ES2251735T3

ES2251735T3 - Ciclacion de cofactor enzimatico utilizando piridina nucleotido transhidrogenasa soluble.

Info

Publication number: ES2251735T3
Application number: ES97910540T
Authority: ES
Inventors: Neil Charles University of Cambridge BRUCE; Christopher University of Cambridge FRENCH
Original assignee: Cambridge University Technical Services Ltd CUTS
Current assignee: Cambridge University Technical Services Ltd CUTS
Priority date: 1996-10-29
Filing date: 1997-10-29
Publication date: 2006-05-01
Anticipated expiration: 2017-10-29
Also published as: CA2269640A1; EP0939799A1; DE69734669D1; JP2001502910A; GB9622516D0; AU4788897A; DE69734669T2; CA2269640C; WO1998018909A1; EP0939799B1; AU709463B2; US6440688B1; ATE310079T1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA REACCION ENZIMATICA QUE IMPLICA UN COFACTOR DE UN NUCLEOTIDO PIRIDINICO, EN LA CUAL SE EMPLEA UNA ENZIMA QUE PRESENTA UNA SECUENCIA QUE TIENE UNA IDENTIDAD CON LA SECUENCIA SEQ ID NO:2, SUPERIOR AL 70 %, Y QUE ES CAPAZ DE TRANSFERIR EQUIVALENTES REDUCTORES ENTRE LOS COFACTORES DE NUCLEOTIDO PIRIDINICO. ALTERNATIVAMENTE, SE PUEDE UTILIZAR UNA CELULA TRANSFORMADA PARA EXPRESAR DICHA ENZIMA.

Description

Ciclación de cofactor enzimático utilizando piridina nucleótido transhidrogenasa soluble.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la utilización de una enzima para la oxidación o reducción de cofactores de piridina nucleótido durante las reacciones enzimáticas in vivo o in vitro, por ejemplo en las biotransformaciones enzimáticas o de toda la célula o en técnicas analíticas enzimáticas.

Antecedentes de la invención

Los procedimientos de biotransformación que utilizan microorganismos naturales o genéticamente modificados o enzimas aisladas proporcionan métodos de síntesis de muchos productos útiles. Las biotransformaciones presentan varias ventajas con respecto a los métodos de síntesis química, en particular la regioespecificidad y la estereoespecificidad de las reacciones catalizadas por enzimas, la utilización de condiciones de reacción suaves y la ausencia de requisitos para disolventes tóxicos.

Con frecuencia las enzimas óxidoreductasas requieren cofactores activos por redox para su actividad. Entre los cofactores más frecuentes están los cofactores de piridina nucleótido dinucleótido dicotinamida adenina (NAD: forma oxidada NAD^{+}, forma reducida NADH) y fosfato de dinucleótido dicotinamida adenina (NADP: forma oxidada NADP^{+}, forma reducida NADPH). Estos cofactores son costosos y, excepto en los casos de productos sumamente valiosos, no pueden suministrarse de manera factible en cantidades estequiométricas. Este es un factor que limita la utilización de muchas enzimas oxidoreductasas para las reacciones de biotransformación.

El requisito para los cofactores en un proceso de biotransformación puede reducirse proporcionando medios de regeneración de la forma deseada del cofactor. Esto significa que el cofactor necesita suministrarse solamente en cantidades catalíticas. Por ejemplo, si la reacción de interés requiere NAD^{+}, que se reduce en la reacción a NADH, el NADH puede ser reoxidado por NAD^{+} mediante otro sistema enzimático, tal como fórmico deshidrogenasa dependiente de NAD^{+} en presencia de formato. Esto se denomina ciclación del cofactor. La fórmico deshidrogenasa es particularmente adecuada para esta finalidad, ya que la reacción que cataliza es esencialmente irreversible.

Una complicación más es que la mayoría de las enzimas que requieren NAD no pueden utilizar NADP como cofactor y viceversa. Por ejemplo, la fórmico deshidrogenasa no puede utilizarse para regenerar NADPH a partir de NADP^{+}.

