es capaz de capturar y unirse a dicha molécula de unión a través de otra especificidad, pueda ejercer una actividad predeterminada en estrecha proximidad del tejido pretratado.

El término "molécula de unión multiespecífica", tal como se utiliza en la presente solicitud, se refiere a una molécula que puede, al menos, fijarse sobre un tejido y también capturar a un agente beneficioso. De forma similar, el término "molécula de unión biespecífica", tal como se utiliza en la presente solicitud, indica una molécula que puede fijarse sobre un tejido y capturar a un agente beneficioso.

En un primer paso previo al tratamiento, la molécula de unión se aplica directamente sobre el tejido, por ejemplo, una prenda de vestir, preferiblemente a una relativamente alta concentración, permitiéndose así que la molécula se una al tejido de una forma eficiente. En un segundo paso, la molécula de unión se pone en contacto con el agente beneficioso que usualmente se encuentra en una dispersión o solución, preferiblemente una solución acuosa, permitiéndose así que el agente beneficioso se una a la molécula de unión a través de otra especificidad de dicha molécula de
unión.

La molécula de unión multiespecífica puede ser cualquier molécula apropiada que tenga, al menos, dos funcionalidades, i.e., que tenga una alta afinidad para unirse al tejido que se desea tratar y sea capaz de unirse a un agente beneficioso, no interfiriendo de ese modo con la actividad predeterminada del agente beneficioso y otras actividades posibles previstas. En un modo de realización preferido, dicha molécula de unión es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, o un derivado de estos.

La presente invención se puede utilizar ventajosamente en, por ejemplo, el tratamiento de manchas sobre tejidos, preferiblemente mediante la decoloración de dichas manchas. En un primer paso se aplica la molécula de unión, preferiblemente sobre la mancha. El agente beneficioso que se une a continuación a la molécula de unión es preferiblemente una enzima o parte de una enzima, más preferiblemente una enzima o una enzima capaz de catalizar la formación de un agente decolorante bajo las condiciones de uso. La enzima o parte de la enzima entra generalmente en contacto con la molécula de unión (y las manchas) al sumergir el tejido pretratado en una dispersión o solución que contiene la enzima o parte de la enzima. La dispersión o solución, que es generalmente, aunque no necesariamente, una dispersión o solución acuosa contiene también ingredientes para generar el agente decolorante, o dichos ingredientes se añaden más tarde. Preferiblemente, la enzima o parte de la enzima y los otros ingredientes mencionados que producen un decolorante se han incorporado a una composición para lavado, y la etapa de unión de la enzima (o parte de la misma) a la molécula de unión y la generación del agente decolorante se llevan a cabo durante el lavado. Como alternativa, el agente beneficioso se puede añadir antes o después del lavado, por ejemplo en el aclarado o antes del
planchado.

El direccionamiento del agente beneficioso según la invención, que en este ejemplo típico es una enzima decolorante, da como resultado una concentración más alta de agente decolorante en las proximidades de las manchas que se desean tratar, antes, durante o después del lavado. Por otra parte, se necesita menos enzima decolorante en comparación con métodos de tratamiento de manchas que no dirigen o dirigen menos eficientemente.

Otro ejemplo típico y preferido de utilización de la presente invención consiste en dirigir una fragancia (como, por ejemplo, un perfume) al tejido para aplicar o capturar la fragancia de modo que se libere a lo largo del tiempo. Otra utilización típica adicional de la presente invención es el tratamiento de un tejido cuyo color se ha debilitado, dirigiendo un agente beneficioso al área para colorear la zona. De forma similar, un área deteriorada de un tejido puede ser sometida a (pre)tratamiento para dirigir un reparador de fibras de celulosa que se unen a través de los anticuerpos a dicha área. Estos agentes, por ejemplo, se pueden añadir convenientemente al tejido pretratado tras el lavado, en el aclarado.

Otras aplicaciones, como, por ejemplo, la utilización de agentes suavizantes de tejidos, lubricantes poliméricos, agentes fotoprotectores, látex, resinas, agentes fijadores de tinte, productos antioxidantes encapsulados, insecticidas, agentes antimicrobianos, agentes repelentes de la suciedad o agentes eliminadores de la suciedad, así como otros agentes preferidos y formas y momentos de añadir los agentes al tejido pretratado, entran por completo dentro de la destrezas normales de una persona experimentada en la técnica.

Para que se comprenda de forma más completa, ciertos elementos de la presente invención se describirán a continuación con más detalle. También se hace referencia al documento WO-A-98/56885, citado más arriba, el contenido del cual se incorpora aquí por referencia.

1.0 Moléculas de unión

En la primera etapa según la invención, se aplica al tejido una molécula de unión multiespecífica que tiene una alta afinidad por dicha área a través de una especificidad.

El grado de unión de un compuesto A a otra molécula B se puede expresar generalmente mediante la constante de equilibrio químico K_{d} que resulta de la siguiente reacción:

[A]+[B] \Leftrightarrow[A\equiv B]

La constante de equilibrio químico K_{d} viene dada por:

K_{d} = \frac{[A] \times [B]}{[A\equiv B]}

Si la unión de una molécula al tejido es específica o no, se puede establecer a partir de la diferencia entre la unión (el valor de K_{d}) de la molécula a un tipo de tejido frente a la unión a otro tipo de material textil. Para las aplicaciones de lavado de ropa, dicho material será un tejido como, por ejemplo, algodón, poliéster, algodón/poliéster o lana. En cualquier caso, normalmente será más conveniente medir los valores de K_{d} y las diferencias en los valores de K_{d} sobre otros materiales como, por ejemplo, bandejas de pocillos de poliestireno o una superficie especializada en un biosensor analítico. La diferencia entre las dos constantes de unión debe ser como mínimo 10, preferiblemente más de 100 y, más preferiblemente, más de 1000. Típicamente, la molécula debe unirse al tejido, o al material sucio, con una K_{d} inferior a 10^{-4} M, preferiblemente inferior a 10^{-6} M y puede ser 10^{-10} M o incluso menos. Afinidades de unión más altas (K_{d} de menos de 10^{-5} M) y/o una diferencia mayor entre un tipo de tejido y otro (o unión de fondo) incrementarán la deposición del agente beneficioso. También se incrementará la eficiencia en peso de la molécula en la composición total y se necesitarán cantidades menores de la molécula.

Se pueden considerar diversas clases de moléculas de unión que tienen la capacidad de unión específica respecto a los tejidos a los que uno quisiera aplicar el agente beneficioso. A continuación daremos unos cuantos ejemplos de tales moléculas con dicha capacidad, sin pretender ser exhaustivos. En conexión con esto, también se hace referencia al documento WO 98/56885 (Unilever), cuya divulgación se incorpora en la presente solicitud por referencia.

1.1 Anticuerpos

Los anticuerpos son ejemplos de compuestos suficientemente conocidos capaces de unirse a compuestos contra los que fueron inducidos. Los anticuerpos se pueden obtener de diversas fuentes. A partir de ratones, se pueden obtener anticuerpos monoclonales que poseen afinidades de unión muy altas. A partir de dichos anticuerpos, se pueden preparar fragmentos Fab, Fv o scFv que conservan sus propiedades de unión. Dichos anticuerpos o fragmentos se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante mediante fermentación microbiana. Las levaduras, mohos o bacterias son hospedadores suficientemente conocidos para la producción de anticuerpos y sus fragmentos.

Una clase de anticuerpos de especial interés está formada por los anticuerpos de Cadena Pesada que se encuentra en Camelidae, como el camello o la llama. Los dominios de unión de estos anticuerpos constan de un único fragmento polipeptídico, en particular la región variable del polipéptido de la cadena pesada (V_{HH}). En cambio, en los anticuerpos clásicos (murinos, humanos, etc.), el dominio de unión está constituido por dos cadenas polipeptídicas (las regiones variables de la cadena pesada (V_{H}) y de la cadena ligera (V_{L})). En los documentos WO-A-94/04678 (Casterman y Hamers) y WO-A-94/25591 (Unilever y la Universidad Libre de Bruselas) se han descrito procedimientos para obtener inmunoglobulinas de cadena pesada de Camelidae o fragmentos (funcionalizados) de las mismas.

Como alternativa, se pueden obtener dominios de unión a partir de los fragmentos V_{H} de anticuerpos clásicos mediante un procedimiento denominado "camelización". Mediante este procedimiento, el fragmento V_{H} clásico se transforma, por sustitución de algunos aminoácidos, en un fragmento de tipo V_{HH} por medio del cual se conservan sus propiedades de unión. Este procedimiento ha sido descrito por Riechman y otros en algunas publicaciones (J. Mol. Biol. (1996) 259, 957-969; Protein. Eng. (1996) 9 531-537; Bio/Technology (1995) 13, 475-479). También pueden producirse fragmentos V_{HH} mediante técnicas de ADN recombinante en algunos hospedadores microbianos (bacterias, levaduras, mohos), como se describe en el documento WO-A-94/29457 (Unilever).

Los métodos para producir proteínas de fusión que comprenden una enzima y un anticuerpo o que comprenden una enzima y un fragmento de anticuerpo son ya conocidos en la técnica. Neiberger y Rabbits (documento EP-A-194 276) describen una posible vía. En el documento WO-A-94/25591 se describe un método para producir una proteína de fusión que contiene una enzima y un fragmento de anticuerpo que se obtuvo a partir de un anticuerpo procedente de Camelidae. Holliger y otros (1993) PNAS 90, 6444-6448 describen un método para producir fragmentos de anticuerpos biespecíficos.

El documento WO-A-99/23221 (Unilever) divulga proteínas de unión a un antígeno multivalente y multiespecífico, así como métodos para su producción, que contienen un polipéptido con dos o más unidades de unión de un único dominio en serie que son, preferiblemente, dominios variables de una cadena pesada obtenida a partir de inmunoglobulina desprovista naturalmente de cadenas ligeras, en particular las obtenidas a partir de inmunoglobulinas de camélido.

Una posible vía alternativa a la utilización de proteínas de fusión es la del entrecruzamiento químico de residuos en una proteína para que se una de forma covalente a la segunda proteína mediante reacciones químicas de unión convencionales, como se describe, por ejemplo, en Bioconjugate Techniques, G.T. Hermanson, Ed. Academic Press, Inc. San Diego, CA, USA. Los residuos de aminoácidos que incorporan grupos sulfhidrilo, como, por ejemplo, la cisteína, se pueden unir de forma covalente mediante un reactivo biespecífico como, por ejemplo, succinimidilmaleimidofenilbutirato (SMPB). Como alternativa, los grupos de lisina que se encuentran en la superficie de la proteína se pueden unir con grupos carboxilo activados de la segunda proteína mediante una unión carbodiimida convencional utilizando 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS).

Una característica particularmente atractiva del comportamiento de unión de los anticuerpos es su conocida capacidad para unirse a una "familia" de moléculas estructuralmente relacionadas. Por ejemplo, en Gani y otros (J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 48, 277-282) se describe un anticuerpo que fue inducido contra la progesterona pero que también se une a los esteroides estructuralmente relacionados, pregnanodiona, pregnanolona y 6-hidroxi-progesterona. Por lo tanto, utilizando la misma aproximación, se pueden identificar anticuerpos que se unan a una "familia" completa de cromóforos de manchas (como, por ejemplo, polifenoles, porfirinas o carotenoides, como se describe más abajo). Un anticuerpo de gran campo de acción como éste se puede utilizar para tratar varias manchas diferentes cuando se une a una enzima decolorante.

1.2 Proteínas de fusión que contienen un dominio de unión a celulosa (CBD)

Otra clase de moléculas de unión apropiadas y preferidas para el propósito de la presente invención son las proteínas de fusión que contienen un dominio de unión a celulosa y un dominio que tiene una alta afinidad de unión a otro ligando. El dominio de unión a celulosa forma parte de la mayoría de las enzimas de celulasa y se puede obtener a partir de las mismas. Los CBD también se pueden obtener a partir de la xilanasa y otras enzimas que degradan la hemicelulasa. Preferiblemente, el dominio de unión a celulosa se puede obtener a partir de un origen de enzima micótica como, por ejemplo, Humicola, Trichoderma, Thermonospora, Phanerochaete y Aspergillus, o a partir de un origen bacteriano como, por ejemplo Bacillus, Clostridium, Streptomyces, Cellulomonas y Pseudomonas. Especialmente preferido es el dominio de unión a celulosa que se puede obtener a partir de Trichoderma reesei.

En la proteína de fusión, el dominio de unión a celulosa está fusionado a un segundo dominio que tiene una alta afinidad de unión a otro ligando. Preferiblemente, el dominio de unión a celulosa está conectado al dominio que tiene una alta afinidad de unión al otro ligando por medio de un enlazador, constituido por 2-15, preferiblemente 2-5 aminoácidos.

El segundo dominio con una alta afinidad de unión a otro ligando puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Son especialmente preferidos los anticuerpos de cadena pesada como, por ejemplo, los que se encuentran en Camelidae.

El conjunto del CBD y el anticuerpo se une al tejido a través de la región CBD, permitiendo de este modo que el dominio del anticuerpo se una a los antígenos correspondientes que contiene, o forman parte de, el agente beneficioso.

1.3 Péptidos

Los péptidos tienen generalmente menos afinidades de unión a las sustancias de interés que los anticuerpos. No obstante, las propiedades de unión de algunos péptidos cuidadosamente escogidos o diseñados pueden ser suficientes para proporcionar la selectividad deseada para unirse a un agente beneficioso o para ser utilizados en un proceso dirigido, por ejemplo, un proceso de oxidación.

