ES2251974T3 - Vacunacion de adn para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. - Google Patents

Abstract

Uso de un casete de expresión de ADN que está compuesto por una región de inicio de la transcripción, una secuencia que codifique un autoantígeno, que codifica al menos una porción de autoantígeno de proteína de mielina y una región de fin de la transcripción, estando asociado el autoantígeno de proteína de mielina con una respuesta linfocítica T de tipo Th1 proinflamatoria, estando la región de inicio de la transcripción bajo el control de un promotor que se activa en un huésped humano con una enfermedad autoinmune, para fabricar un medicamento para su uso en el tratamiento mediante una inyección intramuscular de un enfermedad autoinmune desmielinizante en el huésped humano.

Description

Vacunación de ADN para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

La complejidad del sistema inmunitario ha sido un desalentador obstáculo en la comprensión de las alteraciones del sistema inmunitario. En los últimos años, las técnicas de biología molecular han proporcionado un entendimiento de los mecanismos y componentes que subyacen en el concepto de inmunidad. En gran medida, la historia del concepto de inmunidad es la historia de los linfocitos. Los linfocitos poseen un sistema extremadamente complejo y delicado para interactuar unos con otros, con células presentadoras de antígenos y con células y antígenos extraños.

La modulación de la respuesta inmunitaria varía con los factores específicos producidos, y con los receptores presentes en la célula que está produciendo la respuesta. Las vías de respuesta de regulación a la baja son tan importantes como las que son requeridas para la activación. La tolerancia de los linfocitos T es un mecanismo muy conocido para impedir una respuesta inmunitaria frente un antígeno particular. También se conocen otros mecanismos, como la secreción de citocinas represoras.

Una característica común en varias enfermedades y trastornos inflamatorios es la implicación de los linfocitos T CD4+ proinflamatorios. Estos linfocitos T son responsables de la liberación de citocinas tipo Th1 inflamatorias. Las citocinas caracterizadas como tipo Th1 incluyen la interleucina 2 (IL-2), interferón-\gamma, TNF\alpha e IL-12. Como citocinas proinflamatorias actúan para estimular la respuesta inmunitaria, en muchos casos produciendo la destrucción del tejido autólogo. Las citocinas asociadas a la supresión de la respuesta de los linfocitos T son del tipo Th2, e incluyen IL-10, IL-4 y TGF-\beta. Se ha descubierto que los linfocitos T tipo Th1 y Th2 usan el mismo recetor de antígeno en respuesta a un inumonógeno; en los primeros produciendo una respuesta estimuladora y en los últimos una respuesta represora.

Las citocinas desempeñan un papel crítico en el desarrollo y recuperación de enfermedades autoinmunes. Se han descubierto citocinas Th1 como la interleucina 12 (IL12) y el interferón gamma (IFN\gamma) en el sistema nervioso central (SNC) de pacientes con esclerosis múltiple (EM) así como en animales con EAE (Issazadeh y col. (1995). J Neuroimmunol 61:205-12). Se ha descubierto que los niveles de citocinas Th2 como por ejemplo IL4, IL5 e IL10 son altos durante la remisión de la EM o de la EAE (Waisman y col. (1997) Immunointervention in autoimmunity by Th1/Th2 regulation, L. Adorini, ed. (Austin, Texas: R.G. Landes Co.), pp. 129-50). Previos estudios han demostrado que la administración sistémica de IL4 así como la administración local al SNC de IFN\gamma puede reducir la gravedad de EAE (Racke y col. (1994) J Exp Med 180:1961-6; Voorthuis y col. (1990) Clin Exp Immunol 81:183-8). Además, la adición de IL4 á linfocitos T sin tratamiento previo puede tener como resultado el desarrollo de linfocitos T tipo Th2, mientras que la adición de IL12 puede producir el desarrollo de células tipo Th1 (Macatonia y col. (1993) Int Immunol 5: 1119-28).

La vacunación con ADN es eficaz en la protección de animales experimentales frente patógenos infecciosos y cáncer, y han sido usados recientemente para prevenir enfermedades autoinmunes (Waisman y col. (1996) Nat Med 2, 899-905). La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), un modelo animal prototipo de autoinmunidad por linfocitos T, refleja muchos de los rasgos clínicos y patológicos de la enfermedad humana, esclerosis múltiple.

Para modificar la respuesta inmunitaria a las vacunas de ADN, se han realizado covacunaciones con genes de citocinas, junto con genes de determinados patógenos. Los ejemplos incluyen inmunización con ADN con antígenos de virus de la hepatitis B y ADN de IL2 con respuestas Th1 potenciadas, antígenos del VIH con ADN de IL12 con actividad linfocítica T citotóxica potenciada y antígenos de la gripe con ADN de IL6 que potencia la actividad antiviral (véase por ejemplo Chow y col. (1998) J Immunol 160(3):1320-9).

Se ha demostrado que la vacunación de ratones con ADN desnudo que codifica la cadena \beta del receptor predominante de los linfocitos T (TCR) que está cambiada en linfocitos T reactivos a la proteína básica de la mielina (PBM) protege a los ratones de la EAE. Dicha inmunización indujo un patrón de producción de citocinas Th2 en los linfocitos reactivos frente mielina, originando un entorno represor que bloquea la autoinmunidad. Los linfocitos T que reaccionan frente al antígeno de la mielina pasaron de un linfocito T tipo auxiliar 1 (Th1) a uno Th2 tipo represor.

El desarrollo adicional del tratamiento que inhibe específicamente la activación de linfocitos T tendría una gran utilidad médica.

Bibliografía relacionada

Waisman y col. (1996) Nat. Med. 2:899-905 and) Offner y col. (1998) J. Immunol. 161:2178-2186 describe el uso de la vacunación con ADN para prevenir la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE). La inyección de ADN para promover la vacunación frente microorganismos y tumores se describe en Cohen y col. (1997) Hosp. Pract. 32:169-171; Syrengelas, y col. (1996) Nat. Med. 2:1038-1041; Ulmer y col. (1996) Curr Opin Immunol. 8:531-536; Pardoll y col. (1995) Immunity 3:165-169; Davis y col. (1993) Hum. Mol. Genet. 2:1847-1851; Ulmer y col. (1993) Science 259:1745-1749; y Tang y col. (1992) Nature 356:152-154. La inmunización genética ha demostrado una inducción tanto de una respuesta humoral específica pero además de una respuesta inmunitaria celular con una reactividad más general en modelos animales de cáncer, micoplasma, TB, malaria y muchas infecciones virales, incluyendo la gripe y el VIH. Véase por ejemplo, Mor y col. (1995) J Immunol 155:2039-46; Xu and Liew (1995) Immunology 84:173-6; y Davis y col. (1994) Vaccine 12:1503-9.

La susceptibilidad frente a la esclerosis múltiple (EM) se ha asociado con determinados genes de Calse II del MHC. Oksenberg y Steinman (1990) Current Opinion in Immunology 2:619-621. A nivel celular, se ha descrito la oligoclonalidad de los linfocitos T en líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con EM, Lee y col., Ann. Neurol. 29: 33-40 (1991).

Los antígenos de SNC, incluyendo proteínas de la mielina, estudiados en el contexto de la EM se describen en de Rosbo y col., J. Autoimmunity 11:287-299 (1998). el documento WO97/46253 describe la inmunoterapia para enfermedades autoinmunes basada en la administración de ADN vía un cañón génico. el documento WO97/45144 describe la construcción de genes que codifican epítopos patogénicos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. Nowicka y col, 1(1998) J. Neuroimmunology 90; 102, resumen 582, se refiere al uso de un plásmido, pRc-CMV con un gen PLP, para ser inyectado en ratones. Tsunoda y col, (1998) J Neuropathol Exp Neurol. 57:758-67 describe la potenciación de EAE mediante inmunización con ADN plasmídico de lipoproteína de la mielina. Barnett y col J Neuroimmunol. (1996) 64:163-73 describe que los virus vaccinia recombinantes, que codifican una porción encefalitogénica de la proteína básica de la mielina se evaluaron en un modelo animal de enfermedad desmielinizante humana EAE.

Los potenciadores de la respuesta inmunitaria frente a vacunas de ADN incluyen dinucleótidos CpG desmetilados, Krieg y col., (1998) Trends Microbiol. 6: 23-27, y secuencias fusionadas derivadas de patógenos, King y col. (1998) Nat. Med. 4: 1281-1286.

Descripción de la invención

La invención se refiere así a procedimientos para suprimir respuestas de linfocitos T proinflamatorios en enfermedades autoinmunes. Se vacuna a un hospedador mamífero con un vector de expresión que codifica un fragmento de autoantígeno. En respuesta a la vacunación, se inhibe la proliferación linfocítica T patogénica y se reduce la producción de citocinas Th1 incluyendo IL-2, IFN-\gamma e IL-15.

De este modo la invención proporciona el uso de un casete de expresión de ADN que está compuesto por una región de inicio de la transcripción, una secuencia que codifica un autoantígeno, que codifica al menos una porción de autoantígeno de proteína de la mielina y una región de fin de la transcripción, estando asociado el autoantígeno de proteína de la mielina con una respuesta linfocítica T de tipo Th1 proinflamatoria, estando la región de inicio de la transcripción bajo el control de un promotor que se activa en un hospedador humano con una enfermedad autoinmune, para fabricar un medicamento para su uso en el tratamiento mediante una inyección intramuscular de un enfermedad autoinmune desmielinizante en el hospedador humano.

En una forma de realización de la invención, se coadministra un ácido nucleico que codifica una citocina Th2 con la secuencia que codifica el autoantígeno. Es de particular interés el uso de secuencias que codifican IL4. La vacunación represora disminuye la respuesta proinflamatoria de los linfocitos T de modo específico y dirigido.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Titulaciones de anticuerpos anti-SCH IgG (A) y anti-PLP_{139-151} (B) en ratones SJL/J después de la inmunización con ADN con el minigen PLP.

Figura 2. Respuestas de proliferación celular en un ganglio linfático frente PLP_{139-151} (cuadrados) y el péptido control PLP178-191(triángulos) en animales inyectados con ADN que codifica PLP_{139-151} (A) o el vector control, pTARGET (B).

Figura 3. (A) Niveles de interferón-\gamma (barras rayadas), o IL-2 (barras moteadas) en animales vacunados con ADN plasmídico que codifica PLP_{139-151} o un vector sólo (pTARGET). (B) Detección y análisis de ARNm de citocinas en electroforesis en gel de poliacrilamida al 5%.

Figura 4. Expresión en superficie de B7.1, B7.2, y I-A3 de células esplénicas tras la incubación con ADN. Los números en los cuadrantes se refieren al porcentaje de células en la entrada de monocitos (A) o en la entrada de linfocitos (B) según se define por dispersión frontal y dispersión lateral.

Descripción de las formas de realización específicas

Los procedimientos presentados proporcionan un medio para el tratamiento terapéutico y la investigación de la inflamación, mediante la supresión de la respuesta de los linfocitos T específica para antígenos patogénicos. Se inyecta un casete de expresión vía intramuscular en el tejido del hospedador. El vector comprende una secuencia de ADN que codifica al menos una porción de un autoantígeno de proteína de la mielina. La vacunación también puede incluir secuencias de ADN que codifiquen un citocina Th2, por ejemplo IL4. En respuesta a esta vacunación, se induce una respuesta represora. Se inhibe la proliferación de linfocitos T específicos de antígeno y se reduce la producción de citocina Th1.

Sin limitar el alcance de esta invención, se cree que los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva son un novedoso procedimiento de inmunidad protectora, que combina los efectos de la vacunación con ADN y la administración génica local. Después de la vacunación de ADN con el epítopo del autoantígeno sólo, los linfocitos T son anérgicos. Esto se puede deber en parte a los efectos biológicos de los motivos de ADN como dinucleótidos CpG desmetilados en el contexto de bases particulares (motivos CpG-S) (Krieg y col. (1998) Trends in Microbiol. 6:23-27). La adición de IL4 como covacuna de ADN, rescata la anergia impuesta por la vacuna de ADN con el autoantígeno, y dirige la respuesta al fenotipo Th2. La vacuna con ADN de IL4 activa STAT6 en células secretoras del ganglio linfático. Se cree que IL4 se produce a partir de la vacuna de ADN administrada y que interactúa con el receptor IL4 de las células de los ganglios linfáticos, lo que a su vez provoca la posterior activación de STAT6. La inmunización frente antígenos que activan aquellas enfermedades autoinmunes provocadas por células autorreactivas Th1, enfermedades como por ejemplo la esclerosis múltiple, serían afecciones en las que la covacunación con el ADN que codifica IL-4 podría ser beneficiosa.