Un caso especial es cuando un proceso de biotransformación requiere dos enzimas oxidoreductasas que requieren diferentes cofactores. Por ejemplo, un proceso de biotransformación recientemente propuesto para la conversión de morfina en el potente analgésico hidromorfona requiere la acción sucesiva de la morfina deshidrogenasa dependiente de NADP^{+} y la morfinona reductasa dependiente de NADH (French et al. (1995) Bio/Technology 13:674-676). En la primera reacción, la morfina se transforma en morfinona con reducción de NADP^{+} a NADPH, y en la segunda reacción la morfinona se convierte en hidromorfona con oxidación de NADH a NAD^{+}. Por consiguiente deben suministrarse ambos NADP^{+} y NADH. Una complicación adicional es que, en presencia del NADPH generado en la primera reacción, la morfina deshidrogenasa reduce el producto hidromorfona a un producto indeseable, dihidromorfina, con reoxidación de NADPH a NADP^{+}. Estas reacciones se presentan en la Figura 1A adjunta.

Las enzimas dependientes de piridina nucleótido pueden utilizarse asimismo en determinados procedimientos de ensayo enzimáticos, siendo determinada la cantidad del analito por el grado de oxidación o reducción del cofactor. La oxidación y reducción de NAD y NADP puede medirse por varios métodos; por ejemplo, espectrofotometría y fluorimetría. Sin embargo, los métodos excepcionalmente sensibles para la detección de la oxidación o reducción pueden únicamente estar disponibles para NAD o NADP, pero no para ambos. Por ejemplo, la oxidación de NADH a NAD^{+} puede detectarse con suma sensibilidad utilizando las enzimas gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y fosfoglicerocinasa (PGK) a fosforilato bifosfato de adenosina (ADP) a trifosfato de adenosina (ATP) en una reacción que depende de la presencia de NAD^{+} y a continuación detectando el ATP resultante mediante la reacción emisora de luz que depende de ATP de la luciferasa de la luciérnaga. Este método no puede utilizarse para detectar la oxidación de NADPH a NADP^{+}, ya que la GAPDH disponible en el mercado es específica para NAD^{+}.

Varios de los problemas mencionados anteriormente pueden solventarse mediante la utilización de una enzima que transfiere equivalentes reductores entre NAD y NADP; por ejemplo, reduciendo NAD^{+} a NADH mientras que oxida NADPH a NADP^{+}. Dicha enzima es conocida como piridina nucleótido transhidrogenasa (PNTH). Varios tipos de enzima presentan esta actividad (Rydström et al. (1987) en "Pyridine nucleotide coenzymes: chemical, biochemical and medical aspects", parte B eds. Dolphin et al., John Wiley & Sons, NY, pág. 433-460). La que se conoce mejor es la PNTH que bombea protones, unida a la membrana que se encuentra en las membranas de los mitocondrias y en determinadas bacterias tales como Escherichia coli. Esta enzima, que está unida a la membrana, es generalmente inadecuada con fines de biotransformación y analíticos.

Por ejemplo, el documento EP-A-0733712 da a conocer que los organismos que expresan a PNTH pueden utilizarse como biocatalizadores. La enzima expresada está unida a la membrana y necesita una fuente de energía.

Arch. Biochem. Biophys. (1996) 176; 136-143, da a conocer PNTH de Pseudomonas aeruginosa. Esta enzima PNTH soluble y unida sin energía ha sido caracterizada con algún detalle, pero su utilidad es limitada.

Sumario de la invención

El gen (denominado sth) que codifica la transhidrogenasa soluble de NCIMB 9815 de Pseudomonas fluorescens se ha clonado y secuenciado y la enzima se ha sobrexpresado en Escherichia coli. Esto permite la preparación de grandes cantidades de enzimas de manera relativamente fácil. La enzima se ha purificado y caracterizado. Esta enzima está definida por la reacción que cataliza, es decir, la transferencia de equivalentes reductores entre NAD y NADP o los análogos de estos cofactores; la secuencia del nucleótido del gen estructural, sth, que codifica la enzima, y la secuencia de aminoácidos deducida de la enzima procedente de ésta; las propiedades estructurales de la enzima, incluyendo una subunidad M_{r} de aproximadamente 50.000; y la capacidad para formar grandes polímeros de M_{r} que sobrepasa 1.000.000.