Un péptido capaz de unirse selectivamente a una sustancia que se desearía oxidar se puede obtener, por ejemplo, a partir de una proteína cuya capacidad de unión a dicha sustancia específica es conocida. Un ejemplo de un péptido semejante sería un dominio de unión extraído de un anticuerpo inducido contra esa sustancia. Otros ejemplos son los péptidos ricos en prolina cuya capacidad para unirse a los polifenoles del vino es conocida.

Como alternativa, los péptidos que se unen a dicha sustancia se pueden obtener mediante la utilización de librerías combinatorias de péptidos. Una librería semejante puede contener hasta 10^{10} péptidos, a partir de los cuales se puede delimitar el péptido con las propiedades de unión deseadas. (R.A. Houghten, Trends in Genetics, Vol 9, nº &, 235-239). Se han descrito varios modos de realización para este procedimiento (J. Scott y otros, Science (1990) 249, 386-390; Fodor y otros, Science (1991) 251, 767-773; K. Lam y otros, Nature (1991) 354, 82-84; R.A. Houghten y otros, Nature (1991) 354, 84-86).

Se pueden producir péptidos apropiados mediante síntesis orgánica, utilizando por ejemplo el procedimiento Merrifield (Merrifield (1963) J.Am.Chem.Soc. 85, 2149-2154). Como alternativa, los péptidos se pueden producir mediante tecnología de ADN recombinante en anfitriones microbianos (levaduras, mohos y bacterias) (K.N. Faber y otros, (1996) Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 72-79).

1.4 Mímicos de péptidos

Para aumentar la estabilidad y/o las propiedades de unión de un péptido, se puede modificar su molécula mediante la incorporación de aminoácidos no naturales y/o uniones químicas no naturales de aminoácidos. Tales moléculas reciben el nombre de mímicos de péptidos (H.U. Saragovi y otros (1991) Bio/Technology 10, 773-778; S. Chen y otros (1992) Proc.Natl.Acad. Sci. USA 89, 5872-5876). La producción de tales compuestos está restringida a la síntesis química.

1.5 Otras moléculas orgánicas

La lista de proteínas y péptidos descritos hasta este punto no es en absoluto exhaustiva. También pueden utilizarse otras proteínas, por ejemplo las que se describen en el documento WO-A-00/40968, que se incluyen en la presente solicitud por referencia.

Es fácil suponer que se pueden encontrar otras estructuras moleculares, no necesariamente relacionadas con las proteínas, los péptidos o derivados de ellos, con la propiedades de unión deseadas y capaces de unirse selectivamente a las sustancias que se desearía oxidar. Por ejemplo, ciertas moléculas de ARN poliméricas que se ha comprobado que se unen a pequeñas moléculas de tinte sintéticas (A. Ellington y otros (1990) Nature 346, 818-822). Estos compuestos de unión se pueden obtener mediante el método combinatorio, como se ha descrito para los péptidos (L.B. McGown y otros (1995), Analytical Chemistry, 663A-668A).

Este método también se puede aplicar para compuestos puramente orgánicos que no sean poliméricos. Se han descrito procedimientos combinatorios para la síntesis y selección de las propiedades de unión deseadas para tales compuestos (Weber y otros (1995) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34, 2280-2282; G. Lowe (1995), Chemical Society Reviews 24, 309-317; L.A. Thompson y otros (1996) Chem. Rev. 96, 550-600). Una vez identificados los compuestos de unión apropiados, se pueden producir a mayor escala mediante síntesis orgánica.

2. El agente beneficioso

En general, el agente beneficioso puede ser capturado por la molécula de unión y conservar al menos una parte sustancial de su actividad deseada. El agente beneficioso se escoge para proporcionar un beneficio a la prenda. Este beneficio puede presentarse en forma de un agente decolorante (producido mediante, por ejemplo, enzimas decolorantes) que puede decolorar las manchas, fragancias, reforzadores del color, regeneradores de tejidos, agentes suavizantes, agentes de acabado/protectores, etc. Estos se describen más detalladamente a continuación.

2.1 Enzimas decolorantes

Las enzimas decolorantes apropiadas que son útiles para el propósito de la presente invención son capaces de producir un compuesto químico decolorante.

El compuesto químico decolorante puede ser el peróxido de hidrógeno que se obtiene preferiblemente por procedimientos enzimáticos. La enzima para producir el compuesto químico decolorante o el sistema de producción de peróxido de hidrógeno enzimático se escogen generalmente entre los diversos sistemas de producción de peróxido de hidrógeno enzimático que se conocen en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar una amina oxidasa y una amina, un aminoácido oxidasa y un aminoácido, colesterol oxidasa y colesterol, ácido úrico oxidasa y ácido úrico o una xantina oxidasa con xantina. Otra posibilidad es utilizar una combinación de alcanol oxidasa C_{1}-C_{4} y un alcanol C_{1}-C_{4}, y, especialmente preferida, es la combinación de metanol oxidasa y etanol. La metanol oxidasa se obtiene preferiblemente a partir de una variedad de Hansenula Polimorpha catalasa negativa. (Véase, por ejemplo, el documento EP-A-0 244 920, de Unilever). Las oxidasas preferidas son la glucosa oxidasa, la galactosa oxidasa y la alcohol oxidasa.

Se podría utilizar una enzima productora de peróxido de hidrógeno en combinación con activadores que produzcan ácido peracético. Tales activadores son suficientemente conocidos en la técnica. Algunos ejemplos incluyen la tetraacetiletilendiamina (TAED) y el nonanoiloxibencensulfonato de sodio (SNOBS). Estos y otros compuestos relacionados han sido descritos de forma más completa por Grime y Clauss en Chemistry & Industry (15 de Octubre de 1990) 647-653. Como alternativa, se puede utilizar un catalizador de metal de transición en combinación con una enzima productora de peróxido de hidrógeno para incrementar el poder decolorante. Hage y otros (1994), Nature 369, 637-639, han descrito ejemplos de catalizadores de manganeso.

Otra posibilidad es que el compuesto químico decolorante sea hipohalita, y en ese caso la enzima es una haloperoxidasa. Las haloperoxidasas preferidas son las cloroperoxidasas y el compuesto químico decolorante correspondiente es hipoclorito. Las cloroperoxidasas especialmente preferidas son las cloroperoxidasas de vanadio, por ejemplo de Curvularia inaequalis.

Como alternativa, se pueden utilizar peroxidasas o lacasas. La molécula decolorante se puede obtener a partir de una molécula reforzadora que ha reaccionado con la enzima. En el documento WO-A-95/01426 se proponen ejemplos de sistemas lacasa/reforzador. En el documento WO-A-97/11217 se proponen ejemplos de sistemas peroxidasa/reforzador.

Los ejemplos apropiados de decolorantes incluyen también los fotodecolorantes. En el documento EP-A-379 312 (British Petroleum) se proponen algunos ejemplos de fotodecolorantes, que describen un fotodecolorante insoluble en agua derivado de porfina aniónicamente sustituida, y en el documento EP-A-035 470 (Ciba Geigy), se divulga una composición para el tratamiento de textiles que contiene un componente fotodecolorante.

2.2 Fragancias

El agente beneficioso puede ser una fragancia (perfume), de modo que al aplicarse la invención esta es capaz de proporcionar una fragancia al tejido que permanecerá asociada al mismo durante un período más largo que por métodos convencionales. Las fragancias pueden ser capturadas por la molécula de unión directamente, siendo más preferible la captura de "paquetes" o vesículas que contienen fragancias. Las fragancias o perfumes pueden estar encapsulados, p.e., en microcápsulas de látex. De especial interés son los cuerpos oleosos vegetales, por ejemplo los que se pueden extraer a partir de las semillas de colza (Tzen y otros, J. Biol. Chem. 267, 15626-15634).

2.3 Reforzadores del color

El agente beneficioso puede ser un agente utilizado para restaurar el color de las prendas. Pueden ser moléculas colorantes o, más preferiblemente, moléculas colorantes almacenadas en "paquetes" o vesículas que permiten depósitos más grandes de color.

2.4 Agentes regeneradores de tejidos

El agente beneficioso puede ser un agente capaz de regenerar el tejido deteriorado. Por ejemplo, se podrían utilizar enzimas capaces de sintetizar fibras de celulosa para formar y reparar las fibras deterioradas sobre la prenda.

2.5 Otros

Se puede considerar un buen número de otros agentes para proporcionar un beneficio a un tejido. Estos resultarán evidentes para aquellos experimentados en la técnica y dependerán del beneficio que se quiere proporcionar a la superficie del tejido. Ejemplos de agentes suavizantes son las arcillas, los surfactantes catiónicos o los compuestos de silicio. Ejemplos de agentes de acabado/protectores son los lubricantes poliméricos, los agentes repelentes de la suciedad, los agentes eliminadores de la suciedad, los agentes fotoprotectores (filtros solares), los agentes antiestáticos, los agentes fijadores del color, los agentes antibacterianos y los agentes antifúngicos.

3.1 Los tejidos

Para las aplicaciones de detergentes para el lavado de ropa se pueden considerar varias clases de tejidos naturales o artificiales, en particular el algodón. Estos compuestos macromoleculares presentan la ventaja de que pueden tener una naturaleza más inmunogénica, i.e., que es más fácil inducir anticuerpos contra ellos. Además, resultan más accesibles en la superficie del tejido que, por ejemplo, las sustancias coloreadas de las manchas, que tienen generalmente un peso molecular bajo.

Un modo de realización importante de la invención consiste en utilizar una molécula de unión (como se ha descrito más arriba) que se fija a varios tipos diferentes de tejidos. Esto podría tener la ventaja de permitir que un único agente beneficioso se depositara sobre varios tipos diferentes de tejidos.

Por lo demás, la invención se puede aplicar en composiciones detergentes para el lavado de tejidos, así como en composiciones para el aclarado. A continuación, se continuará ilustrando la invención mediante los siguientes ejemplos no limitantes:

Ejemplo 1 Captura de la glucosa oxidasa de la solución utilizando una superficie activada 1.1 Preparación de un fragmento de anticuerpo biespecífico 1.1.1 Materiales para la construcción de vectores de expresión 1.1.1.1 Plásmidos

Como material inicial se utilizaron cinco plásmidos (derivados de pUC) diferentes (para las secuencias de nucleótidos, véase la figura 1).

a): pUC.Fv4715-myc

b): pUC.scFv4715-myc

c): pUC.Fv3299-H2t

d): pUC.Fv3418

e): pUR.4124

Todas las etapas de clonación se realizaron en E. coli JM109 (endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17(r_{k}^{-}, m_{k}^{+}), relA1, supE44, \Box (lac-proAB), [F', traD36, proAB, lacI^{q}Z\BoxM15].

Los cultivos de E. coli se dejaron crecer en un medio 2xTY (suplementado donde se indica con 2% glusosa y/o 100 \mug/ml de ampicilina), a menos que se indique otra cosa. Las transformaciones se colocaron sobre bandejas SOBAG.

1.1.1.2 Tampones y medios

PBS: 0,24 g de NaH_{2}PO_{4}.H_{2}O

\quad: 0,49 g de Na_{2}HPO_{4} anhidro

\quad: 4,25 g de NaCl

\quad: completar hasta 1 litro en H_{2}O (pH=7,1)

PBS-T: PBS + Tween al 0,15%

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Medio 2xTY: 17 g de Bacto-triptona

\quad: 10 g de Bacto-extracto de levadura

\quad: 5 g de NaCl

\quad: Completar hasta 1 litro con agua destilada y esterilizar.

2xTY/Amp/Glucosa: 2xTY + 100 \mug/ml de Ampicilina + 1% de Glucosa

MP9 + Levadura: 12 g de Na_{2}HPO_{4}, 6 g de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g de NaCl, 5 g de NH_{4}Cl, 0,06 g de L-Prolina, 20 g de Glicerol, 2 ml de Hemina. Completar hasta 1 litro con agua destilada y esterilizar. Antes de usarlo, añadir 12,5 ml de extracto de levadura al 10%, 2,5 ml de Tiamina al 0,01%, 500 \mul de MgCl_{2} 1 M y 25 \mul de CaCl_{2} 1 M

SOBAG agar: 20 g de Bacto-triptona

\quad: 5 g de extracto de levadura

\quad: 15 de agar

\quad: 0,5 g de NaCl

\quad: Completar hasta 1 litro con agua destilada y esterilizar.

\quad: Dejar enfriar y añadir: 10 ml de MgCl_{2} 1 M, 27,8 ml de glucosa 2 M, ampicilina a 100 \mug/ml.

1.1.1.3 Oligonucleótidos y PCR

Los cebadores oligonucleótidos utilizados en las reacciones PCR se sintetizaron en un sintetizador de ADN Applied Biosystems 381A mediante el método de la fosforamidita. En la Tabla 1 siguiente se muestran las estructuras primarias de los cebadores oligonucleótidos utilizados en la construcción de los constructos "pGOSA" biespecíficos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Secuencia de nucleótidos de los oligonucleótidos utilizados para producir los constructos descritos

1

Los sitios de restricción que codifican por estos cebadores aparecen subrayados.

1=SfiI, 2=EcoRI, 3=NheI, 4=XhoI, 5=SalI, 6=NotI, 7=PstI, 8=BstEII, 9=SacI

La mezcla de reacción utilizada para la amplificación de los fragmentos de ADN fue: 10 mM de Tris-HCl, pH8,3/2,5 mM de MgCL_{2}/50 mM de KCl/0,01% de gelatina (p/v)/0,1% de Triton X-100/400 mM de cada uno de los dNTP/5,0 unidades de ADN polimerasa/500 ng de cada uno de los cebadores (para reacciones de 100 \mul) más 100 ng de ADN molde. Las condiciones de reacción fueron: 94ºC durante 4 minutos, seguidos por 33 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 55ºC y 1 minuto a 72ºC.

