ES2251502T3 - Particulas metalicas de nucleo-cubierta revestidas con dextrano o aminodextrano llevando grupos sh, y empleo de los mismos. - Google Patents
Particulas metalicas de nucleo-cubierta revestidas con dextrano o aminodextrano llevando grupos sh, y empleo de los mismos.Info
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Abstract
Partículas de metal coloidales con una cubierta que envuelve dichas partículas de metal (partículas metálicas núcleo-cubierta) en donde la cubierta consiste en un dextrano o amino-dextrano no reticulado, llevando ambos, grupos SH.
Description
Partículas metálicas de
núcleo-cubierta revestidas con dextrano o
aminodextrano llevando grupos SH, y empleo de los mismos.
La presente invención se refiere a partículas
metálicas coloidales revestidas con dextrano o aminodextrano
activados con SH, no reticulados, así como la obtención y empleo de
dichas partículas en métodos de ensayo inmunológico.
En los últimos años, las partículas metálicas
coloidales han sido ampliamente empleadas en investigaciones
biológicas, bioquímicas e inmunológicas. Especialmente en el campo
de los ensayos inmunológicos la aplicación de partículas metálicas
coloidales para el marcado de cualquier tipo de biomoléculas ha
tenido mucho éxito.
Para la obtención de partículas metálicas
coloidales, en particular partículas de oro coloidales, han sido
descritos muy diferentes métodos. Las partículas de oro coloidales
se obtienen habitualmente por reducción de soluciones del ácido
tetracloroáurico y las biomoléculas pertinentes se unen a estas
partículas por adsorción en uno o varios pasos posteriores. El
tamaño de las partículas metálicas coloidales puede controlarse
específicamente por medio de la concentración inicial de los
diferentes participantes en la reacción (G. Frens, Nature Physical
Science, 241, p. 20-22 (1973)). La variación del
tamaño de partícula puede también ser optimizada mediante la
selección específica del procedimiento de obtención como se describe
en la patente EP-B-426 300.
La unión de biomoléculas como por ejemplo
anticuerpos, lectinas o incluso ácidos nucleicos, se hace
principalmente por adsorción, con las respectivas condiciones de
carga dependiendo en gran manera de las propiedades
físico-químicas (p. ej., punto isoeléctrico) de la
biomolécula. Las principales consideraciones sobre el revestimiento
de partículas metálicas coloidales pueden encontrarse en la
literatura técnica pertinente (p. ej., De Mey, The Preparation and
Use of Gold Probes in: Immunocytochemistry ("Preparación y empleo
de sondas de oro en Inmunocitoquímica"), J.M. Polak y S. V.
Noorden, pp. 115-145, Wright, Bristol, 1986 ó G.T.
Hermanson, Preparation of
Colloidal-Gold-Labelled Proteins, in
Bioconjugate Techniques ("Preparación de Proteínas Coloidales
Marcadas en Oro, en Técnicas Bioconjugadas"), pp.
593-604. Academic Press, 1996).
Se ha demostrado que es necesario y útil
estabilizar las partículas metálicas coloidales revestidas con la
biomolécula mediante la adición de otras substancias apropiadas. La
adición de dichas substancias estabilizadoras y bloqueadoras produce
probablemente el efecto de que se bloquean sitios "cohesivos",
sobre las partículas no saturadas. Además, mediante estas
substancias la agregación de partículas se minimiza y la redifusión
de la pertinente biomolécula, se reduce.
Estabilizadores del estado actual de la técnica
son entre otros, proteínas inertes como por ejemplo albúmina de
suero bovino o polímeros técnicos solubles en agua como el
polietilenglicol (peso molecular de 20.000 D),
polivinil-pirrolidona, alcohol polivinílico, sulfato
de polivinilo, dextrano así como gelatina (ver p. ej., De Mey,
supra; Beesly, J.E., Colloidal Gold: A New Perspective for
Cytochemical Marking, Microscopy Handbooks ("Oro coloidal: Una
nueva perspectiva para el marcado citoquímico, Manuales de
Microscopía") 17, Oxford University Press, 1989, en particular
pp. 1-14; Behnke, Eur. J. Cell., Biol..41 (1986),
pp. 326-338; DE 2420531 C3; Meisel et al. J.