Según un primer aspecto de la presente invención, se utiliza un microorganismo como catalizador, en el cual se transforma el microorganismo para expresar una enzima que presenta una secuencia con una identidad superior al 70% con la SEC. ID nº: 2 y que puede transferir equivalentes reductores entre los cofactores de piridina nucleó-
tido.

Un aspecto adicional de la presente invención consiste en un proceso en el que un sustrato se convierte en un producto por medio de una enzima y un cofactor de piridina nucleótido, que comprende la utilización de una enzima u organismo tal como se definió anteriormente.

Otro aspecto de la invención consiste en una molécula de nucleótido que presenta una secuencia con una identidad superior al 70% con la SEC. ID nº: 1, que codifica una enzima con actividad de la piridina nucleótido transhidrogenasa soluble. El gen puede utilizarse para la producción de la enzima o de una forma alterada de la enzima que utiliza un organismo modificado genéticamente. Por ejemplo, un organismo modificado genéticamente que lleva en gen sth como la totalidad o parte de un montaje heterólogo puede desarrollarse de tal modo que estimule la producción de la enzima, que a continuación puede recuperarse del medio de cultivo o de los extractos celulares. Los métodos para realizar esto son bien conocidos en la técnica.

Descripción de la invención

La invención puede ser utilizada por la enzima que presenta la secuencia mostrada en la SEC. ID nº: 2, o una secuencia de aminoácidos que tiene más del 70%, preferentemente por lo menos el 80%, y más preferentemente por lo menos el 90% de identidad. La enzima puede utilizarse como tal o como un microorganismo transformado. Los anfitriones adecuados para la transformación son bien conocidos por los expertos en la materia. Un ejemplo de anfitrión adecuado es E. coli.

Una enzima u organismo de la invención puede utilizarse en biotransformación, con fines analíticos o con cualquier otro fin apropiado. Es particularmente útil en relación con una reacción en la que una enzima utiliza un cofactor de piridina nucleótido. Un ejemplo específico se muestra en la Fig. 1B (para comparación con la Fig. 1A). La utilización de STH significa que la reducción de hidromorfona disminuye mucho, evitando el aumento de NADH. Esto elimina la necesidad de suministrar cofactores costosos. En la biotransformación, STH puede lanzar equivalentes reductores desde NADH a NAD^{-}, permitiendo que las células sean utilizadas en más de un proceso. Puede medirse una señal basada en la oxidación de NADH y NAD^{+}. La señal alterada puede ser detectada después mediante una técnica más sensible que no era aplicable con anterioridad.

El Ejemplo 1 siguiente ilustra la clonación y el secuenciado de sth, mientras que los Ejemplos 2 y 3 ilustran la utilización de STH según la invención. Los Ejemplos se proporcionan con referencia a la Fig. 1 (descrita anteriormente) y a otros dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 2 es una cartografía de restricción del fragmento Eco RI de 5,0 kb y el subclon Sac II/Xho I de 0,5 kb que lleva el gen sth. El área sombreada indica la zona de codificación y las flechas indican las reacciones de secuenciado.

La Figura 3 presenta la transformación de morfina en hidromorfona en presencia de transhidrogenasa soluble. Los cuadrados, morfina; los círculos, hidromorfona; los triángulos, dihidromorfina.

La Figura 4 presenta las biotransformaciones consecutivas de la morfina con células JM109/pMORB3-
AmutMC80S/pPNT4 de E. coli y JM109/pMORB3-AmutMC80S de E. coli (OC = concentración de opioides (mM), \Box = morfina, \bullet = hidromorfona y \blacktriangle = dihidromorfina).

Ejemplo 1

El dinucleótido de tionicotinamida adenina (tNAD^{+}) y 2',5'-difosfato de adenosina agarosa se adquirieron en Sigma (Poole, Dorset, UK). Otros reactivos eran de calidad analítica o superior y se obtuvieron en Sigma o Aldrich (Gillingham, Dorset, UK).

NCIMB9815 de Pseudomonas fluorescens se adquirió en la National Collection of Industrial and Marine Bacteria (Aberdeen, Escocia, UK). JM109 de Escherichia coli se adquirió en Promega (Southampton, UK). Ambos organismos se cultivaron de forma rutinaria en medio SOD (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY) a 30ºC (P. fluorescens) o 37ºC (E. coli) con agitación rotativa a 180 rpm.