Los autoantígenos, como se emplean en la presente memoria descriptiva, son proteínas endógenas o sus fragmentos que producen una respuesta inmunitaria patogénica. Son de particular interés los autoantígenos que inducen una respuesta patogénica inflamatoria mediada por linfocitos T. La vacunación represora con el antígeno diana pertinente encuentra un uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunes desmielinizantes caracterizadas por la implicación de linfocitos T proinflamatorios, como la esclerosis múltiple y la encefalitis autoinmune experimental. Los modelos animales, en particular lo mamíferos de pequeño tamaño, por ejemplo, murinos, lagomorfos son de interés para las investigaciones experimentales.

Los procedimientos presentados de inmunización se emplean con propósitos profilácticos y terapéuticos. Usado como se emplea en la presente memoria descriptiva, "tratar" se usa para referirse tanto a la prevención de la enfermedad, como al tratamiento de afecciones preexistentes. La prevención de una enfermedad autoinmune que implica la vacuna con un autoantígeno (VA), se distingue por la administración de la vacuna antes del desarrollo manifiesto de la enfermedad. Es de particular interés el tratamiento de la enfermedad en desarrollo, en la que la vacunación supresora estabiliza o mejora los síntomas clínicos del paciente. Tales tratamientos de desarrolla preferiblemente antes de se complete la pérdida funcional de los tejidos afectados.

Se sabe que los autoantígenos de proteína de la mielina están asociados con enfermedades desmielinizantes, por ejemplo, la esclerosis múltiple y la mielitis autoinmune experimental.

Los componentes proteicos de las proteínas de la mielina, que incluyen la proteína básica de la mielina (PBM), lipoproteína (PLP), glicoproteína asociada a la mielina (GAM) y glicoproteína oligodendrocítica de la mielina (GOM), son de particular interés para su uso como inmunógenos de la invención. La supresión de la capacidad de respuesta de los linfocitos T contra estos antígenos se usa para prevenir o tratar enfermedades desmielinizantes.

En una forma de realización de la invención, el autoantígeno de la vacuna es la lipoproteína. Por comodidad, se proporciona una secuencia referencia de PLP humana con identificador de secuencia Nº 1, y una proteína básica de la mielina con identificador de secuencia Nº 2. La lipoproteína es un componente principal de la mielina, y se sabe que está implicada en enfermedades desmielinizantes (véase por ejemplo, Greer y col.) (1992) J. Immunol. 149:783-788 y Nicholson (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:9279-9284).

La proteína PLP de membrana integral es un autoantígeno dominante de la mielina. Los determinantes antigénicos de la PLP han sido identificados en varias cepas de ratón, e incluyen los residuos 139-151 (Tuohy y col. (1989) J. Immunol. 142: 1523-1527), 103-116 (Tuohy y col. (1988) J. Immunol. 141:1126-1130], 215-232 (Endoh y col. (1990) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 92:433-438), 43-64 (Whitham y col. (1991) J. Immunol. 147:3803-3808) y 178-191 (Greer, y col. (1992) J. Immunol. 149:783-788). La inmunización con un PLP nativo o con péptidos sintéticos correspondientes a los epítopos de PLP inducen EAE. Los análogos de péptidos PLP generados por sustitución aminoacídica pueden prevenir la inducción de EAE y su desarrollo (Kuchroo y col. (1994) J. Immunol. 153:3326-3336, Nicholson y col. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:9279-9284).

MBP es una proteína de la mielina extrínseca que ya ha sido estudiada en profundidad. Se han descrito al menos 26 epítopos MBP (Meinl y col. (1993) J. Clin. Invest. 92:2633-2643). Son de particular interés para su uso en esta invención lo residuos 1-11, 59-76 y 87-99. Se ha demostrado que los análogos de péptidos MBP generados por truncamiento revierte la EAE (Karin y col. (1998) J. Immunol. 160:5188-5194). El ADN que codifica fragmentos polipeptídicos puede comprender secuencias que codifiquen epítopos inmunogénicos, por ejemplo, proteína básica de la mielina p84-102, más en particular, proteína básica de la mielina p87-99, (identificador de secuencia Nº 11) VHFFKNIVTPRTP (p87-99), o incluso el péptido truncado de 7 mer (identificador de secuencia Nº 12) FKNIVTP. También son de interés las secuencias del exón 2 de la proteína básica de la mielina, incluyendo el epítopo inmunodominante flanqueado por los aminoácidos 59-85. Vea ejemplos en Sakai y col. (1988) J Neuroimmunol 19:21-32; Baxevanis y col (1989) J Neuroimmunol 22:23-30; Ota y col (1990) Nature 346:183-187; Martin y col (1992) J Immunol. 148:1350-1366, Valli y col (1993) J Clin Inv 91:616. Se ha descubierto que el péptido inmunodominante MBP (84-102) tiene una alta afinidad de unión a las moléculas DRB1*1501 y DRB5*0101 del haplotipo DR2 asociado a la enfermedad. Los segmentos peptídicos solapantes pero diferentes fueron importantes para la unión a estas moléculas, los residuos hidrófobos (Val 189 y Phe 92) en el segmento MBP (88-95) para la unión del péptido a las moléculas DRB1*1501; los residuos hidrófobos y con carga (Phe 92, Lys 93) en la secuencia MBP (89-101/102) contribuyeron a la unión con DRB5*0101.

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La glicoproteína transmembrana MOG es un componente minoritario de la mielina que se sabe que induce la EAE. Los epítopos MOG inmunodominantes, que han sido identificados en varias cepas de ratón, e incluyen los residuos 1-22, 35-55, 64-96 (deRosbo y col.) (1998) J. Autoimmunity 11:267-299, deRosbo y col. (1995) Eur J Immunol. 25:985-993) y 41-60 (Leadbetter y co/. (1998) J Immunol 161:504-512).

Se introduce un casete de expresión de ADN que codifica al menos una porción del autoantígeno, normalmente como parte de un vector, en el tejido del receptor de la vacuna. El minigen se expresa en el tejido, y el polipéptido codificado actúa como un inmunógeno o antígeno. La secuencia del autoantígeno puede proceder de cualquier mamífero o ave, por ejemplo, primate sp., particularmente, humanos, roedores, incluyendo ratones, ratas y hámsteres, conejos, equinos, caninos felinos, etc. Son de particular interés los segmentos de autoantígeno de humano y ratón. Generalmente, la secuencia tendrá la misma especies de origen que el animal hospedador, preferentemente será autóloga.

El casete de expresión de ADN presentado comprenderá la mayor parte o toda la secuencia que codifica un fragmento de autoantígeno, según se define en Kabat y col., citado con anterioridad. La secuencia codificadora se puede truncar en los extremos 5' o 3'' y puede ser un fragmento con una secuencia polipeptídica completa. En una forma de realización de la invención, la secuencia codifica un fragmento peptídico que se sabe que es presentado a los linfocitos T patogénicos, por ejemplo péptidos presentados por moléculas MHC de clase II del hospedador. Dichos péptidos están descritos en la bibliografía, y tienen típicamente de aproximadamente 8 hasta aproximadamente 30 aminoácidos.

La vacuna se puede formular con una secuencia o con una combinación de secuencias de autoantígenos. Aunque se ha descubierto que una sola secuencia es capaz de reprimir una respuesta frente a múltiples epítopos, es muy deseable en algunos casos incluir múltiples secuencias, en la que cada una codifica un epítopo diferente. Véase por ejemplo Leadbetter y vol. (1998) J. Immunol. 161:504-512. Se puede usar una formulación que comprenda múltiples secuencias codificadoras de diferentes epítopos PLP para inducir una respuesta represora más potente y/o controlada. Al apuntar específicamente a múltiples poblaciones de linfocitos T autorreactivos, dicha formulación puede ralentizar o prevenir el desarrollo de resistencia a autoantígenos. El uso de secuencias PLP junto con otros epítopos de proteínas de la mielina puede suprimir eficazmente el repertorio de linfocitos T que reaccionan a la mielina.

Además de los epítopos específicos y los polipéptidos de autoantígenos, la respuesta inmunitaria se puede potenciar mediante la inclusión de secuencias CpG, como se describe en Krieg y col. (1998) Trends Microbiol. 6:23-27, and helper sequence, King y col. (1998) Nat. Med. 4:1281-1286. Los efectos biológicos de los motivos de ADN como dinucleótidos CpG desmetilados en el contexto de bases particulares (motivos CpG-S) puede modular la respuesta inmunitaria innata cuando se inyectan en animales. Los niveles bajos de motivos CpG, o la presencia de motivos imperfectos, pueden actuar en el desarrollo de anergia por inmunización con autoantígenos.

La secuencia que codifica el polipéptido, que puede ser secuencias de autoantígeno o citocina, se insertan en un casete de expresión apropiado. La construcción de expresión se prepara por métodos convencionales. El casete tendrá las secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales apropiadas para la expresión de la secuencia en las células que reciban la vacuna. El casete generalmente formará parte de un vector, que contiene un origen de replicación adecuado, y genes que codifican marcadores de selección necesarios para el crecimiento, amplificación y manipulación del vector, antes de introducirlo en el receptor. Los vectores adecuados incluyen plásmidos, YACs, BACs, bacteriófagos, retrovirus, y similares. Convenientemente, el vector de expresión será un plásmido. Antes de la vacunación, se puede aislar el casete de las secuencias del vector mediante cortes, amplificación, etc., como se sabe en la técnica. Para la inyección, el ADN puede estar superenrollado o ser lineal, preferentemente superenrollado. El casete se puede mantener en las células hospedadoras durante largos periodos de tiempo, o puede ser temporal, generalmente temporal. Para lograr un mantenimiento estable se inducen secuencias que proporcionen una integración o un mantenimiento, por ejemplo, vectores retrovirales, vectores EBV y similares.

El casete de expresión generalmente empleará una región de inicio de la transcripción exógena, es decir, un promotor diferente del promotor que está asociado al receptor del linfocito T normal del cromosoma. El promotor es funcional en células hospedadoras, en particular en las células hospedadoras en las que se va a inyectar el casete. El promotor se puede introducir mediante procedimientos recombinantes in vitro, o como resultado de la recombinación homóloga de la secuencia en una célula hospedadora adecuada. El promotor se une operativamente a la secuencia codificadora del autoantígeno para producir un transcrito de ARNm que se pueda traducir. Los vectores de expresión convenientemente tienen sitios de restricción localizados cerca de la secuencia promotora para facilitar la inserción de secuencias de autoantígeno.

Los casetes de expresión se preparan incluyendo una región de inicio de la transcripción, que puede ser constitutiva o inducible, el gen que codifica la secuencia del autoantígeno y la región de fin de la transcripción. Los casetes de expresión se pueden introducir en una variedad de vectores. Los promotores de interés pueden ser inducibles o constitutivos, normalmente constitutivos, y proporcionarán altos niveles de transcripción en las células receptoras de la vacuna. El promotor se puede activar sólo en el tipo celular del receptor, o ser más general y activarse en muchos tipos celulares diferentes. En la técnica, se conocen muchos promotores potentes para células de mamífero, incluyendo el promotor de la \beta-actina, los promotores tempranos y tardíos del SV40, promotor de inmunoglobulina, promotor de citomegalovirus humano, LTR retrovirales, etc. Los promotores pueden estar o no asociados con potenciadores, donde los potenciadores pueden estar asociado de modo natural con el promotor en cuestión o asociados a un promotor diferente.