Phys. Chem. 85 (1981), pp. 179-187).
Sin embargo, el revestimiento directo de
biomoléculas sobre la superficie de partículas metálicas coloidales
tiene también algunas desventajas importantes. Una de estas
desventajas es por ejemplo que los métodos con éxito no pueden
transferirse fácilmente desde una biomolécula a una segunda y que la
estabilidad de estas partículas ha demostrado ser problemática (ver
de Mey, supra, p. 116 y pp. 122-123).
Para evitar estos problemas del antiguo estado de
la técnica, se han desarrollado algunos nuevos métodos en los
últimos años. En particular, deben mencionarse aquí las partículas
así llamadas, "núcleo-cubierta". Las partículas
núcleo-cubierta consisten (normalmente) en un núcleo
de metal y de una cubierta que envuelve la partícula completamente.
Ejemplos importantes de tales substancias de la cubierta son por
ejemplo la BSA (albúmina de suero bovino) descrita en EP 258 963 y
EP 428 412, proteínas desnaturalizadas como por ejemplo, la
gelatina, polímeros solubles en agua, como p. ej., el aminodextrano
(patente US 5.248.772) o cubiertas obtenidas con compuestos de tiol
de bajo peso molecular o proteínas tiolizadas (patente EP 489
465).
Para estabilizar la cubierta, las substancias de
la cubierta están habitualmente reticuladas (p. ej., patente US
5.248.772). Estas cubiertas contienen grupos funcionales a los
cuales pueden unirse las biomoléculas deseadas de forma covalente
como ya es generalmente conocido.
La copulación covalente de las biomoléculas a las
partículas núcleo-cubierta tiene algunas ventajas
sobre la unión directa por adsorción a la superficie coloidal.
Mediante la copulación covalente, puede ser evitada la sangría de
las biomoleculas. Además, se paralizan con ella las interacciones no
específicas provocadas por las áreas libres restantes de la
superficie, inaccesibles para la adsorción durante el procedimiento
de carga por adsorción. Un tratamiento posterior de la superficie
añadiendo estabilizadores no es necesario con las partículas
núcleo-cubierta. Mediante el empleo de una cubierta
hidrofílica bien soluble, la estabilidad de los conjugados
núcleo-cubierta-proteína puede ser
notablemente aumentada. Puede evitarse así, la inestabilidad
ocasionada por la agregación de los conjugados, como se observa
repetidamente con los conjugados de proteína coloidales cargados por
adsorción. Además, la copulación covalente de las proteínas a las
partículas de núcleo-cubierta es independiente en
gran medida de las propiedades fisicoquímicas de las proteínas de
forma que incluso pueden emplearse proteínas que no son adecuadas
para una unión por
adsorción.
adsorción.
Las substancias de la cubierta empleadas por el
estado actual de la técnica, se adsorben a la superficie metálica
mediante complejos mecanismos hasta ahora no explicados
completamente, los cuales implican interacciones electrostáticas así
como también hidrofóbicas. El tipo de substancia de la cubierta
determina qué clase de unión prevalece cuando las substancias de la
cubierta se unen a las partículas coloidales del metal.
Las interacciones de los metales, en particular
oro, con compuestos que contienen azufre conducen a una unión por
adsorción reforzada. La patente EP 369 515 describe el revestimiento
de partículas coloidales de oro con compuestos de bajo peso
molecular que contienen tiol. Mediante grupos funcionales
adicionales las pertinentes biomoléculas pueden unirse a esta
cubierta de tiol.
