ES2251760T3 - Cepas mutantes no patogenas de e. coli, su procedimiento de obtencion y sus usos. - Google Patents
Cepas mutantes no patogenas de e. coli, su procedimiento de obtencion y sus usos.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE CEPAS MUTANTES NO PATOGENAS DE E.COLI A PARTIR DE CEPAS PATOGENAS CAPACES DE INDUCIR SOBRE CELULAS EPITELIALES HELA UN EFECTO CITOPATICO QUE SE MANIFIESTA POR LA FORMACION DE CORDONES DE ACTINA POLIMERIZADA QUE ATRAVIESAN DE PARTE A PARTE DICHAS CELULAS Y POR UN AUMENTO DE LA CANTIDAD DE VINCULINA. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A LAS CEPAS MUTANTES NO PATOGENAS QUE PUEDEN OBTENERSE POR ESTE PROCEDIMIENTO, Y SU UTILIZACION EN VACUNAS.
Description
Cepas mutantes no patógenas de E. Coli, su
procedimiento de obtención y sus usos.
La invención se refiere a nuevos mutantes no
patógenos de E. Coli, utilizables en particular para la
obtención de vacunas que permiten la prevención de la colibacilosis
en el gazapo.
La colibacilosis es la principal causa de diarrea
en los gazapos destetados. Esta enfermedad es una causa importante
de mortalidad en las ganaderías, y se han emprendido investigaciones
con el fin de obtener una vacuna eficaz. Las principales estrategias
de vacunación desarrolladas hasta ahora recurren a cepas homólogas
inactivadas o a cepas heterólogas vivas no patógenas o poco
patógenas que inducen respuestas inmunitarias locales (inducciones
de inmunoglobulinas A anti-lipopolisacárido) y/o de
los efectos de barrera ecológica que se ejerce respecto de las cepas
0130 patógenas.
Sin embargo, ninguna de estas estrategias ha
desembocado hasta ahora en la obtención de una vacuna que confiere
una protección total y de una perfecta inocuidad. Se persiguen
investigaciones con el fin de identificar los mecanismos
responsables de la patogenicidad de algunas cepas de E.
Coli.
Cepas de E. Coli enteropatógenas (EPEC)
del hombre, que son responsables de diarreas infantiles, son capaces
de provocar la formación de lesiones específicas del epitelio
intestinal llamadas: lesiones de
fijación-destrucción''.
En las cepas EPEC humanas, se ha definido un
fenotipo de fijación-destrucción, correlacionado con
un ensayo in vitro sobre células epiteliales de línea Hela o
Hep-2: el ensayo FAS (por "Fluorescence Actin
Staining"). En este ensayo, las bacterias que se adhieren a las
células de una manera denominada localizada, provocan en los focos
de adhesión una concreción de actina polimerizada que es detectada
por la faloidina acoplada a un fluorocromo [KNUTTON et al.,
Infect. Immun. 57, p. 1290-1298, (1989). Los
principales determinantes de este fenotipo de
fijación-destrucción están codificados por un locus
denominado LEE ("Locus of Enterocyte Effacement") [Mc Daniel
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92, p.
1664-1668, (1995)].
Se ha observado que cepas de E. Coli
responsables de las diarreas de los gazapos pueden provocar lesiones
de fijación-destrucción similares a las provocadas
por las cepas EPEC humanas [LICOIS et al., Infect. Immun.
59, p. 3796-3800, (1991); MOON et al.,
Infect. Immun., 41, p.1340-1351, (1983); PEETERS
et al. Vet. Pathol. 22, p.54-59, (1985);
TAKEUCHI et al., Infect. Immun., 19, p.
686-694, (1978)]. Estas cepas EPEC de conejo se
denominan también REPEC (por "Rabbit EPEC") por algunos autores
[ROBINS-BROWNE et al., Infect. Immun. 62, p.
3329-3336, (1994); ROBINS-BROWNE
et al., Infect. Immun. 62, p. 1584-1592,
(1994)].
Se ha encontrado un homólogo del locus
cromosómico LEE de 35 kpb originariamente identificado en la cepa
EPEC prototipo de origen humano E2348/69, [KARAOLIS et al.,
en "Proceedings of the first International Rushmore Conference on
Mechanisms in Pathogenesis of Enteric Diseases". Rapid City,
S.D., (1995); Mc Daniel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92,
p. 1664-1668, (1995)] en la cepa REPEC de referencia
denominada RDEC-1 (serovar 015:H-), inicialmente
descrita por CANTEY y BLAKE [J. Infect. Dis. 135, p.
454-462, (1977)].
Una proteína de membrana externa de
95-100 kDa denominada intimina, codificada por un
gen denominado eaeA del locus LEE de las cepas EPEC humanas
participa en la formación de las lesiones de
fijación-destrucción [JERSE et al., Infect.
Immun. 59, p. 4302-4309, (1991)]. Se ha efectuado un
estudio relativo a la función del gen eaeA en el poder
patógeno por DONNENBERG et al., [J. Clin. Invest., 92. p.
1412-1417, (1993)]. La cepa E2348/69 ha sido
ensayada en 11 voluntarios que han recibido 2.10^{10} UFC por vía
oral. Otros once voluntarios han recibido la misma dosis de un
mutante eaeA isogénico. Los resultados demuestran la función
de eaeA en la virulencia, y por lo tanto indirectamente una
correlación entre lesiones A/E, FAS positivo y locus LEE (no
conocido entonces) con la virulencia, puesto que se consideraba
entonces que eaeA sólo estaba implicado en las lesiones A/E y
el fenotipo FAS positivo. Sin embargo, el poder patógeno residual
del mutante demuestra la intervención de genes de virulencia
distintos de eaeA.
Además, el gen eaeA está igualmente
presente en las cepas de E. Coli
no-enteropatógenas [CANTEY y moseley, Infect. Immun.
59, p. 3924-3929, (1991); [LEROY et al. J.
Med. Microbiol., 40, p. 90-94, (1993)].
Se ha identificado un análogo del gen eaeA
que codifica la intimina en las diferentes cepas de E. Coli
de conejo [AGIN y WOLF, en Proceedings of the First International
Rushmore Conference on Mechanism in the Patogénesis of Enteric
Diseases, Rapid City, SD. p. 43 (1995); LEROY et al. J. Med.
Microbiol. 40, p. 90-94, (1993); POHL et al.,
Infect. Immun., 61, p. 2203-2206, (1993)].
En Europa occidental, unos estudios
epidemiológicos han mostrado que las cepas responsables de las
diarreas durante el destete del conejo pertenecen a varios
serogrupos. Siendo el más frecuente 0130 [BLANCO et al.,
Vet. Microbiol., 38, p. 193-201, (1994); CANGUILHEM
y MILON, J. Clin. Microbiol. 27, p. 743-747,
(1989)].