Se proporciona una región de terminación 3' a la región codificadora, en la que la región de terminación puede estar asociada de modo natural al dominio de la región variable o puede derivar de un origen diferente. Se pueden emplear una amplia variedad de regiones de terminación sin afectar negativamente a la expresión.

Las diferentes manipulaciones se pueden llevar a cabo in vitro o se puede realizar en un hospedador apropiado, por ejemplo. E. coli. Tras cada manipulación, se puede subclonar la construcción resultante, el vector aislado, y el ADN analizado o secuenciado para garantizar la exactitud de la construcción. También se puede analizar la secuencia mediante análisis de restricción, secuenciación o similares.

Se puede introducir un pequeño número de nucleótidos en el extremo de la secuencia de autoantígeno, normalmente no más de 20, más comúnmente no más de 15. La deleción o inserción de nucleótidos se producirá normalmente como resultado de las necesidades de la construcción, proporcionando los sitios de restricción apropiados, la adición de señales de procesamiento, facilidad de manipulación, mejora en los niveles de expresión y similares. Además, uno puede desear sustituir uno o más aminoácidos por un aminoácidos diferentes por motivos similares, normalmente sin sustituir más de aproximadamente cinco aminoácidos en la región.

En una forma de realización de la invención el autoantígeno se administra junto con secuencias de ADN que codifican una citocina Th2, cuyo grupo incluye IL-4, IL-10, TGF-\beta, etc. IL4 es de particular interés. La linfocina IL-4 tiene actividad de factor de crecimiento de mastocitos y linfocitos T. La IL4 humana es una glicoproteína de 18 kD. Por comodidad, en la presente memoria descriptiva se proporciona la secuencia aminoacídica con el identificador de secuencia Nº 13, y la secuencia de ADN con el identificador de secuencia Nº 14 (Yokota y col. (1986) P.N.A.S. 83: 5894-5898). La secuencia es la secuencia preferente de la invención. Sin embargo, la invención no se limita al uso de esta secuencia en las construcciones de la invención. Además del uso de secuencias variantes relativamente próximas con la misma actividad biológica, o con sustancialmente una actividad biológica similar. Un sitio diana de unión al ADN STAT6 específico se encuentra en el promotor del gen del receptor de IL4, y STAT6 activa la expresión del gen IL4 a través de este lugar. Los interferones inhiben la activación inducida por IL4 de STAT6 y la expresión génica dependiente de STAT6, al menos en parte, induciendo la expresión de SOCS1 (véase Kotanides y col. (1996) J. Biol. Chem. 271:25555-25561).

Las secuencias variantes que codifican subunidades proteicas que, cuando están presentes en una construcción de ADN de la invención, confieren a la proteína una o más actividades biológicas de la IL4 como se describe con anterioridad. Las secuencias de ADN de la invención, pueden diferir de la secuencia de IL4 nativa, por deleción, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos, siempre que codifiquen una proteína con la actividad biológica apropiada como se describe con anterioridad. De modo parecido, se pueden truncar o elongar en uno o más aminoácidos. Alternativamente, las secuencias de ADN adecuadas para la práctica de la invención pueden ser secuencias degeneradas que codifican la proteína IL4 natural. Típicamente, las secuencias de ADN de la invención tienen al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia que codifica la IL4 nativa. Pueden proceder de diferentes especies, aunque los ADN que codifican proteínas humanas son los preferentes. Las secuencias variantes se pueden preparar mediante los medios adecuados conocidos en la técnica.

En lo que se refiere a las sustituciones, se prefieren las sustituciones conservativas. Típicamente, las sustituciones conservativas son sustituciones en las que se el aminoácido sustituido es de una naturaleza similar al que existe en la proteína natural, por ejemplo, en términos de carga y/o tamaño y/o polaridad y/o hidrofobicidad. De modo similar, las sustituciones conservativas, no tienen típicamente efecto sobre la actividad de la proteína. Las proteínas de la invención que tienen un secuencia diferente de la IL4 natural se pueden diseñar para que difieran en la actividad de la IL4 natural. Dichas manipulaciones se llevarán a cabo típicamente a nivel del ácido nucleico usando técnicas recombinantes, como las conocidas en la técnica.

La vacuna se puede formular con una secuencia o con una combinación de secuencias de autoantígenos, que pueden estar en el mismo o en diferentes vectores. Los vectores de ADN se resuspenden en un tampón fisiológicamente aceptable, generalmente una solución acuosa, por ejemplo, una solución salina normal, una solución salina tamponada con fosfato, etc. Se pueden usar agentes auxiliares como agentes estabilizantes, humectantes y emulsionantes, sales para variar la presión osmótica o tampones para asegurar un valor de pH, y potenciadores de la penetración dérmica. El ADN estará normalmente presente en una concentración de al menos aproximadamente 1 ng/ml y no más de aproximadamente 10 mg/ml, normalmente aproximadamente entre 100 \mug y 1 mg/ml.

En algunas formas de realización de la presente invención, se administra al paciente tanto la secuencia codificadora de un autoantígeno y la secuencia codificadora de una citocina Th2. La citocina y el autoantígeno se pueden administrar simultáneamente, o separados por un corto periodo de tiempo, a través de la misma o diferentes vías de administración. En una forma de realización, las dos secuencias se incluyen en la misma formulación, lo que significa que se administran juntas como parte de una sola composición. Las secuencias codificadoras pueden estar asociadas con otro enlace covalente en una única molécula de ácido nucleico, en la que pueden estar presente como dos secuencias codificadoras distintas separadas por una parada transcripcional, o pueden estar presentes como una sola proteína de fusión. Las dos secuencias también pueden estar unidas mediante un enlace no covalente como interacciones hidrófobas, puentes de hidrógeno, interacción iónica, fuerzas de Van der Waals, interacción magnética, o combinaciones de las mismas. Alternativamente, las dos construcciones pueden simplemente mezclarse en una suspensión común, o encapsularse juntas en alguna tipo de dispositivo de administración como por ejemplo, un dispositivo de alginato, una vesícula de chitosán liposomal, etc. (Véase por ejemplo el documento WO 98/33520).

La vacuna se puede fraccionar en dos o más dosis, de al menos aproximadamente 1 \mug, más normalmente al menos aproximadamente 100 \mug, y preferentemente al menos aproximadamente 1 mg por dosis, administradas con una separación entre aproximadamente 4 días hasta una semana. En algunas formas de realización de la invención, se somete al individuo a una serie de vacunaciones para producir un respuesta inmunitaria completa y general. De acuerdo con este procedimiento, se administra al menos dos y preferentemente cuatro inyecciones durante un periodo de tiempo. El periodo de tiempo entre las inyecciones puede incluir desde 24 horas de separación hasta dos semanas o más entre cada inyección, preferentemente una semana. Alternativamente, se administran al menos dos y hasta cuatro inyecciones diferentes simultáneamente en diferentes partes del cuerpo.

La vacuna de ADN se inyecta en el músculo u otro tejido vía subcutánea, intradérmica, intravenosa, oral o directamente en el líquido cefalorraquídeo. Es de particular interés esta infección en el músculo esquelético. La vacuna genética se puede administrar, directamente en el individuo que se va a inmunizar o ex vivo eliminando células del individuo que se reimplantarán después de la administración. A través de cualquiera de las vías, el material genético se introduce en las células que están presentes en el cuerpo del individuo. Alternativamente, la vacuna genética se puede introducir mediante diferentes medios en las células que se han obtenido del individuo. Tales medios incluyen, por ejemplo, transfección, electroporación, y bombardeo con microproyectiles. Una vez que la construcción genética haya penetrado en las células, se reimplantan en el individuo. Aparte de eso, las células no inmunogénicas que tienen construcciones genéticas incorporadas en su interior se pueden tomar de un individuo e implantarse en otro.

Se puede encontrar un ejemplo de inyección intramuscular en Wolff y col. (1990) Science 247:1485-1468. También se puede usar una inyección comprimida para la administración intramuscular, como se describe en Furth y col. (1992) Anal Biochem 205:365-368. El ADN puede estar adherido a micropartículas de oro, y administrarse vía intradérmica a través de un dispositivo de bombardeo de partículas, o "cañón génico". La vacunación con ADN en micropartículas está descrito en la bibliografía (véase por ejemplo Tang y col. (1992) Nature 356:152-154). Los microproyectiles de oro están recubiertos con el casete de la vacuna, entonces se realiza un bombardeo sobre las células de la piel.

Las vacunas genéticas están formuladas según el modo de administración que se va a usar. Cualquier experto en la materia puede formular fácilmente una vacuna genética que comprenda una construcción genética. En los casos en que se escoja como modo de administración la inyección intramuscular, se usa una formulación isotónica. Generalmente, se pueden incluir aditivos para alcanzar dicha isotonicidad que incluyen cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. Se prefieren soluciones isotónicas como una solución salina de tampón de fosfato. Los estabilizantes incluyen gelatina y albúmina.

De acuerdo con la presente invención, antes o junto con la administración de la construcción genética, las células pueden administrase junto con un agente estimulante celular o estimulante de la proliferación celular, cuyos términos se emplean indistintamente y se refieren a compuestos que estimulen la división celular y faciliten la entrada del ADN o del ARN.

Se puede administrar bupivacaína o compuestos que tengan una similitud funcional antes o junto con la vacuna. La bupivacaína es un homólogo de la mepivacaína y está relacionada con la lidocaína. Hace que el tejido muscular sea sensible al voltaje en presencia de calcio, y afecte a la concentración iónica intracelular. Además de la bupivacaína, mepivacaína, lidocaína y otros compuestos de actuación similar, otros agentes estimulantes celulares que se contemplan incluyen lectinas, factores de crecimiento, citocinas y linfocinas como por ejemplo derivados plaquetarios, factor de crecimiento (PDGF), gCSF, gMCSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF) e IL-4. Se puede administrar aproximadamente 50 ml hasta aproximadamente 2 ml de clorhidrato de bupivacaína 0,5% y metilparabeno 0,1% en un Vehículo farmacéutico isotónico en el lugar donde se va a administrar la vacuna, preferentemente desde 50 \mul hasta 1.500 \mul, más preferentemente aproximadamente 1 ml. La vacuna genética se puede combinar con colágeno como una emulsión y administrarse intraperitonealmente. La emulsión de colágeno proporciona un medio de liberación controlada de ADN se usan desde 50 \mul hasta 2 ml de colágeno.

Se puede mejorar la eficacia de la vacunación de ADN con la inyección de cardiotoxina en el tejido aproximadamente una semana antes de la vacunación, como se describe en Davis y col. (1993) FEBS Lett. 333:146-150, y en los ejemplos. La cardiotoxina estimula la degeneración y la regeneración muscular. Se inyecta en el músculo con aproximadamente 0,1 a 10 \muM de cardiotoxina disuelta en un vehículo farmacológicamente aceptable.

La dolencia que se está tratando, y el estado inmunológico del hospedador determinarán la elección de la(s) secuencia(s) de autoantígeno. Se puede evaluar la respuesta inmunitaria del hospedador frente una vacuna candidata con un autoantígeno mediante varios procedimientos conocidos en la técnica.

El diagnóstico puede determinar el nivel de reactividad, por ejemplo, en base al número de linfocitos T reactivos en una muestra, en comparación con un control negativo en un hospedador sin tratamiento previo, o normalizado en una curva de datos obtenida a partir de uno o más pacientes. Además de detectar la presencia cualitativa y cuantitativa de linfocitos T reactivos a autoantígenos, los linfocitos T se pueden clasificar según la expresión de citocinas que se sabe que activan o reprimen la respuesta inflamatoria. También podría ser deseable clasificar la especificidad epitópica de los linfocitos T reactivos.

Los linfocitos T se pueden aislar a partir de la sangre periférica de los pacientes, ganglios linfáticos o preferentemente a partir de una inflamación local. La valoración de la reactividad se puede realizar sobre linfocitos T primarios, o se pueden fusionar las células para generar hibridomas. Tales linfocitos T reactivos se pueden usar además en análisis adicionales de la progresión de la enfermedad, controlando su localización in situ, el uso de recetores de los linfocitos T, etc. Las valoraciones de la capacidad de respuesta de los linfocitos T es conocida en la técnica e incluye valoraciones de proliferación y valoraciones de liberación de citocinas.