Es también sabido según el estado actual de la
técnica que los aminodextranos químicamente reticulados pueden
emplearse como substancia de la cubierta (patente US 5.248.772). El
reticulado del aminodextrano es necesario para dar suficiente
estabilidad a las partículas obtenidas de esta manera. Otra
desventaja del método descrito en la patente US 5.248 772 es que los
grupos SH adecuados para la copulación deben ser insertados después
en la cubierta de aminodextrano reticulado. Este procedimiento
requiere varios pasos adicionales de trabajo. Además, la proporción
de inserción de grupos SH puede solamente ser controlada con menos
exactitud y el análisis de la eficiencia de la inserción es casi
imposible.
En el actual estado de la técnica no se conoce
ninguna partícula núcleo-cubierta basada en
aminodextrano, que pueda obtenerse fácilmente, rápidamente y sin
altos costes y que no necesitan ningún paso de tratamiento más, como
por ejemplo la reticulación de la cubierta de aminodextrano o la
subsiguiente inserción de grupos funcionales (p. ej., para la
química de la copulación a base de SH).
Existía por lo tanto el objetivo de proporcionar
partículas núcleo-cubierta perfeccionadas, evitando
al máximo posible las desventajas del estado de la técnica.
Este objeto se logra con la invención definida
con más detalle en las reivindicaciones.
La presente invención proporciona partículas
coloidales de metal con una cubierta de SH-dextrano
ó SH-aminodextrano que puede obtenerse fácil y
reproduciblemente y que tiene muchas ventajas cuando de emplea,
especialmente en inmunoensayos. La invención se refiere en
particular a partículas coloidales de metal con una cubierta
envolviendo estas partículas de metal (partículas metálicas
núcleo-cubierta), en donde esta cubierta consiste en
dextrano o aminodextrano no reticulado, y ambos llevan grupos
SH.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
1
En las condiciones de almacenamiento escogidas
(aproximadamente 7 meses a 4ºC) las analíticas UV/Vis muestran que
las curvas de ambas partidas de conjugados indican un cambio notable
en la forma de la curva antes y después del esfuerzo. Esto significa
que los conjugados ensayados han sufrido fuertes cambios debido a su
almacenamiento a 4ºC durante aproximadamente 7 meses. En otras
palabras, estos conjugados no son estables en las condiciones
del
ensayo.
ensayo.
Figura
2
La forma de la curva casi idéntica de ambas
preparaciones antes y después del esfuerzo en el análisis UV/Vis
demuestra que ambas partidas obtenidas de acuerdo con la invención
muestran el mismo comportamiento a las condiciones de almacenamiento
escogidas (aproximadamente 7 meses a 4ºC) y que no ha ocurrido
ningún cambio. Esto significa que los conjugados son estables en las
condiciones del ensayo.
\newpage
Figura
3
Un anticuerpo monoclonal (MAB) se unió a las
partículas de oro coloidal obtenidas de acuerdo con la invención.
Además, un conjugado MAB-oro se obtuvo de acuerdo
con los métodos del estado actual de la técnica. Ambos conjugados
se evaluaron por medio de un análisis de remisión. Un valor bajo de
la remisión se identifica con una sensibilidad mejorada del
conjugado en el ensayo.
Lo siguiente describe la invención con
detalle:
Los términos partículas coloidales
núcleo-cubierta o partículas coloidales de metal con
una cubierta, se aplican de aquí en adelante para describir
partículas con un núcleo de metal, y una cubierta/recubrimiento
consistente en uno o varios componentes no metálicos.
Como partículas de núcleo metálico pueden entrar
en consideración todas las partículas coloidales metálicas
obtenibles de acuerdo con los métodos del estado actual de la
técnica. De preferencia, los metales más indicados son los metales
nobles, en particular el oro o plata siendo el oro particularmente
preferido.
Los dextranos pertenecen al grupo de los
polisacáridos ya conocidos por el experto. De preferencia, se
emplean las moléculas con pesos moleculares de 5000 a 2 millones de
D, de preferencia de 20000 a 1 millón de D, y con particular
preferencia de 30000 a 100000 D.