Las cepas 0103, (que poseen, además, la
particularidad de no fermentar la ramosa), son muy patógenas en el
conejo después de la inoculación experimental por vía digestiva, y
producen lesiones de fijación-destrucción [LICOIS
et al., Infect. Immun. 59, p. 3796-3800,
(1991); POHL et al., Infect. Immun., 61, p.
2203-2206, (1993); ROBINS-BROWNE
et al., Infect. Immun., 62, p. 3329-3336,
(1994); ROBINS-BROWNE et al., Infect. Immun.
62, p. 1584-1592, (1994) de aspecto similar a las
observadas con las cepas EPEC de origen humana. Este criterio de
lesión, asociado al hecho de que el ADN cromosómico de estas cepas
se hibrida con sondas específicas del gen eaeA de la cepa
EPEC humana de referencia [LEROY et al., J. Med. Microbiol.,
40, p. 90-94, (1993); POHL et al., Infect.
Immun., 61, p. 2203-2206, (1993)] como en el caso
de la cepa RDEC-1, permitiría acercarlas a EPEC (o
REPEC). Sin embargo, no se ha evidenciado ninguna homología con los
genes del locus LEE distintos del gen eaeA en las cepas
0103.
Las cepas de E. Coli 0103 producen una
adhesina específica, denominada AF/R2, que permite que las bacterias
se adhieran a los enterocitos de conejo y a las células de línea
Hela y Hep-2 [MILON et al., Infect. Immun.
58, p. 2690-2696, (1990)].
Se ha demostrado que esta adhesina contribuía al
poder patógeno para el gazapo de las cepas 0103. Esta demostración
ha sido efectuada comparando el poder patógeno de una cepa
representativa del serogrupo 0103, denominada cepa B10, con el de
un mutante de esta cepa que ha perdido la propiedad de adhesión como
consecuencia de la inserción del transposón tn5::phoA en el
operón que codifica la adhesina AF/R2 [PILLIEN et al., Vet
Microbiol., 50, p. 105-115, (1996)]. Se ha
propuesto la utilización para vacunación de estos mutantes
[CHALARENG et al., Communication aux VI^{\text{è}mes}
journées de la recherche cunicole, La Rochelle, 6 y 7 de diciembre
de 1994; INRA-ITAVI-ASFC Publ.]
Con el fin de precisar el grado de similitud
entre las cepas E. Coli 0103 y las cepas EPEC de origen
humano, los inventores han estudiado la respuesta de las cepas 0103
al ensayo FAS; el fenómeno de FAS se considera en efecto como
asociado al locus LEE de las capas EPEC [Mc DANIEL et al.
Proc. Natl. Acad. Sci.92, p. 1664-1668,
(1995)].
Ahora bien, los inventores han constatado que la
cepa B10 respondía negativamente a este ensayo FAS, mientras que,
en las mismas condiciones experimentales, la cepa REPEC
RDEC-1, así como las cepas EPEC humanas producían
reacciones negativas.
Por el contrario, los inventores han constatado
que, de manera sorprendente, la cepa B10 producía sobre las células
epiteliales de línea Hela un efecto citopático (ECP) original, que
se manifiesta por una reorganización del citoesqueleto y de las
placas de adhesión focal. Como en el caso de la respuesta de tipo
FAS, este ECP está asociado a una polimerización intensa de la
actina celular. Sin embargo, contrariamente a los que se observa en
las respuestas de tipo FAS, la actina polimerizada no se localiza en
los contactos bacterianos, sino que se organiza en forma de cables
que atraviesan la célula de lado a lado. Estas modificaciones del
citoesqueleto se amplifican en gran medida e irreversiblemente con
el tiempo.
Además, la formación de los cables de actina se
acompaña del aumento progresivo de la cantidad de vinculina, un
fenómeno que no se observa en la respuesta de tipo FAS [FINLAY et
al., Infect. Immun. 60, p. 2541-2543, (1992)].
En las células control, la vinculina se presenta en forma de amas
puntiformes que aparecen en el contorno de las células, mientras
que en las células expuestas a B10, la vinculina está distribuida
sobre toda la superficie celular, pasando de una distribución
puntiforme a una distribución casi fibrilar, calcada de la de los
cables de actina. Esta modificación del citoesqueleto va acompañada
de una parada de la multiplicación celular y de un aumento moderado
de la dimensión de las células. La citostasa es duradera pero
desemboca en la muerte de las células tras un periodo de 5 a
6
días.
días.
Ensayando otras cepas, los inventores han
constatado igualmente que este ECP se manifestaba en todas las cepas
0103 ramosa negativa de conejo, así como la cepa
RDEC-1. Igualmente, lo han observado en dos aislados
clínicos EPEC de origen humano. Sin embargo, la cepa de referencia
de origen humano E2348/69, ensayada en las mismas condiciones no ha
producido ECP detectable.
Las modificaciones del citoesqueleto que
caracterizan este ECP evocan las producidas por las toxinas CNF y
CNF2 de E. Coli [OSWALD et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU, 91, p. 3814-3818 (1994)]. Sin embargo, los
inventores no ponen en evidencia en B10 ningún gen homólogo a
aquellos de CNF1 y CNF2 de E. coli. Además, cuando la
actividad de los CNF es detectable en los lisados de cultivo de las
cepas que producen, contrariamente a las cepas que producen CNF, no
se ha podido detectar ninguna actividad en los lisados de cultivo
de B10. Sin embargo, es posible que el mecanismo de acción que
conduce al ECP inducido por B10 sea similar al de las toxinas CNF,
que está asociado a la activación de Rho, una pequeña proteína G que
participa en la regulación del citoesqueleto y de los focos de
adhesión focal [FLINN y RIDLEY, J. Cell Sci. 109, p
1133-1141, (1996)].
Paralelamente, los inventores han procedido a la
hibridación del ADN cromosomático de diversas cepas 0103, en
particular la cepa prototipo B10, con cuatro sondas derivadas del
bloque de virulencia LEE de 35 kb de la cepa, y también han
comparado las proteínas secretadas en el medio de cultivo por las
cepas 0103 y por la cepa E2348/69, por el análisis de sus perfiles
electroforéticos respectivos, y por inmunoprecipitaciones cruzadas.
De este modo han evidenciado en las cepas 0103 un locus homólogo del
bloque de virulencia LEE de E2348/69, aunque presentando respecto
de este último algunas diferencias de estructura (detectadas por
polimorfismo de los sitios de restricción del ADN y de las
diferencias menores de migración electroforética de las proteínas
secretadas). Este locus análogo al LEE de las cepas EPEC se
denominará también, de aquí en adelante, "locus LEE".