Las valoraciones de proliferación miden el nivel de proliferación de los linfocitos T en respuesta a un antígeno específico y son generalmente usados en la técnica. En un ejemplo de valoración, se obtienen células del ganglio linfático, sanguíneas o esplénicas del paciente. Se prepara y lava una suspensión de aproximadamente 10^{4} hasta 10^{7} células, normalmente desde aproximadamente 10^{5} hasta 10^{6} células, después se cultivan en presencia del antígeno de control, y los antígenos de prueba. Los antígenos de prueba pueden ser péptidos de cualquier antígeno autólogo que se sospeche que pueda inducir una respuesta inflamatoria vía linfocitos T. Las células se cultivan normalmente durante varios días. La proliferación inducida por antígeno se valora realizando un seguimiento de la síntesis de ADN en los cultivos, por ejemplo, la incorporación de timidina H^{3} durante las últimas 18 h de cultivo.

Se usan ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA) para determinar el perfil de citocinas de los linfocitos T reactivos y se puede usar para analizar la expresión de dichas citocinas como IL-2, IL-4, IL-5, IFN\gamma, etc. Los anticuerpos de captura pueden ser cualquier anticuerpo específico de una citocina de interés, en el que los sobrenadantes de las valoraciones de proliferación de linfocitos T, como se describe con anterioridad, se usan convenientemente como fuente de antígenos. Después de bloquear y lavar, se añaden anticuerpos detectores etiquetados, y se determina las concentraciones de proteína presente como una función de la unión de la etiqueta.

Las valoraciones de diagnóstico anteriores se pueden realizar con varios péptidos derivados de la proteína autóloga de interés. Se puede usar una serie de péptidos con la secuencia de un autoantígeno, por ejemplo, PLP, MBP, etc. Se pueden analizar los péptidos posibles para determinar cuáles son inmunodominantes en el contexto de la enfermedad autoinmune.

Los péptidos inmunodominantes se pueden definir analizando un panel de péptidos derivados de la proteína de prueba. Los péptidos tienen la secuencia aminoacídica de una porción de la proteína, por lo general aproximadamente 8 y no más de aproximadamente 30 aminoácidos, más generalmente no más de aproximadamente 20 aminoácidos. El panel de péptidos representará la longitud de la secuencia de la proteína, es decir, todos los residuos están presentes en al menos un péptido. Preferentemente se generan péptidos solapantes, en el que se marca la pauta de lectura de cada péptido desde 1 a 5 aminoácidos, generando de este modo un juego de epítopos más completo. Los péptidos se pueden analizar inicialmente en grupos, y más tarde analizar según el epítopo exacto al que el linfocito T responderá, como se describe con anterioridad. Los péptidos inmunodominantes se reconocen en una fracción significativa de hibridomas restringidos a HLA, sensibles, por lo general aproximadamente 10%, más generalmente al menos aproximadamente 25% y pueden llegar hasta 80%.

La terapia del sujeto será deseablemente administrada durante la etapa presintomática o preclínica de la enfermedad, y en algunos casos durante la etapa sintomática de la enfermedad. Se prefieren los tratamientos tempranos, para evitar la pérdida de la función asociada con el daño tisular inflamatorio. La etapa presintomática o preclínica se definirá como el periodo no posterior a cuando hay una implicación de linfocitos T en el lugar de la enfermedad., por ejemplo, islotes de Langerhans, tejido sinovial, glándula tiroides, etc., pero la pérdida de la función aun no es lo suficientemente grave como para producir los síntomas clínicos indicativos de la enfermedad manifiesta. La implicación de linfocitos T se puede poner de manifiesto a través de la presencia de un número elevado de linfocitos T en el lugar de la enfermedad, la presencia de linfocitos T específicos para autoantígenos, la liberación de perforinas y granzimas en el lugar de la enfermedad, respuesta a terapia inmunosupresora, etc.

Con la patogénesis de la EM y la EAE hay asociado un aumento cuantitativo del número de linfocitos T autorreactivos con la mielina con capacidad de secretar IFN-gamma, lo que sugiere que los linfocitos T inductores o auxiliares autoinmunes de la sangre periférica de pacientes con EM pueden iniciar y/o regular el proceso de desmielinización en pacientes con tal dolencia. La enfermedad manifiesta está asociada con debilidad muscular, pérdida de reflejos abdominales, defectos visuales y parestesias. Durante el periodo presináptico hay infiltración de leucocitos en el líquido cefalorraquídeo, inflamación y desmielinización. El historial familiar y la presencia del haplotipo HLA DRB1*1501, DQA1*0102, DQB1*0602 son indicativos de una susceptibilidad a la enfermedad. Los marcadores sobre los cuales se puede realizar un seguimiento para controlar el desarrollo de la enfermedad son la presencia de anticuerpos en el líquido cefalorraquídeo, "potenciales evocados" vistos en un electroencefalograma de la corteza visual y del tronco encefálico. El tratamiento durante las etapas tempranas de la enfermedad disminuirá o detendrá la perdida adicional de funciones neurales.

Las especies de mamífero susceptibles a las dolencias inflamatorias incluyen caninos y felinos, equinos, bovinos, ovinos, etc. y primates, particularmente humanos. Se pueden emplear modelos animales, en particular lo mamíferos de pequeño tamaño, por ejemplo, murinos, lagomorfos en las investigaciones experimentales. Los modelos animales de interés incluyen a los implicados en la producción de anticuerpos que tengan isotipos asociados a la producción de IL-4, por ejemplo IgE, IgG1 e IgG4. Otros usos incluyen investigaciones en las que es deseable investigar un efecto específico en ausencia de inflamación mediada por linfocitos T.

Debe comprenderse que la invención no está limitada a la metodología en particular, protocolos, formulaciones y reactivos descritos, ya que tales, por supuesto, pueden variar. También se debe comprender que la terminología usada en la presente memoria descriptiva tiene sólo el propósito de describir formas de realización particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención que se verá limitada sólo a través de las reivindicaciones incluidas.

Debe observarse que según se usan en la presente invención y en las reivindicaciones incluidas, las formas singulares "un", "y" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un complejo" incluye una pluralidad de tales complejos y la referencia a "la formulación" incluye una referencia a una o más formulaciones y a sus equivalentes conocida por aquellos expertos en la materia, y así sucesivamente.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente memoria descriptiva tienen el mismo significado que normalmente cualquier experto en la materia a la que esta invención pertenece entendería. Aunque cualquier procedimiento, dispositivos o materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria descriptiva se pueden usar en la práctica o prueba de la invención, a continuación se describen los procedimientos, dispositivos y materiales preferentes.

Todas las publicaciones citadas en la presente memoria descriptiva se incluyen a modo de referencia con el propósito de describir y revelar, por ejemplo, los procedimientos y metodologías que se describen en dichas publicaciones que podrían ser usadas junto con la invención aquí descrita. Las publicaciones antes comentadas y las que sigan en el texto, se ofrecen solamente para su divulgación antes de la fecha de depósito de la presente solicitud. Nada incluido en la presente memoria descriptiva se debe interpretar como una admisión de que los inventores no tienen el derecho a antedatar cualquier divulgación en virtud de la invención anterior.

Los siguientes ejemplos se exponen para ofrecer a cualquier experto en la materia una completa divulgación y descripción de cómo hacer uso de la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que se refiere a la invención. Se ha realizado un gran esfuerzo para garantizar la precisión con respecto a los números empleados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, concentraciones, etc.) pero puede existir algún error y desviación experimental. A menos que se indique lo contrario, las partes, son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, y la presión es atmosférica o casi.

Parte experimental Materiales y procedimientos

Animales. Se compraron ratones SJL/J hembra de seis a ocho semanas a Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

Antígenos. Los péptidos se sintetizaron en un sintetizador de péptidos (modelo 9050: MilliGen, Burlington, MA) usando la química habitual del 9-fluorenilmetoxicarbonilo. Los péptidos se purificaron con HPLC. La estructura se confirmó mediante análisis aminoacídico y espectroscopía de masas. Los péptidos usados en los experimentos fueron: PLP_{139-151} (identificador de secuencia Nº 5 HSLGKWLGHPDKF). PLP_{139-151} L144/R147 (identificador de secuencia Nº 6 HSLGKLLGRPDKF), y PLP178-191 (identificador de secuencia Nº 6 NTWTTCQSIAFPSK). Se usó un homogeneizado (SCH) de médula espinal de cobaya después de la liofilización.

Vector de expresión del péptido PLP. Se construyeron tres minigenes, codificando cada uno un epítopo PLP, alineando dos oligonucleótidos con una secuencia complementaria solapante de 16 mer (subrayada), y elongando el ADN con ADN polimerasa y dNTP.

100

Estos dúplex de oligonucleótidos están diseñados para incorporar sitios de restricción Xho I y Xba I.

Los productos se clonaron en la región de clonación múltiple del vector pTARGET (Promega, Madison, WI), un vector de expresión en mamíferos bajo el control del promotor CMV. Los clones positivos se identificaron con un análisis del color y la orientación correcta se confirmó con secuenciación automática del ADN. La purificación del ADN plasmídico se realizó con Wizard plus Maxipreps (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Protocolo de inmunización con ADN. Se inyectó a los animales de experimentación 0,1 ml de clorhidrato de bupivacaína al 0,25% (Sigma, St. Louis, MO) en PBS en el cuadriceps izquierdo. Dos y diez días después, se inyectó a los ratones 0,05 ml de ADN plasmídico (1 mg/ml en PBS), en el mismo músculo.

ELISA para las titulaciones de anticuerpos anti PLP_{139-151} o anti SCH de cobaya. Se revistieron placas de microtitulación de 96 pocillos de poliestireno (Dynatech, Chantilly, VA) con 0,1 ml del péptido o de SCH de cobaya, diluidos en PBS a una concentración de 0,01 mg/ml en PBS. Después de bloquear con PBS + 0,05% de suero de timo fetal (Gibco) y 0,05% de Tween 20 (Bio-Rad, Hercules, CA), se incubaron los sueros de los ratones durante dos horas a temperatura ambiente y se probó la unión de los anticuerpos añadiendo una IgG caprina anti ratón obtenida conjugada con fosfatasa alcalina (Southern Biotechnology, Birmingham, AL). Después de la adición del sustrato del enzima, se leyeron las placas a 405 nm en un lector ELISA. La figura 1 muestra los resultados de los sueros tomados diete días después de la segunda inyección intramuscular expresada como D.O. de las muestras individuales en un grupo de diez animales. Los
valores de D.O. para sueros preinmunizados fueron: dilución 1:10: 0,12, dilución 1:20: 0,08, y dilución 01:40: 0,03.

Inducción de EAE. Se disolvió el péptido PLP139-15 en PBS a una concentración de 2 mg/ml y se emulsionó con un volumen igual de Adyuvante de Freund incompleto complementado con 4 mg/ml de H37Ra de Mycobacterium tuberculosis destruido con calor (Difco Laboratories, Detroit, MI). Se inyectó a los ratones vía subcutánea 0,1 ml de la emulsión peptídica y, el mismo día y 48 h después, vía intravenosa 0,1 ml de 4 \mug/ml de toxina de Bordetella pertussis en PBS. Se valoró el estado de los animales de experimentación del siguiente modo: 0 = sin enfermedad clínica; 1 = debilidad o parálisis de la cola; 2 = debilidad de las patas traseras; 3 = parálisis de las patas traseras; 4 = debilidad o parálisis de las patas delanteras; 5 = animal muerto o moribundo.

