ES2252494T3

ES2252494T3 - Ligando natural de gprc chemr23 y usos del mismo.

Info

Publication number: ES2252494T3
Application number: ES02754857T
Authority: ES
Inventors: Valerie Wittamer; David Communi; Ann Vandenbogaerde; Michel Detheux; Marc Parmentier
Original assignee: Euroscreen SA
Current assignee: Ogeda SA
Priority date: 2001-07-09
Filing date: 2002-07-09
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2022-07-09
Also published as: US20030096299A1; US7666401B2; CA2450587C; EP1405083B1; US20090081729A1; JP4446737B2; JP2005500047A; EP1405083A2; WO2003006996A3; US20030104478A1; WO2003006996A2; CA2450587A1; US7582734B2; ATE309543T1; US8003347B2; US20070238862A1; JP2009148278A; DE60207254D1; DK1405083T3; US20090047741A1

Abstract

Método para identificar un agente que se une a ChemR23, comprendiendo dicho método: (a) poner en contacto un polipéptido de ChemR23 con un polipéptido truncado de TIG2 representado por SEQ ID NO: 48 o un polipéptido de TIG2 que comprende adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a dicho polipéptido truncado de TIG2 pero que conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de señalización de dicho polipéptido truncado de TIG2 en presencia o en ausencia de un agente de unión candidato en condiciones que permiten la unión de dicho polipéptido truncado de TIG2 o de dicho polipéptido de TIG2 a dicho polipéptido de ChemR23; y (b) medir la unión de dicho polipéptido de ChemR23 a dicho polipéptido truncado de TIG2 o dicho polipéptido de TIG2, en la que una disminución en la unión en presencia de dicho agente de unión candidato, con respecto a la unión en ausencia de dicho agente de unión candidato, identifica a dicho agente de unión candidato como unagente que se une a ChemR23.

Description

Ligando natural del GPRC ChemR23 y usos del mismo.

Campo de la invención

La invención se refiere a la identificación del ligando natural para el receptor acoplado a proteínas G (GPCR) huérfano ChemR23 y usos del mismo.

Antecedentes de la invención

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) son proteínas responsables de la transducción de una señal dentro de una célula. Los GPCR tienen generalmente siete dominios transmembrana. Con la unión de un ligando a una parte extracelular o fragmento de un GPCR, se transduce una señal dentro de la célula que da como resultado un cambio en una propiedad biológica o fisiológica o en el comportamiento de la célula. Los GPCR, junto con las proteínas G y los efectores (enzimas intracelulares y canales modulados por proteínas G) son los componentes de un sistema de señalización modular que conecta el estado de segundos mensajeros intracelulares con entradas
extracelulares.

Los genes GPCR y productos génicos pueden modular diversos procesos fisiológicos y son posibles agentes causantes de enfermedad. Parece que los GPCR son de importancia crítica tanto para el sistema nervioso central como para los procesos fisiológicos periféricos.

La superfamilia de proteínas GPCR se representa en cinco familias: familia I, receptores tipificados por rodopsina y receptor beta-2 adrenérgico y actualmente representados por más de 200 miembros únicos; familia II, la familia de receptores de hormonas paratiroideas / calcitonina / secretina; familia III, la familia de receptores metabotrópicos de glutamato; familia IV, la familia de receptores de AMPc, importantes en la quimiotaxia y el desarrollo de D. discoideum, y familia V, receptor de feromonas de apareamiento fúngico tal como STE2.

Las proteínas G representan una familia de proteínas heterotriméricas compuestas por subunidades \alpha, \beta, y \gamma, que se unen a los nucleótidos de guanina. Estas proteínas se unen normalmente a receptores de la superficie celular (receptores que contienen siete dominios transmembrana) para la transducción de señales. En efecto, tras la unión del ligando al GPCR, se transmite un cambio conformacional a la proteína G, que provoca que la subunidad \alpha intercambie una molécula de GDP unida por una molécula de GTP y se disocie de las subunidades \beta\gamma.

La forma GTP unida de las subunidades \alpha, \beta, y \gamma funciona normalmente como un resto modulador de efector, que conduce a la producción de segundos mensajeros, tales como AMPc (por ejemplo mediante activación de la adenil ciclasa), diacilglicerol o inositol fosfatos.

Se conocen más de 20 tipos diferentes de subunidades \alpha en seres humanos. Estas subunidades se asocian con un pequeño combinado de subunidades \beta y \gamma. Ejemplos de proteínas G de mamíferos incluyen G_{i}, G_{o}, G_{q}, G_{s} y G_{t}. Las proteínas G sde describen extensamente en Lodish et al., Molecular Cell Biology (Scientific American Books Inc., Nueva York, N.Y., 1995; y también por Downes y Gautam, 1999, The G-Protein Subunit Gene Families. Genomics 62:544-552), cuyo contenido se incorporan al presente documento como referencia.

Los GPCR conocidos y no caracterizados constituyen normalmente importantes dianas para la acción y el desarrollo de fármacos. Se están realizando esfuerzos para identificar nuevos receptores acoplados a proteínas G que pueden usarse para seleccionar nuevos agonistas y antagonistas que tienen posibles propiedades profilácticas y terapéuticas.

Se han clonado más de 300 GPCR hasta la fecha, excluyendo a la familia de los receptores olfativos. Mecanísticamente, un 50 - 60% aproximadamente de todos los fármacos clínicamente relevantes actúan mediante la modulación de las funciones de diversos GPCR (Cudermann et al., J. Mol. Med., 73:51-63, 1995).

ChemR23, también denominado Dez [Secuencia ID Nos: 1 (secuencia de polinucleótido humana, figura 1); 2 (secuencia de aminoácidos humana, figura 2); 3 (secuencia de polinucleótido de ratón, figura 3); 4 (secuencia de aminoácidos de ratón, figura 3); 5 (secuencia de polinucleótido de rata, figura 4); y 6 (secuencia de aminoácidos de rata, figura 4)] se ha descrito como un receptor acoplado a proteína G huérfano relacionado con GPR-1 (38% de identidad de aminoácidos global), receptor C3a (38%), receptor de anafilotoxina C5a (36%) y receptores de formil-Met-Leu-Phe (35%). ChemR23 está relacionado de manera más distante con la subfamilia de receptores de quimiocinas (Methner A, Henney G, Schinke B, Hermans-Borgmeyer I. (1997) Biochem Biophys Res Commun 233:336-42; Samson M, Edinger AL, Stordeur P, Rucker J, Verhasselt V, Sharron M, Govaerts C, Mollereau C, Vassart G, Dorns RW, Parmentier M (1998) Eur J Immunol 28:1689-700). Se encontró que los transcriptos de ChemR23 eran abundantes en células dendríticas derivadas de monocitos y macrófagos, con o sin tratamiento con LPS. La baja expresión también puede detectarse mediante PCR de transcripción inversa en linfocitos T CD4+. Experimentos de hibridación in situ mostraron que el receptor se regulaba de manera diferencial durante el desarrollo, con una expresión prominente en el desarrollo de tejidos óseos y cartilaginosos. También pudo detectarse en las glándulas paratiroideas del adulto, indicando una posible función en el metabolismo fosfocálcico.

Se asignó el gen que codifica para ChemR23 por mapeo híbrido con radiación a la región q21.2-21.3 del cromosoma humano 12, fuera de la agrupación de genes identificada hasta ahora para los receptores quimiotácticos. Se probó ChemR23 en ensayos de fusión para determinar la actividad correceptora potencial mediante una gama de cepas virales VIH-I, VIH-II y SIV (virus de la inmunodeficiencia en simios). Varias cepas de SIV (SIVmac316, SIVmac239, SIVmacI7E-Fr y SIVmac62A), así como una cepa primaria de VIH-1 (92UG024-2) usaron eficazmente ChemR23 como correceptor. Por tanto, este receptor parece ser un correceptor para virus de inmunodeficiencia que no pertenece a la familia de receptores de quimiocinas. También es un supuesto receptor quimiotáctico y podría desempeñar un importante papel en el reclutamiento o tráfico de poblaciones celulares de leucocitos.

TIG2 (gen 2 inducido por tazaroteno) [Secuencia ID Nos: 7 (secuencia de polinucleótido de TIG2 humana, figura 6); 8 (secuencia de aminoácidos humana, figura 6); 9 (secuencia de polinucleótido de ratón, figura 7); y 10(secuencia de aminoácidos de ratón, figura 7) se identificó como un ADNc, la expresión del cual está regulada por incremento mediante el tratamiento de cultivos en balsa de piel por el retinoide sintético antipsoriásico beta/gamma-selectivo del receptor de ácido retinoico (RAR), tarazoteno [AGN 190168 / 6-[2-(4,4-dimetiltiocroman-6-il)-etinilnicotinato de etilo] (Nagpal S, Patel S, Jacobe H, DiSepio D, Ghosn C, Malhotra M, Teng M, Duvic M, Chandraratna RA. (1997) J Invest Dermatol 109:91-5). La regulación por incremento mediada por retinoides en la expresión de TIG2 se confirmó por análisis Northern-blot (inmunotransferencia). El ADNc de TIG2 tiene 830 pb de largo y codifica para un supuesto producto proteico de 164 aminoácidos. TIG2 se expresa e induce por tazaroteno en cultivo sólo cuando los queratinocitos y los fibroblastos forman una estructura tridimensional similar a tejido. Los retinoides específicos para RAR también mostraron que aumentaban los niveles de RNAm de TIG2. En contraste, ni los retinoides específicos para RXR ni la 1,25-dihidroxivitamina D3 aumentaron los niveles de TIG2 en estas células. TIG2 también se expresa en altos niveles en piel con psoriasis sin lesiones pero en niveles inferiores en una lesión psoriásica y su expresión está regulada por incremento en lesiones psoriásicas después de una aplicación tópica de tazaroteno. Además, TIG2 ha demostrado estar drásticamente regulado por incremento por 1,25-dihidroxivitamina D3 y dexametasona en células estromales que soportan osteoclastos (Adams AE, Abu-Amer Y, Chappel J, Stueckle S, Ross FP, Teitelbaum SL, Suva LJ. (1999) J Cell Biochem 74:587-95).

Sumario de la invención

La presente solicitud describe la identificación de TIG2, el producto polipeptídico del gen 2 inducido por tazaroteno, como un ligando natural del GPCR (receptor acoplado a proteína G) ChemR23. La solicitud describe el uso de la interacción de polipéptidos de ChemR23 y polipéptidos de TIG2 como la base de ensayos de selección para agentes que modulan la actividad del receptor ChemR23. La solicitud también describe ensayos diagnósticos basados en la interacción de ChemR23/TIG2, así como kits para realizar ensayos diagnósticos y de selección.

La presente invención se refiere a un método para identificar un agente que se une a ChemR23, comprendiendo dicho método:

(a) poner en contacto un polipéptido de ChemR23 con un polipéptido truncado de TIG2 representado por SEQ ID NO: 48 o un polipéptido de TIG2 que comprende adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a dicho polipéptido truncado de TIG2 pero que conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de la señalización de dicho polipéptido truncado de TIG2 en presencia o en ausencia de un agente de unión candidato en condiciones que permiten la unión de dicho polipéptido truncado de TIG2 o dicho polipéptido de TIG2 a dicho polipéptido de ChemR23; y

(b) medir la unión de dicho polipéptido de ChemR23 a dicho polipéptido truncado de TIG2 o dicho polipéptido de TIG2, en la que una disminución en la unión en presencia de dicho agente de unión candidato, con respecto a la unión en ausencia de dicho agente de unión candidato, identifica a dicho agente de unión candidato como un agente que se une a ChemR23.

La presente invención también se refiere al método anteriormente mencionado, en el dicho agente está presente en una muestra. La presente invención se refiere además a un método para identificar un agente que disminuye la actividad de señalización de ChemR23, comprendiendo dicho método:

(a) poner en contacto un polipéptido de ChemR23 con un polipéptido truncado de TIG2 representado por SEQ ID NO: 48 o un polipéptido de TIG2 que comprende adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a dicho polipéptido truncado de TIG2 pero que conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de la señalización de dicho polipéptido truncado de TIG2 en presencia o en ausencia de dicho
agente,

(b) medir la actividad de señalización de dicho polipéptido de ChemR23, y

(c) comparar la cantidad de dicha actividad medida en una reacción que contiene dicho ChemR23 y dicho polipéptido truncado de TIG2 o dicho polipéptido de TIG2, sin dicho agente, con la cantidad de dicha actividad medida en una reacción que contiene dicho ChemR23, dicho polipéptido truncado de TIG2 o dicho polipéptido de TIG2 y dicho agente, en el que una disminución de la actividad en presencia de dicho agente en relación con la actividad en ausencia de dicho agente identifica a dicho agente como un antagonista para ChemR23.

La presente invención también se refiere al método anteriormente mencionado, en el dicho agente está presente en una muestra.

La presente invención se refiere además a un método para identificar un agente que aumenta la señalización de ChemR23, comprendiendo dicho método:

(a) poner en contacto un polipéptido de ChemR23 con un agente;

(b) medir una actividad de señalización de dicho polipéptido de ChemR23 en presencia de dicho agente; y

(c) comparar dicha actividad medida en presencia de dicho agente modulador candidato con dicha actividad medida en una reacción en la que dicho polipéptido de ChemR23 se pone en contacto con un polipéptido truncado de TIG2 representado por SEQ ID NO: 48 o un polipéptido de TIG2 que comprende adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a dicho polipéptido truncado de TIG2 pero que conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de la señalización de dicho polipéptido truncado de TIG2, en el que dicho agente se identifica como un agonista que aumenta la señalización del polipéptido de ChemR23 cuando la cantidad de dicha actividad medida en presencia de dicho agente es de al menos un 10% de la cantidad inducida por dicho polipéptido truncado de TIG2 o dicho polipéptido de TIG2.

La presente invención se refiere además al método anteriormente mencionado, en el que dicho agente está presente en una muestra.

En una realización preferida de cualquiera de los métodos precedentes, la medición se realiza usando un método seleccionado de desplazamiento de marcador, resonancia de plasmón superficial, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, extinción de fluorescencia y polarización de fluorescencia.

En una realización preferida de cada uno de los métodos precedentes, el polipéptido de TIG2 se marca de manera detectable. Se prefiere que el polipéptido de TIG2 se marque de manera detectable con un resto seleccionado del grupo que consiste en un radioisótopo, un fluoróforo, extintor ("quencher") de fluorescencia, una enzima, una etiqueta de afinidad, y una etiqueta de epítopo.

En una realización de cualquiera de los métodos precedentes, la puesta en contacto se realiza en o sobre una célula que expresa el polipéptido de ChemR23.

En otra realización de cualquiera de los métodos precedentes, la puesta en contacto se realiza en o sobre liposomas sintéticos (véase Tajib et al., 2000, Nature Biotechnology 18:649-654, que se incorpora al presente documento como referencia) o en o sobre membranas en gemación inducidas por virus que contienen un polipéptido de ChemR23 (véase el documento WO0102551, 2001, que se incorpora al presente documento como referencia).

En otra realización de cualquiera de los métodos precedentes, el método se realiza usando una fracción de membrana de células que expresan el polipéptido de ChemR23.

En otra realización, el agente se selecciona del grupo que consiste en un péptido, un polipéptido, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un lípido, un hidrato de carbono, un ácido nucleico y una molécula orgánica pequeña.

En otra realización, la etapa de medir una actividad de señalización del polipéptido de ChemR23 comprende detectar un cambio en el nivel de un segundo mensajero.

En otra realización, la etapa de medir una actividad de señalización comprende la medición de la unión o intercambio de nucleótidos de guanina, actividad adenilato ciclasa, AMPc, actividad de proteína cinasa C, ruptura del fosfatidilinositol, diacilglicerol, inositol trifosfato, calcio intracelular, ácido araquidónico, actividad MAP cinasa, actividad tirosina cinasa, o expresión de un gen indicador ("reporter").

En una realización preferida, la medición de una actividad de señalización comprende usar un ensayo basado en aequorina.

La realización engloba además una composición que comprende un polipéptido de ChemR23 aislado y un polipéptido truncado de TIG2 aislado tal como se define más adelante.

La invención engloba además un kit para seleccionar agentes que modulan la señalización de ChemR23, o para el diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de la señalización de un polipéptido de ChemR23, comprendiendo dicho kit un polipéptido de ChemR23 aislado, un polipéptido truncado de TIG2 aislado tal como se define más adelante y materiales de acondicionamiento para ellos. Los kits de diagnóstico según la invención permiten la determinación de si, por ejemplo, una muestra de tejido o un extracto preparado a partir de una muestra de tejido tiene un elevado nivel o actividad TIG2 o ChemR23. Los kits también permiten la identificación de mutaciones en genes que codifican para ChemR23 o TIG2 y la detección de niveles anómalos de ácidos nucléicos que codifican para ChemR23 o TIG2.

La invención engloba además un kit para seleccionar agentes que modulan la señalización de ChemR23, o para el diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de un polipéptido de ChemR23, comprendiendo dicho kit un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido de ChemR23, un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido de TIG2 tal como se define más adelante y materiales de acondicionamiento para ellos.

La invención engloba además un kit para seleccionar agentes que modulan la señalización de ChemR23, o para el diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de un polipéptido de ChemR23, comprendiendo dicho kit una célula transformada con un polinucleótido que codifica para un polipéptido de ChemR23, un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido de TIG2 tal como se define más adelante o una célula que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido de TIG2 tal como se define más adelante y materiales de acondicionamiento para ellos.

La invención se refiere también a un método in vitro para modular la actividad de un polipéptido de ChemR23 en una célula, comprendiendo dicho método la etapa de administrar a dicha célula de un polipéptido truncado de TIG2 representado por SEQ ID NO: 48, un polipéptido de TIG2 que comprende adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a dicho polipéptido truncado de TIG2 pero que conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de la señalización de dicho polipéptido truncado de TIG2, anticuerpos frente a TIG2, o, nucleótidos que codifican para TIG2, de manera que se modula la actividad de ChemR23.

La presente invención se refiere también al método anteriormente mencionado, en el que dicho nucleótido que codifica para TIG2 es un aptámero.

La presente invención se refiere también al uso de un polipéptido truncado de TIG2 representado por SEQ ID NO: 48 o un polipéptido de TIG2 que comprende adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a dicho polipéptido truncado de TIG2 pero que conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de la señalización de dicho polipéptido truncado de TIG2 para la producción de un kit para seleccionar agentes que modulan la señalización de ChemR23 o para la producción de un kit para el diagnóstico del cáncer, metástasis tumorales, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, deficiencias inmunitarias heredadas o adquiridas, osteoporosis, consolidación de fracturas óseas, injertos de tejido óseo, rechazo de injertos, eccema, infección inflamatoria y enfermedades tróficas de la piel, infecciones virales, bacterianas y parasitarias, esterilidad femenina, y tumores de útero y ovario.

La presente invención se refiere también a un polipéptido truncado de TIG2 representado por SEQ ID NO: 48 o un polipéptido de TIG2 que comprende adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a dicho polipéptido truncado de TIG2 pero que conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de la señalización de dicho polipéptido truncado de TIG2 o una proteína de fusión que comprende el mismo.

