ES2251483T3

ES2251483T3 - Molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una quimiocina sdf-1 gamma, un precursor neuropeptidico o al menos un neuropeptido.

Info

Publication number: ES2251483T3
Application number: ES01936423T
Authority: ES
Inventors: Hans Werner Muller; Frank Bosse; Marc Gleichmann; Clemens Gillen; Johannes Auer
Original assignee: NEURAXO BIOTEC GmbH
Current assignee: NEURAXO BIOTEC GmbH
Priority date: 2000-06-02
Filing date: 2001-06-01
Publication date: 2006-05-01
Anticipated expiration: 2021-06-01
Also published as: US20030215792A1; JP2004521607A; DK1287142T3; WO2001092530A1; EP1287142A1; EP1287142B1; US20080319165A1; DE50108009D1; ATE309361T1; AU6233501A; DE10027383A1

Abstract

Molécula de ácido nucleico con una secuencia que comprende: (1) una secuencia de ácido nucleico que codifica una quimiocina, un precursor neuropeptídico o al menos un neuropéptido, seleccionada entre las siguientes secuencias: (a) una secuencia de ácido nucleico según la SEC. ID. Nº:1; (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos según la SEC. ID. Nº:2; (c) una secuencia de ácido nucleico que presenta una identidad de al menos 80% con la secuencia indicada en (a); (d) una secuencia que hibrida en condiciones restrictivas con la cadena opuesta de la secuencia indicada en (a); o (2) una secuencia complementaria a una de las secuencias de ácido nucleico indicadas en (a) a (d).

Description

Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una quimiocina SDF-1 \gamma, un precursor neuropeptídico o al menos un neuropéptido.

La invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una quimiocina, un precursor neuropeptídico o al menos un neuropéptido, así como a células huésped que contienen esta molécula de ácido nucleico. La invención se refiere asimismo a una molécula polipeptídica que actúa de quimiocina o de neuropéptido o que contiene al menos un neuropéptido, así como a fragmentos suyos que contienen al menos un neuropéptido, y a un procedimiento para la preparación de la molécula polipeptídica o a un fragmento suyo. La invención se refiere además a anticuerpos, procedimientos de detección y kits de ensayo así como a composiciones farmacéuticas.

El SDF-1\alpha (stromal cell derived factor 1\alpha, factor 1\alpha derivado de células conjuntivas) y su isoforma SDF-1\beta generada por ayuste alternativo se clonaron originalmente a partir de una línea celular de células conjuntivas de la médula ósea de ratón (Tashiro y col., 1993). En base a la homología observada de la secuencia de aminoácidos deducida con las secuencias de la interleucina 8 (32%) y de la proteína inflamatoria de macrófagos 1\alpha (32%) y a la presencia de cuatro restos cisteína característicos, los SDF-1\alpha y SDF-1\beta se clasificaron en el grupo de las quimiocinas CXC(\alpha). Las quimiocinas CXC(\alpha) constituyen un subgrupo de la familia de las citocinas intercrinas, que consta de diferentes citocinas inflamatorias lejanamente relacionadas. Las secuencias de ADNc para el SDF-1\alpha y SDF-1\beta de ratón y de humanos presentan una alta homología entre sí y se producen por ayuste alternativo a partir de un único gen.

La función biológica de SDF-1 se estudió con el SDF-1\alpha humano. El SDF-1\alpha es necesario para la maduración de las células B, presenta actividad T-linfotrópica e induce la muerte celular en la línea celular neuronal hNT. El SDF-1\alpha es un ligando natural del receptor de quimiocinas CXCR4(LESTR/fusina) de células T, que es un cofactor de unión de cepas de VIH-1 t-linfotrópicas. Los SDF-1\alpha y -1\beta muestran, tanto in vitro como in vivo, un patrón de expresión específico de "inhibición del crecimiento" en fibroblastos y hepatocitos. Los ratones en los que se inactivó el gen de SDF-1 muestran una formación reducida de células B, un defecto en el septo ventricular y defectos en la migración celular en el cerebelo, y mueren poco después de nacer. El SDF-1 podría desempeñar un papel importante en la regeneración de nervios.

La presente invención se propone el objetivo de proporcionar nuevos agentes que se usen selectivamente para el diagnóstico y/o tratamiento de enfermedades que están relacionadas con un defecto en el factor SDF-1 o en su receptor (CXCR4).

Este objetivo se alcanza de acuerdo con la invención mediante una molécula de ácido nucleico que comprende:

(1) una secuencia de ácido nucleico que codifica una quimiocina, un precursor neuropeptídico o al menos un neuropéptido, seleccionada entre las siguientes secuencias:

(a): una secuencia de ácido nucleico según la SEC. ID. Nº 1;

(b): una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos según la SEC. ID. Nº: 2;

(c): una secuencia de ácido nucleico que presenta una identidad de al menos 80% con la secuencia indicada en (a);

(d): una secuencia que hibrida en condiciones restrictivas con la cadena opuesta de la secuencia indicada en (a);

o

(2) una secuencia complementaria a una de las secuencias de ácido nucleico indicadas en (a) a (d).

El término "polipéptido" según se usa a continuación en la descripción comprende péptidos o proteínas compuestas por 7 o más aminoácidos.

El término "quimiocina" representa un miembro de una familia de proteínas relativamente pequeñas que se subdividen en cuatro subgrupos en función de la disposición característica de los grupos cisteína: C, CC, CXC y CX_{3}C. Las quimiocinas se unen a receptores específicos (Rollins, B.J., 1997). En relación con la presente invención, el término "quimiocina" se refiere en especial a los miembros de la familia de quimiocinas CXC. En el caso de la quimiocina se trata preferentemente de una molécula polipeptídica que en un experimento de formación de imágenes de Ca en las condiciones descritas en Köller y col. (2001) aumenta de 1,5 a 10 veces la concentración intracelular de calcio en astrocitos primarios y/o en neuronas del sistema nervioso central de rata o humano.

Con "neuropéptidos" se designan moléculas señalizadoras biológicamente activas y fisiológicamente importantes con funciones reguladoras y moduladoras en el sistema nervioso. Las áreas funcionales comprenden, entre otras, la neurotransmisión, la modulación de receptores, la modificación de las propiedades electrofisiológicas de membranas celulares y de procesos metabólicos. Los neuropéptidos son sintetizados por las neuronas y liberados normalmente en la sinapsis (Siegel y col., 1989).

Por "precursor neuropeptídico" se entiende una proteína precursora que por disociación proteolítica se convierte en un neuropéptido activo.

La secuencia de ácido nucleico contenida en la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede ser un ADN genómico, un ADNc o un ADN sintético, entendiéndose por secuencias de ADN sintéticas también aquellas que contienen enlaces internucleosídicos modificados.

En relación con las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención, la expresión "una identidad de al menos 80%" se refiere a la identidad a nivel de ADN, que se puede determinar según procedimientos conocidos, por ejemplo mediante comparaciones de secuencias asistidas por ordenador (Altschul y col., 1990).

El término "identidad", conocido para el experto, designa el grado de parentesco entre dos o más moléculas de ácido nucleico, que se determina por coincidencia de las secuencias. El porcentaje de "identidad" resulta del porcentaje de regiones idénticas en dos o más secuencias considerando los espacios u otras peculiaridades de las
secuencias.

La identidad entre moléculas de ácido nucleico relacionadas entre sí se puede determinar con la ayuda de procedimientos conocidos. En general se usan programas informáticos especiales con los algoritmos que tienen en cuenta los requerimientos especiales. Los programas informáticos para la determinación de la identidad entre dos secuencias comprenden el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux, J. y col., Nucleic Acids Research 12 (12): 387, 1984; Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison (WI)); BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul y col., 1990), pero no están limitados a ellos. El programa BLASTX se puede adquirir del National Centre for Biotechnology Information (NCBI) y de otras fuentes (BLAST Handbuch, Altschul S. y col., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul y col., 1990). También se puede usar el conocido algoritmo de Smith Waterman para la determinación de la identidad.

Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de ácido nucleico comprenden los siguientes:

Algoritmo:	Needleman y Wunsch (1970)
Matriz de comparación:	Coincidencia (matches) = +10
	No coincidencia (mismatch) = 0
Penalización de hueco (Gap Penalty):	50
Penalización para la longitud del hueco (Gap Length Penalty):	3

El programa GAP también es adecuado para el uso con los parámetros anteriores. Los parámetros anteriores son los parámetros por defecto (default parameters) para las comparaciones de secuencias de ácido nucleico.

Se pueden usar otros ejemplos de algoritmos, penalizaciones de la apertura del hueco (gap opening penalties), penalizaciones para la extensión del hueco (gap extension penalties), matrices de comparación, incluidos los mencionados en el manual del programa, paquete Wisconsin, versión 9, septiembre 1997. La elección dependerá de la comparación que se ha de realizar y también de si la comparación se realiza entre pares de secuencias, en cuyo caso se prefieren GAP o Best Fit, o entre una secuencia y un extenso banco de datos de secuencias, en cuyo caso se prefieren FASTA o BLAST. En el marco de esta solicitud, una coincidencia de 80% hallada con el algoritmo antes mencionado se denomina identidad de 80%. Lo mismo es válido para grados de identidad mayores.

La característica "secuencia que hibrida con la cadena opuesta de la secuencia indicada en (a)" señala una secuencia que hibrida con la cadena opuesta a la secuencia indicada en (a) en condiciones restrictivas. Las hibridaciones se pueden realizar, por ejemplo, a 42ºC con una solución de hibridación formada por SSPE 5x, Denhardt's 5x, 0,1% de SDS, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, 30 a 50% de formamida (Sambrook y col., 1989). Como paso de lavado son adecuados dos lavados sucesivos de 10 a 15 min en SSPE 2x, 0,1% de SDS a 42ºC, seguido de dos lavados sucesivos de 20 minutos en SSPE 0,2x, 0,1% de SDS a 50ºC. De forma alternativa, se puede usar SSC en lugar de SSPE en las soluciones de lavado.

Sorprendentemente se descubrió ahora que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención constituye un nuevo miembro de la familia SDF de quimiocinas, que en lo sucesivo se denominará SDF-1\gamma. En los ejemplos se describen la clonación y caracterización del ADNc de SDF-1\gamma, así como la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos deducida para el SDF-1\gamma humano y el SDF-1\gamma de rata.

La secuencia de ácido nucleico del SDF-1\gamma consta de la secuencia de ácido nucleico completa de SDF-1\beta y de una secuencia adicional de 2572 nucleótidos que sigue cadena abajo al codón 89 del SDF-1\beta en el mismo marco de lectura. Mediante este inserto se obtiene para el nuevo polipéptido SDF-1\gamma una secuencia de aminoácidos con 119 aminoácidos y un peso molecular teórico de 13,6 kDa, presentando la secuencia en el extremo carboxilo terminal 30 aminoácidos más que la secuencia conocida de SDF-1\alpha. Se supone que el SDF-1\gamma se genera por inserción de un nuevo exón IIIa alternativo entre los exones III y IV conocidos (véase Shirozu y col., 1995).

En la zona carboxilo terminal de la secuencia de aminoácidos de SDF-1\gamma, 5 grupos compuestos por dos aminoácidos básicos (Lys-Lys, Arg-Arg y Lys-Arg) pueden formar patrones de reconocimiento para una proteasa unida a la membrana del sistema de Golgi y de las vesículas de secreción. Por disociación proteolítica en estos puntos se generan cinco péptidos cortos (SEC. ID. Nº: 5, SEC. ID. Nº: 6, SEC. ID. Nº: 8, SEC. ID. Nº: 9, SEC. ID. Nº: 10) y una proteína truncada (SEC. ID. Nº: 7), de los cuales dos péptidos y un polipéptido (SEC. ID. Nº: 5, SEC. ID. Nº: 6 y SEC. ID. Nº: 7) presentan un resto glicina carboxilo terminal. Los péptidos con un resto glicina en el extremo carboxilo terminal son sustratos potenciales para la monooxigenasa \alpha-amidante de peptidil-glicinas (PAM), que cataliza la disociación carboxilo terminal de carboxilato creando así extremos carboxilo terminales \alpha-amidados (CONH_{2}) que son característicos de neuropéptidos (véase la revisión de Eipper y col., 1992).