1.1.2 ADN plásmido \ Vector \ Preparación y ligación del inserto \ transformación

El ADN plásmido se preparó utilizando el sistema "Qiagen P-100 Midi-DNA Preparation". Los vectores y los insertos se prepararon por digestión de 10 \mug (para la preparación de vectores) o 20 \mug (para la preparación de insertos) con las endonucleasas de restricción especificadas bajo condiciones apropiadas (los tampones y temperaturas especificados por los suministradores). La modificación de los extremos del ADN con fragmentos Klenow de la ADN polimerasa y la desfosforilación con fosforilasa de intestino de ternera se realizaron de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El ADN vector y los insertos se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se purificaron con membranas DEAE NA45 (Schleicher & Schnell), como han descrito Maniatis y otros. Las ligaciones se realizaron en volúmenes de 20 \mul que contenían:

: 30 mM de Tris-HCl pH7,8

: 10 mM de MgCl_{2}

: 10 mM de DTT

: 1 mM de ATP

: 300-400 ng de ADN vector

: 100-200 ng de ADN inserto

: 1 unidad Weiss de ADN ligasa T_{4}

Tras la ligación durante 2-4 horas a temperatura ambiente se transformó E. coli JM109 competente por tratamiento con CaCl_{2} utilizando 7,5 \mul de reacción de ligación. Las mezclas de transformación fueron colocadas sobre bandejas SOBAG y se dejaron crecer durante la noche a 37ºC. Se identificaron los clones correctos mediante análisis de restricción y se verificaron mediante el método dideoxi de secuenciación automatizado (Applied Biosystems).

1.1.3 Digestión por restricción de productos de PCR

Después de la amplificación, se comprobó cada reacción mediante electroforesis en gel de agarosa buscando la presencia de una banda del tamaño apropiado. Se sometieron a extracción con fenolcloroformo, extracción con cloroformo y precipitación con etanol una o dos mezclas de reacción PCR de 100 \mul de cada una de las reacciones PCR.I-PCR.X, conteniendo en conjunto aproximadamente 2-4 \mug del ADN producido. Los glomérulos de ADN se lavaron dos veces con etanol al 70% y se dejaron secar. A continuación, los productos de la PCR se digirieron durante la noche (18 h) en presencia de un exceso de enzimas de restricción en las siguientes mezclas y a las temperaturas y volúmenes especificados.

PCR.I:: 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 10 mM de MgCl_{2}, 50 mM de NaCl, 4 mM de espermidina, BSA a 0,4 \mug/ml, 4 \mul (= 40 U) de SacI, 4 \mul (= 40 U) de BstEII, en un volumen total de 100 \mul a 37ºC.

PCR.II:: 10 mM de Tris-Acetato pH 7,5, 10 mM de MgAc_{2}, 50 mM de KAc (tampón 1x "One-Phor-All" {Pharmacia}), 4 \mul (= 48 U) de SfiI, en un volumen total de 50 \mul a 50ºC en aceite mineral.

PCR.III:: 10 mM de Tris-Acetato pH 7,5, 10 mM de MgAc_{2}, 50 mM de KAc (tampón 1x "One-Phor-All" {Pharmacia}), 4 \mul (= 40 U) de NheI, 4 \mul (= 40 U) de SacI, en un volumen total de 100 \mul a 37ºC.

PCR.IV:: 20 mM de Tris-Acetato pH 7,5, 20 mM de MgAc_{2}, 100 mM de KAc (tampón 2x "One-Phor-All" {Pharmacia}), 4 \mul (= 40 U) de XhoI, 4 \mul (= 40 U) de EcoRI, en un volumen total de 100 \mul a 37ºC.

PCR.V:: 20 mM de Tris-Acetato pH 7,5, 20 mM de MgAc_{2}, 100 mM de KAc (tampón 2x "One-Phor-All" {Pharmacia}), 4 \mul (= 40 U) de SalI, 4 \mul (= 40 U) de EcoRI, en un volumen total de 100 \mul a 37ºC.

PCR.VI:: 10 mM de Tris-Acetato pH 7,5, 10 mM de MgAc_{2}, 50 mM de KAc (tampón 1x "One-Phor-All" {Pharmacia}), 4 \mul (= 48 U) de SfiI, en un volumen total de 50 \mul a 50ºC en aceite mineral.

PCR.VII:: 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 10 mM de MgCl_{2}, 50 mM de NaCl, 4 mM de espermidina, BSA a 0,4 \mug/ml, 4 \mul (= 40 U) de NheI, 4 \mul (= 40 U) de BstEII, en un volumen total de 100 \mul a 37ºC.

PCR.VIII:: 20 mM de Tris-Acetato pH 7,5, 20 mM de MgAc_{2}, 100 mM de KAc (tampón 2x "One-Phor-All" {Pharmacia}), 4 \mul (= 40 U) de EcoRI, en un volumen total de 50 \mul a 37ºC.

PCR.IX:: 25 mM de Tris-Acetato pH 7,8, 100 mM de KAc, 10 mM de MgAc, 1 mM DTT (tampón 1x "Multi-Core" {Promega}), 4 mM de espermidina, BSA a 0,4 \mug/ml, 4 \mul (= 40 U) de NheI, 4 \mul (= 40 U) de BstEII, en un volumen total de 100 \mul a 37ºC.

PCR.X:: 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 10 mM de MgCl_{2}, 50 mM de NaCl, 4 mM de espermidina, BSA a 0,4 \mug/ml, 4 \mul (= 40 U) de PstI, 4 \mul (= 40 U) de EcoRI, en un volumen total de 100 \mul a 37ºC.

Tras la digestión durante la noche, el SfiI de la PCR.II fue digerido con EcoRI (durante la noche a 37ºC) mediante la adición de 16 \mul de H_{2}O, 30 \mul de tampón 10x "One-Phor-All" (Pharmacia) (100 mM de Tris-Acetato pH 7,5, 100 mM de MgAc_{2}, 500 mM de Kac) y 4 \mul (= 40 U) de EcoRI. Tras la digestión durante la noche, el SfiI de la PCR.VI fue digerido con NheI (durante la noche a 37ºC) mediante la adición de 41 \mul de H_{2}O, 5 \mul de tampón 10x "One-Phor-All" (Pharmacia) (100 mM de Tris-Acetato pH 7,5, 100 mM de MgAc_{2}, 500 mM de KAc) y 4 \mul (= 40 U) de NheI. Tras la digestión durante la noche, el EcoRI de la PCR.VIII fue digerido con XhoI (durante la noche a 37ºC) mediante la adición de 46 \mul de H_{2}O y 4 \mul (= 40 U) de XhoI.

Los fragmentos de PCR digeridos, el SacI/BstEII de la PCR.I, el SfiI/EcoRI de la PCR.II, el NheI/SacI de la PCR.III, el XhoI/EcoRI de la PCR.IV, el SalI/EcoRI de la PCR.V, el SfiI/NheI de la PCR.VI, el BstEII/NheI de la PCR.VII y el XhoI/EcoRI de la PCR.VIII, se purificaron sobre un gel de agarosa al 1,2% utilizando membranas DEAE Na45 (Schleicher & Schnell) como han descrito Maniatis y otros. Los fragmentos purificados se disolvieron en H_{2}O a una concentración de 100-150 ng/\mul.

1.1.4 Construcción de los vectores de expresión biespecíficos pGOSA

Los vectores de expresión utilizados eran derivados del pUC 19 que contenían un fragmento HindIII-EcoRI, que en el caso de los scFvs contiene una secuencia señal pelB unida al extremo 5' del dominio V de la cadena pesada que se encuentra directamente conectado al dominio V correspondiente de la cadena ligera del anticuerpo a través de una secuencia de conexión que codifica para un péptido flexible (Gly_{4}Ser)_{3}, dando lugar así a una molécula de una sola cadena. En el vector de expresión Fv de doble cadena, tanto el dominio V de la cadena pesada como el de la cadena ligera del anticuerpo están precedidos por un sitio de unión al ribosoma y una secuencia señal pelB en un operón dicistrónico artificial bajo el control de un único promotor inducible. La expresión de estos constructos está controlada por el promotor inducible lacZ. En la Figura 1 aparecen listadas las secuencias de nucleótidos de los insertos HindIII-EcoRI de los constructos Fv.3418, Fv.4715-myc, scFv.4715-myc y pUR.4124 utilizados para la generación de los fragmentos del anticuerpo específico.

La construcción del pGOSA.E supuso varias etapas de clonación, que dieron lugar a 4 constructos intermedios, pGOSA.A a pGOSA.D. El vector de expresión final pGOSA.E y los oligonucleótidos de la Tabla.1 se han diseñado para permitir que en el constructo final, pGOSA.E, se puedan clonar la mayor parte de las especificidades. El dominio VH aguas arriba puede ser reemplazado por cualquier fragmento de gen PstI-BstEII VH obtenido con oligonucleótidos PCR.51 y PCR.89. Los oligonucleótidos DBL.3 y DBL.4 se diseñaron para insertar sitios de restricción SfiI y NheI en los fragmentos de gen VH, permitiendo así la clonación de aquellos fragmentos de gen VH en los sitios SfiI y NheI como si se tratara del dominio VH aguas abajo. Todos los fragmentos de gen VL obtenidos con los oligonucleótidos PCR.116 y PCR.90 se pueden clonar en la posición del fragmento de gen 3418 VL como si se tratara de un fragmento SacI-XhoI. Sin embargo, la presencia de un sitio SacI interno en el fragmento de gen 3418 VH supone una complicación. Los oligonucleótidos DBL.8 y DBL.9 están diseñados para permitir la clonación de los fragmentos de gen VL en la posición del fragmento de gen 4715 VL como si se tratara de un fragmento SalI-NotI. Los pGOSA.V, pGOSA.S, pGOSA.T, derivados de pGOSA.E, con sólo una o ninguna secuencia enlazadora contienen algunos sitios de restricción aberrantes en los nuevos puntos de unión. Al constructo VH_{A}-VH_{B} sin enlazador le falta el sitio 5'VH_{B} SfiI. En estos constructos, el fragmento VH_{B} se clona como si se tratara de un fragmento BstEII/NheI utilizando los oligonucleótidos DBL.10 o DBL.11 y DBL.4. Al constructo VL_{B}-VL_{A} sin enlazador le falta el sitio 5'VL_{A} SalI. En estos constructos, el fragmento VL_{A} se clona como si se tratara de un fragmento XhoI/EcoRI utilizando los oligonucleótidos DBL.11 y DBL.9.

pGOSA.A : Este constructo se obtuvo a partir del constructo scFv.4715-myc. Se insertó un sitio de restricción SfiI entre el enlazador (Gly_{4}Ser)_{3} y el fragmento de gen que codifica el VL del constructo scFv.4715-myc. Esto se consiguió reemplazando el fragmento BstEII-SacI de este constructo por el fragmento BstEII/SacI de la PCR-I que contiene un sitio SfiI entre el enlazador (Gly_{4}Ser)_{3} y el 4715 VL. La inserción del sitio SfiI también incorporó 4 aminoácidos adicionales (Ala-Gly-Ser-Ala) entre el enlazador (Gly_{4}Ser)_{3} y el fragmento del gen 4715 VL. Los oligonucleótidos utilizados para producir la PCR-I (DBL.1 y DBL.2) se diseñaron para coincidir con la secuencia de la región de entramado 3 del 4715 VH y para cebar en el punto de unión del enlazador (Gly_{4}Ser)_{3} y el gen que codifica el 4715 VL, respectivamente (Tabla 1).

pGOSA.B : Este constructo se obtuvo a partir del constructo Fv.3418. Se eliminó el fragmento XhoI-EcoRI del Fv.3418 que codifica el extremo 3' de la región de entramado 4 del VL que incluye el codón de terminación, y se reemplazó por el fragmento XhoI/EcoRI de la PCR-IV. Los oligonucleótidos utilizados para producir la PCR-IV (DBL.6 y DBL.7) se diseñaron para coincidir perfectamente con la secuencia en el punto de unión del VL y el enlazador (Gly_{4}Ser)_{3} (DBL.6), y para ser capaz de cebar en el punto de unión del enlazador (Gly_{4}Ser)_{3} y el VH en pUR.4124 (DBL.7) (Tabla 1). El DBL.7 eliminó el sitio PstI en el VH (mutación silenciosa) e insertó un sitio de restricción SalI en el punto de unión del enlazador (Gly_{4}Ser)_{3} y el VH, reemplazando por lo tanto el último Ser del enlazador por un residuo Val.

pGOSA.C : Este constructo contenía el 4715 VH enlazado por el enlazador (Gly_{4}Ser)_{3}Ala-Gly-Ser-Ala al 3418 VH. Este constructo se obtuvo reemplazando el fragmento SfiI-EcoRI del pGOSA.A que codifica el 4715 VL por el fragmento SfiI-EcoRI de la PCR-II que codifica el 3418 VH. Los oligonucleótidos utilizados para producir la PCR-II (DBL.3 y DBL.4) (Tabla 1) hibridan en las regiones de entramado 1 y 4 del gen que codifica el 3418 VH, respectivamente. El DBL.3 se diseñó para eliminar el sitio de restricción PstI (mutación silenciosa) y para insertar un sitio de restricción SfiI aguas arriba del gen VH. El DBL.4 destruye el sitio de restricción BstEII en la región de entramado 4 e inserta un sitio de restricción NheI aguas abajo de los codones de terminación.