La presente invención se refiere también a una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido tal como se definió anteriormente.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "polipéptido de ChemR23" se refiere a un polipéptido que tiene dos propiedades esenciales: 1) un polipéptido de ChemR23 tiene al menos un 70% de identidad de aminoácidos, y preferiblemente un 80%, 90%, 95% o más, incluyendo el 100% de identidad de aminoácidos con la SEQ ID NO: 2; y 2) un polipéptido de ChemR23 tiene actividad de ChemR23, es decir, el polipéptido se une a un polipéptido de TIG2 o a un fragmento funcional del mismo. Óptimamente, un "polipéptido de ChemR23" también tiene la actividad de señalización de ChemR23 tal como se define en el presente documento.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "polinucleótido de ChemR23" se refiere a un polinucleótido que codifica para un polipéptido de ChemR23 tal como se definió en el presente documento.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "actividad de ChemR23" se refiere a la unión específica de un polipéptido de TIG2 o un fragmento funcional del mismo por un polipéptido de ChemR23.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "actividad de señalización de ChemR23" se refiere a la iniciación o propagación de la señalización mediante un polipéptido de ChemR23. La actividad de señalización de ChemR23 se monitoriza mediante la medición de una etapa detectable en una cascada de señalización sometiendo a ensayo uno o más de los siguientes: estimulación del intercambio de GDP por GTP en una proteína G; alteración de la actividad adenilato ciclasa; modulación de la proteína cinasa C; ruptura del fosfatidilinositol (generando los segundos mensajeros diacilglicerol e inositol trifosfato); flujo de calcio intracelular; activación de MAP cinasas; modulación de tirosina cinasas; o modulación de la actividad de un gen o un gen indicador. Una etapa detectable en una cascada de señalización se considera iniciada o mediada si la actividad medible se altera en un 10% o más por encima o por debajo de una línea base establecida en ausencia sustancial de un polipéptido de TIG2 con respecto a cualquiera de los ensayos de actividad de ChemR23 descritos más adelante en el presente documento. La actividad medible puede medirse directamente, tal como en, por ejemplo, la medición de los niveles de AMPc o diacilglicerol. Alternativamente, la actividad medible puede medirse indirectamente, tal como en, por ejemplo, un ensayo de gen
indicador.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "etapa detectable" se refiere a una etapa que puede medirse, o bien directamente, por ejemplo mediante la medición de un segundo mensajero o la detección de una proteína modificada (por ejemplo, fosforilada), o bien indirectamente, por ejemplo mediante monitorización de un efecto corriente abajo de esa etapa. Por ejemplo, la activación de adenilato ciclasa da como resultado la generación de AMPc. La actividad adenilato ciclasa puede medirse directamente, por ejemplo, mediante un ensayo que monitoriza la producción de AMPc en el ensayo, o indirectamente, mediante la medición de los niveles reales de AMPc.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aislado" se refiere a una población de moléculas, por ejemplo, polipéptidos o polinucleótidos, cuya composición en moléculas contaminantes de diferente naturaleza es inferior al 50% (en peso), preferiblemente inferior al 40% y lo más preferiblemente del 2% o inferior. Cuando el término "aislado" se aplica a un polipéptido de ChemR23, se pretende específicamente englobar un polipéptido de ChemR23 que está asociado con o incluido en una membrana lipídica.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "polipéptido de TIG2" se refiere a un polipéptido que tiene al menos un 31% de identidad (o identidad superior tal como 45%, 55%, 65%, 75%, 85%, 95% o incluso 100%) con el polipéptido representado por SEQ ID NO: 48 que se une específicamente a y activa una actividad de señalización de un polipéptido de ChemR23 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2. El término "se une específicamente" significa que el polipéptido de TIG2 tiene una CE_{50}, CI_{50} o una K_{d} de 100 nM o inferior. "Polipéptido de TIG2" se refiere también a un fragmento de un polipéptido que satisface la definición precedente, en el que el fragmento conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de la señalización del polipéptido de longitud completa de SEQ ID NO: 48. Un polipéptido de TIG2 puede comprender adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a SEQ ID NO: 48, siempre que el polipéptido resultante conserve al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de la señalización del polipéptido de longitud completa representado por SEQ ID NO: 48. En otra realización, un "polipéptido de TIG2" engloba además la secuencia truncada de TIG2, de SEQ ID NO: 48 mostrada en la figura 17 (la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 17, que codifica para el polipéptido truncado de TIG2 es SEQ ID NO: 49).

Los derivados pueden ser polipéptidos similares, proteínas de fusión, o deleciones de los mismos. La presente invención ilustra que el polipéptido truncado tal como se presenta en SEQ ID NO: 48, se une específicamente al polipéptido de ChemR23 y activa su ruta de transducción de señalización. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un polipéptido truncado de TIG2 presentado en SEQ ID NO: 48; una secuencia de nucleótidos presentada en SEQ ID NO: 49 que codifica para dicho polipéptido truncado de TIG2, o derivados de los mismos.

Cuando se comparan la secuencia facilitada en SEQ ID NO: 48 con las secuencias representadas por SEQ ID NO: 8 o la facilitada en la figura 9 (tig2), queda claro que el truncamiento reside en la deleción de la cola "KALPRS". La secuencia de rata pierde la cola "PRS"; la secuencia de gallo pierde la cola "RS", o un equivalente de las mismas dependiendo de qué secuencia se considere como secuencia de referencia. A partir de esta comparación se hace evidente que el extremo C-terminal del péptido de TIG2 puede variar en longitud. La presente invención sugiere además que pueden existir deleciones adicionales en dicha cola dando como resultado un péptido funcional con respecto al polipéptido de ChemR23.

Además de las secuencias necesarias para la unión a ChemR23 y la activación de la actividad de señalización de ChemR23, un polipéptido de TIG2, incluyendo el polipéptido truncado de TIG2, puede comprender secuencias adicionales, tal como por ejemplo, en una proteína de fusión de TIG2. Ejemplos no limitantes de componentes de fusión incluyen la glutation-S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa, fosfatasa alcalina, tiorredoxina, proteína fluorescente verde (GFP), etiquetas de histidina (por ejemplo, 6X o His mayores), o etiquetas de epítopo (por ejemplo, etiqueta Myc, etiqueta FLAG).

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "polinucleótido de TIG2" se refiere a un polinucleótido que codifica para un polipéptido de TIG2 tal como se define en el presente documento, o el complemento del mismo. Un "polinucleótido de TIG2" puede ser una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido truncado de TIG2, por ejemplo el polipéptido truncado de TIG2 tal como se muestra en la figura 17 o cualquiera de los polipéptidos tal como se muestran en la figura 18. El polinucleótido que codifica para un polipéptido truncado tal como se representa por SEQ ID NO: 48, se muestra en la figura 17 y representado por SEQ ID NO: 49. Los polinucleótidos que codifican para cualquiera de los polipéptidos tal como se muestran en la figura 18 y representados por cualquiera de SEQ ID NO: 50 a 60 pueden deducirse de la correspondientes secuencias de aminoácidos por una persona experta en la técnica, estando codificado cada aminoácido por un triplete específico (o un conjunto específico) de nucleótidos conocido por una persona experta en la técnica.

La presente solicitud se refiere también a un agente identificado o detectado mediante un método tal como el descrito anteriormente. Además, la presente invención se refiere a una composición que comprende dicho agente.

La solicitud se refiere además al uso de un agente o una composición según la presente invención, para la preparación de un medicamento; especialmente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad relacionada con ChemR23 o un trastorno relacionado con ChemR23; en el que dicha enfermedad o dicho trastorno se elige preferiblemente del grupo que consiste en cáncer, metástasis tumorales, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, deficiencias inmunitarias heredadas o adquiridas, osteoporosis, consolidación de fracturas óseas, injertos de tejido óseo, rechazo de injertos, psoriasis, eccema, infección inflamatoria y enfermedades tróficas de la piel, infecciones virales, bacterianas y parasitarias, esterilidad femenina, y tumores de útero y ovario; o, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad relacionada con TIG2 o un trastorno relacionado con TIG2, en el que dicha enfermedad o dicho trastorno se elige preferiblemente del grupo que consiste en osteoporosis, consolidación de fracturas óseas, injertos de tejido óseo, rechazo de injertos, psoriasis, eccema, infección inflamatoria y enfermedades tróficas de la piel, infecciones virales, bacterianas y parasitarias, esterilidad femenina, y tumores de útero y ovario.

La presente invención se refiere además a un polipéptido truncado de TIG2 representado por SEQ ID NO: 48, una secuencia de nucleótidos que codifica para dicho polipéptido, o derivados de los mismos. Además se refiere a una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 49 que codifica para el polipéptido truncado de TIG2 tal como se representa por SEQ ID NO: 48.

La presente invención se refiere también al uso de un polipéptido truncado de TIG2 o a una secuencia de polinucleótidos tal como se describió anteriormente, preferentemente en un método según la presente invención.

Los polipéptidos truncados de TIG2 o un polipéptido de TIG2 tal como se definió anteriormente según la presente invención pueden usarse también para la producción de una composición que comprende un polipéptido de ChemR23 aislado y un polipéptido de TIG2 aislado tal como se definió anteriormente. Alternativamente, dichos polipéptidos truncados de TIG2 o polipéptido de TIG2 según la presente invención puede usarse para la producción de un anticuerpo, para la producción de un kit para seleccionar agentes que modulan la señalización de ChemR23 o para la producción de un kit para el diagnóstico de una enfermedad caracterizada por la desregulación de la señalización de ChemR23.

La presente invención también se refiere al uso de un polipéptido truncado de TIG2 tal como se describió anteriormente, o un polipéptido de TIG2 tal como se describió anteriormente, como ligando para ChemR23.

Además, la presente invención se refiere también al uso de una secuencia de polinucleótido que codifica para dicho polipéptido truncado de TIG2 tal como se describió anteriormente, o una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido de TIG2 tal como se describió anteriormente, para la producción de un ligando para ChemR23.

La solicitud también describe el uso de un polipéptido truncado de TIG2 según la presente invención o un polipéptido de TIG2 de longitud completa para la producción de un medicamento. Dicho medicamento puede aplicarse para el tratamiento de una enfermedad relacionada con ChemR23 o un trastorno relacionado con ChemR23; en el que dicha enfermedad o trastorno se elige preferentemente del grupo que consiste en cáncer, metástasis tumorales, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, deficiencias inmunitarias heredadas o adquiridas, osteoporosis, consolidación de fracturas óseas, injertos de tejido óseo, rechazo de injertos, psoriasis, eccema, infección inflamatoria y enfermedades tróficas de la piel, infecciones virales, bacterianas y parasitarias, esterilidad femenina, y tumores de útero y ovario; o puede aplicarse para el tratamiento de una enfermedad relacionada con TIG2 o un trastorno relacionado con TIG2, en el que dicha enfermedad o dicho trastorno se elige preferentemente del grupo que consiste en osteoporosis, consolidación de fracturas óseas, injertos de tejido óseo, rechazo de injertos, psoriasis, eccema, infección inflamatoria y enfermedades tróficas de la piel, infecciones virales, bacterianas y parasitarias, esterilidad femenina, y tumores de útero y ovario.

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "compuesto candidato" y "modulador candidato" se refieren a una composición de la que se está evaluando su capacidad para modular la unión de ligando a un polipéptido de ChemR23 o la capacidad para modular una actividad de un polipéptido de ChemR23. Los moduladores candidatos pueden ser compuestos naturales o sintéticos, incluyendo, por ejemplo, moléculas pequeñas, compuestos contenidos en extractos de células animales, vegetales, bacterianas o fúngicas, así como medio condicionado de tales células.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "molécula pequeña" se refiere a un compuesto que tiene una masa molecular inferior a 3000 Dalton, preferiblemente inferior a 2000 o 1500, todavía más preferiblemente inferior a 1000 y lo más preferiblemente inferior a 600 Dalton. Una "molécula orgánica pequeña" es una molécula pequeña que comprende carbono.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cambio en la unión" o "cambio en la actividad" y los términos equivalentes "diferencia en la unión" o "diferencia en la actividad" se refieren a un aumento o disminución de al menos el 10% en la unión o la actividad de señalización en un ensayo dado.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "condiciones que permiten la unión de TIG2 según la invención a ChemR23" se refiere a las condiciones de, por ejemplo, temperatura, concentración salina, pH y concentración de proteína en las que TIG2 se une a ChemR23. Las condiciones de unión exactas variarán dependiendo de la naturaleza del ensayo, por ejemplo, si el ensayo usa células viables o sólo fracciones de membrana de las células. Sin embargo, debido a que ChemR23 es una proteína de la superficie celular, y debido a que TIG2 es un polipéptido secretado que interacciona con ChemR23 en la superficie celular, las condiciones favorables incluirán generalmente sal fisiológica (90 mM) y pH (aproximadamente de 7,0 a 8,0). Las temperaturas para la unión pueden variar desde 15ºC hasta 37ºC, pero se encontrarán preferiblemente entre la temperatura ambiente y aproximadamente 30ºC. También variará la concentración de TIG2 y polipéptido de ChemR23 en una reacción de unión, pero se encontrará preferiblemente entre aproximadamente 0,1 pM (por ejemplo, en una reacción con el trazador radiomarcado de TIG2, en el que la concentración es generalmente inferior a la K_{d}) y 1 \muM (por ejemplo, TIG2 como competidor). Como ejemplo, para un ensayo de unión que usa células que expresan ChemR23 y un polipéptido de TIG2 purificado, recombinante y marcado, la unión se realiza usando TIG2 marcado 0,1 nM, TIG2 frío 100 nM, y 25.000 células a 27ºC en 250 \mul de un tampón de unión que consiste en HEPES 50 mM (pH 7,4), CaCl_{2} 1 mM, y BSA libre de ácidos grasos al 0,5%.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "muestra" se refiere a la fuente de moléculas que se están probando para determinar la presencia de un agente que modula la unión a o la actividad de señalización de un polipéptido de ChemR23. Una muestra puede ser una muestra medioambiental, un extracto natural de células o tejidos animales, vegetales, de levaduras o bacterianos, una muestra clínica, una muestra sintética, o un medio condicionado de células recombinantes o de un proceso de fermentación. El término, "muestra de tejido" se refiere a un tejido que se prueba para determinar la presencia, abundancia, calidad o una actividad de un polipéptido de ChemR23, un polipéptido de TIG2, un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de ChemR23 o TIG2, o un agente que modifica la unión de ligando o actividad de un polipéptido de ChemR23.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "tejido" es un agregado de células que realiza una función particular en un organismo. El término "tejido" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a material celular procedente de una región fisiológica particular. Las células en un tejido particular pueden comprender varios tipos celulares diferentes. Un ejemplo no limitante de esto podría ser el tejido cerebral que comprende además neuronas y células gliales, así como células endoteliales capilares y células sanguíneas, todas contenidas en una sección de tejido dada o muestra. Además de tejidos sólidos, el término "tejido" también se pretende que englobe tejidos que no son sólidos, tales como la sangre.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "fracción de membrana" se refiere a una preparación de membranas lipídicas celulares que comprenden un polipéptido de ChemR23. Tal como se utiliza el término en el presente documento, una "fracción de membrana" es diferente de un homogeneizado celular, en que se ha eliminado al menos una parte (es decir, al menos el 10% y preferiblemente más) de constituyentes celulares no asociados a membrana. El término "asociado a membrana" se refiere a aquellos constituyentes celulares que están o bien integrados en una membrana lipídica o bien físicamente asociados con un componente que está integrado en una membrana lipídica.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término según la invención "disminución en la unión" se refiere a una disminución de al menos el 10% en la unión de un polipéptido de TIG2 según la invención o de otro agonista a un polipéptido de ChemR23 tal como se midió en un ensayo de unión, tal como se describe en el presente documento.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "segundo mensajero" se refiere a una molécula, a la que se provoca o fuerza a variar de concentración mediante la activación de un receptor acoplado a proteína G, que participa en la transducción de una señal procedente de ese GPCR. Ejemplos no limitantes de segundos mensajeros incluyen AMPc, dialcilglicerol, inositol trifosfato y calcio intracelular. El término "cambio en el nivel de un segundo mensajero" se refiere a un aumento o disminución de al menos el 10% en el nivel detectado de un segundo mensajero dado con respecto a la cantidad detectada en un ensayo realizado en ausencia de un modulador candidato.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "ensayo basado en aequorina" se refiere a un ensayo para determinar la actividad GPCr que mide el flujo de calcio intracelular inducido por GPCR activados, en el que el flujo de calcio intracelular se mide mediante la luminiscencia de la aequorina expresado en la célula.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "unión" se refiere a la asociación física de un ligando (por ejemplo, un polipéptido de TIG2) con un receptor (por ejemplo, ChemR23). Tal como se utiliza el término en el presente documento, la unión es "específica" si sucede con una CE_{50} o una K_{d} de 100 nM o inferior, generalmente en el intervalo de 100 nM a 10 pM. Por ejemplo, la unión es específica si la CE_{50} o K_{d} es de 100nM, 50nM, 10 nM, 1 nM, 950 pM, 900 pM, 850 pM, 800 pM, 750 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 550 pM, 500 pM, 450 pM, 400 pM, 350 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 100 pM, 75 pM, 50 pM, 25 pM o 10 pM o inferior.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "CE_{50}" se refiere a esa concentración de un agente a la cual una actividad dada, incluyendo la unión de un polipéptido de TIG2 según la invención o de otro ligando y una actividad funcional de un polipéptido de ChemR23, es el 50% del máximo para esa actividad de ChemR23 medible usando en mismo ensayo. Establecida de manera diferente, la "CE_{50}" es la concentración de agente que proporciona un 50% de activación, cuando se establece el 100% de activación en la cantidad de actividad que no aumenta con la adición de más agonista. Debe observarse que la "CE_{50} de un polipéptido de TIG2" variará con la identidad del polipéptido de TIG2; por ejemplo, polipéptidos de TIG2 variantes (es decir, aquellos que contienen inserciones, deleciones, sustituciones o fusiones con otros polipéptidos, incluyendo las moléculas de TIG2 procedentes de especies distintas a los seres humanos y variantes de los mismos que satisfacen la definición de polipéptido de TIG2 expuesta anteriormente) pueden tener valores de CE_{50} superiores a, inferiores a o iguales a TIG2 de tipo natural. Por lo tanto, cuando una secuencia variante de TIG2 difiere de TIG2 de SEQ ID NO: 48, un experto en la técnica puede determinar la CE_{50} para esa variante según métodos convencionales. La CE_{50} de un polipéptido de TIG2 dado se mide realizando un ensayo para determinar la actividad de una cantidad fija de polipéptido de ChemR23 en presencia de dosis del polipéptido de TIG2 que aumentan al menos hasta que la respuesta ChemR23 se satura o es máxima, y entonces representando la actividad de ChemR23 medida frente a la concentración de polipéptido de TIG2.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "CE_{50}" es la concentración de un antagonista o agonista inverso que reduce la activación máxima de un receptor ChemR23 en un 50%.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "marcado de manera detectable" se refiere a la propiedad de una molécula, por ejemplo, un polipéptido de TIG2 u otro ligando de ChemR23, que tiene una modificación estructural que incorpora un grupo funcional (marcador) que puede detectarse rápidamente. Los marcadores detectables incluyen pero no se limitan a compuestos fluorescentes, compuestos isotópicos, compuestos quimioluminiscentes, marcadores de punto cuántico, biotina, enzimas, reactivos electrodensos, y haptenos o proteínas para los que hay disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales. Los distintos medios de detección incluyen pero no se limitan a medios espectroscópicos, fotoquímicos, radioquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "etiqueta de afinidad" se refiere a un marcador, unido a una molécula de interés (por ejemplo, un polipéptido de TIG2 u otro ligando de ChemR23), que confiere a la molécula marcada la capacidad para unirse específicamente mediante un reactivo que se une al marcador. Las etiquetas de afinidad incluyen pero no se limitan a un epítopo para un anticuerpo (conocido como "etiqueta de epítopo"), biotina, 6X His y GST. Las etiquetas de afinidad pueden usarse para la detección, así como para

\hbox{la
purificación de las especies marcadas.}

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "disminución en la unión" se refiere a una disminución de al menos el 10% en la cantidad de unión detectada en un ensayo dado, con un modulador conocido o sospechado de ChemR23 con respecto a la unión detectada en un ensayo que carece del modulador conocido o sospechado.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "administración" cuando se utiliza en referencia a un fármaco o un agente, significa la adición del fármaco o agente a una mezcla de ensayo, o a una célula en cultivo. El término se refiere también a la administración del fármaco o agente a un animal. Tal administración puede ser, por ejemplo, mediante inyección (en un vehículo adecuado, por ejemplo, solución salina estéril o agua) o mediante inhalación, o por vía oral, transdérmica, rectal, vaginal, u otra vía común de administración de fármacos.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de un fármaco o agente modulador de ChemR23 que da como resultado un cambio en la actividad de ChemR23 tal como se define en el presente documento (es decir, aumento o disminución de al menos un 10% en la actividad de ChemR23).