El transcrito de SDF-1\beta de rata (véase la SEC. ID. Nº: 16) codifica una proteína con 93 aminoácidos (véase la SEC. ID. Nº: 17) y un peso molecular teórico de 10,5 kDa, en la que los 19 primeros aminoácidos constituyen una secuencia señal para proteínas secretadas. Los 17 primeros aminoácidos de la proteína madura, que aparecen en todas las isoformas, son necesarios para la unión al receptor CXCR4 (véanse Loetscher y col., 1998); Doranz y col., 1999). Dos aminoácidos básicos (Lys 89 y Arg 90) en la región carboxilo terminal proporcionan un patrón de reconocimiento para la disociación proteolítica, de la cual resultan un pentapéptido (Lys 89-Met 93, SEC. ID. Nº: 18) y una proteína truncada.

En una realización de la invención, la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención comprende una secuencia de ácido nucleico que presenta una identidad de al menos 80%, preferentemente de al menos 90%, muy preferentemente de al menos 95%, con la secuencia de ácido nucleico según la SEC. ID. Nº: 1.

Se prefieren especialmente las moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácido nucleico según la SEC. ID. Nº: 3 o una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos según la SEC. ID. Nº: 4.

La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede comprender también un promotor adecuado para la expresión, encontrándose la secuencia de ácido nucleico codificante bajo el control del promotor. Como se usa en la presente memoria, un "promotor adecuado para la expresión" designa un fragmento de ADN por medio del cual se establece en el organismo huésped el punto de iniciación y la frecuencia de iniciación de la transcripción (síntesis de ARN) de una secuencia de ácido nucleico que se encuentra bajo el control del elemento promotor y que codifica una quimiocina, un precursor neuropeptídico o al menos un neuropéptido. La elección del promotor depende del sistema de expresión usado para la expresión. En general se prefieren los promotores constitutivos, aunque también es posible usar promotores inducibles como, por ejemplo, el promotor de metalotioneína. Los promotores considerados para la realización de la invención incluyen, entre otros, los promotores FMD, MOX, TPS1, PMA y DAS de Hansenula polymorpha, los promotores AOX1 y GAP1 de Pichia pastoris, los promotores ADH1, PDC1, GAP1 y CUP1 de S. cerevisiae, los promotores AXDH y AHSB4 de Arxula adeninivorans y los promotores NDK1 y CPC2 de Sordaria macrospora.

La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede comprender además secuencias de un vector que permiten la replicación de la molécula de ácido nucleico en una célula huésped y/o la integración de la molécula de ácido nucleico en el genoma de una célula huésped. En el estado de la técnica se conocen numerosos vectores de clonación y de expresión, véase Recombinant Gene Expression Protocols, Meth. Mol. Biol. vol. 62, Humana Press, New Jersey, EE.UU. Para la replicación en una célula huésped, el vector usado debe contener un origen de replicación y, dado el caso, otras regiones reguladoras. El vector se puede seleccionar entre bacteriófagos, tales como derivados del \lambda, adenovirus, vacciniavirus, baculovirus, virus SV40, retrovirus; plásmidos, tales como plásmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens, vectores YAC y vectores BAC.

El objeto de la presente invención es asimismo una célula huésped que contiene al menos una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, siendo la célula huésped una célula procariótica o eucariótica adecuada para la expresión de la molécula de ácido nucleico y, dado el caso, para el procesamiento de la molécula polipeptídica generada. En el estado de la técnica se conocen numerosos sistemas de expresión procarióticos y eucarióticos. Las células huésped se pueden seleccionar, por ejemplo, entre células procarióticas, tales como E. coli o B. subtilis, o entre células eucarióticas, tales como células fúngicas, células vegetales, células de insectos y células de mamíferos, por ejemplo células CHO, células COS o células HeLa, así como entre derivados de ellas. En el estado de la técnica se conocen, por ejemplo, determinadas líneas CHO de producción cuyos patrones de glicosilación están modificados respecto a los de las células CHO. La célula huésped eucariótica es preferentemente la levadura Saccharomyces cerevisiae, la levadura metilotrófica Hansenula polymorpha, la levadura dimorfa Arxula adeninivorans o el hongo filamentoso Sordaria macrospora.

La invención proporciona asimismo una molécula polipeptídica que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las siguientes secuencias:

\newpage

(i) Una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos según la SEC. ID. Nº: 5 y/o una combinación de dos o más de las secuencias de aminoácidos SEC. ID. Nº: 5, SEC. ID. Nº: 6, SEC. ID. Nº: 8, SEC. ID. Nº: 9 y SEC. ID. Nº: 10;

(ii) una secuencia de aminoácidos según la SEC. ID. Nº: 4;

(iii) una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia comprendida entre el aminoácido 20 y el aminoácido 119 de la SEC. ID. Nº: 4;

(iv) una secuencia de aminoácidos según la SEC. ID. Nº: 22;

(v) una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos 85% con la secuencia indicada en (i), (ii) o (iv);

(vi) una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia según la SEC. ID. Nº: 6 o una secuencia que presenta una identidad de al menos 85% con ésta, excepto la siguiente secuencia de aminoácidos:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

(vii) una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia según la SEC. ID. Nº: 7, una combinación de la SEC. ID. Nº: 7 y una o varias de las secuencias de aminoácidos SEC. ID. Nº: 5, SEC. ID. Nº: 6, SEC. ID. Nº: 8, SEC. ID. Nº: 9 y SEC. ID. Nº: 10 o una secuencia que presenta una identidad de al menos 95% con una combinación de esta secuencia y una o varias de las secuencias antes mencionadas;

(viii) una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia según la SEC. ID. Nº: 8 o una secuencia que presenta una identidad de al menos 85% con ésta, excepto la secuencia de aminoácidos:

4

5

\newpage

y la secuencia de aminoácidos:

6

7

y la secuencia de aminoácidos:

TRKKKRQRRKGSG;

(ix) una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia según la SEC. ID. Nº: 9 o una secuencia que presenta una identidad de al menos 90% con ésta;

(x) una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia según la SEC. ID. Nº: 10, excepto la siguiente secuencia de aminoácidos:

8

9

10

11

12

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

siendo la molécula polipeptídica una quimiocina o un neuropéptido.

En este contexto, la expresión "una identidad de al menos 85%" se refiere a la coincidencia a nivel de la secuencia de aminoácidos, que se puede determinar mediante procedimientos conocidos, por ejemplo mediante las comparaciones de secuencias asistidas por ordenador (Altschul y col., 1990).

El término "identidad" designa en este caso el grado de parentesco entre dos o más moléculas polipeptídicas, que se determina por coincidencia entre las secuencias, entendiéndose por coincidencia tanto una coincidencia idéntica como una sustitución conservadora de aminoácidos. El porcentaje de "identidad" resulta del porcentaje de regiones coincidentes en dos o más secuencias considerando los espacios u otras peculiaridades de las secuencias.

La expresión "sustitución conservadora de aminoácidos" se refiere a una sustitución de un resto de aminoácido por otro resto de aminoácido, debiendo ejercer la sustitución una influencia mínima en la estructura (espacial) de la molécula polipeptídica. En principio se distinguen cuatro grupos físico-químicos en los que se dividen los aminoácidos presentes en la naturaleza. El grupo de los aminoácidos básicos incluye arginina, lisina e histidina. El grupo de los aminoácidos ácidos incluye ácido glutámico y ácido aspártico. Los aminoácidos no cargados/polares comprenden glutamina, asparagina, serina, treonina y tirosina. Los aminoácidos no polares comprenden fenilalanina, triptófano, cisteína, glicina, alanina, valina, metionina, isoleucina, leucina y prolina. Una sustitución conservadora de aminoácidos significa en este contexto la sustitución de un aminoácido dado por un aminoácido que pertenece al mismo grupo físico-químico.

La identidad entre moléculas polipeptídicas relacionadas entre sí se puede determinar con la ayuda de procedimientos conocidos. Los procedimientos preferidos para la determinación de la identidad crean en primer lugar la mayor coincidencia entre las secuencias estudiadas. Los programas informáticos para la determinación de la identidad entre dos secuencias de aminoácidos comprenden el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux y col., 1984; Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison (WI)); BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul y col., 1990), pero no están limitados a ellos. El programa BLASTX se puede adquirir del National Centre for Biotechnology Information (NCBI) y de otras fuentes (BLAST Handbuch, Altschul S. y col., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul y col., 1990). También se puede usar el conocido algoritmo de Smith Waterman para la determinación de la identidad entre secuencias.

Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias comprenden los siguientes:

Algoritmo:	Needleman y Wunsch (1970)
Matriz de comparación:	BLOSUM 62 de Henikoff y Henikoff (1992)
Penalización de hueco (Gap Penalty):	12
Penalización para la longitud del hueco (Gap Length Penalty):	4
Valor umbral de la similitud:	0

El programa GAP también es adecuado para el uso con los parámetros anteriores. Los parámetros anteriores son los parámetros por defecto (default parameters) para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, en los que los huecos en los extremos no reducen el valor de identidad. Cuando las secuencias son muy cortas en comparación con la secuencia de referencia, puede ser necesario aumentar el valor esperado (expected value) a hasta 100.000 y reducir dado el caso el tamaño de palabra (word size) a hasta 2.

Se pueden usar otros ejemplos de algoritmos, penalizaciones de la apertura del hueco (gap opening penalties), penalizaciones para la extensión del hueco (gap extension penalties), matrices de comparación, incluidos los mencionados en el manual del programa, paquete Wisconsin, versión 9, septiembre 1997. La elección dependerá de la comparación que se ha de realizar y también de si la comparación se realiza entre pares de secuencias, en cuyo caso se prefieren GAP o Best Fit, o entre una secuencia y un extenso banco de datos de secuencias, en cuyo caso se prefieren FASTA o BLAST.

En el marco de esta solicitud, una coincidencia de 85% hallada con el algoritmo antes mencionado se denomina identidad de 85%. Lo mismo es válido para grados de identidad mayores.

En una forma de realización de la invención, la molécula polipeptídica de acuerdo con la invención comprende una secuencia que presenta una identidad de al menos 90%, preferentemente de al menos 95%, con la secuencia de aminoácidos indicada anteriormente en (i), (ii), (iii) o (iv). Se prefieren especialmente las moléculas polipeptídicas que comprenden una secuencia de aminoácidos según la SEC. ID. Nº: 12 o SEC. ID. Nº: 13.

En una forma de realización de la invención, la molécula polipeptídica de acuerdo con la invención comprende las secuencias de aminoácidos según SEC. ID. Nº: 5, SEC. ID. Nº: 6 y/o SEC. ID. Nº: 7. Se prefieren las moléculas polipeptídicas de acuerdo con la invención que comprenden las secuencias de aminoácidos según SEC. ID. Nº: 5 y SEC. ID. Nº: 6.

En otra forma de realización, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende al menos un polipéptido de acuerdo con la invención.