pGOSA.D : Este constructo contenía un operón dicistrónico formado por el 3418 VH y el 3418 VL enlazados por el enlazador (Gly_{4}Ser)_{2}Gly_{4}Val al 4715 VL. Este constructo se obtuvo mediante digestión del constructo pGOSA.A con SalI-EcoRI e insertando el fragmento SalI/EcoRI de la PCR-V que contiene el 4715 VL. Los oligonucleótidos utilizados para obtener la PCR-V (DBL.8 y DBL.9) (Tabla 1) se diseñaron para coincidir con la secuencia de nucleótidos de las regiones de entramado 1 y 4 del gen 4715 VL, respectivamente. El DBL.8 eliminó el sitio SacI de la región de entramado 1 (mutación silenciosa) e insertó un sitio de restricción SalI aguas arriba del gen de la cadena VL. El DBL.9 destruyó el sitio de restricción XhoI en la región de entramado 4 del VL (mutación silenciosa) e insertó un sitio de restricción NotI y EcoRI aguas abajo de los codones de terminación.

pGOSA.E : Este constructo contenía un operón dicistrónico formado por el 4715 VH enlazado por el enlazador (Gly_{4}Ser)_{3}Ala-Gly-Ser-Ala al 3418 VH, más el 3418 VL enlazado por el enlazador (Gly_{4}Ser)_{2}Gly_{4}Val al 4715 VL. Las dos unidades de translación se encuentran precedidas por un sitio de unión al ribosoma y una secuencia líder pelB. Este constructo se obtuvo mediante una ligación de tres puntos mezclando el vector pGOSA.D, del que se eliminó el inserto PstI-SacI, con el inserto PstI-NheI del pGOSA.C y el fragmento NheI/SacI de la PCR-III. El PstI-SacI del vector pGOSA.D contiene el extremo 5' de la región de entramado 1 del 3418 VH hasta el sitio de restricción PstI y el 3418 VL enlazado por el enlazador (Gly_{4}Ser)_{2}Gly_{4}Val al 4715 VL empezando en el sitio de restricción SacI en el 3418 VL. El inserto PstI-NheI del pGOSA.C contiene el 4715 VH enlazado por el enlazador (Gly_{4}Ser)_{3}Ala-Gly-Ser-Ala al 3418 VH, empezando en el sitio de restricción PstI de la región de entramado 1 en el 4715 VH. El fragmento NheI-SacI de la PCR-III proporciona el sitio de unión al ribosoma y la secuencia líder pelB para el constructo 3418 VL-(Gly_{4}Ser)_{2}Gly_{4}Val-4715 VL. Los oligonucleótidos DBL.5 y PCR.116 (Tabla 1) utilizados para generar la PCR-III se diseñaron para coincidir con la secuencia aguas arriba del sitio de unión al ribosoma del 4715 VL en el Fv.4715 y para insertar un sitio de restricción NheI (DBL.5), así como para coincidir con la región de entramado 4 del 3418 VL (PCR.116).

PGOSA.G : Este constructo fue un intermedio para la síntesis del pGOSA.J. Se obtiene a partir del pGOSA.E del que se ha extraído el fragmento PstI/BstEII del VH4715 reemplazándolo con el fragmento PstI/BstEII del VH3418 (extraído del Fv.3418). El plásmido resultante pGOSA.G contiene dos copias del dominio V de la cadena pesada del 3418 enlazado por el enlazador (Gly_{4}Ser)_{3}Ala-Gly-Ser-Ala, más el 4715 VL enlazado por el enlazador (Gly_{4}Ser)_{2}
Gly_{4}Val a la región de entramado 4 del 3418 VL.

pGOSA.J : Este constructo contenía un operón dicistrónico formado por el 3418 VH enlazado por el enlazador (Gly_{4}Ser)_{3}Ala-Gly-Ser-Ala al 4715 VH, más el 3418 VL enlazado por el enlazador (Gly_{4}Ser)_{2}Gly_{4}Val al 4715 VL. Las dos unidades de transcripción se encuentran precedidas por un sitio de unión al ribosoma y una secuencia líder pelB. Este constructo se obtuvo insertando el fragmento AfiI/NheI de la PCR-VI que contiene el VH4715 en el vector pGOSA.G del que se había eliminado el SfiI/NheI del VH3418.

pGOSA.L : Este constructo se obtuvo a partir del pGOSA.E del que se eliminó el fragmento HindIII/NheI que contiene el gen que codifica el 4715 VH-(Gly_{4}Ser)_{3}Ala-Gly-Ser-Ala-3418 VH. Los extremos del ADN del vector se convirtieron en romos utilizando fragmentos Klenow de la ADN polimerasa y se ligaron. El plásmido resultante pGOSA.L contiene el dominio 3418 VL enlazado por el enlazador (Gly_{4}Ser)_{2}Gly_{4}Val al extremo 5' de la región de entramado 1 del dominio 4715 VL.

pGOSA.V : Este constructo se obtuvo a partir del pGOSA.E del que se ha extraído el fragmento VH3418-linker (Gly_{4}Ser)_{3}Ala-Gly-Ser-Ala BstEII/NheI y se ha reemplazado por el fragmento BstEII/NheI de la PCR-VII que contiene el 3418 VH. El plásmido resultante pGOSA.V contiene el dominio V de la cadena pesada del 3418 enlazado directamente a la región de entramado 4 del 4715 VH, mas el 4715 VL enlazado por el enlazador (Gly_{4}Ser)_{2}Gly_{4}Val a la región de entramado 4 del 3418 VL.

pGOSA.S : Este constructo se obtuvo a partir del pGOSA.E del que se ha extraído el fragmento (Gly_{4}Ser)_{2}Gly_{4}Val-VL4715 XhoI/EcoRI y se ha reemplazado por el fragmento XhoI/EcoRI de la PCR-VIII que contiene el 4715 VL. El plásmido resultante pGOSA.S contiene el 4715 VH enlazado por el enlazador (Gly_{4}Ser)_{3}Ala-Gly-Ser-Ala al 3418 VH, mas el 3418 VL enlazado directamente al extremo 5' de la región de entramado 1 del 4715 VL.

pGOSA.T : Este constructo contenía un operón dicistrónico formado por el dominio V de la cadena pesada del 3418 enlazado directamente a la región de entramado 4 del 4715 VH, mas el 3418 VL enlazado directamente al extremo 5' de la región de entramado 1 del 4715 VL. Las dos unidades de transcripción se encuentran precedidas por un sitio de unión al ribosoma y una secuencia líder pelB. Este constructo se obtuvo insertando el fragmento NheI/EcoRI del pGOSA.S que contiene el 3418 VL enlazado directamente al extremo 5' de la región de entramado 1 del 4715 VL, en el vector pGOSA.V del que se eliminó el fragmento NheI/EcoRI que contiene el 3418 VL enlazado por el enlazador (Gly_{4}Ser)_{2}Gly_{4}Val al 4715 VL.

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pGOSA.X : Este constructo se obtuvo a partir del pGOSA.T del que se eliminó el fragmento NheI/EcoRI que contiene el gen que codifica el 3418 VL-4715 VL. Los extremos del ADN del vector se convirtieron en romos (Klenow) y se ligaron. El plásmido resultante pGOSA.X contiene el dominio 4715 VH enlazado directamente al extremo 5' de la región de entramado 1 del dominio 3418 VH.

pGOSA.Y : Este constructo se obtuvo a partir del pGOSA.T del que se eliminó el fragmento HindIII/NheI que contiene el gen que codifica el 4715 VH-3418 VH. Los extremos del ADN del vector se convirtieron en romos utilizando fragmentos Klenow de la ADN polimerasa y se ligaron. El plásmido resultante pGOSA.Y contiene el dominio 3418 VL enlazado directamente al extremo 5' de la región de entramado 1 del dominio 4715 VL.

pGOSA.Z : Este constructo se obtuvo a partir del pGOSA.G del que se ha extraído el fragmento VH3418-linker (Gly_{4}Ser)_{3}Ala-Gly-Ser-Ala BstEII/NheI y se ha reemplazado por el fragmento BstEII/NheI de la PCR-IX que contiene el 4715 VH. El plásmido resultante pGOSA.Z contiene el dominio V de la cadena pesada del 3418 enlazado directamente a la región de entramado 1 del 4715 VH, mas el 4715 VL enlazado por el enlazador (Gly_{4}Ser)_{2}Gly_{4}Val a la región de entramado 4 del 3418 VL.

pGOSA.AA : Este constructo contenía un operón dicistrónico formado por el dominio V de la cadena pesada del 3418 enlazado directamente al extremo 5' de la región de entramado 1 del 4715 VH, mas el 3418 VL enlazado directamente al extremo 5' de la región de entramado 1 del 4715 VL. Las dos unidades de transcripción se encuentran precedidas por un sitio de unión al ribosoma y una secuencia líder pelB. Este constructo se obtuvo insertando el fragmento NheI/EcoRI del pGOSA.T que contiene el 3418 VL enlazado directamente al extremo 5' de la región de entramado 1 del 4715 VL, en el vector pGOSA.Z del que se eliminó el fragmento NheI/EcoRI que contiene el 3418 VL enlazado por el enlazador (Gly_{4}Ser)_{2}Gly_{4}Val al 4715 VL.

pGOSA.AB : Este constructo se obtuvo a partir del pGOSA.J mediante una reacción de ligación de tres puntos. Se eliminó el inserto SacI/EcoRI que contiene una parte del 3418 VH y el enlazador (Gly_{4}Ser)_{3}Ala-Gly-Ser-Ala-4715 VH completo y las secuencias de codificación del 3418 VL-(Gly_{4}Ser)_{2}Gly_{4}Val-4715 VL, y se reemplazó con el fragmento SacI/SacI del pGOSA.J que contiene una parte del 3418 VH y el enlazador (Gly_{4}Ser)_{3}Ala-Gly-Ser-Ala-4715 VH completo y el fragmento SacI/EcoRI del pGOSA.T que contiene el 3418 VL enlazado directamente a la región de entramado 1 del 4715 VL. El plásmido resultante contiene el 3418 VH enlazado por el enlazador (Gly_{4}Ser)_{3}
Ala-Gly-Ser-Ala al extremo 5' de la región de entramado 1 del 4715 VH, mas el 3418 VL enlazado directamente al extremo 5' de la región de entramado 1 del 4715 VL.

pGOSA.AC : Este constructo se obtuvo a partir del pGOSA.Z del que se eliminó el fragmento NheI/EcoRI que contiene el gen que codifica el 3418 VL-(Gly_{4}Ser)_{2}Gly_{4}Val-4715 VL. Los extremos del ADN del vector se convirtieron en romos utilizando fragmentos Klenow de la ADN polimerasa y se ligaron. El plásmido resultante pGOSA.AC contiene el dominio 3418 VH enlazado directamente al extremo 5' de la región de entramado 1 del dominio 4715 VH.

pGOSA.AD : Este constructo se obtuvo insertando el fragmento PstI/EcoRI de la PCR.X que contiene el fragmento del gen que codifica el 3418 VH-(Gly_{4}Ser)_{3}Ala-Gly-Ser-Ala-4715 VH en el vector Fv.4715-myc del que se eliminó el inserto PstI/EcoRI del Fv.4715-myc.

1.1.5 Construcción de los vectores de expresión biespecíficos pAlphagox

Los vectores de expresión utilizados eran derivados de los pGOSA.E,S,T y V en los que los dominios de las cadenas pesadas y de las cadenas ligeras del anticuerpo se encontraban precedidos por un sitio de unión al ribosoma y una secuencia señal pelB en un operón dicistrónico artificial bajo el control de un solo promotor inducible. El promotor inducible lacZ dirigió la expresión de estos constructos.

pAlphagox.A : Este constructo se obtuvo a partir del pGOSA.E, en el que se eliminó el fragmento de gen PstI/BstEII 4715 VH y se reemplazó por el fragmento de gen PstI/BstEII 3299 VH del pUC.Fv3299H2t.

pAlphagox.B : Este constructo se obtuvo a partir del pGOSA.V, en el que se eliminó el fragmento de gen PstI/BstEII 4715 VH y se reemplazó por el fragmento de gen PstI/BstEII 3299 VH del pUC.Fv3299H2t.

pAlphagox.C : Este constructo se obtuvo a partir del pAlphagox.A, en el que se eliminó el fragmento de gen SalI/EcoRI 4715 VL y se reemplazó por el SalI/EcoRI 3299 VL equivalente de la PCR.V

pAlphagox.D : Este constructo se obtuvo a partir del pAlphagox.B, en el que se eliminó el fragmento de gen SalI/EcoRI 4715 VL y se reemplazó por el SalI/EcoRI 3299 VL equivalente de la PCR.V

pAlphagox.E : Este constructo se obtuvo a partir del pAlphagox.A, en el que se eliminó el fragmento de gen XhoI/EcoRI 4715 VL y se reemplazó por el XhoI/EcoRI 3299 VL equivalente de la PCR.VII

pAlphagox.F : Este constructo se obtuvo a partir del pAlphagox.B, en el que se eliminó el fragmento de gen XhoI/EcoRI 4715 VL y se reemplazó por el XhoI/EcoRI 3299 VL equivalente de la PCR.VII

1.1.6 Expresión de los constructos GOSA y ALPHAGOX en E.coli

Aunque el siguiente protocolo describe la producción de 500 ml de sobrenadante y 2x100 ml de extracto periplásmico, este protocolo se puede escalar.