Los inventores han constatado, además, que este
ECP estaba correlacionado con el poder patógeno in vivo de
las cepas 0103.
Los inventores han construido, a partir de E
coli 0103, cepas que llevan mutaciones de este locus LEE, y han
constatado que una cepa en la cual uno de los genes está inactivado,
ya no induce el ECP, y pierde su poder patógeno, aunque conserva la
adhesina AF/R2, y permanece capaz de colonizar el intestino. Aparece
entonces el hecho de que el locus LEE de las cepas 0103 lleva
determinantes genéticos responsables del ECP y de la
patogenicidad.
Finalmente, los inventores han estudiado
igualmente las propiedades inmunógenas de estos mutantes del locus
LEE, y han constatado que estas cepas mutantes conferían una
protección muy eficaz contra la cepa pariente patógena.
La presente invención tiene por objeto un
procedimiento de obtención de una cepa mutante no patógena de E.
coli a partir de una cepa de E. Coli patógena capaz de
inducir en células epiteliales HeLa un efecto citopático que se
manifiesta por la formación de cables de actina polimerizada que
atraviesa de lado a lado dichas células y por un aumento de la
cantidad de vinculina, caracterizado porque se procede a la
mutagénesis de dicha cepa de E. Coli patógena, y porque se
seleccionan los mutantes que han perdido la capacidad de inducir
dicho efecto citopático.
A título de ejemplo de cepa de E. Coli
patógena capaz de inducir el efecto citopático anteriormente
mencionado, y por lo tanto utilizable como material de partida para
la aplicación del procedimiento según la invención, se citará la
cepa B10, que se ha depositado en la Collection Nationale de
Cultures De Microorganismes (CNCM), 28 Rue du Docteur Roux, 75724
PARIS CEDEX 15, el 15 de enero 1997 con el número
I-1807.
La presente invención abarca también las cepas
mutantes no patógenas de E. Coli pertenecientes al serogrupo
0103, que son susceptibles de ser obtenidas por dicho procedimiento
a partir de una cepa de E. Coli patógena del conejo, del
serogrupo 0103. Estas cepas llevan al menos una mutación que da como
resultado la inactivación de al menos uno de los genes del locus
LEE.
Según una realización preferida de una cepa
mutante conforme a la invención, lleva al menos una mutación que da
como resultado la inactivación de la menos uno de los genes sep del
locus LEE.
Una cepa mutante conforme a la invención,
denominada B10/CA1 ha sido depositada en la Collection National de
Cultures de Microorganismes (CNCM), 28, rue du Docteur Roux, 75724
PARIS CEDEX 15, el 15 de enero de 1997 con el número
I-1808.
La presente invención tiene también por objeto
vacunas, y en particular vacunas administrables por vía oral, que
comprenden al menos una cepa mutante de E. Coli conforme a la
invención.
Ventajosamente, dicha cepa mutante posee una
adhesina AF/R2 funcional, y conserva por este hecho su capacidad de
colonizar el intestino.
Por ejemplo, vacunas conformes a la invención,
que comprenden la cepa B10/CA1, pueden ser administradas por vía
oral, y permiten proteger gazapos destetados contra las infecciones
por E. Coli patógenas del serogrupo 103.
La presente invención se entenderá mejor con la
ayuda del complemento de descripción que sigue a continuación, que
se refiere a ejemplos no limitativos de obtención de cepas mutantes
conformes a la invención, y de utilización de estas cepas como
vacunas.
Las cepas bacterianas utilizadas en esta
experimentación son:
- -
- las cepas de referencia de E. Coli enteropatógenas de conejo B10 y RDEC-1;
- -
- la cepa B10/16E1, que es un mutante de B10 obtenido por mutagénesis TnphoA, y que ya no produce la adhesina AF/R2[PILLIEN et al., Vet. Microbiol. 50, p. 105-115, (1996)].
- -
- 18 cepas de E. Coli aisladas de casos separados de diarreas del conejo y estudiadas anteriormente por su poder patógeno experimental y la posesión de algunos caracteres de virulencia, tales como AF/R2 y eaeA [CANGUILHEM y MILON, J. Clin. Microbiol., 27, p. 743-747, (1989); LEROY et al., J. Med. Microbiol., 40, p. 90-94, (1993)];
y a título de testigo, cepas humanas FAS
positivas:
- -
- la cepa de referencia EPEC humana E2348/69;
- -
- dos cepas humanas EPEC denominadas CF11201 y CF517 (amablemente proporcionadas por Christiane FORESTIER, Facultad de Farmacia de Clermont-Ferrand), procedente de diarreas infantiles que se hibridan con las sondas específicas de eaeA y bfp y que responden positivamente al ensayo FAS.
El día anterior al ensayo de interacción, las
células HeLa se siembran en laminas con compartimientos
(LAB-TEK, MILES SCIENTIFIC) o en placas de
volumetría para cultivos celulares (NUNC), a razón de 4.10^{4}
células por ml de medio mínimo esencial de EAGLE con sales EARLE
(MEME, GIBCO) que contiene el 10% de suero fetal de ternera (SVF,
GIBCO) y 50 \mug/ml de gentamicina (GIBCO). Igualmente, el día
anterior al ensayo, las bacterias se precultivan en caldo PENASSAY
(DIFCO). Después de 24 horas de incubación a 37ºC en presencia de
5% de CO_{2}, las células se lavan con tampón salino de EARLE
(EBSS, GIBCO) y a continuación se ponen en presencia de las
bacterias en MEME que contiene 25 mM de tapón HEPES (GIBCO), el 1%
de D-manosa (SIGMA) y el 5% de SVF (suero fetal de
ternera). Después de 4 horas de incubación a 37ºC en presencia del
5% de CO_{2}, las células se lavan abundantemente con EBSS y a
continuación se meten en MEME que contiene el 10% de SVF, y 80
\mug/ml de gentamicina para destruir las bacterias residuales.
Después de los tiempos de incubación variables (de 1 a 6 días a
37ºC) en presencia del 5% de CO_{2}, las células se lavan con
EBSS, se fijan con formol al 1% en PBS durante 30 minutos a
temperatura ambiente.
Se han investigado las modificaciones
morfológicas, y se ha cuantificado el crecimiento celular al
concluir estos diferentes tiempos de incubación.
La actina-F se visualiza por la
faloidina acoplada a la rodamina (MOLECULAR PROBES) en las
condiciones recomendadas por el fabricante. La vinculina es
identificada por inmunofluorescencia indirecta con la ayuda de un
anticuerpo monoclonal de ratón anti-vinculina (clón
VIN-11-5; Sigma) con una dilución
1/100, y de un anticuerpo de cabra anti-ratón
acoplado a la fluoresceína (número 0819, IMMUNOTECH). Las láminas
son observadas con un microscopio de fluorescencia LEICA DMR
(objetivo x 40).