La invención comprende igualmente fragmentos de las moléculas polipeptídicas de acuerdo con la invención que comprenden al menos un neuropéptido. Se prefieren los fragmentos que comprenden al menos una de las secuencias de aminoácidos según SEC. ID. Nº: 5, SEC. ID. Nº: 6, SEC. ID. Nº: 7, SEC. ID. Nº: 8, SEC. ID. Nº: 9 y/o SEC. ID. Nº: 10. Se prefieren especialmente los fragmentos con la secuencia de aminoácidos según SEC. ID. Nº: 5, SEC. ID. Nº: 6 o SEC. ID. Nº: 7. Los fragmentos de las moléculas polipeptídicas de acuerdo con la invención también pueden estar modificados, por ejemplo por glicosilación, fosforilación, acetilación o amidación.

En el caso de la molécula polipeptídica, la proteína de fusión o el fragmento de acuerdo con la invención se trata preferentemente de una molécula polipeptídica que en un experimento de formación de imágenes de Ca en las condiciones descritas en Köller y col. (2001) aumenta de 1,5 a 10 veces la concentración intracelular de calcio en astrocitos primarios y/o en neuronas del sistema nervioso central de rata o humano.

El objeto de la invención es asimismo un procedimiento para la preparación de una molécula polipeptídica de acuerdo con la invención y/o de un fragmento suyo, que comprende el cultivo de una célula huésped de acuerdo con la invención en condiciones adecuadas para la expresión y el eventual procesamiento y, dado el caso, la purificación de la molécula polipeptídica o del fragmento expresados. De forma alternativa, las moléculas polipeptídicas de acuerdo con la invención y sus fragmentos también se pueden obtener por síntesis química y enzimática, como, por ejemplo, la síntesis de Merrifield, y/o por condensación de fragmentos. Igualmente se consideran combinaciones de procedimientos de preparación químicos, enzimáticos y recombinantes.

Otro objeto de la invención es un anticuerpo que es específico de la molécula polipeptídica de acuerdo con la invención y/o de un fragmento suyo. En general, los anticuerpos específicos se pueden obtener por inmunización de animales de experimentación, como, por ejemplo, ratones o conejos, con las moléculas polipeptídicas y/o los fragmentos de acuerdo con la invención que, preferentemente, están acopladas a moléculas transportadoras adecuadas de alto peso molecular (con frecuencia proteínas). La inmunización se puede facilitar mediante la adición de adyuvantes adecuados conocidos en el estado de la técnica. Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener habitualmente fusionando células de bazo extraídas de un ratón inmunizado con células tumorales y seleccionado los hibridomas generados. Los hibridomas que secretan eficazmente anticuerpos específicos se pueden detectar cribando el sobrenadante. De forma alternativa, los anticuerpos se pueden preparar por recombinación; en la preparación de anticuerpos recombinantes se aísla el ARNm de células de hibridoma o de linfocitos B, que sirve de base para la síntesis del ADNc correspondiente y se amplifica por PCR. Después de la ligación en un vector adecuado y la introducción en un cultivo adecuado de células huésped se puede obtener el anticuerpo a partir de los sobrenadantes de las células o de los lisados celulares. Los anticuerpos recombinantes permiten la "humanización" del anticuerpo y es, por lo tanto, menos inmunogénico. Los procedimientos a este respecto son conocidos en el estado de la
técnica.

Para la detección de una molécula polipeptídica de acuerdo con la invención y/o de un fragmento suyo en una muestra biológica, la invención proporciona un procedimiento in vitro que comprende poner la muestra en contacto con un reactivo específico de la molécula polipeptídica y/o de un fragmento suyo y detectar la unión.

La invención proporciona asimismo un kit de ensayo para la detección de un polipéptido y/o de un fragmento suyo, que comprende al menos un reactivo específico del polipéptido y/o del fragmento de acuerdo con la invención. Un ejemplo de tales reactivos específicos son los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, por ejemplo los fragmentos Fab o F(ab)_{2}, o derivados de anticuerpos, prefiriéndose especialmente los anticuerpos. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, por ejemplo los fragmentos Fab o F(ab)_{2} o los derivados de anticuerpos pueden ser de origen monoclonal o policlonal.

La invención también proporciona un procedimiento in vitro para la detección de un ácido nucleico que codifica una molécula polipeptídica de acuerdo con la invención en una muestra biológica, que comprende:

- Poner la muestra en contacto con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o con un fragmento suyo, llevando la molécula de ácido nucleico y/o el fragmento una marca detectable, y

- detectar la marca.

El objeto de la invención son asimismo composiciones farmacéuticas que contienen al menos una molécula polipeptídica de acuerdo con la invención y/o un fragmento suyo y/o una sal farmacéuticamente aceptable de una molécula polipeptídica o de un fragmento de este tipo. Estas composiciones farmacéuticas pueden contener un vehículo y/o diluyente farmacológicamente aceptable. En el estado de la técnica se conocen vehículos y/o diluyentes adecuados. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración por vía intravenosa, subcutánea o intramuscular. En una forma de realización de las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención, la composición también contiene al menos un anticuerpo, además de una o varias moléculas polipeptídicas de acuerdo con la invención o fragmentos de las mismas.

Estas composiciones farmacéuticas se pueden usar de acuerdo con la invención para el tratamiento de enfermedades desmielinizantes o neurodegenerativas o de trastornos del desarrollo del sistema nervioso. Una aplicación adicional de las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se centra en la prevención o el tratamiento de una infección por VIH y, en especial, de una encefalopatía causada por el VIH en seres humanos. La invención también comprende el uso de las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención para el tratamiento de enfermedades del sistema hematopoyético, del sistema inmune y del sistema cardiocirculatorio.

La invención comprende asimismo composiciones farmacéuticas que contienen al menos una sonda de ácido nucleico y/o un anticuerpo específico de una molécula polipeptídica de acuerdo con la invención y/o de un fragmento suyo. Estas composiciones farmacéuticas se pueden usar para el diagnóstico o tratamiento de enfermedades desmielinizantes o neurodegenerativas o de trastornos del desarrollo del sistema nervioso. Otro uso más consiste en el diagnóstico o tratamiento de una infección por VIH y, en especial, de una encefalopatía causada por el VIH.

Las siguientes figuras y ejemplos ilustran la invención:

La Figura 1 muestra la estrategia basada en la RT-PCR para la clonación del ADNc de SDF-1\beta y SDF-1\gamma de rata. Las regiones 5' y 3' UTR se representan mediante líneas y las regiones codificantes, mediante rectángulos. Las flechas pequeñas muestran la posición y la orientación de los cebadores. Las secuencias idénticas u homólogas se representan mediante elementos gráficos idénticos. Los cuatro últimos codones de la región codificante de SDF-1\beta se representan en forma de rectángulos negros. Las líneas discontinuas marcan un inserto de 2572 nucleótidos en SDF-1\gamma. Los 30 codones carboxiterminales de SDF-1\gamma se representan en forma de rectángulos rayados.

La Figura 2 muestra el resultado de un ensayo de transferencia Northern para la detección de transcritos de SDF-1\beta y SDF-1\gamma en el nervio ciático de ratas adultas. Los filtros se hibridaron (A) con un fragmento de PCR marcado radiactivo de 626 nucleótidos procedente del ADNc de NT-I-15, que corresponde a los nucleótidos 743-1368 de SDF-1\beta y forma parte de la secuencia 3' UTR común a SDF-1\beta y SDF-1\gamma, (B) con un fragmento de PCR de 190 nucleótidos de la región codificante común a todas las isoformas de SDF-1, que corresponde a los nucleótidos 49-239 de la SEC. ID. Nº: 16, (C) con un fragmento de 1702 nucleótidos que corresponde a los nucleótidos 625-2327 del ADNc de SDF-1\gamma y se generó a partir del inserto específico de SDF-1\gamma por digestión del producto de PCR obtenido con los cebadores GAS2 y MMSE2 con PvuII.

La Figura 3 muestra las secuencias de ácido nucleico del ADNc de SDF-1\beta y SDF-1\gamma de rata, así como las secuencias de aminoácidos deducidas. El inserto específico de SDF-1\gamma se resalta mediante un marco. La secuencia de ácido nucleico del péptido señal común está subrayada. La numeración de los nucleótidos (izquierda) y de los aminoácidos (derecha) corresponde a la secuencia de SDF-1\gamma. (93) indica el último aminoácido de SDF-1\beta.

La Figura 4 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas SDF-1 de ratón y rata. Los puntos representa aminoácidos idénticos. El péptido señal, de 19 aminoácidos, está enmarcado.

La Figura 5 muestra el resultado de diferentes ensayos de transferencia Northern para la detección de transcritos de SDF-1\beta y SDF-1\gamma en diferentes tejidos (A) y estadios de desarrollo (B). (A) Los filtros de transferencia Northern con ARN total procedente de nervio ciático (SN), cerebro (Br), pulmón (Lu), corazón (HE), músculo (Mu), testículos (Te), hígado (Li), riñón (Ki), bazo (Sp) y timo (Th) de ratas se hibridaron con una sonda de ADNc marcada radiactivamente, procedente de la región 3' UTR común a SDF-1\beta y SDF-1\gamma. (B) Detección de ARNm de SDF-1\beta y SDF-1\gamma en el cerebro de ratas durante el desarrollo. Los filtros de transferencia Northern con ARN total procedente del cerebro de embriones de rata de 17 días de edad (E 17), así como de ratas de 1, 4, 7, 13 y 20 días postnatales (P1-20) y de animales adultos (Ad), se hibridaron igual que en (A). (C) Detección de ARNm de SDF-1\beta y SDF-1\gamma en el nervio ciático de ratas a lo largo del desarrollo. Los filtros de transferencia Northern con ARN total obtenido a partir de nervios de ratas de 1, 4, 7, 14 y 21 días de edad (P1-21) y de ratas adultas (Ad) se hibridaron con una sonda de SDF-1\beta/\gamma igual que en (A). La punta de flecha en la parte superior muestra la posición del ARN ribosomal 28S; las partes inferiores muestran filtros de transferencia Northern teñidos con azul de metileno.

La Figura 6 muestra el resultado de ensayos de hibridación in situ para la localización celular del ARNm de SDF-1\gamma en el cerebro de ratas adultas. Los cortes se incubaron con un transcrito antisentido de 596 nucleótidos marcado con digoxigenina-UTP, que deriva de un subclon de la secuencia 5' UTR y codificante (A, D, E) común a todas las isoformas de ARNm de SDF-1 o de un subclon del inserto específico de SDF-1\gamma (B, E, H). Como control negativo sirvió la hibridación con transcritos sentido (C, F, I). (A, B, C) Cuerpo calloso con una alineación a modo de "cadena de perlas" de oligodendrocitos marcados y neuronas intensamente marcadas en las capas bilaterales de la circunvolución supracallosa dorsal del cuerpo calloso. (D, E, F) Se observan señales de hibridación intensas en las células de Purkinje y granulares del cerebelo, y señales débiles en la capa externa. (G, H, I) Se detectan señales de hibridación muy intensas en las neuronas piramidales y granulares del hipocampo. Raya: 10 \mum.

La Figura 7 muestra el resultado de ensayos de hibridación in situ para la localización celular del ARNm de SDF-1\gamma en la neocorteza de ratas usando las mismas sondas que en la Figura 6. En los cortes de las regiones frontolaterales (A) y mediolaterales (B) de la neocorteza están marcadas intensamente las neuronas en todas las capas de la neocorteza (I-VI), tanto con la sonda antisentido común a todas las isoformas de ARNm de SDF-1 (A) como con la sonda específica de SDF-1\gamma (B).