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "patrón" se refiere a una muestra tomada de un individuo que no está afectado por una enfermedad o trastorno caracterizado por la desregulación de la actividad de ChemR23 o TIG2. El "patrón" se usa como referencia para la comparación de niveles y calidad de ChemR23 o polipéptido de TIG2 o ARNm (es decir, mutante frente a tipo natural), así como para la comparación de actividades de ChemR23.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "amplificación" cuando se aplica a una secuencia de ácido nucleico, se refiere a un proceso mediante el cual se generan una o más copias de una secuencia de ácido nucleico a partir de un ácido nucleico molde. Un método preferido de "amplificación" es PCR o RT-PCR.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "ausencia sustancial" se refiere al nivel de un factor de activación o inhibición que está por debajo del nivel necesario para activar o inhibir la función de GPCR en al menos un 10% tal como se midió en un ensayo dado descrito en el presente documento conocido en la técnica.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "receptor acoplado a proteína-G" o "GPCR" se refiere a un polipéptido asociado a membrana con 7 dominios transmembrana de alfa-hélices. Los GPCR funcionales se asocian con un ligando o agonista y también se asocian con y activan proteínas G. ChemR23 es un GPCR.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "agente que modula la función de un polipéptido de ChemR23" es una molécula o compuesto que aumenta o disminuye la actividad de ChemR23, incluyendo compuestos que cambian la unión de polipéptidos de TIG2 según la invención u otros agonistas, y compuestos que cambian las actividades de señalización en sentido 3' de ChemR23.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" es la molécula de inmunoglobulina convencional, así como fragmentos de la misma que son también específicamente reactivos con uno de los polipéptidos objeto. Los anticuerpos pueden fragmentarse usando técnicas convencionales y los fragmentos pueden seleccionarse por su utilidad de la misma manera tal como se describe en el presente documento más adelante para los anticuerpos completos. Por ejemplo, pueden generarse fragmentos F(ab)_{2} tratando el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab)_{2} resultante puede tratarse para reducir los puentes disulfuro para producir fragmentos Fab. El anticuerpo de la presente invención se pretende que incluya adicionalmente moléculas biespecíficas, de cadena sencilla, y quiméricas y humanizadas que tienen afinidad por un polipéptido conferida por al menos una región CDR del anticuerpo. En realizaciones preferidas de los anticuerpos, el anticuerpo comprende además un marcador unido a él y que puede detectarse (por ejemplo, el marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, una enzima, o un cofactor enzimático).

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "mutación nula" se refiere a una inserción, deleción, o sustitución que modifica las secuencias cromosómicas que codifican para un polipéptido, de tal manera que el polipéptido no se expresa.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) y de aminoácidos deducida de ChemR23/Dezb/
CMKRL1 (AC075748) humano.

La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de ChemR23/Dezb/CMKRL1 humano (371 aminoácidos)(SEQ ID NO: 2). Los siete dominios transmembrana pronosticados están subrayados. La secuencia consenso para la glucosilación de unión a N (N-X-S/T) en el extremo N-terminal está en negrita, y el sitio potencial de fosforilación por PKC (S/T-X-R/K) en el extremo C-terminal está en cursiva.

La figura 3 muestra las secuencias de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) y de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 4) del ratón Dez, el ortólogo de ratón de ChemR23 (AC u79525).

La figura 4 muestra las secuencias de nucleótidos (SEQ ID NO: 5) y de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 6) de factor quimiotáctico 1 acoplado a proteína G de rata, el ortólogo de ratón de ChemR23/Dezb/CMKRL1 (AC NM_022218).

La figura 5 muestra las similitudes estructurales entre las secuencias de aminoácidos de ChemR23/Dezb/CMKRL1 y las secuencias de los receptores AT2, C3a, c5a y fMLP y secuencias de receptores de quimiocinas seleccionadas realizadas usando el algoritmo ClustalX. El dendrograma mostrado se construyó usando el algoritmo TreeView.

La figura 6 muestra las secuencias de nucleótidos (SEQ ID NO: 7) y de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 8) del TIG2 humano (AC Q99969).

La figura 7 muestra las secuencias de nucleótidos (SEQ ID NO: 9) y de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 10) del TIG2 de ratón.

La figura 8 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de TIG2 humano (SEQ ID NO: 8) y de ratón (SEQ ID NO: 10). Los aminoácidos idénticos y las sustituciones conservativas están recuadrados.

La figura 9 muestra una alineación de las secuencias de TIG2 humano ("tig2"; SEQ ID NO: 8), de rata (SEQ ID NO: 31), de ratón (SEQ ID NO: 10), de jabalí (Sus Scrofa) (SEQ ID NO: 32), de vaca (Bos Taurus) (SEQ ID NO: 33), y de gallo (Gallus gallus) (SEQ ID NO: 34). La figura proporciona el porcentaje de identidad de aminoácidos entre dos especies cualesquiera enumeradas.

La figura 10 muestra un cromatograma parcial de la quinta etapa de purificación de TIG2 procedente de líquido ascítico. Las fracciones activas (eluídas con CH_{3}CN aproximadamente al 28%) de la etapa previa se diluyeron 6 veces con TFA al 0,1% en H_{2}O y se cargaron directamente en una columna C18 de fase inversa (1 mm x 50 mm, Vydac) preequilibrada con CH_{3}CN al 5%/TFA al 0,1% en H_{2}O a una velocidad de flujo de 0,1 ml/min. a temperatura ambiente. Se aplicó un gradiente del 5-95% de CH_{3}CN en TFA al 0,1% con una pendiente del 0,3%/min entre el 25% y el 45%. Se eluyó la actividad con CH_{3}CN al 40% (indicada por la línea negra horizontal).

La figura 11 muestra la identificación de una respuesta específica para ChemR23 tras la selección de las fracciones de HPLC obtenidas del fraccionamiento de ascitis de ovario humano. Las diferentes fracciones obtenidas tras el fraccionamiento de ascitis de ovario humano se diluyeron cinco veces con el tampón de ensayo y se probaron en el ensayo de aequorina usando una línea celular que expresa ChemR23 (círculos en blanco) o líneas celulares que expresan receptores no relacionados (triángulos y cuadrados rellenos). La respuesta obtenida para cada fracción se normalizó usando la repuesta a ATP de cada línea celular.

La figura 12 muestra la activación de ChemR23 por medio condicionado de células 293T transfectadas de manera transitoria con TIG2. Las células 293T fueron transfectadas de manera transitoria con ADN3pc-TIG2 o con ADN3pc solo (transfectado de prueba). Los volúmenes crecientes de sobrenadante recogidos 4 días después de la transfección se analizaron usando un Microlumat en un ensayo basado en aequorina con células CHO que expresan ChemR23. El ensayo se realizó por triplicado, y se indica la DE. Se muestra un experimento representativo.

La figura 13 muestra la caracterización de los anticuerpos dirigidos contra ChemR23 mediante citometría de flujo. Se hizo reaccionar una mezcla de células recombinantes compuesta por 2/3 de células ChemR23-CHO recombinantes y 1/3 de células HCR-CHO recombinantes (control negativo) con o bien un sobrenadante del anticuerpo monoclonal anti-ChemR23 5C 1H2 (línea gruesa) o bien un sobrenadante sin actividad de anticuerpos conocida (línea fina, relleno gris). Después de la tinción con IG anti-ratón marcada con FITC, estas preparaciones se analizaron mediante citometría de flujo. Los resultados se exponen como un histograma del número de células (eje de los acontecimientos) que expresan una fluorescencia dada (eje de FL1-H). El 5C 1H2 monoclonal permitió la discriminación de la subpoblación de células de ChemR23 recombinante a partir de las células control negativas, tal como se pone en evidencia por las proporciones relativas de ambos tipos de células. La fluorescencia de fondo del ensayo se proporciona mediante una segunda tinción (relleno gris).

La figura 14 muestra la CE_{50} para la activación de ChemR23 por el polipéptido truncado de hTIG2 determinado tal como se explica en el ejemplo 11.

La figura 15 muestra la distribución en los tejidos del ARNm de hTIG2 determinado tal como se explica en el ejemplo 10.

La figura 16 muestra la distribución en los tejidos del ARNm de ChemR23 determinado tal como se explica en el ejemplo 10. DC significa células dendríticas.

La figura 17 muestra el polipéptido (SEQ ID NO: 48) y el polinucleótido (SEQ ID NO: 49) del TIG2 truncado humano.

La figura 18 muestra las secuencia polipeptídicas de otros polipéptidos truncados humanos de TIG2 (SEQ ID NO 50 a 60) comparadas con TIG2 de SEQ ID NO: 48 y TIG2 de longitud completa (SEQ ID NO: 8).

Descripción detallada de la invención

La solicitud describe que el polipéptido de TIG2 es un ligando natural para el GPCR ChemR23 huérfano. La interacción es útil para ensayos de selección de agentes que modulan la interacción y así la función de ChemR23. El ligando conocido y su interacción con el receptor también proporciona el diagnóstico de estados que implican una actividad del receptor desregulada.

I. Ensayos para la identificación de agentes que modulan la actividad de ChemR23

Los agentes que modulan la actividad de ChemR23 pueden identificarse de varias formas que se aprovechan de la interacción del receptor con TIG2. Por ejemplo, la capacidad para reconstituir la unión de ChemR23/TIG2 o bien in vitro, en células en cultivo o bien in vivo proporciona un objetivo para la identificación de agentes que perturban esa unión. Los ensayos basados en la perturbación de la unión pueden identificar agentes, tales como moléculas orgánicas pequeñas, procedentes de bibliotecas o colecciones de tales moléculas. Alternativamente, tales ensayos pueden identificar agentes en muestras o extractos procedentes de fuentes naturales, por ejemplo, extractos vegetales, fúngicos o bacterianos o incluso en muestras de tejido humano (por ejemplo, tejido tumoral). En un aspecto, los extractos pueden prepararse a partir de células que expresan una biblioteca de ácidos nucléicos, péptidos o polipéptidos variantes, incluyendo, por ejemplo, variantes del propio polipéptido de TIG2. Los moduladores de la unión de ChemR23/TIG2 pueden seleccionarse usando un ensayo de unión o un ensayo funcional que mide la señalización en sentido 3' a través del receptor. Ambos ensayos de unión y ensayos funcionales, están validados usando el polipéptido de TIG2.

Otro enfoque que usa la interacción de ChemR23/TIG2 más directamente para identificar agentes que modulan la función de ChemR23 mide los cambios en la señalización en sentido 3' de ChemR23 inducida por agentes candidato o moduladores candidato. Estos ensayos funcionales pueden realizarse en fracciones de membrana celular aisladas o en células que expresan el receptor en su superficie.

La siguiente descripción proporciona métodos para ambos ensayos de unión y funcionales basados en la interacción de ChemR23 y TIG2.

A. Polipéptidos de ChemR23

Los ensayos que usan la interacción de ChemR23 y TIG2 requieren una fuente de polipéptido de ChemR23. La secuencia de polinucleótido y polipéptido de ChemR23 humano se presentan en el presente documento como SEQ ID Nos: 1 y 2. La secuencia de polinucleótido de ChemR23 humano también está disponible en el nº de registro de GenBank Y14838, y se notificó en Samson et al., Eur. J. Immunol. 28: 1689-1700, que se incorpora al presente documento como referencia. La secuencia del polipéptido de ChemR23 también está registrada en los nº de registro 075748 y CAA75112 en la base de datos Swissprot. Secuencias relacionadas incluyen aquellas para CMKRL1 (nº de registro de GenBank XM_006864 y NM004072 (secuencias de nucleótidos) y nº de registro de Swissprot Q99788 (secuencia polipeptídica)), DEZb humano (nº de registro de GenBank U79527 (secuencia de nucleótidos)), DEZa humano (nº de registro de GenBank U79526 (secuencia de nucleótidos), DEZ de ratón (nº de registro de GenBank U79525 (secuencia de nucleótidos) y (nº de registro de Swissprot P97468 (secuencia polipeptídica), y ChemR23 de rata (nº de registro de GenBank AJ002745 (secuencia de nucleótidos) y nº de registro de Swissprot 035786 (secuencia polipeptídica)).

Un experto en la técnica puede amplificar fácilmente una secuencia de ChemR23 a partir de una muestra que contiene ARNm que codifica para la proteína mediante técnicas de PCR y de clonación molecular básicas usando cebadores o sondas diseñados a partir de las secuencias conocidas.

La expresión de polipéptidos recombinantes se conoce bien en la técnica. Aquellos expertos en la técnica pueden seleccionar fácilmente vectores y secuencias de control de la expresión para la expresión de polipéptidos de ChemR23 útiles según la invención en células eucariotas o procariotas. ChemR23 debe estar asociado con la membrana celular o con detergentes como liposomas sintéticos con el fin de tener una función de unión o señalización. Los métodos para la preparación de fracciones de membrana celular se conocen bien en la técnica, por ejemplo, el método notificado por Hubbard & Cohn, 1975 J. Cell Biol. 64: 461-479, que se incorpora al presente documento como referencia. Con el fin de producir membranas que comprendan ChemR23, la necesidad sólo aplica tales técnicas a células que expresan ChemR23 de forma endógena o recombinante. Alternativamente, ChemR23 libre de membrana puede integrarse en preparaciones de membrana mediante dilución de la disolución detergente del polipéptido (véase, por ejemplo, Salamon et al., 1996, Biophys. J. 71:283-294, que se incorpora al presente documento como referencia).

B. Polipéptidos de TIG2

Las secuencias de polipéptido y polinucleótido de TIG2 humano se presentan en el presente documento como SEQ ID Nº 7 y 8, respectivamente. Las secuencias de TIG2 están también disponibles en GenBank (por ejemplo, las secuencias de polinucleótidos humanos incluyen los nº de registro XM 004765, U77594, NM 002889, la secuencia de polipéptido humana está disponible en los nº de registro Q99969, BAA76499, AAB47975, NP002880, y XP004765; las secuencias de polinucleótido de Gallus gallus incluyen los nº de registro BG713704, BG713660 y BG713614; las secuencias de polinucleótido de ratón incluyen BF020273, AW113641 y bf018000; las secuencias de polinucleótido de rata incluyen AW915104; las secuencias de polinucleótido de Sus scrofa incluyen BF078978 y BP713092 (EST solapantes, 7 últimos aminoácidos de la secuencia de TIG2 en BF713092); y las secuencias de polinucleótido de Bos taurus incluyen BG691132). Se presenta en la figura 9 una alineación de secuencias de TIG2.

Como con ChemR23, los polinucleótidos de TIG2 pueden clonarse mediante técnicas de PCR y clonación molecular convencionales usando las secuencias conocidas como fuente de cebadores o sondas de amplificación. De manera similar, los polipéptidos de TIG2 clonados pueden expresarse en células eucariotas o procariotas tal como se conoce en la técnica. Como un ejemplo no limitante, un sistema de vector de expresión de TIG2 de mamífero puede comprender un vector de expresión bicistrónico que contiene el promotor de EF1\alpha humano (descrito por Mishizuma & Nagata, 1990, Nucl. Acids Res. 18:5322), un policonector, el sitio de entrada interna al ribosoma ECMV (IRES, descrito por Ghattas et al., 1991, Mol. Cell. Biol. 11:5848-5859) y el gen de resistencia a neomicina seguido de una señal poliA de SV40. Se describe en el ejemplo 4 un constructo de expresión de TIG2 para la expresión en levaduras.

También puede expresarse TIG2 in vitro mediante transcripción y traducción in vitro. Además, si se desea para un ensayo o técnica dados, los polipéptidos de TIG2 útiles según la invención pueden producirse como proteínas de fusión o proteínas etiquetadas. Por ejemplo, o bien un TIG2 de longitud completa o bien una parte del mismo (es decir, al menos 10 aminoácidos, preferiblemente al menos 20 aminoácidos o más, hasta un aminoácido menos que el TIG2 de longitud completa) pueden fusionarse a la glutation-S-transferasa (GST), fosfatasa alcalina secretada (SEAP), una etiqueta FLAG, una etiqueta TAG, o un péptido de 6X-His para facilitar la purificación o detección del polipéptido de TIG2. Se conocen bien en la técnica métodos y vectores para la producción de proteínas etiquetadas o de fusión, así como los métodos para aislar y detectar tales proteínas etiquetadas o fusionadas.

Los polipéptidos de TIG2 y particularmente las formas truncadas pueden prepararse también por síntesis química tal como se conoce en la técnica.

Los polipéptidos de TIG2 recombinantes pueden usarse en forma purificada. Alternativamente, puede usarse medio condicionado de células transfectadas con TIG2. Las cantidades de TIG2 necesarias en un ensayo de unión o funcional dado según la invención variarán dependiendo del ensayo, pero generalmente se usarán de 1 pM a 1 nM de TIG2 marcado y de 10 pM a 1 \muM de TIG2 no marcado por ensayo. Las afinidades y CE_{50} de los polipéptidos de TIG2 etiquetados para ChemR23 pueden variar con respecto a aquellos polipéptidos de TIG2 de longitud completa tipo natural, y la cantidad necesaria para un ensayo dado puede ajustarse, por tanto, con respecto a los valores del tipo natural. Si es necesario para un ensayo dado, TIG2 puede marcarse mediante incorporación de aminoácidos radiomarcados en el medio durante la síntesis, por ejemplo, ^{35}S-Mel, ^{14}C-Leu, u otros según corresponda. Se conocen métodos en la técnica para el marcaje químico con ^{125}I. También pueden unirse marcadores fluorescentes a polipéptidos de TIG2 o a otros ligandos de ChemR23 usando técnicas convencionales de marcaje.

C. Ensayos para identificar moduladores de la actividad de ChemR23

El descubrimiento de que TIG2 es un ligando del receptor ChemR23 permite ensayos de selección para identificar agonistas, antagonistas y agonistas inversos de la actividad del receptor. Los ensayos de selección tendrán dos enfoques generales.