Los resultados están ilustrados por las figuras 1
y 2.
La Figura 1 representa modificaciones
morfológicas del citoesqueleto de las células HeLa en el ensayo FAS
después de la exposición a las cepas de E. Coli B10(A
y B) y E2348/69 (C y D), seguida de 4 horas de incubación.
Coloración de la actina-F por la
faloidina-rodamina. Para cada cepa se muestra un
mismo campo microscópico en contraste de fase (A y C) y en
fluorescencia (B y D). Objetivo x40. Barra = 20 \mum.
La figura 2 representa las modificaciones del
citoesqueleto y de las placas de adhesión focal inducidas en las
células HeLa después de la exposición a la cepa de E. Coli
B10, 24 horas (B y E), y 48horas (C y F) después de la interacción,
o al mutante B10/CA1 (obtenido como se describe en el siguiente
Ejemplo 2), 24 horas después de la interacción (A y D).
A la izquierda (A, B, C): coloración de la
actina-F por la
faloidina-rodamina.
A la derecha (D, E, F): coloración de la
vinculina por inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos
anti-vinculina.
Barra =20 \mum.
El azul de metileno colorea específicamente las
proteínas celulares y permite por un lado, observar la morfología
de las células, y por otro lado, dosificar el contenido proteico
total de las láminas celulares. Las proteínas celulares son
coloreadas por el azul de metileno al 1% en tampón borato 0,01 M
según el método descrito por WILSON [Animal cell culture: A
practical approach. R.I. Frishney (ed. IRL Press Oxford, (1992)]. La
cuantificación de las proteínas residuales de las láminas celulares
se efectúa el día de la interacción y 72 horas más tarde, por
extracción del colorante por HCI 0,1 M, y a continuación por
medición de la densidad óptica a 630 nm sobre un lector automático
de placa ELISA (Modelo M 5000/7000, DYNATECH).
Los resultados son ilustrados por las Figuras 3 y
4.
La Figura 3 ilustra la morfología de las células
HeLa cuatro días después de la interacción con la cepa B10 (B), así
como el mutante B10/CA1 (A). Coloración con azul de metileno. Barra
= 20 \mum.
La figura 4 ilustra el efecto de la dosis de
inóculo bacteriano sobre el crecimiento de las células HeLa, después
de la interacción con las cepas de E. Coli B10 (\Box),
B10/CA1 (\blacksquare), y B10/16E1 (\bullet).
La multiplicidad de infección = número de UFC por
célula al inicio del ensayo de interacción, se lleva a la
abscisa;
El coeficiente de crecimiento celular = DO 72
horas después de la interacción/DO el día de la interacción se lleva
a la ordenada.
\newpage
Cada punto representa la media de cuatro
pocillos. La separación tipo del coeficiente de crecimiento celular
es en todos los casos inferior a 0,2.
Como lo muestra la figura 1, la cepa B10 no
induce respuesta de tipo FAS, es decir, no provoca ninguna
concreción significativa de actina polimerizada en el punto de
contacto de las bacterias con las células, esto a pesar de una
fuerte adhesión, contrariamente a la cepa E2348/69 que ejerce en las
mismas condiciones una respuesta FAS muy positi-
va.
va.
Igualmente se ha observado una respuesta de tipo
FAS positiva con la cepa RDEC-1 a pesar de una
adhesión muy desparramada, así como con las cepas humanas CF11201 y
CF517.
Entre las otras cepas de E. Coli de conejo
ensayadas, 4 cepas de conejo de fenotipo 0103 ramosa negativas no
inducen respuesta de tipo FAS.
Las células expuestas al cepa B10 presentan, sin
embargo, profundas modificaciones del citoesqueleto detectables
después de la interacción (figura 1), y que se amplifican con el
tiempo (figuras 2B, 2C, 2E y 2F). Estas modificaciones, designadas
en la presente memoria descriptiva con el término ECP, se traducen
por el desarrollo de numerosos cables de actina polimerizada que
atraviesa la célula en forma de haces a menudo paralelos (figuras 2B
y 2C). Paralelamente al refuerzo de los haces de actina, se observa
un aumento progresivo de las formaciones de vinculina asociadas a
las placas de adhesión focal. Estas formaciones que son
habitualmente puntiformes y periféricas en células expuestas a la
cepa E2348/69, adoptan una distribución generalizada y seudofibrilar
en las células expuestas a la cepa B10, después de 48 a 72 horas de
incubación (figura 2E y 2F).
La dimensión de las células expuestas a la cepa
B10 aumenta sensiblemente con el tiempo, en un factor de
aproximadamente 2,5 después de 4 días de incubación y según el
diámetro del núcleo (figura 3); paralelamente, el crecimiento
celular se bloquea, como lo indica la dosificación de proteínas
totales en las láminas residuales (figura 4). La mortalidad de las
células no interviene más que a partir del quinto día de
incubación.
Por otra parte, se ha estimado que un inóculo de
50 a 100 unidades que forman colonias (UFC) de B10 por célula al
inicio del ensayo permitiría obtener un ECP en al menos el 50% de
las células.
La cepa mutante B10/16E1 que no produce adhesina
fimbriar AF/R2 [PILLIEN et al., Vet. Microbiol., 50, p.
105-115, (1996)], produce el mismo ECP que la cepa
B10 pariente, pero, como lo muestra la figura 4, su poder citopático
es aproximadamente 50 veces menos elevado.
Entre las otras cepas que proceden de diarrea de
conejo que han sido ensayadas, las once cepas que presentan el mismo
fenotipo que B10 (serogrupo 0103, ausencia de fermentación de la
ramosa, eaeA positiva) producen todas las modificaciones
morfológicas que definen el ECP. Este también es inducido por tres
de las seis otras cepas ensayadas, así como por la cepa de
referencia RDEC-1. Entre las cepas EPEC de origen
humana, la cepa E2348/69 no ha producido ECP detectable mientras que
las dos cepas CF11201 y CF517 eran muy positivas para este ECP.
No ha sido posible reproducir el ECP con
sobrenadantes de cultivo de interacción de B10 concentrados diez
veces, ni con lisados de cuerpos bacterianos producidos a partir de
los mismos cultivos y concentrados también diez veces.
Para abordar el determinismo molecular de este
ECP y examinar la correlación eventual del ECP con el poder
enteropatógeno en el conejo, se han aislado clones que han perdido
la capacidad de producir ECP a partir de un banco de mutante de B10
obtenidos por inserción al azar del transposón
Tn5IS50_{L}::phoA (TnphoA) [MANOIL y BECKWITH,
Proc. Natl. Acad. Sci. 82, p. 8129-8133,
(1985)].