La Figura 8 muestra el resultado de ensayos de hibridación in situ para la localización celular de ARNm de SDF-1\gamma en el nervio ciático de ratas adultas. Los cortes se hibridaron con sondas de ARN marcadas con digoxigenina-UTP en orientación sentido y antisentido, que se derivaron (a) de al región 3' UTR común a SDF-1\beta y SDF-1\gamma (A-C, E, F), (b) de las regiones 5' UTR y codificantes comunes a todas las isoformas de SDF-1 (G) y del inserto específico de SDF-1\gamma. (A, B, C) El corte longitudinal muestra varias células de Schwann fusiformes próximas a los axones. (D) Corte transversal inmunoteñido con un anticuerpo contra la proteína S100 (un marcador de las células de Schwann). (E) Las señales de hibridación en un corte transversal adyacente al corte transversal de (D) muestran células de Schwann semicirculares marcadas que rodean los axones y que aparecen en los mismos puntos que las células inmunopositivas S100 (puntas de flecha en D, E). (G, H) Cortes transversales adyacentes marcados con uno de los dos transcritos antisentido, que muestran numerosas células de Schwann semicirculares (véanse las puntas de flecha) y la pared de un vaso sanguíneo en la parte superior derecha. (C, F, I) Como control negativo sirvió la hibridación con transcritos en orientación sentido. Rayas en A, C, G-I: 100 \mum, en D-F: 10 \mum.

La Figura 9 muestra la región codificante de la secuencia de ácido nucleico de SDF-1\gamma de rata y la secuencia de aminoácidos derivada de esta.

La Figura 10 muestra la región codificante de la secuencia de ácido nucleico de SDF-1\gamma humano y la secuencia de aminoácidos derivada de esta.

La Figura 11 muestra una comparación de las regiones codificantes de la secuencia de ácido nucleico de SDF-1\gamma humano y de rata. "hum": secuencia humana; "rat": rata.

La Figura 12 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias de ácido nucleico de la Figura 11 de SDF-1\gamma humano y de rata. "hum": secuencia humana; "rat": rata.

La Figura 13 muestra esquemáticamente los constructos hSDF-1\gamma y hSDF-1\gamma-H6 incorporados en el plásmido PCRII-TOPO (Invitrogen, Groningen, NL), así como los constructos M-mhSDF-1\gamma-H6, hSDF-1\gamma-H6 y MF\alpha-mhSDF-1\gamma-H6 en el plásmido pFPMT121.

La Figura 14 muestra el mapa de restricción del fragmento de ADN de 439 pb con la región codificante del gen de hSDF-1\gamma.

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La Figura 15 muestra el mapa de restricción del fragmento de ADN de 457 pb con la región codificante del gen de hSDF-1\gamma y el His-tag.

La Figura 16 muestra el mapa de restricción del plásmido de expresión pFPMT-M-mhSDF-1\gamma-H6.

La Figura 17 muestra el mapa de restricción del plásmido de expresión pFPMT-hSDF-1\gamma-H6.

La Figura 18 muestra esquemáticamente la estrategia para la generación del plásmido de expresión pFPMT-MF\alpha-mhSDF-1\gamma-H6.

La Figura 19 muestra el mapa de restricción del plásmido de expresión pFPMT-MF\alpha-mhSDF-1\gamma-H6.

La Figura 20 muestra el resultado de un ensayo de transferencia Western para la detección de los productos de expresión en extractos celulares de H. polymorpha (A) con el anticuerpo SDF-(C19) específico de SDF-1 (Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.) y (B) con un anticuerpo específico de His-tag (anticuerpo RGS-His, IgG1 de ratón, Qiagen, Hilden, RFA). Los carriles en (A) contienen: (1) Referencia teñida previamente con azul marino, (2) M-mhSDF-1\gamma-H6, (3) M-mhSDF-1\gamma-H6 tratado con PNGasa F, (4) hSDF-1\gamma-H6, (5) hSDF-1\gamma-H6 tratado con PNGasa F, (6) MF\alpha-mhSDF-1\gamma-H6, (7) MF\alpha-mhSDF-1\gamma-H6 tratado con PNGasa F y (8) extracto sin SDF-1\gamma. Los carriles en (B) contienen: (1) Extracto celular sin SDF-1\gamma, (2) referencia teñida previamente con azul marino (3) M-mhSDF-1\gamma-H6, (4) M-mhSDF-1\gamma-H6 tratado con PNGasa F, (5) hSDF-1\gamma-H6, (6) hSDF-1\gamma-H6 tratado con PNGasa F, (7) MF\alpha-mhSDF-1\gamma-H6 y (8) MF\alpha-mhSDF-1\gamma-H6 tratado con PNGasa F.

La Figura 21 muestra una comparación del efecto que ejercen SDF-1\alpha y SDF-1\gamma en la concentración de Ca en astrocitos. (A) SDF-1\alpha 50 nM; (B) 35 \mug de extracto celular de levadura con SDF-1\gamma recombinante (M-mhSDF-1\gamma-H6); (C) 22,4 \mug de extracto control; (D) valoración cuantitativa del incremento de calcio intracelular en el caso de SDF-1\gamma y el extracto control respecto al incremento de calcio provocado por SDF-1\alpha.

La Figura 22 muestra el resultado de un experimento de formación de imágenes de Ca en astrocitos para SDF-1\alpha sin (A) y con (B) incubación previa con anticuerpos contra CXCR4.

La Figura 23 muestra el resultado de un experimento de formación de imágenes de Ca en astrocitos para SDF-1\gamma sin (A) y con (B) incubación previa con anticuerpos contra CXCR4.

La Figura 24 muestra el resultado de un experimento de formación de imágenes de Ca en neuronas corticales para SDF-1\gamma sin (A) y con (B) incubación previa con anticuerpos contra CXCR4.

La Figura 25 muestra el resultado de un experimento de formación de imágenes de Ca en astrocitos para el péptido básico C-terminal de SDF-1\gamma (30 aminoácidos) sin (A) y con (B) incubación previa con anticuerpos contra CXCR4.

La Figura 26 muestra el resultado de un experimento de formación de imágenes de Ca en astrocitos para: (A) el péptido 2 (KKEKIG; SEC. ID. Nº: 6) y (B) el péptido 3 (KKKRQ; SEC. ID. Nº: 8).

Ejemplos Ejemplo 1 Clonación y análisis de la secuencia de SDF-1\gamma A. Materiales y procedimientos Ensayos con animales

Se anestesiaron ratas Wistar adultas (peso corporal 200 a 250 g) mediante la administración de hidrato de cloral (350 ml/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal. El nervio ciático se presionó brevemente con pinzas en la zona superior del fémur (Müller y col., 1986). Antes de obtener el ARN de las vías nerviosas, se retiró y eliminó el tejido de una zona de 2 a 3 mm alrededor de la herida. Todos los ensayos con animales se realizaron conforme a las directrices establecidas en la ley alemana sobre la protección de animales.

Aislamiento del ARN

El ARN total se aisló de tejido de rata mediante el procedimiento de fenol/tiocianato de guanidinio (Chomczynski y Sacchi, 1987). Las muestras de tejido congeladas se homogeneizaron dos veces durante 45 segundos a 2.500 rpm con un Polytron (Brinkmann, Wesstbury, NY). El poli(A)^{+}-ARN se aisló mediante cromatografía en oligo(dT)-celulosa (Sambrook y col., 1998).

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Preparación de un banco de genes de ADNc

Para la preparación de un banco de genes de ADNc se usaron como molde 4,5 \mug de poli(A)^{+}-ARN aislado del nervio ciático de ratas adultas y como cebador, oligo(dT)_{12-18}. El ADNc se generó con el kit de síntesis de ADNc TimeSaver (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ). El ADNc se unió por ligación usando el extracto de empaquetamiento Gigapack-II (Stratagene) con partículas del fago \lambda-ZAP II cortadas previamente con EcoRI. La titulación del banco de genes de ADNc obtenido dio como resultado una complejidad de aproximadamente 0,5 x 10^{6}. El cribado del banco de genes de ADNc se realizó mediante procedimientos convencionales (Sambrook y col., 1989) con un fragmento de ADNc marcado radiactivamente de la región 3' no traducida de rSDF-1\beta (nucleótidos 743-1368).

Oligonucleótidos

Se sintetizaron los siguientes nucleótidos con un GeneAssembler Plus-Synthesator (Pharmacia, Piscataway, NJ).

MMSE2: 5'-ACGCCATGGACGCCAAGGTCG-3' (SEC. ID. Nº: 19) corresponde a los nucleótidos 49-69 del ADNc de rSDF-1\beta.

GAS2: 5'-ACTGTAAGGAAGACCCTCTCTCACC-3' (SEC. ID. Nº: 20) corresponde a los nucleótidos 2327-2303 de SDF-1\gamma.

GAS3: 5'-GTTGAGACTATGCATCGACTCCAAC-3' (SEC. ID.Nº: 21) corresponde a los nucleótidos 2576-2552 de SDF-1\gamma.

Secuenciación y análisis de ADN

Se secuenciaron ambas cadenas de ADNc de SDF-1\beta y del inserto de 2,5 kb en SDF-1\gamma, incluidas las regiones flanqueantes, con el método de secuenciación del didesoxi-ADN (Sanger y col., 1977) con la ayuda del kit de secuenciación T7 (Pharmacia-LKB). Las secuencias se confirmaron por secuenciación de varios clones independientes procedentes de las reacciones de RT-PCR. Los datos se compararon con el banco de datos del EMBL con la ayuda de los programas FASTA (Pearson, 1990) y BLAST (Altschul y col., 1990). Con la ayuda del paquete de software PCGENE (Intelligenetics, Mountain View, CA) se realizó un análisis más detallado de las secuencias.

RT-PCR

La transcripción inversa se realizó con 1 a 5 \mug de ARN total y la transcriptasa inversa Superscript (Gibco, Gaithersburg) según las instrucciones del fabricante. La primera cadena de ADNc se digirió con RNasa H (Boehringer Mannheim) y a continuación se usó 1/10 del volumen como molde para la amplificación por PCR con la polimerasa Amplitaq (Perkin Elmer) o la polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla) (para SDF-1\gamma).

B. Clonación y secuenciación de SDF-1\gamma

Para la identificación de genes que se expresan de forma diferencial tras una lesión nerviosa se aisló de un banco de genes de ADNc generado a partir del nervio ciático de ratas el clon de ADNc NT-I-15 con 2174 nucleótidos. El análisis de la secuencia del clon NT-I-15 mostró que este clon presenta una homología de 86% con la región 3' no traducida (UTR) del ADNc de SDF-1\beta de ratón (véase Tashiro y col., 1993). En los ensayos de transferencia Northern en condiciones de lavado restrictivas, el NT-I-15 hibridó con dos transcritos procedentes del nervio ciático de ratas adultas (Figura 2). Mientras que el transcrito más pequeño, de aproximadamente 3 kb, correspondía al tamaño del ARNm de SDF-1\beta, el transcrito más largo, de 5,5 kb, era desconocido. Este transcrito se denominó SDF-1\gamma.

El aislamiento de clones completos para ambos transcritos se abordó tanto por cribado de un banco de genes de ADNc como por la PCR de transcripción inversa (RT-PCR). Mediante el cribado de un banco de genes de ADNc procedente del nervio ciático de ratas con un fragmento de ADNc de 626 nucleótidos del clon NT-I-15, que corresponde a los nucleótidos 734-1368 de la región 3' UTR de SDF-1\beta de rata, se obtuvo un clon de ADNc completo de una longitud de 2819 nucleótidos que contenía la región codificante completa de SDF-1\beta.