1): Inocular 2,5 ml de 2xTY/Amp con una colonia individual bien aislada a partir de una bandeja con JM109 recién transformado. Incubar durante la noche a 37ºC removiendo a 200 rpm.

2): Colocar en bandejas de 2TY/Amp alícuotas de 100 ml de disoluciones 10^{-3}, 10^{-4}, 10^{-5} y 10^{-6} del cultivo realizado durante la noche.

3): Tras la incubación durante la noche a 37ºC generalmente se pueden ver dos clases de colonias: los tipos "Cremosa" pequeña y "Gris" grande.

4): Preparar unos cultivos iniciales de los dos tipos de colonias, "cremosa" y "gris", en 10 ml de BHI/Amp durante la noche a 37ºC (sin remover).

5): Se utilizan 5 ml de los cultivos iniciales de la noche anterior para inocular a 500 ml de un medio compuesto por MP9+levadura.

6): Se deja crecer el cultivo a 25ºC removiéndolo a 150-200 rpm (en recipientes de agitación) hasta que OD_{600}=0,6-1,0.

7): Se añade ITPG a una concentración final de 1 mM.

8): Incubar el cultivo durante la noche a 25ºC removiendo a 150-200 rpm.

9): Centrifugar el cultivo de la noche anterior y comprobar que el sobrenadante muestra presencia de fragmentos de anticuerpo.

10): El producto presente en el espacio periplásmico se puede extraer mediante dos lisis consecutivas por shock osmótico.

1.2 Activación de una superficie con un fragmento de anticuerpo biespecífico

Se preparó una solución a 50 \mug/ml de gonadotropina coriónica humana (HCG) en una solución tampón fosfato salino (PBS) y se añadieron 100 \mul a cada pocillo de una bandeja de pocillos Greiner HB. Tras una incubación de 60 minutos a temperatura ambiente removiendo constantemente, los pocillos se lavaron tres veces con 200 \mul de PBS que contenía 0,15% (v/v) de Tween 20 (PBST). Después, los pocillos se bloquearon mediante una incubación de 60 minutos con un 1% (p/v) de Marvel a temperatura ambiente. La superficie se activó mediante una incubación de 30 minutos con 0,25 \mug/pocillo de (alphagox) biespecífico en una solución de PBS con el pH ajustado a 8,0. Tras la activación de la superficie, cada pocillo se lavó tres veces con 200 \mul de PBST.

1.3 Recolección de la glucosa oxidasa a partir de una solución

Se incubó una solución de glucosa oxidasa (100 \mul de una solución a 60 \mug/ml completada en PBS) durante 60 minutos a temperatura ambiente removiéndola suavemente. Durante este tiempo se recogió la glucosa oxidasa en la superficie activada. Tras la recolección de la glucosa oxidasa en la superficie activada, cada pocillo se lavó tres veces con 200 \mul de PBST. La presencia de la glucosa oxidasa recogida se reveló mediante incubación con una solución de sustrato que contenía: 50 mM de glucosa, 5 \mul de peroxidasa (Novo) a 21,8 mg/ml, 200 \mul de TMB completada hasta 20 ml con PBS a pH 8,0. Después de 10 minutos se añadieron 50 \mul de HCl (1 M) y se leyó la densidad óptica de la bandeja ELISA a 450 nm. La figura 6 muestra que una superficie activada puede capturar glucosa oxidasa (A: HCG, anticuerpo biespecífico, glucosa oxidasa; B: HCG, glucosa oxidasa; C: no HCG, anticuerpo biespecífico, glucosa oxidasa).

Ejemplo 2 Captura de glucosa oxidasa de una solución sobre plástico activado con vino tinto 2.1 Preparación de un fragmento de anticuerpo doble cabeza

Se construye, produce y purifica un fragmento de anticuerpo biespecífico (12,49) con doble especificidad para el vino tinto y la glucosa oxidasa, del siguiente modo:

2.1.1 Preparación de un fragmento de cadena pesada de inmunoglobulina específica para el vino tinto a partir de la llama 2.1.1.1 Preparación del antígeno

Se filtró vino tinto Cote du Rhone (Co-op) a través de una membrana de 0,2 \mu y se utilizó posteriormente solo o diluido en PBS según fue necesario.

2.1.1.2 Programa de inmunización

Primero se inmunizó una llama, criada en el Instituto Holandés para la Salud y Ciencia Animales (ID-DLO, Lelystad), con BSA y vino tinto unidos mediante química de periodato y reforzado un mes más tarde y una vez más dos meses después con vino tinto conjugado con PLP. Se recogió el suero 14 días después de cada dosis para su análisis.

2.1.1.3 Análisis de Suero Policlonal

Se analizó suero mediante ELISA contra vino tinto del siguiente modo:

1.: Se sensibilizó una bandeja de pocillos Greiner HB con vino tinto a 37ºC y se lavó en PBSTA.

2.: La bandeja se bloqueó mediante preincubación con 200 \mul/pocillo de ovoalbúmina al 1% (p/v) en PBSTA durante 1 hora a temperatura ambiente.

3.: Se eliminó el tampón bloqueante y se añadieron 100 \mul/pocillo de suero de llama inmunizado o preinmunizado, comenzando con una dilución 10^{-2} en PBSA. Se incubaron durante una hora a temperatura ambiente.

4.: Se eliminó el fragmento de anticuerpo sin unir mediante 3 lavados utilizando un limpiador de bandejas en PBSTA.

5.: Se añadieron 100 \mul/pocillo de IgG de ratón anti-llama a 10 \mug/ml en PBSTA. Se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente.

6.: La bandeja se lavó según se ha descrito en la etapa 4.

7.: Se añadieron 100 \mul/pocillo de fosfatasa alcalina conjugada con anti-ratón de cabra (Sigma) a una dilución apropiada en PBSTA y se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente.

8.: La bandeja se lavó según se ha descrito anteriormente.

9.: La actividad de la fosfatasa alcalina se detectó mediante la adición de 100 \mul/pocillo de una solución sustrato: pNPP a 1 mg/ml en 1 M dietanolamina, 1 mM de MgCl_{2}.

10.: La absorbancia se leyó a 405 nm cuando se había desarrollado el color.

2.1.1.4 Identificación de ARNm y síntesis de ADNc

Se identificaron 4x10^{8} PBLs utilizando un gradiente de Ficol y el ARN total se identificó utilizando el método de Chomczynnski y Sacci, (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159.

El ARNm se preparó posteriormente utilizando el equipo de purificación de ARNm Oligotex de Qiagen.

El ADNc se sintetizó utilizando el equipo de Síntesis de Primera Cadena para RT-PCR de Amersham (RPN 1266) y el cebador oligo dT utilizando aproximadamente, según estimaciones, 2 \mug de ARNm (1 \mug/Eppendorf) del total de la concentración total de ARN y suponiendo que el ARNm forma aproximadamente el 1% del total de ARN.

2.1.1.5 Identificación por PCR de las regiones bisagra cortas y largas de HCVs

Se preparó una mezcla maestra para la amplificación por PCR de las regiones bisagra cortas y largas del siguiente modo:

: 46 \mul de mezcla de dNTP (5 mM)

: 11,5 \mul de LAM 07 o LAM 08 (100 pmol/\mul)

Cebador LAM 07 3' (específico de la región bisagra corta)

: 5' AACAGTTAAGCTTCCGCTTGCGGCCGCGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG 3'

Cebador LAM 08 3' (específico de la región bisagra larga)

: 5' ACAGTTAAGCTTCCGCTTGCGGCCGCTGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT 3'

: 11,5 \mul de V_{H} 2B (100 pmol/\mul)

Cebador V_{H} 2B 5'

: 5' AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG 3'

: S = C/G, M = A/C, W = A/T, R = A/G

: 115 \mul de MgCl_{2} (25 mM)

: 161 \mul de agua tratada con DEPC

Se prepararon 20 tubos para la amplificación de las regiones bisagra cortas y largas que contenían 15 \mul/Eppendorf de la mezcla maestra anterior y 1 ampliwax (Perkin Elmer). Los tubos se incubaron durante 5 minutos a 75ºC para fundir la cera y después se colocaron sobre hielo.

Se añadieron 35 \mul de la siguiente mezcla apropiada a cada Eppendorf:

: 200 \mul de solución tampón 5x stoffel (Perkin Elmer)

: 20 \mul de fragmento stoffel de ADN polimerasa Amplitaq (Perkin Elmer)

: 1140 \mul de agua tratada con DEPC

: 40 \mul de ADNc

Los controles negativos hicieron que se omitiera el ADNc y se reemplazara con agua. Las condiciones de reacción fueron:

	1 ciclo a	94ºC 5 minutos
		{94ºC 1 minuto
	35 ciclos a	{55ºC 1,5 minutos
		{77ºC 2 minutos
	1 ciclo a	72ºC 5 minutos

Se hicieron reacciones idénticas y se analizaron 5 \mul sobre un gel de agarosa al 2%.

2.1.1.6 Digestión de la Encima de Restricción de VHHs y pUR4536

Los productos de la PCR de las regiones bisagra cortas y largas de llama se purificaron en un gel de agarosa al 2% utilizando el equipo de purificación Qiaex II (Qiagen) y se volvieron a suspender en un volumen final de 80 \mul. Se digirieron 50 \mul de esta muestra utilizando Hind III (Gibco BRL) y Pst I (Gibco BRL) según las instrucciones del fabricante. Los productos de la PCR digeridos se purificaron de nuevo según se detalla más arriba.

2.1.1.7 Generación de librerías VHH de regiones bisagra cortas y largas

El producto de la PCR se combinó en las proporciones adecuadas con el vector digerido utilizando ADN ligasa (Gibco BRL) según las instrucciones del fabricante. Las reacciones de ligación se purificaron y se utilizaron para transformar E. coli XL-1 Blue electrocompetente (Stratagene).

2.1.1.8 Maxiescala de recuperación del fago

Se inocularon 15 ml de una disolución con 16 g de Triptona, 10 g de extracto de Levadura y 5 g de NaCl por litro conteniendo un 2% de glucosa y 100 \mug/ml de ampicilina (2TY/Amp/Glucosa) con 100 \mul de un sobrante de glicerol de cualquiera de las librerías de VHH de regiones bisagra cortas o largas y se llevaron a cabo recuperaciones del fago. Las células se dejaron crecer hasta alcanzar una fase exponencial de crecimiento y se infectaron con el fago auxiliar M13K07 (Gibco BRL). Las células infectadas se comprimieron y se volvieron a suspender en 2TY/Amp/Kan para permitir la liberación del fago en el sobrenadante. Tras la incubación durante la noche a 37ºC, los fagos se comprimieron y se concentraron mediante precipitación PEG. El sedimento final de fago se volvió a suspender en 1 ml de PBS en BSA al 2% /marvel al 1%, u ovoalbúmina al 2%/marvel al 1% según el caso, y se incubó durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente.

2.1.1.9 Selección de los fagos de unión de antígenos: Elaboración

Los inmunotubos Nunc se sensibilizaron con 2 ml de vino tinto o únicamente con PBSA (como control negativo) durante 1 semana a 37ºC. Los tubos se lavaron con PBSA y se prebloquearon con 2 ml de BSA al 2%/marvel al 1% en PBSTA a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 horas.

Se eliminó la solución bloqueante y se añadieron a los inmunotubos 100 \mul de solución de fago bloqueado en un volumen total de LAS/CoCo al 0,075% en BSA al 2%/marvel al 1%. Las muestras se incubaron durante 3,5 horas a temperatura ambiente.

Los tubos se lavaron 20 veces con PBST y con 20 veces con PBS. El fago unido se eliminó de las superficies con 0,5 ml de glicina 0,2 M/HCl 0,1 M pH2,2 que contiene 10 mg/ml de BSA, y se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las soluciones se trasladaron a tubos limpios y se neutralizaron con 30 \mul de Tris 2 M. Se infectó E. coli XL-1 Blue con fago eluido.

2.1.1.10 Generación de fragmentos HCV solubles

El ADN se identificó a partir de la librería elaborada utilizando el equipo midi-prep de Qiagen utilizado para transformar la E. coli D29A1 competente por tratamiento con CaCl_{2}, que se colocó en bandejas SOBAG y se dejó crecer durante la noche a 37ºC. Las colonias individuales de E. coli D29A1 recién transformadas se cogieron y se indujo la expresión del VHH utilizando el IPTG.

2.1.1.11 Detección de la expresión de los constructos anti-polifenol VHH-myc

Se sensibilizaron bandejas de pocillos Greiner con 100 \mul/pocillo de vino tinto, así como otras fuentes de polifenoles o sólo PBSA durante aproximadamente 60 horas a 37ºC. Las bandejas se bloquearon con 200 \mul/pocillo de BSA/PBSTA al 1% durante 1 hora a 37ºC. Previamente se mezclaron 65 \mul de sobrenadante E. coli sin transformar con 32 \mul de BSA/PBSTA al 2% y se añadieron a los pocillos apropiados de las bandejas bloqueadas. Se permitió la unión de los VHHs a los antígenos durante 2 horas a 37ºC. Los fragmentos no unidos se eliminaron lavando 4 veces con PBSTA. Se añadieron 100 \mul/pocillo de una dilución apropiada de anticuerpos anti-myc de ratón en BSA/PBSTA al 1% y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Las bandejas se lavaron como antes y se añadieron 100 \mul/pocillo de una dilución apropiada de fosfatasa alcalina conjugada con anti-ratón de cabra (Jackson) en BSA/PBSTA al 1% y se incubó como anteriormente. Las bandejas se lavaron de nuevo y se detectó la actividad de la fosfatasa mediante la adición de 100 \mul/pocillo de una solución sustrato: 1 mg/ml de pNPP en 1 M de dietanolamina/1 mM de MgCl_{2}. La absorbancia se leyó a 405 nm cuando se había desarrollado el color.