TnphoA se introduce en la cepa B10 por
conjugación del plásmido suicida pRT733 alojado por cepa E.
coli SM10 (\lambdapir+) [TAYLOR et al., J. Bacteriol.
171, p. 1870-1878, (1989)].
Los clones que han recibido el transposón se
seleccionan en dos tiempos:
- 1)
- las mezclas de conjugación sobre gelosa Luria-Bertani (medio LA) se enriquecen en primer lugar con clones transpuestos por siembra en caldo mímino (M) que contiene kanamicina (20 \mug/ml), y a continuación a la incubación a 37ºC durante 48 horas. En este medio, las cepas parientes no crecen, siendo SM10 auxótrofo (thy thr leu) y B10 sensible a la kanamicina.
- 2)
- En un segundo tiempo, los cultivos de enriquecimiento se extienden en medio LA que contiene kanamicina (50 \mug/ml) y 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (XP) (40 \mug/ml). Los clones de color azul se replican entonces en gelosa con rojo de fenol que contiene el 1% de L-ramosa, y en medio LA que contiene kanamicina (100 \mug/ml) o ampilicina (100 \mug/ml) para de este modo eliminar los clones en los cuales el plásmido pRT733 ha sido íntegramente co-integrado al genoma de B10.
Los clones que poseen el fenotipo:
ramosa-negativo, resistencia a la kanamicina y
sensibilidad a la ampicilina se conservan para su posterior
análisis.
Los mutantes seleccionados de este modo se
cultivan entonces en medio PENASSAY que contiene kanamicina (50
\mug/ml) durante una noche y a continuación se conservan a –20ºC
después de la adición de glicerol (el 20% final). La detección de
su aptitud para producir el ECP sobre las células HeLa se realiza a
continuación sobre placas de cultivos celulares de 96 pocillos
(FALCON) según las modalidades anteriormente descritas en el ejemplo
1.
De aproximadamente 2.700 clones ensayados, 7
clones independientes (es decir, procedentes de mezclas de
conjugación separadas) eran ECP-negativos y no
habían integrado el plásmido suicida en un integridad.
La pérdida del ECP por uno de estos mutantes
(B10/CA1) está ilustrada por la figura 2 (A y B), que muestra que
las células expuestas a este mutante no experimentan las
modificaciones del citoesqueleto características del ECP inducido
por la cepa salvaje B10.
La figura 3A muestra también que el mutante
B10/CA1 no provoca las modificaciones morfológicas inducidas por la
cepa B10. La figura 4 muestra que el poder citopático de este
mutante es casi nulo.
Las técnicas utilizadas, a menos que se indique
lo contrario, se aplican según los protocolos estándar descritos
por [SAMBROOK et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor, Nueva York, (1989)].
Para determinar el número de inserciones en los
mutantes ECP-negativos, se ha acoplado un fragmento
HindIII de 3,4 kpb de Tn5 a la digoxigenina
(DIG-UTP) por un kit comercial (DIG DNA,
BOEHRINGER), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Esta
sonda ha sido ensayada en transferencia de Southern contra los
fragmentos de digestión ClaI, BamHI y SaII del
ADN total.
Dos de los 7 clones seleccionados anteriormente
han sido eliminados ya que contenían una doble inserción.
La localización de los insertos de los 5 mutantes
que quedan ha sido efectuado como sigue:
Los Inventores han observado que el ADN
cromosómicos de B10 se hibridaba con cuatro fragmentos específicos
(A, B, C D representados en la figura 5) del locus LEE de la cepa
E2348/69 descrito por Mc DANIEL et al., [Proc Natl. Acad.
Sci. 92, p. 1664-1668, (1995)], y representado en la
figura 5a. Esta hibridación se efectúa en una región de más de 35
kb (representada en la figura 5b) que aparece por lo tanto como
constituyendo un locus análogo al LEE de E2348/69, con, sin
embargo, diferencias importantes en el polimorfismo de
restricción.
Se han fabricado sondas marcando los fragmentos
A, B, C, D con digoxina-UTP. Después de la digestión
del ADN total por diversas enzimas de restricción y a continuación
Southern Blot, los perfiles de hibridación de los mutantes
ECP-negativos de B10 con estas sondas se comparan
con el de la cepa pariente B10 y con el de E2348/69.
La utilización de estas sondas ha permitido
concluir que los cinco mutantes han recibido el inserto
TnphoA en la región que corresponde al locus LEE. El
emplazamiento de la inserción TnphoA para estos 5 mutantes
está indicado en la figura 5b con una flecha rodeada por un
círculo.
Para 3 de ellos (B10/CA1, B10/E2, B10/FA12), el
inserto ha sido localizado en un fragmento EcoRI de 8 kb que
se híbrida con la sonda B, es decir, a proximidad de genes homólogos
de secreción (sepA a sepD). El inserto del mutante B10/H12
se sitúa entre las regiones que se hibridan con las sondas B y C, y
el de los mutantes B10/A9 en la proximidad de genes análogos a
espA y espB.
Con el fin de identificar eventuales proteínas
bacterianas secretadas asociadas al ECP, los perfiles de migración
electroforética de las proteína de sobrenadante de cultivo han sido
analizados en la cepa EPC humana E2348/69 en las cepas B10,
RDEC-1 y B10/16E1, y en los mutantes
ECP-negativo de B10.
Las bacterias se cultivan en las condiciones del
ensayo de interacción descrito en el ejemplo 1 anterior, pero en
ausencia de células, y con un inóculo de partida de aproximadamente
10^{7} UFC por ml. Después de 2 horas de incubación, las
bacterias se centrifugan (4.000 g, 15 min. 20ºC) y se suspenden en 1
ml de MEME sin metionina (nº 31.900-020, GIBCO)
adicionado con el 5% de SVF dializado. Después de 20 minutos de
incubación a 37ºC, para agotar el depósito de metionina endógena,
se añade metionina marcada ^{35}S a razón de 100 \muCi/ml.
Después de 1 hora de incubación suplementaria, las bacterias son
eliminadas por dos centrifugaciones sucesivas (12.000 g, 10
minutos) y las proteínas del sobrenadante de centrifugación son
entonces precipitadas por el polietilenglicol (PEG) 4.000 (200
mg/ml) MERCK). Después de 1 hora de incubación a 0ºC, se efectúa
una nueva centrifugación (12.000, 30 minutos). El residuo de
centrifugación se suspende en 30 \mul de tampón de carga de
electroforesis y las proteínas se separan por migración
electroforética en gel de poliacrilamida al 12% en presencia de SDS
(SDS-PAGE). El gel se seca a vacío y a continuación
se pone en contacto durante 6 días con una película
\beta-Max (AMERSHAM), a temperatura ambiente. El
revelado se hace según el procedimiento estándar.