En los dextranos o aminodextranos que se
encuentran comercialmente, están insertados grupos SH; los
aminodextranos son en este caso, particularmente preferidos. La
inserción de grupos SH es una reacción química de por ejemplo ácidos
carboxílicos activados con grupos amino. Para reactivos de este tipo
son preferidos el éster N-hidroxisuccinimida del
ácido S-acetil-tiopropionilo (SATP),
el
N-succinimidil-S-acetiltioacetato
(SATA) ó el anhídrido
S-acetil-mercapto-succínico
(SAMBA). La activación de los grupos OH de los dextranos se inicia
por ejemplo mediante el
1-ciano-4-(dimetilamino)-piridinio
tetrafluorborato (CDAP), y la inserción de grupos SH mediante la
subsiguiente adición de aminotioles protegidos por SH (p. ej.,
S-acetil cisteamina).
Cuando se emplea el SATP para la inserción de
grupos SH en el aminodextrano, la parte mayor de los grupos amino
debería ser convertida. Los grupos SH son a continuación liberados
por adición de hidroxilamina. Particularmente ventajosos son los
SH-aminodextranos con grupos amino convertidos en
una extensión de por lo menos el 70%, con particular preferencia el
80% y con muy particular preferencia el 90%, los cuales llevan una
funcionalidad SH.
La activación del aminodextrano por medio del
SATP puede efectuarse en condiciones muy variadas con valores
preferidos del pH de 7,5 a 9,0 y temperaturas de 4ºC ó temperatura
ambiente y períodos de 2 a 24 horas. Se ha demostrado que es
particularmente adecuado trabajar con un pH de 8,5 a temperatura
ambiente, y fijar un tiempo de reacción de aproximadamente 3 horas.
La liberación de los grupos SH, por ejemplo añadiendo hidroxilamina,
se efectúa con particular preferencia en condiciones de pH
débilmente ácidas, con particular preferencia a un pH de 6,0 a
6,5.
A continuación, se menciona el
SH-aminodextrano o amino-dextrano
con grupos SH activos o aminodextrano con SH activados. Este incluye
generalmente SH-aminodextranos o
SH-dextranos, que pueden obtenerse por ejemplo de
acuerdo con los métodos descritos más arriba.
En el estado actual de la técnica (patente EP 489
465) se menciona explícitamente que para el revestimiento posterior,
la estabilización y provisión de grupos reactivos de moléculas de
cadena corta, deben emplearse p. ej., alquilotioles con una longitud
máxima de cadena de 24 átomos de carbono. Existen buenas razones
para que la longitud de cadena máxima esté ajustada en 24 átomos de
carbono en la patente EP 489 465. La razón para rechazar las
moléculas de cadena larga con más de 2 ó 3 grupos SH es evidente. El
experto en la especialidad ha tenido que asumir que las moléculas de
cadena larga como por ejemplo los SH-aminodextranos
no estabilizan las partículas de metal-sol sino que
conducen a su aglutinamiento.
Precisamente, estos aglomerados o pepitas de
muchas partículas de metal coloidal constituye el mayor problema en
el campo de la tecnología y conducen a inestabilidades y problemas
causados por una unión inespecífica.
Sorprendentemente, se ha observado sin embargo,
que los SH-aminodextranos son muy ventajosos cuando
se emplean para el post-revestimiento y
estabilización de las partículas metálicas coloidales. Este
post-tratamiento conduce a películas notablemente
estables de manera que el reticulado de los monómeros de
aminodextrano que se efectúa habitualmente (patente US 5.248.772) ya
no es necesario en absoluto. Obviamente, la unión a la superficie
metálica por medio de las funciones SH es tan estable que no es
necesario ni un adicional post revestimiento para la saturación de
los componentes de superficie "cohesivos" libres, ni un
reticulado de las moléculas de SH-aminodextrano,
para impedir la redifusión (sangrado de las uniones inestables de
moléculas). Un tema que constituye un objetivo de la invención es
por lo tanto el empleo de los SH-aminodextranos para
el revestimiento y estabilización de las partículas coloidales de
metal.