1) Ensayos de unión a ligando, en los que células que expresen ChemR23, extractos de membrana de tales células, o membrana lipídicas inmovilizadas que comprenden ChemR23 se exponen a un polipéptido de TIG2 marcado y un compuesto candidato. Tras la incubación, la mezcla de reacción se mide para determinar la unión específica del polipéptido de TIG2 marcado al receptor ChemR23. Los compuestos que interfieren con o desplazan el polipéptido de TIG2 marcado pueden ser agonistas, antagonistas o agonistas inversos de la actividad de ChemR23. Pueden realizarse ensayos funcionales en compuestos positivos para determinar a cuál de estas categorías pertene-
cen.

2) Ensayos funcionales, en los que se mide la actividad de señalización de ChemR23.

a) Para la selección de agonistas, las células que expresan ChemR23 o las membranas preparadas a partir de ellas se incuban con un compuesto candidato, y se mide la actividad de señalización de ChemR23. Los ensayos se validan usando un polipéptido de TIG2 tal como se definió anteriormente como agonista, y la actividad inducida por compuestos que modulan la actividad del receptor se compara con la inducida por TIG2 tal como se definió anteriormente. Un agonista o agonista parcial tendrá una actividad biológica máxima correspondiente a al menos el 10% de la actividad máxima de TIG2 tal como se definió anteriormente cuando el agonista o agonista parcial se presenta a 10 \muM o menos.

b) Para la selección de antagonistas o agonistas inversos, las células que expresan ChemR23 o las membranas aisladas a partir de ellas se someten a ensayo para determinar la actividad de señalización en presencia de un polipéptido de TIG2 con o sin compuesto candidato. Los antagonistas o agonistas inversos reducirán el nivel de la actividad del receptor estimulado por TIG2 en al menos un 10% con respecto a reacciones que carecen del antagonista o agonista inverso.

c) Para la selección de agonistas inversos, las células que expresan actividad de ChemR23 constitutiva o las membranas aisladas a partir de ellas se usan en un ensayo funcional que mide la actividad del receptor en presencia y ausencia de un compuesto candidato. Los agonistas inversos son aquellos compuestos que reducen la actividad constitutiva del receptor en al menos un 10%. La sobreexpresión de ChemR23 (es decir, la expresión de 5 veces o un exceso superior del polipéptido de ChemR23 en relación con el nivel expresado naturalmente en macrófagos in vivo) puede conducir a una activación constitutiva. ChemR23 puede sobreexpresarse situándolo bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, por ejemplo, el promotor de expresión temprana CMV. Alternativamente, ciertas mutaciones de aminoácidos o de los dominios de aminoácidos de GPCR conservados tienden a conducir a una actividad constitutiva. Véase por ejemplo: Kjelsberg et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:1430; McWhinney et al., 2000, J. Biol. Chem. 275:2087; Ren et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:16483; Samana et al., J. Biol. Chem. 268:4625; Parma et al., 1993, Nature 365:649; Parma et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 286:85; y Parent et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:7949.

Ensayos de unión y desplazamiento de ligandos

Pueden usarse polipéptidos de ChemR23 expresados en una célula, o en membranas aisladas que contienen polipéptidos del receptor, junto con un polipéptido de TIG2 con el fin de seleccionar compuestos que inhiben la unión de TIG2 a ChemR23. Cuando se identifican en un ensayo que mide la unión o el desplazamiento del polipéptido de TIG2 solo, los compuestos tendrán que someterse a pruebas funcionales para determinar si actúan como agonistas, antagonistas o agonistas inversos.

Para experimentos de desplazamiento, las células que expresan un polipéptido de ChemR23 (generalmente 25.000 células por ensayo o de 1 a 100 \mug de extractos de membrana) se incuban en tampón de unión (por ejemplo, HEPES 50 mM pH 7,4, CaCl_{2} 1 mM, y albúmina de suero bovino (BSA) libre de ácidos grasos al 0,5%; y MgCl_{2} 0,5 mM) durante 1,5 h (a, por ejemplo, 27ºC) con un polipéptido de TIG2 marcado en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de un modulador candidato. Para validar y calibrar el ensayo, pueden realizarse reacciones de competición control usando concentraciones crecientes de polipéptido de TIG2 no marcado. Después de la incubación, se lavan las células exhaustivamente, y se mide el TIG2 marcado unido según corresponda para el marcador dado (por ejemplo, recuento por centelleo, ensayo enzimático, fluorescencia, etc.). Una disminución de al menos el 10% en la cantidad de polipéptido de TIG2 marcado unido en presencia de un modulador candidato indica un desplazamiento de la unión por el modulador candidato. Se considera que los moduladores candidato se unen específicamente en este y otros ensayos descritos en el presente documento si desplazan el 50% del TIG2 marcado (dosis de TIG2 inferior a la saturante) a una concentración de 10 \muM o inferior (es decir, CE_{50} es 10 \muM o inferior).

Alternativamente, la unión o el desplazamiento de la unión pueden monitorizarse mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Los ensayos de resonancia de plasmón superficial pueden usarse como método cuantitativo para medir la unión entre dos moléculas por el cambio en masa cerca de un sensor inmovilizado provocado por la unión o pérdida de unión de un polipéptido de TIG2 procedente de la fase acuosa a un polipéptido de ChemR23 inmovilizado en una membrana sobre el sensor. Este cambio en masa se mide como unidades de resonancia frente al tiempo después de la inyección o eliminación del polipéptido de TIG2 o del modulador candidato, y se mide usando un biosensor Biacore (Biacore AB). ChemR23 puede inmovilizarse en un chip sensor (por ejemplo, chip CM5 de calidad para investigación; Biacore AB) en una fina membrana lipídica según los métodos descritos por Salamon et al. (Salamon et al., 1996, Biophys J. 71:283-294; Salamon et al., 2001, Biophys J. 80:1557-1567; Salamon et al., 1999, Trends Biochem. Sci. 24:213-219, cada uno de los cuales se incorpora al presente documento como referencia). Sarrio et al. demostraron que puede usarse SPR para detectar la unión de ligandos al receptor de adenosina GPCR A(1) inmobilizado en una capa lipídica sobre el chip (Sarrio et al., 2000, Mol. Cell. Biol. 20: 5164 - 5174, incorporado al presente documento como referencia). Las condiciones para la unión de TIG2 a ChemR23 en un ensayo de SPR pueden ajustarse por un experto en la técnica usando las condiciones notificadas por Sarrio et al. como punto de partida.

La SPR puede someterse a ensayo para determinar moduladores de unión de al menos dos maneras. En primer lugar, un polipéptido de TIG2 puede unirse previamente a un polipéptido de ChemR23 inmobilizado, seguido de la inyección de un modulador candidato a una velocidad de flujo de aproximadamente 10 \mul/min y a una concentración que oscila desde 1 nM hasta 100 \muM, preferiblemente de aproximadamente 1 \muM. El desplazamiento del TIG2 unido puede cuantificarse, permitiendo la detección de la unión de modulador. Alternativamente, el polipéptido de ChemR23 unido a membrana puede preincubarse con un modulador candidato y exponerse a un polipéptido de TIG2. Una diferencia en la unión de TIG2 al ChemR23 expuesto a modulador con respecto a un chip no expuesto previamente al modulador demostrará unión. En cada ensayo, una disminución del 10% o superior en la cantidad de polipéptido de TIG2 unido es en presencia del modulador candidato, con respecto a la cantidad de polipéptido de TIG2 unido en ausencia de modulador candidato, indica que el modulador candidato inhibe la interacción de ChemR23 y TIG2.

Otro método para medir la inhibición de la unión de un polipéptido de TIG2 a ChemR23 usa la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). FRET es un fenómeno mecánico-cuántico que ocurre entre un donador de fluorescdncia (D) y un aceptor de fluorescencia (A) en proximidad estrecha entre sí (normalmente < 100 A de separación) si el espectro de emisión de D se solapa con el espectro de excitación de A. Las moléculas que van a probarse, por ejemplo, un polipéptido de TIG2 y un polipéptido de ChemR23, se marcan con un par complementario de fluoróforos donador y aceptor. Mientras están unidos estrechamente juntos mediante la interacción de ChemR23:TIG2, la fluorescencia emitida con la excitación del fluoróforo donador tendrá una longitud de onda diferente que la emitida en respuesta a esa longitud de onda de excitación cuando los polipéptidos no están unidos, lo que proporciona la cuantificación de polipéptidos unidos frente a los no unidos mediante la medición de la intensidad de emisión a cada longitud de onda. Las parejas de fluoróforos donador:aceptor con los que unir los polipéptidos se conocen bien en la técnica. Son de particular interés las variantes de A. victoria conocido como FP cian (CFP, donador (D)) y FP amarillo (YPF, aceptor (A)). Pueden prepararse variantes de GFP como proteínas de fusión con los miembros respectivos del par de unión para servir como pares D-A en un esquema FRET para medir la interacción proteína-proteína. Se conocen en la técnica vectores para la expresión de variantes de GFP como fusiones. Como ejemplo, puede prepararse una fusión de CFP-TIG2 y una fusión de YFP-ChemR23. La adición de un modulador candidato a la mezcla de proteínas TIG2 y ChemR23 marcadas dará como resultado una inhibición de la transferencia de energía evidenciada, por ejemplo, por una disminución en la fluorescencia de YFP con respecto a una muestra sin el modulador candidato. En un ensayo que utiliza FRET para la detección de la interacción de ChemR23:TIG2, una disminución del 10% o superior en la intensidad de la emisión de fluorescencia a la longitud de onda del aceptor en muestras que contienen un modulador candidato, con respecto a muestras sin modulador candidato, indica que el modulador candidato inhibe la interacción de ChemR23:TIG2.

Una variación de FRET usa la extinción de fluorescencia para monitorizar las interacciones moleculares. Una molécula en el par de interacción puede marcarse con un fluoróforo, y la otra con una molécula que extingue la fluorescencia del fluoróforo cuando se pone en estrecha aposición con él. Un cambio en la fluorescencia con la excitación es indicativo de un cambio en la asociación de las moléculas etiquetadas con el par de fluoróforo:extintor. Generalmente, un aumento en la fluorescencia del polipéptido de ChemR23 marcado es indicativo de que el polipéptido de TIG2 que soporta el extintor ha sido desplazado. Para ensayos de extinción, un aumento del 10% o más en la intensidad de la emisión de fluorescencia en muestras que contienen un modulador candidato, con respecto a muestras sin el modulador candidato, indica que el modulador candidato inhibe la interacción de ChemR23:TIG2.

Además de los métodos de resonancia de plasmón superficial y FRET, la medida de la polarización de fluorescencia es útil para cuantificar la unión proteína-proteína. El valor de polarización de fluorescencia para una molécula etiquetada con fluorescencia depende del tiempo de correlación rotacional o velocidad de volteo. Los complejos de proteína, tales como aquellos formados por ChemR23 que se asocia con un polipéptido de TIG2 marcado con fluorescencia, tienen valores superiores de polarización que TIG2 marcado no complejado. La inclusión de un inhibidor candidato de la interacción de ChemR23:TIG2 da como resultado una disminución en la polarización de fluorescencia, con respecto a una mezcla sin el inhibidor candidato, si el inhibidor candidato perturba o inhibe la interacción de ChemR23 con TIG2. La polarización de fluorescencia es muy apropiada para la identificación de pequeñas moléculas que perturban la formación de complejos de polipéptidos o proteínas. Una disminución del 10% o superior en la polarización de fluorescencia en muestras que contienen un modulador candidato, con respecto a la polarización de fluorescencia en una muestra que carece del modulador candidato, indica que el modulador candidato inhibe la interacción de ChemR23:TIG2.

Otra alternativa para monitorizar las interacciones de ChemR23:TIG2 usa un ensayo de biosensor. Los biosen-
sores ICS se han descrito por AMBRI (Instituto Australiano de Investigación de Biotecnología de Membranas;
http//www.ambri.com.au/). En esta tecnología, la asociación de macromoléculas tales como ChemR23 y TIG2, está acoplada al cierre de los canales iónicos facilitados por gramicidina en bicapas de membrana en suspensión y por tanto a un cambio medible en la admitancia (similar a la impedancia) del biosensor. Esta aproximación es lineal en seis órdenes de magnitud de cambio de admitancia y es idealmente apto para selecciones a gran escala, de rendimiento elevado de bibliotecas combinatorias de pequeñas moléculas. Un cambio de un 10% o superior (aumento o disminución) en la admitancia de una muestra que contiene un modulador candidato, con respecto a la admitancia de una muestra que carece de modulador candidato, indica que el modulador candidato inhibe la interacción ChemR23 y TIG2.

Es importante observar que en ensayos de interacción proteína-proteína, es posible que un modulador de la interacción no necesite necesariamente interaccionar directamente con el (los) dominio(s) de las proteínas que interaccionan físicamente. También es posible que un modulador interaccionará en un lugar eliminado del sitio de la interacción proteína-proteína y produzca, por ejemplo, un cambio conformacional en el polipéptido de ChemR23. Los moduladores (inhibidores o agonistas) que actúan de este modo son sin embargo de interés como agentes que modulan la actividad de ChemR23.

Debe entenderse que cualquiera de los ensayos de unión descritos en el presente documento pueden realizarse con un ligando distinto a TIG2 (por ejemplo, agonista, antagonista, etc.) de ChemR23, por ejemplo, una molécula pequeña identificada tal como se describió en el presente documento. En la práctica, el uso de un ligando de molécula pequeña u otro ligando distinto a TIG2 tiene el beneficio de que los compuestos químicos no polipeptídicos son generalmente más baratos y más fáciles de producir en forma purificada que polipéptidos tales como TIG2. Por tanto, un ligando distinto a TIG2 está mejor adaptado a ensayos de rendimiento elevado para la identificación de agonistas, antagonistas o agonistas inversos que TIG2 de longitud completa. Esta ventaja no afecta de ninguna manera a la importancia de los ensayos que usan TIG2, sin embargo, ya que tales ensayos son muy aptos para la identificación inicial de ligandos distintos a TIG2.

Cualquiera de los ensayos de unión descritos puede usarse para determinar la presencia de un agente en una muestra, por ejemplo, una muestra de tejido, que se une a la molécula de receptor ChemR23, o que afecta a la unión de TIG2 con el receptor. Para hacer esto, el polipéptido de ChemR23 se hace reaccionar con el polipéptido de TIG2 u otro ligando en presencia o ausencia de la muestra, y se mide la unión de TIG2 o de ligando según corresponda al ensayo de unión que se está usando. Una disminución del 10% o superior en la unión de TIG2 u otro ligando indica que la muestra contiene un agente que modula la unión de TIG2 o de ligando al polipéptido del receptor.

Ensayos funcionales de la actividad del receptor i. Ensayos de unión a GTPasa/GTP

Para GPCR tales como ChemR23, una medida de la actividad del receptor es la unión de GTP mediante membranas celulares que contienen receptores. En el método descrito por Traynor y Nahorski, 1995, Mol. Pharmacol. 47:848-854, que se incorpora al presente documento como referencia, se mide esencialmente el acoplamiento de proteína G a membranas mediante la medición de la unión de GTP marcado. Para ensayos de unión a GTP, se incuban membranas aisladas de células que expresan el receptor en un tampón que contiene HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, y MgCl_{2} 10 mM, ^{35}S-GTP\gammaS 80 pM y GDP 3 \muM. La mezcla de ensayo se incuba durante 60 minutos a 30ºC, después de lo cual se elimina el GTP no unido por filtración sobre filtros GF/B. El GTP unido, marcado, se mide mediante recuento por centelleo líquido. Con el fin de someter a ensayo la modulación de la actividad de ChemR23 inducida por TIG2, se mezclan membranas preparadas a partir de células que expresan un polipéptido de ChemR23 con un polipéptido de TIG2, y se realiza el ensayo de unión a GTP en presencia y en ausencia de un modulador candidato de la actividad de ChemR23. Una disminución del 10% o superior en la unión de GTP marcado tal como se midió mediante recuento por centelleo en un ensayo de este tipo que contiene un modulador candidato, con respecto a un ensayo sin el modulador, indica que el modulador candidato inhibe la actividad de ChemR23.

Puede realizarse un ensayo de unión a GTP similar sin TIG2 para identificar compuestos que actúan como agonistas. En este caso, la unión a GTP estimulada por TIG2 se utiliza como patrón. Se considera que un compuesto es un agonista si induce al menos un 50% del nivel de la unión de GTP inducida por TIG2 de longitud completa tipo natural cuando el compuesto está presente a 1 \muM o inferior, y preferiblemente inducirá un nivel similar a o superior que el inducido por TIG2.

La actividad GTPasa se mide mediante incubación de las membranas que contienen un polipéptido de ChemR23 con \gamma^{32}P-GTP. La GTPasa activa liberará el marcador como fosfato inorgánico, que se detecta mediante la separación de fosfato inorgánico libre en una suspensión al 5% de carbón activado en H_{3}PO_{4} 20 mM, seguido de un recuento por centelleo. Los controles incluyen ensayos que usan membranas aisladas a partir de células que no expresan ChemR23 (transfectado de prueba), con el fin de excluir posibles efectos no específicos del compuesto
candidato.

Con el fin de someter a ensayo el efecto de un modulador candidato sobre la actividad GTPasa regulada por ChemR23, se incuban muestras de membrana con un polipéptido de TIG2, con y sin el modulador, seguido del ensayo de GTPasa. Un cambio (aumento o disminución) de un 10% o superior en el nivel de la unión a GTP o de la actividad GTPasa, con respecto a muestras sin modulador, es indicativo de la modulación de ChemR23 por un modulador candidato.

ii. Ensayos de activación de la ruta corriente abajo a. Flujo de calcio - Ensayo basado en aequorina

El ensayo de aequorina se aprovecha de la capacidad de respuesta de la apoaequorina mitocondrial a la liberación de calcio intracelular inducida mediante la activación de los GPCR (Stables et al., Anal. Biochem. 252:115-126; Detheux et al., 2000, J. Exp. Med., 192 1501-1508; ambos se incorporan al presente documento como referencia). Brevemente, los clones que expresan ChemR23 se transfectan para coexpresar apoaequorina mitocondrial y G\alpha16. Se incuban las células con coelenterazina H 5 \muM (Molecular Probes) durante 4 horas a temperatura ambiente, se lavan con medio de cultivo DMEM-F12 y se resuspenden a una concentración de 0,5 x 10^{6} células/ml. Las células se mezclan entonces con péptidos agonistas de prueba y se registra la emisión de luz por la aequorina con un luminómetro durante 30 segundos. Los resultados se expresan como unidades relativas de luz (URL). Los controles incluyen ensayos que usan membranas aisladas de células que no expresan ChemR23 (transfectado de prueba), con el fin de excluir posibles efectos no específicos del compuesto candidato.

La actividad de aequorina o los niveles de calcio intracelulares "cambian" si la intensidad de la luz aumenta o disminuye un 10% o más en una muestra de células, que expresan un polipéptido de ChemR23 y se tratan con un modulador candidato, con respecto a una muestra de células que expresan el polipéptido de ChemR23 pero que no se tratan con el modulador candidato o con respecto a una muestra de células que no expresan el polipéptido de ChemR23 (células transfectadas de prueba), pero que se tratan con el modulador candidato.