Valoraciones de la proliferación celular en ganglios linfáticos. Se eliminaron los ganglios linfáticos secretores de ratones tras la fase aguda de la enfermedad y se realizaron ensayos in vitro con las células del ganglio linfático (CGL) para estudiar las respuestas proliferativas específicas del péptido PLP_{139-151}. Se prepararon cultivos en placas microtitulación de 96 pocillos de fondo plano en un volumen de 0,2 ml/pocillo a una concentración celular de 2,53 x 10^{6}/ml. Los medios de cultivo tisulares para el ensayo están compuestos por RPMI 1640 complementado con L-glutamina (2 mM), piruvato de sodio (1 mM), aminoácidos no esenciales (0,1 mM), penicilina (100 u/ml), estreptomicina (0,1 mg/ml), 2-mercaptoetanol (5 x 10^{-5} M) y suero de ratón normal autólogo nuevo al 1%. Tras 72 h de incubación a 37ºC, las células fueron tratadas durante 18 h con 1 \muCi/pocillo de timidina (H^{3}). Se recogieron los cultivos de las placas y se midió la incorporación de timidina (H^{3}) en un contador de centelleo. Después de la recuperación de la fase aguda de la enfermedad, se sacrificaron los animales inyectados con ADN que codifica PLP_{139-151} o con el vector control, pTARGET, y se aislaron las CGL secretoras. Se realizaron ensayos in vitro con las células estimulándolas con diferentes concentraciones del péptido PLP_{139-151} o el péptido control PLP178-191. En la figura 2 se muestran las respuestas proliferativas de conjuntos de CGL de grupos de cinco animales como RPM (recuento por minuto) promedio \pm DE de tres muestras de pocillos. El RPM de las CGL estimuladas con concanavalina A (0,001 mg/ml) fue 102401 para el grupo A y 76702 para el grupo B.

Determinación de citocinas. Se recogieron CGL secretoras (10^{7} células/ml) de los animales de experimentación después de la fase aguda de la enfermedad y se estimularon in vitro con varias concentraciones de antígeno. Después de 24 y 48 h de estimulación se recogieron los sobrenadantes y se realizó un ensayo ELISA tipo sándwich.

Ensayo de protección a la ribonucleasa. Para la detección de ARNm de tejidos, se realizaron pruebas con muestras de ARN de CGL de animales de experimentación usando el sistema Multi-Probe RNase Protection Assay (RPA) System, RiboQuant (Pharmigen, San Diego, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Análisis. fluorocitométrico Se incubaron células esplénicas de ratones SJUJ sin tratamiento previo (5 x 10^{6}) en presencia del ADN plasmídico que codifica la secuencia PLP_{139-151} (0,01 mg/ml) a 37ºC. Después de 24 h se recogieron las células y se analizaron en un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson). Se usaron los siguientes conjugados de anticuerpos: FITC anti ratón CD80, clon 16-10A1; FITC anti ratón CD86, clon GL1; FITC anti ratón I-A^{k}, clon 10-3.6; anti ratón B220 conjugado a R-PE, clon RA3-6B2; anti ratón CD11b conjugado a R-PE, clon M1/70; anti ratón conjugado a PE, clon GK 1.5. Todos los anticuerpos fueron comprados a Pharmigen, San Diego, CA. Después de 24 h de incubación in vitro sin ADN (sin) o con un ADN plasmídico que codifica un péptido PLP_{139-151} [DNA (PLP_{139-151})], las células esplénicas se tiñeron con anti-Mac 1 mAb, anti-B220 mAb, anti-B7.1 mAb, and anti-B7.2 mAb como se indica. El blanco se refiere a una tinción de fondo no específica. Los resultados mostrados en la figura 4 son representativos de tres experimentos.

Resultados

Se clonó el minigen que codifica el péptido PLP_{139-151}, en un vector de expresión y se inyectó vía intramuscular en ratones SJUJ, dos veces, con una semana de diferencia. Diez días después de la última inyección, se extrajo la sangre de los animales de experimentación y se realizaron pruebas con su suero para analizar la presencia de anticuerpos específicos. Como se muestra en la figura 1, se pueden detectar titulaciones de IgG anti-PLP_{139-151} en los ratones que habían recibido la inyección con el minigen PLP_{139-151}. Así, con esta construcción particular, se inducen respuestas inmunitarias serológicas específicas.

Para determinar si la inyección de ADN con secuencias PLP puede ser eficaz para proteger a los ratones de la EAE, se inyectó la construcción con el minigen PLP_{139-151}, vía intramuscular, dos veces, con una semana de diferencia. Diez días después de la última inyección, se expusieron a los ratones con el péptido PLP_{139-151} emulsionado con CFA. Como se muestra en la tabla 1, se observa una mejora de la enfermedad clínica aguda en animales vacunados con el vector plasmídicos PLP_{139-151}, en comparación con el grupo con el plásmido de control. La aparición de la enfermedad se retrasó en comparación con el grupo con el plásmido de control (11,5 \pm 0,5 días p<0,008), el pico promedio de gravedad de la enfermedad se redujo (p<0,005), y la valoración promedio de la enfermedad se redujo también (p<0,0005). Además, se inyectó a otros grupos a) un plásmido con un minigen que codifica el ligando peptídico alterado PLP p_{139-151} (W144>L, H147>R), b) un plásmido con un minigen que codifica el epítopo PLP p178-191. El inicio de la enfermedad se retrasó (11,6 \pm 0,5 días p<0,009) y el pico promedio de valoración de la enfermedad también se redujo (p<0, 02) con el minigen que codifica el ligando peptídico alterado (W144, H147). Además, el inicio de la enfermedad se retrasó (11,5 \pm 0,4 días, p<0,003), el pico promedio de gravedad de la enfermedad se redujo (p<0,007) y el pico promedio de valoración de la enfermedad también se redujo (p<0,0001) con el minigen que codifica el péptido PLP p178-191.

TABLA 1 Inducción de EAE en ratones SJL/J inmunizados con ADN

ADN	Porcentaje de	Valoración promedio de	Día promedio del	Pico promedio de la
inyectado	incidencia	la enfermedad el día 11\dagger	inicio de la enfermedad	gravedad de la enfermedad
PLP_{139-151}	68 (13/19)*	0,9 \pm 0,3	11,5 \pm 0,5	1,7 \pm 0,4
		(p<0,0005)¶	(p<0,008)	(p<0,005)
PLP 178-191	70 (14/20)	0,6 \pm 0,2	11,5 \pm 0,4	1,8 \pm 0,3
		(p<0,0001)	(p<0,0035)	(p<0,007)
PLP_{139-151}	85 (17/20)	1,2 \pm 0,3	11,6 \pm 0,5	2,0 \pm 0,3
(L>R)
		(p<0,001)	(p<0,009)	(p<0,01)
pTARGET	90 (18/20)	2,7 \pm 0,3	10,1 \pm 0,27	3,1 \pm 0,3
Sin plásmido	100 (10/10)	2,1 \pm 0,7	9,9 \pm 0,4	3,3 \pm 0,3
* Los números entre paréntesis indican animales enfermos o animales sobrevalorados
\dagger Significa indicado como promedio \pm ESM.
¶ Todos los valores p se indican en comparación con el pTARGET usando el test t de Student.

Se sacrificaron los ratones, que recibieron la inyección con ADN y además fueron expuestos al péptido encefalitogénico PLP_{139-151}, después de la resolución de la fase aguda de la enfermedad. Se reestimularon in vitro las CGL secretoras con el péptido PLP39-151 y se realizaron pruebas para investigar las respuestas proliferativas y la producción de citocinas. La figura 2 muestra que las CGL de ratones inyectados con el ADN que codifica el péptido PLP_{139-151} tenían una menor respuesta proliferativa en comparación con las CNL de los animales de control (p<0,01). La figura 3 (A) muestra que, cuando se estimularon con el PLP_{139-151}, las CGL de ratones inmunizados con ADN plasmídico que codifica la región PLP_{139-151} secretan menores niveles de IL-2 e interferón-\gamma en comparación con los grupos de control. Para valorar los niveles de ARNm transcritos de citocinas en cerebro inflamado utilizamos un ensayo de protección a la ribonucleasa del ARNm aislado del tejido cerebral. La figura 3 (B) revela una reducción de los niveles de ARNm de interferón-\gamma e IL-15 en ratones inmunizados con el minigen que codifica la región PLP_{139-151}. Por lo tanto, es evidente que hay una correlación entre la baja incidencia de enfermedad clínica, respuestas celulares reducidas y bajos niveles de IL-2, IL-15 e interferón-\gamma en los ratones vacunados con ADN. Se midieron los niveles de expresión relativos a las bandas de ARNm mostradas en la figura 3B mediante densitometría. Para corregir las diferencias debidas a la carga, se normalizaron los valores según el nivel de expresión del gen de mantenimiento, GAPDH, en cada muestra. Existe una reducción del nivel de expresión de las citocinas probadas en cerebros de ratones vacunados con el ADN plasmídico que codifica el determinante PLP_{139-151} en comparación con los ratones vacunados con el pTARGET y el ADN plasmídico PLP_{139-151} (L/R).

Para elucidar el mecanismo de las respuestas linfocíticas T disminuidas, realizamos ensayos in vitro sobre el efecto de CPA cultivadas en presencia de ADN, sobre la respuesta proliferativa de los linfocitos T específicos de PLP_{139-151}. Se incubaron esplenocitos con el ADN plasmídico que codifica el segmento PLP_{139-151}, o con el péptido PLP_{139-151} y se usaron como fuente de CPA para estimular células L139, una línea de linfocitos T específicos para PLP_{139-151}. Se comparó la respuesta proliferativa de la línea de linfocitos T L139 frente a las CPA anteriores en presencia o ausencia de perlas recubiertas de anticuerpos anti CD28. Como se muestra en la Tabla 2, las células L139 respondieron a las CPA singénicas preincubadas con el péptido sintético PLP_{139-151} [8512 RPM promedio]. Esta respuesta aumenta al añadir anticuerpos anti CD28 [127281RPM promedio]. Sin embargo, cuando se incubaron las CPA con el ADN plasmídico con la secuencia codificadora de PLP_{139-151}, las células L139 fueron incapaces de responder a las CPA [3358 RPM promedio], incluso en presencia de anticuerpos anti CD28 anticuerpo [4532 RPM promedio]. Esta regulación a la baja no fue efecto del propio plásmido, ya que las CPA incubadas con el plásmido con una secuencia irrelevante no afectaron a la respuesta proliferativa de las células L139 frente a los anticuerpos anti CD28 [4532 RPM frente a 26363 RPM promedio, p<0,0001]. Por lo tanto, los linfocitos T específicos para PLP_{139-151} fueron incapaces de responder a la coestimulación con CD28 cuando se cultivaron en presencia de las CPA transformadas con el ADN plasmídico que codifica la secuencia PLP_{139-151}.