Mediante un nuevo cribado del banco de genes de ADNc con el fragmento de ADNc de 626 nucleótidos del NT-I-15 se obtuvo un clon de SDF-1\gamma incompleto de aproximadamente 3400 nucleótidos (SDF-I-G6), que no sólo contenía la región 3' UTR completa y los 4 últimos codones (90-93) de SDF-1\beta sino también una secuencia nueva (no codificante) de una longitud de aproximadamente 1 kb cadena arriba del codón 90. Se supuso que el transcrito de una longitud de 5,5 kb identificado en la transferencia Northern representaba una isoforma de ayuste alternativo que se crea mediante un inserto de 2,5 kb entre los codones 89 y 90 de SDF-1\beta. Para confirmar esta hipótesis se creó un fragmento nuevo mediante RT-PCR con cebadores antisentido específicos de la secuencia nueva en el extremo 5' del clon SDF-G6 (cebadores GAS2 y GAS3) y un cebador sentido correspondiente al sitio de iniciación de la traducción de SDF-1\beta (cebador MNSE2). La secuenciación del fragmento de PCR amplificado mostró un transcrito que, a partir del codón 89, presentaba cadena abajo una secuencia distinta a la de SDF-1\beta. Este transcrito codificaba un péptido de 119 aminoácidos, de los cuales los 89 primeros aminoácidos eran idénticos a los 89 primeros aminoácidos de SDF-1\alpha y -\beta. Los análisis siguientes de transferencia Northern confirmaron que la secuencia obtenida representaba el transcrito de 5,5 kb. Las sondas de ADNc de la región 3' UTR común a SDF-1\beta y -\gamma (Fig. 2A) o de la región 5' de la región codificante común a todas las isoformas de SDF (Fig. 2B) hibridaban tanto con el transcrito de 3 kb (SDF-1\beta) como con el de 5,5 kb (SDF-1\gamma), mientras que una sonda de ADNc específica del inserto de 2,5 kb sólo hibridaba con el transcrito de 5,5 kb de SDF-1\gamma (Fig. 2C). En el nervio ciático de rata no se pudo detectar ningún ARNm de SDF-1\alpha con una longitud de 1,5 kb.

Se secuenciaron ambas cadenas de ADNc del SDF-1\beta de rata. En el caso de SDF-1\gamma, se secuenciaron igualmente por duplicado el nuevo inserto, de una longitud de 2572 nucleótidos, y las regiones flanqueantes con las secuencias de SDF-1\beta conocidas. La secuencia de aminoácidos deducida para SDF-1\beta constituye un péptido de 93 aminoácidos con un peso molecular teórico de 10,5 kDa. Los 19 primeros aminoácidos representan un péptido señal para proteínas secretadas. La secuencia de aminoácidos deducida para SDF-1\beta incluye los 89 primeros restos de aminoácido de SDF-1\beta y 30 aminoácidos adicionales en la región carboxilo terminal que no muestran homología con SDF-1\beta (véase la Fig. 3). El peso molecular teórico del péptido de SDF-1\gamma de 119 aminoácidos es de 13,5 kDa. La secuencia de aminoácidos del SDF-1\beta de rata muestra una alta homología (96,8%) con la proteína correspondiente de ratón (98,9% considerando sustituciones de aminoácidos conservadoras). En la Fig. 4 se muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de las nuevas isoformas del SDF-1, SDF-1\gamma y SDF-1\beta, con las secuencias conocidas de SDF-1.

Ejemplo 2 Detección del ARNm de SDF-1\beta y SDF-1\gamma en diferentes tejidos y estadios de desarrollo A. Análisis por transferencia Northern

Se fraccionaron en cada caso 10 \mug de ARN total en geles de agarosa al 1,2% que contenían 15% de formaldehído y después se transfirieron a membranas Nytran NY 13 N (Schleicher y Schüll, Keene, NH) mediante procedimientos convencionales. Los filtros se irradiaron con luz UV, se tiñeron con azul de metileno (Sambrook y col., 1989), se prehibridaron en una solución de fosfato sódico 0,5 M (pH 7,0) con 7% de SDS y se hibridaron en la misma solución con 1-5 x 10^{6} cpm/ml de una sonda de ADNc marcada con ^{32}P. Los fragmentos de ADNc correspondientes a (i) la región 3' UTR común de SDF-1\beta/\gamma (nucleótidos 743 a 1368 en SDF-1\beta), (ii) la región codificante común a todas las isoformas de SDF-1 (nucleótidos 49 a 239) y (iii) un segmento de 1702 nucleótidos del inserto específico de SDF-1\gamma (nucleótidos 625 a 2327 en el ADNc de SDF-1\gamma) se marcaron radiactivamente mediante PCR unidireccional (Stürzl y col., 1991). Después de la hibridación, los filtros se lavaron al menos durante 15 minutos a 60ºC en SSC 2x/1% de SDS y durante 15 minutos a 60ºC en SSC 0,1x/1% de SDS. Los filtros o bien se expusieron junto con una película de rayos X (X-Omat AR, Kodal) o bien se cuantificaron directamente con un BAS-1050-Bioimager (Fuji).

B. Detección del ARNm de SDF-1\beta y SDF-1\gamma en diferentes tejidos

Los ensayos de transferencia e hibridación Northern mostrados en la Figura 5A se realizaron con ARN total de diferentes tejidos de ratas adultas y con un fragmento de 602 nucleótidos procedente de la región 3' UTR común a SDF-1\beta/\gamma y marcado radiactivamente con ^{32}P-dCTP. La distribución del ARNm de SDF-1\beta y SDF-1\gamma en diferentes tejidos de ratas adultas mostró un patrón complementario. Mientras que la isoforma \beta se detectó sobre todo en el hígado, el riñón, el bazo y el timo, el SDF-1\gamma se daba principalmente en el tejido cardiaco y pulmonar, así como en el tejido maduro del sistema nervioso (Fig. 5). El hecho de que el transcrito de SDF-1\beta aparezca preferentemente sobre todo en el tejido cerebral embrionario y neonatal y en el nervio ciático apunta a una regulación diferencial de la expresión de SDF-1 durante el desarrollo del sistema nervioso central. En el tejido muscular y testicular no se pudieron detectar ni el ARNm de SDF-1\beta ni el de SDF-1\gamma (Fig. 5A).

C. Detección del ARNm de SDF-1\beta y SDF-1\gamma en el cerebro y en el nervio ciático a lo largo del desarrollo Cerebro

Para estudiar la distribución de SDF-1\beta y SDF-1\gamma específica del desarrollo se hibridó el ARN del tejido cerebral de ratas en diferentes estadios del desarrollo (desde embriones de 17 días de edad (E17) hasta ratas adultas) con un fragmento de 602 nucleótidos de la región 3' UTR común de SDF-1\beta/\gamma. En el tejido cerebral de embriones E17 se detectó principalmente ARNm de SDF-1\beta, pero la cantidad de transcritos disminuyó con la edad y el transcrito ya no se pudo detectar en el tejido cerebral de ratas adultas. Por el contrario, la cantidad de transcritos de SDF-1\gamma era muy pequeña en embriones E 17, pero aumentaba constantemente y alcanzó un máximo en ratas adultas (Fig. 5B).

Nervio ciático

Se aisló ARN total del nervio ciático de ratas en diferentes estadios del desarrollo (desde un días después del nacimiento (P1) hasta alcanzar la edad adulta). En el estadio P1 se detectaron cantidades pequeñas de ARNm de SDF-1\beta; la cantidad de transcritos aumentó en los estadios P4-P7 y disminuyó a por debajo del límite de detección en el tejido nervioso de ratas adultas (Fig. 5C). El ARNm de SDF-1\gamma se observó por primera vez en el estadio P4; la cantidad de transcritos alcanzó un máximo en el estadio P14 y disminuyó después a un nivel medio en el tejido de ratas adultas (Fig. 5C).

Así pues, los ARNm de SDF-1\beta y SDF-1\gamma parecen mostrar un patrón de expresión diferente durante el desarrollo y en el sistema nervioso de la rata adulta. Mientras que la isoforma SDF-1\beta aparece principalmente en los SNC y SNP embrionarios o perinatales, el SDF-1\gamma es la variante más importante en el sistema nervioso de ratas adultas (Fig. 5B, C). En el periodo de tiempo comprendido entre el 4º y el 7º día después del nacimiento, en el que comienza la diferenciación de las células gliales y la maduración de las neuronas, los transcritos de SDF-1\beta y SDF-1\gamma aparecen en cantidades prácticamente iguales.

D. Detección de ARNm de SDF-1\beta y SDF-1\gamma después de una lesión del nervio ciático

Tras la lesión del nervio ciático causada por la compresión se observó en el extremo distal del nervio pequeñas variaciones del patrón de ARNm de SDF-1\beta y SDF-1\gamma. Mediante la "formación de imágenes cuantitativas múltiples" a partir de filtros de transferencia Northern radiactivos se constató tras la lesión un aumento transitorio de la cantidad de ARNm de SDF-1\beta, que alcanzó un máximo de 175% dos días después de la compresión del nervio; después, los valores bajaron hasta alcanzar, 7 días después de la lesión, el mismo nivel que el control. Para el ARNm de SDF-1\gamma no se observaron cambios significativos tras la lesión del nervio.

Ejemplo 3 Localización celular del transcrito de SDF-1\gamma por hibridación in situ A. Hibridación in situ

Las muestras de tejido se incorporaron en Tissue Tec II (Miles, Napperville, IL), se congelaron a -70ºC en metilbutano y se cortaron en cortes de 20 \mum de grosor. Los cortes se fijaron y a continuación se acetilaron y se prehibridaron durante 4 horas a 55ºC según Angerer y col. (1987). Los transcritos in vitro de (i) un subclon de la región 3' UTR común de SDF-1\beta/\gamma (nucleótidos 1758-2199 en SDF-1\beta), (ii) un subclon de las regiones 5' UTR y codificantes comunes a todas las isoformas de ARNm de SDF-1 (nucleótidos 1-596 en el ADNc de SDF-1\beta) y (iii) un subclon del inserto específico de SDF-1\gamma (nucleótidos 661-1313 en el ADNc de SDF-1\gamma) se crearon con la ayuda del kit de marcado DIG-RNA de Boehringer Mannheim usando digoxigenina-UTP. Tras la hibridación durante la noche a 55ºC se realizó un tratamiento con RNasa A (20 \mug/ml en NaCl 0,6 M, Tris-HCl 20 mM, EDTA 2 mM, pH 8) durante 20 minutos a 37ºC. Los cortes se lavaron después tres veces durante 20 minutos cada vez a 50ºC con SSC 2x y tres veces durante 20 minutos cada vez a 50ºC con SSC 0,2x. La detección de digoxigenina se realizó según las instrucciones del fabricante (Boehringer Mannheim).

B. Localización celular del transcrito de SDF-1\gamma

Para la hibridación in situ se marcaron con digoxigenina-UTP transcritos antisentido de (a) la región 3' UTR común de SDF-1\beta/\gamma, (b) la región 5' UTR y codificante común a todas las isoformas de SDF-1 y (c) el inserto específico de SDF-1\gamma. Los transcritos sentido sirvieron de controles negativos.

En el SNC de ratas adultas se observaron, tanto con la sonda común a todas las isoformas de SDF-1 como con la específica de SDF-1\gamma, intensas y extensas señales de hibridación en las regiones con sustancia cerebral gris, así como en las alineaciones de oligodendrocitos a modo de "cadenas de perlas" en fibras nerviosas mielinizadas, tales como el cuerpo calloso (Fig. 6A, B). Otras señales de hibridación aparecían sobre todo en relación con las neuronas de Purkinje y granulares en el cerebelo (Fig. 6D, E), en neuronas piramidales y granulares en el hipocampo (Fig. 6G, H), así como en las neuronas de todas las capas principales la neocorteza (Fig. 7A, B). Con los transcritos sentido no se obtuvieron señales de hibridación (véase la Fig. 6C, F, I para las sondas sentido para SDF-1\gamma).