Se analizó de manera rutinaria la actividad de STH observando la reducción del dinucleótico de tionicotinamida adenina (tNAD^{+}), análogo de NAD^{+} con características espectrales alteradas, a 400 nm en una mezcla de reacción constituida por tNAD^{+} 0,1 mM y NADPH 0,1 mM en tampón de fosfato 50 mM, pH 7,0, a 30ºC. Se definió una unidad (U) de actividad enzimática como la cantidad de actividad que reduce 1 mmol de tNAD^{+} por minuto en estas condiciones. El cambio molar de absorbancia a 400 nm de tNAD^{+} en la reducción a tNADH se asumió como
11.300 l.mol^{-1} cm^{-1} (Cohen et al. (1970) J. Biol. Chem. 245:2825-2836). Se analizó de forma rutinaria la concentración de proteínas utilizando el reactivo de Pierce (Rockford, IL, USA) según el protocolo del fabricante. Se utilizó albúmina de suero bovino como patrón. Se calculó la actividad específica en unidades de actividad de STH por mg de proteína (U/mg).

Se adquirió pBluescript SK+, vector de clonación patrón, en Stratagene (Cambridge, Cambs., UK). polisacárido IEMBL, vector de bajo número de copias, está descrito en Poustka et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4129-4133. Se realizaron la transferencia Southern y la manipulación del ADN utilizando técnicas normalizadas (Sambrook et al., supra).

Purificación de STH: Se purificó piridina nucleótido transhidrogenasa soluble (STH) a partir de las células
NCIMB9815 de P. fluorescens según una modificación del método de Höjeberg et al. (1976) Eur. J. Biochem. 66:467-475. Se cultivaron las células en esta fase estacionaria en 1 l de medio SOB. Se recogieron las células por centrifugación (5.000 g, 15 min) y se volvieron a poner en suspensión en 20 ml de tampón A (Tris/HCl 50 mM, pH 7,0, con ditiotreitol 2 mM). A continuación se destruyeron las células mediante tratamiento con ultrasonidos (25 detonaciones de 5 s a 12 \mum separadas por pausas de 30 s para refrigeración en un baño de agua con hielo) utilizando un MSE Soniprep 150. Se eliminó el residuo celular por centrifugación (25.000 g, 10 min). El extracto contenía 93 unidades de actividad de STH a una actividad específica de 0,19 U/mg.

Se purificó STH utilizando una columna de 1 cm de diámetro interno rellena con 6 ml de 2',5'-difosfato de adenosina agarosa (altura de relleno 7,6 cm). Se operó la columna a 12 ml/h durante la carga y a 24 ml/h durante el lavado. Todos los procedimientos se realizaron a 4ºC y todos los tampones contenían ditiotreitol 2 mM. Después del equilibrado de la columna con CaCl_{2} 5 mM en tampón A, se cargó en la columna extracto en bruto (20 ml), al que se había añadido CaCl_{2} hasta una concentración final de 5 mM. Se lavó la columna a continuación con 90 ml de NaCl
0,4 M, CaCl_{2} 5 mM en tampón A, seguido de 24 ml de NaCl 0,7 M, CaCl_{2} 5 mM en tampón A. En dirección inversa se eluyó con Tris/HCl 50 mM, pH 8,9, que contenía NaCl 0,4 M. Se recogieron las fracciones de 5 ml y se agruparon las fracciones activas. El producto agrupado se concentró por ultrafiltración utilizando una celda de ultrafiltración Amicon 8050 dotada de una membrana de corte M_{r} nominal 10.000 y a continuación se diafiltró con tampón A para reducir el pH y la concentración salina. El volumen final fue de 1,5 ml. Este material contenía 62 U de actividad de STH a una actividad específica de 140 U/mg.

Este producto se aplicó a continuación a una columna de filtración en gel de 1,6 cm de diámetro interno rellena con 150 ml de Sephacryl S-300 (Pharmacia) (75 cm de altura de relleno) equilibrada con tampón A. Esta columna se operó a 8 ml/h. Se recogieron las fracciones de 2 ml. Se agruparon las fracciones activas (16 ml) y se concentraron por ultrafiltración tal como se describió anteriormente hasta un volumen final de 1 ml. El producto contenía 26 U de actividad de STH a una actividad específica de 310 U/mg.