Los resultados están representados en la Figura
6A.
En la cepa pariente el B10 (pista 3), se han
identificado tres proteínas principales, de pesos moleculares
respectivos de aproximadamente 39, 37 y 25 kDa, así como una banda
menos importante de 40 kDa. El perfil de la cepa de conejo
RDEC-1 (pista 1), y el del mutante B10/16El son
idénticos al de B10, mientras que el de la cepa EPEC de referencia
humana E2348/69 (pista 6) presenta cuatro bandas de peso moleculares
bastante cercanos (40, 39, 36 y 26 Kda), así como una banda
principal suplementaria de aproximadamente 29 kDa que no tiene
equivalente en el perfil de B10 (figura 6A). Ninguna de estas
bandas aparece en el mutante ECP-negativo B10/CA1
(pista 4). La pista 2 contiene los marcadores de peso
molecular.
Estas proteínas han sido también analizadas sobre
la base de su parentesco inmunológico, utilizando un suero
policlonal de conejo producido contra las proteínas de sobrenadante
de B10 precipitadas por el PEG.
La inmunoprecipitación con el antisuero contra
las proteínas de sobrenadante se realiza sobre los sobrenadantes de
cultivo después del marcado con ^{35}S, como se ha descrito
anteriormente. La inmunoprecipitación se aplica según los
modalidades estándar [SAMBROOK et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Nueva York., (1989)].
Los resultados se representan mediante las
figuras 6B y 7.
Leyenda de la figura 6B: Pistas 1: B10 con el
suero pre-inmun; 2: B10; 3: B10/CA1, 4: B10/16E1; 5:
marcadores de pesos moleculares; 6: RDEC-1; 7:
E2348/69.
La figura 6B muestra que el antisuero permite
precipitar las tres proteínas (39, 37 y 25 kDa) de B10 (pista 3) y
RDEC-1 (pista 6) así como las cuatro proteínas
principales de E2348/69 (39, 36, 29 y 26 kDa). Las tres proteínas
principales de B10 están presentes en el sobrenadante del mutante
AF/R2 negativo B10/16E1 (pista 4),pero no aparecen en el del
mutante ECP-negativo B10/CA1 (pista 3.) Es preciso
resaltar que el suero preinmun posee también un ligero poder
inmunoprecipitante para la proteína menor de 40 kDa de B10. Estos
resultados indican que las proteínas de sobrenadante de B10 son
homólogas a las de RDEC-1 y de 2348/69 (incluso si
los pesos moleculares de estas últimas son sensiblemente
diferentes), y que la producción de estas proteínas en el
sobrenadante está afectada en un mutante
ECP-negativo.
Con el fin de determinar si esta pérdida de las
proteínas de sobrenadante fuese el resultado de un defecto de
expresión de los genes correspondientes, o de un defecto de
secreción por la bacteria, los perfiles de inmunoprecipitación de
las proteínas de sobrenadante de la cepa B10 y de sus mutantes
ECP-negativos CA1, FA12, E2, A9 y H12 han sido
comparados con los perfiles de inmunoprecipitación de los lisados
bacterianos de los mismos cultivos.
Los lisados se obtienen por tres ciclos de
congelación-descongelación (-20ºC a 20ºC), seguidos
de una centrifugación (12.000 g, 10 minutos), y a continuación de
la recuperación del sobrenadante de lisis. La inmunoprecipitación
se efectúa, después del marcado con ^{35}S, en las mismas
condiciones que las utilizadas para las proteínas de sobrenadante.
El antisuero se agota previamente con un lisado bacteriano de la
cepa de E. Coli de laboratorio HB101, para eliminar las
reacciones no específicas.
Los resultados se representan mediante las
figuras 7A (perfiles de inmunoprecipitación de las proteínas de
sobrenadante) y 7B (perfiles de inmunoprecipitación de los lisados
bacterianos).
Leyenda de la figura 7A: Pistas 1: B10; 2:
marcadores de peso molecular; 3: CA1; 4: FA12; 5: E2; 6: A9; 7:
H12.
La figura 7A muestra que en todos los mutantes,
se observa una disminución significativa de las proteínas de
sobrenadante respecto de B10. En tres de ellos, a saber CA1, E2 y
A9, esta disminución aparece más acentuada. La inmunoprecipitación
permite igualmente poner en evidencia una banda de aproximadamente
110 kDa, de intensidad sensiblemente equivalente en todas las cepas
y que no está por lo tanto afectada por las mutaciones.
Leyenda de la figura 7B: Pistas 1: marcadores de
peso molecular; 2: B10; 3: CA1; 4: FA12; 5: 2E; 6: A9; 7: H12.
La figura 7B muestra que las proteínas
principales descritas anteriormente está presentes en cantidades
sensiblemente equivalentes en los lisados de B10 y los de los
mutantes, con la excepción del mutante CA1 que aparece más
particularmente deficiente para la proteína de 25 kDa.
Con el fin de examinar si la pérdida del ECP
tenía un impacto sobre la virulencia, el poder patógeno por vía oral
en l conejo de la cepa B10 se ha comparado con el de uno de estos
mutantes, en este caso la cepa B10/CA1.
El poder patógeno se ensaya en gazapos de raza
New Zealand White (cepa INRA 1077) de 35 días de edad, destetados a
los 28 días de vida según las modalidades descritas por PILLIEN
et al., [Vet. Microbiol. 50, p. 105-115,
(1996)]. Cincuenta y un conejo han sido repartidos en tres grupos
homogéneos sobre la base del peso y de la camada original y a
continuación han sido inoculados por vía oral con 2.10^{7} UFC de
las cepas de prueba, a saber, respectivamente: la cepa pariente B10
(18 animales), el mutante ECP-negativo B10/CA1 (18
animales) y una cepa de laboratorio K12 no patógena BM21 (15
animales). El registro de los episodios de diarrea, de la mortalidad
y del peso, así como que censo y la tipificación de las cepas de
E. Coli de las heces, se efectúan como se describe en PILLIEN
et al., (1996, publicación anteriormente mencionada).
La inoculación oral de la cepa pariente B10 ha
provocado una caída de peso en los 18 animales inoculados, la
diarrea en 17, y a continuación en 17 de ellos. El deceso se ha
escalonado desde el tercer al doceavo día que siguen a la
inoculación. Por comparación, los animales inoculados con la misma
dosis del mutante B10/CA1, como los inoculados con la cepa de E.
Coli K12, no han mostrado ninguna caída de peso ni ningún signo
clínico. Las curvas de peso registradas en estos dos últimos grupos
eran casi idénticas.