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TABLA 2 Respuesta proliferativa de una línea celular de linfocitos T específicos para PLP_{139-151} en presencia de esplenocitos singénicos transformados con el ADN plasmídico o con el péptido sintético

ADN^{1} plasmídico	ADN^{1} plasmídico	Péptido^{1}	Péptido^{1}	Coestimulación^{2}	RPM^{3}
pTARGET	PLP_{139-151}	HSV-VP16	PLP_{139-151}	con anti CD28	(promedio)
-	-	-	-	-	2186
-	-	+	-	-	2402
-	-	+	-	+	15139
-	-	-	+	-	8512
-	-	-	+	+	127281
+	-	-	-	-	2331
+	-	-	-	+	26363*
-	+	-	-	-	3358
-	+	-	-	+	4532*
^{1} \begin{minipage}[t]{155mm}Se irradiaron esplenocitos (5 x 10^{6}\text{/}ml) de ratones SJL/J sin tratamiento previo (3000 rads) y se incubaron en presencia del ADN plasmídico que codifica la secuencia PLP_{139-151}, sólo el plásmido (pTARGET), el péptido PLP_{139-151}, o el péptido de control (HSV VP16). La concentración de ADN fue de 0,01 mg/ml y la concentración de péptido fue de 0,001 mg/ml. Tras una incubación inicial de 24 horas, se lavaron dos veces los esplenocitos y se añadieron a cada pocillo 10.000 linfocitos T procedentes de la línea de linfocitos T específica para el péptido PLP_{139-151}, L139. Después de 48 horas de incubación adicional, se etiquetó la placa con timidina-H^{3} y se evaluó la proliferación recogiendo las células 18 horas después y midiendo la incorporación de timidina-H^{3}. Para demostrar que el ADN desnudo aplicado exógenamente es asimilado por los esplenocitos, y que se expresa, se usó la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa usando una transcriptasa reversa (RT-PCR). El ARN total se purificó a partir de esplenocitos usando el kit Rneasy total (Quiagen Inc., Valencia, CA). La RT-PCR se realizó usando el sistema Access RT-PCR System (Promega Corp., Madison, WI) y cebadores oligonucleotídicos específicos para el minigen PLP_{139-151}. Se usaron cebadores específicos para el vector en una reacción de RT-PCR diferente para excluir la posibilidad de contaminación de ADN. Se amplificó una sola banda que corresponde al minigen PLP_{139-151} a partir del ARN total purificado a partir de los esplenocitos transformados con el ADN plasmídico PLP_{139-151} (datos no mostrados).\end{minipage}
^{2} \begin{minipage}[t]{155mm}La señal coestimuladora se envió añadiendo perlas recubiertas con anti CD28 (5.000 por pocillo) junto con los linfocitos T. El anticuerpo anti CD28 (clon 37.51) fue suministrado por PharMingen (San Diego, CA). Las microesferas de látex de sulfato de poliestireno de 5 0,1 \mu m de diámetro fueron suministrados por Interfacial Dynamics Corporation (Portland, OR). Las perlas (6 x 10^{6}) se resuspendieron en 6 ml de PBS y se incubaron con 24 \mu g de anticuerpo anti CD28 durante 1,5 horas a 37^{o}C. Las perlas se lavaron minuciosamente con PBS y se resuspendieron en RPMI con FCS al 10% y se dejó que se bloquearan durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente.\end{minipage}
^{3} Los resultados se expresan como RPM promedio de tres pocillos.
* \begin{minipage}[t]{155mm}El valor p es < 0,0001 para la diferencia entre el RPM de los linfocitos T incubados en presencia de esplenocitos con el ADN plasmídico pTARGET frente a los linfocitos T incubados en presencia de esplenocitos con el ADN plasmídico PLP_{139-151}, en presencia de anticuerpos anti CD28.\end{minipage}

El presente estudio demuestra la protección frente a la inmunización con el ADN plasmídico que codifica los minigenes de la mielina.

Se creó una vacuna de ADN introduciendo la secuencia codificadora de la región PLP_{139-151} en un plásmido bacteriano bajo el control del promotor CMV. Este vector se inyectó en ratones SJUJ antes de la inducción de la EAE con la inmunización con el péptido PLP_{139-151} en CFA. Los animales que recibieron el plásmido que codifica el epítopo encefalitogénico estaban protegidos frente a la inducción de la EAE. Los análisis de las respuestas inmunitarias en los animales protegidos demuestran la baja proliferación de los linfocitos T y la secreción de citocinas proinflamatorias disminuida, tanto en órganos linfáticos como en el órgano diana, el cerebro, en comparación con el grupo de control. Estas características sugieren que la inmunización con ADN insensibiliza a los linfocitos T patogénicos.

La capacidad de las construcciones de minigenes para regular a la baja el efecto coestimulador de los anticuerpos anti CD28 sobre una línea de linfocitos T específicos para PLP enfatiza su capacidad para modular las interacciones de los linfocitos T con las CPA. Los análisis fluorocitométricos se llevaron a cabo para determinar si la inmunización con ADN influye a la expresión de ligandos CD28 de superficie en las CPA. Después de 24 h de incubación con el ADN plasmídico, se tiñeron los esplenocitos con anticuerpos anti 87.1 (CD80) o anti 87.2 (CD86). Como se muestra en la figura 4, se observa regulación al alza de B7.1 y B7.2 en las células positivas a Mac-1, pero no en las células B220+, donde se observó una regulación a la baja de B7.2. La expresión de I-A^{s} en esplenocitos también aumento tanto en las células positivas a Mac-1 como en las positivas a B220 tras la incubación con este ADN.

Se ha observado una regulación al alza de moléculas coestimuladoras in vivo en linfocitos de sangre periférica y esplenocitos de animales inoculados con casetes de expresión de ADN que codifican la proteína p55 del núcleo del VIH. En contraste con esta observación, descubrimos que en respuestas inmunitarias al PLP_{139-151} los cambios de expresión de las moléculas coestimuladoras después de la inmunización con ADN ejerce un efecto modulando el potencial proliferativo y la producción de citocinas de los linfocitos T autorreactivos. Recientemente se ha descrito que en EAE, hay una potenciación de la expresión de B7.1 relativa a B7.2, en el entorno esplénico, un descubrimiento que puede ayudar a explicar cómo se inclina el sistema inmunitario hacia la autoinmunidad, en lugar de autoignorarse inmunológicamente. Algo muy interesante, es que los niveles de 87.2 aumentan en el SNC durante la EAE activa y durante las recaídas. La regulación a la baja de B7.2 está correlacionada con su remisión. Los cambios en la expresión de B7-1 y B7-2 después de que las células presentadoras de antígenos (CPA) asimilen el ADN podría ser un factor clave en la regulación de las respuestas de los linfocitos T hacia autoantígenos en enfermedades autoinmunes.

Las vacunas de ADN han sido eficaces en la generación de respuestas inmunitarias protectoras en varios modelos de cáncer, y de infecciones virales, bacterianas y parasitarias. Aunque la generación de respuesta tipo Th1 pueda ser una propiedad de las vacunas de ADN cuya diana son los antígenos no propios, no se han logrado respuestas Th1 producidas hacia uno mismo con la vacuna de ADN.

Los efectos biológicos de los motivos de ADN como los dinucleótidos CpG desmetilados en contextos de bases particulares (motivos CpG-S) pueden modular las respuestas inmunitarias innatas cuando se inyectan en animales (Krieg, A.M. y col. 1998. Trends in Microbiol. 6, 23-27). Aunque no podemos descartar un posible efecto de tales secuencias en las construcciones PLP_{139-151} y PLP 139/151 (UR), los motivos CG en estos insertos no cumplen todos los criterios de un motivo CpG-S.

Lewis describió la supresión de la EAE en ratas previamente inmunizadas con el ADN que codifica un péptido MBP inmunodominante en tándem con un receptor de Fc de IgG. La vacunación suprimió los signos clínicos e histopatológicos de la EAE, y redujo la producción de interferón-\gamma tras la exposición al péptido MBP 68-85 [Lobell y col. (1998) J. Exp. Med. 187:1543-1548]. La vacunación no tuvo éxito sin la inclusión de una construcción de Fc de IgG en tándem. En los experimentos que incluimos en la presente memoria descriptiva, aparentemente no hubo necesidad de ninguna construcción en tándem junto con el minigen de mielina. Tanto en este artículo como en los experimentos que utilizan ADN con la construcción de Fc de IgG, se observó una reducción de la autoinmunidad Th1. Por el contrario, nuestro laboratorio ha descrito la inducción de respuestas proliferativas tipo Th2 mediante inmunización con ADN en EAE [Waisman, 1996 citado con anterioridad]. Por lo tanto, la respuesta inmunitaria frente a una vacuna de ADN que se codifica un antígeno propio podría ser muy distinta de la que se observa con la vacunación con ADN frente a antígenos extraños. Se podría prever que las respuestas inmunitarias inducidas por autoantígenos codificados en vacunas de ADN serían análogas a las que se había observado con la inmunización con el mismo autoantígeno del péptido o forma proteica. Nuestros resultados sugieren que un autoantígeno codificado en un vector de ADN puede insensibilizar a los linfocitos T autorreactivos, y evitar un ataque autoinmunitario. La coestimulación de linfocitos T con el ADN que codifica autoantígenos es defectuosa, atenuándose así los linfocitos T patogénicos. Nuestras observaciones en la EAE sugieren un modelo en el que se puede usar la inmunización con ADN como tratamiento de la enfermedad autoinmune.

Ejemplo 2 La protección frente la enfermedad autoinmune y una vacuna simultánea con ADN de interleucina 4 a través de la inducción de los linfocitos T auxiliares tipo 2 y del activador STAT6

El siguiente ejemplo demuestra que la covacunar los genes de la citocina IL4 junto el gen PLP_{139-151} como dos plásmidos diferentes puede suministrar inmunidad contra la EAE. Además, se propone un mecanismo, en el que la IL4 funcional expresada a partir de la vacuna de ADN actúa localmente sobre los linfocitos T autorreactivos a través de la activación de STAT6 para alterar su perfil de expresión de citocinas hacia un tipo Th2. Estos resultados muestran el diseño de un novedoso procedimiento de tratamiento de enfermedades autoinmune que combina los efectos específicos de antígeno de la vacunación con ADN junto con los efectos beneficiosos de la administración génica local.

Resultados

La vacuna con ADN de IL4 produce la proteína IL4. Para construir la vacuna con ADN de IL4, se amplificó por PCR toda la secuencia codificadora de IL4 a partir de ADNc de bazo de ratón. El gen se clonó en el vector de expresión en mamíferos pTARGET bajo el control del promotor CMV y se purificó el plásmido como se describe en la sección de procedimientos. Para demostrar que la construcción con ADNc de IL4 podía realmente producir la proteína IL4 completa, se usó un sistema de traducción in vitro. Cuando se transcribió el plásmido con el ADNc de IL4 y se tradujo in vitro con metionina S^{35} y se cargó en un gel de electroforesis de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se autorradiografió, se observó un único producto del tamaño adecuado para la IL4 de ratón. Una reacción de control con un vector de ADN sin inserto o un plásmido que codifica PLP_{139-151} no produjeron un producto detectable. El peso molecular teórico de PLP_{139-151} es aproximadamente 1,5 kD, por lo tanto, sería extremadamente difícil visualizarlo por electroforesis.

La vacunación con ADN de IL4 provoca la activación de STAT6. Para demostrar que una vacuna de ADN puede actuar como un vehículo de administración génica, quisimos profundizar en la cuestión de si realmente se estaba expresando una citocina IL4 funcional a partir de la vacuna de ADN administrada al animal. Se sabe que IL4 actúa a través del receptor de IL4 para activar específicamente STAT6, un miembro de la familia de transductores de señales y activadores de la transcripción (Takeda y col. (1996) Nature 380: 627-30; Quelle y col. (1995) Mol Cell Biol 15:3336-43.

Los ratones fueron vacunados vía intramuscular semanalmente con un ADN plasmídico que codificaba el ADNc de IL4 como se describe en la sección de procedimientos. Se diseccionaron los ganglios linfáticos secretores de ratones después de la vacunación con el ADN. Se aislaron lisados de proteínas a partir de las células de ganglios linfáticos, y se probó la presencia en ellos de STAT6 activado con una inmunotransferencia tipo Western usando un anticuerpo policlonal específico de la forma fosforilada de STAT6. Como controles, se vacunó también a los ratones sólo con el vector pTARGET, o sin ADN. Sólo se observó la forma fosforilada y activada de sTAT6 en ganglios linfáticos procedentes de ratones vacunados con el ADN de IL4. La proteína STAT6 activada tiene una altura de aproximadamente 60 kD.

Se obtuvieron idénticos resultados en otro experimento en el que los ratones recibieron tres dosis diarias, de la vacuna de ADN, en lugar de una a la semana. Los ratones fueron vacunados vía intramuscular diariamente con un ADN plasmídico durante tres días. Un día después de la última vacuna de ADN, se obtuvieron lisados proteicos a partir de los ganglios linfáticos secretores y se analizaron como se describe anteriormente en un Western usando un anticuerpo anti STAT6 fosforilado. Sólo se observó una banda de 60 kD en ganglios linfáticos procedentes de ratones vacunados con el ADN de IL4.

La covacunación con el ADN que codifica IL4 y el minigen PLP_{139-151} protegen frente a la inducción de la EAE. Para analizar el efecto de la modificación de la protección que ofrece la inmunización con ADN con el gen que codifica el PLP_{139-151}, se covacunaron ratones con los genes IL4 y PLP_{139-151} en dos plásmidos diferentes. El gen murino IL4 se clonó en el vector de expresión en mamíferos pTARGET bajo el control del promotor CMV como se describe anteriormente. El gen que codifica el PLP_{139-151} se obtuvo como se describe anteriormente.