Cuando se realiza en ausencia de un polipéptido de TIG2, el ensayo puede usarse para identificar un agonista de la actividad de ChemR23. Cuando el ensayo se realiza en presencia de un polipéptido de TIG2, puede usarse para someter a ensayo un antagonista.

b. Ensayo de adenilato ciclasa

Los ensayos para determinar la actividad adenilato ciclasa se describen en Kenimer & Nirenberg, 1981, Mol. Pharmacol. 20:585-591, que se incorpora al presente documento como referencia. Este ensayo es una modificación del ensayo enseñado por Solomon et al., 1974, Anal. Biochem. 58:541-548, que también se incorpora al presente documento como referencia. Brevemente, 100 \mul de las reacciones contienen Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 5 mM, creatina fosfato (sal disódica) 20 mM, 10 unidades (71 \mug de proteína) de creatina fosfocinasa, \alpha-^{32}P-ATP 1 mM (sal tetrasódica, 2 \muCi), AMP cíclico 0,5 mM, AMP cíclico marcado con G-^{3}H (aproximadamente 10.000 cpm), Ro20-1724 0,5 mM, etanol al 25%, y 50-200 \mug de homogeneizado de proteína que va a someterse a ensayo (es decir, homogeneizado procedente de células que expresan o que no expresan el polipéptido de ChemR23, tratadas o no tratadas con un polipéptido de TIG2 con o sin un modulador candidato). Las mezclas de reacción se incuban generalmente a 37ºC durante 6 minutos. Tras la incubación, las mezclas de reacción se desproteinizan mediante la adición de 0,9 ml de ácido tricloroacético al 6% frío. Se centrifugan los tubos a 1800 x g durante 20 minutos y cada disolución sobrenadante se añade a una columna Dowex AG50W-X4. La fracción de AMPc procedente de la columna se eluye con 4 ml de imidazol-HCl 0,1 mM (pH 7,5) en un vial de recuento. Los ensayos deben realizarse por triplicado. También deben realizarse reacciones control usando homogeneizado de proteína procedente de células que no expresan un polipéptido de ChemR23.

Según la invención, la actividad adenilato ciclasa "cambia" si aumenta o disminuye en un 10% o más en una muestra tomada de células tratadas con un modulador candidato de la actividad de ChemR23, con respecto a una muestra similar de células no tratadas con el modulador candidato o con respecto a una muestra de células que no expresan el polipéptido de ChemR23 (células transfectadas de prueba), pero tratadas con el modulador candidato.

c. Ensayo de AMPc

El AMPc intracelular o extracelular se mide usando un radioinmunoensayo (RIA) de AMPc o proteína de unión a AMPc según métodos ampliamente conocidos en la técnica. Por ejemplo, Horton & Baxendale, 1995, Methods Mol. Biol. 41:91-105, que se incorpora al presente documento como referencia, describe un RIA para AMPc.

Varios kits para la medición de AMPc están disponibles comercialmente, tal como el ensayo homogéneo de alta eficacia basado en la polarización de fluorescencia comercializado por LJL Biosystems y NEN Life Science Products. Deben realizarse reacciones control usando células transfectadas de prueba, para excluir posibles efectos no específicos de algunos moduladores candidato.

El nivel de AMPc "cambia" si el nivel de AMPc detectado en las células, que expresan el polipéptido de ChemR23 y tratadas con un modulador candidato de la actividad de ChemR23 (o en extractos de tales células), usando el ensayo basado en RIA de Horton & Baxendale, 1995, anteriormente, aumenta o disminuye en al menos un 10% con respecto al nivel de AMPc en células similares no tratadas con el modulador candidato.

d. Ruptura de fosfolípidos, producción de DAG y niveles de inositol trifosfato

Los receptores que activan la ruptura de fosfolípidos pueden monitorizarse para cambios debidos a la actividad de moduladores conocidos o sospechados de ChemR23 mediante la monitorización de la ruptura de fosfolípidos, y la producción resultante de segundos mensajeros DAG y/o inositol trifosfato (IP_{3}). Los métodos para medir cada uno de éstos se describen en Phospholipid Signaling Protocols, editado por Ian M. Bird. Totowa, NJ, Humana Press, 1998, que se incorpora al presente documento como referencia. Véase también Rudolph et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:11824-11831, que se incorpora al presente documento como referencia, que también describe un ensayo para la ruptura del fosfatidilinositol. Los ensayos deben realizarse usando células o extractos de células que expresan ChemR23, tratadas o no tratadas con un polipéptido de TIG2 con o sin un modulador candidato. Deben realizarse reacciones control usando células transfectadas de prueba, o extractos de las mismas, con el fin de excluir posibles efectos no específicos de algunos moduladores candidato.

Según la invención, los niveles de ruptura de fosfatidilinositol, y de diacilglicerol y/o inositol trifosfato "cambian" si aumentan o disminuyen en al menos un 10% en una muestra de células que expresan el polipéptido de ChemR23 y tratadas con un modulador candidato, con respecto a el nivel observado en una muestra de células que expresan un polipéptido de ChemR23 que no están tratadas con el modulador candidato.

e. Ensayos de activación de PKC

Las tirosina cinasas de receptores de factores de crecimiento tienden a señalizar a través de una ruta que supone una activación de la proteína cinasa C (PKC), que es una familia de proteínas cinasas activadas por calcio y fosfolípidos. La activación de PCK, en última instancia, da como resultado la transcripción de una serie de genes que codifican para factores de transcripción de protooncogenes, que incluyen c-fos, c-myc y c-jun, proteasas, inhibidores de proteasas, que incluyen la colagenasa tipo I y el inhibidor del activador del plasminógeno, y moléculas de adhesión, que incluyen la molécula de adhesión intracelular I (ICAM I). Los ensayos diseñados para detectar aumentos en los productos génicos inducidos por PKC pueden usarse para monitorizar la activación de PKC y así la actividad del receptor. Además, la actividad de los receptores que señalizan a través de PKC puede monitorizarse mediante el uso de constructos de gen indicador dirigidos por las secuencias de control de genes activados por la activación de PKC. Este tipo de ensayo basado en gen indicador se trata en mayor detalle más adelante.

Puede usarse el método de Kikkawa et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 13341, que se incorpora al presente documento como referencia, para una medición más directa de la actividad PKC. Este ensayo mide la fosforilación de un péptido sustrato de PKC, que se separa posteriormente mediante su unión a un papel de fosfocelulosa. Este sistema de ensayo de PKC puede usarse para medir la actividad de cinasa purificada, o la actividad en extractos celulares brutos. Una muestra de proteína cinasa C puede diluirse con HEPES 20 mM/DTT 2 mM justo antes del ensayo.

El sustrato para el ensayo es el péptido Ac-FKKSFKL-NH2 (SEQ ID NO: 35), derivado de la proteína sustrato de proteína cinasa C rica en alanina miristoilada (MARCKS). La K_{m} de la enzima para este péptido es de aproximadamente 50 \muM. Pueden usarse otros péptidos selectivos de proteína cinasa C básicos conocidos en la técnica, a una concentración de al menos 2 - 3 veces su K_{m}. Los cofactores requeridos para el ensayo incluyen calcio, magnesio, ATP, fosfatidilserina y diacilglicerol. Dependiendo de la intención del usuario, el ensayo puede realizarse para determinar la cantidad de PKC presente (condiciones activantes) o la cantidad de PCK activa presente (condiciones no activantes). Para la mayoría de los fines según la invención, se usarán las condiciones no activantes, tales que se mide la PKC que es activa en la muestra cuando se aísla, en lugar de medir la PKC que puede activarse. En condiciones no activantes, se omite el calcio en el ensayo en favor de EGTA.

El ensayo se realiza en una muestra que contiene HEPES 20 mM, pH 7,4, DTT 1 - 2 mM, MgCl_{2} 5 mM, ATP 100 \muM, \gamma^{32}P-ATP \sim1 \muCi, 100 \mug/ml de sustrato peptídico (\sim100 \muM), membranas de fosfatidilserina/diacilglicerol 140 \muM/3,8 \muM y calcio 100 \muM (o EGTA 500 \muM). Se usan 48 \mul de muestra, diluidos con HEPES 20 mM, pH 7,4, DTT 2 mM en un volumen de reacción final de 80 \mul. Las reacciones se realizan a 30ºC durante 5-10 minutos, seguidas de la adición de 25 \mul de ATP 100 mM, EDTA 100 mM, pH 8,0, que detiene las reacciones.

Después de que se detiene la reacción, una parte (85 \mul) de cada reacción se coloca sobre un filtro Whatman P81 de fosfato de celulosa, seguido por lavados: cuatro veces 500 ml en ácido fosfórico al 0,4% (5 - 10 min. por lavado); y un lavado final en 500 ml de EtOH al 95%, durante 2-5 min. La radioactividad unida se mide mediante un recuento por centelleo. La actividad específica (cpm/nmol) del ATP marcado se determina colocando una muestra de la reacción sobre un papel P81 y contando sin lavado. Las unidades de actividad PKC, definidas como nmol de fosfato transferido por min., se calculan tal como sigue:

La actividad, en UNIDADES (nmol/min) es:

\frac{(cpm\ en\ papel)\ x\ (105\ \mu l\ total/85\ \mu l\ colocados)}{(tiempo\ de\ ensayo,\ min)\ (\text{actividad específica de ATP cpm/nmol})}

Puede realizarse un ensayo alternativo usando el kit de ensayo de proteína cinasa C vendido por PanVera (nº de cat. P2747).

Se realizan ensayos en extractos de células que expresan un polipéptido de ChemR23, tratado o no tratado con un polipéptido de TIG2 con o sin un modulador candidato. Las reacciones control deben realizarse usando células transfectadas de prueba, o extractos de las mismas, con el fin de excluir posibles efectos no específicos de algunos moduladores candidato.

Según la invención, la actividad PKC "cambia" mediante un modulador candidato cuando las unidades de PKC medidas mediante cualquier ensayo descrito anteriormente aumentan o disminuyen en al menos un 10%, en extractos de células que expresan ChemR23 tratadas con un modulador candidato, con respecto a una reacción en una muestra similar de células no tratadas con el modulador candidato.

f. Ensayos de cinasa

La actividad MAP cinasa puede someterse a ensayo usando cualquiera de los diversos kits disponibles comercialmente, por ejemplo, el kit de ensayo de MAP cinasa p38 vendido por New England Biolabs (nº de cat. 9820) o los ensayos de MAP cinasa FlashPlate^{MR} vendidos por Perkin-Elmer Life Sciences.

La actividad MAP cinasa "cambia" si el nivel de actividad aumenta o disminuye en un 10% o más en una muestra de células, que expresan un polipéptido de ChemR23 y tratadas con un modulador candidato, con respecto a la actividad MAP cinasa en una muestra de células similares no tratadas con el modulador candidato.

Se conocen bien los ensayos directos para la actividad tirosina cinasa usando sustratos de tirosina cinasa conocidos sintéticos o naturales y fosfato marcado, como también lo son ensayos similares para otros tipos de cinasas (por ejemplo, Ser/Thr cinasas). Los ensayos de cinasas pueden realizarse tanto con cinasas purificadas como con extractos brutos preparados a partir de células que expresan un polipéptido de ChemR23, tratadas o no con un polipéptido de TIG2, con o sin un modulador candidato. Deben realizarse reacciones control usando células transfectadas de prueba, o extractos de las mismas con el fin de excluir posibles efectos no específicos de algunos moduladores candidato. Los sustratos pueden ser o bien proteína de longitud completa o bien péptidos sintéticos que representan el sustrato. Pinna & Ruzzene (1996, Biochem. Biophys. Acta 1314:191-255, que se incorpora al presente documento como referencia) enumera varios sitios de fosforilación de sustrato útiles para medir las actividades cinasa. Hay disponibles comercialmente varios péptidos sustrato de cinasa. Uno que es particularmente útil es el "péptido relacionado con Src" RRLIEDAEYAARG (SEQ ID NO: 11; disponible de Sigma nº A7433), que es un sustrato para muchos tirosina cinasas de receptores y no de receptores. Debido a que el ensayo descrito anteriormente requiere la unión de sustratos peptídicos a filtros, los sustratos peptídicos deben tener una carga neta positiva para facilitar la unión. Generalmente, los sustratos peptídicos deben tener al menos 2 residuos básicos y un extremo amino-terminal libre. Las reacciones usan generalmente una concentración peptídica de 0,7 - 1,5 mM.

Los ensayos se llevan a cabo generalmente en un volumen de 25 \mul que comprende 5 \mul de tampón cinasa 5X (BSA 5 mg/ml, Tris-HCl 150 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 100 mM; dependiendo de la cinasa exacta para la que se realiza el ensayo, puede usarse MnCl_{2} en lugar de o además de MgCl_{2}), 5 \mul de ATP 1,0 mM (concentración final 0,2 mM), \gamma-^{32}P-ATP (100 - 500 cpm/pmol), 3 \mul de sustrato peptídico 10 mM (concentración final 1,2 mM), extracto celular que contiene la cinasa que se va a probar (los extractos celulares usados para ensayos de cinasas deben contener un inhibidor de fosfatasa (por ejemplo, ortovanadato de sodio 0,1 - 1 mM)), y H_{2}O hasta 25 \mul. Las reacciones se realizan a 30ºC, y se inician con la adición del extracto celular.

Las reacciones de cinasa se realizan durante de 30 segundos a aproximadamente 30 minutos, seguidas por la adición de 45 \mul de ácido tricloroacético al 10% frío (TCA). Las muestras se centrifugan durante 2 minutos en una microcentrífuga, y se colocan 35 \mul del sobrenadante sobre unos círculos de filtro de fosfato de celulosa Whatman P81. Se lavan los filtros tres veces con 500ml de ácido fosfórico al 0,5% frío, seguido de un lavado con 200 ml de acetona a temperatura ambiente durante 5 minutos. Los filtros se secan y se mide el ^{32}P incorporado mediante un recuento por centelleo. La actividad específica del ATP en la reacción de cinasa (por ejemplo, en cpm/pmol) se determina mediante la colocación de una pequeña muestra (2 - 5 \mul) de la reacción sobre un círculo de filtro P81 y se cuenta directamente, sin lavado. Las cuentas por minuto obtenidas en la reacción de cinasa (menos el blanco) se dividen entonces entre la actividad específica para determinar los moles de fosfato transferidos en la reacción.

La actividad tirosina cinasa "cambia" si el nivel de actividad aumenta o disminuye en un 10% o más en una muestra de células, que expresan un polipéptido de ChemR23, tratadas con un modulador candidato, con respecto a la actividad cinasa en una muestra de células similares no tratadas con el modulador candidato.

g. Indicadores transcripcionales para la activación de la ruta corriente abajo

La señal intracelular iniciada por la unión de un agonista a un receptor, por ejemplo, ChemR23, pone en marcha una cascada de acontecimientos intracelulares, cuya consecuencia última es un cambio rápido y detectable en la transcripción o traducción de uno o más genes. La actividad del receptor puede, por tanto, monitorizarse mediante la expresión de un gen indicador dirigido por las secuencias control sensibles a la activación de ChemR23.

Tal como se utiliza en el presente documento, "promotor" se refiere a elementos de control transcripcional necesarios para una regulación mediada por el receptor de la expresión génica, que incluye no sólo el promotor basal, sino también cualquier potenciador o sitios de unión del factor de transcripción necesarios para la expresión regulada por el receptor. Seleccionando promotores que son sensibles a las señales intracelulares que resultan de la unión del agonista, y uniendo operativamente los promotores seleccionados a genes indicadores cuya transcripción, traducción o actividad última es fácilmente detectable y medible, el ensayo de indicador basado en la transcripción proporciona una rápida indicación de si se activa un receptor dado.

Los genes indicadores tales como luciferasa, CAT, GFP, \beta-lactamasa o \beta-galactosidasa se conocen bien en la técnica, así como los ensayos para la detección de sus productos.

Los genes particularmente aptos para monitorizar la actividad del receptor son los genes "de expresión inmediatamente temprana", que se inducen rápidamente, generalmente en un plazo de minutos de contacto entre el receptor y la proteína o ligando efector. La inducción de la transcripción de genes de expresión inmediatamente temprana no requiere la síntesis de nuevas proteínas reguladoras. Las características de los genes preferidos útiles para preparar constructos de indicador incluyen, además de la rápida capacidad de respuesta a la unión de ligando: expresión baja o indetectable en células quiescentes; inducción que es transitoria e independiente de la nueva síntesis de proteína; el posterior corte de la transcripción requiere nueva síntesis de proteína; y los ARNm transcritos a partir de estos genes tienen una corta semivida. Se prefiere, aunque no es necesario, que un elemento de control transcripcional tenga todas estas propiedades para que sea útil.

Un ejemplo de un gen que es sensible a varios estímulos diferentes es el protooncogen c-fos. El gen c-fos, se activa de forma independiente de la síntesis de proteínas mediante factores de crecimiento, hormonas, agentes específicos de diferenciación, estrés, y otros inductores conocidos de proteínas de la superficie celular. La inducción de la expresión de c-fos es extremadamente rápida, sucediendo a menudo dentro de un plazo de minutos desde la estimulación del receptor. Esta característica hace las regiones reguladoras de c-fos particularmente atractivas para su uso como indicador de la activación del receptor.

Los elementos reguladores de c-fos incluyen (véase, Verma et al., 1987, Cell 51:513-514): una caja TATA que se requiere para la iniciación de la transcripción; dos elementos corriente arriba para la transcripción basal, y un potenciador, que incluye un elemento con simetría par y que se requiere para la inducción por TPA, suero, EGF, y PMA.

El elemento potenciador de la transcripción de c-fos de 20 pb localizado entre -317 y -298 pb por delante del sitio caperuza del ARNm de c-fos, es esencial para la inducción por suero en células NIH 3T3 privadas de suero. Uno de los dos elementos corriente arriba se localiza en -63 a -57 y se parece a la secuencia consenso para la regulación de AMPc.

El factor de transcripción CREB (proteína de unión al elemento sensible a AMP cíclico) es, como su nombre implica, sensible a los niveles de AMPc intracelular. Por lo tanto, la activación de un receptor que señaliza a través de la modulación de los niveles de AMPc puede monitorizarse midiendo o bien la unión del factor de transcripción, o bien la expresión de un gen indicador unido al elemento de unión a CREB (denominado CRE, o elemento de respuesta a AMPc). La secuencia de ADN del CRE es TGACGTCA (SEQ ID NO: 12). Los constructos de indicador sensibles a la actividad de unión a CREB se describen en la patente de los EE.UU. número 5.919.649.

Otros promotores y elementos de control transcripcional, además de los elementos de c-fos y los constructos sensibles a CREB, incluyen el promotor del gen para el péptido intestinal vasoactivo (VIP) (sensible a AMPc; Fink et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:6662-6666) el promotor del gen para somatostatina (sensible a AMPc; Montoainy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:6682-6686); el promotor de proencefalina (sensible a AMPc, agonistas nicotínicos, y ésteres de forbol; Comb et al., 1986, Nature 323:353-356); el promotor del gen para la fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PEPCK) (sensible a AMPc; Short et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:9721-9726).