Las señales obtenidas con el transcrito antisentido específico de SDF-1\gamma eran prácticamente idénticas al patrón de hibridación que se obtuvo con la sonda antisentido común a los SDF-1, lo que apunta a que la isoforma SDF-1\gamma se expresa en neuronas y oligodendrocitos del cerebro de ratas adultas. Los transcritos de SDF-1\beta, en tanto que aparezcan en el cerebro de ratas adultas, parecen estar presentes en las mismas regiones y poblaciones celulares que
SDF-1\gamma.

En cortes longitudinales del nervio ciático de ratas adultas, una sonda antisentido de la región 3' UTR común de SDF-1\beta/\gamma produjo señales de hibridación fusiformes que recordaban a la forma típica de las células de Schwann próximas a las fibras axonales (Fig. 8A, B). La localización idéntica de la inmunorreactividad de S100, así como de las señales de hibridación en los cortes transversales del nervio ciático (véanse las puntas de flecha), confirman la expresión del ARNm de SDF-1\beta/\gamma en células de Schwann (Fig. 8D, E). Cuando se usó una sonda antisentido específica de SDF-1\gamma, se obtuvo en el nervio ciático de ratas adultas un patrón de marcado (Fig. 8H) muy similar al patrón de hibridación del transcrito antisentido común a todas las isoformas SDF (Fig. 8G). El ARNm de SDF-1\gamma (y presumiblemente también la isoforma SDF-1\beta) aparecen tanto en células de Schwann (véanse las puntas de flecha) como en células vasculares (parte superior derecha en la Fig. 8G, H) del nervio ciático. Los resultados de los ensayos de hibridación in situ coinciden con los resultados de los ensayos de transferencia Northern de las Figuras 2 y 5. Con los transcritos antisentido/sentido de la región 3' UTR específica de SDF-1\alpha no se detectó el ARNm de SDF-1\alpha ni en el cerebro ni en el nervio ciático de ratas adultas.

Ejemplo 4 Expresión de productos de SDF-1\gamma en Hansenula polymorpha A. Constructos hSDF-1\gamma

Para la expresión de SDF-1\gamma en Hansenula polymorpha se crearon tres constructos diferentes que, con el fin de mejorar la accesibilidad analítica, se dotaron de un His-tag. Los constructos se muestran en la Figura 13.

1. M-mhSDF-1\gamma-H6 (metionina/ SDF-1\gamma humano maduro/ His-tag). En esta proteína de fusión, la secuencia del SDF-1\gamma humano maduro (aminoácidos 20-119 en la SEC. ID. Nº: 12) se encuentra detrás de un resto metionina N-terminal. Puesto que no existe ninguna secuencia líder, cabía esperar una localización citosólica. En el extremo C-terminal se encuentran seis restos histidina (His-tag).

2. hSDF-1\gamma-H6 (SDF-1\gamma humano inmaduro/ His-tag). Este constructo comprende los aminoácidos 1-119 de SDF-1\gamma (SEC. ID. Nº: 12), seguidos de un His-tag C-terminal. Contiene, por lo tanto, la secuencia líder natural reconocida en las células humanas. Puesto que las secuencias líder en ocasiones también son reconocidas por células huésped heterólogas, se quería estudiar con este constructo si H. polymorpha reconoce el péptido líder auténtico de SDF-1\gamma.

3. MF\alpha-mhSDF-1\gamma-H6 (secuencia prepro del factor de apareamiento \alpha de Saccharomyces cerevisiae/ SDF-1\gamma humano maduro/ His-tag). La secuencia del SDF-1\gamma maduro (aminoácidos 20-119 en la SEC. ID. Nº: 12) se encuentra en este caso detrás de la secuencia prepro, usada a menudo en H. polymorpha, del factor de apareamiento \alpha de la levadura de cerveza relacionada Saccharomyces cerevisiae. Este constructo debía ser secretado por H. polymorpha.

B. Construcción de plásmidos de expresión

Como constructo de partida sirvió el plásmido SDF-1\gamma-PCRII-TOPO que contenía el inserto de SDF-1\gamma de 439 pb (Fig. 14). En un primer paso se añadieron a la secuencia de hSDF-1\gamma por mutagénesis mediante PCR seis codones para un His-tag C-terminal (hSDF-1\gamma-H6, Fig. 15).

Como vector que sirvió de base para la expresión posterior de los constructos de SDF-1\gamma en H. polymorpha se usó el plásmido integrante pFPMT121 (Gellissen, 2000), en el que el gen exógeno que se ha de expresar se encuentra bajo el control del promotor FMD. Sobre la base de este plásmido se construyeron los siguientes vectores de expresión:

1. pFPMT-M-mhSDF-1\gamma-H6. A partir del M-mhSDF-1\gamma-H6-ORF se generó por PCR un fragmento de ADN en el que la secuencia codificante de SDF-1\gamma estaba flanqueada por un sitio de restricción de EcoRI (delante del codón de iniciación) y por uno de BamHI. Como ADN molde sirvió el hSDF-1\gamma-H6 en PCRII-TOPO (Invitrogen, Groningen, NL). El producto de PCR se digirió con EcoRI/BamHI y se clonó entre los sitios correspondientes del plásmido pFPMT121. En la Fig. 16 se muestra el mapa del plásmido resultante pFPMT-M-mhSDF-1\gamma-H6.

2. pFPMT-hSDF-1\gamma-H6. En el caso de este constructo también se creó primero un producto de PCR flanqueado por un sitio de corte para EcoRI y por uno para BamHI, sirviendo de nuevo el hSDF-1\gamma-H6 en PCRII-TOPO como ADN molde. El producto de PCR digerido con EcoRI y BamHI se clonó entre los sitios correspondientes del plásmido pFPMT121. En la Fig. 17 se muestra el mapa del plásmido resultante pFPMT-hSDF-1\gamma-H6.

3. pFPMT-MF\alpha-mhSDF-1\gamma-H6. Para la generación de este plásmido se crearon dos productos de PCR separados (véase la Fig. 18). El primer producto de PCR (PCR IA) comprendía los codones de la secuencia prepro del factor de apareamiento \alpha, flanqueados por un sitio de corte para EcoRI (delante del codón de iniciación) y, en el otro extremo, por bases con homología con los primeros codones de la secuencia del hSDF-1\gamma maduro. El segundo producto de PCR (PCR IB) contenía la secuencia del hSDF-1\gamma maduro, flanqueada en la parte anterior por bases con homología con la parte posterior de la secuencia prepro del factor de apareamiento \alpha y flanqueada en la parte posterior por un sitio de corte para BamHI (detrás del codón de terminación). Después se realizó una reacción de PCR adicional (PCR II) en la que se mezclaron los productos de las dos PCR IA y PCR IB antes descritas. Como cebadores se usaron el cebador Hin de la PCR IA (el que contenía el sitio de corte para EcoRI) y el cebador inverso de la PCR IB (el que contenía el sitio de corte para BamHI). El producto de PCR generado comprendía la secuencia prepro del factor de apareamiento \alpha fusionada con la secuencia del mhSDF-1\gamma-H6 y flanqueada por los sitios de corte para EcoRI (delante del codón de iniciación) y BamHI (detrás del codón de terminación). Tras la digestión con EcoRI/BamHI se clonó el fragmento entre los sitios de corte correspondientes del plásmido pFPMT121. En la Fig. 19 se muestra el mapa del plásmido resultante pFPMT-MF\alpha-mhSDF-1\gamma-H6.

C. Transformación de H. polymorpha con los vectores de expresión creados, generación e identificación de cepas

Para la preparación de células competentes de H. polymorpha para la electroporación se inocularon 5 ml de medio YPD con una colonia individual de H. polymorpha RB11 (odc^{-}, cepa de H. polymorpha deficiente en orotidina-5-fosfato descarboxilasa (auxótrofo de uracilo) (Weydemann y col., 1995)) y se agitaron durante 16 h a 37ºC. A continuación se inocularon 100 ml de medio YPD en un matraz Erlenmeyer de 2 l con 3 ml de este cultivo previo y se incubaron a 37ºC hasta alcanzar una DO_{600} de 0,8 a 1 (frecuencia de agitación 140 rpm). La recolección de las células se llevó a cabo por centrifugación del cultivo en tubos Falcon de 50 ml (4.000 rpm; 6') en una centrífuga de Beckmann. Para eliminar los sobrenadantes, las células se resuspendieron en 20 ml de tampón fosfato potásico 50 mM (pH 7,5; precalentado a 37ºC), se añadieron 0,5 ml de DTT 1 M y se incubaron durante 15' a 37ºC (baño de agua). A continuación, las células se volvieron a centrifugar (3.000 rpm; 10', centrífuga de Beckmann) y se lavaron primero con 100 ml y después con 50 ml de tampón STM (sacarosa 270 mM; Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; MgCl_{2} 1 mM). Tras centrifugar de nuevo, las células se resuspendieron en 0,5 ml de tampón STM y, en forma de alícuotas de 60 \mul, se usaron directamente para las transformaciones o bien se congelaron a -70ºC para el uso posterior.

Las células competentes de H. polymorpha RB11 se transformaron de la siguiente manera con los tres plásmidos de expresión creados (véase anteriormente): A 60 \mul de células H. polymorpha competentes se añadieron 1 a 2 \mug del ADN plasmídico circular que se ha de introducir y se transfirieron a cubetas de electroporación con una anchura de ranura de 2 mm. La electroporación se llevó a cabo a 2 kV, 25 \muF y 200 ohm. A continuación, las células se transfirieron a tubos de ensayo con 1 ml de medio YPD y se agitaron durante 1 h a 37ºC (ángulo 45º; 160 rpm). Después de este periodo de recuperación se sembraron 330 \mul de las células en placas de agar-YNB (1% de glucosa; sin uracilo). Las placas se incubaron a 37ºC hasta que fueron visibles colonias macroscópicas prototróficas de uracilo (aproximadamente 1 semana).

A continuación se convirtieron en cada caso 36 colonias prototróficas de uracilo en cepas estables mediante cuatro pasadas y dos estabilizaciones. Para las pasadas se inocularon 2 ml de medio YNB (1% de glucosa) con colonias prototróficas de uracilo individuales procedentes de las placas de transformantes y se incubaron durante 2 días a 37ºC (ángulo 45º; frecuencia de agitación 160 rpm). Se transfirieron 150 \mul de cada cultivo resultante a 2 ml, respectivamente, de medio YNB reciente y se volvieron a incubar durante 2 días (véase anteriormente). Este proceso se realizó cuatro veces en total (= cuatro pasadas). Para la estabilización se transfirieron 150 \mul de cada cultivo procedente de la última pasada a 2 ml de medio YPD y se incubaron durante 2 días a 37ºC (véase anteriormente). A continuación se sembraron alícuotas de estos cultivos en placas de agar-YNB (1% de glucosa; sin uracilo). Se aisló una colonia individual por cultivo de extensión y se definió como cepa.

D. Inducción de la expresión y detección de los productos de SDF-1\gamma

Tras su aislamiento, todas las cepas se sometieron a una inducción por MeOH y las fracciones intracelulares solubles se analizaron mediante transferencia Western respecto a su contenido en productos de hSDF-1\gamma. En primer lugar se inocularon en cada caso 2 ml de medio YPD en tubos de ensayo de 10 ml con colonias individuales de las cepas que había que analizar y a continuación los cultivos se incubaron durante 16 h a 37ºC (ángulo 45º; frecuencia de agitación 160 rpm) para la inducción de la expresión del gen exógeno. A continuación se usaron 150 \mul de los cultivos densos resultantes para inocular en cada caso 3 ml de medio YNB (1% de glicerina). Tras agitar durante 24 h a 37ºC, las células se centrifugaron y se resuspendieron en cada caso en 3 ml de medio YNB (1% de MeOH). La expresión del gen exógeno se indujo entonces agitando de nuevo durante 24 horas a 37ºC.