Se inyectaron 100 \mug de cada plásmido, dos veces, en ratones SJL/J vía intramuscular, con intervalos semanales. Se inyectó el vector solo o PBS en los ratones de control. Diez días después de la última inyección, se indujo la EAE en los ratones con el péptido encefalitogénico PLP_{139-151} emulsionado en adyuvante completo de Freund (CFA). Como se muestra en la figura 3, hay un significativo descenso en las puntuaciones medias de la enfermedad en ratones covacunados tanto con el plásmidos con IL4 como con el plásmido con PLP_{139-151} en comparación con los controles. Además hay una disminución en la incidencia de la enfermedad y el pico medio de la gravedad de la enfermedad con la covacuna en comparación con los controles. La aparición de la enfermedad no se retrasa significativamente en comparación con los grupos control. No se ha observado una protección significativa de la enfermedad en ratones vacunados sólo con el ADN que codifica la IL4.

TABLA 2 Gravedad de la enfermedad EAE en ratones vacunados con ADN

ADN	n	Porcentaje	Pico^{a} promedio	Valoración	Valoración	Valoración
		de Incidencia	de la gravedad	promedia	promedia	promedia
			de la enfermedad	el día 12	el día 14	el día 16
Ninguna	14	86	2,3 \pm 0,3	1,6 \pm 0,4	1,2 \pm 0,2	0,7 \pm 0,3
pTARGET	15	93	2,4 \pm 0,2	1,6 \pm 0,3	1,7 \pm 0,2	1,1 \pm 0,2
IL4	15	80	2,7 \pm 0,3	1,4 \pm 0,3	1,1 \pm 0,2	0,4 \pm 0,2
IL4 y	15	53	1,6 \pm 0,3	0,8 \pm 0,3	0,7 \pm 0,3	0,5 \pm 0,2
PLP_{139-151}			(p<0,0383)^{b}	(p<0,0494)	(p<0,0035)	(p<0,0494)
^{a} Significa indicado como promedio \pm ESM.
^{b} Todos los valores p se indican en comparación con el pTARGET usando el test t de Student.

La covacunación con el ADN que codifica la IL4 recupera las respuestas proliferativas en animales vacunados con el ADN de PLP_{139-151}.

Se vacunó a los ratones con ADN y se expusieron al péptido PLP_{139-151} para inducir la enfermedad, se sacrificaron tras la recuperación de la fase aguda inicial de la enfermedad. Se obtuvieron células de ganglios linfático secretores (CGL) a partir de ratones y se reestimularon in vitro con el péptido PLP_{139-151} para determinar sus respuestas proliferativas. Además, se mantuvieron líneas de linfocitos T específicos de antígeno a partir de estas CGL para analizar sus perfiles de secreción de citocinas.

Se analizaron las respuestas proliferativas al péptido PLP_{139-151} en las CGL. NO hubo un cambio significativo en al patrón de proliferación de las CGL de ratones vacunados con IL4 y covacunados con ADN de PLP_{139-151} en comparación con los ratones de control vacunados sólo con el vector. Por el contrario, las CGL de ratones vacunados con el ADN de PLP_{139-151} tuvieron una reducida capacidad proliferativa. Hemos demostrado previamente que estos linfocitos T son anérgicos (Ejemplo 1). Por lo tanto, la adición de IL4 como covacuna de ADN es capaz de recuperar la anergia impuesta por la vacuna con ADN de PLP_{139-151}. Así, se puede ofrecer un mecanismo diferente de covacunación con ADN de IL4 en comparación con la vacunación sólo con ADN de PLP_{139-151}.

La covacunación con el ADN que codifica IL4 cambia el fenotipo de los linfocitos T hacia el tipo Th2. Se aislaron líneas de linfocitos T específicos de PLP_{139-151} y se mantuvieron en cultivo a partir de ratones expuestos al PLP_{139-151} para inducir la enfermedad y que previamente habían sido vacunados con varias combinaciones de ADN. Se realizaron pruebas sobre estas líneas de linfocitos T para analizar la producción de citocinas in vitro después de la estimulación con el péptido PLP_{139-151}. Los linfocitos T obtenidos de ratones covacunados con el ADN de IL4 y PLP_{139-151} produjeron cantidades significativamente mayores de IL4 (promedio de 716 \pm 237 pg/ml frente a los 0,208 \pm 0,36 pg/ml de los ratones vacunados con el pTARGET, p< 0,0064) e IL10 (promedio de 1073 \pm 221 pg/ml frente a los 464 \pm 44 pg/m de los ratones vacunados con el pTARGET p< 0,0151) en comparación con los ratones de control. Además, los linfocitos T de los ratones covacunados con el ADN de IL4 y PLP_{139-151} produjeron cantidades menores de IFN\gamma en comparación con los linfocitos T de control (promedio de 1389 \pm 108 pg/ml frente a los 6689 \pm 85 pg/m de los ratones vacunados con el pTARGET p< 0,0001). Así, los linfocitos T aislados de los ratones covacunados y protegidos produjeron más citocinas tipo Th2 en comparación con los linfocitos T de control. Como se describe anteriormente, los linfocitos T de ratones vacunados sólo con ADN de PLP_{139-151} tuvieron una reducida cantidad de IFN\gamma, pero no sufrieron un cambio a Th2.

La protección frente a la EAE en ratones covacunados con ADN de IL4 y PLP_{139-151} puede ser transferida mediante linfocitos T. Se analizaron los linfocitos T derivados de ratones covacunados tanto con ADN de IL4 como de PLP_{139-151}, que mantuvieron una capacidad proliferativa pero se sufrieron un cambio a Th2, para estudiar la capacidad de transferir dicha protección Los ratones se inmunizaron con el péptido encefalitogénico PLP_{139-151} emulsionado en CFA, y ocho días después, se inyectaron 10 millones de linfocitos T vía intravenosa en cada ratón. Se realizó a continuación un seguimiento de los animales para analizar el fenotipo de la enfermedad. También se inyectaron linfocitos T de control que son específicos para el PLP_{139-151} y que se sabe que inducen EAE, como control Los ratones inyectados con los linfocitos T procedentes de los ratones covacunados tuvieron una incidencia reducida (1/5 ratones en comparación con 4/5 ratones en los controles) y bajas puntuaciones de enfermedad en comparación con los ratones inyectados con los linfocitos T de control. Estos resultados sugieren que el efecto protector logrado con la covacunación con ADN de IL4 y PLP_{139-151} puede ser transferido a animales que no han recibido tratamiento previo a través de células Th2 específicas.

Discusión

Este ejemplo demuestra un novedoso procedimiento de inmunidad protectora que combina los efectos de la vacunación con ADN y la administración génica local. Primero demostramos que la vacuna genética con IL4 administra IL4 funcional. Tras confirmar que realmente se estaba expresando IL4 in vitro a partir de la construcción de ADN usada para la vacunación, demostramos que activa la vacuna con ADN de IL4 STAT6 en células de ganglio linfático. Ya que IL4 activa específicamente STAT6, creemos que la conclusión más probable es que IL4 se produce a partir de la vacuna de ADN administrada y que interactúa con el receptor IL4 de las células de los ganglios linfáticos, lo que a su vez provoca la posterior activación de STAT6. La proteína STAT6 hiperfosforilada en el presente estudio tiene aproximadamente 60 kD. Aunque la isoforma predominante de STAT6 descrita en la bibliografía es de 100 kD, se han descrito otras isoformas en tejidos inmunitarios de ratón (Quelle y col., 1995). Además, un reciente estudio demostró la existencia de una isoforma de 65 kD en mastocitos de ratón (Sherman y col.). La IL4 administrada con la vacuna de ADN parece activar específicamente esta isoforma. NO hemos sido capaces de detectar respuestas de anticuerpos frente a la IL4 en los ratones vacunados con ADN de IL4. Por lo tanto, postulamos que el gen IL4 administrado y expresado de este modo genera eficazmente una inmunidad protectora si inducir una respuesta inmune contra
IL4.

Cuando inmunizamos ratones tanto con la vacuna con ADN de IL4 y una vacuna diferente con ADN del autopéptido PLP_{139-151}, se protegió a estos ratones contra la inducción de enfermedad producida con el péptido PLP_{139-151} emulsionado en CFA. La vacuna de ADN sola no mejoró la protección significativamente, Cuando se examinó el perfil de expresión de citocinas de linfocitos T procedentes de ratones covacunados y protegido, se observó un cambio hacia el tipo Th2 de secreción de citocinas. Además, estos linfocitos Th2 podrían transferir la protección contra la inducción de la enfermedad en ratones sin tratamiento previo. De este modo proponemos que la combinación de la administración local de IL4 y de la vacuna con ADN de PLP_{139-151} hace que los linfocitos T específicos de antígeno cambien su fenotipo hacia un tipo de respuesta Th2 más protectora. Estos linfocitos T protectores y específicos de antígeno se dirigen entonces hacia los lugares de daño en la mielina y atenúan la respuesta autoinmunitaria
patogénica.

Un mecanismo posible de cómo se produce este cambio fenotípico es que las vacunas con ADN de IL4 y PLP_{139-151} son asimiladas por las células presentadoras de antígenos (CPA) en el lugar de la administración de la vacuna. El péptido PLP_{139-151} se expresa en las CPA y es presentado en MHC de clase II a linfocitos T específicos reclutados de este modo. Las CPA también expresan IL4 que se secreta localmente durante la interacción entre la CPA y el linfocito T. Está IL4 secretada provoca entonces hace que el fenotipo del linfocito T específico de antígeno asuma un tipo fenotípico más Th2. Este modelo es compatible con estudios anteriores que demostraban que los linfocitos T que crecían en cultivo podían asumir un tipo fenotípico más Th2 al crecer en presencia de IL4 (Macatonia y col. (1993) Int Immunol 5:1119-28).

Otros estudios anteriores demostraron que la CPA presentes en el lugar de la administración o reclutadas desde la médula ósea pueden asimilar el AD desnudo y viajar hacia los ganglios linfáticos (Chattergoon y col. (1998) J Immunol 160:5707-18). Es posible que dos CPA diferentes e incluso distantes asimilen hasta dos tipos diferentes de plásmidos. Sin embargo, creemos que es el microentorno local durante la interacción de los linfocitos T y las CPA lo realmente importante ya que no se observó ningún incremento detectable de IL4 sérica en los ratones vacunados con ADN. Como procedimiento de administración de productos génicos potencialmente adversos, como una citocina a dosis altas, esta técnica podría ser deseable frente a los procedimientos de terapia génica tradicionales ya que el gen administrado actúa localmente en lugar de sistémicamente.

Se ha probado que las vacunas de ADN son eficaces al proteger contra algunos modelos animales de enfermedades autoinmunes. Una de las principales ventajas de las vacunas de ADN sobre los tratamientos tradicionales de enfermedades autoinmunes es la capacidad de modificar fácilmente el vehículo del tratamiento. En la presente memoria descriptiva que con la adición a la vacuna con ADN de PLP_{139-151} de citocina IL4 administrada genéticamente, podemos proteger con la EAE, y además, dirigir la respuesta inmunitaria hacia un tipo más Th2. La adición de IL4 como covacuna de ADN, rescata la anergia impuesta por la vacuna con ADN de PLP_{139-151}, y dirige la respuesta al fenotipo Th2. Este mecanismo de protección producido con la covacunación con ADN de IL4 en comparación con la vacunación sólo con ADN de PLP_{139-151}, tiene ventajas particulares. Esta técnica podría ser beneficiosa en el tratamiento de otras enfermedades autoinmunes. La inmunización frente antígenos que activan aquellas enfermedades autoinmunes provocadas por células autorreactivas Th1, enfermedades como por ejemplo la esclerosis múltiple, diabetes juvenil y artritis reumatoide, serían afecciones en las que la covacunación con ADN que codifique IL-4 podría ser beneficiosa. Conclusión, los datos presentados en la presente memoria descriptiva implican una poderosa y novedosa herramienta, la combinación de administración local y vacunación con ADN específico, que podría aplicarse universalmente en todas las vacunas de ADN.