Ejemplos adicionales de elementos de control transcripcional que son sensibles a cambios en la actividad de GPCR, incluyen, pero no se limitan a aquellos sensibles al factor de transcripción AP-1 y a aquellos sensibles a la actividad de NF-\kappaB. El sitio de unión a AP-1 consenso es el palíndromo TGA(C/G)TCA (Lee et al., 1987, Nature 325:368-372; Lee et al., 1987, Cell 49:741-752). El sitio AP-1 también es responsable de mediar en la inducción mediante promotores tumorales tales como el éster de forbol \beta-acetato de 12-O-tetradecanoilforbol (TPA), y por lo tanto a veces se denomina TRE, para el elemento de respuesta a TPA. AP-1 activa numerosos genes que están implicados en la respuesta temprana de las células a estímulos de crecimiento. Ejemplos de genes sensibles a AP-1 incluyen, pero no se limitan a los genes para Fos y Jun (proteínas que presentan por sí mismas actividad AP-1), antígenos relacionados con Fos (Fra) 1 y 2, I\kappaB\alpha, ornitina descarboxilasa, y anexinas I y II.

El elemento de unión NF-\kappaB tiene la secuencia consenso GGGGACTTTCC (SEQ ID NO: 36). Se han identificado un gran número de genes como sensibles a NF-\kappaB, y sus elementos de control pueden unirse a un gen indicador para monitorizar la actividad de GPCR. Una pequeña muestra de genes sensibles a NF-\kappaB incluyen a aquellos que codifican para IL-1\beta (Hiscott et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13:6231-6240), TNF-\alpha (Shakhov et al., 1990, J. Exp. Med. 171:35-47), CCR5 (Liu et al., 1998, AIDS Res. Hum. Retroviruses 14:1509-1519), P-selectina (Pan & McEver, 1995, J. Biol. Chem. 270:23077-23083), ligando Fas (Matsui et al., 1998, J. Immunol. 161:3469-3473), GM-CSF (Schreck & Baeuerie, 1990, Mol. Cell. Biol. 10:1281-1286) e I\kappaB\alpha (Haskill et al., Cell 65:1281-1289). Cada una de estas referencias se incorpora al presente documento como referencia. Los vectores que codifican para los indicadores sensibles a NF-\kappaB también se conocen en la técnica o pueden prepararse fácilmente por un experto en la técnica usando, por ejemplo, elementos NF-\kappaB sintéticos y un promotor mínimo, o usando las secuencias sensibles a NF-\kappaB de un gen conocido para someterlo a regulación por NF-\kappaB. Además, los constructos de indicador sensibles a NF-\kappaB están comercialmente disponibles en, por ejemplo, CLONTECH.

Un constructo promotor dado debe probarse exponiendo las células que expresan ChemR23, transfectadas con el constructo, a un polipéptido de TIG2. Un aumento de al menos dos veces en la expresión de un indicador en respuesta al polipéptido de TIG2 indica que el gen indicador es un indicador de la actividad de ChemR23.

Con el fin de someter a ensayo la actividad de ChemR23 con un constructo de indicador transcripcional sensible a TIG2, las células que expresan de manera estable un polipéptido de ChemR23 se transfectan de manera estable con el constructo de indicador. Para seleccionar agonistas, las células se dejan sin tratar, expuestas a moduladores candidato, o expuestas a un polipéptido de TIG2, y se mide la expresión del indicador. Los cultivos tratados con TIG2 sirven como patrones del nivel de transcripción inducida por un agonista conocido. Un aumento de al menos el 50% en la expresión del indicador en presencia de un modulador candidato indica que el candidato es un modulador de la actividad de ChemR23. Un agonista inducirá al menos como mucho, y preferiblemente la misma cantidad o más, de expresión del indicador que el polipéptido de TIG2. Este enfoque también puede usarse para seleccionar agonistas inversos cuando las células expresan un polipéptido de ChemR23 a niveles tales que existe una actividad basal elevada del indicador en ausencia de TIG2 u otro agonista. Una disminución en la actividad del indicador del 10% o más en presencia de un modulador candidato, con respecto a su ausencia, indica que el compuesto es un agonista inverso.

Para seleccionar antagonistas, las células que expresan ChemR23 y que llevan el constructo de indicador se exponen a un polipéptido de TIG2 (u otro agonista) en presencia y en ausencia de modulador candidato. Una disminución del 10% o más en la expresión de indicador en presencia del modulador candidato, con respecto a la ausencia del modulador candidato, indica que el candidato es un modulador de la actividad de ChemR23.

Los controles para ensayos de transcripción incluyen células que no expresan ChemR23 pero que llevan el constructo de indicador, así como células con un constructo de indicador sin promotor. Los compuestos que se identifican como moduladores de la transcripción regulada por ChemR23 deben analizarse para determinar si afectan a la transcripción dirigida por otras secuencias reguladoras y por otros receptores, con el fin de determinar la especificidad y el espectro de su actividad.

El ensayo de indicador transcripcional, y la mayoría de los ensayos basados en células, son muy aptos para la selección de bibliotecas de expresión para proteínas, para aquellos que modulan la actividad de ChemR23. Las bibliotecas pueden ser, por ejemplo, bibliotecas de ADNc procedentes de fuentes naturales, por ejemplo, plantas, animales, bacterias, etc., o pueden ser bibliotecas que expresan al azar o sistemáticamente variantes mutadas de uno o más polipéptidos. Las bibliotecas genómicas en vectores virales también pueden usarse para expresar el contenido de ARNm de una célula o tejido, en las diferentes bibliotecas usadas para seleccionar ChemR23.

Cualquiera de los ensayos de la actividad del receptor, incluyendo la unión a GTP, GTPasa, adenilato ciclasa, AMPc, ruptura de fosfolípido, diacilglicerol, inositol trifosfato, PKC, ensayos de indicador transcripcional y de cinasa, pueden usarse para determinar la presencia de un agente en una muestra, por ejemplo, una muestra de tejido, que afecta a la actividad de la molécula receptora de ChemR23. Para hacerlo, se somete a ensayo el polipéptido de ChemR23 para determinar su actividad en presencia y en ausencia de la muestra o un extracto de la muestra. Un aumento en la actividad de ChemR23 en presencia de la muestra o extracto con respecto a la ausencia de la muestra indica que la muestra contiene un agonista de la actividad del receptor. Una disminución en la actividad del receptor en presencia de TIG2 u otro agonista y la muestra con respecto a la actividad del receptor en presencia de TIG2 solo, indica que la muestra contiene un antagonista de la actividad de ChemR23. Si se desea, pueden fraccionarse entonces las muestras y probarse después para aislar o purificar el agonista y el antagonista. La cantidad de aumento o disminución en la actividad medida necesaria para una muestra para que se diga que contiene un modulador depende del tipo de ensayo usado. Generalmente, un cambio (aumento o disminución) del 10% o superior con respecto a un ensayo realizado en ausencia de una muestra indica la presencia de un modulador en la muestra. Una excepción es el ensayo de indicador transcricional, en el que un aumento de al menos dos veces o una disminución del 10% en la señal es necesario para que se diga que una muestra contiene un modulador. Se prefiere que un agonista estimule la activación del receptor al menos un 50%, y preferiblemente un 75% o un 100% o más, por ejemplo, 2 veces, 5 veces, 10 veces o superior que un TIG2 tipo natural.

Otros ensayos funcionales incluyen, por ejemplo, ensayos de microfisiométro o biosensor (véase Hafner, 2000, Biosens. Bioelectron. 15:149-158, que se incorpora al presente documento como referencia).

II. Ensayos diagnósticos basados en la interacción de ChemR23 y TIG2

La señalización mediante GPCR representa un papel decisivo en la patología de un gran número de enfermedades y trastornos. ChemR23, que se expresa en células de linajes de linfocitos y que ha mostrado que actúa como un correceptor para los virus de inmunodeficencia, puede desempeñar un papel en procesos inmunitarios, trastornos o enfermedades. El patrón de expresión de ChemR23 también incluye hueso y cartílago, lo que indica que este receptor puede desempeñar un papel decisivo en enfermedades, trastornos y procesos (por ejemplo, consolidación de fracturas óseas) que afectan a estos tejidos. La expresión en las glándulas paratiroideas de un adulto sugiere la posible importancia en el metabolismo fosfocálcico.

Debido a su expresión en células de linajes de linfocitos, ChemR23 puede estar implicado en la respuesta del organismo a infecciones virales o enfermedades inducidas por virus diversos, que incluyen los virus VIH tipos I y II, o bacterias. El patrón de expresión de ChemR23 y el conocimiento con respecto a los trastornos mediados generalmente por GPCR sugieren que ChemR23 puede estar implicado en alteraciones de la migración celular, cáncer, desarrollo de tumores y metástasis tumorales, procesos inflamatorios y neoplásicos, cicatrización de heridas y consolidación de fracturas óseas y disfunción de funciones de crecimiento reguladoras, diabetes, obesidad, anorexia, bulimia, insuficiencia cardíaca aguda, hipotensión, hipertensión, retención urinaria, osteoporosis, angina de pecho, infarto de miocardio, reestenosis, aterosclerosis, enfermedades caracterizadas por la excesiva proliferación celular del músculo liso, aneurismas, enfermedades caracterizadas por la pérdida de células del músculo liso o por la reducida proliferación celular de células del músculo liso, accidente cerebrovascular, isquemia, úlceras, alergias, hipertrofia prostática benigna, migraña, vómitos, trastornos psicóticos y neurológicos, que incluyen ansiedad, esquizofrenia, depresión maníaca, depresión, delirio, demencia y retraso mental grave, enfermedades degenerativas, enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson, y disldnasias, tales como la enfermedad de Fluntington o el síndrome de Gilles de la Tourett y otras enfermedades relacionadas.

La interacción de ChemR23 con TIG2 puede usarse como la base de ensayos para el diagnóstico o la monitorización de enfermedades, trastornos o procesos que implican la señalización de ChemR23. Los ensayos diagnósticos para las enfermedades o trastornos relacionados con ChemR23 pueden tener varias formas. En primer lugar, los ensayos diagnósticos pueden medir la cantidad de polipéptido, genes o ARNm de ChemR23 y/o TIG2, en una muestra de un tejido. Los ensayos que miden la cantidad de ARNm que codifica para cualquiera o ambos de estos polipéptidos también entran en esta categoría. En segundo lugar, los ensayos pueden evaluar las cualidades del receptor o del ligando. Por ejemplo, pueden usarse de manera diagnóstica ensayos que determinan si un individuo expresa una forma mutante o variante de o bien ChemR23 o bien TIG2. En tercer lugar, pueden usarse de manera diagnóstica ensayos que miden una o más actividades del polipéptido de ChemR23.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método según la presente invención, en el que dicha enfermedad o trastorno es una enfermedad relacionada con ChemR23 o un trastorno relacionado con ChemR23 elegido del grupo que consiste en cáncer, metástasis tumorales, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, deficiencias inmunitarias heredadas o adquiridas, osteoporosis, consolidación de fracturas óseas, injertos de tejido óseo, rechazo de injertos, psoriasis, eccema, infección inflamatoria y enfermedades tróficas de la piel, infecciones virales, bacterianas y parasitarias, esterilidad femenina, y tumores de útero y ovario. Alternativamente, la presente invención se refiere a un método según la presente invención, en el que dicha enfermedad o trastorno es una enfermedad relacionada con TIG2 o un trastorno relacionado con TIG2 elegido del grupo que consiste en osteoporosis, consolidación de fracturas óseas, injertos de tejido óseo, rechazo de injertos, psoriasis, eccema, infección inflamatoria y enfermedades tróficas de la piel, infecciones virales, bacterianas y parasitarias, esterilidad femenina, y tumores de útero y ovario.

Según el presente método, dicho polipéptido de TIG2 puede ser un polipéptido que tiene al menos un 31% de identidad o identidad superior, tal como un 45%, 55%, 65%, 75%, 85%, 95% o incluso 100% con el polipéptido representado por SEQ ID NO: 8; y en el que dicho polipéptido se une específicamente a y activa una actividad de señalización del polipéptido de ChemR23 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2. Alternativamente, dicho polipéptido de TIG2 puede ser un fragmento del polipéptido de longitud completa de SEQ ID NO: 8, en el que dicho fragmento conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de la señalización del polipéptido de longitud completa SEQ ID NO: 8. Según la presente invención, dicho polipéptido de TIG2 puede comprender una o más adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a SEQ ID NO: 8. Dicho polipéptido de TIG2 puede ser un polipéptido truncado de TIG2 representado por SEQ ID NO: 48 o representado por cualquiera de SEQ ID NO: 50 a 60; dicho polipéptido de TIG2 puede comprender secuencias adicionales que forman una proteína de fusión de TIG2, en el que dichas secuencias adicionales pueden elegirse del grupo que consiste en secuencias de glutation-S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa, fosfatasa alcalina, tiorredoxina, proteína fluorescente verde (GFP), etiquetas de histidina (por ejemplo, 6X o His mayores), o etiquetas de epítopo (por ejemplo, etiqueta Myc, etiqueta FLAG).

A. Ensayos que miden la cantidad de ChemR23 o TIG2

Los niveles de ChemR23 y TIG2 pueden medirse y compararse con los patrones con el fin de determinar si un nivel anómalo del receptor o de su ligando está presente en una muestra, indicando cualquiera de los dos una probable desregulación de la señalización de ChemR23. Se miden los niveles de polipéptido, por ejemplo, mediante inmunohistoquímica usando anticuerpos específicos para el polipéptido. Una muestra aislada de un individuo que se sospecha que padece una enfermedad o trastorno caracterizado por la actividad de ChemR23 se pone en contacto con un anticuerpo para ChemR23 o TIG2, y se mide la unión del anticuerpo tal como se conoce en la técnica (por ejemplo, mediante la medición de la actividad de una enzima conjugada con un anticuerpo secundario).

Otro enfoque de la medición de los niveles de los polipéptidos de ChemR23 y/o TIG2 usa el análisis por citometría de flujo de células de un tejido afectado. Se conocen bien en la técnica métodos de citometría de flujo, que incluyen el marcaje fluorescente de anticuerpos específicos para ChemR23 o TIG2. Otros enfoques incluyen radioinmunoensayo o ELISA. También se conocen bien en la técnica métodos para cada uno de estos.

La cantidad de unión detectada se compara con la unión en una muestra de tejido similar de un individuo sano, o de una zona del individuo afectado que no esté tan afectada. Un aumento del 10% o más con respecto al patrón es un diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de ChemR23.

La expresión de ChemR23 y TIG2 puede medirse también mediante la determinación de la cantidad de ARNm que codifica para cualquiera o ambos de los polipéptidos en una muestra de tejido. El ARNm puede cuantificarse mediante PCR cuantitativa o semicuantitativa. Los métodos para la amplificación "cuantitativa" se conocen bien por aquellos expertos en la técnica, y las secuencias cebadoras para la amplificación de ambos ChemR23 y TIG2 se describen en el presente documento. Un método común de PCR cuantitativa implica coamplificar simultáneamente una cantidad conocida de una secuencia control usando los mismos cebadores. Esto proporciona un patrón interno que puede usarse para calibrar la reacción de PCR. Se proporcionan protocolos detallados para PCR cuantitativa en PRC Protocols. A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. Nueva York, (1990), que se incorpora al presente documento como referencia. Un aumento del 10% o más en la cantidad de ARNm que codifica para ChemR23 o TIG2 en una muestra, con respecto a la cantidad expresada en una muestra de un tejido similar de un individuo sano o en una muestra de tejido de una localización no afectada en un individuo afectado es un diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de la señalización de ChemR23.

B. Ensayos cualitativos

Pueden usarse de manera diagnóstica ensayos que evalúan si el polipéptido de ChemR23 o el ARNm que codifica para él son de tipo natural o no. Con el fin de diagnosticar una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de ChemR23 o TIG2 de esta manera, se utiliza ARN aislado de una muestra como molde para la amplificación por PCR de TIG2 y/o ChemR23. Las secuencias amplificadas entonces o bien se secuencian directamente usando métodos convencionales, o bien se clonan en primer lugar en un vector, seguido de la secuenciación. Una diferencia en la secuencia que cambia en uno o más aminoácidos codificados con respecto a la secuencia de ChemR23 o TIG2 de tipo natural puede ser un diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de la señalización de ChemR23. Puede ser útil, cuando se identifica en una muestra un cambio en la secuencia codificante, expresar el receptor o ligando variante y comparar su actividad con la de ChemR23 o TIG2 de tipo natural. Entre otros beneficios, esta enfoque puede proporcionar mutantes novedosos, que incluyen mutantes constitutivamente activos y nulos.

Además de los métodos de secuenciación convencionales, pueden someterse a ensayo secuencias amplificadas para determinar la presencia de mutaciones específicas, usando, por ejemplo, hibridación de balizas moleculares que discriminan entre secuencias de tipo natural y variantes. Se conocen bien en la técnica ensayos de hibridación que discriminan basándose en cambios tan pequeños como de un nucleótido. Alternativamente, pueden realizarse cualquiera de varios ensayos de "minisecuenciación", que incluyen, aquellos descritos, por ejemplo, en las patentes de los EE.UU. 5.888.819, 6.004.744 y 6.013.431 (que se incorporan al presente documento como referencia). Estos ensayos y otros conocidos en la técnica pueden determinar la presencia, en una muestra dada, de un ácido nucleico con un polimorfismo conocido.

Si se desea, pueden usarse métodos basados en matriz o micromatriz para analizar la expresión o la presencia de una mutación, en las secuencias de ChemR23 o TIG2. Los métodos basados en matriz para la minisecuenciación y para la cuantificación de la expresión de ácido nucleico se conocen bien en la técnica.

C. Ensayos funcionales

También puede realizarse el diagnóstico de enfermedad o trastorno caracterizado por la desregulación de la señalización de ChemR23 usando ensayos funcionales. Para hacerlo, membranas celulares o extractos celulares preparados a partir de muestras de tejido se usan en un ensayo de la actividad de ChemR23 tal como se describió en el presente documento (por ejemplo, ensayos de unión de ligandos, ensayo de unión a GTP, ensayo de GTPasa, ensayo de adenilato ciclasa, ensayo de AMPc, ruptura de fosfolípidos, ensayos de diacilglicerol o inositol trifosfato, ensayo de activación de PKC o ensayo de cinasa). La actividad detectada se compara con la de una muestra patrón tomada de un individuo sano o de una zona que no esté afectada del individuo afectado. Como alternativa, puede aplicarse una muestra o un extracto de una muestra a células que expresan ChemR23, seguido de la medición de la actividad de señalización de ChemR23 con respecto a una muestra patrón. Una diferencia del 10% o más en la actividad medida en cualquiera de estos ensayos, con respecto a la actividad del patrón, es un diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de la señalización de ChemR23.

Modulación de la actividad de ChemR23 en una célula según la invención

El descubrimiento de TIG2 como un ligando de ChemR23 proporciona métodos para modular la actividad de un polipéptido de ChemR23 en una célula. La actividad de ChemR23 se modula en una célula mediante la administración a esa célula de un agente que modula la función de un polipéptido de ChemR23. Esta modulación puede realizarse en células en cultivo como parte de un ensayo para la identificación de agentes moduladores adicionales, o, por ejemplo, en un animal, incluyendo un ser humano. Los agentes incluyen polipéptidos de TIG2 tal como se definen en el presente documento, así como moduladores adicionales usando los métodos de selección descritos en el presente
documento.