La invención se refiere a un método para la
obtención de partículas coloidales de metal con una cubierta de
SH-aminodextrano en donde las partículas coloidales
de metal y el aminodextrano SH-activado se incuban
en condiciones apropiadas. Sorprendentemente, las partículas
núcleo-cubierta de acuerdo con la invención son
fáciles de preparar. El simple mezclado de la solución de oro
coloidal y la solución de aminodextrano
SH-modificado con un pH controlado a temperatura
ambiente, provoca la formación de las partículas de
núcleo-cubierta de acuerdo con la invención. Las
partículas así resultantes se lavan solamente y ya pueden emplearse
para el copulado con moléculas de empalme o biomoléculas sin que sea
necesaria una estabilización por medio de reticulación.
El revestimiento del sol de oro producido de
acuerdo con el procedimiento estándar con
SH-aminodextrano, se realiza de preferencia en el
margen de pH 5,0 a 7,0, con particular preferencia entre pH 5,5 y pH
6,5. La temperatura de reacción y el tiempo de duración pueden ser
ampliamente variables pero se prefiere unos 4ºC ó la temperatura
ambiente durante 2 a 24 horas.
La invención se refiere especialmente a
partículas metálicas coloidales con una cubierta envolviendo estas
partículas de metal (partículas metálicas de
núcleo-cubierta), en donde la cubierta consiste en
un aminodextrano no reticulado, con grupos SH,.
Con particular preferencia estas partículas de
metal coloidal de acuerdo con la invención consisten en metales
nobles, en particular oro y plata, con particular preferencia el
oro.
No todos los grupos SH se bloquean con el
revestimiento y la interacción con la superficie de metal. Muchos
grupos SH no están sorprendentemente implicados en la interacción
con la superficie de metal. Estos grupos SH que son todavía
accesibles después de su recubrimiento, constituyen un sitio de
unión óptimo para otras moléculas, en particular, biomoléculas.
Así, se ha demostrado que es muy conveniente
emplear moléculas de empalme SH-reactivas homo o
heterobifuncionales, las cuales por una parte provocan una unión
covalente al grupo SH del SH-aminodextrano y por
otra parte, se unen también covalentemente a la biomolécula deseada
por medio de una funcionalidad específicamente escogida.
Funcionalidades preferidas en las biomoléculas que hay que copular
son por ejemplo los grupos -NH_{2} ó -SH.
Además, la invención se refiere a un método para
la obtención de conjugados que consisten en biomoléculas, en
particular, anticuerpos y partículas coloidales metálicas de
SH-aminodextrano.
La carga de las partículas con las biomoléculas
se efectúa en condiciones apropiadas de un tampón. Con particular
preferencia a un pH en el margen de 6,5 a 7,0, las biomoléculas
activadas con maleimida pueden ser copuladas mediante una unión
covalente a las partículas de oro cargadas con
SH-aminodextrano. La copulación de las biomoléculas
se efectúa de preferencia durante la noche, es decir, durante un
período de aproximadamente 10 a 30 horas a una temperatura que no es
crítica y puede ser aproximadamente 4ºC ó la temperatura ambiente.
Para el bloqueo de los grupos de maleimida reactiva todavía
presentes, se emplean reactivos tales como la tioglucosa o cisteína.
Los grupos SH se bloquean por adición de reactivos tales como la
yodo-acetamida,
N-metil-maleimida (NMM) o
N-etil-maleimida (NEM).
Como biomoléculas se consideran todas las
moléculas empleadas en los métodos de ensayo de diagnóstico
habituales. De acuerdo con la invención, éstas son de preferencia
los ácidos nucleicos, péptidos y proteínas. Otras biomoléculas como
por ejemplo haptenos, lípidos o polisacáridos tienen también un
efecto beneficioso cuando se emplean.
Son particularmente preferidas las biomoléculas
del grupo de las proteínas, en particular aquellas proteínas que
representan buenos socios de unión para otras biomoléculas, muy
particularmente preferidas son en este aspecto, las lectinas,
avidina, estreptavidina y los anticuerpos.