2.1.2 Preparación de fragmentos Anti-Gox VHH

Se inmunizó una llama, criada en el Instituto Holandés para la Salud y Ciencia Animales (ID-DLO, Lelystad) con cantidades equimolares de dos preparaciones Gox diferentes: Novo y Amano.

La llama se inmunizó y posteriormente se le administró un refuerzo dos veces más, con un mes de separación, antes de eliminar los linfocitos sanguíneos periféricos (PBLs) para identificar su ARN.

Se construyeron librerías de VHHs de regiones bisagra cortas y largas tal y como se describe para los VHHs del vino tinto más arriba. Las librerías se elaboraron contra inmunotubos (Nunc) sensibilizados con 2 ml de Gox a 20 \mug/ml (Novo) o únicamente PBSA (control negativo). El ADN de las librerías elaboradas se identificó y se utilizó para transformar E. coli D29A1. Se tomaron colonias individuales y se generaron fragmentos VHH solubles exactamente como se ha descrito más arriba.

2.1.2.1 Detección de la expresión de constructos Anti-GOx VHH-myc

Se sensibilizaron bandejas de pocillos de alta capacidad de unión (Greiner) con 100 \mul/pocillo de GOx a 10 \mug/ml (Novo) o únicamente con PBSA durante la noche a 37ºC. Las bandejas se bloquearon con 200 \mul/pocillo de BSA/PBSTA al 1% durante 1 hora a 37ºC. Previamente se mezclaron 80 \mul de sobrenadante E. coli sin transformar con 40 \mul de BSA/PBSTA al 2% y se añadieron a los pocillos apropiados de las bandejas bloqueadas. Se permitió a los VHHs unirse durante 2 horas a 37ºC. La unión de los VHHs a los Gox se detectó como se ha descrito para la unión de los VHHs al vino tinto.

2.1.3 Construcción de vectores de expresión biespecífico RW/GOx

La estrategia para clonar moléculas biespecífico se muestra diagramáticamente en la Figura 7.

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2.1.3.1 PCR de VHH49RW

HCV49RW se amplificó mediante PCR utilizando cebadores 51 y HCV 3'

100

La mezcla de la reacción para la amplificación fue de 10 pmoles de cada cebador, un tampón 1xPfu (Stratagene), 0,2 mM de dNTPs, 0,2 \mul de ADN midiprep VHH49RW, 1 \mul de la enzima Pfu (Stratagene) y agua hasta 50 \mul. Las condiciones de la reacción fueron:

	94ºC durante 4minutos
	94ºC durante 1minuto	}
	55ºC durante 1minuto	} 33 ciclos
	72ºC durante 1minuto	}
	72ºC durante 10minutos

2.1.3.2 Clonación de VHHs en vectores de expresión de Levadura pPic

Se extrajo VHH12GOx del plásmido pUR4536 utilizando PstI y BstEII según las instrucciones de los fabricantes. El fragmento de PCR de VHH49RW se digirió de modo similar. Todos los fragmentos extraídos se purificaron en un gel de agarosa al 1% utilizando el equipo de purificación Qiaex II (Qiagen).

Después, los fragmentos se clonaron en el vector modificado, pUC19 (conteniendo un sitio de restricción XhoI en el extremo 5' de un VHH clonado previamente y una cola hidrofílica II para la detección), que también había sido digerido con PstI y BstEII. La ligación se llevó a cabo utilizando ADN ligasa (Gibco BRL) según las instrucciones de los fabricantes. E. coli TG1 competente por tratamiento con cloruro de calcio se transformó con una porción de la reacción de ligación. Para seleccionar clones que contienen los insertos correctos, se tomaron colonias individuales, se aisló el ADN, y se realizo un análisis de enzimas de restricción de diagnóstico utilizando PstI y BstEII. Para verificar los insertos, se secuenció el ADN mediante secuenciación dideoxi automatizada (Applied Biosystems).

Posteriormente se extrajeron los VHHs de los vectores pUC19 utilizando digestiones secuenciales con XhoI y EcoRI y los tampones recomendados por los fabricantes de las enzimas. El vector pPic9 (Invitrogen) se digirió de modo análogo y los VHHs digeridos se insertaron en este vector tal y como se describe para el clonado en el pUC19. Los clones que contienen los insertos correctos se determinaron también utilizando digestión diagnóstica con XhoI y EcoRI, y secuenciación del ADN.

Para crear los constructos biespecíficos se combinaron el anti-polifenol VHH49RW y el anti-GOx VHH12GOx en el mismo vector de ADN pPic9. El vector pPic9 que contenía el anti-GOx VHH se digirió con BstEII y EcoRI para eliminar un fragmento de 85pb. El vector pPic9 que contenía el VHH49RW se digirió con PstI y EcoRI para liberar el VHH. Todas las digestiones de enzimas de restricción fueron secuenciales utilizando los tampones apropiados según las recomendaciones de los fabricantes. El vector digerido y el VHH se purificaron utilizando el equipo de purificación Qiaex II (Qiagen).

Se hibridaron dos oligonucleótidos, que contenían un extremo saliente 5' BstEII y un PstI 3' (GTCACCGT CTCCTCACAGGTGCAGCTGCA, y GCAGAGGAGTGTCCACGTCG) utilizando la siguiente mezcla:

: 1 \mug de cada oligonucleótido

: 1 \mul de tampón 10x ligasa (Promega)

: agua hasta 10 \mul.

La mezcla se hirvió durante 1 minuto y después se dejó enfriar durante aproximadamente 30 minutos. Se añadieron 190 \mul de agua. Se añadieron diferentes proporciones de vectores que contenían VHH49RW y VHH12Gox. Se llevaron a cabo las reacciones de ligación de tres puntos utilizando las condiciones descritas previamente. Se transformaron 100 \mul de E. coli XL-1Blue competente por tratamiento con cloruro de calcio con 4 \mul de la reacción de ligación. la identificación de los clones que contienen ambos VHHs se realizo utilizando los cebadores 392 y 393.

Cebador 392

: 5' GCAAATGGCATTCTGACATCC 3'

Cebador 393

: 5' TACTATTGCCAGCATTGCTGC 3'

El ADN amplificado se analizó sobre un gel de agarosa al 1% y se identificaron los vectores que contenían los anticuerpos biespecíficos en función de su tamaño. Los clones apropiados se confirmaron posteriormente mediante digestiones de enzimas de restricción de diagnóstico de los productos de PCR con PstI y BstEII simultáneamente, y una secuenciación Sanger dideoxi utilizando los cebadores 392 y 393. La secuencia de aminoácido pronosticada biespecífico 12,49 se muestra en la Figura 8.

2.2 Expresión de anticuerpos biespecíficos en Pichia pastoris

Los vectores pPic9 que contenían ADN biespecífico se transformaron en la levadura metilotrófica, Pichia pastoris. Se digirieron 10 \mug del ADN vector con la enzima de restricción de ADN Bgl II, se purificaron mediante extracción de fenol, se precipitaron con etanol, y se utilizaron para transformar la GS115, variedad de P. pastoris electrocompetente (Invitrogen). Las células se dejaron crecer durante 48 horas a 30ºC en bandejas MD (1,34% de TND, 5x10^{-5}% de biotina, 0,5% de metanol, 0,15% de agar) y después se seleccionaron colonias Mut^{+}/Mut^{s} corrigiendo en una bandeja MM (1,34% de TND, 5x10^{-5}% de biotina, 1% de glucosa, 0,15% de agar) y una bandeja MD. Las colonias que crecen normalmente en las bandejas MD pero crecen muy lentamente en las bandejas MM son los clones Mut^{s}.

Se utilizó una única colonia de las bandejas MD para inocular 10 ml de medio BMGY (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 100 mM de fosfato de potasio pH 6,0, 1,34% de YNB, 5x10^{-5}% de biotina, 1% de glicerol) en un tubo Falcon de 50 ml. La expresión de los anticuerpos biespecíficos se indujo mediante la adición de metanol después de permitir a las colonias alcanzaran la fase de crecimiento exponencial. Los sobrenadantes se recogieron mediante centrifugación y se analizaron.

2.3 Activación de una superficie con un fragmento de anticuerpo biespecífico

Se incubó vino tinto durante la noche a 37ºC en una bandeja de pocillos Nunc con 200 \mul/pocillo y las bandejas se guardaron a 4ºC hasta que se necesitaran. Las bandejas se lavaron una vez con un tampón fosfato salino que contenía 0,15% (v/v) de Tween 20 y 0,02% de tiomersal (PBSTM) y se incubó con varias diluciones de anticuerpos biespecíficos 12,49 de un cultivo sobrenadante (en una concentración de stock de aproximadamente 1 mg/ml). Pasados 20 minutos los pocillos de la bandeja se lavaron tres veces mediante la adición de 200 \mul de PBSTM.

2.4 Glucosa oxidasa recogida a partir de una solución y su subsiguiente detección

Se incubó una solución de glucosa oxidasa (Novo) con 100 \mul/pocillo (20 \mug/ml diluidos en PBSTM) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron a continuación tres veces mediante la adición de 200 \mul de PBSTM y después se incubaron con 100 \mug/pocillo de una solución sustrato que contenía 20 mM de glucosa, 10 \mug/ml de tetrametilbencidina, 1 \mug/ml de peroxidasa de rábano en 0,1 M de tampón de fosfato a un pH 6,5. Pasados 10 minutos se añadieron 100 \mul de HCl 1 M por pocillo y se determinó la densidad óptica a 450 nm. Para su comparación, tras la unión del vino tinto a la solución de la bandeja de pocillos, que contenía una mezcla de anticuerpos biespecíficos a varias diluciones y glucosa oxidasa a 20 \mug/ml diluidos en PBSTM, se incubó durante 15 minutos y la bandeja se lavó como se describe más arriba. La Figura 9 muestra que una superficie de vino tinto activada con un anticuerpo biespecífico (Fig 9 A) puede recoger más glucosa oxidasa de la que se puede unir a una superficie de vino cuando el anticuerpo biespecífico y la glucosa oxidasa se mezclan conjuntamente en una única etapa (Fig 9 B).

Ejemplo 3 Recuperación de glucosa oxidasa de la solución en algodón activado con vino tinto 3.1. Activación de una superficie de algodón con un fragmento de anticuerpo biespecífico

Se mancharon hojas de algodón (aprox. 20 x 10 cm) con vino tinto mediante la inmersión de las hojas en vino tinto durante 2 horas a 37ºC. Las hojas manchadas se dejaron secar al aire a 37ºC y se guardaron en la oscuridad durante 4 días en bolsas de papel de aluminio selladas. Las hojas sucias se guardaron en bolsas de papel de aluminio a 20ºC hasta que se requirieron. Se prepararon muestras de algodón sucio troquelando discos circulares del tejido utilizando una troqueladora. Las muestras se prelavaron en una solución tampón de carbonato de sodio 0,1 M y pH 9,0 y se bloqueó una bandeja de pocillos Nunc mediante la incubación de los pocillos con 200 \mul de Marvel al 1% (p/v). Las muestras se colocaron en los pocillos de la bandeja y se añadieron 100 \mul de anticuerpo biespecífico 12,49 a 5 \mug/ml en una solución tampón de carbonato de sodio 0,1 M con pH 9,0 por pocillo. Pasados 15 minutos de incubación a temperatura ambiente las muestras se lavaron tres veces con una solución tampón de carbonato de sodio 0,1 M con pH 9,0.

3.2 Recuperación de glucosa oxidasa de una solución y la decoloración posterior de una mancha de vino tinto

Se incubó una solución de glucosa oxidasa (una alícuota de 100 \mul a 50 \mug/ml en una solución tampón de carbonato de sodio 0,1 M con un pH 9,0) con la muestra activada en el pocillo de una bandeja durante 15 minutos a 37ºC. Después, se lavaron las muestras tres veces en una solución tampón de carbonato de sodio 0,1 M con pH 9,0 y posteriormente se añadieron 25 \mul de glucosa (80 mM) a cada muestra y se incubó a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se lavaron las muestras cinco veces con H_{2}O destilada y a continuación se secaron a 37ºC. Las imágenes de las muestras se escanearon en el escáner digital Scanjet ADF de Hewlett Packard. Para su comparación, las muestras prelavadas que no habían sido expuestas al anticuerpo biespecífico se incubaron con una mezcla de anticuerpo biespecífico 12,49 (5 \mug/ml), glucosa oxidasa (50 \mug/ml) y glucosa (80 mM) a temperatura ambiente durante 60 minutos. Estas muestras se lavaron en H_{2}O y se secaron como anteriormente. Las muestras que se preactivaron con moléculas de unión mostraron unos resultados de decoloración superiores cuando se compararon con las que estaban sin tratar. Esto demuestra la ventaja de preactivar una superficie para capturar un agente beneficioso que se puede emplear o puede llevar a cabo su efecto deseado en un lugar o región especificado.

Ejemplo 4 La captura de cuerpos oleosos en el tejido

El experimento ejemplifica la captura de partículas (cuerpos oleosos vegetales) sobre tejido de algodón que se ha preparado con una molécula de biorreconocimiento capaz de unirse al algodón y eliminar específicamente partículas del entorno próximo.