La figura 8A representa el peso medio de los
animales supervivientes en cada uno de los grupos durante la
experimentación: B10 (2 sobrevivientes/18 animales) = \Delta; K12
(control; 15 sobrevivientes/15 animales) = \medcirc; B10/CA1 (18
sobrevivientes/18 animales) = \Box;
La figura 8B representa la población colibacilar
fecal, en diferentes tiempos después de la inoculación, en los
animales inoculados con la cepa control K12, con la cepa B10 y con
la cepa B10/CA1:
\Box : Flora colibacilar identificada como
constituida por la cepa B10/CA1,
\Box : Flora colibacilar identificada como
constituida por la cepa B10.
En los conejos inoculados con la cepa pariente
B10, se ha observado una colonización colibacilar masiva, que
alcanza en los sobrevivientes un nivel de 10^{9} UFC por gramo de
contenido fecal, y esto durante más de dos semanas después de la
inoculación. La totalidad de la flora colibacilar identificada
estaba constituida por la cepa B10.
Este nivel de población colibacilar total era
10^{3} a 10^{4} veces más elevado que el de los conejos del
grupo control inoculados con la cepa de E. Coli K12, la cual
por otra parte no ha sido detectada en los animales
correspondien-
tes.
tes.
En los conejos inoculadas con el mutante B10/CA1,
la cepa ha colonizado el intestino a un nivel elevado y a
continuación la población bacilar se ha estabilizado a un nivel de
aproximadamente 10^{6} UFC por gramo de contenido fecal durante al
menos dos semanas. Durante este periodo, la cepa B10/CA1 constituía
del 70 al 100% de la población colibacilar total.
El efecto de la inoculación oral de una dosis de
10^{4} CFU dela cepa patógena B10 ha sido comparado en dos grupos
de 18 gazapos de 35 días, de los que una había recibido una semana
antes la cepa mutante B10/CA1 por vía oral
(2.10^{7} CFU).
(2.10^{7} CFU).
Treinta y seis gazapos (misma raza y mismas
condiciones de cría que las descritas en el Ejemplo 4 anterior)
están repartidos en dos grupos homogéneos en la base del peso y de
la camada original. A la edad de 30 días, los animales de uno de los
dos grupos reciben por vía oral 2.10^{7} UFC del mutante B10/CA1
en 2 ml de PBS. Siete días más tarde, los animales de los dos grupos
reciben la cepa pariente patógena B10 por vía oral, a la dosis de
2.10^{4} UFC (es decir, aproximadamente 1 dosis letal del 50%). El
registro de los episodios de diarrea, de la mortalidad y del peso,
así como el censo y la tipificación de las cepas de E. Coli
de las heces se efectúa como se describe en el Ejemplo 4
ante-
rior.
rior.
En los gazapos que han recibido la cepa mutante
B10/CA1 por vía oral, no se ha observado ninguna manifestación
clínica y ninguna pérdida de peso durante todo el periodo de
observación.
Por el contrario, 11 de los 18 gazapos no
vacunados con B10/CA1 han presentado una caída de peso, 9 de la
diarrea y 7 de 18 han muerto.
El análisis de la colonización intestinal muestra
que la cepa B10/CA1 ha colonizado eficazmente el intestino hasta la
administración de la cepa pariente patógena B10, y a continuación se
ha mantenido durante dos semanas a un nivel estable de
aproximadamente 10^{7} CFU/g, que impide la instalación de B10 a
un nivel detectable.
Paralelamente, las IgA locales
anti-LPS 0103 han sido dosificadas por ELISA en las
heces. La figura 9 muestra la evolución de las IgA fecales después
de la inoculación oral de la cepa ECP-negativa
B10/CA1, (a día 0), y a continuación de la cepa virulenta B10 (a día
7) (\Box), o bien de la sola inoculación de la cepa virulenta B10
a día 7 (\blacksquare). Se observa que la respuesta anticuerpo
aumenta de manera significativa aproximadamente 15 días después la
inoculación oral de la cepa B10/CA1.
Los inventores han clonado y secuenciado el
extremo derecho del LEE de la cepa B10. La organización de la
región secuenciada está esquematizada por la Figura 10, y la
secuencia obtenida está representada en la lista de secuencias en
anexo con el número SEQ ID NO: 1. Los inventores han estudiado,
además, la organización general del LEE en las cepas 0103
patógenas, y han confirmado que era idéntica en todas estas
cepas.
Los inventores han construido mutantes del LEE de
las cepas 0103 a partir de la cepa denominada E22. Esta cepa
patógena es análoga a la cepa B10, pero es sensible a la
estreptomicina (Como también a todos los antibióticos de especto
Gram negativo ensayados).
Estos mutantes han sido construidos por el método
del intercambio alélico.
Para cada unos de los locus elegidos (eaeA,
espB y espB), el alelo de la cepa salvaje E2 ha sido
sustituido por un alelo mutado por inserción de un casete [GALAN
et al., J. Bacteriol., 174, 4338-4349, (1992)
que contiene un gen de resistencia a la kanamicina (gen aphT:
aminoglicosido 3’fosfotransferasa), bajo control de un promotor
fuerte, y sin terminador de transcripción. Este casete, flanqueado
de secuencias del gen que hay que mutar y llevada por un plásmido
suicida [KANIGA et al., Gene, 109, 137-141
(1991)], está introducido en la cepa salvaje, y a continuación se
seleccionan las bacterias recombinantes que han sustituido el alelo
salvaje por el alelo mutado.
Los genes eaeA y espD han sido
inactivados respectivamente por la inserción del casete en los
sitios de restricción "naturales" EcoRV y BgIII. Para
espB y espA, se ha creado un sitio bgIII de
novo por mutagénesis dirigida (PCR con la ayuda de oligonucleótidos
degenerados y la selección de los plásmidos por restricción):
Las proteínas producidas por los mutantes
obtenidos han sido analizadas por inmunohuellas para EaeA e
inmunoprecipitación para ESPA, ESPB y ESPD. Estos análisis han
permitido verificar que estos mutantes no diferían de la cepa
salvaje más que por la ausencia de producción de la proteína cuyo
gen era inactivado por la mutación.
Los mutantes obtenidos son los siguientes:
- -
- E22\DeltaespA, que ya no sintetiza la proteína EspA.
- -
- E22\DeltaespB, que ya no sintetiza la proteína EspB.
- -
- E22\DeltaspD, que ya no sintetiza la proteína EspD.
- -
- E22\DeltaeaeA, que ya no sintetiza la proteína EaeA y
por lo tanto ya no la incluye en su membrana
externa.