De acuerdo con la invención, el término
anticuerpo incluye también -al lado de las inmunoglobulinas
intactas- todos los fragmentos de anticuerpos. Estos son por ejemplo
los fragmentos Fab, Fab' de F(ab')_{2}. El término
anticuerpo sin el aditivo "monoclonal" o "policlonal"
incluye siempre tanto los distintos tipos de anticuerpos así como
las construcciones quiméricas y todos los fragmentos mencionados más
arriba.
La presente invención se refiere por lo tanto en
otra forma, a partículas de núcleo-cubierta con un
recubrimiento de SH-aminodextrano no reticulado al
cual se han unido otras moléculas por medio de los grupos SH del
SH-aminodextrano.
Para esta unión covalente o copulación de
biomoléculas es ventajoso emplear moléculas de empalme
SH-reactivas, es decir, moléculas con por lo menos
dos grupos adecuados para la copulación con por lo menos un grupo
reactivo, de preferencia grupos SH. La invención por lo tanto se
refiere también a partículas metálicas coloidales con un
revestimiento de SH-amino-dextrano
no reticulado que lleva moléculas de empalme
SH-reactivas. La presente invención incluye
particularmente partículas núcleo-cubierta a las
cuales se han copulado las biomoléculas. Aquí no es importante si la
copulación de las biomoléculas se hace directamente a las funciones
SH del SH-amino-dextrano o si se
emplean moléculas de empalme homo o heterobifuncionales para la
copulación. Las partículas núcleo-cubierta
copuladas a las biomoléculas se llaman también conjugados.
En una forma particularmente preferida, los
socios de unión para posteriores biomoléculas, particularmente
anticuerpos, se copulan a las partículas metálicas coloidales de
acuerdo con la invención.
Se ha observado que los conjugados de anticuerpos
de acuerdo con la invención, es decir, conjugados de partículas de
núcleos de oro-cubierta, con anticuerpos de acuerdo
con la invención, son ventajosos respecto a partículas análogas del
estado actual de la técnica. Cuando se compara la estabilidad al
almacenamiento de los conjugados
anticuerpo-partículas de oro, obtenidos con
partículas de oro de acuerdo con el estado actual de la técnica
(figura 1) ó respectivamente, empleando las partículas de
núcleo-cubierta de acuerdo con la invención (figura
2), está claro que los últimos mencionados son mucho más estables.
Juntamente con la sorprendente buena estabilidad, los conjugados de
acuerdo con la invención presentan un mejor comportamiento en los
sistemas de ensayo inmunológico. Los resultados con respecto a la
sensibilidad inmunológica de dos diferentes conjugados
anticuerpo-partículas de oro dados en la figura 3,
resultan de un llamado test rápido con el formato de una tira de
ensayo. De la figura 3 el experto puede inferir que el ensayo es
más sensible cuando se emplea el conjugado de acuerdo con la
invención.
Habitualmente, los ensayos rápidos hay que
entenderlos como sistemas de ensayo con cada uno o todos los
componentes reactivos del ensayo, impregnados sobre una estructura
soporte p. ej., en forma de una tira de ensayo de manera que para el
procedimiento de ensayo en sí mismo sea suficiente aplicar una
muestra fluida. Las moléculas del analito de la muestra reaccionan
con los reactivos de detección impregnados cuando el fluido de
muestra pasa a la tira de ensayo. En general, la tira de ensayo
incluye un equipo como zona de detección, p. ej., en forma de una
línea de un socio de unión específica íntimamente unido para unirse
a los complejos analito-reactivo de detección. La
intensidad de la señal en esta zona de detección puede determinarse
a continuación a simple vista o mediante instrumentos analíticos
apropiados. La amplia variedad de versiones de ensayo rápido ya es
conocida por el experto (p. ej., a partir de las patentes
EP-B-186 799 ó
EP-A-299 428).
Los conjugados de acuerdo con la invención pueden
así por ejemplo emplearse en un ensayo rápido para la detección de
anticuerpos anti-HIV.