1.1 Obtención del cuerpo oleoso

Se obtuvieron cuerpos oleosos de semillas de colza esencialmente como han descrito Tzen y otros (J. Biol Chem. 267, 15626-15634). Brevemente, las semillas de colza se molieron hasta un polvo fino en nitrógeno líquido utilizando a mano un mortero, y se tamizaron. Se homogeneizó 1 g de semilla triturada en un 4 g medio pulverizador, sobre hielo. La muestra se mezcló con un volumen igual de un medio flotante que contenía 0,6 M sucrosa, y se centrifugó. La "capa grasienta" se trasladó a otro tubo, se resuspendió en un medio flotante que contenía 0,25 M sucrosa y se centrifugó. La "capa grasienta" se recogió y se guardó a 4ºC.

1.2 Preparación de cuerpos oleosos que contienen nilo rojo

Para ser capaces de visualizar la presencia de cuerpos oleosos sobre piel o algodón, se preparan conteniendo un reactivo lipofílico, nilo rojo, que es un marcador fluorescente.

Se añadió un cristal de nilo rojo a una suspensión al 2% de cuerpos oleosos en agua. La muestra se agitó durante 2 minutos y se centrifugó a 13.000 rpm durante 2 minutos. La capa superior que contenía los cuerpos oleosos se recogió y se lavó 3 veces con un tampón fosfato salino (PBS) (0,24 g NaH_{2}PO_{4}.H_{2}0, 0,49 g Na_{2}HPO_{4} anhidro, 4,25 g NaCl, en 1 litro de agua, pH 7,1). Después del lavado final, se resuspendieron los cuerpos oleosos en 5 ml de PBS.

1.3 Sensibilización de cuerpos oleosos con reactivos rojo 6 y nilo rojo

Había disponible un anticuerpo para el reactivo tinte-azo rojo 6 (RR6) (ICI), por lo tanto, se sensibilizaron cuerpos oleosos con RR6 para posibilitar el estudio de la deposición específica de los cuerpos oleosos sobre las superficies.

Se resuspendieron 0,1 g de cuerpos oleosos en 4,8 ml de Na_{2}B_{4}O_{7}.10H_{2}O 0,1 M, NaCl 0,05 M pH 8,5, y 0,2 ml de RR6 al 2% en agua. La suspensión se agitó durante una noche a temperatura ambiente. La muestra se centrifugó a 13.000 rpm durante 2 minutos, y se recogió la capa superior y se añadió nilo rojo como se ha descrito más arriba.

1.4 Generación de anti-RR6 VHH-anti-Queratina VHH-CBD

La recolección de cuerpos oleosos a partir de la solución y su captura sobre algodón se realizó utilizando una molécula que tenía 2 especificidades VHH unidas al CBD (\alphaRR6 VHH-\alphaqueratina VHH-CBD).

1.4.1. Preparación de VHH específico de queratina de la llama 1.4.1.1 Preparación del antígeno

Se obtuvieron corneocitos de callo plantar humano mediante limado. Se preparó un extracto soluble de callo suspendiendo 100 mg de corneocitos de callo en 50 ml de Tris 20 mM pH 7,4 / urea 8 M / SDS al 1%, hirviendo durante 15 minutos y después aplicando una sonda de ultrasonidos de 22 \mu durante 2 minutos. La muestra se centrifugó a 1.000 g durante 20 minutos a 15ºC. El sobrenadante se recuperó y se dializó contra PBS durante la noche.

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1.4.1.2 Programa de inmunización

Una llama, criada en el Instituto Holandés para la Salud y Ciencia Animales (ID-DLO, Lelystad), se inmunizó con corneocitos de callo y posteriormente se reforzó 2 veces más con aproximadamente un mes de separación. El suero utilizado para la construcción de la librería se recogió 1 semana después del segundo refuerzo.

1.4.1.3 Análisis de suero policlonal

El suero se analizó con ELISA contra extracto soluble de callo del siguiente modo:

1. Una bandeja de pocillos Sterilin (Sero-Wel) se sensibilizó con 100 \mul/pocillo de extracto de callo a 25 \mug/ml en PBS. Las bandejas se incubaron durante la noche a 4ºC y después se lavaron en PBS.

2. La bandeja se bloqueó mediante preincubación con 200 \mul/pocillo de marvel al 1% en PBS conteniendo Tween (PBST) al 0,15% durante 1 hora a 37ºC.

3. Se eliminó el tampón bloqueante y se añadieron 100 \mul/pocillo de una solución de suero de llama inmunizado o preinmunizado, comenzando con una dilución 10^{-1} en PBS. Las incubaciones duraron 1 hora a 37ºC.

4. El fragmento de anticuerpo sin unir se eliminó lavando 4 veces utilizando un limpiador de bandejas en PBST.

5. Se añadieron 100 \mul/pocillo de una dilución apropiada de VHH anti-llama de ratón en PBST. La incubación duró 1 hora a 37ºC.

6. La bandeja se lavó como se ha descrito en la etapa 3.

7. Se añadieron 100 \mul/pocillo de una dilución apropiada de fosfatasa alcalina conjugada con anti-ratón de cabra (Jackson) en PBSTA y se incubó durante 1 hora a 37ºC.

8. La bandeja se lavó como se ha descrito previamente.

9. Se detectó la actividad de la fosfatasa alcalina añadiendo 100 \mul/pocillo de una solución sustrato: 1 mg/ml de pNPP en dietanolamina 1 M, MgCl_{2} 1 mM.

10. La absorbancia se leyó a 405 nm cuando se había desarrollado el color.

1.4.1.4 Identificación del ARNm y síntesis del ADNc

Se separaron 2,5x10^{8} linfocitos sanguíneos periféricos (Pals) utilizando un gradiente de Ficol. El ARN se identificó basándose en el método de Chomczynnski y Sacchi, (1997) Anal. Biochem., vol. 162, págs. 156-159. Posteriormente se preparó ARNm utilizando el equipo de purificación de Qiagen ARNm Oligotex.

El ADNc se sintetizó utilizando el equipo de Síntesis de Primera Cadena para RT-PCR de Amersham (RPN 1266) y el cebador oligo dT. Aproximadamente, según estimaciones, se utilizaron 2 \mug de ARNm (1 \mug/Eppendorf) del total de la concentración total de ARN y suponiendo que el ARNm forma aproximadamente el 1% del total de ARN.

1.4.1.5 Identificación de VHHs de regiones bisagra cortas y largas mediante PCR

Se preparó una mezcla maestra para la amplificación de PCR de las regiones bisagra cortas y largas del siguiente modo:

: 46 \mul de mezcla de dNTP (5 mM)

: 11,5 \mul de LAM 07 o LAM 08 (100 pmol/\mul)

: LAM 07: 5' AACAGTTAAGCTTCCGCTTGCGGCCGCGGAGCTGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG

: LAM 08: 5' AACAGTTAAGCTTCCGCTTGCGGCCGCTGGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT

: 11,5 \mul de VH2B (100 pmol/\mul)

: VH2B: 5' AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG

: S= C/G, M= A/C, W= A/T, R= A/G

: 115 \mul de MgCl_{2} (25 mM)

: 161 \mul de agua tratada con DEPC

Se añadieron 35 \mul de la siguiente mezcla apropiada a cada Eppendorf:

: 200 \mul de solución tampón 5x stoffel (Perkin Elmer)

: 20 \mul de fragmento stoffel de ADN polimerasa Amplitaq (Perkin Elmer)

: 1140 \mul de agua tratada con DEPC

: 40 \mul de ADNc

Los controles negativos hicieron que se omitiera el ADNc y se reemplazara con agua. Las condiciones de reacción fueron: 1 ciclo a 94ºC 5 minutos; 35 ciclos a (94ºC 1 minuto; 55ºC 1,5 minutos; 77ºC 2 minutos) y 1 ciclo a 72ºC 5 minutos. Se hicieron reacciones idénticas y se analizaron 5 \mul sobre un gel de agarosa al 2%.

1.4.1.6 Digestión de la enzima de restricción de VHHs y pUR4536

Los productos de la PCR de regiones bisagra cortas y largas de llama se purificaron a partir de un gel de agarosa al 2% utilizando el equipo de purificación Qiaex II (Qiagen) y se resuspendieron en un volumen final de 80 \mul. Se digirieron 40 \mul de esta muestra utilizando Hind III (Gibco BRL) y PstI (Gibco BRL) según las instrucciones del fabricante. Los productos de la PCR digeridos se purificaron de nuevo como se ha detallado más arriba. El pUR4536 (Figura 10) se digirió y purificó de manera similar.

1.4.1.7 Generación de las librerías VHH de regiones bisagra cortas y largas

El producto de la PCR se combinó en las proporciones adecuadas con el vector digerido utilizando ADN ligasa (Gibco BRL) según las instrucciones del fabricante. Las reacciones de ligación se purificaron y se utilizaron para transformar E. coli JM109 electrocompetente (Stratagene).

1.4.1.8 Maxiescala para recuperación de fagos

Se inocularon 15 ml de 2TY/Amp/Glucosa (16 g de Triptona, 10 g de extracto de Levadura, 5 g de NaCl por litro conteniendo un 2% de glucosa y 100 \mug/ml de ampicilina) con 100 \mul de un stock de glicerol de cualquiera de las librerías de VHH de regiones bisagra cortas o largas y se llevaron a cabo recuperaciones de fagos. Las células se dejaron crecer hasta que se alcanzó la fase de crecimiento exponencial y se infectaron con el fago auxiliar M13K07 (Gibco BRL). Las células infectadas se comprimieron y se resuspendieron en 2TY/Amp/Kan para permitir la liberación del fago en el sobrenadante. Tras la incubación durante la noche a 37ºC, los fagos se comprimieron y se concentraron mediante precipitación PEG. El sedimento final de fago se resuspendió en 3 ml de PBS en BSA al 2%/marvel al 1% y se incubó durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente.

1.4.1.9 Selección de los fagos de unión de antígenos: Elaboración

Los inmunotubos Nunc se sensibilizaron con 1 ml de extracto soluble de callo a 50 \mug/ml en PBS, o únicamente con PBS (como control negativo) durante 1 la noche a 4ºC. Los tubos se lavaron con PBS y se prebloquearon con 2 ml de BSA al 2%/marvel al 1% en PBST a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 horas.

La solución bloqueante se eliminó y se añadió 1 ml de solución de fago bloqueado a los inmunotubos. Las muestras se incubaron durante 4 horas a temperatura ambiente.

Los tubos se lavaron 20 veces con PBST y 20 veces con PBS. Los fagos unidos se recogieron con 0,5 ml de glicina 0,2 M/HCl 0,1 M pH2,2 que contiene 10 mg/ml de BSA, y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. La solución se trasladó a un tubo limpio y se neutralizó con 30 \mul de Tris 2 M. Se añadieron 200 \mul de Tris 1 M pH7,5 a los tubos.

Se añadió el fago eluido a 9 ml de E. coli XL-1 Blue en fase de crecimiento exponencial. También se añadieron a los inmunotubos 4 ml de E. coli en fase de crecimiento exponencial. Los cultivos se incubaron durante 30 minutos a 37ºC sin remover para permitir la infección de E. coli por el fago.

Los cultivos se agruparon como fue conveniente, se sedimentaron y resuspendieron en 2TY y se colocaron en bandejas SOBAG (20 g de bactotriptona, 5 g de extracto de bacto-levadura, 0,5 g de NaCl por litro, MgCl_{2} 10 mM, glucosa al 1%, ampicilina a 100 \mug/ml) para su recogida y el proceso de elaboración se repitió otras 2 veces más.

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1.4.1.10 Generación de fragmentos VHH solubles

Los clones de las librerías elaboradas se recogieron y el ADN se obtuvo a partir de los gránulos de células utilizando el equipo midi-prep de Qiagen. El ADN de cada librería elaborada se utilizó para transformar E. coli D29A1 competente por tratamiento con CaCl_{2}, que se colocó en bandejas SOBAG y se dejó crecer durante una noche a 37ºC. Se tomaron colonias individuales de E. coli D29A1 recién transformadas y se indujo su expresión VHH en una escala de bandeja de pocillos utilizando IPTG.

1.4.1.11 Detección de la expresión del constructo anti-piel VHH-myc

Se sensibilizó una bandeja de pocillos Sterilin (Sero-Wel) con extracto soluble de callo o únicamente con PBS. Las bandejas se bloquearon con 200 \mul/pocillo de BSA/PBST al 1% durante 1 hora a 37ºC. Se premezclaron 90 \mul de sobrenadante de E. coli sin refinar con 45 \mul de BSA/PBS al 2% y se añadieron a los pocillos apropiados de las bandejas bloqueadas. La incubación duró dos horas a 37ºC. El fragmento sin unir se eliminó mediante 4 lavados con PBST. Se añadieron 100 \mul/pocillo de una dilución apropiada de anticuerpo anti-myc de ratón (casero) en BSA/PBST al 1% y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Las bandejas se lavaron como anteriormente y se añadieron 100 \mul/pocillo de una dilución apropiada de fosfatasa alcalina conjugada con anti-ratón de cabra (Jackson) en BSA/PBST al 1% y se incubaron como anteriormente. Las bandejas se lavaron de nuevo y se detectó la actividad de la fosfatasa alcalina mediante la adición de una solución sustrato de 100 \mul/pocillo: 1 mg/ml pNPP en dietanolamina 1 M/MgCl_{2} 1 mM. La absorbancia se leyó a 405 nm cuando se había desarrollado el color. El clon VHH8 se identificó como específicamente unido a la queratina epidérmica.