Para cada mutante, la síntesis de las otras
proteínas permanece efectivamente normal. Por ejemplo, el mutante
E22espA ya no produce EspA, pero produce y secreta
normalmente EspB y EspD. Al igual que sintetiza e incluye
normalmente EaeA en su membrana externa. Parece por lo tanto que
estos mutantes presentan una mutación estricta y
no-polar, relativa a únicamente al gen diana de la
mutación.
La Figura 10 representa el extremo derecho del
LEE de las cepas 0103, e indica la posición de los diferentes genes,
así como el emplazamiento de inserción del casete para los 4
mutantes obtenidos.
Estos mutantes han sido objeto de ensayo in
vitro para verificar su capacidad de inducir el ECP en células
HeLa, tal como se describe en el ejemplo 1 anterior.
Los mutantes de los genes esp han sido ensayados
también por su poder patógeno en el conejo destetado, por
administración oral de 2 x 10^{7} CFU a lotes de gazapos de 35
días, según el mismo protocolo que el descrito en el Ejemplo 4
anterior.
\newpage
Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla I
anterior
| Cepa | ECP/HeLa | Poder patógeno in vivo^{\underline{a}} | ||
| Pérdida de peso | Diarrea | Mortalidad | ||
| E22^{*} | +++ | 28/34 | 26/34 | 25/34 |
| E22\DeltaespA | - | 0/16 | 0/16 | 0/16 |
| E22\DeltaespB | - | 0/16 | 0/16 | 0/16 |
| E22\DeltaespD | - | 3/18 | 2/18 | 2/18 |
| E22\DeltaeaeA | +++ | NE | NE | NE |
| a: número de animales que ha presentado el signo clínico/número de animales inoculados | ||||
| *: cepa salvaje | ||||
| NE: no ensayado |
Estos resultados muestran que los mutantes de
síntesis de las proteínas Esp ya no expresan el efecto citopático
en las células HeLa, contrariamente al mutante de eaeA. En
conclusión, dos de los mutantes de las proteínas Esp
(\DeltaespA y \DeltaespB) han perdido
completamente su poder patógeno en el conejo, y el poder patógeno
del mutante \DeltaespD es mucho menor que el de la cepa de
la cepa salvaje.
(1) INFORMACIONES GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- DEPOSITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 147 RUE DE L’UNIVERSITE
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: PARIS CEDES 07
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 75341
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE TOULOUSE
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 23, CHEMIN DES CAPELLES
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: TOULOUSE CEDES
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 75341
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: CEPAS MUTANTES NO PATÓGENAS DE E. COLI, SU PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y SUS USOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn release #1.0, Versión # 1.30 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12.626 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 1768..4787
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: PRODUCTO = "eaeA"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 1768..4787
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: PRODUCTO = "espA"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 1768..4787
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRAS INFORMACIONES: PRODUCTO = "espD"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EMPLAZAMIENTO: 1768..4787
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- OTRAS INFORMACIONES: PRODUCTO = "espB"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 2.
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 940 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 3.
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LONGITUD: 193 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- LONGITUD: 381 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- LONGITUD: 315 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Procedimiento de obtención de una cepa mutante
no patógena de E. Coli a partir de una cepa de E.
Coli patógena capaz de inducir en células epiteliales
Hela un efecto citopático que se manifiesta por la formación
de cables de actina polimerizada que atraviesa de lado a lado dichas
células y por un aumento de la cantidad de vinculina,
caracterizado porque se procede a la mutagénesis de dicha
cepa de E. Coli patógena, y porque se seleccionan los
mutantes que han perdido la capacidad de inducir dicho efecto
citopático.
2. Cepa mutante no patógena de E. Coli
perteneciente al serogrupo O103, caracterizada porque es
susceptible de ser obtenida por un procedimiento según la
reivindicación 1, a partir de una cepa de E. coli del
serogrupo O103 patógena del conejo, y porque posee un locus LEE del
que al menos uno de los genes está inactivado por la mutación que
provoca la pérdida del poder patógeno y de la capacidad de inducir
el efecto citopático.
3. Cepa mutante según la reivindicación 2,
caracterizada porque es susceptible de ser obtenida a partir
de la cepa de E coli denominada B10, depositada en la CNCM,
el 15 de enero de 1997 con el número I-18070.
4. Cepa mutante según no-patógena
de E. Coli según una cualquiera de las reivindicaciones 2 ó
3, caracterizada porque lleva al menos una mutación que da
como resultado la inactivación de al menos uno de los genes sep del
locus LEE.
5. Cepa mutante según no-patógena
de E. Coli según una cualquiera de las reivindicaciones 2 ó
4, caracterizada porque posee una adhesina AF/R2
funcional.
6. Cepa mutante no-patógena de
E. Coli denominada B10/CA1, depositada en la CNCM, el 15 de
enero de 1997 con el número I-1808.
7. Vacuna que comprende al menos una cepa mutante
no-patógena de E. Coli según una cualquiera
de las reivindicaciones 2 a 6.
8. Vacuna según la reivindicación 7,
administrable por vía oral.
9. Utilización de una cepa mutante de E.
Coli según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, para la
obtención de una vacuna.
10. Utilización según la reivindicación 9,
caracterizada porque dicha vacuna está
destinada a ser administrada a conejos.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9700532A FR2758568B1 (fr) | 1997-01-20 | 1997-01-20 | Souches mutantes non pathogenes d'e. coli, leur procede d'obtention et leurs utilisations |
| FR9700532 | 1997-01-20 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2251760T3 true ES2251760T3 (es) | 2006-05-01 |
Family
ID=9502763
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98400093T Expired - Lifetime ES2251760T3 (es) | 1997-01-20 | 1998-01-20 | Cepas mutantes no patogenas de e. coli, su procedimiento de obtencion y sus usos. |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0864644B1 (es) |
| DE (1) | DE69831888T2 (es) |
| ES (1) | ES2251760T3 (es) |
| FR (1) | FR2758568B1 (es) |
| HU (1) | HU228496B1 (es) |
-
1997
- 1997-01-20 FR FR9700532A patent/FR2758568B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-01-20 HU HU9800094A patent/HU228496B1/hu unknown
- 1998-01-20 EP EP98400093A patent/EP0864644B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-20 ES ES98400093T patent/ES2251760T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-20 DE DE69831888T patent/DE69831888T2/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2758568B1 (fr) | 1999-03-26 |
| FR2758568A1 (fr) | 1998-07-24 |
| HUP9800094A2 (hu) | 1998-09-28 |
| DE69831888T2 (de) | 2006-07-27 |
| HU228496B1 (en) | 2013-03-28 |
| HUP9800094A3 (en) | 2001-11-28 |
| HU9800094D0 (en) | 1998-03-30 |
| DE69831888D1 (de) | 2006-03-02 |
| EP0864644A1 (fr) | 1998-09-16 |
| EP0864644B1 (fr) | 2005-10-19 |
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