Antes del análisis por SDS-PAGE se concentró más la muestra mediante liofilización y resuspensión en un pequeño volumen de tampón A. El material redisuelto no era activo. SDS-PAGE presentaba una sola banda de proteínas con un M_{r} aparente de 55.000, conforme con el valor descrito para la enzima procedente de Pseudomonas aeruginosa (Rydström et al., supra).

Clonación: Se transfirió la proteína desde un gel SDS-PAGE a una membrana de poli(difloruro de vinilideno) (PVDF) (ProBlott, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) utilizando el sistema de transferencia semiseco
PhastTransfer (Pharmacia, St. Albans, Herts, UK) según las instrucciones del fabricante.

Se determinó la secuencia N-terminal por degradación automática de Edman. La secuencia N-terminal de la PNTH purificada se determinó como:

A-V-Y-N-Y-D-V-V-V-L-G-S-(G/V)-P-A-G-E-(G/V)-A-A-M-N-A-A-(R/D)- en la que los paréntesis indican asignaciones dudosas.

Se obtuvo como resultado una tabla de sesgo del codón para P. fluorescens basada en 20 genes en la base de datos del gen EMBL. Esto puso de manifiesto una preferencia significativa para G y C en la tercera posición de la mayoría de los codones. Basándose en este sesgo del codón, se diseñó el oligonucleótido degenerado siguiente:
AC-(C/G)AC-(C/G)AC-GTC-GTA-GTT-GTA-(C/G)AC-(G/C)GC (basándose en los restos 1 a 9 de la secuencia
N-terminal).

Las transferencias Southern del ADN genómico de NCIMB9185 de P. fluorescens demostraron que este oligonucleótido se liga más fuertemente a un fragmento Eco RI de 5,0 kb. Se preparó un banco de fragmentos Eco RI de 4 a 5 kb en el vector de clonación pBluescript SK+ utilizando JM109 de E. coli como anfitrión y las células recombinantes se identificaron por transferencia de colonias utilizando la sonda de oligonucleótido. Se aislaron varias colonias positivas y se observó que todas llevaban la misma inserción de 5,0 kb. Se recuperaron ambas orientaciones de la inserción. Los plásmidos recombinantes se denominaron pSTH1A y pSTH1B, variando únicamente en la orientación de la inserción Eco RI. Se localizó el gen sth por cartografía de restricción de la inserción seguido de análisis Southern utilizando la sonda de oligonucleótido. El secuenciado indicó la presencia de un marco de lectura abierto que codifica una proteína de la misma secuencia N-terminal que la determinada para STH. Se prepararon varios subclones en pBluescript SK+ y se secuenciaron utilizando cebadores basados en el vector como se presenta en la Figura 1. La secuencia de sth y la secuencia de STH de aminoácidos deducida se presenta como SEC. ID nº: 1 y nº 2.

Los extractos celulares preparados a partir de cultivos saturados de JM109/pSTHIA de E. coli o pSTHIB que presentaba actividad de STH detectable, se analizaron por reducción del dinucleótido de tionicotinamida adenina (tNDA^{+}) en presencia de NADPH. Se subclonó un fragmento Sac II/Xho I de 1,5 kb en pBluescript SK+ (Figura 2). Este plásmido se denominó pSTH2. En pSTH2, sth está en la orientación correcta para ser expresado en el activador lac de pBluescript SK+. Los extractos celulares de los cultivos saturados de JM109/pSTH2 de E. coli en ausencia o presencia de IPTG 0,4 mM presentaban actividad de transhidrogenasa de 4,1 U/mg y de 22,0 U/mg respectivamente. Basándose en la actividad específica de la STH purificada, se estimó que en el último caso STH formó aproximadamente 6% de proteína celular soluble, aproximadamente 100 veces el nivel observado en P. fluorescens.