Tras centrifugar las células de los cultivos inducidos se añadió, para la preparación de sobrenadantes de cultivo, SAB 4x (SDS 8% p/v; glicerina 40% p/v; EDTA 8 mM, pH 6,8; Tris 250 mM, pH 5,8; azul de bromofenol 0,04% p/v; \alpha-mercaptoetanol 40% v/v) a alícuotas de los sobrenadantes y se desnaturalizaron durante 5' a 95ºC.

Para la preparación de fracciones intracelulares solubles, se realizaron los siguientes pasos en hielo o a 4ºC: Los sedimentos celulares de los cultivos inducidos se resuspendieron en cada caso en 500 \mul de tampón de extracción (Tris 50 mM, pH 7,5; NaCl 150 mM, Triton X-100 0,1% v/v o tampón PBS) y se añadieron en cada caso 12,5 \mul de PMSF. A continuación, las muestras se transfirieron a tubos Eppendorf de 1,5 ml. Tras añadir 500 \mul de perlas de vidrio se llevó a cabo la ruptura de las células en un vibrador a 2.500 rpm. Los sobrenadantes se transfirieron a nuevos tubos Eppendorf y se centrifugaron durante 10' a 10.000 rpm (centrífuga de Eppendorf con función de refrigeración). Los sobrenadantes de esta centrifugación constituyeron la denominada fracción intracelular soluble. Se añadió a ésta 1/4 vol. de SAB 4x y se desnaturalizó durante 5' a 95ºC para la electroforesis en gel directa de las proteínas, o se congelaron a -20ºC sin la adición de SAB para usos posteriores.

Para la digestión con la PNGasa F se añadió 1 \mul de SDS al 1% a 8 \mul de cada fracción intracelular soluble nativa y se incubó durante 5' a 95ºC. A continuación se llevó a cabo la adición de 1 \mul de PNGasa F (2 u; Roche) o de H_{2}O. Tras una incubación de 16 h a 37ºC se añadieron 4 \mul de SAB 4x, las muestras se desnaturalizaron durante 5' a 95ºC y se separaron en geles de proteínas.

La separación de las muestras desnaturalizadas mediante la electroforesis en gel para proteínas se llevó a cabo en geles de tricina-SDS al 4-20% (Novex) según las instrucciones del fabricante. A continuación, las bandas de proteína se transfirieron a membranas de nitrocelulosa en un aparato de transferencia semiseca (Trans-Blot SD; Biorad) según las instrucciones del fabricante. Para las transferencias Western se usó como anticuerpo primario (suero) un anticuerpo monoclonal de ratón específico de His-tag (anticuerpo RGS-His, Qiagen, Hilden, RFA) o un suero policlonal de cabra específico de SDF-1 (SDF-1 (C19); #sc6193; Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.). Las transferencias Western se realizaron con los kits Western Breeze ratón o cabra (Novex) según las instrucciones del fabricante.

De este modo se pudieron identificar para cada uno de los tres constructos cepas que producían cantidades significativas del derivado de hSDF-1\gamma-H6 correspondiente. Para análisis adicionales de los productos se seleccionó en cada caso la cepa más productiva. Para pFPMT-M-mhSDF-1\gamma-H6, ésta era la cepa g7-5/36; para pFPMT-hSDF-1\gamma-H6 y pFPMT-MF\alpha-mhSDF-1\gamma-H6 se eligieron las cepas g8-28/7 y g9c-20/6 respectivamente.

E. Análisis de los productos

En los sobrenadantes de cultivo de las cepas g7-5/36, g8-28/7 y g9c-20/6 no se pudieron detectar por transferencia Western productos de SDF-1\gamma secretados. En la fracción intracelular soluble de estas cepas se pudieron identificar productos de SDF-1\gamma tanto con un anticuerpo de ratón específico de His-tag como con un suero de cabra específico de SDF-1 (SDF-1 (C19); #sc6193; Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.) (véase la Fig. 20A, B). La fracción intracelular soluble de una cepa control (sin SDF-1\gamma) no muestra los productos identificados como SDF-1\gamma (Fig. 20, carril 8 (A), carril 1 (B)).

Los pesos moleculares de los productos de SDF-1\gamma principales observados en la transferencia Western se encuentran en general un poco por encima de los pesos moleculares calculados. M-mhSDF-1\gamma-H6: calculado 12,692 kDa, observado aproximadamente 16 kDa (Fig. 20, carriles 2 y 3 (A), carriles 3 y 4 (B)); hSDF-1\gamma-H6: calculado 14,529 kDa, observado aproximadamente 17 kDa (Fig. 20, carriles 4 y 5 (A), carriles 5 y 6 (B)); MF\alpha-mhSDF-1\gamma-H6: calculado 21,468, observado aproximadamente 30 kDa (Fig. 20, carriles 6 y 7 (A), carriles 7 y 8 (B)). Puesto que todas las bandas principales se pueden detectar tanto con el anticuerpo específico de His-tag como con el suero específico de SDF-1, las proteínas correspondientes a las bandas tienen que estar intactas en su extremo C-terminal. Por lo demás, los pesos moleculares aparentes de los diferentes productos muestran la gradación relativa esperada (M-mhSDF-1\gamma-H6 < hSDF-1\gamma-H6 < MF\alpha-mhSDF-1\gamma-H6; Fig. 20).

Las secuencias de aminoácidos de M-mhSDF-1\gamma-H6 y hSDF-1\gamma-H6 no contienen sitios potenciales de N-glicosilación. Por consiguiente, la digestión con PNGsa F no influye en el peso molecular aparente de la banda principal del producto correspondiente (Fig. 20, carriles 2/3 y 4/5 (A), carriles 3/4 y 5/6 (B)). MF\alpha-mhSDF-1\gamma-H6 presenta tres sitios de N-glicosilación en la región de la secuencia prepro del MFa, que típicamente son glicosilados en el RE. La ausencia de una reducción del peso molecular aparente del producto de 30 kDa después de la digestión con PNGasa F indica que en el caso de este producto se trata de la forma prepro que no se introdujo en el RE (Fig. 20, carriles 6/7 (A), carriles 7/8 (B)). Por encima de 30 kDa se encuentran tres bandas débiles sensibles a la PNGasa F (carril 7 (B)) que después de la N-desglicosilación se desplazan a por debajo de 30 kDa (carril 8 (B)). Estas bandas se pueden interpretar como formas pro de MF\alpha-mhSDF-1\gamma-H6 N-glicosiladas en la secuencia pro, en las que la secuencia pre se disoció durante la entrada en el RE.

Ejemplo 5 Efecto del SDF-1\gamma humano recombinante en la concentración de calcio en células nerviosas y células gliales

En este ejemplo se estudió el efecto que ejerce el SDF-1\gamma humano recombinante (M-mhSDF-1\gamma-H6) de extractos celulares de Hansenula polymorpha en la concentración de calcio en células nerviosas y células gliales. Para la determinación de la concentración de calcio se usó el procedimiento de formación de imágenes de calcio (véase Köller y col., 2001).

Para los experimentos de formación de imágenes de Ca se prepararon y cultivaron astrocitos primarios y neuronas primarias de la corteza de rata (cepa Wistar) procedentes de ratas recién nacidas (día postnatal 0-1; astrocitos) o de embriones de rata (día embrionario 15; neurona cortical) como describió Köller y col. (2001). Al cabo de 5 a 15 días en cultivo, las células se cargaron in vitro durante 1 h con el indicador de calcio fura-2. El fura-2 intracelular reacciona con el calcio liberado para convertirse en fura-calcio, que absorbe a una longitud de onda diferente (340 nm) que el fura-2 (380 nm). Con la ayuda del coeficiente de extinción (F340/F380) se puede hallar la concentración intracelular relativa de calcio y representarla gráficamente. Este procedimiento permite la detección de cambios en la concentración intracelular de calcio causados por estímulos extracelulares (por ejemplo, interacciones ligando/receptor).

La Figura 21 muestra el resultado de experimentos de formación de imágenes de Ca en los que se comparó el efecto de SDF-1\alpha y SDF-1\gamma en la concentración de Ca en astrocitos. Tras la aplicación de SDF-1\alpha (50 nM, R&D Systems, Wiesbaden, RFA) aumenta la concentración intracelular de calcio en astrocitos cultivados (Figura 21 A). Tras la aplicación de extracto de levadura con SDF-1\gamma recombinante (M-mhSDF-1\gamma-H6) (35 \mug de proteína total) se produce un aumento de calcio intracelular en astrocitos cultivados (Figura 21 B). La respuesta, sin embargo, es algo menor que la respuesta a SDF-1\alpha.

Tras la aplicación del extracto control (22,4 \mug de proteína de un extracto celular de células de H. polymorpha RB11 que se transformaron con el plásmido pFPMT121 sin inserto) no se produce ningún aumento del calcio intracelular en astrocitos cultivados (Figura 21 C).

La Figura 21 D muestra la valoración cuantitativa de los aumentos del calcio intracelular en los casos del SDF-1\gamma y el extracto control respecto al aumento de calcio causado por SDF-1\alpha.

Asimismo se analizó si la preincubación de las células con un anticuerpo específico de CXCR4 (anticuerpo monoclonal 12G5; R&D Systems, Wiesbaden, RFA) puede reducir esta respuesta de calcio tal y como se observó previamente para la reacción de calcio inducida por SDF-1\alpha (véase Köller y col., 2001, para detalles metodológicos sobre los experimentos de formación de imágenes de Ca).

La Figura 22 muestra el resultado de un experimento de formación de imágenes de Ca en astrocitos para SDF-1\alpha (A) sin y (B) con anticuerpos contra CXCR4. La Figura 23 muestra el resultado de los experimentos correspondientes para SDF-1\gamma. Tras la aplicación de SDF-1\alpha (50 nM; R&D Systems, Wiesbaden, RFA), la concentración intracelular de calcio en astrocitos cultivados aumenta considerablemente (Figura 22 A). Sin embargo, si el SDF-1\alpha se añade tras 5 min de preincubación con el anticuerpo monoclonal 12G5, los astrocitos cultivados muestran una liberación de calcio intracelular reducida en aproximadamente 50% (Figura 22 B). Estos resultados confirman los hallazgos descritos en la bibliografía, que muestran que la influencia de SDF-1\alpha o -1\beta en la concentración intracelular de calcio en astrocitos del sistema nervioso central es mediada por el receptor CXCR4.

Tras la aplicación de 35 \mug de extracto de levadura con SDF-1\gamma (M-mhSDF-1\gamma-H6; ruptura de las células en tampón PBS) se produce un aumento medible del calcio intracelular en astrocitos cultivados (Figura 23 A). Al contrario que en el caso de SDF-1\alpha, la aplicación de SDF-1\gamma en astrocitos cultivados preincubados durante 5 min con el anticuerpo monoclonal 12G5 contra el receptor CXCR4 conduce a una liberación de calcio intracelular significativa, considerablemente mayor (Figura 23 B).

También los cultivos celulares de neuronas corticales de cerebro de rata muestran, tras la preincubación con el anticuerpo contra CXCR4, un aumento adicional de la concentración de calcio como respuesta a SDF-1\gamma. La Figura 24 muestra el resultado de un experimento de formación de imágenes de Ca correspondiente en neuronas corticales. La aplicación tanto de 35 \mug como de 124 \mug (proteína total) de un extracto de levadura con SDF-1\gamma recombinante (M-mhSDF-1\gamma-H6) conduce a un aumento significativo de la concentración intracelular de calcio en neuronas corticales primarias cultivadas (Figura 24 A). Tras una preincubación de 5 min con el anticuerpo monoclonal 12G5 (anticuerpo contra CXCR4), la adición de SDF-1\gamma provoca una fuerte liberación de calcio intracelular en neuronas corticales primarias cultivadas (Figura 24 B).