Los resultados de la evaluación cuantitativa de
la tira de ensayo por medio de la medición por remisión mediante un
cromómetro mostró que los conjugados obtenidos de acuerdo con la
invención tenían señales significativamente mayores que otras tiras
de ensayo comparables con conjugados cargados por adsorción. Por
comparación, la figura 3 muestra una serie de diluciones de una
muestra de HIV positiva para ambos conjugados. Una remisión más
pequeña es sinónimo de una sensibilidad más alta con respecto a la
concentración de la serie medida. Para el rendimiento de la tira de
ensayo esto es una notable ventaja.
El empleo de conjugados de acuerdo con la
invención que consisten en biomoléculas, en particular anticuerpos y
partículas coloidales de
metal-SH-aminodextrano en sistemas
de ensayo como un marcador o reactivo de detección, especialmente en
procedimientos de ensayo inmunológico y con particular preferencia
en los llamados ensayos rápidos, es por lo tanto otra versión
particularmente preferida de la presente invención.
El empleo de los conjugados de acuerdo con la
invención es posible en todos los procedimientos de ensayo
inmunológico usuales conocidos por el experto. En todos los ensayos
inmunológicos conocidos el análisis es especialmente detectado
directamente o indirectamente en una muestra por medio de la unión a
uno o varios socios de unión inmunológica. Los formatos habituales
de ensayo, por ejemplo procedimientos de ensayo heterogéneos u
homogéneos son conocidos por el experto y no necesitan aquí más
explicaciones.
Otro tema objeto de la invención es por lo tanto
un procedimiento, en particular un procedimiento inmunológico, para
la detección de un analito en una muestra en donde los conjugados de
las partículas de núcleo-cubierta de acuerdo con la
invención, se emplean juntamente con biomoléculas como un marcador o
un reactivo de detección.
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\vskip1.000000\baselineskip
5 g de aminodextrano con un peso molecular de
aproximadamente 40.000 y una concentración de aproximadamente 30
grupos amino por molécula, se disuelven en 200 ml de tampón de
fosfato de pH 8,5. Se disuelven 1,225 g de SAPT en 62 ml de DMSO y
se añaden a la solución del aminodextrano. La mezcla se agita a
temperatura ambiente durante 3 horas y a continuación se dializa. La
liberación de los grupos SH se logra mediante la adición de 694 mg
de hidroxilamina disueltos en 2 ml de agua. El pH se ajusta a 6,0 y
después de una hora se dializa frente a tampón de fosfato de pH
6,0.
\newpage
400 ml de un sol de oro obtenido de acuerdo con
el estado actual de la técnica, con una concentración de 400 OD, se
ajusta a un pH de 5,6. Seguidamente, se añaden 400 \mug de
SH-aminodextrano obtenido de acuerdo con el ejemplo
1, a 10 mM de acetato de K de pH 5,6 y se agita durante 2 horas.
18 mg de inmunoglobulina de un anticuerpo
monoclonal de ratón, contra digoxigenina (MABM-IgG)
se disuelven en 1 ml de tampón de fosfato de pH 7. Se disuelven 6,9
mg de MHS en 690 \mul de DMSO. Seguidamente se mezclan 330 \mul
de la solución del anticuerpo con 10 \mul de la solución de MHS y
se agitan a 4ºC durante 2 horas. A continuación, se efectúa la
diálisis durante la noche.
360 OD de oro SH-aminodextrano se
ajustan a pH 6,6. Seguidamente, se añaden 720 \mug del anticuerpo
modificado con MH, disueltos en 40 ml de acetato/tampón Tris de pH
6,6, el pH se ajusta a 7,0 y la mezcla se agita a 4ºC durante la
noche. El exceso de grupos SH y maleimida que no han reaccionado
completamente, se paraliza a continuación añadiendo tioglucosa y
yodo-acetamida. Seguidamente se añaden 400 mg de
albúmina de suero bovino y el pH se ajusta a 7,8.