Se purificó la STH recombinante hasta homogeneidad aparente en una sola etapa de cromatografía por afinidad utilizando 2',5'-difosfato de adenosina agarosa. Se preparó el extracto celular tal como se describió anteriormente a partir de 1 l de cultivo saturado de JM109/pSTH2 de E. coli cultivado en presencia de IPTG 0,4 mM. De los 25 ml resultantes de extracto celular, se cargaron 5 ml, que contenían 2140 U de actividad de STH a una actividad específica de 27 U/mg en una columna rellena con 2',5'-difosfato de adenosina agarosa tal como se describió anteriormente. Se lavó la columna a continuación con 35 ml de NaCl 0,7 M, CaCl_{2} 5 mM en tampón A. La STH se eluyó a continuación con NaCl 0,4 M Tris/HCl 50 mM, pH 8,9. Las fracciones más activas, que totalizaban 13 ml, se agruparon, se concentraron y se dializaron tal como se describió anteriormente, excepto que se utilizó una membrana de corte de peso molecular nominal 300.000. El producto contenía 900 U de actividad de STH a una actividad específica de 300 U/mg. Este material parecía ser homogéneo por SDS-PAGE; por consiguiente se omitó la etapa de filtración en gel. La STH purificada se almacenó a -20ºC en tampón A con ditiotreitol 2 mM, sin pérdida detectable de actividad durante varias semanas.

Se compararon las propiedades de la STH recombinante con las descritas para la enzima de Pseudomonas aeruginosa. La subunidad M_{r} determinada por SDS-PAGE es coherente con la descrita anteriormente (Rydström et al., supra). Para determinar si la enzima recombinante podía formar grandes polímeros, se adsorbieron las muestras en películas de carbono, teñidas negativamente con acetato de uranilo al 1% p/v y se examinaron por microscopía electrónica utilizando un microscopio electrónico Phillips CM100. Se observaron polímeros largos de aproximadamente 10 nm de diámetro y en exceso de 500 nm de longitud. Esto es coherente con los informes previos (Louie et al. (1972) J. Mol. Biol. 70:651-664).

Ejemplo 2

Se prepararon morfina deshidrogenasa y morfinona reductasa a partir de las cepas recombinantes de Escherichia coli según los procedimientos publicados (Willey et al. (1993) Biochem. J. 290:539-544; French y Bruce (1995) Biochem. J. 312:671-678). Se preparó STH a partir de NCIMB9815 de Pseudomonas fluorescens tal como se describió en el Ejemplo 1. Se analizaron cuantitativamente los alcaloides de morfina por HPLC (French et al., supra).

Se incubó a 4ºC durante 8 horas una mezcla de reacción constituida por 0,5 ml de tampón Tris/HCl 50 mM, pH 8,0, que contenía morfina 10 mM, NADPH 0,2 Mm, NAD^{+} 0,2 mM, ditiotreitol 1 mM, 1 unidad de morfinona reductasa, 1 unidad de morfina deshidrogenasa y 6 unidades de STH. Se tomaron a intervalos muestras de 50 \mul, se trataron con ácido acético para precipitar las proteínas y se analizaron por HPLC. La morfina se convirtió en hidromorfona con alto rendimiento, como se muestra en la Figura 3. Se realizó asimismo un experimento en paralelo con carencia de STH. En este caso, no tuvo lugar ninguna transformación de la morfina. Esto demuestra que STH es capaz de catalizar la ciclación de los cofactores en un proceso de biotransformación enzimática.

Ejemplo 3

Un fragmento Pst I de 1,2 kb que lleva un gen estructural (morA) completo de morfina deshidrogenasa mutante con su secuencia de unión al ribosoma corriente arriba y secuencias activadoras se ligó en el vector de bajo número de copias, pS IEMBL, digerido previamente con Pst I creando el montaje pMORA4mutMC80S, que contenía las secuencias de restricción adecuadas para la subclonación adicional. Un fragmento Hind@III/Eco RI de 1,2 kb que lleva el gen mutante morA, la secuencia de unión al ribosoma y la zona activadora se escindió de pMORA4mutMC80S y se ligó en pMORB3 digerido con HindIII/Eco RI (French et al, supra) que llevaba una sola copia de morB, gen estructural para morfinona reductasa, junto con su secuencia de unión al ribosoma y la zona activadora, creando el montaje pMORB3-AmutMC80S.

Un fragmento Pst I/Xho I de 1,5 kb que llevaba el gen estructural para la piridina nucleótido transhidrogenasa soluble se ligó en pS IEMBL, previamente digerido con Pst I y Sal I, creando el montaje pPNT4.