Estos resultados precedentes demuestran que la respuesta citofisiológica de neuronas y astrocitos del sistema nervioso central a SDF-1\alpha o -1\beta difiere claramente de las respuestas a la nueva quimiocina SDF-1\gamma.

Ejemplo 6 Efecto del péptido básico C-terminal de SDF-1\gamma y de los productos de disociación peptídica derivados de éste y preparados sintéticamente en la concentración intracelular de Ca en astrocitos

En primer lugar se analizó la influencia que ejerce la adición de un péptido básico con una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de los 30 últimos aminoácidos en la región C-terminal de SDF-1\gamma sobre la concentración intracelular de Ca en astrocitos.

La Figura 25 muestra el resultado de un experimento de formación de imágenes de Ca con el péptido básico C-terminal de SDF-1\gamma en astrocitos. La aplicación de 1 mg/ml del péptido sintético que representaba los 30 aminoácidos C-terminales de SDF-1\gamma dio como resultado una influencia tan sólo ligera en la concentración intracelular de Ca en los astrocitos cultivados (Figura 25 A). Si los astrocitos se incubaban previamente durante 5 minutos con el anticuerpo monoclonal 12G5 (anticuerpo contra CXCR4), se producía en los astrocitos primarios una fuerte liberación de calcio intracelular al aplicar el mismo péptido C-terminal (Figura 25 B).

Cuando se realizó un experimento de formación de imágenes de Ca con los péptidos RREEKVG (péptido 1, SEC. ID. Nº: 5), KKEKIG (péptido 2, SEC. ID. Nº: 6), KKKRQ (péptido 3, SEC. ID. Nº: 8), KKRKAAQ (péptido 4, SEC. ID. Nº: 9) y KKKN (péptido 5, SEC. ID. Nº: 10) derivados de la región C-terminal de SDF-1\gamma, así como con los péptidos 1' (RREEKV(NH2)) y 2' (KKEKI(NH2)) amidados según se describe en Eipper y col. (1992), se observó que la adición de los péptidos 1, 2 y 3 no amidados, así como de los péptidos 1' y 2' amidados, producía un aumento de la concentración intracelular de Ca en astrocitos. En la Figura 26 se muestra que la aplicación de 1 mg/ml del péptido 2 (KKEKIG, SEC. ID. Nº: 6) (Figura 26 A) o del péptido 3 (KKKRQ; SEC. ID. Nº: 8) (Figura 26 B) conduce a un aumento significativo de la concentración intracelular de calcio en astrocitos primarios cultivados. Por el contrario, los péptidos 4 y 5 no provocan ningún aumento de la concentración de Ca en astrocitos.

Estos resultados demuestran que los neuropéptidos putativos pueden modular la concentración intracelular de calcio de distintas maneras. Asimismo sugieren que el responsable de la drástica regulación al alza de la concentración intracelular de calcio provocada por SDF-1\gamma tras la preincubación de las células con el anticuerpo anti-CXCR4 es exclusivamente la región C-terminal de SDF-1\gamma pero no el segmento de la molécula que coincide con las quimiocinas SDF-1\alpha o -1\beta. Este hallazgo demuestra la función especial y específica del extremo C-terminal de SDF-1\gamma y confirma los resultados obtenidos con la molécula de SDF-1\gamma completa.

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Tashiro, K., Tada, H., Heilker, R., Sherozou, M., Nakano, T. y Honjo, T. (1993) Signal sequence trap: a cloning strategy for secreted proteins and type I membrane proteins. Science 261, 600-602.

Weydemann, U., Keup, P., Piontek, M., Strasser, A.W.M., Schweden, J., Gellissen, G., Janowicz, Z.A. (1995) High level secretion of hirudin by Hansenula polymorpha - authentic processing of three different preprohirudins. Appl. Microbiol. Biotechnol. 44:844-849.

<110>

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una quimiocina, un precursor neuropeptídico o al menos un neuropéptido

\vskip0.400000\baselineskip

<130> PCT1385-1966

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip0.400000\baselineskip

<150> DE 100 27 383.1

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-06-02

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial:

\hskip1cm

Secuencia consenso para la región específica de SDF-1-gamma

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial:

\hskip1cm

Secuencia consenso para la región específica de SDF-1-gamma

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Arg o Lys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Arg Arg Glu Glu Lys Val Gly Lys Lys Glu Lys Ile Gly Lys Lys}

\sac{Lys Arg Gln Lys Lys Arg Lys Ala Ala Gln Lys Xaa Lys Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 360

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial:

\hskip1cm

Secuencia consenso para la región codificante de SDF-1-gamma

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial:

\hskip1cm

Secuencia consenso para el polipéptido SDF-1-gamma

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Val o Ala

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Val o Ala

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Thr o Ala

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Leu o Ile

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (65)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Asn o Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (84)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Glu o Asp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (117)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Arg o Lys

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido obtenible por disociación proteolítica de SDF-1-gamma

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Glu Glu Lys Val Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Lys Glu Lys Ile Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Lys Lys Arg Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Lys Arg Lys Ala Ala Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SITIO

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Arg o Lys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Xaa Lys Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5391

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

22

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 360

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 360

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2819

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido obtenible por disociación proteolítica de SDF-1-beta

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lya Arg Leu Lys Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador MMSE2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgccatgga cgccaaggtc g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador GAS2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actgtaagga agaccctctc tcacc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador GAS3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttgagacta tgcatcgact ccaac

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos de la proteína SDF-1-gamma humana madura con una metionina C-terminal (constructo M-mhSDF-1-gamma)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

27

Claims

1. Molécula de ácido nucleico con una secuencia que comprende:

(a): una secuencia de ácido nucleico según la SEC. ID. Nº: 1;

o

2. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico indicada en (1) (c) presenta una identidad de al menos 90%.

3. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de ácido nucleico indicada en (1) (c) presenta una identidad de al menos 95%.

4. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico según la SEC. ID. Nº: 3.

5. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos según la SEC. ID. Nº: 4.

6. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además un promotor adecuado para la expresión, encontrándose la secuencia de ácido nucleico codificante bajo el control del promotor.

7. Molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además secuencias de un vector que permiten la replicación de la molécula de ácido nucleico en una célula huésped y/o la integración de la molécula de ácido nucleico en el genoma de una célula huésped.

8. Célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, siendo la célula huésped una célula procariótica o eucariótica adecuada para la expresión de la molécula de ácido nucleico.

9. Célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque la célula huésped procariótica es E. coli.

10. Célula huésped de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque la célula huésped eucariótica es una célula de hongo, de insecto o de mamífero.

11. Célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque la célula huésped es la levadura Saccharomyces cerevisiae, la levadura metilotrófica Hansenula polymorpha, la levadura dimorfa Arxula adeninivorans o el hongo filamentoso Sordaria macrospora.

12. Célula huésped de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque la célula huésped es una célula CHO, COS o HeLa.

13. Molécula polipeptídica que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las siguientes secuencias:

(ii) una secuencia de aminoácidos según la SEC. ID. Nº: 4;

\newpage

(iv) una secuencia de aminoácidos según la SEC. ID. Nº: 22;

\vskip1.000000\baselineskip

28

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

(vii) una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia según la SEC. ID. Nº: 7, una combinación de la SEC. ID. Nº: 7 y una o más de las secuencias de aminoácidos SEC. ID. Nº: 5, SEC. ID. Nº: 6, SEC. ID. Nº: 8, SEC. ID. Nº: 9 y SEC. ID. Nº 10 o una secuencia que presenta una identidad de al menos 95% con una combinación de esta secuencia y una o más de las secuencias antes mencionadas;

31

32

\newpage

y la secuencia de aminoácidos:

33

34

y la secuencia de aminoácidos:

TRKKKRQRRKGSG;

35

36

37

38

39

40

41

siendo la molécula polipeptídica una quimiocina o un neuropéptido.

14. Molécula polipeptídica de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizada porque la secuencia indicada en (v) presenta una identidad de al menos 90%.

15. Molécula polipeptídica de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizada porque la secuencia indicada en (v) presenta una identidad de al menos 95%.

16. Molécula polipeptídica de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos según la SEC. ID. Nº: 12 o SEC. ID. Nº: 13.

17. Fragmento de una molécula polipeptídica de acuerdo con una de las reivindicaciones 13 a 16, que comprende al menos un neuropéptido.

18. Fragmento de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende al menos una de las secuencias de aminoácidos según SEC. ID. Nº: 5, SEC. ID. Nº: 6, SEC. ID. Nº: 7, SEC. ID. Nº: 8, SEC. ID. Nº: 9 y/o SEC. ID. Nº: 10.

19. Procedimiento para la preparación de una molécula polipeptídica y/o de un fragmento suyo de acuerdo con una de las reivindicaciones 13 a 18, que comprende el cultivo de una célula huésped de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 a 12 en condiciones adecuadas para la expresión y el eventual procesamiento y, dado el caso, la purificación de la molécula polipeptídica o el fragmento expresado.

20. Procedimiento in vitro para la detección de una molécula polipeptídica y/o de un fragmento suyo de acuerdo con una de las reivindicaciones 13 a 18 en una muestra biológica, que comprende poner la muestra en contacto con un reactivo específico de la molécula polipeptídica y/o del fragmento y detectar la unión.

21. Kit de ensayo para la detección de un polipéptido y/o de un fragmento suyo de acuerdo con una de las reivindicaciones 13 a 18, que comprende al menos un reactivo específico del polipéptido y/o del fragmento.

22. Procedimiento in vitro para la detección de un ácido nucleico que codifica una molécula polipeptídica de acuerdo con una de las reivindicaciones 13 a 16 en una muestra biológica, que comprende:

- Poner la muestra en contacto con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5 y/o con un fragmento suyo, llevando la molécula de ácido nucleico y/o el fragmento una marca detectable, y

- detectar la marca.

23. Composición farmacéutica que contiene al menos una molécula polipeptídica y/o un fragmento suyo de acuerdo con una de las reivindicaciones 13 a 18 y/o una sal farmacéuticamente aceptable de una molécula polipeptídica o fragmento de este tipo.

24. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 23, caracterizada porque contiene además al menos un anticuerpo.

25. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 23 ó 24 para el uso terapéutico en enfermedades desmielinizantes o neurodegenerativas o en trastornos del desarrollo del sistema nervioso.

26. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 23 ó 24 para la prevención o el tratamiento de una infección por VIH y, en especial, de una encefalopatía causada por el VIH en seres humanos.

27. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 23 ó 24 para el uso terapéutico en enfermedades del sistema hematopoyético, del sistema inmune y del sistema cardiocirculatorio.

28. Composición farmacéutica que contiene al menos un anticuerpo específico de una molécula polipeptídica y/o de un fragmento suyo de acuerdo con una de las reivindicaciones 13 a 18.

29. Composición farmacéutica que contiene al menos una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7.

30. Composición farmacéutica de acuerdo con una de las reivindicaciones 27 a 29 para el uso diagnóstico o terapéutico en enfermedades desmielinizantes o neurodegenerativas o en trastornos del desarrollo del sistema nervioso.

31. Composición farmacéutica de acuerdo con una de las reivindicaciones 27 a 29 para el diagnóstico o el tratamiento de una infección por VIH y, en especial, de una encefalopatía causada por el VIH en seres humanos.