Puede administrarse un agente a una célula añadiéndolo al medio de cultivo. La cantidad a administrar variará con la identidad del agente y con el fin para el que se administra. Por ejemplo, en un ensayo en cultivo para identificar antagonistas de la actividad de ChemR23, se añadirá preferiblemente una cantidad de polipéptido de TIG2 que active a la mitad del máximo los receptores (por ejemplo, aproximadamente CE_{50}), preferiblemente sin superar la dosis requerida para la saturación del receptor. Esta dosis puede determinarse mediante la tritiación de la cantidad de polipéptido de TIG2 para determinar el punto en el que nuevas adiciones de TIG2 no tienen efectos adicionales sobre la actividad de ChemR23.

Cuando se administra un modulador de la actividad de ChemR23 a un animal para el tratamiento de una enfermedad o trastorno, la cantidad administrada puede ajustarse por un experto en la técnica basándose en la respuesta deseada. Se consigue un tratamiento satisfactorio cuando uno o más aspectos medibles de la patología (por ejemplo, crecimiento celular de tumor, acumulación de células inflamatorias) cambia en al menos un 10% con respecto al valor para ese aspecto antes del tratamiento.

Moduladores candidato útiles según la invención

Los moduladores candidato pueden seleccionarse a partir de grandes bibliotecas de compuestos naturales o sintéticos. Actualmente se utilizan numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de sacáridos, péptidos, lípidos, hidratos de carbono, y compuestos a base de ácidos nucleicos. Existen bibliotecas de compuestos sintéticos disponibles comercialmente de varias compañías que incluyen, por ejemplo, Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH) y Microsource (New Milford, CT). Una biblioteca química singular está disponible en Aldrich (Milwaukee, WI). Bibliotecas combinatorias de moléculas orgánicas pequeñas están disponibles y pueden prepararse. Alternativamente, existen bibliotecas disponibles de compuestos naturales en la forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales de, por ejemplo, Pan Laboratorios (Bothell, WA) o MycoSearch (NC), o pueden producirse fácilmente mediante métodos bien conocidos en la técnica. Adicionalmente, las bibliotecas producidas de manera natural y sintética y los compuestos son fácilmente modificables mediante medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales.

Tal como se observó previamente en el presente documento, los moduladores candidato pueden ser también variantes de polipéptidos conocidos (por ejemplo, TIG2, anticuerpos) o ácidos nucleicos (por ejemplo, aptámeros) codificados en una biblioteca de ácidos nucleicos. Las células (por ejemplo, bacterias, levaduras o células eucariotas superiores) transformadas con la biblioteca pueden hacerse crecer y prepararse como extractos, que se aplican entonces en ensayos de unión a ChemR23 o en ensayos funcionales de la actividad de ChemR23.

Anticuerpos útiles según la invención

La invención proporciona anticuerpos frente a ChemR23 y TIG2. Pueden prepararse los anticuerpos usando protocolos habituales conocidos por la técnica (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual ed. por Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Un mamífero, tal como un ratón, hámster, o conejo, puede inmunizarse con una forma inmunogénica del péptido (por ejemplo, un polipéptido de ChemR23 o TIG2 o un fragmento antigénico que pueda provocar una respuesta del anticuerpo, o una proteína de fusión tal como se describió anteriormente en el presente documento). Se preparan los inmunógenos para producir anticuerpos mediante el mezclado de los polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos recombinantes aislados o péptidos sintéticos) con adyuvantes. Alternativamente, se preparan los polipéptidos o péptidos de ChemR23 o TIG2 como proteínas de fusión para proteínas inmunogénicas mayores. Los polipéptidos pueden estar también unidos covalentemente con otras proteínas inmunogénicas mayores, tales como la hemocianina de lapa californiana. Alternativamente, pueden usarse vectores plásmidos o virales que codifican para ChemR23 o TIG2, o un fragmento de estas proteínas, para expresar los polipéptidos y generar una respuesta inmunitaria en un animal, tal como se describe en Costagliola et al., 2000, J. Clin. Invest. 105:803-811, que se incorpora al presente documento como referencia. Con el fin de producir anticuerpos, se administran normalmente los inmunógenos por vía intradérmica, por vía subcutánea, o por vía intramuscular a los animales de experimentación tales como conejos, ovejas, y ratones. Además de los anticuerpos tratados anteriormente, pueden prepararse derivados de anticuerpos modificados mediante ingeniería genética, tales como anticuerpos de cadena sencilla.

Puede monitorizarse el progreso de la inmunización mediante la detección de títulos de anticuerpos en plasma o suero. Pueden usarse también ELISA, citometría de flujo u otros inmunoensayos convencionales con el inmunógeno como antígeno para evaluar los niveles de anticuerpos. Las preparaciones de anticuerpos pueden ser simplemente de suero de un animal inmunizado, o si se desea, pueden aislarse anticuerpos policlonales del suero mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad usando un inmunógeno inmovilizado.

Para producir anticuerpos monoclonales, pueden recogerse esplenocitos que producen anticuerpos de un animal inmunizado o fusionarse mediante procedimientos habituales de fusión celular somática con células inmortalizadas tales como células de mieloma para producir células de hibridoma. Tales técnicas se conocen bien en la técnica, e incluyen, por ejemplo, la técnica de hibridoma (desarrollada originalmente por Kohler y Milstein, (1975) Nature, 256:495-497), la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4:72), y la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. págs. 77-96). Pueden seleccionarse las células de hibridoma inmunoquímicamente para la producción de anticuerpos especialmente reactivos con un péptido o polipéptido de TIG2 o ChemR23, y de anticuerpos monoclonales aislados a partir del medio de un cultivo que comprende tales células de hibridoma.

Kits útiles según la invención

La invención proporciona kits útiles para la selección de moduladores de la actividad de ChemR23. Los kits útiles según la invención pueden incluir un polipéptido de ChemR23 aislado (incluyendo un polipéptido de ChemR23 asociado a una membrana o célula, por ejemplo, sobre membranas aisladas, células que expresan ChemR23, o, sobre un chip de SPR) y un polipéptido de TIG2 aislado. Un kit puede comprender también un anticuerpo para TIG2. Alternativamente, o además, un kit puede contener células transformadas para expresar un polipéptido de ChemR23 según la invención y/o células transformadas para expresar un polipéptido de TIG2 según la invención. En una realización adicional, un kit según la invención puede contener un polinucleótido que codifica para un polipéptido de ChemR23 y/o un polinucleótido que codifica para un polipéptido de TIG2 según la invención. Todos los kits según la invención comprenderán los artículos indicados o combinaciones de los artículos o materiales de acondicionamiento de los mismos. Los kits incluirán también instrucciones de uso.

Según el presente kit, dicho polipéptido de TIG2 puede ser un polipéptido que presenta al menos un 31% de identidad o una identidad superior, tal como un 45%, 55%, 65%, 75%, 85%, 95% o incluso 100% con el polipéptido representado por SEQ ID NO: 48; y en el que dicho polipéptido se une específicamente a y activa una actividad de señalización de un polipéptido de ChemR23 que presenta la secuencia de SEQ ID NO: 2. Alternativamente, dicho polipéptido de TIG2 puede ser un fragmento del polipéptido de longitud completa de SEQ ID NO: 48, en el que el fragmento conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de señalización del polipéptido de longitud completa de SEQ ID NO: 8. Según la presente invención, dicho polipéptido de TIG2 puede comprender una o más adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a SEQ ID NO: 48. Dicho polipéptido de TIG2 puede comprender un polipéptido truncado de TIG2 representado por SEQ ID NO: 48 o representado por cualquiera de SEQ ID NO: 50 a 60; dicho polipéptido de TIG2 puede comprender secuencias adicionales que forman una proteína de fusión de TIG2, en la que dichas secuencias adicionales pueden elegirse del grupo que consiste en secuencias de glutation-S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa, fosfatasa alcalina, tiorredoxina, proteína fluorescente verde (GFP), etiquetas de histidina (por ejemplo, 6X o His mayores), o etiquetas de epítopo (por ejemplo, etiqueta Myc, etiqueta FLAG).

Ejemplos

En los siguientes ejemplos, todos los productos químicos se obtienen de Sigma, a menos que se indique. Los medios de cultivo celular son de Gibco BRL y los péptidos son de Bachem.

Ejemplo 1 Clonación del receptor ChemR23 humano

Se clonó ChemR23 humano tal como se describe en Samson et al. (1998) (SEQ ID Nos 1 y 2). Como ejemplo de una serie de etapas que pueden usarse para clonar otros polipéptidos de ChemR23 útiles según la invención, se describe aquí el método. Con el fin de clonar la secuencia ChemR23, se realizó un procedimiento de clonación clásico sobre ADN genómico humano. Se amplificó un clon, designado como HOP 102, a partir de ADN genómico humano usando oligonucleótidos degenerados. HOP 102 compartía el 45-50% de identidad con los receptores fMLP y C5a y similitudes algo más bajas con la familia de los receptores de quimiocinas. Se usó este clon parcial como una sonda para seleccionar una biblioteca genómica humana y se aislaron tres clones lambda que se solapaban. Se estableció un mapa de restricción de los clones y se subclonó en pBS SK+ (Stratagene) y se secuenció en ambas cadenas. Se encontró que la secuencia incluía la sonda HOP 102 completamente, con el 100% de identidad. Se nombró este gen novedoso como ChemR23 (Registro GenBank Nº Y14838).

La amplificación de la secuencia codificante de ChemR23 tuvo como resultado un fragmento de 1,1 kb. Este fragmento se subclonó en el vector pCADN3 (Invitrogen) y se secuenciaron ambas cadenas.

Ejemplo 2 Purificación del ligando natural de ChemR23 e identificación de TIG2

Se prefiltró aproximadamente un litro de líquido ascítico humano de una paciente con cáncer de ovario y después de filtró sucesivamente a través de filtros Millex (Millipore) de 0,45 y 0,22 \mum.

En la etapa 1, se cargó directamente la ascitis en una columna C18 en fase inversa (10 mm X 100 mm POROS 20 R2 bolas, Applied Biosystems) preequilibrada con CH_{3}CN al 5% / TFA al 0,1% con un velocidad de flujo de 20 ml/min a temperatura ambiente. Se aplicó después un gradiente del 5-95% de CH_{3}CN en TFA al 0,1% con una pendiente de 0,6%/min. Se recogieron fracciones de 5 mililitros, y se apartaron 20 \mul de cada fracción y se ensayaron para aumentos transitorios de [Ca^{2+}] en células CHO que expresan ChemR23.

En la etapa 2, se acumularon las fracciones activas (aproximadamente 10 fracciones eluyendo entre el 25 y el 40% de CH_{3}CN), se ajustaron a pH 5, se filtraron a través de un filtro Millex (Millipore) de 20 \mum, se diluyeron 3 veces en tampón acetato a pH 4,8 y luego se aplicaron a una columna de HPLC de intercambio catiónico (Polycat 9,6 mm x 250 mm, Vydac) preequilibrada con tampón de acetato a pH 4,8 y 4ºC. Se aplicó un gradiente 0-1 M de NaCl en tampón acetato a pH 4,8 con 10%/min con una velocidad de flujo de 4 ml/min. Se recogieron fracciones de 1 mililitro, y se usó una alícuota de 25 \mul de cada fracción para el ensayo de [Ca^{2+}] después de la desalación sobre una membrana de punto de corte de 10 kDa (Ultrafree, Millipore).

En la etapa 3, se acumularon las fracciones activas (eluídas con aproximadamente 700 mM de NaCl) y se desalaron sobre una membrana de punto de corte de 10 kDa Ultrafree hasta aproximadamente una concentración de 10 nM de NaCl. Se acumularon los eluatos de distintas series de HPLC de intercambio catiónico y se cargaron sobre una segunda columna de HPLC de intercambio catiónico (Polycat 2,1 mm x 250 mm, Vydac) preequilibrada con tampón acetato a pH 4,8 y 4ºC. Se aplicó un gradiente 0-1 M de NaCl en tampón acetato a pH 4,8 con una velocidad de flujo de 1 ml/min con una pendiente de 2%/min. Se recogieron fracciones de 0,5 mililitros y se usó una alícuota de 20 \mul de cada fracción para el ensayo de calcio intracelular después de la desalación sobre una membrana de punto de corte de 10 kDa Ultrafree.

En la etapa 4, se acumularon las fracciones activas, se diluyeron 8 veces con H_{2}O / H_{3}PO_{4} al 0,1% y se cargaron sobre una columna C18 en fase inversa analítica (4,6 mm x 250 mm Vydac) preequilibrada con CH_{3}CN al 5% / H_{3}PO_{4} al 0,1% con una velocidad de flujo de 1 ml/min a temperatura ambiente. Se aplicó un gradiente del 5-95% de CH_{3}CN en H_{3}PO_{4} al 0,1% con un gradiente del 0,3%/min de entre el 25 y el 40% de CH_{3}CN. Se recogieron manualmente los picos de absorción de UV individuales (214 nm), y se sometió a ensayo aproximadamente el 5% del volumen de cada fracción para determinar la actividad biológica.

En la etapa 5, se diluyeron los picos activos (aproximadamente el 28% de CH_{3}CN) 6 veces con H_{2}O / TFA al 0,1% y se cargaron directamente sobre una segunda columna C18 en fase inversa (1 mm x 50 mm, Vydac) preequilibrada con CH_{3}CN al 5% / TFA al 0,1% con una velocidad de flujo de 0,1 ml/min a temperatura ambiente. Se aplicó un gradiente del 5-95% de CH_{3}CN en TFA al 0,1% con un gradiente del 0,3%/min entre el 30 y el 45% de CH_{3}CN. Se recogió el pico final manualmente al 40% CH_{3}CN y se analizó mediante espectrometría de masas. 800 ml de líquido ascítico de cáncer de ovarios produjeron 50 fmoles de TIG2.

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La fracción activa se secó completamente en una Speed Vac (centrífuga de vacío) y se resuspendió en 10 \mul de Tris 0,1 M a pH 8,7. Tras hervir la muestra durante 15 min a 95ºC, se incubó la muestra a 37ºC durante la noche en presencia de 250 ng de tripsina modificada (Promega). Después se purificó la muestra digerida mediante extracción en fase sólida sobre ZipTip (puntas de micropipeta) C18 (Millipore). Se aplicó la muestra eluida (1,5 \mul en CH_{3}CN al 70% / TFA al 0,1%) sobre una diana MALDI en presencia de 120 mg/ml de una matriz de ácido dihidroxibenzoico y después se analizó en un prototipo MALDI-Q-TOF (Micromass). Una identificación mediante huella dactilar de masa monoisotópica directa permitió identificar 7 péptidos trípticos, es decir, 63 aminoácidos con una recuperación de secuencia del 38,7%.

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TABLA 1

Secuencias de péptidos encontradas en la huella de masa monoisotópica
\begin{minipage}[t]{158mm} Los dos péptidos indicados con un asterisco se microsecuenciaron mediante fragmentación MS/MS. La posición de los péptidos se define con respecto a la secuencia de aminoácido de TIG2 (SEQ ID NO: 5)\end{minipage}
Nº de residuos	Secuencia	M + H
72-78	\hskip0,8cm (K) LQQTSCR	835,41
	\hskip0,8cm (K) [SEQ ID NO: 13]
81-88	\hskip0,8cm (R) DWKKPECK	1033,51
	\hskip0,8cm (V) [SEQ ID NO: 14]
29-39*	\hskip0,8cm (R) GLQVALEEFHK	1270,68
	\hskip0,8cm (H) [SEQ ID NO: 15]
98-109	\hskip0,8cm (K) CLACIKLGSEDK	1279,64
	\hskip0,8cm (V) [SEQ ID NO:16]
114-125*	\hskip0,8cm (R) LVHCPIETQVLR	1407,78
	\hskip0,8cm (E) [SEQ ID NO: 17]
28-39	\hskip0,8cm (R) RGLQVALEEFHK	1426,78
	\hskip0,8cm (H) [SEQ ID NO: 18]
126-137	\hskip0,8cm (R) EAEEHQETQCLR	1472,64
	\hskip0,8cm (V) [SEQ ID NO: 19]

Ejemplo 3 Clonación y expresión recombinante de TIG2 humano

Con el fin de clonar la secuencia de TIG2 (figura 6, Registro GenBank Nº Q99969) se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) sobre ADNc renal (Clontech Laboratories). Se sintetizaron cebadores basándose en la secuencia TIG2 humana y fueron las siguientes:

1

Se realizó la amplificación con Taq polimerasa de Qiagen en las condiciones descritas por el proveedor y con los ciclos siguientes: 3 min a 94ºC, 35 ciclos de 1 min a 94ºC, 90 s a 58ºC y 90 s a 72ºC, seguido por una incubación final de 10 min a 72ºC. La amplificación tuvo como resultado un fragmento de 500 pb que contenía la secuencia codificante completa del gen Tig2. Se subclonó este fragmento en un vector pCADN3 (Invitrogen) para el análisis de secuencia de ADN. Se usó ADN Maxiprep (Quiagen) en la transfección transitoria de células HEK293 que expresan el antígeno T grande (293T) y células COS-7 usando Fugene6 en placas de 10 cm. En paralelo, se realizaron transfecciones en las mismas líneas celulares con el vector de expresión solo (transfectado de prueba). 24 h después de la transfección, se sustituyó el medio por 9 ml de DMEM-F12, BSA al 1%, y se recogieron 3 ml de sobrenadante cada 24 h durante tres días (48, 72 y 96 h tras la transfección). Se transfectaron las células CHO con el mismo plásmido y se seleccionaron las células transfectadas con G418. Se verificó la actividad del medio condicionado en células que expresaban ChemR23 usando el ensayo de aequorina.

Ejemplo 4 Expresión recombinante de TIG2 en levaduras

Se amplifican las secuencias codificantes de TIG2 humano y de ratón mediante PCR usando los cebadores siguientes (se usan dos cebadores diferentes para la amplificación del extremo 5' de TIG2 humano para tener en cuenta las diferentes predicciones del péptido señal de esta proteína):

2

Se clonan las secuencias de TIG2 amplificadas, se secuencian y se insertan en pPIC9K, un plásmido de expresión de copia múltiple de Pichia (InVitrogen) que contiene las señales que dirigen la secreción de las proteínas expresadas. Siguiendo a la transformación, se seleccionan las células de Pichia pastoris usando el antibiótico G418. Tras la selección, se analizan 20 clones para su expresión y se amplifica el clon con la mayor expresión para una expresión a gran escala en matraces de agitación. Se recoge el medio, se centrifuga y se usa para la purificación parcial con un protocolo derivado del usado para la purificación inicial de TIG2 (véase anteriormente).

Ejemplo 5 Expresión recombinante de TIG2 quimérico fusionado con fosfatasa alcalina secretada (SEAP)

Se amplifican las secuencias codificantes del TIG2 de ratón y humano mediante PCR, se clonan y se secuencian. Los cebadores y de secuenciación y PCR son como sigue:

3

Después se subclonan las secuencias de TIG2 clonadas en el vector de expresión bicistrónico de mamíferos, pEFIN, para obtener una proteína de fusión con TIG2 unido en su extremo carboxilo terminal a la fosfatasa alcalina secretada, marcada con seis residuos de histidina (His6). Las células de mamíferos, incluyendo las células COS-7, HEK-293 que expresan el antígeno T grande (293T) y CHO-K1, se transfectan con este plásmido usando Fugene 6^{MR} y se incuban durante 3-4 días en un medio F12 de Ham completo (F12 de Ham con mezcla de nutrientes (Life Technologies) que contiene un 10% de suero bovino fetal; 100 U.I./ml de penicilina, 100 \mug de estreptomicina y 2,5 \mug/ml de Fungizone (anfotericina B). Se recoge el sobrenadante que contiene TIG2-SEAP-His6 después de la centrifugación, se filtra (0,45 \mum) y se almacena a 4ºC después de añadir Hepes 20 mM (pH 7,4) y azida de sodio al 0,02%.