1.4.2 Preparación de VHH específico anti-RR6 de llama

El VHH anti-RR6 se identificó de modo similar al VHH anti-queratina como ha sido descrito por Linden, R (Unique characteristics of llama heavy chain antibodies, PhD Thesis, Utrecht University, Netherlands, 1999).

1.4.3 Construcción de anti-RR6-anti-queratina-CBD

El anti-RR6VHH estaba genéticamente fundido con 6 histidinas (para fines de purificación) y se derivó CBD de Trichoderma reesei (Linder M. y otros, Protein Science, 1995, vol 4, pag 1056-1064), y se clonó en pPic9 (Figura 11). El VHH8 (anti-queratina) se obtuvo posteriormente a partir de pUR4536 mediante digestión de enzimas de restricción. Utilizando BstEII, el VHH8 se ligó entre el anti-RR6 VHH y la secuencia CBD en pPic9. El clon se expresó en Pichia pastoris. La secuencia de ADN se muestra en al Figura 12.

1.5 Producción y análisis de una molécula de biorreconocimiento de triple especificidad 1.5.1 Transformación y selección de células P. pastoris transformadas

Se utilizaron aproximadamente 2-5 \mug de ADN en 2 \mul de agua (TthIIIi, SacI digerido) y el constructo pPic9 para transformar P. pastoris GS115 electrocompetente (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.

1.5.2 Producción y evaluación de anti-RR6-VHH8-CBD

Los clones de P. pastoris transformados y seleccionados se indujeron para expresar el anticuerpo utilizando el protocolo esbozado a continuación:

1) Utilizando una única colonia de la bandeja MD, inocular 10 ml de BMGY (extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, fosfato de potasio 100 mM pH6,0, YNB al 1,34%, biotina al 4x10^{-5}%, glicerol al 1%) en un tubo Falcon de 50 ml.

2) Dejar crecer a 30ºC en una incubadora giratoria (250 rpm) hasta que el cultivo alcance un OD_{600}\sim2-8.

3) Centrifugar los cultivos a 2000 g durante 5 minutos y resuspender las células en 2 ml de un medio BMMY (extracto de levadura al 1%, peptona al 2%, fosfato de potasio 100 mM pH6,0, YNB al 1,34%, biotina al 4x10^{-5}%, glicerol al 0,5%).

4) Devolver los cultivos a la incubadora.

5) Añadir 20 \mul de MeOH a los cultivos tras 24 horas para mantener la inducción.

6) Transcurridas 48 horas, recolectar el sobrenadante recogiendo las células mediante centrifugación.

Se analizaron los sobrenadantes sin tratar buscando la presencia de constructos de anticuerpos sobre geles de acrilamida al 12% utilizando el sistema Bio-Rad mini-Protean II. La actividad del VHH8 se detectó como se ha descrito en la sección 1.4.1.11. La actividad del anti-RR6 se detectó del siguiente modo:

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1) Se sensibilizaron 96 pocillos de bandejas ELISA (bandejas Greiner HB) durante la noche a 37ºC con 100 \mul/pocillo de BSA-RR6 conjugado (tinte azo RR6 (ICI) que se unió al BSA a través de su grupo triazina reactivo) en PBS, o únicamente PBS.

2) Después de lavar los pocillos con PBST se incubaron durante 1 hora a 37ºC con un 100 \mul de una solución tampón bloqueante (BSA al 1% en PBST) por pocillo.

3) Se mezclaron los sobrenadantes (50 \mul) del análisis con iguales volúmenes de tampón bloqueante y se añadieron a los pocillos ELISA sensibilizados. Se incubaron a 37ºC durante 1 hora.

4) Después de 4 lavados con PBST, se añadieron 100 \mul de suero policlonal anti-llama de ratón (casero) a una dilución apropiada en una solución tampón bloqueante. Se incubó a 37ºC durante 1 hora.

5) Después de cuatro lavados con PBST, se añadió fosfatasa alcalina conjugada con anti-ratón de cabra (Zymed) a una dilución apropiada en una solución tampón bloqueante. Se incubó a 37ºC durante 1 hora.

6) Después de 4 lavados con PBST, se añadieron 100 \mul/pocillo de sustrato pNPP (1 mg/ml de pNPP en dietanolamina 1 M/MgCl_{2} 1 mM) a cada pocillo. Las bandejas se leyeron a 405nm cuando se había desarrollado el color.

La actividad de unión CBD se detectó del siguiente modo:

1) Se añadieron 20 \mul de etilcelulosa y 80 \mul de marvel al 0,1% en PBST (solución tampón bloqueante), o únicamente solución tampón bloqueante, a los pocillos de una bandeja filtrante MAHV de 0,45 \mu (Millipore). Se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente removiendo.

2) La solución tampón se eliminó utilizando un tubo de vacío.

3) Se mezclaron los sobrenadantes del análisis (50 \mul) con iguales volúmenes de solución tampón bloqueante y se añadieron a los pocillos ELISA. Se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora, removiendo.

4) Después de 10 lavados con PBST, se añadieron 100 \mul de suero policlonal anti-llama de ratón (casero) a una dilución apropiada en una solución tampón bloqueante. Se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora, removiendo.

5) Después de 10 lavados con PBST, se añadió fosfatasa alcalina conjugada con anti-ratón de cabra (Zymed) a una dilución apropiada en una solución tampón bloqueante. Se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora, removiendo.

6) Después de lavar 10 veces con PBST, se añadieron 100 \mul/pocillo de sustrato pNPP (1 mg/ml de pNPP en dietanolamina 1 M/MgCl_{2} 1 mM) a cada pocillo. Cuando se había desarrollado el color, se trasladó el sustrato a una nueva bandeja ELISA sólida y se leyó la densidad óptica a 405 nm.

1.5.3 Expresión a gran escala del constructo

Los clones que produjeron los mejores niveles de expresión y actividades de unión se seleccionaron y produjeron en una escala de fermentación 31 en un fermentador. La purificación se hizo con cola de histidina utilizando IMAC (cromatografía de afinidad metálica inmovilizada).

1.6 Direccionamiento de los cuerpos oleosos al algodón

Se colocaron múltiplos de 4 lotes de 2 cm de longitud de fibras de algodón en viales de cristal de 3 ml de volumen. El algodón se prelavó durante 30 minutos en 1 ml de PBST removiendo. La solución tampón se decantó y se reemplazó con 1 ml de anti-RR6-VHH8-CBD a 25 \mug/ml en PBS que contenía detergente Tween al 0,15% (PBST) o únicamente PBST. La incubación duró 1 hora a temperatura ambiente removiendo. Las muestras se lavaron 3 veces durante 5 minutos con 1 ml de PBST, removiendo a temperatura ambiente. Después, las muestras se incubaron durante 1 hora, a temperatura ambiente, removiendo, con cualquiera de los siguientes:

: 100 \mul de cuerpos oleosos que contenían nilo rojo y 900 \mul de PBST

: 100 \mul de cuerpos oleosos que contenían nilo rojo, sensibilizados con RR6 y 900 \mul de PBST

: 1 ml de PBST únicamente.

Las muestras se lavaron 3 veces durante 10 minutos con 1 ml de PBST, seguido de 3 ml de PBST durante 10 minutos, removiendo a temperatura ambiente.

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1.6.1 Análisis de la imagen

Se colocó una única fibra del algodón tratado en un portaobjetos y se colocó un cubreobjetos con cuidado sobre él. Los portaobjetos se observaron utilizando un microscopio de escaneo láser confocal Bio-rad MRC600 (Bio-Rad Laboratories Ltd), unido a un microscopio Ortolux II (Leica Microsystems UK Ltd), con una excitación láser de 488nm. Se utilizó un objetivo x4/0,12 LEITZ Plan (2) con un factor de zoom de 2,0 para observar los portaobjetos. Se tomaron cuatro áreas a lo largo de cada fibra de algodón a aproximadamente distancias iguales. Cada área de imagen tomada fue de 1795x1197 \mum. Los niveles de negro y ganancia para cada conjunto de imágenes se configuraron utilizando el control negativo y se mantuvieron constantes para el resto de las muestras.

El software Bio-Rad CoMos se utilizó para capturar, almacenar y analizar las imágenes. Se abrió una imagen y se seleccionaron las opciones de Mejorar y después Histograma. Se dibujó una caja y se cambió la relación de aspecto a un cuadrado. Se cambió el tamaño de esta caja hasta 150x150 píxeles (122.937,88 \mum^{2}), que se utilizó para todas las medidas. La caja se colocó cinco veces de manera aleatoria a lo largo de la fibra y se tomó la intensidad promedio de píxel dentro de la caja en cada punto. Se tomó un registro visual de cada área de medida y se imprimió. Los valores se exportaron a Microsoft Excel y se calculó el promedio de los valores promedio para cada fibra.

Los tratamientos que implican cuerpos oleosos sensibilizados con RR6 no pueden compararse directamente con aquellos que únicamente contienen nilo rojo, debido a que la aplicación de concentraciones iguales de las dos preparaciones diferentes no se pudo controlar estrictamente. Sin embargo, los resultados demuestran claramente que la deposición de cuerpos oleosos se mejora de manera significativa si el tejido se prepara previamente con una molécula de biorreconocimiento capaz de unir el algodón con la partícula recolectora de un medio acuoso, en presencia del detergente. La deposición de cuerpos oleosos sin sensibilizar con RR6, y por tanto, incapaces de unirse a \alphaRR6 VHH, fue significativamente menor. De manera análoga, si no estaba presente ningún anticuerpo, se reducía en gran medida la deposición de cuerpos oleosos. Los controles negativos de algodón sin tratar o de algodón incubado con anticuerpos mostraron únicamente unos niveles muy bajos de autofluorescencia.

Claims

1. Un método para aplicar un agente beneficioso a un tejido para llevar a cabo una actividad predeterminada, que comprende el tratamiento previo de dicho tejido con una molécula de unión multiespecífica, teniendo dicha molécula de unión una alta afinidad de unión a dicho tejido a través de una especificidad y siendo capaz de capturar y unirse a dicho agente beneficioso a través de otra especificidad, seguido por la puesta en contacto de dicho tejido pretratado con dicho agente beneficioso para llevar a cabo dicha actividad predeterminada con dicho tejido, donde dicha molécula de unión es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, o un derivado de los mismos.

2. El método de la reivindicación 1, donde dicha molécula de unión es una proteína de fusión que comprende un dominio de unión a celulosa y un dominio que tiene una alta afinidad de unión a otro ligando.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha área de un tejido contiene una o más manchas, dicha actividad predeterminada es una actividad decolorante, y dicho agente beneficioso es capaz de generar un agente decolorante.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho agente beneficioso es una enzima o parte de una enzima capaz de catalizar la formación de un agente decolorante.

5. El método de la reivindicación 4, donde dicha enzima o parte de enzima es una oxidasa o una haloperoxidasa o una parte funcional de las mismas.

6. El método de la reivindicación 5, donde dicha oxidasa se selecciona del grupo que consta de glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y alcohol oxidasa.

7. El método de la reivindicación 5, donde dicha haloperoxidasa es una cloroperoxidasa.

8. El método de la reivindicación 5, donde dicha cloroperoxidasa es una cloroperoxidasa de vanadio.

9. El método de la reivindicación 8, donde dicha cloroperoxidasa de vanadio es una cloroperoxidasa de Curvularia inaequalis.

10. El método de la reivindicación 1, donde dicho agente decolorante es peróxido de hidrógeno o un hipohalito, en particular un hipoclorito.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho agente beneficioso es una lacasa o una peroxidasa y dicho agente decolorante se deriva de una molécula mejoradora que ha reaccionado con la enzima.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha parte de la enzima está unida a dicha molécula de unión que tiene una alta afinidad de unión a estructuras derivadas de la porfirina, taninos, polifenoles, carotenoides, antocianinas, y productos de la reacción de Maillard.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha parte de la enzima está unida a dicha molécula de unión que tiene una alta afinidad de unión a estructuras derivadas de la porfirina, taninos, polifenoles, carotenoides, antocianinas, y productos de la reacción de Maillard cuando son adsorbidos en la superficie de un tejido.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el tejido es algodón, poliéster, poliéster/algodón, o lana.

15. El método de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo o dicho fragmento de anticuerpo o dicho derivado de los mismos es la totalidad o parte de una inmunoglobulina de cadena pesada inducida en Camelidae y tiene una especificidad por las moléculas de las manchas.

16. El método de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo o dicho fragmento de anticuerpo o dicho derivado de los mismos se unen a constituyentes químicos que están presentes en el té, la zarzamora y el vino tinto incluyendo los componentes no pigmentados de las manchas, por ejemplo las pectinas.

17. El método de la reivindicación 2 donde dicho ligando se une a constituyentes químicos que están presentes en el té, la zarzamora y el vino tinto incluyendo los componentes no pigmentados de las manchas, por ejemplo las pectinas.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la molécula de unión que tiene una alta afinidad de unión tiene una constante de equilibrio químico K_{d} para la sustancia menor que 10^{-4} M, preferiblemente menor que 10^{-6} M.

19. El método de la reivindicación 18, donde la constante de equilibrio químico K_{d} es menor que 10^{-7} M.

20. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho agente beneficioso se elige del grupo que consta de agentes de fragancia, perfumes, reforzadores del color, agentes suavizantes de tejidos, lubricantes poliméricos, agentes fotoprotectores, látex, resinas, agentes fijadores de tintes, materiales encapsulados, antioxidantes, insecticidas, agentes antimicrobianos, agentes repelentes de la suciedad, agentes eliminadores de la suciedad, y agentes reparadores de fibras de celulosa.

21. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho agente beneficioso está comprendido en una solución acuosa.