La solución del anticuerpo que hay que cargar, se
dializa contra el tampón de carga apropiado (p. ej., Tris, pH 8,0).
Posiblemente, los agregados existentes se eliminan por filtración.
El valor del pH de la solución sol de oro se ajusta al pH de la
solución de proteína. La solución del anticuerpo (10 \mug de
proteína/oro OD) se añade a la solución de sol de oro y se incuba
durante 2 horas. Seguidamente se satura añadiendo un 10% de solución
de BSA (concentración final de aproximadamente 1% de BSA). La
purificación del conjugado se logra por diálisis.
Se almacenan conjugados
MABM-IgG-aminodextrano-SH
así como también conjugados de MABM-IgG y partículas
de sol de oro a partir del estado actual de la técnica, a 4ºC
durante 7 meses. Durante el período observado, los conjugados de
acuerdo con la invención permanecen invariables en cuanto a su
espectro UV/Vis. Los conjugados cargados por adsorción exhiben sin
embargo un espectro cambiado, de acuerdo con una amplia distribución
por tamaño de partícula (ver figuras 1 + 2).
Los conjugados descritos
MABM-IgG-aminodextrano-SH
se evaluaron en un ensayo con el anticuerpo anti HIV y se compararon
con un conjugado cargado por adsorción.
El formato del ensayo recibe el nombre de ensayo
en seco con tiras de ensayo con socios de reacción específicos del
HIV (dioxigenados) secados sobre una lámina de soporte. El conjugado
MABM-IgG-oro se seca en una lámina
de soporte separada.
Mediante la aplicación de la muestra de líquido
(p. ej., suero, plasma) los reactivos secos y los socios de la
reacción se resolubilizan, reaccionan con los anticuerpos
específicos del HIV que hay que detectar a partir de la muestra y se
indican en un campo de detección separado mediante el color rojo del
conjugado de oro.
Claims (12)
1. Partículas de metal coloidales con una
cubierta que envuelve dichas partículas de metal (partículas
metálicas núcleo-cubierta) en donde la cubierta
consiste en un dextrano o aminodextrano no reticulado, llevando
ambos, grupos SH.
2. Partículas de metal
núcleo-cubierta, como se ha reivindicado en la
reivindicación 1, en donde las partículas son partículas de metal
noble.
3. Partículas de metal
núcleo-cubierta, como se ha reivindicado en la
reivindicación 1 ó 2, en donde otras moléculas están unidas a las
partículas de metal por medio de grupos SH.
4. Partículas de metal
núcleo-cubierta, como se ha reivindicado en la
reivindicación 3, en donde dichas otras moléculas son moléculas de
empalme con los SH reactivos.
5. Partículas de metal
núcleo-cubierta, como se ha reivindicado en la
reivindicación 4, en donde a las moléculas de empalme están
copuladas biomoléculas.
6. Partículas de metal
núcleo-cubierta, como se ha reivindicado en la
reivindicación 1 ó 2, en donde las biomoléculas están directamente
copuladas a las funciones SH.
7. Partículas de metal
núcleo-cubierta, como se ha reivindicado en la
reivindicación 5 ó 6, en donde las biomoléculas son anticuerpos.
8. Empleo de partículas de metal coloidales como
se ha reivindicado en una de las reivindicaciones precedentes, como
un marcador o reactivo de detección en procedimientos de análisis
inmunológico.
9. Empleo de partículas coloidales como se ha
reivindicado en una de las reivindicaciones precedentes, como
reactivo de detección en ensayos rápidos.
10. Método de obtención de partículas de metal
coloidales con una cubierta que contiene funciones SH activas, en
donde para el recubrimiento de estas partículas de metal coloidales
se emplea aminodextrano no reticulado en el cual están insertados
grupos SH.
11. Empleo de SH-aminodextrano no
reticulado para el revestimiento posterior o estabilización de
partículas de metal coloidales.
12. Método para la detección de un analito en una
muestra, en donde para la detección del analito se emplea un
producto de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 7.
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