Para la purificación de afinidad en una etapa de la proteína de fusión TIG2, se aplica el sobrenadante a 1 ml de resina de Hisbond (Qiagen). Tras el lavado, se eluye la unión TIG2-SEAP-His6 con un gradiente de imidazol. Se determina la concentración del TIG2-SEAP-His6 aislado mediante un ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas de tipo sándwich (intercalado). Brevemente, se recubren las placas de microtítulo con un anticuerpo anti-fosfatasa alcalina placentaria. Después de bloquearse con 1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) en solución salina de tamponada con fosfato, se titulan las muestras y se incuban durante 1 h a temperatura ambiente. Después del lavado, se incuban las placas con anticuerpos anti-fosfatasa alcalina placentaria biotinilada de conejo diluida 1:500 durante 1 h a temperatura ambiente, se lavan de nuevo, y se incuban con estreptavidina conjugada con peroxidasa durante 30 min. Después del lavado, se hace reaccionar la peroxidasa unida con 3,3',5,5'-tetrametilbencidina. Se para la reacción mediante la adición de H_{2}SO_{4} 1 N, se mide la absorbancia a 450 nm. Se determina la actividad de la fosfatasa alcalina mediante un ensayo quimioluminiscente usando el kit de detección Great Escape^{MR} (Clontech). Se usa la fosfatasa alcalina placentaria purificada para generar una curva patrón. Se expresa la actividad enzimática como unidades relativas de luz/s.

Ejemplo 6 Ensayo funcional para ChemR23

Se han obtenido clones que expresan ChemR23 mediante la transfección de células CHO-K1 a apoaequorina mitocondrial de coexpresión y G\alpha16, limitando la dilución y la selección mediante inmunotransferencia Northern blot. Se usaron los clones positivos para seleccionar con extractos de ascitis de cáncer de ovario humano preparados tal como se describió anteriormente. Se realizó un ensayo funcional basado en la luminiscencia de liberación de Ca^{2+} intracelular de aequorina mitocondrial (Stables et al., 1997, Anal. Biochem. 252:115-126; que se incorpora al presente documento como referencia) tal como se describe (Detheux et al., 2000, J. Exp. Med., 192: 1501-1508; que se incorpora al presente documento como referencia). Brevemente, se recogieron las células de las placas en PBS que contenían EDTA 5 mM, se dejaron sedimentar y se resuspendieron a 5 x 10^{6} células/ml en un medio DMEM-F12. Se incubaron las células con coelenterazina H 5 \muM (Molecular Probes) durante 4 horas a temperatura ambiente. Después se lavaron las células en un medio DMEM-F12 y se resuspendieron a una concentración de 0,5 x 10^{6} células/ml. Después se mezclaron las células con péptidos agonistas de prueba o con placas que contenían extractos de tejido y se registró la emisión de luz durante 30 s usando un luminómetro Microlumat (Perkin Elmer). Se expresan los resultados como unidades relativas de luz (URL).

Ejemplo 7 Activación de células que expresan ChemR23 mediante TIG2 recombinante

Se recogió el medio condicionado de células COS-7, CHO-K1 y 293T transfectadas con un sistema de vector de expresión de TIG2 de mamíferos (pCADN-TIG2) o con pCADN3 solo, y se usó para ensayos de aequorina sobre células CHO que expresan ChemR23. Se muestran los resultados en la figura 12. Cantidades cada vez mayores de sobrenadante condicionado tuvieron como resultado un aumento de la luminiscencia en las células del sistema de aequorina que expresan ChemR23.

Ejemplo 8 Producción de anticuerpos específicos para ChemR23

Se produjeron anticuerpos dirigidos contra ChemR23 mediante inyecciones repetidas de plásmidos que codifica para ChemR23 en ratones. Se recogieron sueros empezando después de la segunda inyección y se evaluó el título y la especificidad de los anticuerpos mediante citofluorometría de flujo con células CHO-K1 transfectadas con el ADNc de ChemR23 y células CHO-K1 transfectadas con el ADNc de ADNc de GPCR no relacionado. Varios sueros fueron positivos y se usaron para la inmunohistoquímica y otras aplicaciones relacionadas, incluyendo análisis de citometría de flujo de células primarias humanas.

Se obtuvieron anticuerpos monoclonales a partir de ratones inmunes mediante tecnología de hibridoma convencional usando la línea celular de mieloma murino NSO como componente inmortal. Se probaron los sobrenadantes para determinar la actividad de los anticuerpos anti-ChemR23 usando la prueba usada para evaluar los antisueros. Se expandieron y se congelaron las células de los pocillos positivos y se recogieron los sobrenadantes.

La figura 13 muestra los resultados de los experimentos para caracterizar los anticuerpos cultivados frente a ChemR23. Se hizo reaccionar una mezcla de células recombinantes compuesta de 2/3 de células ChemR23 - CHO recombinantes y 1/3 de células CHO transfectadas de prueba (control negativo) con o bien un sobrenadante de células que expresan el anticuerpo monoclonal anti-ChemR23 5C 1H2 (línea gruesa) o bien un sobrenadante de células sin actividad de anticuerpos conocida (línea fina, relleno gris). Tras la tinción con Ig anti-ratón marcado con FITC, se analizaron estas preparaciones mediante citofluorometría de flujo. Se exponen los resultados como un histograma de número de células (eje de los acontecimientos) que expresan una fluorescencia dada (eje de FL1-H). El 5C 1H2 monoclonal permitió la discriminación de la subpoblación recombinante de ChemR23 de las células a partir de las células control negativas, tal como se evidencia mediante las proporciones relativas de ambos tipos de células. La fluorescencia de fondo del ensayo se da mediante la segundo tinción (relleno gris).

Ejemplo 9 Ensayo de desplazamiento de la unión

Para experimentos de desplazamiento, se incuban las células ChemR23-CHO-K1 (25.000 células/tubo) durante 90 min a 27ºC con SEAP-HIS6 1 nM o TTG2-SEAP-HIS6 en presencia de concentraciones crecientes de TIG2 sin marcar en 250 \mul de tampón de unión (Hepes 50 mM, pH 7,4; CaCl_{2} 1 mM; albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5% libre de ácidos grasos; MgCl_{2} 5mM). Para experimentos de saturación, se incuban las células ChemR23-CHO-K1 (25.000 células/tubo) durante 90 min a 27ºC con concentraciones crecientes de TIG2-SEAP-HIS6 en presencia o en ausencia de 1 \muM de TIG2 sin marcar. Tras la incubación, se lavan las células 5 veces y se lisan en 50 \mul de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), Triton X100 al 1%. Se calientan las muestras a 65ºC durante 10 min para inactivar las fosfatasas celulares. Se recogen los lisados mediante centrifugación, y se determina la actividad de la fosfatasa alcalina en 25 \mul de lisado mediante el ensayo de quimioluminiscencia descrito anteriormente.

Ejemplo 10 Distribución de tejido de TIG2 y ChemR23

Se realizó una RT-PCR semicuantitativa usando cebadores específicos de gen para hTIG2 y ChemR23 sobre ARN poliA+ y ARN total de varios tejidos humanos (CLONTECH y Ambion). Brevemente, se prepararon los ARN totales de células sanguíneas con el Mini Kit Rneasy (Qiagen). Los cebadores de hTIG2 fueron directo (5'-GCAGACAAGCTGCCGGA-3'; SEQ ID NO: 37), sonda TaqMan (5'-AACCCGAGTGCAAAGTCAGGCCC-3'; SEQ ID NO: 38), e inverso (5'-AGTTTGATGCAGGCCAGGC-3'; SEQ ID NO: 39). Los cebadores de hChemR23 fueron directo (5'-GTCCCAGAACCACCGCAG-3'; SEQ ID NO: 40), sonda TaqMan (5'-TTCGCCTGGCTTACATGGCCTGC-3'; SEQ ID NO: 41), e inverso (5'-AAGAAAGCCAGGACCCAGATG-3'; SEQ ID NO: 42). Se usaron los cebadores diseñados para el gen de mantenimiento GAPDH directo (5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'; SEQ ID NO: 43), sonda TaqMan (5'-AGCTCTCCCGCCGGCCTCTG-3'; SEQ ID NO: 44), e inverso (5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'; SEQ ID NO: 45) para producir perfiles de ARNm de referencia. Se muestra la distribución de hTIG2 y ChemR23 en varios tejidos en las figuras 15 y 16, respectivamente. Se expresan los niveles de expresión de hTIG2 o ChemR23 como una razón de la expresión del ARNm de referencia de hTIG2 o ChemR23 con respecto a GAPDH.

Ejemplo 11 Identificación de un polipéptido truncado de TIG2 humano como ligando para ChemR23

Se aisló el polipéptido truncado de TIG2 humano a partir de líquido ascítico tumoral humano de una paciente con cáncer de ovario. Se describe el procedimiento usado para dicho aislamiento en el ejemplo 2 de la presente solicitud de patente; excepto por el hecho de que tras la secuenciación de péptidos se reveló un polipéptido como se representa mediante SEQ ID NO: 48.

Se aisló la secuencia de nucleótidos que codifica para dicho polipéptido truncado según un método descrito en el ejemplo 3. Se realizó la expresión recombinante del TIG2 truncado en células de levadura y de mamíferos tal como se describe en los ejemplos 4 y 5.

Un ensayo funcional reveló que ambos polipéptidos de TIG2 representados por SEQ ID NO: 8 y representados por SEQ ID NO: 48 son ligandos para ChemR23. El método seguido para dicho ensayo es tal como se describe en el ejemplo 6.

La figura 14 muestra la curva de respuesta de concentración para el péptido truncado de hTIG2 (SEQ ID NO: 48) para ChemR23 que se expresa en las células CHO. Se llevó a cabo el ensayo tal como se describe en el párrafo anterior. Como se muestra en la figura, la molécula truncada de hTIG2 activa ChemR23 con un CE_{50} de 4,27 nM. Se expresan los resultados como unidades relativas de luz (URL). Se están realizando para el péptido truncado de TIG2 estudios de activación similares, ensayos de desplazamiento de la unión y la producción de anticuerpos para el péptido truncado de TIG2 tal como se realiza para el polipéptido de TIG2 de longitud completa tal como se describe en los ejemplos 7, 8 y 9.

Se está estudiando la distribución de tejido del polipéptido truncado de TIG2 con el fin de determinar si ésta es distinta de la distribución del polipéptido de TIG2 de longitud completa. Esto puede revelar una función específica de dicha forma truncada con respecto a la forma de longitud completa.

Claims

1. Método para identificar un agente que se une a ChemR23, comprendiendo dicho método:

(a) poner en contacto un polipéptido de ChemR23 con un polipéptido truncado de TIG2 representado por SEQ ID NO: 48 o un polipéptido de TIG2 que comprende adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a dicho polipéptido truncado de TIG2 pero que conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de señalización de dicho polipéptido truncado de TIG2 en presencia o en ausencia de un agente de unión candidato en condiciones que permiten la unión de dicho polipéptido truncado de TIG2 o de dicho polipéptido de TIG2 a dicho polipéptido de ChemR23; y

2. Método según la reivindicación 1, en donde dicho agente está presente en una muestra.

3. Método para identificar un agente que disminuye la actividad de señalización de ChemR23, comprendiendo dicho método:

(a) poner en contacto un polipéptido de ChemR23 con un polipéptido truncado de TIG2 representado por SEQ ID NO: 48 o un polipéptido de TIG2 que comprende adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a dicho polipéptido truncado de TIG2 pero que conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de señalización de dicho polipéptido truncado de TIG2 en presencia o en ausencia de dicho agente,

(b) medir una actividad de señalización de dicho polipéptido de ChemR23, y

(c) comparar la cantidad de dicha actividad medida en una reacción que contiene dicho ChemR23 y dicho polipéptido truncado de TIG2 o dicho polipéptido de TIG2 sin dicho agente con la cantidad de dicha actividad medida en una reacción que contiene dicho ChemR23, dicho polipéptido truncado de TIG2 o dicho polipéptido de TIG2 y dicho agente, en donde una disminución de la actividad en presencia de dicho agente con respecto a la actividad en ausencia de dicho agente identifica a dicho agente como un antagonista para ChemR23.

4. Método según la reivindicación 3, en donde dicho agente está presente en una muestra.

5. Método para identificar un agente que aumenta la señalización de ChemR23, comprendiendo dicho método:

(a) poner en contacto un polipéptido de ChemR23 con un agente;

(c) comparar dicha actividad medida en presencia de dicho agente modulador candidato con dicha actividad medida en una reacción en la que dicho polipéptido de ChemR23 se pone en contacto con un polipéptido truncado de TIG2 representado por SEQ ID NO: 48 o un polipéptido de TIG2 que comprende adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a dicho polipéptido truncado de TIG2 pero que conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de señalización de dicho polipéptido truncado de TIG2, en donde dicho agente se identifica como un agonista que aumenta la señalización del polipéptido de ChemR23 cuando la cantidad de dicha actividad medida en presencia de dicho agente es de al menos un 10% de la cantidad inducida por dicho polipéptido truncado de TIG2 o dicho polipéptido de TIG2.

6. Método según la reivindicación 5, en donde dicho agente está presente en una muestra.

7. Método según la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho polipéptido truncado de TIG2 o dicho polipéptido de TIG2 se marca de manera detectable.

8. Método según la reivindicación 7, en donde dicho polipéptido truncado de TIG2 o dicho polipéptido de TIG2 se marca de manera detectable con un resto seleccionado del grupo que consiste en un radioisótopo, un fluoróforo, un inhibidor de fluorescencia, una enzima, una etiqueta de afinidad, y una etiqueta de epítopo.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha puesta en contacto se realiza en o sobre una célula que expresa dicho polipéptido de ChemR23.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha puesta en contacto se realiza en o sobre liposomas sintéticos.

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11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha puesta en contacto se realiza en o sobre membranas en gemación inducidas por virus que contienen el polipéptido de ChemR23.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 ó 11, en donde dicho método se realiza usando una fracción de membrana de células que expresan dicho polipéptido de ChemR23.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha medición se realiza usando un método seleccionado de desplazamiento de marcador, resonancia de plasmón superficial, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, extinción de fluorescencia, y polarización de fluorescencia.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en un péptido, un polipéptido, un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, un lípido, un hidrato de carbono, un ácido nucleico y una molécula orgánica pequeña.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 - 6 y 9 - 14, en donde dicha etapa de medición de una actividad de señalización de dicho polipéptido de ChemR23 comprende detectar un cambio en el nivel de un segundo mensajero.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 - 6 y 9 - 14, en donde la etapa de medición de una actividad de señalización comprende la medición de la unión o intercambio de nucleótidos de guanina, actividad adenilato ciclasa, AMPc, actividad de proteína cinasa C, ruptura del fosfatidilinositol, diacilglicerol, inositol trifosfato, calcio intracelular, ácido araquidónico, actividad MAP cinasa, actividad tirosina cinasa, o expresión de gen indicador.

17. Método según la reivindicación 16, en el que dicha medición de una actividad de señalización comprende usar un ensayo basado en aequorina.

18. Kit para seleccionar agentes que modulan la unión o la actividad de señalización de ChemR23 o para el diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de la señalización de ChemR23, comprendiendo dicho kit un polipéptido de ChemR23 aislado, un polipéptido truncado de TIG2 aislado representado por SEQ ID NO: 48 o un polipéptido de TIG2 que comprende adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a dicho polipéptido truncado de TIG2 pero que conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de señalización de dicho polipéptido truncado de TIG2 y materiales de acondicionamiento para ellos.

19. Kit para seleccionar agentes que modulan la unión o la actividad de señalización de ChemR23 o para el diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de la señalización de ChemR23, comprendiendo dicho kit un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido de ChemR23, un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido truncado de TIG2 representado por SEQ ID NO: 48 o un polipéptido de TIG2 que comprende adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a dicho polipéptido truncado de TIG2 pero que conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de señalización de dicho polipéptido truncado de TIG2 y materiales de acondicionamiento para ellos.

20. Método in vitro para modular la actividad de un polipéptido de ChemR23 en una célula, comprendiendo dicho método la etapa de administrar a dicha célula un polipéptido truncado de TIG2 representado por SEQ ID NO: 48, un polipéptido de TIG2, que comprende adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a dicho polipéptido truncado de TIG2 pero que conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de señalización de dicho polipéptido truncado de TIG2, anticuerpos frente a TIG2, o, nucleótidos que codifican para TIG2, de manera que se modula la actividad de ChemR23.

21. Método según la reivindicación 20, en donde dicho nucleótido que codifica para TIG2 es un aptámero.

22. Uso de un polipéptido truncado de TIG2 representado por SEQ ID NO: 48 o un polipéptido de TIG2 que comprende adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a dicho polipéptido truncado de TIG2 pero que conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de señalización de dicho polipéptido truncado de TIG2 para la producción de un kit para seleccionar agentes que modulan la señalización de ChemR23 o para la producción de un kit para el diagnóstico del cáncer, metástasis tumorales, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, deficiencias inmunitarias heredadas o adquiridas, osteoporosis, consolidación de fracturas óseas, injertos de tejido óseo, rechazo de injertos, eccema, infección inflamatoria y enfermedades tróficas de la piel, infecciones virales, bacterianas y parasitarias, esterilidad femenina, y tumores de útero y ovario.

23. Uso de un polipéptido truncado de TIG2 representado por SEQ ID NO: 48 o un polipéptido de TIG2 que comprende adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a dicho polipéptido truncado de TIG2 pero que conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de señalización de dicho polipéptido truncado de TIG2 como ligando para ChemR23.

24. Composición que comprende un polipéptido de ChemR23 aislado y un polipéptido truncado de TIG2 aislado representado por SEQ ID NO: 48 o un polipéptido de TIG2 que comprende adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a dicho polipéptido truncado de TIG2 pero que conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de señalización de dicho polipéptido truncado de TIG2.

25. Método, uso, composición o kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde dicho polipéptido truncado de TIG2 comprende secuencias adicionales que forman una proteína de fusión truncada TIG2.

26. Método, uso, composición o kit según la reivindicación 25, en donde dichas secuencias adicionales pueden elegirse del grupo que consiste en secuencias de glutation-S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa, fosfatasa alcalina, tiorredoxina, proteína fluorescente verde (GFP), etiquetas de histidina (por ejemplo, 6X o His mayores), o etiquetas de epítopo (por ejemplo, etiqueta Myc, etiqueta FLAG).

27. Polipéptido truncado de TIG2 representado por SEQ ID NO: 48 o polipéptido de TIG2 que comprende adiciones, inserciones, deleciones o sustituciones con respecto a dicho polipéptido truncado de TIG2 pero que conserva al menos el 50% de la actividad de unión y del nivel de activación de señalización de dicho polipéptido truncado de TIG2 o una proteína de fusión que comprende el mismo.

28. Secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido según la reivindicación 27.