Procedimientos experimentales

Animales. Se compraron ratones SJL/J hembra de seis a ocho semanas a The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

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Péptidos. Los péptidos se sintetizaron en un sintetizador de péptidos (modelo 9050; MilliGen, Burlington, MA) usando la química habitual del 9-fluorenilmetoxicarbonilo. Los péptidos se purificaron con HPLC. Las estructuras se confirmaron mediante análisis aminoacídico y espectroscopía de masas. Los péptidos usados en estos experimentos fueron: (Identificador de secuencia Nº 15) PLP_{139-151} (HSLGKWLGHPDKF) e (identificador de secuencia Nº 16) HSVP16 P45 (DMTPADALDDRDLEM).

Vacunas de ADN. Se obtuvo un gen que codifica el PLP_{139-151} como se describe anteriormente. Se clonó el gen murino IL4 mediante PCR a partir de ADNc de bazo (Clontech, Palo Alto, CA), usando los siguientes cebadores para la PCR. (Identificador de secuencia Nº 17) 5'-CGCGGATCCTTGATGGGTCTCAACCCCCAGCTAGTTGTC-3' e (identificador de secuencia Nº 18) 5'-ACGCTCGAGGTACTACGAGTAATCCATTTGCATGATGC-3'. Los productos se clonaron en la región de clonación múltiple del vector pTARGET (Promega, Madison, WI), bajo el control del promotor CMV. Los clones correctos se confirmaron con secuenciación de ADN automática. La purificación del ADN plasmídico se realizó usando el kit Qiagen Endo-free Mega Prep (Qiagen, Santa Clarita, CA). La pureza del ADN olasmídico se confirmó con espectrofotometría UV y electroforesis en gel de agarosa. Sólo se usó ADN que tuviera un cociente de absorbancias 260 nm/280 nm mayor de 1,7.

Traducción in vitro. Se analizaron las construcciones usadas en la vacuna de ADN para comprobar que producían un producto del tamaño adecuado mediante un ensayo de traducción in vitro. Se incubó aproximadamente 1 \mug de ADN plasmídico durante 2 horas a 30ºC en un volumen de 50 \mul que contenía: 25 ml de lisado de reticulocitos de conejo TNT (Promega Corp., Madison, WI), 2 \mul de tampón de reacción TNT Promega Corp., Madison, WI), 1 \mul de ARN polimerasa (Promega Corp., Madison, WI), 1 \mul de una mezcla de aminoácidos sin metionina (Promega Corp., Madison, WI), 4 \mul de metionina S^{35} 10mCi/ ml (Amersham Life Sciences Inc., Arlington Heights, IL), y 1 \mul de ribonucleasa RNasin 40 U/\mul (Promega Corp., Madison, WI). Se mezclaron 3 \mul de los productos de esta reacción con un tampón de carga con SDS y se corrieron en un gel de poliacrilamida con SDS al 18%. Tras secar, el gel se expuso para obtener una autorradiografía.

Westerns STAT6. Después de diseccionar ganglios linfáticos de ratones vacunados con ADN, los tejidos se homogenizaron mecánicamente en 1 ml del siguiente tampón. NaCl 0,1 M, Tris-HCl 0,01 M, pH 7,4, EDTA 0,001 M, 1 \mug/ml de aprotinina, Pefabloc SC 1,6 \muM (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Se usaron 0,5 ml del lisado resultante en un ensayo de cuantificación de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL) para determinar la concentración de proteína total. Los 0,5 ml restantes se añadieron a 0,25 ml de tampón de carga con SDS 3X (New England Biolabs, Beverly, MA) con DTT a una concentración final de 0,04 M. Estos productos se analizaron en una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS con un gradiente de 4% a 15% (Bio-Rad, Hercules, CA). Se usaron marcadores preteñidos para determinar los pesos moleculares (Bio Rad, Hercules, CA). Tras las electroforesis, los geles se transfirieron a membranas de PVDF (Amersham Life Sciences Inc., Arlington Heights, IL) con un voltaje constante de 100 V en Tris 25 mM, glicina 192 mM y 20% (v/v) de metanol como tampón de transferencia. Las membranas se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con TBS (siglas en inglés de solución salina tamponada con Tris), 0,1% de Tween 20 y 20% de leche desnatada. Tras lavar las membranas con TBS y Tween 20 al 0,1%, se hibridaron durante toda la noche y a 4ºC con un anticuerpo anti STAT6 fosforilada (New England Biolabs, Beverly, MA) diluido 1:1000 en TBS, 0,1% de Tween 20, y un 5% BSA (seroalbúmina bovina). Se procesaron las membranas siguiendo el protocolo ECL Plus (Amersham Life Sciences Inc., Arlington Heights, IL) para visualizar las bandas por quimioluminiscencia. Se eliminaron los anticuerpos de las membranas con lavados en \beta-mercaptoetanol 100 mM, 2% (p/v) de SDS, y Tris-HCl 62,5 mM pH 7,4 durante 30 minutos a 60ºC. Estas mismas membranas fueron probadas con otro anticuerpo contra el CD3\zeta de ratón (Pharmingen, San Diego, CA) como control para verificar que existía la misma cantidad de muestra en todas las calles.

Protocolo de inmunización con ADN. Se inyectó a los animales 0,1 ml de clorhidrato de bupivacaína al 0,25% en el cuadriceps izquierdo (Sigma, St. Louis, MO) en PBS. Dos y 9 días después, se inyectó a los ratones 100 mg de ADN plasmídico (a una concentración de 1 mg/ml en PBS), en el mismo músculo. Los animales que recibieron una covacuna recibieron dos inyecciones diferentes de cada ADN plasmídico.

Inducción de EAE. Entre siete y 10 días después de la vacuna de ADN final, se indujo la EAE a los ratones con 100 \mug del péptido PLP_{139-151}. Se disolvió el péptido PLP139-15 en PBS a una concentración de 2 mg/ml y se emulsionó con un volumen igual de Adyuvante de Freund incompleto complementado con 4 mg/ml de H37Ra de Mycobacterium tuberculosis destruido con calor (Difco Laboratories, Detroit, MI). Se inyectó a los ratones 0,1 ml de la emulsión peptídica vía subcutánea. Se valoró el estado de los animales de experimentación del siguiente modo: 1 = debilidad o parálisis de la cola; 2 = debilidad de las patas traseras; 3 = parálisis de las patas traseras; 4 = debilidad o parálisis de las patas delanteras; 5 = animal muerto o moribundo.

Valoraciones de la proliferación celular en ganglios linfáticos. Se diseccionaron los ganglios linfáticos secretores de ratones después de la fase aguda de la enfermedad y se realizaron ensayos in vitro con las células del ganglio linfático (CGL) para estudiar respuestas proliferativas específicas para el péptido PLP_{139-151}. Las CGL se prepararon en placas de microtitulación de 96 pocillos en un volumen de 0,2 ml/pocillo a una concentración de 2,5 x 10^{6} células/ml. Los medios de cultivo están compuestos por RPMI (RPMI 1640 complementado con L-glutamina (2 mM), piruvato de sodio (1 mM), aminoácidos no esenciales (0,1 mM), penicilina (100 u/ml), estreptomicina (0,1 mg/ml), 2-ME (5 x 0-5 M) complementado con suero de ratón normal autólogo nuevo al 1%. Las células fueron incubadas a 37ºC y después de 72 horas se trataron durante 18 horas con 1 mCi/pocillo de timidina (H^{3}). Después, se recogieron las células y se realizó un recuento en un contador beta.

Determinación del perfil de expresión de citocinas. Se establecieron líneas de linfocitos T a partir de las CGL de ratones vacunados con ADN. Se realizaron pruebas con estos linfocitos T para analizar la producción de varias citocinas. Se incubaron 50 x 10^{3} células/ml con 2,5 x 10^{6} CPA singénicas irradiadas/ml en RPMI enriquecido y 10% de FCS. Los sobrenadantes se recogieron después de 6 días de cultivo y se realizaron pruebas de ELISA tipo sándwich usando kits ELISA estándar (Pharmingen, San Diego, CA).

<110> Lawrence Steinman

\hskip1,08cmPedro Ruiz

\hskip1,08cmHideki Garren

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<120> VACUNACIÓN CON ADN PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES

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<130> STAN-123WO

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<150> 09/267,590

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<151> 1999-03-12

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<160> 14

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 2777

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (119)...(952)

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<400> 1

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1

2

3

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<210> 2

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<211> 277

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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4

5

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<210> 3

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<211> 2139

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (37)...(552)

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<400> 3

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6

7

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<210> 4

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<211> 171

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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8

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<210> 5

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> M. musculus

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<400> 5

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\sa{His Ser Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe}

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<210> 6

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> M. musculus

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<400> 6

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\sa{His Ser Leu Gly Lys Leu Leu Gly Arg Pro Asp Lys Phe}

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<210> 7

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> M. musculus

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<400> 7

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\sa{Asn Thr Trp Thr Thr Cys Gln Ser Ile Ala Phe Pro Ser Lys}

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<210> 8

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<211> 65

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<212> ADN

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<213> M. musculus

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<400> 8

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9

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<210> 9

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<211> 63

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<212> ADN

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<213> M. musculus

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<400> 9

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10

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<210> 10

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<211> 63

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<212> ADN

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<213> M. musculus

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<400> 10

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11

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<210> 11

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

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\sa{Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro}

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<210> 12

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

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\sa{Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro}

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<210> 13

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<211> 153

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 13

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12

13

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<210> 14

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<211> 614

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (64)...(525)

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<221> mat_peptídico

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<222> (136)...(522)

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<400> 14

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14

15

Claims (14)

1. Uso de un casete de expresión de ADN que está compuesto por una región de inicio de la transcripción, una secuencia que codifique un autoantígeno, que codifica al menos una porción de autoantígeno de proteína de mielina y una región de fin de la transcripción, estando asociado el autoantígeno de proteína de mielina con una respuesta linfocítica T de tipo Th1 proinflamatoria, estando la región de inicio de la transcripción bajo el control de un promotor que se activa en un huésped humano con una enfermedad autoinmune, para fabricar un medicamento para su uso en el tratamiento mediante una inyección intramuscular de un enfermedad autoinmune desmielinizante en el huésped humano.

2. Uso según la reivindicación 1 en el que el casete de expresión está presente en un vector.

3. Uso según la reivindicación 2 en el que dicho casete de expresión de ADN es un vector plasmídico.

4. Uso según la reivindicación 2 ó 3 en el que el vector además comprende un segundo casete de expresión de ADN que comprende una secuencia que codifica una citocina Th2 bajo el control regulador de un promotor que es activo en un hospedador humano.

5. Uso según la reivindicación 4 en el que dicha citocina Th2 es IL4.

6. Uso según la reivindicación 5 en el que dicha IL4 es IL4 humana.

7. Uso según la reivindicación 1, que además comprende el uso de un segundo casete de expresión de ADN que comprende una segunda secuencia que codifica una citocina Th2 bajo el control regulador de un promotor que es activo en dicho hospedador humano, estando el casete presente en una construcción de ADN diferente.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que se coformula dicha construcción de expresión que codifica dicha citocina Th2 y dicha construcción de expresión que codifica al menos una porción del autoantígeno de la proteína de la mielina.

9. Uso según la reivindicación 7, en el que dicha construcción de expresión que codifica dicha citocina Th2 y dicha construcción de expresión que codifica al menos una porción del autoantígeno de la proteína de la mielina se formulan independientemente.

10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que dicha primera secuencia codifica una proteína endógena humana.

11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha proteína de la mielina es la lipoproteína, la proteína básica de la mielina, la proteína oligodendrocítica de la mielina o la proteína asociada a la mielina.

12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la enfermedad desmielinizante es la esclerosis múltiple.

13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la respuesta proinflamatoria incluye la expresión de IL-2, interferón-\gamma o IL-15.

14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el medicamento se debe administrar en una serie de al menos dos inyecciones administradas con al menos 24 horas de diferencia.