Las células JM109/pMORB3-AmutMC80S de E. coli y JM109/pMORB3-AmutMC80S/pPNT4 de E. coli se cultivaron en fase estacionaria y se recogieron por centrifugación a 17.310 x g durante 15 min a 4ºC. Se lavaron a continuación las células con Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) y se volvieron a centrifugar. Se eliminó el sobrenadante y los sedimentos celulares se almacenaron en hielo hasta que se necesitaron para su biotransformación. Los valores típicos para las actividades enzimáticas en las células JM109/pMORB3-AmutMC80S de E. coli fueron 0,06 U/mg para morfina deshidrogenasa y 0,88 U/mg para morfinona reductasa; mientras que los valores para las células de JM109/pMORB3-AmutMC80S/pPNT4 de E. coli fueron de 0,044 U/mg para morfina deshidrogenasa, 0,78 U/mg para morfinona reductasa y 0,72 U/mg para STH. Se realizaron biotransformaciones celulares completas a pequeña escala (volumen total de 3 ml) en las mezclas de reacción que contenían morfina 20 mM y una densidad celular final de 0,17 g/ml en Tris-HCl 50 mM (pH 7,5). Se realizaron biotransformaciones por duplicado a 30ºC en un agitador rotativo y se extrajeron muestras a intervalos regulares. Se clarificaron las muestras por centrifugación y se analizó el contenido en opioides utilizando HTLC tal como se describió anteriormente (French et al., supra). Se realizaron una serie de biotransformaciones consecutivas utilizando el mismo lote de células que se recogió y se lavó en las incubaciones. Los resultados ilustrados en la Figura 4 indican que las células que contienen STH recombinante podían utilizarse más de una vez durante el proceso de biotransformación, mientras que las células que carecen de STH recombinante solamente podían utilizarse una vez. Estos resultados dan a entender que la STH recombinante puede ciclar el cofactor en procesos enzimáticos in vivo dependientes de NADP y de NAD.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: CAMBRIDGE UNIVERSITY TECHNICAL SERVICES LTD.

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(B): CALLE: The Old Schools, Trinity Lane

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(C): CIUDAD: Cambridge

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(D): ESTADO: N/A

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(E): PAÍS: Reino Unido

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(F): CÓDIGO POSTAL: (ZIP): CB2 ITS

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: CICLACIÓN DE COFACTOR ENZIMÁTICO UTILIZANDO PIRIDINA NUCLEÓTIDO DESHIDROGENASA SOLUBLE

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv): FORMA DESCIFRABLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release nº 1.0. Versión nº 1.30 (EPO)

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(v): DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

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: NÚMERO DE SOLICITUD: WO (todavía desconocido)

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1660 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): NÚMERO DE CADENAS: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(iv): CADENA COMPLEMENTARIA: NO

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(ix): CARACTERÍSTICAS:

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(A): DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS

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(B): POSICIÓN: 209...1600

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:

1

2

3

4

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 464 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:

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5

6

7

Claims

1. Utilización de un microorganismo como biocatalizador, en la que el microorganismo se transforma para expresar una enzima que presenta una secuencia con una identidad superior al 70% con la SEC. ID nº: 2 y que es capaz de transferir equivalentes reductores entre los cofactores de piridina nucleótido.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que la identidad es por lo menos del 80%.

3. Utilización según la reivindicación 1, en la que la identidad es por lo menos del 90%.

4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima es piridina nucleótido transhidrogenasa soluble.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en un ensayo analítico basado en enzimas y que comprende además la medición de una señal basada en la oxidación de NADH a NAD.

6. Procedimiento en el que un sustrato se transforma en un producto mediante una enzima y un cofactor de piridina nucleótido, que comprende la utilización de una enzima o microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 4.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, que consiste en una biotransformación o un análisis.

8. Procedimiento según la reivindicación 6 ó 7, en el que el sustrato es morfina.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el cofactor se utiliza en una cantidad catalítica.

10. Molécula de nucleótido que presenta una secuencia con una identidad superior al 70% con la SEC. ID nº: 1, que codifica una enzima con actividad de la piridina nucleótido transhidrogenasa soluble.